CN115925852A - 突变的Br2蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种相对于亲本Br2蛋白具有氨基酸突变的Br2突变蛋白，所述亲本Br2蛋白来源于玉米，所述Br2突变蛋白相对于亲本Br2蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的若干个氨基酸存在突变。所述Br2突变蛋白可以导致玉米的株高或穗位高的降低，在玉米矮化育种中具有重要的应用价值。

Description

突变的Br2蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术、作物遗传育种领域，涉及突变的Br2蛋白及其应用，尤其玉米中突变的Br2蛋白以及在降低玉米株高和/或穗位高中的应用。

背景技术

美国作为全球第一大玉米生产国，近20多年玉米产量的提升得益于单产的提升，虽然中国玉米单产水平逐年提高，但中国玉米总产量的提升更多的来自于种植面积的增加。目前中国玉米单产水平稍高于世界平均水平，但仅为美国玉米单产的55％左右。我国玉米的种植密度偏低，是造成单产水平低的一个主要原因。美国玉米种植密度可达5000-5500株每亩，而我国玉米种植密度仅为3500-4500株/亩。

在高密度条件下，玉米会产生避阴反应，表现为株高穗位高升高、茎秆变细、茎叶夹角缩小、叶片细长、雌雄发育异常、雌雄间隔期增加等性状的改变，最终表现为抗倒性降低、光合效率降低、结籽率降低、单株产量降低。而株型紧凑、株高低的品种一般表现出具有较强的耐密性。降低株高往往会使茎秆粗壮、穗位降低更有利于增加植株的抗倒伏能力，另外适当的降低株高和穗位高还可以提高玉米的收获指数。因此在保持产量的前提下的矮化育种是当前玉米育种的一个重要方向。

虽然有关植物株高的研究工作很多，生长素、赤霉素、油菜素内酯、细胞分裂素等植物激素都可以调控株高，但玉米中能用于株高矮化改良的种质资源却是有限的。利用这有限的矮化种质资源通过传统育种方法进行株高改良，将会使原本就不丰富的玉米育种种质资源变得更加狭窄，阻碍育成更多优秀玉米品种。

我们通过基因编辑技术在郑58、PH4CV和PH6WC等骨干玉米自交系中通过单基因敲除、改变基因氨基酸序列以及改变基因表达量等创造了多种类型的矮化突变体，实现了5％-50％范围内的株高降低。而且有些突变形式表现出穗位高降低幅度大于株高降低幅度，这种主要降低果穗以下节间长度的突变更有利于抗倒伏耐密植玉米育种。

通过无基因型限制的任意程度的玉米株高改良可以满足广大育种家的需求，同时还可以保持现有的玉米种质资源的多样性，这将强有力的推动玉米育种。

发明内容

玉米中的Br2(Brachytic2)基因与矮化育种有密切的关系，Br2基因编码auxin转运蛋白PGP1，本发明中，又将该蛋白称之为“Br2蛋白”或者“BR2蛋白”，其含义均指由玉米中的Br2基因编码的蛋白。

本发明提供了一种突变的Br2蛋白以及该突变蛋白在降低玉米株高和/或穗位高中的应用。

一方面，本发明提供了一种相对于亲本Br2蛋白具有氨基酸突变的Br2突变蛋白，所述亲本Br2蛋白来源于玉米、由Br2基因编码，其特征在于，所述Br2突变蛋白相对于亲本Br2蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的若干个氨基酸存在突变。

在一个实施方式中，所述Br2突变蛋白选自如下任意一种或任意几种组合：

(1)172AA23：所述Br2突变蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的第499位-502位氨基酸序列替换为GDSTTPAQ；

(2)172AA17：所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

(3)173AA59：缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第802-809位氨基酸；

(4)175AA74：缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1203-1205位氨基酸；

(5)175AA7：所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

(6)175AC42：缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1136-1140位和第1205-1208位氨基酸；

(7)179AC19：所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

(8)171AC20：所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

(9)175AC27：缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1136-1204位氨基酸；

(10)174AH9：所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

(11)175AH28：所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

(12)175AH77：所述Br2突变蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的第1202-1209位氨基酸序列替换为VVE；

(13)176AH9：缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1149-1160位氨基酸和第1167-1267位氨基酸。

上述第(1)-(7)的Br2突变蛋白将会使玉米株高降低约20％-40％；上述第(8)-(13)的突变蛋白将会使玉米株高降低约40％-60％。

在一个实施方式中，所述亲本Br2蛋白来源于天然存在的玉米株系(例如，天然存在的玉米自交系)。

在一个实施方式中，所述亲本Br2蛋白为来源于玉米自交系的Br2蛋白。在一个实施方式中，所述玉米包括玉米自交系B73、郑58(Z58)、齐319(Q319)、XCW175、PH4CV、PH6WC、昌7-2等中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述亲本Br2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；在其他的实施方式中，所述亲本Br2蛋白为来源于玉米的Br2蛋白，并且与SEQ ID No.1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。

在一个实施方式中，本发明的Br2突变蛋白是通过对玉米的Br2基因的操作所导致的Br2蛋白的缺失/删除、增加、截短、替换等，所述突变蛋白包括Br2蛋白的缺失/删除、增加、截短、替换等。

在一个实施方式中，可以通过基因编辑的方式，对Br2基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3或内含子4的基因中进行基因编辑，从而引入上述Br2突变蛋白。

在一个实施方式中通过基于CRISPR的基因编辑技术可以实现Br2基因的编辑，从而得到上述突变的Br2蛋白。位点特异性核酸酶可以诱导基因组序列的靶位点处的双链断裂(DSB)，该双链断裂(DSB)然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的自然过程来修复，从而导致Br2蛋白的缺失/删除、增加、截短或替换；也可以通过添加外源供体模板，从而导致Br2蛋白的突变。

本发明另一方面，提供了一种融合蛋白，包含上述的Br2突变蛋白或其生物活性片段；进一步的，所述融合蛋白还包括与所述的突变蛋白融合的蛋白，例如，标签肽、质体引导肽或调控元件。其中，标签肽如，组氨酸标签，6×His；质体引导肽，例如引导到叶绿体内的肽；调控元件，例如启动子序列、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、标记基因等。

另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，编码所述Br2突变蛋白或融合蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、RNA序列、或其组合。

在另一优选例中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。

在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述突变多肽的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、核定位信号或其组合。

在另一优选例中，该多核苷酸还包含与所述突变多肽的ORF序列操作性连接的启动子。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

本发明另一方面，提供一种核酸构建体，含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。

在另一优选例中所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。

另一方面，本发明还提供了一种载体，所述载体包含有编码本发明的Br2突变蛋白的核酸序列，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。

在另一优选例中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体或整合载体。

在一个实施方式中，载体可以是对宿主细胞内源性的Br2蛋白编码基因(例如，Br2基因)进行基因编辑的载体。

在一个实施方式中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。

在一个实施方式中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。

载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

优选地，本发明中的载体是质粒。

另一方面，本发明提供了一种编辑载体系统，所述编辑载体系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体至少包含靶向亲本Br2蛋白编码基因(Br2基因)的引导序列。所述引导序列含有部分亲本型Br2蛋白编码基因(Br2基因)的核苷酸序列，优选的至少含有15bp的Br2蛋白编码基因(Br2基因)的核苷酸序列，更优选的至少包括20bp的Br2蛋白编码基因(Br2基因)的核苷酸序列。在一种实施方式中，该编辑载体系统还包括基因编辑酶。所述基因编辑酶包括CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术Tanscription Activator-like(TAL)effector nucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zincfinger nuclease)编辑工具的核酸酶。

优选地，所述基因编辑酶为Cas蛋白，又名CRISPR酶或Cas效应蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。

优选的，Cas蛋白可操作的连接第一调节元件。

在一个实施方式中，所述基因编辑酶为Cas9蛋白，所述载体中还包括与该Cas9蛋白可以特异性结合的Scaffold序列。Scaffold序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。

在其他的实施方式中，所述基因编辑酶为Cas12蛋白，例如，Cas12a、Cas12b、Cas12i，所述载体中还包括与该所述Cas12蛋白特异性结合的同向重复序列(DirectRepeat)。同向重复序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。

上述调节元件包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。

优选的，所述编辑载体系统还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。

在一种实施方式中，编辑载体中还包含抗性基因以便于筛选，所述抗性基因包括hyg、bar、kana、rif、spec、amp，所述抗性基因是本领域技术人员所熟知的。

优选的，Cas蛋白选用nCas9或其他有nick活性的Cas9蛋白。其中“n”表示nick，即只具有单链切割活性的Cas蛋白。

另一方面，本发明提供了一种基因编辑试剂，所述基因编辑试剂能够在植物中产生上述突变多肽；所述基因编辑试剂包括CRISPR/Cas蛋白和gRNA，所述gRNA可以靶向植物内源性的Br2蛋白编码基因(Br2基因)；任选的，所述基因编辑试剂还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。

在另一个实施方式中，所述基因编辑试剂包括上述编辑载体系统。

本发明另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述Br2突变蛋白、所述编码基因、所述融合蛋白、核酸构建体、载体中的一种或多种；或者，所述的宿主细胞基因组中整合有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或动物细胞或植物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述植物包括玉米、拟南芥、烟草、水稻、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

另一方面，本发明提供了一种降低植物的株高和/或穗位高的方法，或者，制备株高和/或穗位高降低的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入上述Br2突变蛋白的步骤，所述植物为玉米。

在一个实施方式中，所述引入Br2突变蛋白包括将Br2突变蛋白在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤，例如，通过表达载体对所述突变蛋白进行表达的，或者将所述编码突变蛋白的多核苷酸整合到植物基因组上进行表达。

在另一优选例中，所述引入Br2突变蛋白包括将植物的内源性Br2蛋白编码基因(例如，玉米中的Br2基因)进行突变从而引入所述突变蛋白的步骤。

在另一优选例中，所述引入Br2突变蛋白包括将植物的内源性Br2蛋白编码基因(例如，玉米中的Br2基因)进行突变并表达从而引入所述突变蛋白的步骤。

所述突变包括Br2蛋白的缺失/删除、增加、截短、替换等。

在另一优选例中，所述的方法中，引入突变的方法包括自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、X射线或Y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑。

在另一优选例中，所述的方法包括将以下步骤：

(1)在植物细胞、植物组织、植物部分中引入含有基因编辑工具的表达载体；

(2)使基因编辑工具作用于其内源性Br2蛋白编码基因(例如，玉米中的Br2基因)，并使其在相应于SEQ ID No.1的上述突变位点发生突变，产生相应的突变的Br2蛋白；

(3)筛选突变的植物细胞、植物组织、植物部分；

(4)分离所述的基因编辑工具。

在另一优选例中，所述的基因编辑工具包括CRISPR、TALEN和ZFN。

另一方面，本发明还提供了上述Br2突变蛋白、核酸、载体、核酸构建体，基因编辑试剂或宿主细胞在制备株高和/或穗位高降低的植物中的用途，所述植物为玉米；或者，在制备降低植物的株高和/或穗位高的试剂或试剂盒中的用途。

本发明还提供了一种株高和/或穗位高降低的玉米植株，所述玉米植株中含有上述Br2突变蛋白、核酸、载体、基因编辑试剂或宿主细胞。在一个实施方式中，所述“含有上述Br2突变蛋白”通过上述的在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入上述Br2突变蛋白来实现。

所述降低植物的株高和/或穗位高，或者株高和/或穗位高降低，是指，含有述Br2突变蛋白、核酸、核酸构建体、载体、基因编辑试剂或宿主细胞的玉米植株的株高和/或穗位高要低于含有亲Br2蛋白的玉米植株的株高和/或穗位高。

所述株高是指从地面至玉米最高处的高度。

所述穗位高是指从地面至玉米最高果穗的穗柄在茎节上的着生位置的高度。

在一个实施方式中，含有本发明的Br2突变蛋白的玉米植株与野生型亲本相比，株高降低约10％-90％，例如，15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。

在一个实施方式中，含有本发明的Br2突变蛋白的玉米植株与野生型亲本相比，穗位高降低约10％-90％，例如，15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。

在一个实施方式中，本发明的Br2突变蛋白的玉米植株与野生型亲本相比，产量、籽粒重量无显著差异。

本发明还提供了一种降低植物的株高和/或穗位高的方法，或者，制备株高和/或穗位高降低的植物的方法，所述方法包括利用上述基因编辑试剂对植物的内源性的Br2蛋白编码基因进行基因编辑的步骤，所述植物为玉米。

本发明另一方面，提供一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒可用于降低植物的株高和/或穗位高，所述的试剂含有本发明所述的突变蛋白、编码突变蛋白的核苷酸、载体、核酸构建体、基因编辑试剂或宿主细胞。

另一方面，本发明还提供了一种制备杂交玉米植株的方法，所述方法包括利用上述株高和/或穗位高降低的玉米植株或者利用上述制备方法制备得到的株高和/或穗位高降低的玉米植株与其他玉米植株进行杂交从而制备杂交玉米植株的步骤。本发明还提供了利用上述制备杂交玉米植株的方法制备得到的杂交玉米植株。

在一个实施方式中，可以利用本发明Br2突变蛋白的不同的玉米自交系进行杂交，从而制备杂交玉米植株。在一个实施方式中，可以以含有上述任一种Br2突变蛋白的玉米自交系PH6WC以及含有上述任一种Br2突变蛋白的玉米自交系PH4CV为亲本进行杂交，例如，以PH6WC为母本、以PH4CV为父本。在另一个实施方式中，可以以含有上述任一种Br2突变蛋白的玉米自交系郑58以及含有上述任一种Br2突变蛋白的玉米自交系昌7-2为亲本进行杂交，例如，以郑58为母本、以昌7-2为父本。

在一个实施方式中，含有Br2突变蛋白的杂交玉米植株与野生型亲本杂交植株相比，株高降低约10％-90％，例如，15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。

在一个实施方式中，含有Br2突变蛋白的杂交玉米植株与野生型亲本杂交植株相比，穗位高降低约10％-90％，例如，15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％。

在一个实施方式中，含有Br2突变蛋白的杂交玉米植株与野生型亲本杂交植株相比，产量、籽粒重量无显著差异。

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。

“Br2蛋白”，在玉米中由Br2(Brachytic2)基因编码；不同玉米株系的Br2蛋白可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

可以通过包括但不限于以下的已知方法计算“同源性”或“同一性”：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)OxfordUniversity Press[牛津大学出版社],纽约(1988)；Biocomputing:Informatics andGenome Projects[生物运算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑)Academic Press[学术出版社],纽约(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I[序列数据的计算机分析，第I部分](Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡马纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学中的序列分析](von Heinje,G.编辑)Academic Press[学术出版社](1987)；以及Sequence AnalysisPrimer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约(1991)。

本发明所述Br2蛋白的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标氨基酸序列进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similarity searches ofnucleic acid and proteindata banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)。通过将不同玉米自交系或品种的Br2蛋白的氨基酸序列进行对比，从而确定不同亲本Br2蛋白的氨基酸与SEQ ID No.1所对应的特定位置；通过本领域公知的序列比对方式，本领域技术人员可以获知不同品种的玉米的Br2蛋白序列与SEQ ID No.1的氨基酸对应关系。

术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

术语“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。

本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在Br2蛋白的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。

本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从Br2蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。

应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备Br2蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

领域技术人员能够理解，本发明Br2蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。

本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定Br2蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。如本文所用，术语“Br2突变蛋白”、“突变的Br2多肽”、“突变型Br2多肽”、“突变Br2蛋白”、“突变蛋白”、“突变多肽”等可互换使用。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。

本发明的主要优点：

1、本发明筛选出了一组突变的Br2蛋白。

2、含有本发明突变的Br2蛋白的玉米植株相比野生型玉米植株相比，其株高和/或穗位高显著降低。

附图说明

图1为本实施方式中利用的基因编辑载体示意图。

图2不同编辑植株相对于野生型玉米的株高降低比例。

图3不同编辑植株相对于野生型玉米的穗位高降低比例。

图4部分编辑植株与野生型玉米植株株高对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、靶点设计及载体构建

通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站获得br2基因的基因组序列及氨基酸序列，获得的玉米自交系B73的br2的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，针对不同的结构域区域进行靶点的选择与设计。

本实施例中利用Cas9和靶向br2的sgRNA在玉米中br2基因进行编辑，具体操作方法可按照本领域常规的方式进行；本实施方式中，所构建的基因编辑载体的示意图如图1所示；其中，ZmU6_pro为U6启动子，gly-tRNA为甘氨酸tRNA，ZmU6_Ter为终止子，UBI_pro为UBI启动子，NLS为核定位信号；载体构建亦可借鉴参考文献(“High-efficiency CRISPR/Cas9multiplex gene editing using the glycine tRNA-processing system-basedstrategy in maize”，Weiwei Qi等，《BMC Biotechnology》，2016)；本实施例中，Cas9采用植物密码子优化的Cas9，在其他的实施方式中，也可以采用其他方式优化的Cas9。

具体而言，本实施方式中，利用target Design(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)设计gRNA，br2基因含有5个外显子与4个内含子，编码的蛋白PGP1具有4个功能性结构域。针对这几个不同的结构域进行靶点的设计，分别对其进行编辑。

其中位于第一个外显子区gTM1-1(GAAGCGGAAGAGGTCGCGCA)gTM1-2(GGGAGCCGAAGGAGTCGACG)是针对于br2基因编码的PgP1蛋白的第一个跨膜结构域；位于第三个外显子区的gNTPase1-1(AGCGAGAAGCCGCGCAGGAT)和gNTPase1-2(CGACACCACCGTGCTCTTCC)是针对于br2基因编码的第一个ATP结合区的结构域；位于第五外显子区的gTM2-1(GCTGAAGGAGCCGCAGACCA)、gTM2-2(TCTCGCGCTTCATGTACCGC)、gTM2-3(ACACGGTGCAGCACGTGTTC)、gTM2-4(GTTCTCGTCCGCGTCGAACC)是针对于br2基因编码的第二个跨膜结构域；同样位于第五外显子区的gNTPase2-1(TCGCGGAACACCTGGATGTC)、gNTPase2-2(GAGCGGGTGCGGCAAGAGCT)、gNTPase2-3(GCGAACAGGAACGGCTCCTG)gNTPase2-4(AACATCGCGTACGGGCGCGA)是针对于br2基因编码的第二个ATP结合区。

将gTM1-1和gTM1-2组合构建入U6启动子启动的利用甘氨酸tRNA间隔的基因编辑载体中,构建成载体P1509；同样将gNTPase1-1和gNTPase1-2组合构建成载体P1510；gTM2-1和gTM2-3组合构建为载体P1511，gTM2-2和gTM2-4组合构建成载体P1512；gNTPase2-1和gNTPase2-3组合构建为载体P1513；gNTPase2-2和gNTPase2-4组合构建成载体P1514。两个gRNA用甘氨酸tRNA间隔开。

具体构建方法如下：

1)、分别利用引物对

gTM1-1F(TAGGTCTCTTGCAGAAGCGGAAGAGGTCGCGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT)和gTM1-2R(TAGGTCTCTAAACTGCACCAGCCGGGAATCG)；

gNTPase1-1F(TAGGTCTCTTGCAAGCGAGAAGCCGCGCAGGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT)和gNTPase1-2R(TAGGTCTCTAAACGACACCACCGTGCTCTTCCCTGCACCAGCCGGGAATCG)；

gTM2-1F(TAGGTCTCTTGCAGCTGAAGGAGCCGCAGACCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT和gTM2-3R(TAGGTCTCTAAAACACGGTGCAGCACGTGTTCCTGCACCAGCCGGGAATCG)；

gTM2-2F(TAGGTCTCTTGCATCTCGCGCTTCATGTACCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT和gTM2-4R(TAGGTCTCTAAAAGTTCTCGTCCGCGTCGAACCCTGCACCAGCCGGGAATCG)；

gNTPase2-1F(TAGGTCTCTTGCATCGCGGAACACCTGGATGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT)和gNTPase2-3R(TAGGTCTCTAAAGCGAACAGGAACGGCTCCTGCTGCACCAGCCGGGAATCG)；

gNTPase2-2F(TAGGTCTCTTGCAGAGCGGGTGCGGCAAGAGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT)和gNTPase2-4R(TAGGTCTCTAAAAACATCGCGTACGGGCGCGACTGCACCAGCCGGGAATCG)；

以质粒P0055为模板扩增，分别割胶回收约200bp的片段为gTM1-1&2,gNTPase1-1&2,gTM2-1&3,gTM2-2&4,gNTPase2-1&3,gNTPase2-2&4对回收片段用BsaI酶切，并利用试剂盒回收；

2)、对骨架载体P0522进行BsaI酶切，回收23Kb片段；

3)、分别将gTM1-1&2,gNTPase1-1&2,gTM2-1&3,gTM2-2&4,gNTPase2-1&3,gNTPase2-2&4与P0522进行连接，构建成最终载体P1509、P1510、P1511、P1512、P1513、P1514；

4)、将上述连接产物分别转化大肠杆菌感受态Trans-T1，涂布于Kan平板培养，挑8个菌落液体培养2h，PCR菌液检测，选择正确的单克隆2个，进行菌液送测。

5)、选择测序正确的单克隆进行扩繁、保菌、提质粒，转化农杆菌EHA105，挑取5个单菌落培养，PCR检测正确后保菌备用。

实施例2、遗传转化

本实施例中，选择玉米自交系郑58(Z58)、PH4CV、PH6WC，分别利用实施例1中的载体进行基因编辑。

2.1转化农杆菌

将实施例1中的载体利用热击法转入农杆菌菌株EHA105中，挑取单克隆经液体培养以及PCR鉴定后保存于-80℃冰箱中备用。

2.2菌种活化

从冰箱取出菌，在YEP固体培养基上划线培养。

2.3准备农杆菌侵染液

从新活化的菌板上刮取新鲜菌体，重悬到侵染液中。

2.4取玉米幼胚

取授粉后10天左右的玉米果穗，拨去苞叶和花丝，挑取幼胚，放入加有AS的侵染培养基(不含农杆菌)中。

2.5侵染

将待转化幼胚用侵染液洗3遍，至侵染液澄清，将侵染液倒干净加入1ml菌液，温和颠倒10下，静置5～10min。取干净培养皿，放3张灭菌滤纸，侵染完毕后颠倒几下后迅速将菌液倒在滤纸上，手持培养皿，变换方向使携带幼胚的菌液在滤纸上均匀分布。

2.6共培养

待最上一层滤纸看不到菌液时用镊子将上层滤纸夹起，沾有幼胚的一面贴在共培养培养基上，用镊子驱赶滤纸和培养基之间的气泡后，用镊子夹住滤纸一角快速揭下，留在滤纸上的幼胚用剥胚刀转移到培养基上，幼胚盾面朝上，22℃暗培养3天。

2.7恢复培养

共培养3天后，将幼胚转移到恢复培养基。

2.8分化

转P1515载体额幼胚直接于分化培养基上分化。

2.9生根

将分化产生的小苗转接到生根培养基，每瓶3～4个小苗，25～28℃光照培养直至长成完整植株，生根培养7天后将有白色小根长出，可取样检测。

实施例3、阳性苗的筛选

对于再生苗，取少量叶片以TPS法提取基因组DNA。

对于转化载体的植株以引物对ZmCas9-jc-F4(atatcgtgcctcagagctttc)和ZmCas9-jc-R4(aactcgctttccagcttaggg)，ZmU6P-F2(caagagtggagcgtaccttat)和ZmUBI-R2(gctcattatctctagagagg)，35S-F2(TCATTTggAgAggACACgCT)和sp110(ggAgAAACTCgAgTCAAATCTCg)等3对引物分别检测，任何一对引物可以扩增到目的产物，则该再生苗即为转基因阳性苗。

对于阳性苗以引物对P1509-jc-F1(gcttctctggagaccgagc)和P1509-jc-R1(ctccgacgacgaggaagtag)、P1510-jc-F1(ggagccggagtcggtgac)和P1510-jc-R1(gcgaactggacatcctcag)、P1511-jc-F1(cagctccttcctgcgcctc)和P1511-jc-R1(aacatcttctcgcgcaccc)、P1512-jc-F1(gccatcttcgcctacatcc)和P1512-jc-R1(cacgttctgggcgtccag)、P1513-jc-F1(gcgaggtggagctgaagc)和P1513-jc-R1(acgcgatgttctcgtgg)、P1514-jc-F1(ccggacatccaggtgttccgcg)和P1514-jc-R1(gccgcctccaccacctc)、P1515-jc-F1(gccgcgtaggacggaatg)和P1515-jc-R1(ctgatgcggatgagaaacaag)分别扩增br2基因的相应片段。扩增产物经sanger法进行测序，确认编辑形式，若为测序结果显示双峰，则将PCR产物连接入T载体，选取5个克隆进行测序，确认编辑形式。

结果显示，利用P1509转化PH4CV的幼胚获得了编辑植株171AC20,其编辑结果是在br2的449-452nt缺失4bp，即第一外显子的第373-376nt，导致其后的编码区发生移码突变，并在新的CDS 940-942nt形成一个终止密码子TGA，编码了240个氨基酸，即br2基因的944-946nt，位于第2外显子中，将会导致蛋白翻译的提前终止。

利用P1509转化Z58的幼胚获得了编辑植株171AA48,其编辑结果是在br2的559-588nt缺失30bp，导致此处缺失10个氨基酸，即缺失了第一个外显子中第161-170位的氨基酸，其他位置的氨基酸序列没有改变。

利用P1510转化Z58的幼胚获得了编辑植株172AA23,其编辑结果是在br2的1810nt后插入20bp并在1811-1818nt缺失8bp,即在br2第3外显子的255nt后插入20bp缺失原来的256-263nt。导致7个氨基酸插入与3个氨基酸缺失，其他位置氨基酸序列没有发生改变。

利用P1510转化Z58的幼胚获得了编辑植株172AA17,其编辑结果是在br2的1818nt插入1bp,导致其后的编码区发生移码突变。并在新CDS的6772-6774nt形成一个终止密码子TGA，比原始氨基酸序列多编码14个氨基酸。

利用P1511转化Z58的幼胚获得了编辑植株173AA49,其编辑结果是在br2的4995-5003nt缺失9bp,导致中间缺失3个氨基酸即在第5外显子的第624-632nt发生缺失。

利用P1511转化Z58的幼胚获得了编辑植株173AA59,其编辑结果是在br2的4493-5016nt缺失24bp,导致此处缺失8个氨基酸，其他位置的氨基酸序列没有改变。

利用P1512转化PH6WC的幼胚获得了编辑植株174AH9,其编辑结果是在br2的5081-5082nt插入1bp,导致其后的编码区发生移码突变，并在新的内含子区6772-6774nt(原br2基因的6771-6773nt)形成一个终止密码子TGA。

利用P1513转化Z58的幼胚获得了编辑植株175AA74,其编辑结果是在br2的6195-6203nt缺失9bp,导致突变位置减少3个氨基酸。

利用P1513转化Z58的幼胚获得了编辑植株175AA7,其编辑结果是在br2的5996-6201nt之间缺失206bp,导致突变序列之间缺失68个氨基酸且后续氨基酸序列发生改变，并在新的CDS区的6208-6210nt产生终止密码子TGA，即原br2基因的6414-6416nt。

利用P1513转化PH4CV的幼胚获得了编辑植株175AC42,其编辑结果是在br2的5995-6012nt缺失18bp,导致突变位置减少6个氨基酸,并缺失6200-6211nt的12bp,导致缺失部位减少4个氨基酸。

利用P1513转化PH4CV的幼胚获得了编辑植株175AC27,缺失5995-6201nt的207bp的碱基序列，导致缺失部位减少69个氨基酸。

利用P1513转化PH6WC的幼胚获得了编辑植株175AH28,其编辑结果是缺失了br2的第6202nt，造成一个碱基的缺失,并在缺失部位后产生移码突变，在新的CDS区6412-6414nt产生终止密码子，即br2基因的6413-6415nt将会导致蛋白翻译的提前终止。

利用P1513转化PH6WC的幼胚获得了编辑植株175AH77,其编辑结果是缺失了br2的第6194-6195nt之间插入7bp并在其后缺失22bp，造成2个碱基的插入和7个碱基的缺失。

利用P1514转化Z58的幼胚获得了编辑植株176AA62,其编辑结果是在br2的6077-6251nt缺失175bp,导致其后的编码区发生移码突变，并在新的CDS区6238-6240nt形成一个终止密码子TgA即在br2基因的6413-6415nt,将会导致蛋白翻译的提前终止。

利用P1514转化Z58的幼胚获得了编辑植株176AA76,其编辑结果是在br2的6072-6081nt缺失10bp,导致突变位置后发生移码突变,并在新的CDS区6403-6405nt形成一个终止密码子TgA即br2基因的6413-6415nt，将会导致蛋白翻译的提前终止。

测序结果显示，上述不同玉米编辑植株的Br2蛋白的编辑形式如表1-3所示。

表1.郑58(Z58)不同编辑植株的Br2编辑类型

表2.PH4CV不同编辑植株的Br2编辑类型

表3.PH6WC不同编辑植株的Br2编辑类型

利用P1514转化PH4CV的幼胚获得了编辑植株179AC19,其编辑结果是在br2的6077-6251nt缺失175bp,自1163位氨基酸开始缺失58个氨基酸，此后发生移码突变，氨基酸序列发生改变。并在新的CDS区6238-6240nt形成一个终止密码子TgA即在br2基因的6413-6415nt，179AC19的BR2蛋白编辑之后的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

利用P1514转化PH6WC的幼胚获得了编辑植株176AH9，其编辑结果是在br2的第6036-6071nt缺失36bp并在6086-6388nt缺失303bp，造成编码第2ATP结合区的氨基酸缺失113个氨基酸。其他位置的氨基酸没有发生改变。176AH9的Br2蛋白的编辑类型与SEQ IDNo.1相比，缺失第1149-1160位氨基酸以及第1167-1267位氨基酸。

对上述编辑植株的植株高度和穗位高进行测量并与野生型玉米植株进行对比(在授粉结束后一周测量，此时玉米株高不会再有显著变化)。结果显示，不同的编辑类型相对于野生型植株，产生了不同的株高和穗位高矮化表型。

如图2所示，不同编辑玉米植株相对于亲本玉米植株，株高降低率从25％到60％不等；171AA48的株高降低30％左右，179AC19的株高降低40-50％；如图3所示，不同编辑玉米植株相对于亲本玉米植株，穗位高降低率从40％到80％不等；171AA48的穗位高降低50％左右，179AC19的穗位高降低60-70％；结合不同编辑植株的Br2蛋白的突变类型，Br2蛋白不同位置的突变与株高降低程度没有必然的联系；例如，同样在SEQ ID No.1第1200-1210位区段内存在氨基酸突变的175AC42和175AH77；175AC42的株高降低不到30％，属于比较明显的半矮化类型，但是，175AH77的株高降低了50％以上，属于比较明显的矮化表型。

图4示出了部分编辑植株与野生型亲本玉米植株的株高对比结果。本发明中获得的株高降低程度不同的矮化突变体与种质资源，会极大的丰富玉米育种的种质资源。

实施例4、不同矮化株系的杂交及种植

本实施例中，可以采用实施例3获得的不同的编辑植株杂交制备杂交玉米，例如，以PH4CV编辑植株179AC19和PH6WC编辑植株176AH9进行杂交制种，具体操作如下：

利用野生型父本PH4CV和野生型母本PH6WC采用人工辅助授粉得到野生型杂交种。以父本PH4CV编辑植株179AC19和母本PH6WC编辑植株176AH9为父母本，保持两种自交系生育期一致，制备编辑的杂交种。父母本的种植比例在1：3或1：4以保证雌穗的供应。在母本雌穗开始吐丝前对雌穗进行套袋处理，吐丝后将父本雄穗花粉进行收集，对母本进行人工辅助授粉，保证杂交种的纯度。

得到杂交种后在大田种植，主要有以下几种株系：1、利用野生型父本PH4CV和野生型母本PH6WC得到的野生型杂交植株；2、以父本PH4CV编辑植株179AC19和母本PH6WC编辑植株176AH9为父母本得到的矮化杂交植株。种植密度为每亩4000-4500株。按照小区进行播种测产，每个小区长4米，22株苗。4行为一个小区，行距为50cm,株距20cm。测产时为了避免边行效应，选择收取每个小区中间两行玉米。晾干后先称取这些玉米的总重量，然后脱去籽粒单独称取籽粒重量。

结果显示，父本PH4CV编辑植株179AC19与野生型父本PH4CV相比，株高降低约33.9％，母本PH6WC编辑植株176AH9与野生型母本PH6WC相比株高降低约47％；以父本PH4CV编辑植株179AC19和母本PH6WC编辑植株176AH9为父母本得到的矮化杂交植株与利用野生型父本PH4CV和野生型母本PH6WC得到的野生型杂交植株相比，株高降低约31.59％；也就是说，杂交之后的玉米植株仍然保持了矮化性状。

另外，父本PH4CV编辑植株179AC19与野生型父本PH4CV相比，母本PH6WC编辑植株176AH9与野生型母本PH6WC相比，以父本PH4CV编辑植株179AC19和母本PH6WC编辑植株176AH9为父母本得到的矮化杂交植株与利用野生型父本PH4CV和野生型母本PH6WC得到的野生型杂交植株相比，小区产量和籽粒重量均无显著差异。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种相对于亲本Br2蛋白具有氨基酸突变的Br2突变蛋白，所述亲本Br2蛋白来源于玉米、由Br2基因编码，其特征在于，所述Br2突变蛋白相对于亲本Br2蛋白在对应于SEQ IDNo.1所示序列的若干个氨基酸存在突变，所述Br2突变蛋白选自如下任意一种或任意几种组合：

(1)所述Br2突变蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的第499位-502位氨基酸序列替换为GDSTTPAQ；

(2)所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

(3)所述Br2突变蛋白缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第802-809位氨基酸；

(4)所述Br2突变蛋白缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1203-1205位氨基酸；

(5)所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

(6)所述Br2突变蛋白缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1136-1140位和第1205-1208位氨基酸；

(7)所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

(8)所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

(9)所述Br2突变蛋白缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1136-1204位氨基酸；

(10)所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

(11)所述Br2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

(12)所述Br2突变蛋白在对应于SEQ ID No.1所示序列的第1202-1209位氨基酸序列替换为VVE；

(13)所述Br2突变蛋白缺失对应于SEQ ID No.1所示序列的第1149-1160位氨基酸和第1167-1267位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的Br2突变蛋白，其特征在于，所述亲本Br2蛋白来源于玉米自交系B73、郑58、齐319、XCW175、PH4CV、PH6WC、昌7-2中的一种或任意几种。

3.一种融合蛋白，其包含权利要求1或2所述的BR2突变蛋白。

4.一种多核苷酸，其编码权利要求1-2任一所述的BR2突变蛋白，或编码权利要求3所述的融合蛋白。

5.一种载体，所述载体包含权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其含有权利要求1-2任一所述的Br2突变蛋白，或权利要求4所述的多核苷酸，或权利要求5所述的载体。

7.一种基因编辑试剂，其特征在于，所述基因编辑试剂能够在植物中产生权利要求1-2任一所述的突变蛋白；所述基因编辑试剂包括CRISPR/Cas蛋白和gRNA，所述gRNA可以靶向植物内源性的Br2蛋白编码基因，所述植物为玉米。

8.一种降低植物的株高和/或穗位高的方法，或者，一种制备株高和/或穗位高降低的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入权利要求1-2任一所述的Br2突变蛋白的步骤，所述植物为玉米。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述引入权利要求1-2任一所述的Br2突变蛋白包括将植物的内源性的Br2蛋白编码基因进行突变从而引入所述突变蛋白步骤；优选的，通过基因编辑的方式在植物中引入所述Br2突变蛋白。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述引入权利要求1-2任一所述的Br2突变蛋白包括将所述突变蛋白在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤。

11.权利要求1-2任一所述的突变蛋白，权利要求3所述的融合蛋白，权利要求4所述的多核苷酸，权利要求5所述的载体，权利要求6所述的宿主细胞，或权利要求7所述的基因编辑试剂在制备株高和/或穗位高降低的植物中的用途；或者，在制备降低植物株高和/或穗位高的试剂或试剂盒中的用途；所述植物为玉米。

12.一种株高和/或穗位高降低的玉米植株，所述玉米植株中含有权利要求1-2任一所述的突变蛋白，权利要求3所述的融合蛋白，权利要求4所述的多核苷酸，权利要求5所述的载体，权利要求6所述的宿主细胞，或权利要求7所述的基因编辑试剂；或者，所述玉米植株由权利要求8-10任一所述的方法制备得到。

13.一种制备杂交玉米植株的方法，所述方法包括利用权利要求12所述的玉米植株与其他玉米植株进行杂交从而制备杂交玉米植株的步骤。

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