CN116064428A - 新型抗除草剂乙酰辅酶a羧化酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白、核酸及其应用，具体地，涉及突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白、核酸及其在植物育种中的应用，具体地，本发明提供了一种突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白，并且所述的突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白与亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第2125位、第2097位、第2139位、第2194位、第2186位、第2273位、第2168位、第1975位、第1954位、第1864位、第2211位、第2187位、第2123位、第2126位；乙酰辅酶A羧化酶(ACC)突变后的植物具有很高的除草剂抗性，在培育抗除草剂植物中具有非常广阔的应用前景。

Description

新型抗除草剂乙酰辅酶A羧化酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术、作物遗传育种领域，具体涉及一种乙酰辅酶A羧化酶突变型蛋白、核酸及其在提高植物对除草剂抗体的方法与应用。

背景技术

稻米(Oryza sativa)被世界人口的2/3所食用，是至少其中一半人口饮食中的主要能量来源。大米是一种低成本食品，制备简便，快速，并且可以与各种菜肴搭配食用。

除草剂用于防治农作物中的杂草或植物已经成为几乎普遍的做法。除草剂作为现代农业生产体系的重要组成部分，是农田除草技术中最可靠且经济的手段。自2,4-D于20世纪四十年代开始使用以来，除草剂工业已有60多年的发展历史，迄今已成功开发出了一大批选择性除草剂。对于ACC酶抑制剂的研究始于20世纪70年代，ACC除草剂共分为4种类型，分别是芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxyp ropanoates，APP)、肟醚类环己二酮(Cyclohexanedione oximes，CHD)、芳氧苯基环己二酮类(Aryloxyphenylcy-clohexanedione，APCHD)以及三酮类环己二酮(Cyclict riketones，CTR)。ACC除草剂可以抑制禾本科植物体内的脂肪酸合成，选择性高，在植物体内传导，能够苗后防除一年或多年生禾本科杂草。

它具有高效、低毒、施用期长、对后茬作物安全等优点，因而在除草剂市场中占有重要地位。

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACCase，ACC)是化学除草剂的一个重要靶标，是发现于1958年的一种生物素包含酶。它在生物体内催化乙酰辅酶A羧化形成丙二酰辅酶A，为脂肪酸和许多次生代谢产物的合成提供底物，是脂肪酸生物合成的关键酶或限速酶。该羧化酶有两步可逆反应，包括通过生物素-羧化酶酶活性将底物结构域上的生物素基团进行ATP依赖的羧化反应，然后通过羧基转移酶从生物素转移羧基得到乙酰辅酶A底物。乙酰辅酶A羧化酶是植物生物合成脂肪酸的关键酶，该过程发生在叶绿体和线粒体中，而且ACC还在长链脂肪酸和类黄酮的形成以及发生在细胞质中的丙二酰化中起作用。

发明内容

本发明目的是提供一种可赋予植物除草剂抗性的突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白或多核苷酸及其应用。

本文中，ACCase或ACC指代的均是乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase)。突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)

一方面，本发明提供了一种突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，所述突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)与亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ IDNo.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第2125位、第2097位、第2139位、第2194位、第2186位、第2273位、第2168位、第1975位、第1954位、第1864位、第2211位、第2187位、第2123位、第2126位；优选的，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第2125位、第2097位、第2139位、第2194位、第2186位。

在一个实施方式中，所述第2186和第2187位氨基酸位点同时发生突变，或者，所述第2123和第2125位氨基酸位点同时发生突变，或者，所述第2125和第2126位氨基酸位点同时发生突变。

在一个实施方式中，第2273位、第2194位、第2168位、第1975位、第1954位、第1864位、第2097位、第2211位、第2139位、第2186位、第2187位、第2123位、第2125位、第2126位氨基酸位点分别为S、G、R、S、P、I、W、E、I、C、Y、A、W、R。

在一个实施方式中，所述第2273位氨基酸突变为非S的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，F。

在一个实施方式中，所述第2194位氨基酸突变为非G的氨基酸，例如，A，V，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，S或A。

在一个实施方式中，所述第2168位氨基酸突变为非R的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，I；优选，P。

在一个实施方式中，所述第1975位氨基酸突变为非S的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，F。

在一个实施方式中，所述第1954位氨基酸突变为非P的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，H，R，I；优选，S。

在一个实施方式中，所述第1864位氨基酸突变为非I的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R；优选，V。

在一个实施方式中，所述第2097位氨基酸突变为非W的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，S或G。

在一个实施方式中，所述第2211位氨基酸突变为非E的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，K。

在一个实施方式中，所述第2139位氨基酸突变为非I的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R；优选，V或N。

在一个实施方式中，所述第2186位氨基酸突变为非C的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，P，H，R，I；优选，R或H。

在一个实施方式中，所述第2187位氨基酸突变为非Y的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，H。

在一个实施方式中，所述第2123位氨基酸突变为非A的氨基酸，例如，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，T。

在一个实施方式中，所述第2125位氨基酸突变为非W的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，C或S。

在一个实施方式中，所述第2126位氨基酸突变为非R的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，I；优选，K。

在优选的实施方式中，所述第2125位氨基酸突变为C；所述第2097位氨基酸突变为G；所述第2139位氨基酸突变为V或N；所述第2194位氨基酸突变为A；所述第2186位氨基酸突变为H。

在一个实施方式中，所述亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)可以来源于任何植物。

在一个实施方式中，所述亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

在一个实施方式中，所述亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

在一个优选实施方式中，本发明的亲本型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)来源于稻属，特别是水稻。

在一个实施方式中，所述亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)具有ACC活性、并且所述亲本ACC的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。

在优选的实施方式中，所述亲本ACC的氨基酸序列具有SEQ ID No.1所示的序列。

在优选的实施方式中，所述亲本ACC的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

另一方面，本发明提供了一种突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，所述突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)选自以下I-III任意一组：

I、由SEQ ID No.1所示氨基酸序列在包含以下任一或任意几个氨基酸位点处产生突变得到的突变型的ACC：第2273位、第2194位、第2168位、第1975位、第1954位、第1864位、第2097位、第2211位、第2139位、第2186位、第2187位、第2123位、第2125位、第2126位；

II、与I所述的突变型的ACC相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的ACC相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的突变型的ACC，并且保留了除草剂抗性的活性；

III、与I所述的突变型的ACC相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的ACC相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且保留了除草剂抗性的活性；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。

在其他的实施方式中，本发明的突变型的乙酰辅酶A羧化酶还包括其他的对除草剂产生抗性的突变位点。

本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。

表1

保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在ACC的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。

本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从ACC蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。

应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备ACC蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

领域技术人员能够理解，本发明ACC蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。

本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定ACC蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。

融合蛋白

另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，包含本发明的突变型ACC蛋白；进一步的，所述融合蛋白还包括：标签肽如，组氨酸标签，6×His，或者质体引导肽，例如引导到叶绿体内的肽，或者调控元件，例如启动子序列、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、标记基因等。

多核苷酸

另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码所述突变型ACC蛋白或其活性片段。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、RNA序列、或其组合。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸在所述突变蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、核定位信号(NLS)或其组合。

在一个实施方式中，该多核苷酸还包含与所述突变多肽的ORF序列操作性连接的启动子。

在一个实施方式中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

核酸构建物

另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。

在一个实施方式中，所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。

载体

本发明还提供了一种载体，所述载体包含有编码本发明的突变型ACCase或者融合蛋白的核酸序列，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。

在一个实施方式中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体。

在一个实施方式中，载体可以是对宿主细胞内源性的ACC基因进行基因编辑的载体。

在一个实施方式中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。

在一个实施方式中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。

载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

优选地，本发明中的载体是质粒。

编辑载体系统

另一方面，本发明提供了一种编辑载体系统，所述编辑载体系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体至少包含靶向亲本ACC的引导序列。

所述引导序列含有部分亲本型ACC的核苷酸序列，优选的至少含有15bp的ACC核苷酸序列，更优选的至少包括20bp的ACC核苷酸序列。在一种实施方式中，该编辑载体还包括基因编辑酶。所述基因编辑酶包括CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术Tanscription Activator-like(TAL)effector nucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zinc finger nuclease)编辑工具的核酸酶。

优选地，所述基因编辑酶为Cas蛋白，又名CRISPR酶或Cas效应蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。

优选的，Cas蛋白可操作的连接第一调节元件。

在一个实施方式中，所述基因编辑酶为Cas9蛋白，所述载体中还包括与该Cas9蛋白可以特异性结合的Scaffold序列。Scaffold序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。

在其他的实施方式中，所述基因编辑酶为Cas12蛋白，例如，Cas12a、Cas12b、Cas12i，所述载体中还包括与该所述Cas12蛋白特异性结合的单向重复序列(DirectRepeat)。单向重复序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。

上述调节元件包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。

优选的，所述编辑载体系统还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。

在一种实施方式中，编辑载体中还包含抗性基因以便于筛选，所述抗性基因包括hyg、bar、kana、rif、spec、amp，所述抗性基因是本领域技术人员所熟知的。

优选的，Cas蛋白选用nCas9或其他有nick活性的Cas9蛋白。其中“n”表示nick，即只具有单链切割活性的Cas蛋白。

宿主细胞

另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的基因、所述融合蛋白、载体和核酸构建物中的一种或多种；或者，所述的宿主细胞基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个实施方式中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

在一个实施方式中，所述的宿主细胞为植物细胞，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在一个实施方式中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在一个实施方式中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在一个实施方式中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

抗性植株

另一方面，本发明提供了一种具有除草剂抗性的植株，所述植株含有所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的多核苷酸、所述融合蛋白、载体和核酸构建物中的一种或多种；或者所述的植株基因组中整合有所述的多核苷酸。

制备突变多肽的方法

另一方面，本发明提供了一种制备所述突变型ACC多肽或其活性片段的方法，所述的方法包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养包含所述突变型ACC多肽的宿主细胞，从而表达所述的突变型ACC多肽；优选的，所述方法还包括

(b)分离所述的突变型ACC多肽的步骤。

获得除草剂抗性植物的方法

另一方面，本发明提供了一种具有除草剂抗性的植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分、植物，其中，所述植物细胞、植物组织、植物种子、植物部分、植物含有所述的突变型ACC多肽或其多核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了一种获得或制备具有除草剂抗性的植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入上述突变型ACC多肽或其多核苷酸序列。

在一个实施方式中，本发明所述的引入ACC突变多肽，包括将ACC突变多肽在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤，例如，通过表达载体对所述突变多肽进行表达的，或者将所述突变多肽整合到植物基因组上进行表达。

在另一优选例中，上述方法包括以下步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的突变型ACC多肽或其活性片段的DNA编码序列；

(2)将植物细胞、植物组织、植物部分与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述突变型ACC多肽或其活性片段的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和

(3)选择已转入所述突变型ACC多肽或其活性片段的DNA编码序列的植物细胞。

在一个实施方式中，所述引入ACC突变多肽包括将植物的内源性ACC进行突变从而引入所述突变多肽的步骤；优选的，可以采用基因编辑的方式引入所述突变多肽。

在另一优选例中，所述的方法包括使植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分内源性ACC编码序列在相应于SEQ ID No.1的第2273位、第2194位、第2168位、第1975位、第1954位、第1864位、第2097位、第2211位、第2139位、第2186位、第2187位、第2123位、第2125位、第2126位氨基酸位点的任一或任意几处发生突变的步骤。

在另一优选例中，所述的方法包括以下步骤：

(1)在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分中引入前述编辑载体系统；

(2)使基因编辑工具作用于其内源性ACC编码序列，并使其在相应于SEQ ID No.1的第2273位、第2194位、第2168位、第1975位、第1954位、第1864位、第2097位、第2211位、第2139位、第2186位、第2187位、第2123位、第2125位、第2126位氨基酸位点的任一或任意几处发生突变的步骤。

进一步的，上述方法还包括筛选突变的植物细胞、植物组织、植物部分，以及任选的，分离所述的基因编辑工具的步骤。

在另一优选例中，所述的基因编辑工具包括CRISPR、TALEN和ZFN。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

控制杂草的方法

另一方面，本发明还提供了一种控制植物附近杂草生长的方法，其包括：

a)提供上述对除草剂具有抗性的植物；

b)向所述植物和其附近的杂草施用有效量的除草剂，从而控制所述植物附近的杂草。

所述植物优选为水稻。

所述除草剂为ACCase抑制剂或ACCase抑制剂类除草剂，包含芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxyp ropanoates，APP)、肟醚类环己二酮(Cyclohexanedione oximes，CHD)、芳氧苯基环己二酮类(Aryloxyphenylcy-clohexanedione，APCHD)以及三酮类环己二酮(Cyclict riketones，CTR)中的一种或多种。优选的，所述除草剂包含高效氟吡甲禾灵、禾草灭、丁苯草酮、烯草酮、环己烯草酮、噻草酮、烯禾啶、吡喃草酮、三甲苯草酮、苯丙草酮、炔禾灵、炔草酸、氯丁草、禾草灵、唑禾草灵、精唑禾草灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、精吡氟氯禾灵、异草醚、环苯草酮、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、精喹禾乙酯、精喹禾糠酯、三氟苯氧丙酸、唑啉草酯、或其盐或酯中的一种或多种。

优选的，所述除草剂为高效氟吡甲禾灵、烯禾啶和烯草酮中的一种或多种。

用途

另一方面，本发明提供了所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的基因、所述融合蛋白、载体或核酸构建物在制备具有除草剂抗性的植物的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明提供了所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的基因、所述融合蛋白、载体或核酸构建物在控制杂草中的用途。

另一方面，本发明提供了所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的基因、所述融合蛋白、载体或核酸构建物在制备具有抗除草剂的植物中的用途。

除草剂

在一个实施方式中，本发明所述的除草剂为ACCase抑制性除草剂，所述ACCase抑制性除草剂包括但不限于芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxyp ropanoates，APP)、肟醚类环己二酮(Cyclohexanedione oximes，CHD)、芳氧苯基环己二酮类(Aryloxyphenylcy-clohexanedione，APCHD)以及三酮类环己二酮(Cyclict riketones，CTR)中的一种或多种。

优选的，本发明所述的除草剂包括但不限于高效氟吡甲禾灵、禾草灭、丁苯草酮、烯草酮、环己烯草酮、噻草酮、烯禾啶、吡喃草酮、三甲苯草酮、苯丙草酮、炔禾灵、炔草酸、氯丁草、禾草灵、唑禾草灵、精唑禾草灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、精吡氟氯禾灵、异草醚、环苯草酮、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、精喹禾乙酯、精喹禾糠酯、三氟苯氧丙酸、唑啉草酯、或其盐或酯中的一种或多种。

优选的，除草剂为高效氟吡甲禾灵、烯禾啶和烯草酮中的一种或多种。

一般定义

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。因此，本发明的组合物和方法还包含本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。可以通过包括但不限于以下的已知方法计算“同源性”：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物运算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑)Academic Press[学术出版社],纽约(1993)；Computer Analysis ofSequence Data,Part I[序列数据的计算机分析，第I部分](Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡马纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology[分子生物学中的序列分析](von Heinje,G.编辑)Academic Press[学术出版社](1987)；以及Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约(1991)。

本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.1进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similarity searchesofnucleic acid and protein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.1进行比来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。

术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。

本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。

术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如S1975F表示第1975位的S变为F。对于双重或多重突变，各突变之间以“/”隔开，例如，A2123T/W2125C表示相对于SEQ IDNo.1的氨基酸序列而言，第2123位的A被T取代且第2125位的W被C取代。

术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。

如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。

“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。

如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。

术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。

术语“ACC抑制剂类除草剂”是抑制禾本科植物体内的脂肪酸合成，选择性高，在植物体内传导，能够苗后防除一年或多年生禾本科杂草的一类除草剂。它具有高效、低毒、施用期长、对后茬作物安全等优点，因而在除草剂中占有重要地位。

ACC抑制剂类除草剂共分为4种类型，分别是芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxypropanoates，APP)、肟醚类环己二酮(Cyclohexanedione oximes，CHD)、芳氧苯基环己二酮类(Aryloxyphenylcy-clohexanedione，APCHD)以及三酮类环己二酮(Cyclict riketones，CTR)，结果如下所示。

所述除草剂包括但不限于：高效氟吡甲禾灵、禾草灭、丁苯草酮、烯草啶、环己烯草酮、噻草酮、烯禾啶、烯草酮、吡喃草酮、三甲苯草酮、苯丙草酮、炔禾灵、炔草酸、氯丁草、禾草灵、唑禾草灵、精唑禾草灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、精吡氟氯禾灵、异草醚、环苯草酮、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、精喹禾乙酯、精喹禾糠酯、三氟苯氧丙酸、唑啉草酯。

“抗除草剂”或“除草剂抗性”是指植物在暴露于通常对野生型致死的除草剂剂量后存活和繁殖的遗传能力。在植物中，抗性可以是天然产生的或通过诸如基因工程或选择由组织培养或诱变产生的变体的技术诱导的。除非另有说明，除草剂“抗性”是可遗传的，并且允许植物在除草剂对给定植物的典型除草有效处理的存在下生长和繁殖，如本发明公开的归档时除草剂手册的当前版本所建议的。正如本领域技术人员所认识到的，植物仍然可以被认为是“抗性的”，即使由于除草剂暴露而引起的一定程度的植物损伤是显而易见的。如本文所用，术语“耐受性”或“耐受性”包括本文所定义的“抗性”或“抗性”植物，以及特定植物在相同除草剂剂量下耐受在相同基因型的野生型植物中典型为乙基的各种程度的除草剂诱导的伤害的改进的能力。

在一个实施方式中，所述的突变多肽与亲本多肽相比，其对最大ACC抑制性除草剂的耐受浓度，提高至少1倍，例如，提高至少1.5倍，优选提高至少2倍，优选提高至少3倍，优选提高至少4倍，优选提高至少5倍，优选提高至少6倍，优选提高至少10倍。

在一个实施方式中，含有突变多肽的植物可以耐受至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或至少10倍的推荐用量的ACC抑制性除草剂浓度。

术语“亲本型ACC多肽”、“亲本ACC多肽”指的是所述ACC突变多肽所来源的多肽，在优选的实施方式中，所述亲本ACC多肽是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或蛋白质(多肽)，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型ACC多肽的氨基酸序列，例如SEQ IDNo.1所示；在某些实施方式中，所述亲本ACC多肽可以是对野生型的ACC多肽进行一个或多个氨基酸残基改变的、但不影响其酶活性质的多肽。

术语“突变的ACC蛋白”、“突变型ACC蛋白”、“突变ACC”、“突变ACC酶”、“突变蛋白”、“突变多肽”、“本发明多肽”、“本发明蛋白”等可互换使用。

术语“宿主生物”应理解为可以引入突变型ACC蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。

术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。

术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

术语“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。

如本文所用，术语“基因编辑酶”指适用于CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术Transcription Activator-like(TAL)effector nucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zinc finger nuclease)等编辑工具的核酸酶。优选地，所述基因编辑酶为CRISPR酶，又名Cas蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。所述的Cas蛋白是指蛋白家族，可以根据其来源不同而具有不同的结构，如来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9、来源于葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SaCas9；还可以根据结构特征(如结构域)进行下位分类，如Cas12家族包括Cas12a(又名Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12i等。所述的Cas蛋白可以具有双链或单链或无切割活性。本发明所述的Cas蛋白可以是野生型或其突变体，所述的突变体的突变类型包括氨基酸的替换、取代或缺失，所述的突变体可以改变也可以不改变Cas蛋白的酶切活性。优选地，本发明所述的Cas蛋白只具有单链切割活性或无切割活性，其为野生型Cas蛋白的一种突变体。优选地，本发明Cas蛋白为具有单链切割活性的Cas9、Cas12、Cas13或Cas14。在一优选实施方式中，本发明的Cas9蛋白包括SpCas9n(D10A)、nSpCas9NG、SaCas9n、ScCas9n、XCas9n，其中“n”表示nick，即只具有单链切割活性的Cas蛋白。突变已知Cas蛋白获得具有单链或无切割活性的Cas蛋白为本领域的常规技术手段。本领域技术人员所知，现有技术中已报到的多种具有核酸切割活性的Cas蛋白，该公知蛋白或其改造后的变体均可以实现本发明的功能，本文通过引用方式将其纳入保护范围。

如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的N和/或C末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型ACC蛋白的N和/或C末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段(比如含有本发明突变位点的氨基酸片段)，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型ACC蛋白的一部分，其保留了本发明的突变型ACC蛋白的生物学活性。例如，突变型ACC蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的N和/或C末端缺失了一个或多个(例如1-50个、1-25个、1-10个或1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。

此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。

本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。所获得的核苷酸序列可将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到大批量有关序列。本发明突变位点亦可通过人工合成引入。

可将一拷贝以上的本发明之多核苷酸插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。可通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中或者通过将可扩增的可选择标记基因与所述多核苷酸包含在一起来达到多核苷酸拷贝数目的增加，在后一情形下，包含扩增拷贝的选择标记基因以及由此而来的附加拷贝的多核苷酸的细胞可通过在适当的可选择制剂存在的条件下人工培养所述细胞进行选择。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ACC突变多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript IIKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。

本发明还提供了包含本发明ACC突变多肽编码核酸序列、核酸构建体或表达载体的宿主细胞。将包含编码本发明的载体引入宿主细胞中使得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在，或者载体可以对宿主细胞内源性的ACC基因进行基因编辑。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核生物细胞和真核生物细胞。

本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。

在本发明的生产方法中，用本领域众所周知的方法将所述细胞培养于适于所述多肽产生的营养培养基上。若所述多肽被分泌入营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。若所述多肽不分泌到培养基中，则可从细胞裂解物中回收它。

如本文中所使用的，术语“指导RNA(guide RNA)”、“成熟crRNA”、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。

在某些情况下，引导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，引导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。本发明的主要优点：

1、本发明筛选出了一组突变型的ACC蛋白。

2、含有本发明突变型ACC蛋白的植物相比野生型植物其具有明显的除草剂抗性。

附图说明

图1.evoAPOBEC1-SpRYCas9n碱基编辑器。

图2.ABE8e-SpRYCas9n碱基编辑器。

图3.ACCase基因的序列结构。

图4.转化CBE碱基编辑文库的愈伤组织分化出抗性幼苗(箭头所示)。

图5.转化ABE碱基编辑文库的愈伤组织分化出抗性幼苗(箭头所示)。

图6.转化CBE碱基编辑文库产生的抗性幼苗能正常生根(箭头所示)。

图7.转化ABE碱基编辑文库产生的抗性幼苗能正常生根(箭头所示)。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、碱基编辑载体优化、文库构建及抗除草剂突变位点的筛选

1、构建效率高、编辑范围广的水稻evoAPOBEC1-SpRYCas9n(CBE)和ABE8e-SpRYCas9n(ABE)碱基编辑器。

碱基编辑器可以在一定的序列窗口范围内实现C/G->T/A(CBE)或A/T->G/C(ABE)的碱基转换，而evoAPOBEC1和ABE8e是在第二代CBEmax和ABEmax碱基编辑器的基础上优化而来，靶向碱基编辑的效率有进一步的提高。SpRYCas9由SpCas9改进而来，SpCas9主要识别NGG的PAM序列，而SpRYCas9大幅降低了对PAM基序的要求，几乎可以以任何三个碱基作为PAM序列，但其中对NRN的识别效率高于NYN(R＝G/A，Y＝C/T)。为了进一步提高水稻碱基编辑的效率及扩大碱基编辑的范围，我们设计把新的脱氨酶和Cas9蛋白融合在一起，在之前开发的Anc689BE4max-nCas9和ABEmax-nCas9碱基编辑器的基础上，通过更换脱氨酶和Cas9蛋白，形成了新的evoAPOBEC1-SpRYCas9n(CBE)和ABE8e-SpRYCas9n(ABE)碱基编辑器(图1，图2)。

2、构建靶向水稻内源ACCase基因特定结构域的碱基编辑文库。

水稻内源ACCase基因(LOC_Os05g22940，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)由35个外显子组成，其中位于第34外显子的CT结构域被推测为外源除草剂靶向结合的主要结构域(图3)。我们把CT结构域里的一些特定区段设置为碱基编辑的靶标区，把DNA序列导入CRISPR-GE网站，以NRN(R＝R＝G/A)为PAM基序设计sg(sgRNA)靶点，共生成了数百条sg。我们把这些sg序列送到生工生物工程有限公司(上海)合成，然后分别克隆至evoAPOBEC1-SpRYCas9n和ABE8e-SpRYCas9n载体上，形成两个靶向水稻内源ACCase基因的碱基编辑文库。

3、水稻遗传转化及除草剂抗性突变体的筛选

把以上构建好的碱基编辑文库分别通过农杆菌转化水稻粳稻品种秀水134的愈伤组织，以潮霉素筛选出转基因阳性愈伤。在阳性愈伤分化阶段，我们在培养基上添加了靶向ACCase的除草剂：2mg/L高效氟吡甲禾灵(haloxyfop-R-methyl)(Sigma)。在该培养基上，转入空载体的愈伤组织不能分化形成幼苗，而转入CBE或ABE碱基编辑文库的愈伤组织，当ACCase基因实现碱基编辑导致氨基酸突变，并且该突变位点能够对高效氟吡甲禾灵产生抗性时，相应的突变植株就能正常分化形成幼苗(图4，图5)。

同样，我们在生根壮苗培养上也添加2mg/L高效氟吡甲禾灵，转入空载体的水稻幼苗在该培养基上不能生根，而转入CBE或ABE碱基编辑文库的愈伤组织所产生的幼苗能够正常生根(图6，图7)。

4、抗性突变体的基因型鉴定

我们提取筛选到的抗性植株的叶片DNA，通过PCR及Sanger测序对ACCase基因靶标区进行鉴定，结果表明这些植株相对于野生型序列在靶点区出现一个或多个碱基替换，导致一个或多个氨基酸突变，表明这些突变赋予了植株对高效氟吡甲禾灵除草剂的抗性。我们筛选到12株水稻编辑植株，其各自对应的ACCase抗性突变位点总结于表2。

表2.不同编辑水稻的ACCase基因抗性突变位点

由上表可知，水稻ACC酶S2273F、G2194S、R2168P、S1975F、P1954S、I1864V、W2097S或E2211K的单氨基酸位点突变分别导致水稻对高效氟吡甲禾灵除草剂产生抗性；I2139突变为V或N导致水稻对高效氟吡甲禾灵除草剂产生抗性；C2186R和Y2187H的突变、A2123T和W2125C的突变、W2125S和R2126K的突变，也分别导致水稻对高效氟吡甲禾灵除草剂产生抗性。

针对上述获得的不同的突变位点，为了研究同一氨基酸位点突变成不同的残基对水稻除草剂抗性的影响，我们采用单碱基编辑的方式又获得了其他的单氨基酸位点突变的水稻编辑植株，其涉及的水稻ACCase的突变形式如下所示：W2125C、G2194A、I2139V、I2139N、W2097G、W2097L或C2186H。

实施例2、对实施例1获得的水稻ACCase突变体抗除草剂的性能测试

本实施方式中，采用高效氟吡甲禾灵和烯禾啶，针对实施例1获得的不同水稻ACCase突变植株E0代组织培养阶段的除草剂抗性、E1代苗期的除草剂抗性以及温室和田间种植时不同水稻突变植株的主要农艺性状进行测试，主要农艺性状包括株高、分蘖数、结实率等。

其中，E0代组织培养阶段，高效氟吡甲禾灵的用量为2mg/L；E1代苗期喷施高效氟吡甲禾灵或烯禾啶，高效氟吡甲禾灵或烯禾啶的用量分别采用大田推荐用量的1倍和2倍。

注：除草剂抗性:++表示强抗；+表示弱抗。其中，E1代苗期抗性中的强抗表示植株在推荐用量2倍的除草剂浓度下仍然长势良好，但这并不意味着其只能耐受推荐用量2倍的除草剂浓度，有可能还可以耐受推荐用量3倍、4倍甚至更高浓度的除草剂；E1代苗期抗性中的弱抗是指植株在推荐用量2倍的除草剂浓度下表现不好，但在推荐用量1倍的除草剂浓度下长势良好。

温室和田间的表型：√表示突变植株表型与野生型一致；-表示植株表型比野生型稍差；×表示植株表型严重受影响，包括植株矮小、结实率明显变低等。

由表3可知，虽然有些突变植株在组培阶段对除草剂表现除了抗性，但是在苗期却无法再表现出抗性，在温室和田间培养时的农艺性状也受到了严重影响，例如，I1879L和G2194N的突变。其中，除草剂抗性以及农艺性状表现较好的是W2125C、G2194S、G2194A、I2139V、I2139N、W2097G或C2186H的突变株；这反映出，水稻的ACCase的如下突变：W2125C、G2194S、G2194A、I2139V、I2139N、W2097G或C2186H对于培育除草剂抗性水稻具有实际的应用价值。另外，通过表3，还可以知晓，即使是同一氨基酸位点的突变，当其突变为不同的氨基酸时，对于植株的影响是巨大的；例如，W2097S的突变导致植株的农艺性状受到严重影响，但是，W2097G的突变对于植株的农艺性状没有影响。

对上述除草剂抗性以及农艺性状表现较好的W2125C、G2194S、G2194A、I2139V、I2139N、W2097G或C2186H的突变株，采用其他的ACC抑制剂类除草剂进行除草剂耐受试验(例如，吡氟氯禾灵)，上述突变株同样表现出了与高效氟吡甲禾灵或烯禾啶相当的耐受效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (18)

1.一种突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，所述突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)与亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第2273位、第2168位、第1975位、第1954位、第1864位、第2211位、第2139位；

所述第2273位氨基酸突变为F，所述第2168位氨基酸突变为P，所述第1975位氨基酸突变为F，所述第1954位氨基酸突变为S，所述第1864位氨基酸突变为V，所述第2211位氨基酸突变为K，所述第2139位氨基酸突变为V。

2.一种突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，所述突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)选自以下I-III任意一组：

I、由SEQ ID No.1所示氨基酸序列在包含以下任一或任意几个氨基酸位点处产生突变得到的突变型的ACC：第2273位、第2168位、第1975位、第1954位、第1864位、第2211位、第2139位；

II、与I所述的突变型的ACC相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的ACC相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的突变型的ACC，并且保留了除草剂抗性的活性；

III、与I所述的突变型的ACC相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的ACC相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且保留了除草剂抗性的活性；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。

3.根据权利要求1-2任一所述的突变型的ACC，其特征在于，所述亲本ACC来源于单子叶植物或双子叶植物。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-3任一所述的突变型的ACC。

5.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有权利要求4所述的多核苷酸，优选的，还含有与之可操作连接的调控元件；

优选地，所述调控元件选自下组中的一种或任意几种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多核苷酸序列、标记基因。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求1-3任一所述的突变型的ACC，或权利要求4所述的多核苷酸，或权利要求5所述的核酸构建体。

7.一种赋予植物对除草剂产生抗性的方法或者制备具有除草剂抗性的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入权利要求1-3任一所述突变型的ACC的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述除草剂为ACCase抑制剂类除草剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述除草剂选自高效氟吡甲禾灵、烯禾啶、吡氟氯禾灵中的一种或任意几种组合。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-3任一所述的突变型的ACC在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括将植物的内源性ACC进行突变从而引入所述突变型的ACC的步骤。

12.权利要求1-3任一所述的突变型的ACC、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的核酸构建体、或权利要求6所述的宿主细胞在制备具有除草剂抗性的植物中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述除草剂为ACCase抑制剂类除草剂。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述除草剂选自高效氟吡甲禾灵、烯禾啶、吡氟氯禾灵中的一种或任意几种组合。

15.一种植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物，其包含权利要求1-3任一所述的突变型的ACC、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的核酸构建体、或权利要求6所述的宿主细胞。

16.一种控制农田中杂草的方法，其特征在于：

a)提供权利要求7-11任一方法制备得到的除草剂抗性植株，

b)向所述植物和其附近的杂草施用有效量的除草剂，从而控制所述植物附近的杂草。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述除草剂为ACCase抑制剂类除草剂。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述除草剂选自高效氟吡甲禾灵、烯禾啶、吡氟氯禾灵中的一种或任意几种组合。

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