KR101459546B1 - 공변세포 특이적 목적 단백질 발현용 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 잎에서 목적 단백질을 특이적으로 발현하는 SLAC1 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것으로 보다 상세하게는 단자엽 식물의 공변세포에서 특이적으로 발현하는 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 SLAC1 프로모터는 목적 단백질이 식물의 공변세포에서 특이적으로 발현하는 것을 조절할 수 있고, 식물의 성장과 발달에 유익하거나 각종 환경 스트레스 저항성을 증진시키기 위한 유전자가 공변세포에서 특이적으로 발현하는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

공변세포 특이적 목적 단백질 발현용 프로모터{Promoter producing a target protein specifically in plant guard cells}

본 발명은 식물의 잎에서 목적 단백질을 특이적으로 발현할 수 있도록 하는 프로모터에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 식물의 잎의 공변세포, 특히 단자엽 식물의 공변세포에서 목적 단백질의 특이적 발현을 유도할 수 있는 SLAC1 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이를 이용하여 제조한 형질전환체 및 이를 이용하여 목적 단백질을 유도하는 방법에 관한 것이다.

최근 생명공학의 발전으로 바람직한 유전자를 식물에 직접 도입하는 시스템이 농작물에도 적용됨으로써 종래의 육종에 있어서의 문제점들을 해결할 수 있게 되었다. 이 시스템에서는 외래유전자가 식물에 정확하게 도입되면 그 예정된 조직에서 곧바로 충분히 발현될 수 있다. 외래유전자의 발현을 위해서는, 조직 특이적 프로모터를 외래 유전자에 결합시킴으로써 유전자가 이 프로모터의 조절 하에서 발현 가능하도록 조작하여야 한다. 따라서 유전자 발현을 조절할 수 있는 특정 프로모터에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있다.

한편, 식물이 저수분(가뭄), 고염(염해), 저온(냉해), 등의 환경 스트레스에 대하여 자체적 저항성을 보이게 되는 메카니즘은 식물분자생물학의 큰 분야로서 매우 많은 연구가 진행되어 왔다(Xiong et al., PlantCell S165-S183, 2002). 이 저항성 반응은 잎에 분포하는 두 개의 반달형 공변세포(guard cells)가 이루는 기공(stomata)들의 역할이 결정적인 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 기공이 닫히면 식물체 내의 수분이 증발하는 증산작용(transpiration)을 억제하여 환경 스트레스를 받을 때 체내 수분을 유지할 수 있도록 한다(Roelfsema andHedrich, New Phytologist 167: 665-691, 2005).

공변세포가 환경 스트레스의 신호를 받아들여 기공의 개폐를 조절하는 메카니즘과, 이에 관여하는 많은 유전자들이 다수 밝혀져 있다(Fan et al., Curr. Opin. Plant Biol. 7: 537-546, 2004). 그리고 학술적 연구를 통하여 밝혀진 세포 신호전달 과정 및 유전자 발현 조절 메카니즘을 인위적으로 조절하여 가뭄 등 환경 스트레스에 대하여 저항성을 갖는 식물체를 개발하고자 하는 연구가 오래 전부터 진행되어 왔다.

이에 본 발명자들은 목적 단백질을 공변세포에서 특이적으로 발현시키는 신규 프로모터에 대한 연구를 거듭한 결과, 식물의 잎의 공변세포, 특히 단자엽 식물잎의 공변세포에서 목적 단백질을 특이적으로 발현하는 프로모터를 찾아내고 이를 이용한 벡터 및 형질전환체를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는 식물의 잎의 공변세포, 특히 단자엽 식물의 잎의 공변세포에서 특이적으로 단백질을 발현하는 프로모터를 활용하여 식물의 생산성 증대에 활용하고자 하였다. 즉, 벼의 음이온 채널(anion channel)중 하나인 SLAC1 유전자에서 유래된 프로모터를 포함한 벡터 및 형질전환체를 제작하여 목적 유전자가 잎의 공변세포에서 특이적으로 발현될 수 있도록 하였다. 이를 이용한, 식물의 성장과 발달에 유익하고 각종 환경 스트레스에 대해 저항성을 증진시키기 위한 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 위와 같은 과제를 달성하기 위해 다음과 같은 과제 해결 수단을 제공한다:

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는, 식물의 잎에의 목적 단백질 특이적 발현용 SLAC1 프로모터.

2. 위 1에 있어서, 상기 식물의 잎은 공변세포인 것을 특징으로 하는 SLAC1 프로모터.

3. 위 1의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터.

4. 위 3에 있어서, 위 1에 따른 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 발현 벡터.

5. 위 3에 있어서, 상기 벡터는 오퍼레이터, 폴리아데닐화 신호, 인핸서, 분비 신호, 선택 마커 및 복제 기원으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.

6. 위 3의 벡터로 형질전환된 형질전환체.

7. 위 6에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환체.

8. 위 6에 있어서, 상기 형질전환체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환체.9. 위 8에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 형질전환체.

10. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 식물의 잎에의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 식물을 형질전환하여 식물의 잎에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법.

11. 위 10에 있어서, 상기 식물의 잎은 공변세포인 것을 특징으로 하는 방법.

12. 위 10에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.

13. 위 12에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 방법.

본 발명에 따르면, SLAC1 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 제작된 형질전환체를 식물의 공변세포에 위치 특이적으로 발현시킴으로써 식물의 성장 및 발달에 유익한 유전자의 발현을 조절하거나 식물의 저수분(가뭄), 고염(염해), 저온(냉해) 등의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 것이 가능하므로 작물의 생산성을 증대시키는 것이 가능하다.

도 1은 본 발명의 프로모터 분석을 위하여 리포터 유전자 GUS를 포함하고 있는 식물 형질전환 벡터의 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 프로모터를 포함한 발현벡터가 도입된 형질전환 벼 식물체의 잎이 GUS염색에 의해 염색된 모습을 나타낸 것이다.
도 2b 및 도 2c는 본 발명의 프로모터를 포함한 발현벡터가 도입된 형질전환 벼 식물체의 공변세포가 GUS염색에 의해 염색된 모습을 나타낸 도면이다.
도 2d 및 도 2e는 본 발명의 프로모터를 포함한 발현벡터가 도입된 형질전환 벼 식물체의 꽃을 GUS염색한 모습을 나타낸 도면이다.

본 발명은 식물의 잎에서 목적 단백질을 특이적으로 발현하는 SLAC1 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것으로 보다 상세하게는 단자엽 식물의 공변세포에서 특이적으로 발현하는 프로모터, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SLAC1 프로모터는 목적 단백질이 식물의 공변세포에서 특이적으로 발현하는 것을 조절할 수 있으므로 식물의 성장과 발달에 유익하거나 각종 환경 스트레스 저항성을 증진시키기 위한 유전자가 공변세포에서 특이적으로 발현하는 것을 유도할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는, 식물의 잎에서 목적 단백질이 특이적으로 발현하도록 유도할 수 있는 위치 특이적 프로모터에 관한 것이다.

본 발명의 위치 특이적 프로모터는 벼의 음이온 채널(anion channel) 중 하나인 SLAC1(Slow anion channel-associated 1) 오쏠로그(orthologue) 유전자에서 유래되었다.

본 발명에 있어서“오쏠로그(orthologue) 유전자”란 하나의 조상으로부터 유래하여 서로 다른 생물종으로 진화가 진행되면서 유전자 변이가 일어나 유전자 서열이 변화된 유전자를 지칭한다.

본 발명의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있으며, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

본 발명에 있어“상동성”이란 야생형(wild type) 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 발명의 프로모터는 식물의 잎에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 식물의 잎 중에서 공변세포에서, 더욱 바람직하게는 단자엽 식물의 잎 중에서 공변세포에서 특이적으로 목적 단백질을 발현시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 벼를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자가 벼의 잎에서 특이적으로 발현되었고, 특히 잎의 공변세포에서 특이적으로 발현됨을 확인하였다. (도 2a 내지 도 2e)

본 발명의 위치 특이적 프로모터는 통상의 재조합 발현 벡터의 프로모터로 작용할 수 있다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "재조합 발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 리포터 유전자를 포함할 수 있고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 당업계에 알려진 다양한 구조 유전자를 포함할 수 있으며, 이러한 구조 유전자는 당업계에 알려진 다양한 프로모터와 작동 가능하게 연결된다.

본 발명에서“프로모터”란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위(downstream) 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에서“작동 가능하게 연결된다(operably linked)”는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말하며, 일반적 기능을 수행하도록 염기 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

또한, 상기 구조 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein, AY598428) 유전자, GUS(β-glucuronidase, AF485783) 유전자, GAL(β-galactosidase, AAB49721) 유전자 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 재조합 발현 벡터는 게이트웨이 시스템을 이용하여 프로모터 발현용 pBGWFS7 벡터에 리포터 유전자 GUS를 작동 가능하게 연결시켜 제작하였다.

또한, 본 발명은 본 발명의 SLAC1의 프로모터를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함되며, 예를 들어 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 조, 수수, 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스일 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물은 바람직하게는 단자엽 식물이고, 더욱 바람직하게는 벼, 보리, 밀, 옥수수, 조 또는 수수일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 SLAC1의 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 구조 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 식물을 형질전환하여 식물 세포에서 상기 구조 유전자의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다.

상기 SLAC1의 프로모터는 상기 언급한 식물 조직에서 특이적으로 발현되며, 특히 공변세포에서 특이적으로 목적하는 구조 유전자의 발현을 유도할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. Genomic DNA 의 PCR 에 의한 OsSALC1 프로모터 영역의 cloning 및 염기서열 분석

1) Motif 검색 및 프로모터 영역의 PCR 증폭

PLACE (a database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements) 프로그램을 이용하여 상기 유전자의 프로모터 부위의 모티프(Motif)를 검색하고 TATA box 등의 주요 모티프를 포함하는 충분한 영역이 증폭 되도록 약 1.5Kb의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 프라이머를 디자인한 후, PCR을 통해 상기 유전자의 프로모터 영역을 분리하였다.

벼의 잎에서 총 DNA를 추출 (Qiagen 사, DNeasy Plant Mini kit 사용)하여 상기 유전자의 프로모터 영역으로 예상되는 약 1378bp 정도의 단편을 증폭하기 위한 프라이머를 디자인하여 센스 프라이머 OsSLAC1 promoter-Forward (서열번호 2: 5'- CACC CCT TAT ACA TTG TAG GCA CAA GCA TCA CAG TCC CAA AGG-3')와 안티센스 프라이머 OsSLAC1 promoter-Reverse (서열번호 3: 5'- CCT GCC GCT TGA TAG TTG ATA CTA CGT ACG TGA GCT CCC-3')을 합성하여 Invitrogen사의 Pfx 폴리머라제와 함께 PCR 반응액에 넣어 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 이용된 PCR 반응조건은 95℃에서 10 분간 변성한 후 95℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 2분을 30회 반복한 후 다시 확장 반응을 위하여 68℃에서 5 분간 처리하였다. PCR 반응이 끝난 후 증폭된 유전자를 1% 아가로스에 전기영동 한 후 상기 프로모터로 추정되는 밴드를 아가로스 젤에서 잘라내어 QIAquick 젤 추출 키트를 이용하여 정제한 후 토포(topo) 클로닝에 이용하였다.

2) 게이트웨이 도입 벡터( Gateway entry vector )인 pENTR D- topo 벡터( Invitrogen 사, direct entry TOPO Cloning vector kit ) 에 클로닝

증폭된 유전자를 상온에서 30분 토포 반응을 시킨 후 DH5알파 균주에 열 충격(heat shock) 방법으로 형질 전환하여 LB배지에 플레이팅하여 얻어진 콜로니를 선발하여 콜로니 PCR을 실시하였다. 그 결과 밴드가 확인된 콜로니의 플라스미드를 추출하여 염기서열 결정 (sequencing)에 이용하였다.

3) 염기서열 분석

ABI 3700 시퀀서(sequencer)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.

실시예 3. 게이트웨이 시스템을 이용한 벡터 제작 및 형질전환

1) 상기의 OsSLAC1 유전자 프로모터 운반체 제작

상기 실시예 2에서 분리한 OsSLAC1 유전자의 프로모터를 이용하여 리포터 유전자 GUS를 발현시키기 위하여 재조합 발현 벡터를 구축하였다. 이를 위해 먼저, 벨기에의 겐트대학으로부터 구입한 게이트웨이 프로모터 발현용 pBGWFS7 벡터에 상기 프로모터가 삽입된 재조합 벡터를 제작하였다.

먼저 LR(Invitrogen 사) 반응하여 목적 벡터인 pBGWFS7 벡터 (PSB 사, Plant System Biology)에 형질 전환하였다. 콜로니 PCR과 시퀀싱으로 유전자를 확인한 후 벼에 형질전환하기 위하여 먼저 아그로박테리움(Agrobacterium)에 형질전환하였다.

완성된 이원벡터(binary vector)를 아그로박테리움(LBA4404)에 형질전환하기 위하여 얼림과 녹임을 2-3번 반복 한 후, 37℃의 열 충격 방법에 의해 형질전환하여 YEP배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L) 에서 이틀 동안 배양하여 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지 (AB buffer(K₂HPO₄ 60g, NaH₂PO₄ 20g/1L), AB Salts(NH₄Cl 60g, MgSO₄ㆍ7H₂O 6g, KCl 3g, CaCl_{2 ㆍ}2H₂O 0.265g, FeSO₄.7H₂O 50mg/1L), Glucose 5g/1L>)에서 배양하였다.

2) 벼 형질전환

벼 형질전환에 사용하는 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용한다. 볍씨를 70% ethanol에서 1분간 침지시킨 후 락스를 50% 소독한 용액에서 40분간 소독한다. 이때 락스 30mL당 10uL Tween 20을 떨어뜨린 것을 사용하는 것이 더 바람직하다.

소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척한다. 소독액이 잘 세척이 되면 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 후 2N6 배지에 볍씨를 치상한다. 이때 볍씨는 배지 안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하며 씨눈은 위로 향하도록 한다. 2N6 배지는 문헌에 기재한 배지에 일부 수정된 배지로 만든다. (문헌 [Hiel et al., 1994]). 즉 N6 배지 (Chu et al., Scin Sin(1975)18:659-668)의 다량원소, 미량원소, 비타민을 함유한 혼합물 4g/L와 30g/L sucrose, 0.5g/L proline, 0.5g/L glutamine, 0.3g/L casamino acids, 0.01g/L myo-inositol, 2mg/L 2,4-D, 4g/L phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)이다. 배양온도는 28℃이며 암처리한다.

2N6에서 5일간 배양하며, 캘러스가 유도되면 배유를 제거한다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어야 캘러스가 훼손되는 것을 방지한다.

아그로박테리움은 목적 유전자가 삽입된 것을 준비하여 AB 고체 배지에 3일간 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 만든다. 흡광도기계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하며 먼저 OD₅₉₅=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD₅₉₅=0.01이 되도록 만든다.

현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분간 침지시켜 아그로박테리움을 접종하며, 2분 동안 부드럽게 용액을 흔들어 주는 것이 바람직하다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리며 여과지를 이용하여 여액을 제거한다. 이 작업은 신속히 진행하며 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의한다. 캘러스는 2N6-AS 배지에 옮겨서 공동배양한다. 2N6-AS배지는 2N6 배지에 10g/L glucose와 100uM acetosyringone을 추가하여 만든 배지로 pH5.2로 조정한다.

배지 위에는 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 접종이 끝난 캘러스를 여과지 위에 올려놓는다. 여과지는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 공동배양은 25℃에서 7일간 암배양 한다.

공동배양이 끝나면 캘러스에 유용 유전자를 삽입하는 기능을 맡았던 아그로박테리움이 더 이상 필요 없으므로 세척 작업을 통해 제거 한다. 세척은 멸균증류수 1L에 항생제인 carbenicillin을 500mg을 넣은 용액으로 수행하며, 캘러스를 3회 정도 세척한 뒤 여과지를 사용하여 여액까지 모두 제거한다. 아그로박테리움 LBA4404 균주를 사용하는 경우에는 공동배양 기간동안 아그로박테리움의 과도한 성장이 이루어지지 않았기 때문에 위의 세척 작업을 하지 않는 것이 더 바람직하다.

캘러스는 2N6 배지에 항생제인 cefotaxime 200mg/L, Hygromycin 40mg/L가 첨가된 2N6-CH 배지로 옮긴다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2~3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양한다. 배양온도는 28℃가 적당하며 암배양기에서 14일간 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도한다.

14일 후, 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양한다. 형질전환된 캘러스의 구분은 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 판단하며 갈변되어 죽은 캘러스는 버린다. MSR 재분화 배지에서 성장한 유 식물체는 수도용 상토로 옮겨 온실에서 생육하였다.

실시예 4. 상기 프로모터의 GUS 염색에 의한 발현 분석

GUS염색에 의한 프로모터 영역의 조직화학(Histochemistry) 검정은 2주간 키운 유식물 형질전환체를 이용하여 프로모터의 발현을 분석한 결과를 통하여 이루어졌다.

도 2a를 참조하면, OsSLAC1 프로모터가 작동되는 부위는 GUS염색에 의해 파란색으로 염색되는데, 2주차된 벼 유식물(seedling)의 잎이 파란색으로 염색된 것으로 볼 때, OsSLAC1 프로모터는 목적 유전자를 잎에서 발현시키는 것을 알 수 있었다. 또한 도 2b 및 도 2c를 참조하면, 가시적으로 잎 중에서도 특히 잎의 공변세포가 파란색으로 염색된 것으로 볼 때, OsSLAC1 프로모터는 목적 유전자를 잎 중에서도 특히 공변세포에서 특이적으로 발현시키는 것을 알 수 있었다. 그러나, 도 2d 및 도 2e를 참조하면, 벼의 꽃은 염색이 제대로 이루어지지 않았다.

이를 통하여 OsSLAC1 프로모터는 대표적인 단자엽 식물인 벼에서 목적 유전자를 공변세포에서 특이적으로 발현시킬 수 있음을 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Promoter producing a target protein specifically in plant guard cells <130> P12-097 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1378 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 acccaatcta atgtaagagg cacttcagct ggtcaaatgg ccaatgcaac tgcttctatg 60 ccaggcctga aacaaaagca tcagctgccc cagcctacgg cactttcgaa agaggtgtgt 120 tatatgtagc attatggcaa caatattaca cttggagtgg ttttcaagta gacgaatata 180 ttatgacatt tatacctttt tatactgtta attaggagga acgacaaagg aaactcgccg 240 aggaaagaga gaaaagagca gccgcagccg aaagaagatt tgcggctctg gcggcacaat 300 caagtagcac atcagggaca gcagcagcag aacatccccc acagagagca gccgcggcag 360 acgatacttc ttgttcgtgc tgtttttctt ccttggtcgg caaagtacca ttccacaggt 420 acaattacaa gtactgcagc accacatgta tgcatcttca ttcagaaatg ctggaagatg 480 attgaggaaa tcaggaaatt gtatgacgag agacatgaga tttaattata cctttcacct 540 gtttttctta tgcatgagat tcaataacag gtctatctac cagtcttgct taatctttag 600 ctaatccgaa tcttgttaca aatttccaaa ttccgaggga tattgtttgt ggttcctgga 660 tgatacatgt atccagcact tcctgggtac tggcaatctt tttagttccg tgggtttgca 720 acagtttaaa actaaaagaa acacattcat tgagccaaag tgagaatcgc tctttgcctc 780 tttctggtac tagttggagc taatctagac ctcatgttta atcttaagct gtcctttttc 840 atgccgagtc agagtttcat agtccccccg tgatcatctt tttttttgcc aaaatgccaa 900 cctcgaacag caagcaggca gccttcggct gttgacggcc tcttcctttc acagatcata 960 tgcttaggaa aaccacagct tttgtgcgga tttcatgacc tacacgacga cggggcacac 1020 cgcacaccca atggattcct catctcgtga cctcgcgcca ttgatttctt cctctggagc 1080 aaaaggcatg gctagcaatc catctccttc acatcgacca accacctgga cagcaatggc 1140 ttccgccgcc taatgcctct ccatgcacgc acgccgcgac gccacacgtg aaagctccca 1200 cctagggatg caagtgggta gtggaaacta cccgcataaa aacccatttg ctaatttatt 1260 tttcacatgc tgatacaaaa tttaaaagaa aaaataaact agaagtgaga taagcgggct 1320 aaaataaccc gcttgccacc gatcggagct tatattggcc tctaccatct tagttctt 1378 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsSLAC1 promoter-Forward primer <400> 2 caccccttat acattgtagg cacaagcatc acagtcccaa agg 43 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsSLAC1 promoter-Reverse primer <400> 3 cctgccgctt gatagttgat actacgtacg tgagctccc 39

Claims (13)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 단자엽 식물의 잎에서의 목적 단백질 특이적 발현용 음이온 채널(SLAC1, SLOW ANION CHANNEL-ASSOCIATED 1) 프로모터.
2. 제1항에 있어서, 상기 단자엽 식물의 잎 중 공변세포인 것을 특징으로 하는 음이온 채널(SLAC1, SLOW ANION CHANNEL-ASSOCIATED 1) 프로모터.
3. 제1항 또는 제2항의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터.
4. 제3항에 있어서, 상기 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜 제조된 재조합 발현 벡터.
5. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 오퍼레이터, 폴리아데닐화 신호, 인핸서, 분비 신호, 선택 마커 및 복제 기원으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
6. 제3항의 벡터로 형질전환된 형질전환체
7. 제6항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
8. 제6항에 있어서, 상기 형질전환체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
9. 제8항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
10. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 단자엽 식물의 잎에서의 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 식물을 형질전환하여 단자엽 식물의 잎에서 목적 단백질의 발현을 유도하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 단자엽 식물의 잎 중 공변세포인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 삭제
13. 제10항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 방법.

Images