KR102081963B1 - 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents
식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적유전자를 식물 종자의 배, 배반 및 호분층 중 하나 이상에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 성숙 종자에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 식물체 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터를 이용하여 목적유전자를 성숙 종자에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 식물 종자의 형태 및 기능적 특성을 조절하는데 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명의 식물체 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터를 이용하여 목적유전자를 성숙 종자에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 식물 종자의 형태 및 기능적 특성을 조절하는데 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적유전자를 식물 성숙 종자에서 특이적으로 발현을 유도하는 벼 유래 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 배에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
최근 들어 유전공학 기술이 발달함에 따라 식물의 형질을 개량시키고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체로부터 얻고자 하는 기술들에 대해 많은 관심이 대두 되고 있는데 이러한 목적 유용 유전자를 형질전환 식물체에서 발현시키고자 할 때 유전자 발현에 관여하는 프로모터(promoter)가 요구된다.
일반적으로 프로모터란 유전자가 언제 어디서 어느 정도 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절영역의 일종이다. 그동안 끊임없는 연구들을 통해 수많은 종류의 프로모터들이 밝혀진 바 있다. 종래 보고된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분되어 질 수 있다.
보다 구체적으로 살펴보면, 첫째로 발현 양을 최대화할 수 있는 강한 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현량을 최대화하는데 이용되는 프로모터로써 초기에 많이 개발되었으며, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 유전자의 프로모터(P35S) 및 벼의 액틴(actin) 유전자 프로모터가 대표적이다. 이들은 식물의 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제 저항성 유전자, 식물의 병충해 억제 유전자 또는 식물을 이용한 물질 생산 등의 목적으로 주로 사용되고 있다.
둘째로, 발현 시기를 제한하는 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물 발달 단계 중 특별한 시기에만 국한시키는 프로모터로서 많은 예들이 보고되어 있다. 예를 들어, 개화에 관련된 유전자들의 프로모터는 개화기에만 유전자를 발현시키며, 각종 생물학적(biotic) 또는 비생물학적(abiotic) 자극에 의하여 발현되는 유전자들의 프로모터들도 시기를 조절하는 프로모터에 포함시킬 수 있다.
셋째로, 발현 조직을 제한하는 조직 특이적인 프로모터를 들 수 있다. 이는 목적 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 프로모터들이다. 이러한 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 사용하고자 하는 다양한 목적에 따라서 식물체의 각 조직에 대하여 많은 예가 보고된 바 있다.
특히, 상기와 같이 기능 및 특징에 따라 구분되어진 프로모터들 중 조직 특이적인 발현을 유도하는 프로모터들은 식물체 내에서 발현되는 조직에 따라 다시 다음과 같이 분류되고 있다.
첫째로, 전신 발현 유도 프로모터를 들 수 있다. 식물체 전신에서 발현을 유도하는 프로모터로는 발현 양을 최대화하는데 이용되는 프로모터이기도 한 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터가 대표적인 쌍자엽 식물용 프로모터로 사용되고 있으며, 벼 등의 외떡잎식물용 전신발현 유도 프로모터로는 벼 액틴(actin) 및 옥수수 유비퀴틴(ubiquithin) 유전자의 프로모터들이 주로 이용되고 있고, 최근에는 벼 시토크롬 C유전자(OsOc1)의 프로모터가 개발된 바 있다(한국등록특허 제10-0429335호). 이들도 상기 발현 양을 최대화하는 프로모터와 동일하게 형질전환 시 선발 마커로 이용되는 항생제나 제초제 저항성 유전자 및 리포터 유전자의 발현을 유도하는 목적으로 사용되고 있으며, 연구적인 측면에서 목적하는 유전자의 식물체내 기능을 밝히고자 시도할 때 우선적으로 고려되는 프로모터들이다.
둘째로, 종자 특이적 프로모터를 들 수 있다. 대표적인 예로는 벼 주요 저장 단백질 유전자의 프로모터들로서 황금쌀(golden rice) 개발에 사용된 벼 글루테린(glutelin) 프로모터가 현재까지 단자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는 경우에 많이 사용되고 있고, 쌍자엽 식물의 종자 특이적 발현을 유도하는데 주로 사용되는 프로모터로는 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 및 애기장대의 종자에서 감마 토코페롤 메틸기 전이효소(γ-tocopherol methyl transferase:γ-TMT) 유전자 발현을 유도함으로써 비타민 E 생성을 증진시키는 연구에 사용된 당근 유래 DC-3 프로모터 및 들깨 유래 올레오신(oleosin) 프로모터가 있다.
셋째로, 뿌리 특이 발현 프로모터로서 이는 아직까지 상용화된 사례는 없으나 애기장대 퍼옥시다제(peroxidase, prxEa)가 분리되어 뿌리 특이적 발현을 확인하였고, 최근에는 고구마 유래의 매즈 유전자(ibMADS) 및 당 유도성 에이디피 글루코즈 파이로포스파타제(ADP-glucose pyrophosphatase, AGPase) 유전자가 분리되어 해당 프로모터가 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하며, 당근 및 무에서는 뿌리 특이적으로 일시적 발현을 유도한다는 내용이 보고된 바 있다.
넷째로, 잎 등의 기타 조직 특이 프로모터를 들 수 있는데, 이와 관련된 프로모터로는 잎 등의 광합성 조직에서만 강력한 유전자의 발현을 유도하는 벼 및 옥수수 유래의 알비씨에스(rbcS: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 프로모터, 토마토 유래의 과실 성숙 특이 발현 유도 피디에스(PDS: phytoene synthase) 프로모터 및 배추 꽃의 화분 특이적인 배추 유래의 올레오신(oleosin) 프로모터 등이 있다.
이러한 종자, 뿌리 또는 잎 특이적 발현 프로모터들은 식량이나 식품 또는 식품의 원료로 사용되는 주요 작물에서 농업적 형질 개량이나 유용 단백질 축적 및 유용 물질 생성 등을 목적으로 사용이 기대되고 있다.
그러나 상기 공지된 프로모터들, 특히 식물체에서 조직 특이적으로 발현을 유도하는 것으로 알려진 종래의 프로모터들은 조직 특이적으로 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 장점이 있으나, 그 발현 양이 미미한 단점이 있다. 따라서 식물체 내에서 목적 유전자의 발현을 조직 특이적이면서도 대량으로 발현시킬 수 있는 유용한 새로운 프로모터의 발굴이 시급한 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 식물체에서 목적 유전자를 조직 특이적으로 발현시킬 수 있는 새로운 프로모터, 구체적으로 식물 성숙 종자에 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 벼에서 목적 유전자를 종자에만 특이적으로 발현시킬 수 있는 프로모터를 분리함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터, 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 성숙 종자에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터, 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 형질전환된 식물체 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 성숙 종자에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 식물체 성숙 종자에서 특이적으로 유전자를 발현시키는 프로모터를 이용하여 목적유전자를 성숙 종자에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 식물체 종자의 형태 및 기능적 특성을 조절하는데 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 벼 출수 후 종자 발달 단계에 따른 전사체 분석을 통해, 본 발명의 종자 발현 전사인자 선발 목적으로 도출한 분석 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A) 벼 종자 발달 단계별 주요 특징, (B) 종자 발달 과정에서 발현이 급증된 유전자군의 벼 출수 후 일수(0, 3-6, 25, 40일째)에 따른 발현 수준을 나타낸 그래프 및 (C) 종자 발달 단계별 Os05g48650 유전자의 발현 양상을 나타내는 마이크로어레이(microarray) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 공공 데이터베이스를 이용한 인실리코(in silico) 발현 분석을 통해 Os05g48650 유전자의 벼 조직별 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A) Rice Oligonucleotide Array 데이터 분석 결과 및 (B) RiceXPRO 데이터 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 Os05g48650 프로모터의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 Os05g48650 프로모터-GUS 발현 벡터의 모식도를 나타낸 도이다:
SmSpR: spectinomycin and streptomycin resistant
LB: left T-DNA border
Bar: bialaphos resistance gene
Egfp: enhanced green fluorescence protein
gus: beta-glucuronidase A
T35S: CaMV 35S terminator
RB: right T-DNA border
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 Os05g48650 프로모터-GUS 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 벼에서 벡터 도입 여부를 확인한 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, DJ는 대조구인 동진벼이며, T143-2 및 T144-5는 Os05g48650 프로모터가 삽입된 형질전환 벼이다.
도 6은 본 발명의 Os05g48650 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 GUS 염색 분석 결과를 나타낸 도이다. (A) 출수후 종자발달 단계별 GUS 염색 양상 (B) 종자 발아후 GUS 염색 양상 (C) 발아후 7일된 종자의 횡단면에서 GUS 염색 양상 (D) 7일된 유식물과 5개월 생육 벼의 잎과 마디에서 GUS 염색 양상
An, Anther; OV, Ovule; AL, Aleurone Layer; Em, Embryo; En, Endosperm;
Sc, Scutelum; VB, Vascular bundle; R, Root; S, Shoot; L, Leaf; N, Node
도 2는 공공 데이터베이스를 이용한 인실리코(in silico) 발현 분석을 통해 Os05g48650 유전자의 벼 조직별 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, (A) Rice Oligonucleotide Array 데이터 분석 결과 및 (B) RiceXPRO 데이터 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 Os05g48650 프로모터의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 Os05g48650 프로모터-GUS 발현 벡터의 모식도를 나타낸 도이다:
SmSpR: spectinomycin and streptomycin resistant
LB: left T-DNA border
Bar: bialaphos resistance gene
Egfp: enhanced green fluorescence protein
gus: beta-glucuronidase A
T35S: CaMV 35S terminator
RB: right T-DNA border
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 Os05g48650 프로모터-GUS 발현 벡터를 이용하여 형질전환시킨 벼에서 벡터 도입 여부를 확인한 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, DJ는 대조구인 동진벼이며, T143-2 및 T144-5는 Os05g48650 프로모터가 삽입된 형질전환 벼이다.
도 6은 본 발명의 Os05g48650 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 GUS 염색 분석 결과를 나타낸 도이다. (A) 출수후 종자발달 단계별 GUS 염색 양상 (B) 종자 발아후 GUS 염색 양상 (C) 발아후 7일된 종자의 횡단면에서 GUS 염색 양상 (D) 7일된 유식물과 5개월 생육 벼의 잎과 마디에서 GUS 염색 양상
An, Anther; OV, Ovule; AL, Aleurone Layer; Em, Embryo; En, Endosperm;
Sc, Scutelum; VB, Vascular bundle; R, Root; S, Shoot; L, Leaf; N, Node
본 발명은 식물 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 목적 유전자를 식물 종자의 배, 배반 및 호분층 중 하나 이상에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터, 상기 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 제조한 형질전환 식물체와 이로부터 수득한 종자, 상기 형질전환 식물체의 제조 방법, 및 상기 프로모터를 이용하여 외래 유전자를 형질전환 식물체의 종자에서 특이적으로 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 식물 종자의 배(embryo), 배반 및 호분층 중 하나 이상에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "배(embryo)"란 배아, 씨눈이라고도 하며, 종자식물에서는 휴면종자 내에 위치하며 나중에 식물체가 되는 부분을 의미한다. “배반(Scutellum)”은 발아할 때에 배젖 분해물질 흡수에 관여하는 화본과(科) 특유의 배적기관(胚的器官)으로 배 가운데서 최대의 부피를 차지하며 배 본체로부터 관다발이 1개 들어가며 이어서 분기한다. 또한 “호분층(aleurone layer)”은 벼과 식물 종자의 한 조직으로 배젖을 둘러싸고 있는 층을 말한다. 본 발명의 프로모터에 발현되는 유전자들은 식물 성숙 종자의 출수 후 발아단계까지 배에서 그리고 배반을 거쳐 호분층 조직에서 시기별로 각각 특이적으로 발현됨을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "프로모터(promoter)"란 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.
본 발명의 프로모터는 식물체의 특정 부위, 특히 식물체의 성숙 종자의 초기 발아단계에서 배, 배반 및 호분층 조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터로, 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 발명에 있어 "상동성"이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
본 발명의 프로모터는 식물체의 성숙 종자의 특정 부분에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 식물체의 성숙 종자의 발아 단계초기까지 배, 배반 및 호분층 조직에서 특이적으로 목적 단백질을 발현시킬 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일실시예에서, 본 발명의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질이 벼 성숙 종자의 초기발아과정에서 배(embryo), 배반 및 호분층 조직에서 특이적으로 발현됨을 확인할 수 있었다(도 6).
본 발명의 조직 특이적 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.
본 발명의 상기 프로모터는 벼(Oryza sativa L.)로부터 분리된 것일 수 있고, 구체적으로 고품벼로부터 분리된 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 벼 출수 후 3-6일에서 25일 사이에 유전자 발현이 약 10배 이상 증가하는 유전자군의 번역시작 상위염기서열을 분리하였다.
상기 프로모터는 2,000 bp 크기의 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 서열번호 1의 염기서열은 니폰바레(Nipponbarre)의 게놈 데이터베이스(genome database)에서 추출한 Os05g48650 유전자의 프로모터 염기서열과 100% 상동성을 지닌 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 프로모터는 종자 발아와 휴면 조절 및 성장에 관여하는 다양한 조절인자를 포함할 수 있으며, 구체적으로 종자 또는 배 특이적 발현에 관여하는 모티프(motif), 지베렐린(gibberellin, GA) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프, 앱시스산(abscisic acid, ABA) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프, 옥신(auxin) 호르몬 신호전달에 관여하는 모티프 등이 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 최근의 여러 가지 연구기법, 예를 들어 방향성 진화법(directed evolution) 또는 부위특이돌연변이기술(site-directed mutagenesis) 등의 방법을 통해 일정 정도 변형이 가능하다. 즉, 본 발명의 프로모터 핵산 분자는 이와 기능적으로 동일한 작용을 수행하는 이의 작용성 등가물을 포함하는데, 상기 작용성 등가물은 인위적인 변형에 의해 뉴클레오타이드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 이들의 조합에 의해 변형된 변이체(varients) 또는 동일한 작용을 수행하는 상기 폴리뉴클레오티드의 작용성 단편(fragments)을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "특이적"은 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물체 내의 적어도 하나 이상의 다른 조직보다 특정한 조직 내에서 더 높다는 것을 의미한다. 프로모터의 발현 활성의 수준은 본 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 미리 측정된 조직 내에서의 프로모터의 발현 수준을 다른 조직 내에서의 것과 비교함으로써 평가될 수 있다. 일반적으로 프로모터의 발현 수준은 프로모터의 조절 하에서 발현된 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 및 RNA 등의 생성량에 의해 측정된다.
따라서, 용어 "식물 종자에서 특이적"이란 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물 내 다른 조직 보다 식물 종자 내에서 더 높다는 것을 의미한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 프로모터를 포함하는 식물 종자의 배(embryo), 배반 및 호분층 조직에서 특이적 유전자 발현을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란 프로모터 서열이 상기 코딩 서열의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 코딩 서열과 프로모터가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에서, 벡터의 제작은 Gateway 벡터 시스템을 이용하였다. 구체적으로, 발현하고자 하는 유전자 서열의 양쪽 서열을 프라이머(primer) 서열로 하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭하였다. attL1과 attL2 사이트(site)를 가지고 있는 pENTR/Directional TOPO vector(Invitrogen)에 삽입하기 위하여 양방향 프라이머 중 정방향 프라이머 앞쪽에 CACC를 삽입하여 증폭된 유전자가 방향성을 가지고 pENTR™ Directional TOPO vector에 들어갈 수 있게 만들었다(pENTR™ Directional TOPO Cloning Kits, Invitrogen). 그리고 이를 다시 attR1과 attR2를 가지고 있는 목적 Gateway 벡터 시스템에 LR Clonase II Enzyme Mix를 이용하여 목적 유전자를 목적 벡터(vector)에 삽입하였다. 이러한 방식으로 목적 유전자를 과발현하는 벡터를 제작하였다. att라 불리는 특이한 서열을 통한 위치 특이적 재조합(SSR, Site-specific recombination)을 이용한 것이다.
상기 재조합 벡터는 프로모터의 하위(downstream)에 리포터 유전자를 연결시켜 프로모터의 활성 정도를 측정할 수 있으며, 예를 들어 리포터 유전자로는 GUS를 이용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 GUS 리포터 유전자를 포함하는 pBGWFS7 벡터에 Os05g48650 프로모터를 삽입하여 제조한 재조합 벡터 Os05g48650 프로모터-GUS 발현 벡터를 예시하고 있으나, 본 발명은 이러한 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다. 상기 GUS 리포터 유전자는 프로모터의 활성 정도를 측정하기 위한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터에서 GUS 리포터 유전자 대신 식물 종자의 배에서 특이적 발현을 유도하기 위한 목적하는 외래 유전자를 도입할 수 있음은 자명한 것이다.
상기 일실시예에 따른 재조합 벡터는 외래 유전자를 식물 종자의 발아과정에서 배(embryo), 배반 및 호분층 조직에서 특이적으로 발현시킬 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 Os05g48650 프로모터를 포함한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 프로모터 도입에 의해 목적 유전자가 조직 특이적으로, 특히 식물체의 성숙 종자의 발아과정에서 배(embryo), 배반 및 호분층 조직에서 특이적으로 발현되는 것을 의미한다.
본 발명에서 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어 "형질전환체"란 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 의미한다.
상기 형질전환체는 미생물이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 사용하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 Os05g48650 프로모터 및 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물체 내로 도입함으로써 형질전환된 식물체를 제공한다.
상기 본 발명에 따른 형질전환된 식물체는 이 기술분야의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물은 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 이 기술분야에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 형질전환된 식물체를 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물체는 전체 식물체 뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 형질전환 식물체는 단자엽 식물일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 벼, 밀, 보리 또는 옥수수일 수 있으며, 보다 바람직하게는 벼(Oryza sativa)일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 Os05g48650 프로모터를 포함한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물 형질전환체인, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 벼(Oryza sativa)에 접종하여 형질전환 벼 식물체를 제작하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환 식물체로부터 수득한 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, Os05g48650 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 종자의 발달 단계에 따라 채취하여 GUS 염색법으로 분석한 결과, 성숙 종자의 발아과정에서 배(embryo), 배반 및 호분층에서 GUS 발현이 유도되는 특성이 있었으므로, 조직 특이적으로 발현됨을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터 및 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질이 형질전환 식물체의 종자, 바람직하게는 종자 발아 과정에서 배(embryo), 배반 및 호분층에서 특이적으로 발현된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 형질전환 식물체는 단자엽 식물일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 벼, 밀, 보리 또는 옥수수일 수 있으며, 보다 바람직하게는 벼(Oryza sativa)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, Os05g48650 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 다양한 조직을 채취하여 GUS 염색법으로 분석한 결과, 종자의 배(embryo), 배반 및 호분층에서만 GUS 발현이 강하게 유도되었으며, 다른 부위에서는 대부분 염색이 관찰되지 않았으므로, Os05g48650 프로모터가 식물 종자의 발아과정에서 배, 배반 및 호분층에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 식물체의 성숙 종자의 발아과정에서 배(embryo), 배반 및 호분층에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 식물 성숙 종자에서의 목적 단백질 특이적 발현용 Os05g48650 프로모터 및 목적 단백질을 암호화하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 벡터로 식물을 형질전환하여, 식물 성숙 종자의 발아과정에서 배, 배반 및 호분층에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 목적 단백질은 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 단백질의 일예로는, 인터루킨, 인터페론, 혈소판 유도 성장 인자, 헤모글로빈, 엘라스틴, 콜라겐, 인슐린, 섬유아세포 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 에리스로포이에틴 등이 있다.
본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 특정 부위, 예를 들면 종자, 잎, 뿌리 또는 줄기 등을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 특정 조직에서 발현시킴으로써 종자, 잎 또는 줄기와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:
벼 종자 발달 전사체 분석 및 전사인자 선발
식물 종자에서 특이적으로 발현되는 유전자를 선발하기 위하여, 벼 종자의 발달 단계에 따른 마이크로어레이(microarray) 분석을 통해 발달 과정에서 발현이 급증되는 유전자를 선발하고, 공공 데이터 분석을 통해 상기 선발한 유전자의 종자 발달 단계별 발현 정도를 분석하였다.
구체적으로, 고품벼에서 출수 후 종자 발달 단계에 따라 RNA를 분리하여 마이크로어레이 분석을 수행하고, 출수 후 25일째 유전자 발현이 10배 이상 증가하는 유전자군을 선발하였다(도 1의 A 및 도 1의 B). 선발된 전사인자에 대한 기능군 분류를 수행하고, 종자 발달 과정에서 유전자 발현이 크게 증가하는 전사인자 중에서 Os05g48650를 선발하였다(도 1의 C).
실시예 2: Os05g48650 유전자의 인실리코 (
in silico
) 발현 분석
상기 실시예 1에서 선발한 종자 발달 단계에 따라 특이적으로 발현이 증가하는 유전자 Os05g48650의 발현 양상을 2개의 공공 데이터베이스(RiceXPro; http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/ 및 Rice Oligonucleotide Array; http://www.ricearray.org/)를 이용하여 인실리코(in silico) 발현을 분석하였다.
분석 결과, 벼 종자의 배(embryo) 및 배유(endosperm)에서 Os05g48650 유전자의 발현이 특히 높은 것으로 예측되었다(도 2).
실시예 3: 게놈 DNA의 PCR에 의한 Os05g48650 유전자 프로모터 영역의 클로닝 및 염기서열 분석
식물 종자에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 선발하기 위해, 상기 실시예 1에서 벼 종자의 발달 단계에 따라 발현이 증가되는 유전자, Os05g48650 유전자를 선발하였으며, 이를 기반으로 종자, 특히 성숙 종자의 배 특이적 발현 프로모터, Os05g48650 유전자의 프로모터를 분리하였다.
실시예 3-1: Os05g48650 프로모터 영역의 PCR 증폭
벼의 종자에서 발현되는 Os05g48650 유전자의 프로모터 영역을 분리하기 위하여, 번역시작 상위염기서열 정보를 벼(Nipponbarre) 게놈 데이타베이스(genome database)에서 추출하고, 상기 단편을 증폭하기 위한 하기 표 1의 프라이머 세트를 디자인하여 합성하였다. 상기 합성한 프라이머 세트를 이용하여 동진벼의 잎에서 분리한 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하여 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR의 반응조건은 95℃에서 5분간 변성한 후, 95℃에서 30초, 54℃에서 30초, 72℃에서 90초를 총 35회(cycle) 반복하였으며, 마지막 단계로 72℃에서 5분간으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% 아가로즈에 전기영동 한 후 Os05g48650 프로모터로 추정되는 밴드를 잘라내어 정제한 후 클로닝(cloning)에 이용하였다. 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 1차 및 2차에 걸쳐 PCR을 수행하여 2,000bp의 프로모터 영역을 확보하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 프라이머 방향 | 염기서열(5'→3') |
| 2 | Os05g48650P-F1 | 정방향 | 5‘-TTGAAAATTTGGCCACTCGT-3‘ |
| 3 | Os05g48650P-R1 | 역방향 | 5‘-GGAGCCAGAGGTGGAACC-3‘ |
| 4 | Os05g48650P-F2 | 정방향 | 5‘-gccgcccccttcacc GATTAATTAGTGGTTAATATCG -3‘ |
| 5 | Os05g48650P-R2 | 역방향 | 5‘-tcggcgcgcccaccc tt CGCGGCGAGGCCGGTCG-3‘ |
실시예 3-2: Os05g48650 프로모터 영역의 클로닝(cloning) 및 염기서열 분석
상기 실시예 3-1에서 증폭된 Os05g48650 프로모터 영역의 PCR 산물을 게이트웨이 도너 벡터(gateway donor vector; pENTER/D-TOPO, Invitrogen)에 클로닝하고 전체 염기서열을 결정하였으며, 이에 따라 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 Os05g48650 프로모터 유전자를 확보하였다.
한편, 상기 니폰바레(Nipponbarre)의 게놈 데이터베이스(genome database)에서 추출한 Os05g48650 유전자의 프로모터 염기서열과 비교하였을 때 100% 일치하는 2,000 bp 크기의 프로모터임을 확인하였다(도 3).
실시예 3-3: Os05g48650 프로모터 영역의 모티프(motif) 검색
상기 실시예 3-2에서 확보된 Os05g48650 프로모터 유전자 내에 존재하는 반응조절인자를 확인하기 위해, New PLACE(database of plant cis-acting regulatory DNA elements: http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) 프로그램을 이용하여 유전자 발현 모티프를 분석하였다.
그 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, Os05g48650 프로모터 유전자 내에는 종자 혹은 배 특이적인 발현을 지시하는 motif (CANBNNAPA, DPBFCOREDCDC3, GCN4OSGLUB1, GLMHVCHORD) 및, GA 호르몬 신호전달에 관여하는 motif (GAREAT), ABA 호르몬 신호전달에 관여하는 motif (ABRELATERD1), auxin 호르몬 신호전달에 관여하는 motif (ARFAT)등이 존재함을 확인하였다. 이는 Os05g48650 프로모터가 종자 발아와 휴면 조절 및 성장에 관여하는 motif를 다수 포함하고 있음을 알려준다
| Element name | Motif sequence | Numbers | Positions |
| ABRELATERD1 | ACGTG | 2 | -805, -393 |
| ANAERO2CONSENSUS | AGCAGC | 4 | -1884, -1869, -740, -236 |
| ARFAT | TGTCTC | 1 | -1092 |
| CANBNNAPA | CNAACAC | 1 | -1200 |
| DPBFCOREDCDC3 | ACACNNG | 3 | -1453, -1299, -162 |
| GAREAT | TAACAAR | 1 | -671 |
| GARE2OSREP1 | TAACGTA | 1 | -1538 |
| GCN4OSGLUB1 | TGAGTCA | 1 | -1528 |
| GLMHVCHORD | RTGASTCAT | 2 | -1529, -1529 |
| HEXMOTIFTAH3H4 | ACGTCA | 4 | -804, -495, -395, -207 |
| LTRECOREATCOR15 | CCGAC | 1 | -1381 |
| MYBCOREATCYCB1 | AACGG | 1 | -659 |
| MYBGAHV | TAACAAA | 1 | -671 |
| RYREPEATBNNAPA | CATGCA | 1 | -148 |
| TATCCACHVAL21 | TATCCAC | 1 | -1401 |
실시예 4: 형질전환 벡터(vector) 및 형질전환체 제작
실시예 4-1: Os05g48650 프로모터 운반체 제작
상기 실시예 3-1에서 분리한 Os05g48650 유전자의 프로모터를 이용하여 리포터(repoter) 유전자 GUS를 발현시키기 위하여 재조합 발현 벡터를 구축하였다.
구체적으로, 게이트웨이 프로모터 발현용 pBGWFS7 벡터(PSB사, Plant System Biology)에 상기 프로모터가 삽입된 재조합 벡터(Os05g48650 프로모터-GUS 발현 벡터)를 제작하였다(도 4).
실시예 4-2: 아그로박테리움(
Agrobacterium tumefaciens
) 형질전환체 제작
상기 실시예 4-1에서 제작된 Os05g48650 프로모터 발현 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(LBA4404)에 형질전환하기 위하여, 동결-해동(freeze-thaw) 방법을 사용하여 형질전환하였다.
구체적으로, 동결과 해동(freeze and thaw)을 2 내지 3번 반복한 후, 37℃의 열충격(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 YEP 배지(Yeast extract 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g/1L)에서 철야배양(overnight)하여 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K2HPO4 60g, NaH2PO4 20g/1L), AB Salts(NH4Cl 60g, MgSO47H2O 6g, KCl 3g, CaCl22H2O 0.265g, FeSO4.7H2O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.
실시예 5:
아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환체 제작 및 분석
실시예 5-1: 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환체 제작
Os05g48650 프로모터의 기능을 연구하기 위하여, 상기 실시예 4-2에서 제작한 Os05g48650 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 LBA4404를 이용하여, 동진벼의 캘루스(callus)에 접종하여 감염시킨 후, PPT(phosphinothricin, 포스피노트리신) 6㎍/L의 조건에서 형질전환체를 선발하고, 최종적으로 상기 선발된 형질전환체를 온실에서 생육하여 형질전환된 벼를 제조하였다.
구체적으로, 아그로박테리움에 의한 벼 형질전환은 2N6 배지에서 동진벼의 캘러스를 유도하기 위하여 종자를 락스에 세척한 후 적당히 건조시켜 2N6 배지 (Duchefa 사 vitamin 포함 배지)에 2,4-D 호르몬이 2 mg/L 첨가된 배지에 치상하였다. 27℃에서 3 내지 4주간 암배양하여 캘러스를 유도한 후, 2N6 새 배지에 배형성 캘러스(embryogenesis callus)를 배양(sub-culture)하였다. 형질전환 유전자를 포함하는 아그로박테리움 형질전환된 유전자를 AB 액체배지에 배양한 후 배형성 캘러스와 20분간 공배양(co-culture) 시킨 후 3일간 암 배양하였다. 멸균수에 세포탁심(cefotaxime)을 첨가하여 아그로박테리움이 완전히 제거될 때까지 씻은 후 다시 2N6 배지에 세포탁심(cefotaxime)과 PPT(포스피노트리신, phosphinothricin)가 6 ㎍/L로 첨가된 배지에서 3주간 암 배양하였다. 세포탁심(cefotaxime)과 PPT가 첨가된 2N6배지에서 갈변되지 않고 살아남은 캘러스를 다시 세포탁심(cefotaxime)과 PPT가 첨가된 2N6 배지에 옮겨 2주간 암 배양하였다. 캘러스에서 슈팅(shooting) 유도를 위해 세포탁심(cefotaxime)과 PPT가 첨가된 MSR 배지(Duchefa MS 배지에 Maltose와 Sorbitol 첨가)에 옮겨 4주간 양 배양하여 슈팅된 후 발근이 되면 온실로 옮기기 이전에 순화처리를 실시하였다.
실시예 5-2: Os05g48650 프로모터 삽입 벼 형질전환체 분석
상기 실시예 5-1에서 Os05g48650 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 형질전환체를 이용하여 제작한 형질전환 벼에, Os05g48650 프로모터 발현 벡터가 제대로 삽입되었는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-1에서 제작한 Os05g48650 프로모터가 도입된 벼 형질전환체의 게놈(genomic) DNA를 분리하여 PCR 분석을 수행하였다.
구체적으로, Inclone Genomic DNA prep kit(Inclone Cat# IN1003-0200)을 사용하여 상기 Os05g48650 프로모터가 삽입된 형질전환 벼의 잎에서 게놈 DNA를 추출하고, 상기 단편을 증폭하기 위한 도입 벡터에 존재하는 베타-글루코로니다아제 A(beta-glucuronidase A, GUSA) 부분과 Os05g48650 프로모터 부분에 대한 하기 표 3의 프라이머 세트를 디자인하여 합성하였다. 상기 합성한 프라이머 세트를 이용하여 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이때 PCR은 PCR 증폭 조건으로 95℃에서 5분간 가열한 다음, 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분 가열하는 단계로 구성된 일련의 과정을 총 35회(cycle) 반복한 후, 이를 72℃에서 5분간 더 가열하는 조건으로 진행하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 PCR 산물은 전기영동 장치를 이용하여 1% 아가로즈 겔 상에 전개한 후 UV 하에서 전개된 반응 산물의 밴드를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군으로 사용한 원품종(wild type)인 동진벼(DJ)에서는 PCR 증폭 산물이 나타나지 않은 데 반해, Os05g48650 프로모터 발현 벡터가 삽입된 형질전환 벼(T143-2 및 T144-5)에서는 PCR 증폭 산물 밴드가 뚜렷하게 나타남을 확인할 수 있었다(도 5).
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 염기서열(5'→3') |
| 6 | GUSA-Anti | 5'-CGCGATCCAGACTGAATGCCC-3' |
| 7 | Os05g48650P-1604F | 5’-CGATGACGTGACATGTATGAACAGG-3′ |
이러한 결과를 통하여, Os05g48650 프로모터 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 형질전환체를 이용하여 생산한 형질전환 벼에, Os05g48650 프로모터 발현 벡터가 제대로 삽입되었음을 알 수 있었다.
실시예 6: Os05g48650 프로모터의 조직 발현 검정을 위한 형질전환 벼의 GUS 염색 분석
상기 실시예 5-2에 따라 Os05g48650 프로모터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 종자를 발달 단계에 따라 채취하여 GUS 단백질 염색법으로 분석하였다. 이때, 조직을 투명화하여 염색 부위를 관찰하였으며, Os05g48650 프로모터가 작동되는 부위는 GUS 염색에 의해 파란색으로 염색되었다.
그 결과 성숙종자의 배, 배반 및 호분층에서 GUS 발현을 유도하는 특성이 있는 것을 확인하였다 (도 6A). 또한 종자가 발아함에 따라서 호분층에서 GUS 발현이 증가하였고, 특히 종자의 등 쪽에 위치한 관다발 조직의 아래쪽에 위치한 호분층에서 GUS 발현을 강하게 유도하는 고유한 특성이 있는 것을 확인하였다 (도 6B, 6C). 이 부분은 종자에서 물질과 이온의 수송통로가 되는 ETC (endosperm transfer cell)이 발달하는 것으로 알려져 있다 (Plant Mol Biol (2011) 76:47-56). 반면 유식물의 줄기와 뿌리 및 성숙한 벼의 잎과 마디에서는 GUS 염색이 전혀 관찰되지 않았다 (도 6D). 따라서 Os05g48650 프로모터가 벼 종자에서 목적유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 증명하였다.
<110> Republic of Korea
<120> Promoter specific for plant seed embryo and uses thereof
<130> P18R12C1460
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 2000
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
gattaattag tggttaatat cgaaatagtc attgtcaacc gtatcagtta ttcaaaaagg 60
gaggtagtaa taccagtgat gatcaggtaa gctttggcat gcggttggta caaccaagca 120
gccaaatgag gagcagctaa ctgacaaaga agcagtaagc tctgaagtcc aaaacctttg 180
tactccctcc gtcctataat ataagggatt ttgagttttt acttataacg tttgaccact 240
cgtcttattt aatttttttt aaattattat ttattttatt tatgacttac tttattatct 300
acagtacttt aagcacaact tttcattttt tatatttgta aaaaaaattt aaataagatg 360
agtggtcaaa cgttacaaat aaaaacttaa aatctcttat attgtgggac ggagggagta 420
tacttgtata aagcaaaagg gcaaagtcag agcaaaactc tatacgttaa catgagtcat 480
gagagcaagg tggccttggt caggtaaggc cacgccgcca tattcgacat agagaactcc 540
attattgaca ccagaaagca caatattaat ctgacctcgt gagcagtagc agacaacagt 600
atccacattg tcgcacactc cgacttagcc cccccaaaat gttcctatcc tcacaagtca 660
caccaccaga aaaaccatat gccccatttt taatctgcag aacacatgat ctgtgtgcga 720
tgttcttgaa gctacggact ccatcccgaa catctgcagc cagccagatg gaacccagcc 780
aaaaaggcgt tgctcaggtg gtgtttggat ccatgaactt agctttagtc catatattta 840
gacactaatt tagagtatta gatatagact acctacaaaa ctaattacat aaatgaaagc 900
taattcgtga gacaaatttt ttaagcctaa ttaatctata attagagaat gtttactgta 960
gcatcatata ggctaattat ggattaatta gactcaatag attcgtcgct cgaattagtc 1020
caagattatg gatgggtttt attaatagtc tacgtttaat atttatagtt agtgtccaaa 1080
tatccgatat gatagtaact tgaaagtttt agtccaatct aaatagggtc tcagaccggc 1140
caaaactccc atgtgcatca atgatttttg atcggtttcc cggctggtca tcgctcacgt 1200
caggcgacag atatttccag gcccaaatga tcatcgcctc gtcagtttaa ttttgggttt 1260
gctgctgcaa attaatcgag cattgttagt agcagtattg aacgtagcat tagtactctt 1320
tctgtttctt aacaaatgat accgttgact ttctaacata aatatagtta ttcgtttggt 1380
ttaaaatttt ataaaaataa attatattta aagtatttta agtgataaaa caacttcaac 1440
aaataaatta taattatgta aatttttaag taagacgaat atttaaaggt gtgataaaaa 1500
agtaatgacg tcgtatgctg aaaaaatgag ttatacatca ttttcgcaag ctcaaatcaa 1560
atcccatcca tttcgtgcaa gatttgggca acgaacgatt gccgatgacg tgacatgtat 1620
gaacaggagg gcagtattgc agtagaatat tgctcgcgtg atcgttgaga ggggaaaaag 1680
aagaggaaag aagaaaaagc actgaccttt gggcaggcca ggcgggcacc ccactggcgg 1740
ttgggccaca tgtcattggc tcccagcagc cagccaccct cgccgcggcg tcgtgacgtc 1800
gtcgccgctc gcggccggtc tcttctgctc agtggctcac acatgggcct cctgcatgcg 1860
cgccacctat cgcctcctca tacgccgccg cggcgcgccc ccgcgaccgt ccgttcgtcc 1920
cgaatccacg gccctggatc cccttctccc gccgcctata aaatccccac cggcctcgcg 1980
cgccgaccgg cctcgccgcg 2000
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Os05g48650P-F1
<400> 2
ttgaaaattt ggccactcgt 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Os05g48650P-R1
<400> 3
ggagccagag gtggaacc 18
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Os05g48650P-F2
<400> 4
gccgccccct tcaccgatta attagtggtt aatatcg 37
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Os05g48650P-R2
<400> 5
tcggcgcgcc cacccttcgc ggcgaggccg gtcg 34
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GUSA-Anti
<400> 6
cgcgatccag actgaatgcc c 21
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Os05g48650P-1604F
<400> 7
cgatgacgtg acatgtatga acagg 25
Claims (9)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 식물 종자의 배(embryo), 배반 및 호분층 중 하나 이상에서 유전자 발현을 유도하는 프로모터.
- 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 벼(Oryza sativa L.)로부터 분리된 것인 프로모터.
- 제1항의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 식물 종자의 배(embryo), 배반 및 호분층 중 하나 이상에서 유전자 발현 유도용 조성물.
- 제3항의 조성물로 형질전환된 형질전환 식물체.
- 제4항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 단자엽 식물체인 것인 형질전환 식물체.
- 제5항에 있어서, 상기 단자엽 식물체는 벼(Oryza sativa)인 것인 형질전환 식물체.
- 제4항에 따른 형질전환 식물체로부터 수득한 형질전환된 종자.
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터 및 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질이 형질전환 식물체의 배(embryo), 배반 및 호분층 중 하나 이상에서 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체의 제조 방법.
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프로모터 및 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 제조된 재조합 벡터로 식물체를 형질전환하여, 형질전환 식물체의 배(embryo), 배반 및 호분층 중 하나 이상에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020180160106A KR102081963B1 (ko) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180160106A KR102081963B1 (ko) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도 |
Publications (1)
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| KR102081963B1 true KR102081963B1 (ko) | 2020-02-26 |
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ID=69637995
Family Applications (1)
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| KR1020180160106A KR102081963B1 (ko) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도 |
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Citations (1)
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| KR100429335B1 (ko) | 2001-10-08 | 2004-04-29 | 주식회사 그린진 바이오텍 | 단자엽 식물의 형질전환을 위한 프로모터 |
-
2018
- 2018-12-12 KR KR1020180160106A patent/KR102081963B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100429335B1 (ko) | 2001-10-08 | 2004-04-29 | 주식회사 그린진 바이오텍 | 단자엽 식물의 형질전환을 위한 프로모터 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Akula Dinesh 등. Advances in Research. Vol. 9, No. 1, 페이지 1-8 (2017.03.18.) * |
| Genbank Accession number AP014961 (2015.10.10.) * |
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Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20181212 |
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