KR101898257B1 - 환경 스트레스 특이적 감자 유래 pStNF-YA7 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

환경 스트레스 특이적 감자 유래 pStNF-YA7 프로모터 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환경 스트레스 특이적 감자 유래 pStNF-YA7 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현 증가를 유도하는 pStNF-YA7 프로모터, 상기 프로모터와 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 및 상기 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 감자 유래 pStNF-YA7 프로모터는 염, 건조 등의 환경 스트레스에 의해 기능이 향상되어 목적 단백질의 발현을 증가시키는 효과를 나타내므로, 환경 스트레스에 대한 저항성이 증진된 작물의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

환경 스트레스 특이적 감자 유래 pStNF-YA7 프로모터 및 이의 용도{pStNF-YA7 promoter from Solanum tuberosum specific for environmental stress and use thereof}
본 발명은 환경 스트레스 특이적 감자 유래 pStNF-YA7 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현 증가를 유도하는 pStNF-YA7 프로모터, 상기 프로모터와 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 및 상기 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조 방법에 관한 것이다.
식물체의 생장은 환경 스트레스에 매우 큰 영향을 받는다. 그 중에서도 건조 스트레스(dryness stress, drought stress)와 염 스트레스(salt stress)는 농작물의 생장 및 생존을 위협하는 가장 주요한 요인이다. 관개시설이 설비된 곳이라고 하더라도 작물이 필요로 하는 수분량을 충분히 확보할 수 있다고는 할 수 없고, 근래의 인구증가 또는 공업화에 따라 농작물생산에 이용할 수 있는 물자원이 급격히 감소하고 있기 때문이다. 또한, 유기질비료 또는 화학비료의 과다사용에 의한 무기염류의 농도 장해는 식물체의 뿌리 기능을 파괴하여 식물체의 생장을 저해한다. 최근 기후 온난화 등의 급격한 기후 변화도 작물의 재배기간, 재배가능지역을 변화시키고 있으며, 이에 따라 작물 생산량이 감소하여 농가 소득에 악영향을 미치고 있다.
이에, 다양한 환경적 스트레스에 잘 대응할 수 있는 작물을 개발하고자, 내재해성 관련 유전자를 이용하여 식물 형질전환체를 개발하는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그 예로, AtSRG1, AtSRG2 유전자의 발현이 억제된 염 스트레스 저항성이 증진된 식물체(한국 등록특허 제10-1648558호), RsERF1 유전자가 과발현되어 염 또는 삼투 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 애기장대 식물체(한국 등록특허 제10-1350225호) 등이 개발된 바 있다. 그러나, 감자(Solanum tuberosum) 유래 NF -YA7 유전자에 대한 연구는 전무한 상황이었다.
한편, 프로모터(promoter)는 구조유전자의 상류(upstream)에 연결되어 있는 유전체 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사되도록 조절하는 역할을 한다. 식물체로 도입되는 외래 유전자(즉, 트랜스진(transgene))의 발현은 다양한 요소들에 의해 큰 영향을 받으며, 특히 전사적 요소(Transcriptional regulatory elements)에 속하는 프로모터는 외래 유전자의 전사에 직접적인 영향을 끼쳐 결과적으로 발현의 수준을 변화시키며, 조직 또는 세포 특이성을 변화시킨다. 현재까지 외래 유전자의 발현을 위하여 다양한 식물체로부터 수많은 프로모터들이 분리되었지만, 그들 중 소수만이 식물의 형질전환에 실제로 이용되고 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 환경 스트레스, 특히 염 또는 건조 스트레스에 대하여 저항성을 갖는 작물을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 감자 유래 NF-YA7 유전자의 프로모터는 염, 건조 등의 환경 스트레스에 의해 유전자의 발현수준을 증가시키며, 이를 이용하는 경우 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현이 증가되는 형질전환 식물체를 제조할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현 증가를 유도하는 pStNF-YA7 프로모터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된, 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현이 증가되는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현 증가를 유도하는 pStNF-YA7 프로모터를 제공한다.
본 발명의 용어, "환경 스트레스"는 식물체의 생장 또는 생존에 부정적인 영향을 미치는 환경적인 요인을 의미한다. 구체적인 예로, 고온(high temperature). 저온(low temperature), 강광(strong light), 암흑(darkness), 건조(dryness), 강우(rainfall), 염(salt) 등이 있으며, 본 발명의 목적상 상기 환경 스트레스는 염 또는 건조, 더욱 구체적으로 염류 농도의 증가 또는 수분함량 감소인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "pStNF-YA7 프로모터"는 감자(Solanum tuberosum) 유래 NF-YA7 유전자의 상류(upstream)에 연결되어 있는 유전체 부위로서, 유전자의 발현을 조절하는 DNA 부분을 의미한다. 이때, 상기 용어 'NF-YA7 유전자'는 nuclear factor Y subunit A7을 코딩하는 유전자를 의미하며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession: OAP15428, AJP06333.1, AJE59531.1 등).
본 발명의 용어, "목적 단백질"은 본 발명에서 제공하는 pStNF-YA7 프로모터와 작동가능하게 연결되어, 상기 프로모터를 사용하여 환경 스트레스에 특이적으로 발현의 증가를 유도하고자 하는 단백질을 의미한다. 구체적인 예로, 식물에 존재하거나 또는 식물로부터 생산될 수 있는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 발명의 목적에 맞게 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
상기 감자(Solanum tuberosum) 유래 pStNF-YA7 프로모터는 염, 건조 등의 환경 스트레스에 의해 활성이 향상되므로, 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현 증가를 유도하는 효과를 제공할 수 있다. 이러한 상기 프로모터의 효과는 본 발명자들에 의하여 처음으로 규명된 것이다.
구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명에서 제공하는 pStNF-YA7 프로모터와 동일한 기능을 나타내는 한, 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
따라서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 높은 상동성을 갖는 염기서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90%이상의 높은 상동성을 갖는 염기서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 염 또는 건조 스트레스에 대한 감자 유래 pStNF-YA7 프로모터의 활성을 조사한 결과, 상기 프로모터는 상시 활성을 나타내며 염 또는 건조 스트레스에 대해서는 그 활성이 더욱 향상됨을 확인하였다(도 3 및 4).
이는, 상기 프로모터는 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현 증가를 유도하는 데 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태는 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.
이때, 상기 '프로모터' 및 '목적 단백질'의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "재조합 발현 벡터"는 숙주세포에 DNA를 도입하여 목적 유전자의 발현을 효율적으로 증가시키기 위한 수단으로서, 구체적으로 목적 유전자의 mRNA가 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미할 수 있다.
상기 벡터의 구체적인 예로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 더욱 구체적인 예로, 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pET30a, pET30c 및 pGEX-GST), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 또는 Ti 플라스미드 등을 사용할 수 있고, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 또는 식물 바이러스가 사용될 수 있으며, pORE. pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있으나, 본 발명의 카세트를 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적인 예로, 상기 벡터는 pORE 계열의 pORE-R2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 발현조절 서열과 기능적으로 연결될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 발명의 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 재조합 발현 벡터는 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "외래 유전자"는 외부에서 식물체로 도입되는 유전자를 의미하며, 개체(즉, 형질전환을 유도하고자 하는 대상)에 이미 존재하는 것이거나, 또는 존재하지 않는 것일 수 있다. 상기 외래 유전자의 염기 서열은 목적 단백질의 코돈 최적화를 통하여 얻어질 수 있다.
상기 용어, '작동가능하게 연결된'(operably linked)은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예로, 프로모터와 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위 특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, pStNF-YA7 프로모터에 GUS 단백질을 암호화하는 유전자를 작동 가능하게 연결하였고, 이를 pORE-R2 벡터에 클로닝함으로써 형질전환용 재조합 발현 벡터를 제작하였다(도 2).
이는, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터는 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현이 증가되는 형질전환체의 제조에 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 상기 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.
이때, 상기 "재조합 발현 벡터"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "형질전환"은, 유전물질을 다른 계통의 살아 있는 생물체에 도입함으로써 유전형질을 변화시키는 현상을 의미한다.
본 발명의 용어, "형질전환체"는 외래의 유전물질이 도입되어 유전형질이 변화된 생물체를 의미하며, 박테리아, 바이러스, 동물, 식물 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 아그로박테리움 투마파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것일 수 있으나, 상기 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환되는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, pStNF-YA7 프로모터와 GUS 유전자가 작동 가능하게 연결된 재조합 발현 벡터를 아그로박테리움 투마파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) C58에 도입하여 형질전환된 아그로박테리움을 제작하였고, 상기 아그로박테리움을 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 도입하여 형질전환된 애기장대를 제작하였다(실시예 2-2 및 2-3).
또 다른 하나의 양태는 상기 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현이 증가되는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
이때, 상기 '재조합 발현 벡터', '환경 스트레스', '목적 단백질' 및 '형질전환'의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "식물체"는 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함한다.
본 발명에서 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물이며, 더욱 구체적으로 애기장대일 수 있으나, 본 발명의 벡터에 의해 목적 단백질의 발현이 증가될 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, pStNF-YA7 프로모터와 GUS 유전자가 작동 가능하게 연결된 재조합 발현 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 애기장대에 도입하였으며, 상기 형질전환된 애기장대는 염 또는 건조 스트레스에 대해서 GUS 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 3 및 4).
이는, 상기 프로모터는 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현 증가를 유도하는 효과를 나타내므로, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터는 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현이 증가되는 형질전환 식물체의 제조에 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 감자 유래 pStNF-YA7 프로모터는 염, 건조 등의 환경 스트레스에 의해 기능이 향상되어 목적 단백질의 발현을 증가시키는 효과를 나타내므로, 환경 스트레스에 대한 저항성이 증진된 작물의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 감자(Solanum tuberosum) 유래 NF-YA7 유전자의 프로모터(이하, 'pStNF-YA7 프로모터'로 명명)의 염기서열을 도시한다.
도 2는 상기 pStNF-YA7 프로모터를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 재조합 벡터의 구조를 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 상기 pStNF-YA7 프로모터를 포함하는 애기장대 형질전환체의 염(NaCl) 스트레스의 농도 및 시간별 처리에 의한 GUS 염색 결과를 나타내는 사진이다. 이때, MS0은 NaCl을 처리하지 않은 애기장대를 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한, 상기 pStNF-YA7 프로모터를 포함하는 애기장대 형질전환체의 건조(PEG; Polyethylene glycol) 스트레스의 농도 및 시간별 처리에 의한 GUS 염색 결과를 나타내는 사진이다. 이때, MS0은 PEG를 처리하지 않은 애기장대를 의미한다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 환경 스트레스 내성 프로모터의 동정 및 확인
환경 스트레스에 내성을 갖는 식물 형질전환체를 개발하기 위하여, 환경 스트레스 하에서 활성이 향상되는 감자(Solanum tuberosum) 유래 NF -YA7 유전자의 프로모터(이하, 'pStNF-YA7 프로모터'로 명명)를 사용하고자 하였다.
먼저, pStNF-YA7 프로모터를 클로닝하여 이의 염기서열을 분석하였다. 구체적으로, DNeasy Plant Mini kit(Qiagen 사)를 사용하여 감자의 잎에서 총 DNA(total DNA)를 추출하였다. 이후, pStNF-YA7 유전자의 프로모터 영역으로 예상되는 약 933bp 정도의 단편을 증폭하기 위한 프라이머(pStNF-YA7-F: 5'-AGTCTTCTTTATTTTTTAAAACTTC-3' (정방향, 서열번호 2); pStNF-YA7-R: 5'-GATTGGAAGAG AAAATATATGTTA-3'(역방향, 서열번호 3))를 제작하여 rTaq 중합효소(rTaq polymerase, Takara사)와 함께 PCR 반응액에 넣어 Applied Biosystem 9700기를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR은 95℃에서 10분간 변성한 후, 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 2분을 25회 반복하고, 다시 확장 반응을 위하여 72℃에서 10분간 처리하는 조건을 사용하였다.
상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스(agarose)에 전기영동 하였고, pStNF-YA7 프로모터로 추정되는 밴드를 아가로스 젤에서 잘라내어 QIA quick gel extraction kit를 이용하여 정제하여 염기서열분석에 이용하였다. 구체적으로, In-Fusion® HD Cloning Kit(Clontech)를 이용하여 상기 유전자 단편을 클로닝벡터에 삽입하고, 대장균(DH5α)에 형질전환시킨 후, 얻어진 콜로니(colony)에 대해 콜로니 PCR을 실시하였다. 상기 유전자의 밴드가 확인된 콜로니의 플라스미드(plasmid)를 추출한 후, ABI 3700 sequencer를 이용하여 염기서열 분석하였고, NCBI의 BLAST 검색을 수행하였다.
그 결과, PCR에 의해 분리된 유전자는 서열번호 1로 표시되는 StNF -YA7 유전자의 프로모터임을 확인하였고, 이의 염기서열은 도 1에 도시하였다.
실시예 2. pStNF -YA7 프로모터를 포함하는 형질전환 식물체의 제작
실시예 2-1. pStNF -YA7 프로모터를 포함하는 재조합 벡터의 제작
환경 스트레스에 내성을 갖는 식물 형질전환체를 개발하기 위하여, pStNF-YA7 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 이용하였다.
구체적으로, 프라이머(pStNF-YA7-F-XhoI: 5'-GCCCAACGTTCTCGAGAGTCTTCTTTATTTTTTAAAACTTC-3' (정방향, 서열번호 4); pStNF-YA7-R-BamHI: 5'-TCTCCCGGGTGGATCCGATTGGAAGAGAAAATATATGTTA-3' (역방향, 서열번호 5))를 합성하여 pStNF-YA7 프로모터 영역을 PCR을 통해 증폭하였고, 상기 증폭물을 pORE-R2 벡터에 클로닝하였다. 이후, 상기 실시예 1에 따른 방법으로 콜로니 PCR을 수행하였으며, 이의 염기서열을 확인함으로써 도 2에 도시된 바와 같은 식물 형질전환용 재조합 벡터를 제작하였다.
실시예 2-2. pStNF -YA7 프로모터를 포함하는 아그로박테리움( Agrobacterium )의 제작
환경 스트레스에 내성을 갖는 식물 형질전환체를 개발하기 위하여, 상기 실시예 2-1을 통해 제작한 재조합 벡터 갖는 아그로박테리움을 이용하였다.
구체적으로, 아그로박테리움 투마파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) C58에 대하여 결빙(freeze) 및 해빙(thaw) 과정을 2~3번 반복한 후, 37℃의 열충격(heat shock) 방법을 통해 형질전환하였다. 이후, YEP 배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L)에서 밤새 배양(overnight)하여 콜로니(colony)를 확인하였다. 상기 벡터를 갖는, 형질전환된 콜로니를 선발하여 YEP 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하였다.
실시예 2-3. pStNF -YA7 프로모터를 포함하는 형질전환 식물체의 제작
환경 스트레스에 내성을 갖는 식물 형질전환체를 개발하기 위하여, 상기 실시예 2-2을 통해 제작한 아그로박테리움을 이용하여 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 형질전환시켰다.
구체적으로, 애기장대를 20-22℃, 습도 70%의 조건에서 약 3-4주간 키웠다. 이후, YEP 액체배지에서 배양한 상기 아그로박테리움을 식물 침지(Floral dipping)의 방법으로 애기장대에 형질전환시켰다. 이를 6주 정도 키운 다음, 종자를 채취하여 카나마이신(kanamycin) 선발 배지에서 배양함으로써 형질전환된 애기장대를 선발하였다.
실시예 3. pStNF -YA7 프로모터를 포함하는 형질전환 식물체의 스트레스 내성 확인
실시예 3-1. 염 스트레스에 대한 pStNF -YA7 프로모터의 활성 확인
상기 실시예 2를 통해 개발한 형질전환 애기장대에서, 염 스트레스, 구체적으로 염류의 농도 증가에 따른 pStNF-YA7 프로모터의 활성을 확인하기 위하여, NaCl 처리 후 상기 프로모터의 활성 정도를 분석하였다.
구체적으로, MS0 액체 배지에 NaCl을 농도별(75mM, 125mM, 250mM) 및 시간대별(0, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h)로 처리한 후, GUS 염색을 수행하였다. GUS-assay buffer(SolI: X-gluc(cyclohexyl ammonium salt) 20mM; SolII: NaH2PO4ㆍH2O 100mM, NaEDTA 10mM, Triton-X-100 0.1%, pH7.5)에 37℃에서 24시간 동안 담구었고, 70% 에탄올을 처리하여 클로로필(chlorophyll)을 제거하였다. 이후, 염색된 애기장대 식물체를 관찰하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, pStNF-YA7 프로모터는 염을 처리하지 않아도 활성을 나타내며, 염의 처리 시 그 기능이 더욱 향상됨을 확인하였다. 특히, 75mM 처리 후 3시간부터 72시간까지 GUS 유전자는 안정적으로 강하게 발현됨을 확인하였고, 125mM과 250mM의 농도 처리 시에는 3시간부터 12시간까지 GUS 유전자의 발현이 약해지다가 다시 24시간부터 발현이 더 강해짐을 확인하였다.
상기 결과를 통해, pStNF-YA7 프로모터는 상시 활성을 나타내면서, 염 등의 스트레스에 대해서는 활성이 더욱 향상되어 불리한 환경에서도 식물체가 잘 견딜 수 있도록 기능함을 알 수 있었다.
실시예 3-2. 건조 스트레스에 대한 pStNF -YA7 프로모터의 활성 확인
상기 실시예 2를 통해 개발한 형질전환 애기장대에서, 건조 스트레스, 구체적으로 수분함량 감소에 따른 pStNF-YA7 프로모터의 활성을 확인하기 위하여, PEG(Polyethylene glycol) 처리 후 상기 프로모터의 활성 정도를 분석하였다.
구체적으로, MS0 액체 배지에 PEG(Polyethylene glycol)를 농도별(0%, 1%, 2%, 5%) 및 시간대별(0, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h)로 처리한 후, 상기 실시예 3-2에 따른 방법으로 GUS 염색을 수행하여 애기장대 식물체를 관찰하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 상기 pStNF-YA7 프로모터는 PEG를 처리하지 않아도 발현되며, PEG의 처리 시 그 기능이 더욱 향상됨을 확인하였다. 특히, PEG 1%에서는 처리 후 3시간부터 72시간까지 GUS 유전자는 발현이 점차 더 강해짐을 확인할 수 있었다. 또한, 2%와 5%의 농도 처리 시에는 3시간부터 72시간까지 GUS 유전자의 발현이 더 강해짐을 확인하였다.
상기 결과를 통해, pStNF-YA7 프로모터는 상시 활성을 나타내면서, 건조 등의 스트레스에 대해서는 활성이 더욱 향상되어 불리한 환경에서도 식물체가 잘 견딜 수 있도록 기능함을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> pStNF-YA7 promoter from Solanum tuberosum specific for environmental stress and use thereof <130> KPA161308-KR <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 933 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pStNF-YA7 <400> 1 agtcttcttt attttttaaa acttcgtgcc aagtcaaacc aggtcactct ttgtgaaacg 60 gagggagtaa gatttaaata aatgatataa cttaaaggag atttttaaag tacttattat 120 cttaattata attcaaagat tctgaagtga aagtggagct agtctaaaga tctcttttgc 180 ttaaccaata ttttaggagc ttgagttggt gaaactagtc attgatattt acgtgaatac 240 ttcataatgt gatgcgtcta tttatttatt tttataaaat ttaaatattt tgattgaagt 300 tttgaattga aattgaagta acttttcaat attttcttat ttattcgata tttgcattga 360 aatctcaata taattagcaa aatttatttc tctcatgtga taaaaagaag attttcataa 420 agataacctc taattgttgg tccactttgg atagatctac cacctaacca ttttaggcat 480 gattcccaaa aaaatctaac aaaatgacct tatcttatac ctagtcatgt ttcttattaa 540 attttcatat gaattaaaaa aacatttctc acaattaatt tcatcttctt atacaaagag 600 agcatatata ttatattata atagacaaat agagaagaat attaaacaag tgccttttag 660 tcatttacta ttagaataat ggacatatca ttgtacgtct tacaatggta atcctagatt 720 gtgtttttat atttaaatat tcacacatca ctttcttatc ttctcttctt tgattctctc 780 tttctatttt attttatttt atttattcta acttagcatg cacaattatg aatagaccat 840 gttaaacccc atatatattt aatctttata tggttgagat acaatatttt ccacaaagag 900 aaagcttatt aacatatatt ttctcttcca atc 933 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pStNF-YA7-F <400> 2 agtcttcttt attttttaaa acttc 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pStNF-YA7-R <400> 3 gattggaaga gaaaatatat gtta 24 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pStNF-YA7-F-XhoI <400> 4 gcccaacgtt ctcgagagtc ttctttattt tttaaaactt c 41 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pStNF-YA7-R-BamHI <400> 5 tctcccgggt ggatccgatt ggaagagaaa atatatgtta 40

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 염류 농도의 증가 또는 수분함량 감소 특이적으로 목적 단백질의 발현 증가를 유도하는 pStNF-YA7 프로모터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 pStNF-YA7 프로모터는 감자(Solanum tuberosum) 유래인 것인, 프로모터.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항의 프로모터와 작동 가능하게 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  5. 제4항의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된, 형질전환체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 형질전환체는 아그로박테리움 투마파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 것인, 형질전환체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 형질전환체는 애기장대(Arabidopsis thaliana)인 것인, 형질전환체.
  8. 제4항의 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 환경 스트레스 특이적으로 목적 단백질의 발현이 증가되는 형질전환 식물체의 제조 방법.
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