CN116478988A - 一种增大大豆籽粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种增大大豆籽粒的方法，所述方法通过利用Cas12i和gRNA对大豆miR396进行编辑，从而获得了籽粒增大、产量提高的大豆。

Description

一种增大大豆籽粒的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及在大豆中进行基因编辑的方法，尤其涉及一种利用Cas12i基因编辑技术获得的突变的miR396及其在增大大豆籽粒中的应用。
背景技术
大豆是人类主要油脂和蛋白质的来源，是世界最重要的经济作物之一，也是人类植物油和植物性蛋白的主要来源。大豆因营养全面，蛋白含量高等诸多有点被广泛用于豆制品工和饲料。然而因为我国大豆产量低、农民种植经济效益低导致我国大豆种植面积小、总产量仅有2000万吨，80％以上的大豆依赖进口，严重威胁到国家粮食安全。
microRNA(miRNA)是一类非编码单链小RNA分子，它通过碱基配对结合靶基因的mRNA，从而调控靶基因。在植物的生长过程中，植物miRNA在调控分生组织特性、叶片极性和开花模式等方面发挥着关键性的作用。其中，植物miR396是一类高度保守的内源性的含有20–24个核苷酸长度的非编码单链小RNA分子，能够调控其靶基因GRF的表达。相关研究表明，miR396能够调控作物的分蘖、粒型和穗型等，进而影响作物的产量。
CRISPR/Cas基因编辑技术用于作物育种具有不含转基因成分、育种周期短和定向改良植物性状的优点。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5’-TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。Cas12i也属于V型CRISPR/Cas系统，中国专利(CN111757889B，公告日期：20210525)公开了一种V型Cas酶(Cas12f.4)，在本发明中，将Cas12f.4定义为Cas12i。Cas12i用于真核细胞基因编辑的编辑效率有待提升。
本研究通过优化的Cas12i定向编辑大豆miR396家族基因，创制出大籽粒、高产大豆的种质资源。
发明内容
本发明目的是提供一种突变的miR396及其在增大大豆籽粒、增加大豆粒重、增加大豆单株种子数或提高大豆产量中的应用。
一方面，本发明提供了一种突变的miR396，所述的突变的miR396相对于亲本miR396具有碱基突变，所述亲本miR396为来源于大豆的野生型miR396，所述亲本miR396选自miR396a、miR396b、miR396c、miR396d或miR396f。
在一个实施方式中，所述miR396包括miR396a、miR396c、miR396d和miR396f；在其他的实施方式中，所述miR396包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d和miR396f。
在一个实施方式中，所述突变的miR396选自以下一种或任意几种：
(i)miR396a、miR396c、miR396d和miR396f相对于亲本miR396具有碱基突变；
(ii)miR396a、miR396b、miR396c、miR396d和miR396f相对于亲本miR396具有碱基突变。
在一个实施方式中，所述突变的miR396导致大豆的籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高。
在一个实施方式中，所述碱基突变包括碱基缺失、碱基插入或碱基替换。
在一个实施方式中，所述亲本miR396为来源于大豆的野生型miR396。在一个实施方式中，所述大豆为中黄302。
在一个实施方式中，所述亲本miR396a来源于大豆，且与SEQ ID No.2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396a的序列如SEQ ID No.2所示。
在一个实施方式中，所述亲本miR396b来源于大豆，且与SEQ ID No.3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396b的序列如SEQ ID No.3所示。
在一个实施方式中，所述亲本miR396c来源于大豆，且与SEQ ID No.4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396c的序列如SEQ ID No.4所示。
在一个实施方式中，所述亲本miR396d来源于大豆，且与SEQ ID No.5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396d的序列如SEQ ID No.5所示。
在一个实施方式中，所述亲本miR396f来源于大豆，且与SEQ ID No.6所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396f的序列如SEQ ID No.6所示。
在一个实施方式中，所述miR396a、miR396c、miR396d和miR396f相对于野生型miR396a、miR396c、miR396d或miR396f具有碱基突变。
在一个实施方式中，所述miR396a、miR396c、miR396d和miR396f相对于野生型miR396a、miR396c、miR396d或miR396f具有碱基缺失。
在一个实施方式中，所述亲本miR396a的序列如SEQ ID No.2所示，所述突变的miR396a相对于SEQ ID No.2所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396c的序列如SEQIDNo.4所示，所述突变的miR396c相对于SEQ ID No.4所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396d的序列如SEQ ID No.5所示，所述突变的miR396d相对于SEQ ID No.5所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396f的序列如SEQ ID No.6所示，所述突变的miR396f相对于SEQ IDNo.6所示序列具有碱基缺失。
在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396a的序列如SEQ ID No.2所示，所述突变的miR396a缺失相对于SEQ ID No.2所示序列的第229位碱基；所述亲本miR396c的序列如SEQ ID No.4所示，所述突变的miR396c缺失相对于SEQ ID No.4所示序列的第230位-第255位碱基；所述亲本miR396d的序列如SEQ ID No.5所示，所述突变的miR396d缺失相对于SEQID No.5所示序列的第19位-第29位碱基；所述亲本miR396f的序列如SEQ ID No.6所示，所述突变的miR396f缺失相对于SEQ ID No.6所示序列的第265位碱基。
在一个实施方式中，所述突变的miR396a、miR396b、miR396c、miR396d和miR396f相对于野生型miR396a、miR396b、miR396c、miR396d或miR396f具有碱基突变。
在一个实施方式中，所述突变的miR396a、miR396b、miR396c、miR396d和miR396f相对于野生型miR396a、miR396b、miR396c、miR396d或miR396f具有碱基缺失。
在一个实施方式中，所述亲本miR396a的序列如SEQ ID No.2所示，所述突变的miR396a相对于SEQ ID No.2所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396b的序列如SEQ IDNo.3所示，所述突变的miR396b相对于SEQ ID No.3所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396c的序列如SEQ ID No.4所示，所述突变的miR396c相对于SEQ ID No.4所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396d的序列如SEQ ID No.5所示，所述突变的miR396d相对于SEQ IDNo.5所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396f的序列如SEQ ID No.6所示，所述突变的miR396f相对于SEQ ID No.6所示序列具有碱基缺失。
在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396a的序列如SEQ ID No.2所示，所述突变的miR396a缺失相对于SEQ ID No.2所示序列的第229位碱基；所述亲本miR396b的序列如SEQ ID No.3所示，所述突变的miR396b缺失相对于SEQ ID No.3所示序列的第30位-第100位碱基；所述亲本miR396c的序列如SEQ ID No.4所示，所述突变的miR396c缺失相对于SEQID No.4所示序列的第229位碱基；所述亲本miR396d的序列如SEQ ID No.5所示，所述突变的miR396d缺失相对于SEQ ID No.5所示序列的第18位-第26位碱基；所述亲本miR396f的序列如SEQ ID No.6所示，所述突变的miR396f缺失相对于SEQ IDNo.6所示序列的第264位-第265位碱基。
另一方面，本发明还提供了一种载体，所述载体包含所述突变的miR396。
在一个实施方式中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
在一个实施方式中，所述载体是病毒载体(例如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关载体和单纯疱疹载体)，还可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。
在一个实施方式中，所述载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。
在一个具体的实施方式中，所述载体是质粒。
在一个实施方式中，所述载体还包括表达调控元件。
另一方面，本发明了提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包括所述突变的miR396或所述的载体。
在一个实施方式中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或动物细胞或植物细胞。
在一个实施方式中，所述植物包括被子植物和裸子植物。
在一个实施方式中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在一个实施方式中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在一个实施方式中，所述植物包括大豆、拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
在一个实施方式中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
另一方面，本发明提供了一种基因编辑试剂，所述基因编辑试剂能够在大豆中产生所述突变的miR396；所述基因编辑试剂包括Cas12i和gRNA，所述gRNA包括与Cas12i结合的骨架区以及与靶序列杂交的引导序列，所述gRNA靶向大豆中的miR396；所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变。
在一个实施方式中，所述Cas12i在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸突变为R，第433位氨基酸突变为R。
另一方面，本发明提供了上述突变的miR396、载体、宿主细胞或基因编辑试剂在制备籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆中的用途；或在制备用于产生籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆的试剂或试剂盒中的用途。
另一方面，本发明提供了一种制备籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆的方法，所述方法包括步骤：
(a)在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中引入所述突变的miR396；
(b)将步骤(a)中的大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分再生为大豆植株。
在一个实施方式中，所述籽粒增大是指含有突变的miR396的大豆比亲本大豆(含有野生型miR396)的籽粒至少增大了3％，优选增大了5％，优选增大了8％，优选增大了10％，优选增大了15％，优选增大了20％，优选增大了30％，优选增大了40％，优选增大了50％，优选增大了60％，优选增大了80％，优选增大了100％。
在一个实施方式中，所述粒重增加是指含有突变的miR396的大豆比亲本大豆(含有野生型miR396)的单粒重或百粒重或千粒重至少增加了5％，优选增加了10％，优选增加了12％，优选增加了13％，优选增加了15％，优选增加了20％，优选增加了25％，优选增加了30％，优选增加了40％，优选增加了50％，优选增加了100％。
在一个实施方式中，所述单株种子数增加是指含有突变的miR396的大豆比亲本大豆(含有野生型miR396)的单株种子数至少增加了3％，优选增加了5％，优选增加了6％，优选增加了10％，优选增加了15％，优选增加了20％，优选增加了23％，优选增加了25％，优选增加了30％，优选增加了40％，优选增加了50％，优选增加了100％。
在一个实施方式中，所述产量提高是指含有突变的miR396的大豆比亲本大豆(含有野生型miR396)的产量或单株产量或亩产量至少增加了5％，优选增加了10％，优选增加了15％，优选增加了20％，优选增加了21％，优选增加了25％，优选增加了30％，优选增加了40％，优选增加了50％，优选增加了60％，优选增加了100％。
在一个实施方式中，所述引入所述突变的miR396包括将大豆的内源性的miR396进行突变从而引入所述突变的miR396的步骤。
在一个实施方式中，引入突变的方法包括自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、X射线或Y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑。
在一个实施方式中，通过基因编辑的方式在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中引入所述突变的miR396。
在一个实施方式中，所述的方法包括将以下步骤：
(1)在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中引入含有基因编辑工具的表达载体；
(2)使基因编辑工具作用于大豆内源性miR396，并使其发生突变；
(3)筛选突变的大豆细胞、大豆种子、大豆组织、大豆部分或大豆；
(4)分离所述的基因编辑工具。
在一个实施方式中，所述基因编辑工具包括CRISPR、TALEN和ZFN。
在一个实施方式中，所述基因编辑工具为Cas12i。
在一个具体的实施方式中，所述基因编辑为采用Cas12i在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中进行基因编辑，所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变。
在一个实施方式中，所述Cas12i在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸突变为R，第433位氨基酸突变为R。
在一个具体的实施方式中，所述Cas12i蛋白连接有一个或多个NLS序列。在一个实施方式中，所述NLS序列连接至所述蛋白的N端和/或C端。
在一种实施方式中，所述引入所述突变的miR396包括将所述突变的miR396在大豆细胞、大豆种子、大豆组织、大豆部分或大豆中进行表达的步骤。
在一个实施方式中，所述基因编辑的方式还包括向大豆细胞、大豆种子、大豆组织、大豆部分或大豆中递送Cas12i的步骤。
另一方面，本发明还提供了一种对大豆进行基因编辑的方法，所述方法包括步骤：
(a)利用Cas12i和gRNA在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中进行基因编辑，获得经基因编辑的大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分；所述gRNA包括与Cas12i结合的骨架区以及与靶序列杂交的引导序列，所述gRNA靶向大豆中的miR396；所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变；
(b)将步骤(a)中经基因编辑的大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分再生成大豆植株。
在一个实施方式中，所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变；优选的，第369位氨基酸突变为精氨酸(Arg，R)，第433位氨基酸突变为精氨酸(Arg，R)。
在一个具体的实施方式中，所述Cas12i为突变的Cas12i(或优化的Cas12i)，其为SEQ ID No.1第369位氨基酸和第433位氨基酸同时发生突变(均突变为R)的突变蛋白，上述突变的Cas12i蛋白与SEQ ID No.1所示的野生型Cas12i相比，显著的提高了编辑活性。
在一个实施方式中，所述gRNA包括第一区段和第二区段；所述第一区段又称为“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复(Direct Repeat)序列”；所述第二区段又称为“靶向核酸的靶向序列”或者“靶向核酸的靶向区段”，或者“靶向靶序列的引导序列”。
所述gRNA的第一区段、“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复序列”能够与本发明的Cas12i蛋白相互作用，从而使Cas12i蛋白和gRNA形成复合物。本发明gRNA经过靶向核酸的靶向序列的作用将其相互作用的Cas12i蛋白引导至靶核酸内的特异性核苷酸序列。
本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列。换言之，本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段经过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。因此，靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段可改变，或可被修饰以杂交靶核酸内的任何希望的序列。
优选的，所述gRNA从5’至3’方向包含第一区段和第二区段。
本发明中，所述第二区段还可以理解为与靶序列杂交的引导序列。
在一个具体的实施方式中，所述gRNA中靶向靶序列的引导序列如SEQ ID No.7-8任一所示。
在一个具体的实施方式中，所述gRNA中的同向重复序列为如SEQ ID No.9所示。
在其他的实施方式中，所述gRNA的同向重复序列在SEQ ID No.9的基础上，还可以具有碱基缺失、取代或添加，只要其能保证与Cas12i的结合能力即可，例如，中国专利申请(CN113337502A)中记载的“agagaaugugugcauagucaacac”、
“agagaaugugugcauagucuacac”、“agagaaugugugcauaguccacac”或“agagaaugugugcauagucgacac”。
在一种实施方式中，所述编码所述Cas12i蛋白的核酸序列和编码指导RNA的核酸是人工合成的。
在一个实施方式中，本发明的基因编辑的方法包括向大豆细胞、大豆种子、大豆组织、大豆部分或大豆中递送Cas12i和gRNA的步骤。
上述递送可采用本领域已知的任何方法进行递送。此类方法包括但不限于，转化、转染、电穿孔、脂转染、显微注射、声孔效应、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状转染、热激转染、核转染、磁转染、脂转染、穿刺转染、光学转染、试剂增强性核酸摄取、以及经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒、载体、病毒载体、人工病毒体等的递送。
在一些实施方式中，使用一种或多种AAV载体、慢病毒载体、纳米颗粒或其组合递送Cas12i和gRNA中的一种或多种组分。
在一个实施方式中，通过农杆菌转化将Cas12i和gRNA递送到大豆细胞、大豆种子、大豆组织、大豆部分或大豆中。
上述gRNA在大豆细胞中靶向miR396，并且引导Cas12i蛋白到达所述基因组座位部位，对靶序列进行修饰、编辑或切割，由此该miR396发生突变。
在一个实施方式中，所述方法包括在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中引入所述突变的miR396的步骤。
另一方面，本发明还提供了一种制备籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆的方法，所述方法包括利用上述方法得到的大豆种子或大豆植株与其他的大豆进行杂交从而制备籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆的步骤。
术语定义
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。
术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。
术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。
如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
术语“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
野生型
如本文中所使用的，术语“野生型”具有本领域技术人员通常理解的含义，其表示生物、菌株、基因的典型形式或者当它在自然界存在时区别于突变体或变体形式的特征，其可从自然中的来源分离并且没有被人为有意地修饰。
载体
术语“载体”是指一种核酸分子，它能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。一种载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、融合蛋白、分离的核酸分子等(例如，CRISPR转录物，如核酸转录物、蛋白质、或酶)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。
另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。
其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。
宿主细胞
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如微生物细胞、真菌细胞、动物细胞和植物细胞的真核细胞。
本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。
动物
例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、非人灵长类动物(例如，猕猴或食蟹猴)或人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有病症(例如，疾病相关基因缺陷所导致的病症)。
植物
术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearingtree)、以及灌木和其他苗木。
术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
术语“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
基因编辑
术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。
CRISPR系统
如本文中所使用的，术语“规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR-相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统”或“CRISPR系统”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义，其通常包含与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达有关的转录产物或其他元件，或者能够指导所述Cas基因活性的转录产物或其他元件。
Cas蛋白
Cas蛋白、或CRISPR相关蛋白是指适用于CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统的核酸酶。优选地，所述Cas蛋白为CRISPR酶，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。所述的Cas蛋白可以根据其来源不同而具有不同的结构，如来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9、来源于葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SaCas9；还可以根据结构特征(如结构域)进行下位分类，如Cas12家族包括Cas12a(又名Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12i等。所述的Cas蛋白可以具有双链或单链或无切割活性。本发明所述的Cas蛋白可以是野生型或其突变体，所述的突变体的突变类型包括氨基酸的替换、取代或缺失，所述的突变体可以改变也可以不改变Cas蛋白的酶切活性。本领域技术人员所知，现有技术中已报到的多种具有核酸切割活性的Cas蛋白，该公知蛋白或其改造后的变体均可以实现本发明的功能，本文通过引用方式将其纳入保护范围。
本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如，可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在上述Cas突变蛋白的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。
表1
本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从Cas蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。
应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备上述蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
本领域技术人员能够理解，本发明Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。
本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定本发明Cas突变蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。
本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。
术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，如无特别说明，均是从N端起第xx位的氨基酸A变为氨基酸B。例如，N369R表示第369位的N突变为R。多个氨基酸位点同时存在突变时，可以采用N369R、S433R或N369R/S433R等类似的形式进行表述，例如，N369R、S433R代表第369位N突变为R同时第433位N突变为R。
本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.1进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similarity searchesofnucleic acid and protein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10，缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.1进行比来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。
本领域人员可以用本领域常用的软件，如Clustal Omega,将任一亲本Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1进行序列同一性比较和对齐(alignment),进而得到与本申请中所述基于SEQ ID No.1所定义的氨基酸位点相对应的所述亲本Cas蛋白中的氨基酸位点。
所述Cas蛋白的生物学功能包括但不限于，与指导RNA结合的活性、核酸内切酶活性、在指导RNA引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性，包括但不限于Cis切割活性和Trans切割活性。
本发明中，“Cas突变蛋白”也可以称之为突变的Cas蛋白、优化的Cas蛋白或者Cas蛋白变体。
指导RNA(guideRNA，gRNA)
如本文中所使用的，术语“指导RNA(guide RNA，gRNA)”、“成熟crRNA”、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列组成。
在某些情况下，引导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，指导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。
靶序列
“靶序列”是指被gRNA中的引导序列所靶向的多核苷酸，例如与该引导序列具有互补性的序列，其中靶序列与引导序列之间的杂交将促进CRISPR/Cas复合物(包括Cas蛋白和gRNA)的形成。完全互补性不是必需的，只要存在足够互补性以引起杂交并且促进一种CRISPR/Cas复合物的形成即可。
靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA。在某些情况下，所述靶序列位于细胞内或细胞外。在某些情况下，所述靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在某些情况下，该靶序列可位于真核细胞的一个细胞器例如线粒体或叶绿体内。可被用于重组到包含该靶序列的靶基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一个实施方式中，所述编辑模板为外源核酸。在一个实施方式中，该重组是同源重组。
在本发明中，“靶序列”或“靶多核苷酸”或“靶核酸”可以是对细胞(例如，真核细胞)而言任何内源或外源的多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种存在于真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。在某些情况下，该靶序列应该与原间隔序列临近基序(PAM)相关。
miR396
miR396是一类高度保守的内源性的含有20–24个核苷酸长度的非编码单链小RNA分子。植物miR396家族，在长时间的生物进化中，序列变化极小，具有高度保守性。miR396通过碱基配对结合靶基因生长调控因子(growth-regulating factors,GRFs)的mRNA，调节其表达来影响植物的各个器官的生长发育。
在大豆中，发现了多个miR396(miR396a/b/c/d/e/f/g/h/i/j/k)，这些miR396是从测序数据中识别出来的，它们的功能目前尚未得到相关研究的证实。
在一个实施方式中，大豆miR396a的序列如SEQ ID No.2所示；大豆miR396b的序列如SEQ ID No.3所示；大豆miR396c的序列如SEQ ID No.4所示；大豆miR396d的序列如SEQID No.5所示；大豆miR396f的序列如SEQ ID No.6所示。
本发明涉及的序列如下：
序列号(SEQ ID No.) 序列描述
1 Cas12i野生型的氨基酸序列
2 GmmiR396a的核酸序列
3 GmmiR396b的核酸序列
4 GmmiR396c的核酸序列
5 GmmiR396d的核酸序列
6 GmmiR396f的核酸序列
7 gRNA的引导序列1
8 gRNA的引导序列2
9 gRNA的DR序列
本发明的主要优点：
本发明通过Cas12i基因编辑技术定向编辑miR396，发现当miR396a、miR396c、miR396d和miR396f具有碱基突变，或者miR396a、miR396b、miR396c、miR396d和miR396f具有碱基突变时，大豆的籽粒增大、产量提高。
附图说明
图1.Cas12i蛋白编辑效率的验证，其中，1为野生型Cas12i，2为N369R和S433R组合突变的Cas12i蛋白。
图2.A部分为编辑植株acdf与野生型大豆(中黄302，WT)的籽粒大小比较，B部分为编辑植株abcdf与野生型大豆(中黄302，WT)的籽粒大小比较。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、Cas12i(N369R、S433R)突变蛋白的获得和编辑活性验证
申请人通过生物信息学方法对潜在的Cas12i3与目标序列相互结合的氨基酸进行定点突变，野生型Cas12i的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。定点突变的方法参照本领域常用的方法，本实施例中通过基于PCR的定点诱变产生Cas蛋白的变体。具体的方法是以突变的位点为中心将Cas12i3蛋白的DNA序列设计分成两部分，设计两对引物分别扩增这两部分DNA序列，同时引物上引入需要突变的序列，最后通过Gibson克隆的方式将两个片段装载到pcDNA3.3-eGFP载体上。突变体的组合则通过将Cas12i3蛋白的DNA拆分成多段，使用PCR、Gibson clone实现构建。片段扩增试剂盒：TransStart FastPfu DNAPolymerase(含2.5mMdNTPs)，具体实验流程详见说明书。胶回收试剂盒：Gel DNAExtraction MiniKit，具体实验流程详见说明书。载体构建所用试剂盒：pEASY-Basic Seamless Cloningand Assembly Kit(CU201-03)，具体实验流程详见说明书。本实施方式中所涉及的突变氨基酸位点以及所采用的引物序列如下表所示：
本实施方式中，通过定点突变，获得了N369R和S433R同时发生突变的Cas12i的突变蛋白，所述突变蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，第369位的N突变为R，第433位的S突变为R。
针对上述突变的Cas12i蛋白在动物细胞中验证其基因编辑的活性，针对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)FUT8基因设计靶点，FUT8-Cas-XX-g3：斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。载体pcDNA3.3经改造后带有EGFP荧光蛋白及PuroR抗性基因。经酶切位点XbaI和PstI插入SV40NLS-Cas-XX融合蛋白；经酶切位点Mfe1插入U6启动子及gRNA序列。CMV启动子启动融合蛋白SV40 NLS-Cas-XX-NLS-GFP表达。蛋白Cas-XX-NLS与蛋白GFP用连接肽T2A进行连接。启动子EF-1α启动嘌呤霉素抗性基因表达。铺板：CHO细胞融合度至70-80％进行铺板，12孔板中接种细胞数为8*10^4细胞/孔。转染：铺板24h进行转染，100μl opti-MEM中加入6.25μl HieffTransTM脂质体核酸转染试剂，混匀；100μl opti-MEM中加入2.5ug质粒，混匀。稀释好的Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂与稀释后的质粒混合均匀，室温孵育20min。孵育好的混合液加入铺有细胞的培养基中进行转染。加嘌呤霉素筛选：转染24h加嘌呤霉素，终浓度10μg/ml。嘌呤霉素处理24h更换成正常培养基继续培养24h。
提DNA、PCR扩增编辑区附近、送hiTOM测序：细胞经胰酶消化处理后进行收集，经细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(百泰克)进行基因组DNA提取。对基因组DNA扩增靶点附近区域。PCR产物进行hiTOM测序。测序数据分析，统计靶点位置上游15nt、下游10nt范围内的序列种类及比例，统计序列中SNV频率大于/等于1％或非SNV的突变频率大于/等于0.06％的序列，得到Cas-XX蛋白对靶点位置的编辑效率。CHO细胞FUT8基因靶点序列：FUT8-Cas-XX-g3：斜体部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。gRNA序列为：AGAGAAUGUGUGCAUAGUCAaCAC CAGCCAAGGUUGUGGACGGAUCA，下划线区域为靶向区，其他区域为DR(同向重复序列)区。
结果如图1所示，N369R和S433R组合突变的Cas12i蛋白与野生型Cas12i蛋白相比，编辑效率有显著的提高，提高了近1倍，针对目标基因编辑的类型包括碱基缺失、碱基插入以及碱基替换等。
实施例2、基于Cas12i(N369R、S433R)的CRISPR基因编辑技术制备大籽粒、高产大 豆
1、基因编辑载体构建
大豆miR396(GmmiR396)的家族成员包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d和miR396f，其核酸序列分别如SEQ ID No.2-6所示。
选取大豆GmmiR396的序列设计gRNA，设计的gRNA的引导序列如下：
上述gRNA的同向重复序列为agagaaugugugcauagucacac(5’至3’，SEQ ID No.9)。上述gRNA从5’至3’依次包括上述同向重复序列以及各自的引导序列。
根据靶点设计退火引物,引物退火后，通过T5核酸外切酶同源连接基因编辑骨架载体，所述基因编辑载体上包含Cas12i(N369R、S433R)蛋白以及上述gRNA。
2、重组菌获得
1)转化大肠杆菌
将步骤1中的基因编辑载体转化大肠杆菌，对转化的大肠杆菌进行菌液PCR，选择PCR条带大小正确的扩增产物测序，测序结果正确的大肠杆菌即含有基因编辑载体的重组大肠杆菌。
2)转化农杆菌
将步骤1)含有基因编辑载体的重组大肠杆菌进行培养后提质粒DNA，加入到农杆菌感受态细胞中，冰浴5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰上放置5min；
取出离心管，加入700μl培养液(无抗生素)，28℃振荡培养2～4h；
取出菌液与含相应抗生素的培养基平板上涂板，在培养箱中倒置培养，2天左右菌落可见，对菌落按步骤1)中的方法进行PCR，并对扩增产物进行测序，测序结果正确的农杆菌即含有基因编辑载体的重组农杆菌。
3、植物遗传转化
1)大豆种子灭菌：
将挑选好的大豆种子(中黄302)放在干燥器中的培养皿里，向干燥器中装有150ml次氯酸钠的烧杯中贴壁缓慢加入10ml浓盐酸，迅速关闭干燥器的盖子。用次氯酸钠和浓盐酸产生的氯气灭菌16h。
2)种子发芽：
将步骤1)已灭菌种子种脐向下插进培养基，于22℃暗培养24h。
3)农杆菌菌液制备：
取储藏在-80℃冰箱中的菌液，在含有抗生素的YEP平板上划菌，28℃培养2天，挑取菌落接种于50ml离心管中的5ml YEP液体培养基中，28℃振荡过夜；取300μl菌液，加到250ml YEP液体培养基中，过夜培养至OD600＝0.3-0.4左右，4000rpm离心10min，用侵染液重新稀释至OD600＝0.3-0.4左右备用。
4)子叶节划伤、侵染和共培养：
步骤2)的种子发芽1天后，切掉部分胚轴，分开两片子叶，夹住留有子叶节的一半子叶，去除两片真叶，生长点刺2-3刀，切好的豆子放入浸染液中。
5)恢复培养：
将共培养之后的外植体插到恢复培养基中，放置在光下，28℃左右恢复培养5～7天。
6)筛选培养：
将恢复之后的子叶切掉部分下胚轴后插入筛选培养基，28℃左右光下筛选，每10天继代一次，继代2次。
7)芽伸长培养：
将筛选后的外植体拔掉黄色的叶子，每个10-15天轻磕表面培养基及腐叶，切掉子叶节底部表面，将处理好的子叶节插入伸长培养基(S5培养基)，置于28℃光下培养。
8)生根和移苗：
将伸长期间苗长到3-4cm剪下来放在生根土上生根，得到至少三根1cm左右的根系，三片绿色叶子，移到人工光照培养室炼苗，2周左右长出新叶后移到28℃人工气候室下继续生长。
4、大豆转化株检测及表型观察
在E0代转化苗中通过PCR和测序检测并筛选编辑苗，并以野生型大豆(中黄302)为对照，观察其表型变化。经过2-3代自交扩繁，增加突变类型群体，以获得纯合的无外源基因插入的编辑苗。
5、结果
上述得到编辑苗或编辑植株是以中黄302为亲本进行基因编辑获得的。
检测上述获得的基因编辑大豆的编辑类型，分别为：
编辑植株acd，编辑植株acd的miR396与野生型大豆(中黄302)的miR396相比，miR396a、miR396c和miR396d存在突变，miR396b和miR396f与野生型一致、无突变；
编辑植株acdf，编辑植株acdf的miR396与野生型大豆(中黄302)的miR396相比，miR396a、miR396c、miR396d和miR396f存在突变，miR396b与野生型一致、无突变，其miR396a相对于SEQ ID No.2所示序列的第229位碱基C缺失，miR396c相对于SEQ IDNo.4所示序列的第230位-第255位碱基(共26个碱基)缺失，miR396d相对于SEQ IDNo.5所示序列的第19位-第29位碱基(共11个碱基)缺失，miR396f相对于SEQ ID No.6所示序列的第265位碱基T缺失；
编辑植株cdf，编辑植株cdf的miR396与野生型大豆(中黄302)的miR396相比，miR396c、miR396d和miR396f存在突变，miR396a和miR396b与野生型一致、无突变；
编辑植株abcdf，编辑植株abcdf的miR396与野生型大豆(中黄302)的miR396相比，miR396a、miR396b、miR396c、miR396d和miR396f存在突变，其miR396a相对于SEQ IDNo.2所示序列的第229位碱基C缺失，miR396b相对于SEQ ID No.3所示序列的第30位-第100位碱基(共71个碱基)缺失，miR396c相对于SEQ ID No.4所示序列的第229位碱基C缺失，miR396d相对于SEQ ID No.5所示序列的第18位-第26位碱基(共9个碱基)缺失，miR396f相对于SEQ IDNo.6所示序列的第264位-第265位碱基(共2个碱基)缺失。
统计野生型大豆植株和上述编辑大豆植株的单株产量和单株种子株，其均值如下所示：
编辑类型 单株产量(g) 单株种子数 百粒重(g)
野生型(中黄302) 37.0 190 19.5
acd 29.9 140.0 21.4
acdf 51.8 235.4 22.0
cdf 27.5 135.9 20.2
abcdf 44.8 203.1 22.1
可以看出，与野生型大豆植株(中黄302)相比，编辑大豆植株acd、cdf的单株产量和单株种子数均没有提高，编辑大豆植株acdf、abcdf的单株产量、单株种子数和百粒重均显著提高。编辑大豆植株acdf、abcdf与野生型大豆(中黄302，WT)的籽粒大小比较如图2所示，编辑大豆植株acdf的籽粒直径比野生型大豆的籽粒直径长10.8％左右，编辑大豆植株abcdf的籽粒直径比野生型大豆的籽粒直径长15.3％左右。
另外，我们还比较了上述突变的Cas12i(N369R、S433R)蛋白与野生型Cas12i蛋白在大豆中针对miR396的编辑效率，结果显示，野生型Cas12i蛋白在大豆中的编辑效率仅在1％-2％，而突变的Cas12i(N369R、S433R)蛋白在大豆中的编辑效率能够达到10％-20％。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (12)

1.一种突变的miR396，所述突变的miR396相对于亲本miR396具有碱基突变，所述亲本miR396为来源于大豆的野生型miR396，所述miR396包括miR396a、miR396c、miR396d和miR396f；任选的，所述miR396还包括miR396b；
所述突变的miR396导致大豆的籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高。
2.根据权利要求1所述的突变的miR396，其特征在于，所述突变的miR396选自以下一种或任意几种：
(i)所述突变的miR396a相对于SEQ ID No.2所示序列具有碱基缺失；所述突变miR396c相对于SEQ ID No.4所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396d相对于SEQ ID No.5所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396f相对于SEQ ID No.6所示序列具有碱基缺失；
(ii)所述突变的miR396a相对于SEQ ID No.2所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396b相对于SEQ ID No.3所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396c相对于SEQ IDNo.4所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396d相对于SEQ ID No.5所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396f相对于SEQ ID No.6所示序列具有碱基缺失。
3.一种载体，所述载体包含权利要求1-2任一所述的突变的miR396。
4.一种宿主细胞，所述的宿主细胞包括权利要求1-2任一所述的突变的miR396或权利要求3所述的载体。
5.一种基因编辑试剂，其特征在于，所述基因编辑试剂能够在大豆中产生权利要求1-2任一所述的突变的miR396；所述基因编辑试剂包括Cas12i和gRNA，所述gRNA包括与Cas12i结合的骨架区以及与靶序列杂交的引导序列，所述gRNA靶向大豆中的miR396；所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变；
优选的，所述Cas12i在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸突变为R，第433位氨基酸突变为R。
6.权利要求1-2任一所述的突变的miR396，权利要求3所述的载体，权利要求4所述的宿主细胞，或权利要求5所述的基因编辑试剂在制备籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆中的用途；或在制备用于产生籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆的试剂或试剂盒中的用途。
7.一种制备籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中引入权利要求1-2任一所述的突变的miR396；
(b)将步骤(a)中的大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分再生为大豆植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引入权利要求1-2任一所述的突变的miR396包括将大豆的内源性的miR396进行突变从而引入所述突变的miR396的步骤；
优选的，通过基因编辑的方式在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中引入所述突变的miR396；
更优选的，所述基因编辑是采用Cas12i在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中进行基因编辑，所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变。
9.一种对大豆进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)利用Cas12i和gRNA在大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分中进行基因编辑，获得经基因编辑的大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分；所述gRNA包括与Cas12i结合的骨架区以及与靶序列杂交的引导序列，所述gRNA靶向大豆中的miR396；所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变；
(b)将步骤(a)中的经基因编辑的大豆细胞、大豆种子、大豆组织或大豆部分再生成大豆植株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Cas12i在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸突变为R，第433位氨基酸突变为R。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述gRNA中与靶序列杂交的引导序列如SEQ ID No.7-8任一所示。
12.一种制备籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆的方法，其特征在于，所述方法包括利用7-11任一所述的方法得到的大豆种子或大豆植株与其他的大豆进行杂交从而制备籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高的大豆的步骤。
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