CN114958903B - 一种增强大豆香味的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种增强大豆香味的方法，具体地，提供了一种赋予植物产生香味或增强植物香味的方法，具体地，本发明提供了BADH基因或其编码蛋白的抑制剂的用途，用于赋予植物产生香味或增强植物香味；或制备用于赋予植物产生香味或增强植物香味的组合物或制剂，其中所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。本发明首次发现，同时抑制BADH1和BADH2基因或其编码蛋白的表达可显著增强植物，尤其是大豆的香味。

Description

一种增强大豆香味的方法

技术领域

本发明涉及农学领域，具体地，涉及一种增强大豆香味的方法。

背景技术

香味作为食物品质的重要特征之一，广受大众的喜爱，赋予了食物更高的商品价值。2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2AP)是一种能够产生强烈“稻花”香味的挥发性化合物，是香米的重要香味成分，存在于多种植物和谷类产品。甜菜碱醛脱氢酶BADH2能够催化γ-氨基丁醛(γ-amino butyraldehyde，GABald)向γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)转化，BADH2活性降低或丧失，2AP合成前体GABald发生积累，从而促使2AP的含量增加。已有报道，玉米、高粱、黄瓜和椰子的BADH2功能缺失突变造成2AP的积累，但是没有关于BADH1基因与2AP的含量或者产生香味的关系的研究。

大豆是人类主要油脂和蛋白质的来源，是世界最重要的经济作物之一，能够作为肉类和奶制品的等类似物的替代品，并为人类提供了60％的植物蛋白和30％的脂肪。人们对大豆的品质需求愈来愈高，香味也成为影响大豆食用品质的重要特征。

本发明利用CRISPR基因编辑技术编辑大豆GmBADH1和GmBADH2基因，发现同时突变GmBADH1和GmBADH2基因的大豆植株，比GmBADH2基因单突变的大豆植株的2AP含量显著增加。

发明内容

本发明的目的在于提供一种赋予植物产生香味或增强植物香味的方法。

本发明第一方面提供了一种赋予植物产生香味或增强植物香味的方法，包括步骤：

降低或抑制所述植物中BADH基因或其编码蛋白的表达量和/或活性，从而增强植物的香味，其中，其中，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草(包括草坪草)。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

在另一优选例中，所述BADH1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述BADH2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；优选的，所述BADH1或BADH2基因来源于大豆。

在一个实施方式中，所述降低或抑制BADH基因或其蛋白的表达和/或活性是通过BADH1基因的突变实现的；优选的，所述突变导致BADH1功能完全丧失或功能部分丧失；优选，所述突变导致BADH1功能完全丧失；优选的，所述突变为BADH1基因的核苷酸序列相对于SEQ ID NO.3缺失第1290位碱基后的5个碱基；优选的，所述突变为BADH1基因的核苷酸序列相对于SEQ ID NO.3缺失第1290位碱基后的1个碱基。

在一个实施方式中，所述降低或抑制BADH基因或其蛋白的表达和/或活性是通过BADH2基因的突变实现的；优选的，所述突变导致BADH2功能完全丧失或功能部分丧失；优选，所述突变导致BADH2功能完全丧失；优选的，所述突变为BADH2基因的核苷酸序列相对于SEQ ID NO.4缺失第729位碱基后的2个碱基；优选的，所述突变为BADH2基因的核苷酸序列相对于SEQ ID NO.4缺失第725位碱基后的7个碱基并插入1个碱基。

在另一优选例中，所述方法包括给予植物BADH基因或其编码蛋白的抑制剂。

在另一优选例中，所述赋予植物产生香味或增强植物香味包括提高所述植物的4-氨基丁醛或2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)的含量。

在另一优选例中，所述的降低或抑制是指与野生型植株中BADH1基因或其编码蛋白的表达水平E0相比，所述植株中BADH1基因或其编码蛋白的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％，更佳地，0-30％；所述的降低或抑制是指与野生型植株中BADH2基因或其编码蛋白的表达水平E0相比，所述植株中BADH2基因或其编码蛋白的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％，更佳地，0-30％。

在另一优选例中，所述降低或抑制BADH基因或其蛋白的表达和/或活性通过选自下组的方法实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、基因编辑技术、导入基因或蛋白的抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的基因突变通过以下一种或多种方法获得：自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、X射线或Y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑或生物合成。

在另一优选例中，所述的突变区域包括外显子和/或内含子区。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、Crispr试剂、小分子配体、或其组合。

在另一优选例中，所述的基因编辑技术选自下组：CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术、或其组合。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)提供一植物或植物细胞；和

(ii)将BADH基因或其编码蛋白的抑制剂导入所述植物或植物细胞，从而获得改造的植物或植物细胞，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)提供一植物或植物细胞；和

(ii)利用靶向BADH基因的gRNA以及相应的Cas蛋白导入所述植物或植物细胞；在优选的实施方式中，向所述植物或植物细胞中导入含有所述gRNA和Cas蛋白的表达载体，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述BADH基因包括野生型BADH基因和突变型BADH基因，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)。

在另一优选例中，所述的突变型BADH基因编码的多肽与野生型BADH基因所编码的多肽相同或基本相同，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述的突变型BADH基因包括与野生型BADH基因相比，同源性≥70％(较佳地≥70％，较佳地≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％)的多核苷酸，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述的突变型BADH基因包括在野生型BADH2基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述的BADH基因包括cDNA序列、CDS序列、基因组序列、或其组合，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述BADH1基因的编码蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述相同或相近功能(甜菜碱醛脱氢酶活性)由(i)衍生的多肽；

或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)的同源性、具有相同或相近功能的多肽。

在另一优选例中，所述BADH2基因的编码蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述相同或相近功能(甜菜碱醛脱氢酶活性)由(i)衍生的多肽；

或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)的同源性、具有相同或相近功能的多肽。

在另一优选例中，所述BADH1基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:1所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:3所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述BADH2基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:4所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:4所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述降低或抑制所述BADH基因或其编码蛋白的表达量和/或活性通过对BADH1基因和BADH2基因同时进行突变来实现。

在另一优选例中，所述突变包括插入突变、缺失突变、移码突变、取代突变。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：测试植物中香味物质含量的增加量。

在另一优选例中，所述植物中的香味物质的含量为0.01-5000ppb，较佳地，0.05-2000ppb，更佳地，1-2000ppb，更佳地，10-2000ppb。

在另一优选例中，所述香味物质包括2AP。

本发明第二方面提供了一种用于赋予植物产生香味或增强植物香味的组合物，包括：(a)BADH基因或其编码蛋白的抑制剂，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因；和(b)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草(包括草坪草)。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

在另一优选例中，所述BADH1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述BADH2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。

在另一优选例中，所述抑制剂包括农用抑制剂。

在另一优选例中，所述赋予植物产生香味或增强植物香味包括提高植物中香味物质的含量。

在另一优选例中，所述植物中的香味物质的含量为0.01-5000ppb，较佳地，0.05-2000ppb，更佳地，1-2000ppb，更佳地，10-2000ppb。

在另一优选例中，所述香味物质包括2AP。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：反义核酸、抗体、小分子化合物、Crispr试剂、小分子配体、或其组合。

在另一优选例中，所述反义核酸选自下组：反义RNA、反义DNA、干扰RNA、核酶、或其组合。

在另一优选例中，所述干扰RNA选自下组：siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、dsRNA、hpRNA、ihpRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物还包括其他增强农作物的香味的物质。

本发明第三方面提供了一种本发明第二方面所述的组合物的用途，用于赋予植物产生香味或增强植物香味。

在另一优选例中，所述的组合物的用途，用于制备赋予植物产生香味或增强植物香味的试剂或试剂盒。

本发明第四方面提供了一种制备基因工程的植物细胞、或植物组织、或植物部分、或植物的方法，包括步骤：

降低或抑制植物细胞、或植物组织、或植物部分、或植物中的BADH基因或其编码蛋白的表达和/或活性，从而获得基因工程的植物细胞、或植物组织、或植物部分、或植物，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草(包括草坪草)。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

在另一优选例中，所述BADH1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述BADH2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述降低BADH基因或其蛋白的表达和/或活性通过选自下组的方法实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、基因编辑技术、导入基因或蛋白抑制剂、或其组合，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

本发明第五方面提供了一种制备基因工程植物的方法，包括步骤：

将本发明第四方面所述方法制备的基因工程的植物细胞、或植物组织、或植物部分再生为植物体，从而获得基因工程植物。

本发明第六方面提供了一种产生香味或香味增强的植物细胞、或植物组织、或植物部分、或植物，其特征在于，所述植物细胞、或植物组织、或植物部分、或植物是通过将本发明第四或第五方面所述的方法制备得到。

本发明第七方面提供了一种改良植物的方法，所述的方法包括步骤：

(a)提供一植物细胞、或植物组织、或植物部分，向所述植物细胞、或植物组织、或植物部分中导入BADH基因或其编码蛋白的抑制剂；或者，降低或抑制植物细胞、植物组织、植物部分中的BADH基因或其编码蛋白的表达和/或活性；所述BADH2基因包括BADH1和BADH2基因；

(b)将步骤(a)中的植物细胞、植物组织、植物部分再生成植株。

在另一优选例中，所述植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草(包括草坪草)。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

在另一优选例中，所述BADH1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述BADH2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞、植物组织、植物部分，从而使所述植物细胞、植物组织、植物部分中的BADH基因或其编码蛋白的表达或活性降低，所述BADH2基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述的基因编辑技术选自下组：CRISPR基因编辑体系、易错PCR、基因重组、TALEN和ZFN。

在另一优选例中，所述改良为赋予植物产生香味或增强植物香味。

在另一优选例中，所述方法用于赋予植物产生香味或增强植物香味。

在另一优选例中，所述方法用于提高香味物质的含量。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：对所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物，测试香味物质含量的增加量。

在另一优选例中，所述植物中的香味物质的含量为0.01-5000ppb，较佳地，0.05-2000ppb，更佳地，1-2000ppb，更佳地，10-2000ppb。

本发明第八方面提供了一种筛选或鉴定香味植物的方法，检测植物中BADH基因和/或其蛋白的表达量，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在另一优选例中，所述植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草(包括草坪草)。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。

在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。

在另一优选例中，所述植物选自大豆。

在另一优选例中，所述BADH1基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性；所述BADH2基因编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。

在另一优选例中，所述检测植物的检测部位包括植物的愈伤组织、果实、种子、花、茎、叶、穗、根。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的植物性状位点的研究和筛选，首次意外地发现，当同时抑制BADH1、BADH2基因或其编码蛋白的表达时，可显著增强植物的香味。本发明人在此基础上完成了本发明。

除非本申请定义，本发明中所使用的科学术语或专业名词具有本领域技术人员所理解的含义，当本领域技术人员理解的含义与本申请所定义的含义出现矛盾时，以本申请所定义的含义为准。

如本文所用，所述“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

如本文所用，所述“Cripsr制剂”是指可以实现基因编辑效果的各有效成分的组合，包括gRNA(向导RNA)或其编码序列和Cas蛋白或其编码序列，还可以进一步包括载体，以及有利于同源重组或基因表达的元件。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。比对方法为本领域技术人员已知的常规方法，比如BLAST运算法则。

术语“基因工程”是指通过人工干预的方式对控制生物遗传信息的核苷酸进行改造和利用，从而获得新的遗传特性、或新品种、或新产品的技术，包括本领域所公开的所有基因改造技术，如基因诱变、转基因或基因编辑等方法。基因诱变的方法包括但不限于物理诱变(比如紫外线诱变)、化学诱变(比如吖啶类染料)、生物诱变(如病毒、噬菌体诱变)等。在一优选实施方式中，本发明的基因工程改造包括用一个或多个sgRNA介导的Cas核酸酶对BADH基因家族的成员进行基因编辑。

本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similaritysearches ofnucleic acid and protein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQID No.1或SEQ ID No.2进行比来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。

术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。

术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。

术语“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。

术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。

术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。

本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript IIKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。

本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。

术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

术语“植物细胞”应理解为来自或者发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearingtree)、以及灌木和其他苗木。

术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。

如本文所用，术语“基因编辑酶”指适用于CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术Transcription Activator-like(TAL)effector nucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zinc finger nuclease)等编辑工具的核酸酶。优选地，所述基因编辑酶为CRISPR酶，又名Cas蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。所述的Cas蛋白是指蛋白家族，可以根据其来源不同而具有不同的结构，如来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9、来源于葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SaCas9；还可以根据结构特征(如结构域)进行下位分类，如Cas12家族包括Cas12a(又名Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12i等。所述的Cas蛋白可以具有双链或单链或无切割活性。本发明所述的Cas蛋白可以是野生型或其突变体，所述的突变体的突变类型包括氨基酸的替换、取代或缺失，所述的突变体可以改变也可以不改变Cas蛋白的酶切活性。本领域技术人员所知，现有技术中已报到的多种具有核酸切割活性的Cas蛋白，该公知蛋白或其改造后的变体均可以实现本发明的功能，本文通过引用方式将其纳入保护范围。

如本文中所使用的，术语“指导RNA(guide RNA)”、“成熟crRNA”、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。

在某些情况下，引导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，引导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

BADH基因

BADH基因是甜菜碱合成的关键酶之一，也是很好的胁迫抗性基因之一，可以催化有毒的甜菜碱醛转化为无毒性的甜菜碱，尤其在干旱、盐碱等逆境胁迫下BADH大量表达合成并积累甜菜碱，从而通过调节细胞内渗透压维持细胞膜稳定性，保护细胞内酶活性。在大豆中存在两种编码甜菜碱脱氢酶的同源基因，分别为BADH1(Glyma.06g186300)和BADH2(Glyma.05g033500)，均编码甜菜碱醛脱氢酶,均属于ALDH-SF超家族、醛脱氢酶家族，该家族具有氧化还原酶活性，可以催化醛基氧化为羧基。大豆BADH1和BADH2基因分别位于5号和6号染色体，基因编码区分别有15和16个外显子，基因结构一致性较高。

BADH1基因是甜菜碱醛脱氢酶的编码基因，与BADH2基因编码的蛋白序列同源性达90％，没有关于BADH1基因与2AP或者植物香味有关的报道。大豆BADH1的核苷酸序列如SEQID NO.:3所示，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.:1所示。

BADH2是甜菜碱醛脱氢酶的编码基因，甜菜碱醛脱氢酶具有醛脱氢酶活性，可能催化甜菜碱醛、4-氨基丁醛(AB-ald)和3-氨基丙醛的氧化，而4-氨基丁醛是2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)的合成前体，2AP与植物香味密切相关。大豆BADH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.:2所示。

如本文所用，术语“本发明的BADH基因”包括单子叶或双子叶植物。在一优选实施方式中，本发明的BADH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3或4所示。

本发明还包括与本发明的优选基因序列(SEQ ID NO.:3或4)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％，或100％)同源性的核酸，所述核酸也能有效地增强植物的香味。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

在本发明中，SEQ ID NO.:3或4中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO.:3或4的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQ ID NO.:3或4的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.:1或2所示的氨基酸序列。另外，“在SEQ IDNO.:3或4中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.:3或4所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于大豆，但是来源于其它类似的植物的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO.:3或4所示)具有一定同源性(如具有70％以上，如70％,75％,80％,85％,90％,95％甚至98％，99％，或100％序列相同性)的BADH的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:3或4所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的BADH核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

BADH基因编码的多肽

如本文所用，术语“本发明多肽”、“BADH基因的编码蛋白”、可以互换使用，都是指来源于植物(如大豆)的BADH的多肽及其变体。在一优选实施方式中，本发明多肽的一种典型的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1或2所示。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO.:1或2所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％或100％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指具有甜菜碱醛脱氢酶活性。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有BADH蛋白活性的BADH蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然BADH蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明中，所述的多肽变体是如SEQ ID NO.:1或2所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO.:1或2差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

农用抑制剂

可将本发明的活性物质(如BADH基因或其编码蛋白的抑制剂)以常规的方法制备成农用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、用活性物质浸渍的天然的和合成的材料、在多聚物中的微胶囊、用于种子的包衣剂。

这些制剂可用已知的方法生产，例如，将活性物质与扩充剂混合，这些扩充剂就是液体的或液化气的或固体的稀释剂或载体，并可任意选用表面活性剂即乳化剂和/或分散剂和/或泡沫形成剂。例如在用水作扩充剂时，有机溶剂也可用作助剂。

用液体溶剂作稀释剂或载体时，基本上是合适的，如：芳香烃类，例如二甲苯，甲苯或烷基萘；氯化的芳香或氯化的脂肪烃类，例如氯苯，氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃类，例如环己烷或石蜡，例如矿物油馏分；醇类，例如乙醇或乙二醇以及它们的醚和脂类；酮类，例如丙酮，甲乙酮，甲基异丁基酮或环已酮；或不常用的极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。

就液化气的稀释剂或载体说，指的是在常温常压下将成为气体的液体，例如气溶胶推进剂，如卤化的烃类以及丁烷，丙烷，氮气和二氧化碳。

固体载体可用研磨的天然矿物质，例如高岭土，粘土，滑石，石英，活性白土，蒙脱土，或硅藻土，和研磨合成的矿物质，例如高度分散的硅酸，氧化铝和硅酸盐。供颗粒用的固体载体是碾碎的和分级的天然锆石，例如方解石，大理石，浮石，海泡石和白云石，以及无机和有机粗粉合成的颗粒，和有机材料例如锯木屑，椰子壳，玉米棒子和烟草梗的颗粒等。

非离子的和阴离子的乳化列可用作乳化剂和/或泡沫形成剂。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯类，聚氧乙烯-脂肪醇醚类，例如烷芳基聚乙二醇醚类，烷基磺酸酯类，烷基硫酸酯类，芳基磺酸酯类以及白蛋白水解产物。分散剂包括，例如木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。

在制剂中可以用粘合剂，例如羧甲基纤维素和以粉末，颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物，例如阿拉伯胶，聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。

可以用着色剂例如无机染料，如氧化铁，氧化钻和普鲁士蓝；有机染料，如有机染料，如偶氮染料或金属钛菁染料；和用痕量营养剂，如铁，猛，硼，铜，钴，铝和锌的盐等。

在本发明中，所述“农用制剂”通常是农用植物生长调节剂，其含有BADH基因或其编码蛋白的抑制剂作为改良植物性状(如，增强植物香味)的活性成分；以及农业上可接受的载体。

如本文所用，所述“农业上可接受的载体”是用于将本发明的活性物质传送给植物的农药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的农业上可接受的载体选自下组：水、缓冲液、DMSO、表面活性剂如Tween-20、或其组合。任何本领域技术人员已知的农业上可接受的载体均可用于本发明中。

本发明的农用抑制剂可包括农用组合物。

本发明的农用制剂可与其他增强植物香味的物质联用。所述其他增强香味的物质可以是本领域技术人员已知的植物生长调节剂。

本发明所述的农用制剂的剂型可以是多种多样的，只要能够使活性成分有效地到达植物体内的剂型都是可以的，从易于制备和施用的立场看，优选的农用制剂是一种喷雾剂或溶液制剂。

本发明所述的农用制剂通常含有占所述农用制剂总重量的0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的本发明的活性成分。商品制剂或使用剂型中的本发明的活性成分的浓度可在广阔的范围内变动。商品制剂或使用剂型中的本发明的活性成分的浓度可从0.0000001-100％(g/v)，最好在0.0001与50％(g/v)之间。

植物性状的改良

本发明还提供了一种改良植物性状的方法，所述的改良包括：增强植物的香味，包括步骤：降低所述植物中BADH基因或其编码蛋白的表达量和/或活性，或添加BADH基因或其编码蛋白的抑制剂，所述BADH基因包括BADH1和BADH2基因。

在本发明中，还可进一步用常规方法将其他可以增强植物香味的物质处理植物或植物种子，从而改良对应植物的性状。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，通过抑制BADH1和BADH2基因或其编码蛋白的表达或活性，可显著增强植物香味，尤其是大豆的香味。

(2)本发明首次发现，通过抑制BADH1和BADH2基因或其编码蛋白的表达或活性，可提高香味物质(如2AP)的含量。

序列信息

序列号	描述
		SEQ ID NO.:1	BADH1氨基酸序列
SEQ ID NO.:2	BADH2氨基酸序列
		SEQ ID NO.:3	BADH1核苷酸序列
SEQ ID NO.:4	BADH2核苷酸序列

附图说明

图1为突变植株gmbadh1-1、gmbadh2-1和gmbadh1/gmbadh2-1的基因编辑方式和编码蛋白的推导氨基酸序列，图1A、图1B、图1C分别显示了突变植株gmbadh1-1、gmbadh2-1和gmbadh1/gmbadh2-1的基因编辑方式，图1D显示了突变植株gmbadh1-1、gmbadh2-1和gmbadh1/gmbadh2-1的基因编码蛋白的推导氨基酸序列。

图2为徐豆20（野生型大豆，XD20）、突变植株gmbadh1-1、gmbadh2-1和gmbadh1/gmbadh2-1的叶子(leaf)、籽粒（seed）、豆荚(pod)中的2AP含量。野生型大豆XD20和植株gmbadh1-1不含2AP，植株gmbadh2-1的叶片、籽粒、豆荚、干物质中2AP分别为43.76ppb、293.13ppb、246.02ppb；植株gmbadh1/gmbadh2-1的叶片、籽粒、豆荚干物质中2AP含量分别为497.46ppb、1618.86ppb、927.89pp。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非有特别说明，否则实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

实施例

1、靶点设计及载体构建

本实施例中利用Cas9和靶向GmBADH1和GmBADH2的sgRNA在大豆(以徐豆20为亲本)中针对上述两个基因进行编辑，具体操作方法可按照本领域常规的方式进行；载体构建亦可借鉴参考文献(“High-efficiency CRISPR/Cas9multiplex gene editing using theglycine tRNA-processing system-based strategy in maize”，Weiwei Qi等，《BMCBiotechnology》，2016)；本实施例中，Cas9采用植物密码子优化的Cas9，在其他的实施方式中，也可以采用其他方式优化的Cas9。

利用NCBI网站下载了GmBADH1(Glyma.06g186300)和GmBADH2(Glyma.05g033500)基因序列，其基因编码区分别有15和16个外显子。所述GmBADH1的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmBADH2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；利用target Design(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)设计gRNA,gRNA1(TGCTCCTGTATCCCTTCCTA)和gRNA2(GGCTCATGTGTCTCTTCCCA)分别靶向GmBADH1和GmBADH2的第四个外显子。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建双启动子启动不同靶基因的复合载体，分别用大豆的U6启动子(pGmU6)驱动的gRNA1靶向GmBADH2,用大豆U3启动子(pGmU3)驱动的gRNA2靶向GmBADH1。

具体构建方法如下：

1)、分别利用引物对

SP315-F(tagtcccaggaaaacatatggattGGCTCATGTGTCTCTTCCCAgttttagagctagaaatagcaagt)

SP316-R(taacttgctatttctagctctaaaactaggaagggatacaggagcttgaccagacatgtcacgcttag)，

以Scalfold-pGmU3质粒为模板，正反向引物SP315/SP316克隆片段gRNA2-Scalfold-pGmU3-gRNA1，获得PCR产物的片段长650bp,并利用试剂盒回收。

2)、分别对骨架载体P0378进行BsaI酶切，分别回收15Kb片段。

3)、利用同源重组与将克隆后回收的片段与酶切后回收骨架载体进行连接，构建成最终载体P1252。

4)将上述3)中的连接产物分别转化大肠杆菌感受态Trans-T1，涂布于Kan平板培养，挑8个菌落液体培养1h，PCR菌液检测，选择正确的单克隆2个，进行菌液送测。

5)、选择测序正确的单克隆进行扩繁、保菌、提质粒，转化农杆菌K599和EHA105，挑取5个单菌落培养，PCR检测正确后保菌备用。

2、发根农杆菌瞬时转化

为验证载体的编辑效率，将构建完成的载体进行大豆幼苗的发根农杆菌瞬时转化。

(1)大豆种子萌发：取营养土及蛭石按2:1的比例混匀，平铺在穴盘上，将大豆种子以0.5cm的深度点播到穴盘中，浇适量水准备萌发。

(2)菌板及菌液的准备：取500～600μl发根农杆菌K599甘油菌液涂板，同时取50μl菌液加入含有相应抗生素的TY培养液，28℃过夜培养。

(3)发根农杆菌侵染大豆：用刀片在生长7-14天的大豆幼苗子叶的下胚轴1cm处切一倾斜的伤口，伤口处蘸取接种发根农杆菌。然后将接种的幼苗的下胚轴直接种植在潮湿的无菌蛭石培养盒中，每棵浇10ml K599侵染悬浮液，随后在16天内保持高湿度，以促进大豆毛状根生长。

毛状根长出后，利用TPS法提取大豆毛状根的DNA，分别用检测引物GmBADH1-cx-F(AGATGAAGCACTGGCAGACC)，GmBADH1-jc-R(GACATCGTTGATAATGTGAGTGC)扩增相应片段；BADH2-jc-F-1(CGCTGCCAAGGTTCCTCTTA),BADH2-jc-R-1(GCCAACTCAGAGGGCTTCAA)扩增产物经sanger法进行测序，确认编辑形式，若为测序结果显示双峰，则将PCR产物连接入T载体，选取5个克隆进行测序，确认编辑形式。检测敲除载体对靶基因的编辑效率,突变频率计算为突变的毛状根数除以毛状根总数。

3、遗传转化

通过大豆毛状根瞬时转化的已验证载体工作效率，将转化的EHA105农杆菌进行大豆的稳定遗传转化。

(1)大豆种子氯气灭菌：将挑选好的大豆种子用75％的酒精清洗两次，在超净工作台晾干，然后将盛有大豆的无菌培养皿放在干燥器中，向装有150ml NaClO的烧杯中贴壁缓慢加入10ml浓盐酸，利用产生的氯气灭菌16h。

(2)种子萌发：将已灭菌的大豆种子种脐向下插进萌发培养基，于22℃培养箱暗萌发过夜。

(3)农杆菌侵染液制备：将在-80℃冰箱中储藏的甘油农杆菌液接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃摇床，20rpm/min活化培养过夜；取300μl菌液，加到100mlYEP液体培养基中，28℃摇床，200rpm/min过夜培养至OD600为0.6～1.0左右，4000rpm离心10min，弃上清，用侵染液重新悬浮沉淀菌体至OD600为0.6左右备用。

(4)子叶节侵染：将萌发的种子在下胚轴靠近子叶节处，横切一刀，去掉种皮，然后沿着两片子叶中间纵切，去掉顶芽，在子叶节部位轻刺伤口，迅速放入事先制备的农杆菌侵染液中，室温，100rpm/min摇床避光侵染1～4小时左右，取出后在超净工作台晾干，然后转移到铺有灭菌滤纸的共培养培养基上，于22℃培养箱黑暗共培养3～5天。

(5)共培养：将侵染完的子叶取出放置无菌滤纸上吹至表面无水，然后接到共培养培养基上，22℃暗培养5天。

(6)恢复培养：将共培养后的子叶取出，观察子叶是否符合标准，将子叶插入恢复培养基中，28℃光下恢复培养5～7天。

(7)筛选培养：将恢复之后的外植体伤口处插入筛选培养基，25℃左右光下筛选，每10天继代一次，继代3～5次。

(8)伸长培养：将筛选后带丛生芽的外植体，切掉子叶，转移到芽伸长培养基，每10天继代一次，光照和温度同筛选培养。

(9)生根和移苗：在伸长培养期间，将培养苗长到3-4cm具有3-4片绿叶后剪下来插入灭菌的营养土中，浇生根培养液生根。后观察根系生长合适，移到人工光照培养箱炼苗，待幼苗长出新叶转移到人工气候室继续培养。

4、阳性苗的筛选

对于再生苗，取少量叶片以TPS法提取基因组DNA。

对植株以引物对

Cas9-jc-F1(GAGTACAAGGTGCCCTCAAAG)，

Cas9-jc-R1(TCCTCAGCGAGATCGAAATT；

CH35S-F(TCATTTGGAGAGGACACGCT)，

SP110(GGAGAAACTCGAGTCAAATCTCG)等2对引物分别检测，任何一对引物可以扩增到目的产物，则该再生苗即为转基因阳性苗。

5、基因检测

对于转基因阳性苗以引物对检测引物

GmBADH1-cx-F(AGATGAAGCACTGGCAGACC)，

GmBADH1-jc-R(GACATCGTTGATAATGTGAGTGC)扩增GmBADH1相应片段；

BADH2-jc-F-1(CGCTGCCAAGGTTCCTCTTA),

BADH2-jc-R-1(GCCAACTCAGAGGGCTTCAA)扩增GmBADH2基因的相应片段。扩增产物经sanger法进行测序，确认编辑形式，若为测序结果显示双峰，则将PCR产物连接入T载体，选取5个克隆进行测序，确认编辑形式。

6、实验结果

载体构建完成进行大豆子叶节稳定转化，分别获得GmBADH1单突变体植株gmbadh1-1、GmBADH2单突变体植株gmbadh2-1和GmBADH1/GmBADH2双突变体植株gmbadh1/gmbadh2-1。

突变植株gmbadh1-1、gmbadh2-1和gmbadh1/gmbadh2-1的基因编辑方式分别如图1A、1B、1C所示，突变植株gmbadh1-1、gmbadh2-1和gmbadh1/gmbadh2-1的基因编码蛋白的推导氨基酸序列如如图1D所示，其中，突变植株gmbadh1-1、gmbadh2-1和gmbadh1/gmbadh2-1的氨基酸序列的未突变部分用黑色标记，突变部分用红色标记，扩折号代表缺失氨基酸。GmBADH1单突变体植株gmbadh1-1的编辑方式为在基因+1290nt后缺失5bp，由编辑后CDS的推导出的蛋白质在第27位氨基酸开始发生移码突变，并在CDS的186位形成一个终止密码子TGA，将会导致蛋白翻译的提前终止；GmBADH2单突变体植株gmbadh2-1的编辑方式为+729nt后缺失2bp，在CDS的148位引入终止密码子TAA，蛋白质翻译提前终止；GmBADH1/GmBADH2双突变体植株gmbadh1/gmbadh2-1的编辑方式为GmBADH1基因+1290nt后缺失1bp，导致CDS编码区157为引入终止密码子TAA，导致蛋白质翻译提前终止；GmBADH2基因缺失+725nt后缺失7个碱基并插入G，在CDS编码区的缺失138和139位的氨基酸，导致蛋白翻译的提前终止。

利用GC-MS法对徐豆20(野生型大豆，XD20)、突变植株gmbadh1-1、gmbadh2-1和gmbadh1/gmbadh2-1的鼓粒期的鲜大豆叶子(leaf)、籽粒(seed)、豆荚(pod)进行2AP含量的测定。如图2所示，XD20和gmbadh1-1不含2AP，植株gmbadh2-1的叶片、籽粒、豆荚、干物质中2AP分别为43.76ppb、293.13ppb、246.02ppb；植株gmbadh1/gmbadh2-1的叶片、籽粒、豆荚干物质中2AP含量分别为497.46ppb、1618.86ppb、927.89pp，均显著高于植株gmbadh2-1。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种增强植物香味的方法

<130> P2022-0534

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 503

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BADH1氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Ile Ser Ile Pro Ser Arg Gln Leu Phe Ile Asp Gly Glu Trp

1 5 10 15

Lys Val Pro Leu Leu Asn Asn Arg Phe Pro Ile Ile Asn Pro Ala Thr

20 25 30

Glu Asp Ile Ile Gly His Ile Pro Ala Ala Thr Lys Glu Asp Val Asp

35 40 45

Leu Ala Val Asp Ala Ala Lys Arg Ala Phe Ser His Asn Lys Gly Lys

50 55 60

Asp Trp Ser Ser Ala Pro Gly Ser Val Arg Ala Arg Tyr Leu Arg Ala

65 70 75 80

Ile Ala Ser Lys Ile Thr Glu Lys Lys Asp Glu Leu Gly Lys Leu Glu

85 90 95

Ala Ile Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ala Asp Leu Asp

100 105 110

Asp Val Ile Gly Cys Phe Asn Tyr Tyr Ala Glu Leu Ala Glu Gly Leu

115 120 125

Asp Ala Lys Gln Asn Ala Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Thr Phe Lys

130 135 140

Ser Tyr Val Leu Lys Glu Pro Ile Gly Val Val Ala Leu Ile Thr Pro

145 150 155 160

Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu

165 170 175

Ala Ala Gly Cys Thr Ala Ile Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val

180 185 190

Thr Cys Leu Glu Leu Ala Glu Ile Cys Arg Glu Val Gly Leu Pro Pro

195 200 205

Gly Val Leu Asn Ile Val Thr Gly Leu Gly Asn Glu Ala Gly Ala Pro

210 215 220

Leu Ser Ser His Pro Asp Val Asp Lys Ile Ser Phe Thr Gly Ser Ser

225 230 235 240

Ala Thr Gly Ser Arg Ile Met Thr Ala Ala Ala Gln Leu Thr Lys Pro

245 250 255

Val Ser Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Ile Val Phe Glu Asp

260 265 270

Val Asp Leu Asp Lys Thr Ala Glu Trp Thr Ile Phe Gly Cys Phe Phe

275 280 285

Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Ile Val His Glu

290 295 300

Ser Ile Ala Thr Glu Phe Val Asn Arg Leu Val Gln Trp Ala Lys Asn

305 310 315 320

Ile Lys Ile Ser Asp Pro Phe Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Ile

325 330 335

Val Ser Glu Gly Gln Tyr Lys Lys Val Leu Asn Cys Ile Ser Thr Ala

340 345 350

Lys Ser Glu Gly Ala Thr Ile Leu Ile Gly Gly Ser Arg Pro Glu His

355 360 365

Leu Lys Lys Gly Tyr Phe Val Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp Val Thr

370 375 380

Thr Ser Met Gln Ile Trp Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Leu Cys

385 390 395 400

Val Lys Thr Phe Ser Thr Glu Glu Glu Ala Ile Glu Leu Ala Asn Asp

405 410 415

Thr His Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Val Met Ser Lys Asp Leu Glu Arg

420 425 430

Cys Glu Arg Ile Ser Lys Ala Ile Gln Ala Gly Ile Val Trp Ile Asn

435 440 445

Cys Ala Gln Pro Ser Phe Ile Gln Ala Pro Trp Gly Gly Val Lys Arg

450 455 460

Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Trp Gly Leu Glu Asn Tyr Leu

465 470 475 480

Ser Val Lys Gln Val Thr Lys Tyr Ile Ser Asp Glu Pro Trp Gly Trp

485 490 495

Tyr Gln Ser Pro Ser Lys Leu

500

<210> 2

<211> 488

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BADH2氨基酸序列

<400> 2

Met Ser Ile Pro Ile Pro His Arg Gln Leu Phe Ile Asp Gly Asp Trp

1 5 10 15

Lys Val Pro Val Leu Lys Asn Arg Ile Pro Ile Ile Asn Pro Ser Thr

20 25 30

Gln His Ile Ile Gly Asp Ile Pro Ala Ala Thr Lys Glu Asp Val Asp

35 40 45

Leu Ala Val Ala Ala Ala Lys Ala Ala Leu Ser Arg Asn Lys Gly Ala

50 55 60

Asp Trp Ala Ser Ala Ser Gly Ser Val Arg Ala Arg Tyr Leu Arg Ala

65 70 75 80

Ile Ala Ala Lys Ile Thr Glu Lys Lys Pro Glu Leu Ala Lys Leu Glu

85 90 95

Ala Ile Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp Ile Asp

100 105 110

Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Phe Tyr Ala Asp Leu Ala Glu Lys Leu

115 120 125

Asp Ala Gln Gln Lys Ala His Val Ser Leu Pro Met Asp Thr Phe Lys

130 135 140

Ser Tyr Val Leu Lys Glu Pro Ile Gly Val Val Ala Leu Ile Thr Pro

145 150 155 160

Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu

165 170 175

Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ile Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val

180 185 190

Thr Cys Leu Glu Leu Ala Glu Ile Cys Lys Glu Val Gly Leu Pro Pro

195 200 205

Gly Val Leu Asn Ile Leu Thr Gly Leu Gly Pro Glu Ala Gly Ala Pro

210 215 220

Leu Ala Ala His Pro Asp Val Asp Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Ser

225 230 235 240

Ala Thr Gly Ser Lys Ile Met Thr Ala Ala Ala Gln Leu Ile Lys Pro

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Val Ser Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Ile Val Phe Glu Asp

260 265 270

Val Asp Leu Asp Lys Ala Ala Glu Trp Thr Ile Phe Gly Cys Phe Trp

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Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Ile Glu Ser Ile

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Ala Thr Glu Phe Leu Asn Arg Ile Val Lys Trp Val Lys Asn Ile Lys

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Ile Ser Asp Pro Leu Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Ile Val Ser

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Glu Gly Gln Tyr Glu Lys Ile Leu Lys Phe Ile Ser Asn Ala Lys Ser

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Glu Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly Ser Arg Pro Glu His Leu Lys

355 360 365

Lys Gly Phe Phe Val Asp Gln Leu Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Leu

370 375 380

Cys Val Lys Thr Phe Ser Thr Glu Glu Glu Ala Ile Asp Leu Ala Asn

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Asp Thr Val Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Val Ile Ser Asn Asp Leu Glu

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Arg Cys Glu Arg Ile Thr Lys Ala Phe Lys Ala Gly Ile Val Trp Ile

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Asn Cys Ser Gln Pro Cys Phe Thr Gln Ala Pro Trp Gly Gly Ile Lys

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Arg Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Trp Gly Leu Asp Asn Tyr

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Leu Ser Val Lys Gln Val Thr Gln Tyr Ile Ser Asp Glu Pro Trp Gly

465 470 475 480

Trp Tyr Gln Ser Pro Ser Arg Leu

485

<210> 3

<211> 5626

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BADH1核苷酸序列

<400> 3

atggcaatct ccatacccag tagacaactt ttcatagatg gagagtggaa agtccctctt 60

ctcaacaatc ggtttccgat catcaacccc gctactgaag acatcatagg ttccctctct 120

aactttcttt tcattatttt tccacatgac ttctttgttc tattgtcaaa actcgtgtct 180

aaactcattt attatgttta tgattatgat atgatttttg acacgtgcat agtacttgta 240

agtaataagt aaaaaaaaaa aaaaatacac atgtaatttt aagattttga cttgatgtga 300

ttggtgttca gggcatattc cagccgctac taaggaagat gttgaccttg cggtggatgc 360

tgctaaaaga gccttttccc ataacaaagg caaagattgg tcttcagctc ctggctctgt 420

tcgtgctcgc tatcttcgag ccatcgcttc aaaggttcta acgttttttt tcacttgaat 480

atgtttttat tggcagaggg aaaagataaa attatatatg aagttattga gtaagttgca 540

tcaactagta tattgtttaa tagctttcca tagaataact ttatctattg gattaaaagt 600

tctttatcat gtatactata acaaaatttt atattaacaa aaatttgttt aatattctat 660

taatttatat caaattcatt gaatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 720

actttttaac atataaaaaa taaaattatt taatcatata tttatagatg cttaattttg 780

actaaattta atacaaataa tcaagattgt tgtttgaggg tgagtcttgg cataagagta 840

aagttgtgcc ttggtgatta gttcgaatcc caaaacaaca tctttacata ttcaagtgca 900

tggctgcata taatgaccct cttctatacg atcttcataa gttgtttttc tttttaaaaa 960

aaatcaagat agttgttcaa ccctttaaat acattttgat gtgcatgtgt ggacacctta 1020

ctgtgctttt ctttatcaca gataacagag aaaaaggatg aactaggaaa gcttgaagca 1080

attgattgtg gaaaaccact agatgaagca ctggcagacc tggtgagtgg tgacatttaa 1140

ctttgggaaa acaacaactg atgttaccat gagctttttt tgcttatttt tatctgtgac 1200

tttatcatgt aggatgatgt tattggttgt tttaactact atgccgagct tgcagaagga 1260

ttggacgcaa agcaaaatgc tcctgtatcc cttcctatgg aaaccttcaa gagttatgtt 1320

ctcaaggagc ccatcggagt tgttgcatta attactccat ggtatttgct gtttcttcat 1380

tttaactgct tatgcatttc aatgtaattt acttccatga acaatcttta taaactgaac 1440

ataggtccat aagtgaaata ttatgcatta attagctttt atctagtgca tactggttat 1500

agaggccagg ctgcattgac ttagattctt atcagtttac ttgcatagga aattgatgca 1560

ctcacattat caacgatgtc aattgctgat tgaatgtgtt gaatagctaa tgaaattata 1620

tgatttatgt tatgcattag gaactatcct ctattgatgg ctacatggaa agttgctcct 1680

gctctagctg ctggttgtac agcaatattg aagccatctg aattggcatc tgtgtatgtt 1740

ctcattaact attgtgcaac cttgattatt tgatatgttg gtttcttatg ctgtcttatc 1800

atttacaatt ttaggacctg tttggagctg gctgaaatat gcagagaagt tggccttcct 1860

ccaggggtat taaacattgt tactggatta ggcaatgaag ctggtgctcc tttgtcatct 1920

catcctgacg tagacaaggt tcaaccgatt ttacttatta gtagaatcaa aattatatgg 1980

agatatattt cattctatat attgcaagta ttgttacttt gctatgattt ttaaaaacta 2040

cttagccatt gtggctgatg tgtaactttt caacagattt cctttactgg aagctctgca 2100

actggaagca ggattatgac agctgcagca cagctaacga aggtattttt aagcagtatt 2160

atctgcaaat tatgtacaat ttatattgtc attctgcttt aaaagatata atagaggata 2220

ctaagtaaca agcataagat gaaatgatag aaatcctttt tatttttcct ttcatatttt 2280

cattctcttt tctttgtgag atcgtgtaat atccaatttg gggtttcttg ttggcagcct 2340

gtttctctag agcttggtgg aaaaagccca atcattgttt ttgaggatgt tgaccttgat 2400

aagagtaagt gccttttatt ttgttatgga caacctatgt tttcttgcat tgaggaatca 2460

tatttcccat gaaactgatt gagtggttgt cgatgagtaa aatttgggta cctagaacct 2520

attactgaaa ccaaaatcca aatagacagt catataccat ttaacattta ttttgctatt 2580

ttccttgatt taaacagctg ctgaatggac catctttggc tgcttcttta caaatggtca 2640

gatatgcagt gcaacatctc gccttattgt gcatgtaagt ttaacatatt gattttgatt 2700

catccataac acatttccct cttcacaaac aagtatttgt agcttacttt tcttactgtg 2760

ctgtctaaac aggaaggttc tgatatactc agatatcatt ttgtctgtaa actttgtagc 2820

aattgcattg gctgagtttt gaacattgat aaagtgagag atggttttac tgtttcagga 2880

aagtatagca acagaatttg tgaatagact tgtgcaatgg gccaaaaaca tcaaaatttc 2940

agatcccttt gaagaaggtt gtaggctagg tcctattgtt agtgaaggac aggtatgttt 3000

aatgtttatc acttttgtat ttactatata tttgcttaac ttactccctc ctgcttttac 3060

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atttatattt gaaatatatc cgaatatagg tctagcagaa aaaatctaac atatatcagc 3240

aattagttag tacagacaca cttggaagag tttagtgatt tagcaggaaa gcagtgcaaa 3300

tattcagcat agaaatgcct ttagaagtca aaaatataag catattttgg attattttga 3360

aggaaaaata gatgctgttt gcttgaacat tttctgaaat caaggatttc tttgtgtgac 3420

catttctctc tctagaagta actggtcaca tctccataaa aacttaaggt atatgcttca 3480

agtccaaaca ggggaaactt aaggtagtat tcccttgaac ttttccaata aaaaagaaaa 3540

aactgcagac tacagagaga tatgcttcat ctgaacatgg ttcattcgtt gaatgcttca 3600

ttatgttaaa aattgtcaaa ggaatggatg caattattac atatgttact tttactttat 3660

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ctatttttac ttactctttc tgattaatgt acttctgcct ttaacgaaga tatgtcatgt 3780

tctggttgtt acaccttgtt tcatttcttc ctctaatacg ctgtagtttt gggtttaaga 3840

tattgtttga agtagatatg taacactgaa atctactgct aacgtagact tctgtatttc 3900

tgcttgtgtt tattcaaatg ccttcgccat catccaaaat ggaaatgtat gttagtgtga 3960

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tgaaccaaca ttttatcata tctaatgttt ggattatatg gttcagtata aaaaagtgtt 4140

gaattgtatc tcaactgcta agagtgaggg tgcaacaatt ttgattggag ggtctcgccc 4200

agaggtatga ttatactctc tagtatgtgt gcccggttat gtattgcaaa acttgtcatg 4260

agaaatgata gatttgtcaa atttgatggc agcatttgaa aaaggggtac tttgttgaac 4320

caaccatcat aactgatgtg actacctcga tgcaaatttg gagagaagaa gtttttggac 4380

ctgtgctatg tgtgaaaaca ttcagtaccg aagaagaagc tattgaacta gcaaatgaca 4440

cacagtgagt taattatttt tctggaggtt taagtatatt ttttattcct taaatttgag 4500

tcatcgttat tttttatccc ctaaattttt tttgttttct aattttgaac aatgttcttt 4560

ttagtctttt ttgactgatt ttttaatgca gaagggacta aagattattt ttcaaagatt 4620

gagagactaa aaaataaatt taaattttaa aggaccaaaa atttaaaata ataacctcaa 4680

tttgaggaac caaaaacatt ttaaagccaa aacatattta aaactgtaat acttaacgcc 4740

tgtaactact ttttattcac ttgtgcattg atgctaatca atgttgtata tgatctgtta 4800

tttcacagct acggcttagg gtctgctgta atgtcaaaag atctagaaag atgcgagcgc 4860

atatcaaagg tgagactgat cctagattat cataaaaact gcaaaacaaa agggttttat 4920

gtaaattgaa tggttaatat ttatacttgt attgcttttt gtgcaggcta ttcaggctgg 4980

aattgtatgg ataaattgtg ctcaaccaag cttcattcaa gctccatggg gaggcgttaa 5040

acgtagtggt tttggtcgtg aactaggaga atggtatgaa tcttatttcc tatatcagtg 5100

aatgaggaag tcaattttaa tgcctttaat ccctcatcta atagttattt gtggaaaata 5160

aaaatgtgaa tttaattgga acacattaat ggtgtaaatg ttttttactt tatcatccaa 5220

gcgtggatta atataaaatt caagcttgtg aatttttatc aagagtttca cactgtcata 5280

tacacatcac tattggtgta atttttaagg taattgttgt acatgaccag ttggtgattg 5340

gatgacggta agactatttt acagagcgga aaaaatttag taggcatgtt taggattatt 5400

tttaattgac tcacaatgta aaaaacttta tgctgtaaac tctaaaaata ttggttaggc 5460

tatatcttga ttcttgattg tttttcatct gagaatctga atctgggtct gagtttttgt 5520

tgtttattat ttcaggggac tcgagaacta tttaagtgtg aagcaagtga ccaagtacat 5580

atctgatgaa ccgtggggct ggtatcagtc gccttcaaag ctgtga 5626

<210> 4

<211> 4323

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BADH2核苷酸序列

<400> 4

tttaggataa agaaggagag actggactag ctgagttagg gtgagttgca ggcagtgtca 60

tctctccttt gacgacaaga tgagcatccc aattccccat cggcagttat tcatagacgg 120

agactggaaa gtccccgtcc tcaagaatcg gattcccatc atcaaccctt ccacccaaca 180

catcatcggt tctcttcttt cccattctct gtctctcatc agatctcaat ctcaatctca 240

atctccttcc ttgtcttctc aatgcagggg atatcccagc agctactaag gaagacgttg 300

atctcgctgt cgctgccgcc aaagctgccc tctcccgcaa caagggcgcc gattgggcct 360

ccgcttccgg ctccgttcgg gctcgctacc tccgcgccat cgctgccaag gttcctctta 420

tttcactttt attctatttt cgctcttttc cttatttcca ttattctccc tccctccctc 480

gcagatcacc gagaaaaagc ctgaactagc aaaactcgaa gctattgact gtggaaaacc 540

gctcgatgaa gccgcctggg acatcgtaat ctctcacatc cctaaattgc aagcaaagaa 600

acaccgatta aagttgtatc actgtgtgtt cggttatttg tttctgtagg acgatgttgc 660

tggttgcttt gagttctatg ctgaccttgc tgaaaaattg gacgcacagc aaaaggctca 720

tgtgtctctt cccatggaca cattcaagag ttatgttctt aaggagccga ttggagtcgt 780

tgctttaata actccttggt actaccttct ccttctctct ctctctctct ctctgctctt 840

ttttaactga atccgatgct ttactttaat cattgcattg catttgtgaa tcatcatcct 900

ctgttgatgg cgttttagga attatcctct gttgatggct acgtggaagg ttgctcctgc 960

tctggcggcc ggctgtgctg caatattgaa gccctctgag ttggcatctg tgtatgtttt 1020

tgttctccat gactgtctgt tgctgtcttg cttctttgtt ttgttttgtt cgttgcttgg 1080

tttcttctca ttctatgttg tcatgtgttg ttgtgtgcaa tttttaggac atgtttggag 1140

ctcgctgaaa tttgcaaaga agtcgggctt cctcctggcg tgttgaacat tctcactgga 1200

ttaggacctg aagcgggtgc tcctttagca gctcatcccg atgtagacaa ggttcaattt 1260

ttaaaagaat tgaagctgta tggggctata tcttgttttt atgtctcaca ttgttgcaca 1320

caaggtttta aattgcagtc acggtcgcaa ttttgtcaat ccttcaatta caaacagatg 1380

catgtggtca caattgtggt cgcggaaagc caaaaaaaac tttatgtccc agccaaaatt 1440

gcggccacgc gctgtttttg aaaaacctcg tttgcgtgta tcattactga gatttctttg 1500

agtttgcaat gctagtttga cattgtggcc gtaatttttc caatagattg cctttactgg 1560

aagctctgca actgggagca aaattatgac agctgcagct cagctgatca aggtattttt 1620

gagcagttat ctgtaagtta tgaacagttc gtgtttccat ttgttttgat agaacaaaga 1680

acaaataaag gcatgctcag aaagagatag gaaccccttt ttttcccctt acatgtttta 1740

attgtgtttt cttcatgaat cactctaaca taaaatgtgt ggtttcttgg cagcctgttt 1800

cactagagct tggtgggaaa agcccaatca ttgtttttga ggatgttgac cttgacaagg 1860

gtcagtgact tcgcaagtat agtgatttag ttatggacag cacttgtcta cttgcatcac 1920

aaaatcacat ttccttaaat actgagtgag gatgagtaat tttttttcat ctatttccta 1980

ttgcatgatt tagatccttt ctccatgatt taaacagctg ctgaatggac catatttggt 2040

tgcttctgga caaatggtca gatatgcagt gcaacttccc gccttattgt acatgcaagt 2100

tttgtcttct ttaacttcaa ctgtggttga attttttcag caccttgata gaaattatgt 2160

tggcatttat cttcaaaaac taagatactc tcatttttca ggaaagtata gcaacagaat 2220

ttttgaatag gattgtgaaa tgggtcaaaa acatcaaaat ttctgatccc ttggaagaag 2280

gttgcagact aggccctatt gttagtgaag gacaggtata ttttctgttt ctcatttctg 2340

tatatcttat gcatttacgt cctactctct ttctaaagta aagggcaggt atgctttggt 2400

atgttcaaat gcccttattc aatattcaaa atgagaatgt gattaatatg atatcatcat 2460

taattatgaa ttatgatcaa gcttaatgta gtatggaata atgcataagc ttccttagaa 2520

gaattattgg ttggctggct atatatatat tatgagaagg agtcagagaa ggaaccttct 2580

cctggttgtt gtatatgttc ctatgattta gctttctctc tgttcttata acttaaaaca 2640

tcttattgat ataagcatat ttttcttgaa caaagattat ctaatattta tattatatgg 2700

ttcagtatga aaagatattg aagtttatct caaatgctaa gagtgagggt gcaaccattt 2760

tgactggtgg gtctcgccca gaggtatgat tatacattta taatttcttt gaaggtgtgt 2820

tttggttatg tgcttctgca attgttgtga gaattgattt tttttttctt tctgaaattc 2880

aatggcagca tctaaagaag ggattctttg ttgaaccaac tgtcataact gatgtaacta 2940

cctccatgca aatttggaga gaagaagtat ttggaccagt tctctgtgta aaaacattta 3000

gcactgagga agaagctatt gatctagcaa atgacactgt gtgagctgat gttttctgtg 3060

aactggcgac attaacttcc tctgtaaaaa aaaatttccc ttcatttttg gtttgatatc 3120

taagttatat actttaacct tccacagata tggcttgggt tctgctgtaa tatcaaatga 3180

tctagaaaga tgtgagcgca ttactaaggt gagactaatc ctaggttatc acagaaaaca 3240

aaaaatgatt ggattgtttc tgcagctaaa tagttcatct tgcttcaatg caggctttta 3300

aggctggaat tgtgtggatt aattgctctc aaccatgctt cactcaagcc ccatggggag 3360

gcattaaacg cagtggtttt ggtcgtgaat taggagaatg gtatggtcct tatttcctaa 3420

attaacaaat gcaagtaacc tcaaatacct ttcttctctt tgcctggata tcatgtctaa 3480

catgcaaaag aaacttacat ttataagttg aagtccatgg attgttgaat gctcctgtac 3540

cactcaaccg ttgacagttt gttgaccatc agattttgta caaccaaatt taatcaaaag 3600

gtcgataaag ctgtgtaaca tcgtggcact ggtgcagctt tgcacttttt agttggagta 3660

attttaaatc atagggattg tgatgcattg acacatttaa attaataaac taataataaa 3720

aaagtcacct acgatttgag tgaatttatt ctaagttgtc acgttccttt ggtttgaagc 3780

tagcataaaa aatgaatagg gtcacagaga cagtagatta aactcacgca caattgcaaa 3840

agagaaaaca taccttcacc tcgatcattc tcagatatgg tgtggaaaat aaaaactttt 3900

aagcttttat ttgagcttct gagtaatttt tcttattaac tttttcaggg gacttgataa 3960

ttacttgagt gtgaagcaag tgacccaata tatctctgat gaaccgtggg gctggtacca 4020

gtctccttca aggctgtgat aggtatccaa aagctaacat taataagttg tgggtaatat 4080

caaattacga ttatgacccc aaagtcgaga agacatgatg tctatgtata acattgaaat 4140

ggtttgcact ttgcagtcaa gattatgttg gtagtgtttt tatttgattt gtttatggtt 4200

ggctccacca catgcttcta atgtttgaat ttcatcatgg aagacttcca tcattacatt 4260

atattgaagc atttcttgcg cttaagttac gaatcatgca tcaatagatc tgacttaaaa 4320

ttg 4323

Claims (10)

1.一种赋予植物产生香味或增强植物香味的方法，其特征在于，包括步骤：

降低或抑制所述植物中BADH1和BADH2基因或两者编码蛋白的表达量和/或活性，从而赋予植物产生香味或增强植物的香味，其中，所述BADH1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1所示；所述BADH2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述植物为大豆。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降低或抑制BADH1和BADH2基因或两者蛋白的表达和/或活性通过选自下组的方法实现： RNA干扰技术、基因编辑技术、导入基因或蛋白的抑制剂、或其组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降低或抑制BADH1和BADH2基因或两者蛋白的表达和/或活性通过选自下组的方法实现：基因突变、基因敲除、基因中断、或其组合。

4.一种用于赋予植物产生香味或增强植物香味的组合物，其特征在于，包括：

(a) BADH1和BADH2基因或两者编码蛋白的抑制剂；和

(b) 农学上可接受的载体；

所述BADH1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述BADH2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述植物为大豆；所述抑制剂选自下组：基因编辑试剂、反义核酸、Crispr试剂、或其组合。

5.权利要求4所述的组合物的用途，其特征在于，用于赋予植物产生香味或增强植物香味；所述植物为大豆。

6.权利要求4所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备赋予植物产生香味或增强植物香味的试剂或试剂盒；所述植物为大豆。

7.一种制备基因工程的植物细胞、或植物组织、或植物部分、或植物的方法，其特征在于，包括步骤：

降低或抑制植物细胞、或植物组织、或植物部分、或植物中的BADH1和BADH2基因或两者编码蛋白的表达和/或活性，从而获得基因工程的植物细胞、或植物组织、或植物部分、或植物；所述BADH1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述BADH2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述植物为大豆。

8.一种制备基因工程植物的方法，其特征在于，包括步骤：

将权利要求7所述方法制备的基因工程的植物细胞、或植物组织、或植物部分再生为植物体，从而获得基因工程植物；所述植物为大豆。

9.一种改良植物的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)提供一植物或植物部分，抑制所述植物或植物部分中的BADH1和BADH2基因或两者编码蛋白的表达和/或活性；或者，降低或抑制植物细胞、植物组织、植物部分中的BADH1和BADH2基因或两者编码蛋白的表达和/或活性；

(b)将步骤(a)中的植物细胞、植物组织、植物部分再生成植株；

所述BADH1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述BADH2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述植物为大豆。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述改良为赋予植物产生香味或增强植物香味。