CN113755457B - 抗除草剂乙酰辅酶a羧化酶突变体及其应用 - Google Patents

抗除草剂乙酰辅酶a羧化酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白、核酸及其应用，具体地，涉及突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白、核酸及其在植物育种中的应用，具体地，本发明提供了一种突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白，并且所述的突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白与亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白相比，在对应于SEQIDNO.1的第1879位和/或第2186位氨基酸发生突变。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)突变后的植物具有很高的除草剂抗性，在培育抗除草剂植物中具有非常广阔的应用前景。

Description

抗除草剂乙酰辅酶A羧化酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术、作物遗传育种领域，具体涉及一种乙酰辅酶A羧化酶突变型蛋白、核酸及其在提高植物对除草剂抗体的方法与应用。
背景技术
稻米(0ryza sativa)被世界人口的2/3所食用，是至少其中一半人口饮食中的主要能量来源。大米是一种低成本食品，制备简便，快速，并且可以与各种菜肴搭配食用。
除草剂用于防治农作物中的杂草或植物已经成为几乎普遍的做法。除草剂作为现代农业生产体系的重要组成部分，是农田除草技术中最可靠且经济的手段。自2，4-D于20世纪四十年代开始使用以来，除草剂工业已有60多年的发展历史，迄今已成功开发出了一大批选择性除草剂。对于ACC酶抑制剂的研究始于20世纪70年代，ACC除草剂共分为4种类型，分别是芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxypropanoates，APP)、肟醚类环己二酮(Cyclohexanedioneoximes，CHD)、芳氧苯基环己二酮类(Aryloxyphenylcy-clohexanedione，APCHD)以及三酮类环己二酮(Cyclictriketones，CTR)。ACC除草剂可以抑制禾本科植物体内的脂肪酸合成，选择性高，在植物体内传导，能够苗后防除一年或多年生禾本科杂草。它具有高效、低毒、施用期长、对后茬作物安全等优点，因而在除草剂市场中占有重要地位。
乙酰辅酶A羧化酶(AcetyI CoA carboxylase，ACCase，ACC)是化学除草剂的一个重要靶标，是发现于1958年的一种生物素包含酶。它在生物体内催化乙酰辅酶A羧化形成丙二酰辅酶A，为脂肪酸和许多次生代谢产物的合成提供底物，是脂肪酸生物合成的关键酶或限速酶。该羧化酶有两步可逆反应，包括通过生物素-羧化酶酶活性将底物结构域上的生物素基团进行ATP依赖的羧化反应，然后通过羧基转移酶从生物素转移羧基得到乙酰辅酶A底物。乙酰辅酶A羧化酶是植物生物合成脂肪酸的关键酶，该过程发生在叶绿体和线粒体中，而且ACC还在长链脂肪酸和类黄酮的形成以及发生在细胞质中的丙二酰化中起作用。
发明内容
本发明目的是提供一种可赋予植物除草剂抗性的突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)蛋白或多核苷酸及其应用。
本文中，ACCase或ACC指代的均是乙酰辅酶A羧化酶(Acety l CoA carboxy lase)。
突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)
一方面，本发明提供了一种突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，所述突变型的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)与亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的氨基酸序列相比，在对应于SEQIDNO.：1所示氨基酸序列的第1879位和/或第2186位氨基酸处发生突变。
在一个实施方式中，所述亲本ACC第1879位氨基酸为异亮氨酸(I)，第2186位氨基酸为半胱氨酸(C)。
在一个实施方式中，所述第1879位的异亮氨酸(I)突变为非异亮氨酸(I)的氨基酸，所述非异亮氨酸(I)的氨基酸选自下组的一种或多种氨基酸：丙氨酸(A)、缬氨酸(V)，甘氨酸(G)，亮氨酸(L)，谷酰胺酸(Q)，苯丙氨酸(F)，色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，天冬氨酸(D)，天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，赖氨酸(K)，甲硫氨酸(M)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，半胱氨酸(C)，脯氨酸(P)，组氨酸(H)或精氨酸(R)。
在优选的实施方式中，所述第1879位的异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)。
在一个实施方式中，所述第2186位的半胱氨酸(C)突变为非半胱氨酸(C)的氨基酸，所述非半胱氨酸(C)的氨基酸选自下组的一种或多种氨基酸：丙氨酸(A)、缬氨酸(V)，甘氨酸(G)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，苯丙氨酸(F)，色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，天冬氨酸(D)，天冬酰胺(N)，赖氨酸(K)，谷氨酰胺(Q)，甲硫氨酸(M)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，谷氨酸(E)，脯氨酸(P)，组氨酸(H)或精氨酸(R)。
在优选的实施方式中，所述第2186位的半胱氨酸(C)突变为精氨酸(R)。
在一个实施方式中，所述的突变选自下组：I1879V、C2186R、或其组合。
在一个实施方式中，所述亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)可以来源于任何植物。
在一个实施方式中，所述亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。
在一个实施方式中，所述亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
在一个优选实施方式中，本发明的亲本型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)来源于稻属，特别是水稻。
在一个实施方式中，所述亲本乙酰辅酶A羧化酶(ACC)具有ACC活性、并且所述亲本ACC的氨基酸序列与SEQIDNO.：1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
在优选的实施方式中，所述亲本ACC的氨基酸序列具有SEQIDNO.：1所示的序列，或者，所述亲本ACC的氨基酸序列如SEQIDNO.：1所示。
在一个实施方式中，所述的突变型ACC与SEQIDNO.：2-4任一所示序列的同源性至少为60％，较佳地至少为70％，更佳地至少为80％，最佳地至少为90％，如95％、97％、99％。
在一个实施方式中，所述的突变型ACC为具有SEQIDNO.：2-4任一所示氨基酸序列的多肽、其活性片段、或其保守性变异多肽。
在一个实施方式中，所述的突变型ACC的氨基酸序列如SEQIDNO.：2-4任一所示。
融合蛋白
另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，包含本发明的突变型ACC蛋白；进一步的，所述融合蛋白还包括：标签肽如，组氨酸标签，6×His，或者质体引导肽，例如引导到叶绿体内的肽，或者调控元件，例如启动子序列、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、标记基因等。
多核苷酸
另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码所述突变型ACC蛋白或其活性片段。
在一个实施方式中，所述多核苷酸选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.：2-4任一所示蛋白的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.：5-7任一所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.：5所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.：2所示蛋白的多核苷酸；或者，核苷酸序列与SEQ ID NO.：6所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.：3所示蛋白的多核苷酸；或者，核苷酸序列与SEQ ID NO.：7所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.：4所示蛋白的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在一个实施方式中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、RNA序列、或其组合。
在一个实施方式中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。
在一个实施方式中，所述的多核苷酸在所述突变蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、核定位信号(NLS)或其组合。
在一个实施方式中，该多核苷酸还包含与所述突变多肽的ORF序列操作性连接的启动子。
在一个实施方式中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。
核酸构建物
另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。
在一个实施方式中，所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。
载体
本发明还提供了一种载体，所述载体包含有编码本发明的突变型ACCase或者融合蛋白的核酸序列，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。
在一个实施方式中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体。
在一个实施方式中，载体可以是对宿主细胞内源性的ACC基因进行基因编辑的载体。
在一个实施方式中，所述的载体含有编码如SEQIDNO.：2-4任一所示多肽的多核苷酸。
在一个实施方式中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。
在一个实施方式中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。
载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。
优选地，本发明中的载体是质粒。
编辑载体系统
另一方面，本发明提供了一种编辑载体系统，所述编辑载体系统能够在植物中产生上述突变型ACC。所述编辑载体系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体至少包含靶向亲本ACC的引导序列。
所述引导序列含有部分亲本型ACC的核苷酸序列，优选的至少含有15bp的ACC核苷酸序列，更优选的至少包括20bp的ACC核苷酸序列。在一种实施方式中，该编辑载体还包括基因编辑酶。所述基因编辑酶包括CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列ClusteredRegularly lnterspaced Short Palindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术Tanscription Activator-like(TAL)effector nucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zinc finger nuclease)编辑工具的核酸酶。
优选地，所述基因编辑酶为Cas蛋白，又名CRISPR酶或Cas效应蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。
优选的，Cas蛋白可操作的连接第一调节元件。
在一个实施方式中，所述基因编辑酶为Cas9蛋白，所述载体中还包括与该Cas9蛋白可以特异性结合的Scaffold序列。Scaffold序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。
在其他的实施方式中，所述基因编辑酶为Cas12蛋白，例如，Cas12a、Cas12b、Cas12i，所述载体中还包括与该所述Cas12蛋白特异性结合的单向重复序列(DirectRepeat)。单向重复序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。
上述调节元件包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。
优选的，所述编辑载体系统还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。
在一种实施方式中，编辑载体中还包含抗性基因以便于筛选，所述抗性基因包括hyg、bar、kana、rif、spec、amp，所述抗性基因是本领域技术人员所熟知的。
优选的，gRNA的引导序列为A-ACC1879：GAGAATATACATGGAAGTGC、A-ACC2186：ATAGCACTCAATGCGGTCTG、或其组合。
优选的，Cas蛋白选用nCas9或其他有nick活性的Cas9蛋白。其中“n”表示nick，即只具有单链切割活性的Cas蛋白。
宿主细胞
另个方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的基因、所述融合蛋白、载体和核酸构建物中的一种或多种；或者，所述的宿主细胞基因组中整合有所述的多核苷酸。
在一个实施方式中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
在一个实施方式中，所述的宿主细胞为植物细胞，所述植物包括被子植物和裸子植物。
在一个实施方式中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在一个实施方式中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在一个实施方式中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
抗性植株
另一方面，本发明提供了一种具有除草剂抗性的植株，所述植株含有所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的多核苷酸、所述融合蛋白、载体和核酸构建物中的一种或多种；或者所述的植株基因组中整合有所述的多核苷酸。所述基本相同表示两条氨基酸序列有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
制备突变多肽的方法
另一方面，本发明提供了一种制备所述突变型ACC多肽或其活性片段的方法，所述的方法包括步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养包含所述突变型ACC多肽的宿主细胞，从而表达所述的突变型ACC多肽；优选的，所述方法还包括
(b)分离所述的突变型ACC多肽的步骤。
获得除草剂抗性植物的方法
另一方面，本发明提供了一种具有除草剂抗性的植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分、植物，其中，所述植物细胞、植物组织、植物种子、植物部分、植物含有所述的突变型ACC多肽或其多核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了一种获得或制备具有除草剂抗性的植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入上述突变型ACC多肽或其多核苷酸序列。
在一个实施方式中，本发明所述的引入ACC突变多肽，包括将ACC突变多肽在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤，例如，通过表达载体对所述突变多肽进行表达的，或者将所述突变多肽整合到植物基因组上进行表达。
在另一优选例中，上述方法包括以下步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的突变型ACC多肽或其活性片段的DNA编码序列；
(2)将植物细胞、植物组织、植物部分与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述突变型ACC多肽或其活性片段的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和
(3)选择已转入所述突变型ACC多肽或其活性片段的DNA编码序列的植物细胞。
在一个实施方式中，所述引入ACC突变多肽包括将植物的内源性ACC进行突变从而引入所述突变多肽的步骤；优选的，可以采用基因编辑的方式引入所述突变多肽。
在另一优选例中，所述的方法包括使植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分内源性ACC编码序列在相应于SEQIDNO.：1的1879和/或2186氨基酸位点发生突变的步骤。
在另一优选例中，所述的方法包括以下步骤：
(1)在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分中引入前述编辑载体系统；
(2)使基因编辑工具作用于其内源性ACC编码序列，并使其在相应于SEQIDNO.：1的1879和/或2186位氨基酸位点发生突变。
进一步的，上述方法还包括筛选突变的植物细胞、植物组织、植物部分，以及任选的，分离所述的基因编辑工具的步骤。
在另一优选例中，所述的基因编辑工具包括CRISPR、TALEN和ZFN。
在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。
在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
在一个实施方式中，含有上述突变多肽的植物相比亲本型植物相比，对除草剂的最大耐受浓度至少提高了1-4倍，例如，2倍，3倍，4倍。在施用除草剂时，本发明含有上述突变多肽的植物对除草剂的抗性至少能耐受推荐用量的2-4倍，而亲本型植物无法耐受此浓度的除草剂。
控制杂草的方法
另一方面，本发明还提供了一种控制植物附近杂草生长的方法，其包括：
a)提供上述对除草剂具有抗性的植物；
b)向所述植物和其附近的杂草施用有效量的除草剂，从而控制所述植物附近的杂草。
所述植物优选为水稻。
所述除草剂包含芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxypropanoates，APP)、肟醚类环己二酮(Cyclohexanedioneoximes，CHD)、芳氧苯基环己二酮类(Aryloxyphenylcy-clohexanedione，APCHD)以及三酮类环己二酮(Cyclictriketones，CTR)中的一种或多种。优选的，所述除草剂包含禾草灭、丁苯草酮、烯草酮、环己烯草酮、噻草酮、烯禾啶、吡喃草酮、三甲苯草酮、苯丙草酮、炔禾灵、炔草酸、氯丁草、禾草灵、唑禾草灵、精唑禾草灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、精吡氟氯禾灵、异草醚、环苯草酮、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、精喹禾乙酯、精喹禾糠酯、三氟苯氧丙酸、唑啉草酯、或其盐或酯中的一种或多种。
优选的，所述除草剂为烯禾啶、苯丙草酮、烯草酮中的一种或多种。
用途
另一方面，本发明提供了所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的基因、所述融合蛋白、载体或核酸构建物在制备具有除草剂抗性的植物的试剂或试剂盒中的用途。
另一方面，本发明提供了所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的基因、所述融合蛋白、载体或核酸构建物在控制杂草中的用途。
另一方面，本发明提供了所述突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、所述编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的基因、所述融合蛋白、载体或核酸构建物在制备具有抗除草剂的植物中的用途。
除草剂
在一个实施方式中，本发明所述的除草剂为ACCase抑制性除草剂，所述ACCase抑制性除草剂包括但不限于芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxypropanoates，APP)、肟醚类环己二酮(Cyclohexanedioneoximes，CHD)、芳氧苯基环己二酮类(Aryloxyphenylcy-clohexanedione，APCHD)以及三酮类环己二酮(Cyclictriketones，CTR)中的一种或多种。
优选的，本发明所述的除草剂包括但不限于禾草灭、丁苯草酮、烯草酮、环己烯草酮、噻草酮、烯禾啶、吡喃草酮、三甲苯草酮、苯丙草酮、炔禾灵、炔草酸、氯丁草、禾草灵、唑禾草灵、精唑禾草灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、精吡氟氯禾灵、异草醚、环苯草酮、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、精喹禾乙酯、精喹禾糠酯、三氟苯氧丙酸、唑啉草酯、或其盐或酯中的一种或多种。优选的，除草剂为苯丙草酮、烯禾啶和烯草酮中的一种或多种。
一般定义
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。因此，本发明的组合物和方法还包含本发明的核苷酸序列和多肽序列(例如，SEQ ID NO：1-7)的同源物。可以通过包括但不限于以下的已知方法计算“同源性”：ComputationalM0lecular Biology[计算分子生物学](Lesk，A.M.编辑)OxfordUniversity Press[牛津大学出版社]，纽约(1988)；Biocomputing：lnformatics andGenome Projects[生物运算：信息学和基因组项目](Smith，D.W.编辑)AcademicPress[学术出版社]，纽约(1993)；Computer Ana l ysis of Sequence Data，Part I[序列数据的计算机分析，第l部分](Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humana Press[胡马纳出版社]，新泽西州(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学中的序列分析](yon Heinje，G.编辑)Academic Press[学术出版社](1987)；以及Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社]，纽约(1991)。
本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.1进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur，W.J.and Lipman，D.J.(1983)Rapid similarity searchesofnucleic acid and protein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：726-730中所述的方法进行计算。在ClustaIW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分：10og缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.1进行比来确定所述蛋白质内特定氨基酸的位置。
术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。
术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。
术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。
术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如I1879V表示第1879位的I变为V，C2186R表示第2186位的C变为氨基酸R，以此类推。对于双重或多重突变，各突变之间以“/”隔开，例如，I1879V/C2186R表示相对于SEQIDNO.：1的氨基酸序列而言，第1879位的I被V取代且第2186位的C被R取代，两个突变均存在于所述具体的突变型ACC蛋白内。
术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。
如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。
术语“ACC除草剂”是抑制禾本科植物体内的脂肪酸合成，选择性高，在植物体内传导，能够苗后防除一年或多年生禾本科杂草的一类除草剂。它具有高效、低毒、施用期长、对后茬作物安全等优点，因而在除草剂中占有重要地位。
ACC除草剂共分为4种类型，分别是芳氧苯氧丙酸酯类(Aryloxyphenoxypropanoates，APP)、肟醚类环己二酮(Cyclohexanedioneoximes，CHD)、芳氧苯基环己二酮类(AryloxyphenylCy-clohexanedione，APCHD)以及三酮类环己二酮(Cyclictriketones，CTR)，结果如下图所示。
Figure BDA0003269547490000071
所述除草剂包括但不限于：禾草灭、丁苯草酮、烯草啶、环己烯草酮、噻草酮、烯禾定、吡喃草酮、三甲苯草酮、炔禾灵、炔草酸、氯丁草、禾草灵、唑禾草灵、精唑禾草灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、精吡氟氯禾灵、异草醚、环苯草酮、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、精喹禾乙酯、精喹禾糠酯、三氟苯氧丙酸、唑啉草酯。
“抗除草剂”或“除草剂抗性”是指植物在暴露于通常对野生型致死的除草剂剂量后存活和繁殖的遗传能力。在植物中，抗性可以是天然产生的或通过诸如基因工程或选择由组织培养或诱变产生的变体的技术诱导的。除非另有说明，除草剂“抗性”是可遗传的，并且允许植物在除草剂对给定植物的典型除草有效处理的存在下生长和繁殖，如本发明公开的归档时除草剂手册的当前版本所建议的。正如本领域技术人员所认识到的，植物仍然可以被认为是“抗性的”，即使由于除草剂暴露而引起的一定程度的植物损伤是显而易见的。如本文所用，术语“耐受性”或“耐受性”包括本文所定义的“抗性”或“抗性”植物，以及特定植物在相同除草剂剂量下耐受在相同基因型的野生型植物中典型为乙基的各种程度的除草剂诱导的伤害的改进的能力。
术语“亲本型ACC多肽”、“亲本ACC多肽”指的是所述ACC突变多肽所来源的多肽，在优选的实施方式中，所述亲本ACC多肽是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或蛋白质(多肽)，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型ACC多肽的氨基酸序列，例如SEQIDNO.：1所示；在某些实施方式中，所述亲本ACC多肽可以是对野生型的ACC多肽进行一个或多个氨基酸残基改变的、但不影响其酶活性质的多肽。
术语“突变的ACC蛋白”、“突变型ACC蛋白”、“突变ACC”、“突变ACC酶”、“突变蛋白”、“突变多肽”、“本发明多肽”、“本发明蛋白”等可互换使用。优选地，所述突变蛋白在对应于SEQ ID NO.：1所示序列的第1879位和/或第2186位的氨基酸突变。
术语“宿主生物”应理解为可以引入突变型ACC蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。
术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阅叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。
术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
术语“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered reguIarIy interspaced short palindromicrepeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。
如本文所用，术语“基因编辑酶”指适用于CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered Regularly Inter spaced Short Palindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术Transcription Activator-Iike(TAL)effector nucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zinc finger nuclease)等编辑工具的核酸酶。优选地，所述基因编辑酶为CRISPR酶，又名Cas蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。所述的Cas蛋白是指蛋白家族，可以根据其来源不同而具有不同的结构，如来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9、来源于葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SaCas9；还可以根据结构特征(如结构域)进行下位分类，如Cas12家族包括Cas12a(又名Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12i等。所述的Cas蛋白可以具有双链或单链或无切割活性。本发明所述的Cas蛋白可以是野生型或其突变体，所述的突变体的突变类型包括氨基酸的替换、取代或缺失，所述的突变体可以改变也可以不改变Cas蛋白的酶切活性。优选地，本发明所述的Cas蛋白只具有单链切割活性或无切割活性，其为野生型Cas蛋白的一种突变体。优选地，本发明Cas蛋白为具有单链切割活性的Cas9、Cas12、Cas13或Cas14。在一优选实施方式中，本发明的Cas9蛋白包括SpCas9n(D10A)、nSpCas9NG、SaCas9n、ScCas9n、XCas9n，其中“n”表示nick，即只具有单链切割活性的Cas蛋白。突变已知Cas蛋白获得具有单链或无切割活性的Cas蛋白为本领域的常规技术手段。本领域技术人员所知，现有技术中已报到的多种具有核酸切割活性的Cas蛋白，该公知蛋白或其改造后的变体均可以实现本发明的功能，本文通过引用方式将其纳入保护范围。
例如，本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维构型产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不损害蛋白质的生物活性，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的突变型GBSS1蛋白除了包含上述突变之外，还可以在氨基酸序列中包含一个或多个其他突变例如保守性取代。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的突变型ACC蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的N和/或C末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型ACC蛋白的N和/或C末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段(比如含有本发明突变位点的氨基酸片段)，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型ACC蛋白的一部分，其保留了本发明的突变型ACC蛋白的生物学活性。例如，突变型ACC蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的N和/或C末端缺失了一个或多个(例如1-50个、1-25个、1-10个或1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。
此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
本发明还提供编码所述突变型ACC多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。优选的所述突变型ACC多肽如SEQIDNO.：2-4所示。本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。所获得的核苷酸序列可将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到大批量有关序列。本发明突变位点亦可通过人工合成引入。
可将一拷贝以上的本发明之多核苷酸插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。可通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中或者通过将可扩增的可选择标记基因与所述多核苷酸包含在一起来达到多核苷酸拷贝数目的增加，在后一情形下，包含扩增拷贝的选择标记基因以及由此而来的附加拷贝的多核苷酸的细胞可通过在适当的可选择制剂存在的条件下人工培养所述细胞进行选择。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ACC突变多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript IIKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。
本发明还提供了包含本发明ACC突变多肽编码核酸序列、核酸构建体或表达载体的宿主细胞。将包含编码本发明的载体引入宿主细胞中使得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在，或者载体可以对宿主细胞内源性的ACC基因进行基因编辑。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核生物细胞和真核生物细胞。
本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。
在本发明的生产方法中，用本领域众所周知的方法将所述细胞培养于适于所述多肽产生的营养培养基上。若所述多肽被分泌入营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。若所述多肽不分泌到培养基中，则可从细胞裂解物中回收它。
如本文中所使用的，术语“指导RNA(guide RNA)”、“成熟crRNA”、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。
在某些情况下，引导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，引导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。
序列表
序列号 类型 内容
SEQIDNO.：1 蛋白质 野生型ACC的氨基酸序列
SEQIDNO.：2 蛋白质 11879V的氨基酸序列
SEQIDNO.：3 蛋白质 C2186R的氨基酸序列
SEQIDNO.：4 蛋白质 11879V和C2186R双突变的氨基酸序列
SEQIDNO.：5 DNA 11879V的DNA序列
SEQIDNO.：6 DNA C2186R的DNA序列
SEQIDNO.：7 DNA I1879V和C2186R双突变的DNA序列
本发明的主要优点：
1、本发明筛选出了一组突变型的ACC蛋白。2、含有本发明突变型ACC蛋白的植物相比野生型植物其具有明显的除草剂抗性。
附图说明
图1.ABE-nCas9碱基编辑器示意图；其中，OsU6、ZmUbi为启动子；sgRNA为指导RNA；bp-NLS为核定位信号；NOS为终止子。
图2.ACC第1879位氨基酸位点的突变的植株相对于野生型所表现出的除草剂抗性。
图3.ACC第2186位氨基酸位点的突变的植株相对于野生型所表现出的除草剂抗性。
图4.I1879V编辑植株对烯禾啶的耐受性试验。
图5.I1879V编辑植株对苯丙草酮喷施20天的耐受性试验。图6.I1879V和C2186R编辑植株对精喹禾灵和精恶唑禾草灵的耐受性试验。
图7.I1879V编辑植株对不同除草剂的耐受性试验。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、基因编辑载体构建及突变位点的筛选
1、构建靶向水稻内源ACC基因的ABE-nCas9碱基编辑器
ABE碱基编辑器可以在一定的序列窗口范围内实现A/T-＞G/C的碱基转换，本发明以ABE-nCas9碱基编辑器为载体，在水稻内源ACCase基因中设计sgRNA(表1所示的sgRNA)，分别克隆至ABE-nCas9载体，形成靶向水稻内源ACCase基因的碱基编辑器，水稻内源ACCase基因编码的氨基酸如SEQ ID No.1所示。
表1靶向水稻ACC的sgRNA序列(引导序列)
sgRNA编号 guide-PAM序列(5’-3’)
A-ACC1879 GAGAATATACATGGAAGTGC
A-ACC2186 ATAGCACTCAATGCGGTCTG
2、水稻遗传转化及转基困植株鉴定
以皖直粳006、南粳9108、嘉禾218等多个水稻品种作为实验材料，把以上构建好的碱基编辑器分别通过农杆菌转化，获得基因编辑植株。生出的苗用含有烯禾啶除草剂的培养基筛选，选用的浓度为SET-2浓度：2mg/L。或将编辑苗种于栽培间，使用浓度为0.5g/L的烯禾啶除草剂喷施编辑苗和对照植株(对应田间施用量为10g.a.i/mu)，10天后统计苗成活情况。
通过筛选培养，在含有烯禾啶除草剂的培养基筛选获得抗除草剂的植株，如图2所示，箭头所示的植株与其他植株相比，能够耐受除草剂，表现出了对除草剂的抗性，通过PCR及测序对以上抗除草剂植株进行鉴定，发现抗性植株在靶点范围内出现预期的碱基替换，具体编辑类型分别为I1879V。另外，在栽培间也筛选获得抗除草剂的植株，所图3所示，编辑植株与对照植株相比，能够耐受除草剂，表现出了对除草剂的抗性，通过PCR及测序对以上抗除草剂植株进行鉴定，发现抗性植株在靶点范围内出现预期的碱基替换，具体编辑类型分别为C2186R。
针对I1879V水稻编辑植株，继续增加烯禾啶的用量，增加到对应田间施用量为15g.a.i/mu，14天后对照明显发黄、枯死，编辑材料可正常生长，如图4所示。继续增加烯禾啶的用量，增加到30g.a.i/mu，培养20天后，野生型植株全部枯死；同时，编辑材料仍能表现出显著的耐药性，药害只有30％左右。
实施例2、对其他类型除草剂的抗性
分别种植实施例1得到的I1879V和C2186R水稻编辑植株，进行其他类型除草剂的抗性测试，如苯丙草酮、精喹禾灵、精恶唑禾草灵、烯草酮(clethodim，中文商品名为收乐通、赛乐特)、高效氟吡甲禾灵、唑啉草酯、丁酰烯草酮等除草剂。
2.1苯丙草酮：
采用田间穴栽苗期的水稻，喷施20g.a.i./mu(4倍推荐用量)苯丙草酮然后观察结果。针对I1879V编辑植株，喷施苯丙草酮7日后，野生型喷施除草剂组有明显的退绿和药斑，但是，I1879V编辑材料无肉眼可见药害。用药20天后，如图5所示，野生型喷施除草剂组药害严重(图5箭头处显示出明显的药害)，并且其生长也受到了严重的影响；I1879V编辑材料与未喷施组的对照组生物量差异不大，也就是说，即使到20天后，l1879V编辑材料仍能对苯丙草酮表现出优秀的抗性，没有明显的药害，生长也不受影响。但是，针对C2186R编辑植株，其与野生型对照相比，能够表现出一定的抗性，C2186R编辑植株与I1879V编辑植株相比，在20g.a.i./mu苯丙草酮的用量情况下，表现出了明显的药害，编辑材料叶片基部有褪绿药斑，安全性不足，无法实际利用。
2.2精喹禾灵、精恶唑禾草灵：
针对I1879V编辑植株和C2186R编辑植株，分别施用5g a.i/mu的精喹禾灵或5ga.i/mu精恶唑禾草灵，14天后观察结果；如图6所示，14天后，施药的编辑植株和施药的野生型对照相比，没有显著区别，上述编辑植株无法对精喹禾灵或精恶唑禾草灵产生耐受性。
2.3烯草酮、高效氟吡甲禾灵、唑啉草酯、丁酰烯草酮：
针对I1879V编辑植株测试其对烯草酮、高效氟吡甲禾灵、唑啉草酯、丁酰烯草酮除草剂的耐受性，其中，针对烯草酮、高效氟吡甲禾灵、唑啉草酯分别施用5g a.i/mu(1X)和10g a.i/mu(2X)的浓度：针对丁酰烯草酮，施用10g a.i/mu(1X)和20g a.i/mu(2X)的浓度。用药20天后，观察编辑植株的长势，统计编辑植株的耐药性，如图7所示，I1879V编辑植株在上述1X除草剂的浓度下已经表现出了一定的药害，死亡率在30％-50％；在上述2X除草剂的浓度下，编辑植株已经处于基本抗的状态，死亡率在70％-90％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东舜丰生物科技有限公司
<120> 抗除草剂乙酰辅酶A羧化酶突变体及其应用
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<170> PatentIn version 3.5
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865 870 875 880
Ala His Val Asp Ala Asp Val Pro Tyr Ala Glu Val Glu Val Met Lys
885 890 895
Met Cys Met Pro Leu Leu Ser Pro Ala Ser Gly Val Ile His Val Val
900 905 910
Met Ser Glu Gly Gln Ala Met Gln Ala Gly Asp Leu Ile Ala Arg Leu
915 920 925
Asp Leu Asp Asp Pro Ser Ala Val Lys Arg Ala Glu Pro Phe Glu Asp
930 935 940
Thr Phe Pro Gln Met Gly Leu Pro Ile Ala Ala Ser Gly Gln Val His
945 950 955 960
Lys Leu Cys Ala Ala Ser Leu Asn Ala Cys Arg Met Ile Leu Ala Gly
965 970 975
Tyr Glu His Asp Ile Asp Lys Val Val Pro Glu Leu Val Tyr Cys Leu
980 985 990
Asp Thr Pro Glu Leu Pro Phe Leu Gln Trp Glu Glu Leu Met Ser Val
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Leu Ala Thr Arg Leu Pro Arg Asn Leu Lys Ser Glu Leu Glu Gly
1010 1015 1020
Lys Tyr Glu Glu Tyr Lys Val Lys Phe Asp Ser Gly Ile Ile Asn
1025 1030 1035
Asp Phe Pro Ala Asn Met Leu Arg Val Ile Ile Glu Glu Asn Leu
1040 1045 1050
Ala Cys Gly Ser Glu Lys Glu Lys Ala Thr Asn Glu Arg Leu Val
1055 1060 1065
Glu Pro Leu Met Ser Leu Leu Lys Ser Tyr Glu Gly Gly Arg Glu
1070 1075 1080
Ser His Ala His Phe Val Val Lys Ser Leu Phe Glu Glu Tyr Leu
1085 1090 1095
Tyr Val Glu Glu Leu Phe Ser Asp Gly Ile Gln Ser Asp Val Ile
1100 1105 1110
Glu Arg Leu Arg Leu Gln His Ser Lys Asp Leu Gln Lys Val Val
1115 1120 1125
Asp Ile Val Leu Ser His Gln Ser Val Arg Asn Lys Thr Lys Leu
1130 1135 1140
Ile Leu Lys Leu Met Glu Ser Leu Val Tyr Pro Asn Pro Ala Ala
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Tyr Arg Asp Gln Leu Ile Arg Phe Ser Ser Leu Asn His Lys Ala
1160 1165 1170
Tyr Tyr Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ser Glu Leu Leu Glu Gln Thr
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Lys Leu Ser Glu Leu Arg Ala Arg Ile Ala Arg Ser Leu Ser Glu
1190 1195 1200
Leu Glu Met Phe Thr Glu Glu Ser Lys Gly Leu Ser Met His Lys
1205 1210 1215
Arg Glu Ile Ala Ile Lys Glu Ser Met Glu Asp Leu Val Thr Ala
1220 1225 1230
Pro Leu Pro Val Glu Asp Ala Leu Ile Ser Leu Phe Asp Cys Ser
1235 1240 1245
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1250 1255 1260
Leu Tyr Gln Pro His Leu Val Lys Asp Ser Ile Lys Met Lys Trp
1265 1270 1275
Ile Glu Ser Gly Val Ile Ala Leu Trp Glu Phe Pro Glu Gly His
1280 1285 1290
Phe Asp Ala Arg Asn Gly Gly Ala Val Leu Gly Asp Lys Arg Trp
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Gly Ala Met Val Ile Val Lys Ser Leu Glu Ser Leu Ser Met Ala
1310 1315 1320
Ile Arg Phe Ala Leu Lys Glu Thr Ser His Tyr Thr Ser Ser Glu
1325 1330 1335
Gly Asn Met Met His Ile Ala Leu Leu Gly Ala Asp Asn Lys Met
1340 1345 1350
His Ile Ile Gln Glu Ser Gly Asp Asp Ala Asp Arg Ile Ala Lys
1355 1360 1365
Leu Pro Leu Ile Leu Lys Asp Asn Val Thr Asp Leu His Ala Ser
1370 1375 1380
Gly Val Lys Thr Ile Ser Phe Ile Val Gln Arg Asp Glu Ala Arg
1385 1390 1395
Met Thr Met Arg Arg Thr Phe Leu Trp Ser Asp Glu Lys Leu Ser
1400 1405 1410
Tyr Glu Glu Glu Pro Ile Leu Arg His Val Glu Pro Pro Leu Ser
1415 1420 1425
Ala Leu Leu Glu Leu Asp Lys Leu Lys Val Lys Gly Tyr Asn Glu
1430 1435 1440
Met Lys Tyr Thr Pro Ser Arg Asp Arg Gln Trp His Ile Tyr Thr
1445 1450 1455
Leu Arg Asn Thr Glu Asn Pro Lys Met Leu His Arg Val Phe Phe
1460 1465 1470
Arg Thr Leu Val Arg Gln Pro Ser Val Ser Asn Lys Phe Ser Ser
1475 1480 1485
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1490 1495 1500
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1505 1510 1515
Glu Glu Leu Glu Leu His Ala Ile Arg Thr Gly His Ser His Met
1520 1525 1530
Tyr Leu His Val Leu Lys Glu Gln Lys Leu Leu Asp Leu Val Pro
1535 1540 1545
Val Ser Gly Asn Thr Val Leu Asp Val Gly Gln Asp Glu Ala Thr
1550 1555 1560
Ala Tyr Ser Leu Leu Lys Glu Met Ala Met Lys Ile His Glu Leu
1565 1570 1575
Val Gly Ala Arg Met His His Leu Ser Val Cys Gln Trp Glu Val
1580 1585 1590
Lys Leu Lys Leu Asp Cys Asp Gly Pro Ala Ser Gly Thr Trp Arg
1595 1600 1605
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1610 1615 1620
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1640 1645 1650
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1655 1660 1665
Ala Arg Asn Asn Arg Thr Thr Tyr Cys Tyr Asp Phe Pro Leu Ala
1670 1675 1680
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1685 1690 1695
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1715 1720 1725
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Glu Ile Ile Val Val Ala Asn Asp Ile Thr Phe Arg Ala Gly Ser
1760 1765 1770
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1775 1780 1785
Ala Cys Glu Lys Lys Leu Pro Leu Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Ser
1790 1795 1800
Gly Ala Arg Ile Gly Ile Ala Asp Glu Val Lys Ser Cys Phe Arg
1805 1810 1815
Val Gly Trp Ser Asp Asp Gly Ser Pro Glu Arg Gly Phe Gln Tyr
1820 1825 1830
Ile Tyr Leu Ser Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Ile Gly Thr Ser Val
1835 1840 1845
Ile Ala His Lys Met Gln Leu Asp Ser Gly Glu Ile Arg Trp Val
1850 1855 1860
Ile Asp Ser Val Val Gly Lys Glu Asp Gly Leu Gly Val Glu Asn
1865 1870 1875
Val His Gly Ser Ala Ala Ile Ala Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Tyr
1880 1885 1890
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1895 1900 1905
Ile Gly Ala Tyr Leu Ala Arg Leu Gly Ile Arg Cys Ile Gln Arg
1910 1915 1920
Leu Asp Gln Pro Ile Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Ala Leu Asn Lys
1925 1930 1935
Leu Leu Gly Arg Glu Val Tyr Ser Ser His Met Gln Leu Gly Gly
1940 1945 1950
Pro Lys Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Leu Thr Val Ser
1955 1960 1965
Asp Asp Leu Glu Gly Val Ser Asn Ile Leu Arg Trp Leu Ser Tyr
1970 1975 1980
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1985 1990 1995
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2000 2005 2010
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2015 2020 2025
Trp Leu Gly Gly Met Phe Asp Lys Asp Ser Phe Val Glu Thr Phe
2030 2035 2040
Glu Gly Trp Ala Lys Thr Val Val Thr Gly Arg Ala Lys Leu Gly
2045 2050 2055
Gly Ile Pro Val Gly Val Ile Ala Val Glu Thr Gln Thr Met Met
2060 2065 2070
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2075 2080 2085
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2090 2095 2100
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Asn Leu Arg Thr Tyr Asn Gln Pro Ala Phe Val Tyr Ile Pro Met
2150 2155 2160
Ala Ala Glu Leu Arg Gly Gly Ala Trp Val Val Val Asp Ser Lys
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2180 2185 2190
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2210 2215 2220
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2225 2230 2235
Ala Asp Thr Lys Ser Leu Gln Glu Asn Ile Glu Ala Arg Thr Lys
2240 2245 2250
Gln Leu Met Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Ala Ile Arg Phe Ala Glu
2255 2260 2265
Leu His Asp Thr Ser Leu Arg Met Ala Ala Lys Gly Val Ile Lys
2270 2275 2280
Lys Val Val Asp Trp Glu Glu Ser Arg Ser Phe Phe Tyr Lys Arg
2285 2290 2295
Leu Arg Arg Arg Ile Ser Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Ile Arg
2300 2305 2310
Ala Val Ala Gly Glu Gln Phe Ser His Gln Pro Ala Ile Glu Leu
2315 2320 2325
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2330 2335 2340
Asp Asp Ala Phe Val Ala Trp Met Asp Asn Pro Glu Asn Tyr Lys
2345 2350 2355
Asp Tyr Ile Gln Tyr Leu Lys Ala Gln Arg Val Ser Gln Ser Leu
2360 2365 2370
Ser Ser Leu Ser Asp Ser Ser Ser Asp Leu Gln Ala Leu Pro Gln
2375 2380 2385
Gly Leu Ser Met Leu Leu Asp Lys Met Asp Pro Ser Arg Arg Ala
2390 2395 2400
Gln Leu Val Glu Glu Ile Arg Lys Val Leu Gly
2405 2410
<210> 3
<211> 2414
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 3
Met Pro Met Arg Pro Trp Glu Phe Ile Ile Leu Gly Arg Thr Ala Pro
1 5 10 15
Ile Ser Pro Pro Pro Leu Gly Ile Ser Ala Phe Ser Arg Pro Leu Arg
20 25 30
Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Ala Ala Val Val Asp Ala Ala Arg Ile
35 40 45
Gln Thr Pro Pro Arg Val Ala Phe Ser Ala Phe Phe Phe Phe Phe Phe
50 55 60
Phe Phe Ser Glu Gly Leu Ser Arg Glu Gly Thr Ala Ala Arg Leu Pro
65 70 75 80
Ala Leu Ile Tyr Arg Val Pro Phe Ile Pro Cys Leu Leu Gln Leu Gln
85 90 95
Ile Arg Ala Pro His Ala Asp Pro Arg Pro Ala Gly Phe Ser Cys Ala
100 105 110
His His Phe Leu Ala Leu Ala Gln Gly Leu Ser Ser Ser Leu Leu Ser
115 120 125
Gly Thr Ile Ser His Ile Trp Gly Phe Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Thr
130 135 140
Thr His Leu Arg Asn Arg Ala Ile Leu Leu Phe Gly Leu Ala Gly Ile
145 150 155 160
Ile Asp Leu Pro Asn Asp Ala Ala Ser Glu Val Asp Ile Ser His Gly
165 170 175
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Gly Ile Ile Asn Glu Thr His Asn Gly Arg His Ala Ser Val Ser Lys
195 200 205
Val Val Glu Phe Cys Thr Ala Leu Gly Gly Lys Thr Pro Ile His Ser
210 215 220
Val Leu Val Ala Asn Asn Gly Met Ala Ala Ala Lys Phe Met Arg Ser
225 230 235 240
Val Arg Thr Trp Ala Asn Asp Thr Phe Gly Ser Glu Lys Ala Ile Gln
245 250 255
Leu Ile Ala Met Ala Thr Pro Glu Asp Leu Arg Ile Asn Ala Glu His
260 265 270
Ile Arg Ile Ala Asp Gln Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Thr Asn Asn
275 280 285
Asn Asn Tyr Ala Asn Val Gln Leu Ile Val Glu Ile Ala Glu Arg Thr
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Gly Val Ser Ala Val Trp Pro Gly Trp Gly His Ala Ser Glu Asn Pro
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Glu Leu Pro Asp Ala Leu Thr Ala Lys Gly Ile Val Phe Leu Gly Pro
325 330 335
Pro Ala Ser Ser Met His Ala Leu Gly Asp Lys Val Gly Ser Ala Leu
340 345 350
Ile Ala Gln Ala Ala Gly Val Pro Thr Leu Ala Trp Ser Gly Ser His
355 360 365
Val Glu Val Pro Leu Glu Cys Cys Leu Asp Ser Ile Pro Asp Glu Met
370 375 380
Tyr Arg Lys Ala Cys Val Thr Thr Thr Glu Glu Ala Val Ala Ser Cys
385 390 395 400
Gln Val Val Gly Tyr Pro Ala Met Ile Lys Ala Ser Trp Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Lys Gly Ile Arg Lys Val His Asn Asp Asp Glu Val Arg Thr Leu
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Phe Lys Gln Val Gln Gly Glu Val Pro Gly Ser Pro Ile Phe Ile Met
435 440 445
Arg Leu Ala Ala Gln Ser Arg His Leu Glu Val Gln Leu Leu Cys Asp
450 455 460
Gln Tyr Gly Asn Val Ala Ala Leu His Ser Arg Asp Cys Ser Val Gln
465 470 475 480
Arg Arg His Gln Lys Ile Ile Glu Glu Gly Pro Val Thr Val Ala Pro
485 490 495
Arg Glu Thr Val Lys Glu Leu Glu Gln Ala Ala Arg Arg Leu Ala Lys
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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Gln Val Ala Val Gly Met Gly Ile Pro Leu Trp Gln Ile Pro Glu Ile
565 570 575
Arg Arg Phe Tyr Gly Met Asn His Gly Gly Gly Tyr Asp Leu Trp Arg
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Pro Asp Asp Gly Phe Lys Pro Thr Gly Gly Lys Val Lys Glu Ile Ser
625 630 635 640
Phe Lys Ser Lys Pro Asn Val Trp Ala Tyr Phe Ser Val Lys Ser Gly
645 650 655
Gly Gly Ile His Glu Phe Ala Asp Ser Gln Phe Gly His Val Phe Ala
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675 680 685
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Val Asp Leu Leu Asn Ala Ser Asp Phe Arg Glu Asn Lys Ile His Thr
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Gly Trp Leu Asp Thr Arg Ile Ala Met Arg Val Gln Ala Glu Arg Pro
725 730 735
Pro Trp Tyr Ile Ser Val Val Gly Gly Ala Leu Tyr Lys Thr Val Thr
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His Val Ile Tyr Ala Glu Glu Glu Ala Ser Gly Thr Arg Leu Leu Ile
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850 855 860
Leu Ala Glu Thr Pro Cys Lys Leu Leu Arg Phe Leu Val Ala Asp Gly
865 870 875 880
Ala His Val Asp Ala Asp Val Pro Tyr Ala Glu Val Glu Val Met Lys
885 890 895
Met Cys Met Pro Leu Leu Ser Pro Ala Ser Gly Val Ile His Val Val
900 905 910
Met Ser Glu Gly Gln Ala Met Gln Ala Gly Asp Leu Ile Ala Arg Leu
915 920 925
Asp Leu Asp Asp Pro Ser Ala Val Lys Arg Ala Glu Pro Phe Glu Asp
930 935 940
Thr Phe Pro Gln Met Gly Leu Pro Ile Ala Ala Ser Gly Gln Val His
945 950 955 960
Lys Leu Cys Ala Ala Ser Leu Asn Ala Cys Arg Met Ile Leu Ala Gly
965 970 975
Tyr Glu His Asp Ile Asp Lys Val Val Pro Glu Leu Val Tyr Cys Leu
980 985 990
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995 1000 1005
Leu Ala Thr Arg Leu Pro Arg Asn Leu Lys Ser Glu Leu Glu Gly
1010 1015 1020
Lys Tyr Glu Glu Tyr Lys Val Lys Phe Asp Ser Gly Ile Ile Asn
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Ser His Ala His Phe Val Val Lys Ser Leu Phe Glu Glu Tyr Leu
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Tyr Val Glu Glu Leu Phe Ser Asp Gly Ile Gln Ser Asp Val Ile
1100 1105 1110
Glu Arg Leu Arg Leu Gln His Ser Lys Asp Leu Gln Lys Val Val
1115 1120 1125
Asp Ile Val Leu Ser His Gln Ser Val Arg Asn Lys Thr Lys Leu
1130 1135 1140
Ile Leu Lys Leu Met Glu Ser Leu Val Tyr Pro Asn Pro Ala Ala
1145 1150 1155
Tyr Arg Asp Gln Leu Ile Arg Phe Ser Ser Leu Asn His Lys Ala
1160 1165 1170
Tyr Tyr Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ser Glu Leu Leu Glu Gln Thr
1175 1180 1185
Lys Leu Ser Glu Leu Arg Ala Arg Ile Ala Arg Ser Leu Ser Glu
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Leu Glu Met Phe Thr Glu Glu Ser Lys Gly Leu Ser Met His Lys
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Arg Glu Ile Ala Ile Lys Glu Ser Met Glu Asp Leu Val Thr Ala
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1250 1255 1260
Leu Tyr Gln Pro His Leu Val Lys Asp Ser Ile Lys Met Lys Trp
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Phe Asp Ala Arg Asn Gly Gly Ala Val Leu Gly Asp Lys Arg Trp
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Gly Ala Met Val Ile Val Lys Ser Leu Glu Ser Leu Ser Met Ala
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Ile Arg Phe Ala Leu Lys Glu Thr Ser His Tyr Thr Ser Ser Glu
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Gly Asn Met Met His Ile Ala Leu Leu Gly Ala Asp Asn Lys Met
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2135 2140 2145
Asn Leu Arg Thr Tyr Asn Gln Pro Ala Phe Val Tyr Ile Pro Met
2150 2155 2160
Ala Ala Glu Leu Arg Gly Gly Ala Trp Val Val Val Asp Ser Lys
2165 2170 2175
Ile Asn Pro Asp Arg Ile Glu Arg Tyr Ala Glu Arg Thr Ala Lys
2180 2185 2190
Gly Asn Val Leu Glu Pro Gln Gly Leu Ile Glu Ile Lys Phe Arg
2195 2200 2205
Ser Glu Glu Leu Gln Asp Cys Met Ser Arg Leu Asp Pro Thr Leu
2210 2215 2220
Ile Asp Leu Lys Ala Lys Leu Glu Val Ala Asn Lys Asn Gly Ser
2225 2230 2235
Ala Asp Thr Lys Ser Leu Gln Glu Asn Ile Glu Ala Arg Thr Lys
2240 2245 2250
Gln Leu Met Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Ala Ile Arg Phe Ala Glu
2255 2260 2265
Leu His Asp Thr Ser Leu Arg Met Ala Ala Lys Gly Val Ile Lys
2270 2275 2280
Lys Val Val Asp Trp Glu Glu Ser Arg Ser Phe Phe Tyr Lys Arg
2285 2290 2295
Leu Arg Arg Arg Ile Ser Glu Asp Val Leu Ala Lys Glu Ile Arg
2300 2305 2310
Ala Val Ala Gly Glu Gln Phe Ser His Gln Pro Ala Ile Glu Leu
2315 2320 2325
Ile Lys Lys Trp Tyr Ser Ala Ser His Ala Ala Glu Trp Asp Asp
2330 2335 2340
Asp Asp Ala Phe Val Ala Trp Met Asp Asn Pro Glu Asn Tyr Lys
2345 2350 2355
Asp Tyr Ile Gln Tyr Leu Lys Ala Gln Arg Val Ser Gln Ser Leu
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Ser Ser Leu Ser Asp Ser Ser Ser Asp Leu Gln Ala Leu Pro Gln
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Gly Leu Ser Met Leu Leu Asp Lys Met Asp Pro Ser Arg Arg Ala
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Gln Leu Val Glu Glu Ile Arg Lys Val Leu Gly
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<210> 4
<211> 2414
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 4
Met Pro Met Arg Pro Trp Glu Phe Ile Ile Leu Gly Arg Thr Ala Pro
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Ile Ser Pro Pro Pro Leu Gly Ile Ser Ala Phe Ser Arg Pro Leu Arg
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Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Ala Ala Val Val Asp Ala Ala Arg Ile
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Gln Thr Pro Pro Arg Val Ala Phe Ser Ala Phe Phe Phe Phe Phe Phe
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Phe Phe Ser Glu Gly Leu Ser Arg Glu Gly Thr Ala Ala Arg Leu Pro
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Ala Leu Ile Tyr Arg Val Pro Phe Ile Pro Cys Leu Leu Gln Leu Gln
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Ile Arg Ala Pro His Ala Asp Pro Arg Pro Ala Gly Phe Ser Cys Ala
100 105 110
His His Phe Leu Ala Leu Ala Gln Gly Leu Ser Ser Ser Leu Leu Ser
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Gly Thr Ile Ser His Ile Trp Gly Phe Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Thr
130 135 140
Thr His Leu Arg Asn Arg Ala Ile Leu Leu Phe Gly Leu Ala Gly Ile
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Ile Asp Leu Pro Asn Asp Ala Ala Ser Glu Val Asp Ile Ser His Gly
165 170 175
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180 185 190
Gly Ile Ile Asn Glu Thr His Asn Gly Arg His Ala Ser Val Ser Lys
195 200 205
Val Val Glu Phe Cys Thr Ala Leu Gly Gly Lys Thr Pro Ile His Ser
210 215 220
Val Leu Val Ala Asn Asn Gly Met Ala Ala Ala Lys Phe Met Arg Ser
225 230 235 240
Val Arg Thr Trp Ala Asn Asp Thr Phe Gly Ser Glu Lys Ala Ile Gln
245 250 255
Leu Ile Ala Met Ala Thr Pro Glu Asp Leu Arg Ile Asn Ala Glu His
260 265 270
Ile Arg Ile Ala Asp Gln Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Thr Asn Asn
275 280 285
Asn Asn Tyr Ala Asn Val Gln Leu Ile Val Glu Ile Ala Glu Arg Thr
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325 330 335
Pro Ala Ser Ser Met His Ala Leu Gly Asp Lys Val Gly Ser Ala Leu
340 345 350
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370 375 380
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Gln Val Val Gly Tyr Pro Ala Met Ile Lys Ala Ser Trp Gly Gly Gly
405 410 415
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Arg Arg His Gln Lys Ile Ile Glu Glu Gly Pro Val Thr Val Ala Pro
485 490 495
Arg Glu Thr Val Lys Glu Leu Glu Gln Ala Ala Arg Arg Leu Ala Lys
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Arg Arg Phe Tyr Gly Met Asn His Gly Gly Gly Tyr Asp Leu Trp Arg
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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Phe Lys Ser Lys Pro Asn Val Trp Ala Tyr Phe Ser Val Lys Ser Gly
645 650 655
Gly Gly Ile His Glu Phe Ala Asp Ser Gln Phe Gly His Val Phe Ala
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Gln Leu Met Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Ala Ile Arg Phe Ala Glu
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<211> 13931
<212> DNA
<213> Oryza sativa
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cacgccgatc cgcgcccggc cggtgagtcc gccgcgggtt tccgccattg ctgccgtttc 360
tgcgctgcta gggggaggtt tagatgtggg tggtgggagc cgcgtgctgt tgtctgggat 420
gggagagaga gggtttaagg gtgggtgccg gatgcggatg ctcccgcccg ggttttggtc 480
ctgcttgtgg actggcgagg ggctaggggt tgagttgtag ggattcggga tggaaatgga 540
ctggggagct cggatgggga ggtaatgcca cgccggtgaa atgcagctcg ctgttgttgg 600
ttctggttaa tgcctgggtg ttgctggcta tgttactatg ttgcatgcct acgcgagata 660
ctgccatgtg ccattttgcg tgattgtgat attggtttga ggttttagct gcgctcatca 720
tttcctcgcg ttggctcagg gtttaagctc ctctttgtta agtgggacgg tatgcatatg 780
cattgtgttc ttttaggttt aaattctggt tacggtgcca cacaacaagt cgtagatgct 840
cattcttgtt cttttcatgg ggcttatgga attgatggca catggcacac ctttctcctt 900
tttccgtcat gcatgttagt gccatattgt ctacgcaaaa aagaatattc tgcatatttg 960
tttactcact atttttttcc aagagaattg ggttttgcca tgcttcaaaa ggaacatttc 1020
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tgacattatt caccatgata aagttttacc ttttgttttt ttcctttcac taggaacaga 1200
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aattatcctg tgcaaaatga acaaaggtgg cacacaatgt acaagcttgc atttcatttt 1380
tggatcctca aacgtcttaa agacttttgc ataaagtatt tgatgagtaa cgagctggaa 1440
ctaatcattc ttatatattt tcatctgtca gatttcacac atctggggat ttatcttctc 1500
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agaatggtca gcgtactcgg tcacttaggg aagaaagcaa tggaggagtg tctgattcca 1740
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ctataggata cagcaaaaat atataattga ctgggcaaga tgcaacaatt gtttttcact 1920
aaagttagtt atcttttgct gtaaaagaca actgtttttt acataaaatg gtattaataa 1980
ccttgtaata ttcaatgcaa catgttctca agtaaaaaaa aacattgcct ggttgtataa 2040
gcaaatgtgt cgttgtagac atcttattaa acctttttgt gatatctatt accgtaggga 2100
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ttataataat tattatataa ttttctgaca tgttttgaga acctcaaaac atgtgattgc 2340
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cctgcaattc taatgtaccc actcaaactg gtatcaccaa agatctccat ctgattgaaa 2760
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cggtcccagg ttcctaccaa atgaatggga ttatcaatga aacacataat gggaggcatg 3000
cttcagtctc caaggttgtt gagttttgta cggcacttgg tggcaaaaca ccaattcaca 3060
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gggctaatga tacttttgga tcagagaagg caattcagct gatagctatg gcaactccgg 3180
aggatctgag gataaatgca gagcacatca gaattgccga tcaatttgta gaggtacctg 3240
gtggaacaaa caacaacaac tatgcaaatg tccaactcat agtggaggtt agttcagctc 3300
atccctcaac acaacatttt cgtttctatt taagttaggg aaaaatctct acgaccctcc 3360
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atacctgatg agatgtatag aaaagcttgt gttactacca cagaggaagc agttgcaagt 3780
tgtcaggtgg ttggttatcc tgccatgatt aaggcatctt ggggtggtgg tggtaaagga 3840
ataaggaagg tttgttcttc ttgtagttat caagagattg tttggattgc aagtgtttag 3900
tgcccatagt taactctggt ctttctaaca tgagtaactc aactttcttg caggttcata 3960
atgatgatga ggttaggaca ttatttaagc aagttcaagg cgaagtacct ggttccccaa 4020
tatttatcat gaggctagct gctcaggtgg ggccttttat ggaagttaca ccttttccct 4080
taatgttgag ttattccgga gttattatgg ttatgttctg tatgtttgat ctgtaaatta 4140
ttgaaattca cctccattgg ttctccagat tagcagacct acaattctac atatggttta 4200
tactttataa atactaggat ttagggatct tcatatagtt tatacatggt atttagattt 4260
catttgtaac cctattgaag acatcctgat tgttgtctta tgtagagtcg acatcttgaa 4320
gttcagttgc tttgtgatca atatggcaac gtagcagcac ttcacagtcg agattgcagt 4380
gtacaacggc gacaccaaaa ggtctgctgt ctcagttaaa tcacccctct gaatgatcta 4440
cttcttgcct gctgcgttgg tcagaggaat aatggttgta ttctactgaa cagataatcg 4500
aggaaggacc agttactgtt gctcctcgtg agactgtgaa agagcttgag caggcagcac 4560
ggaggcttgc taaagctgtg ggttatgttg gtgctgctac tgttgaatac ctttacagca 4620
tggaaactgg tgaatattat tttctggaac ttaatccacg gctacaggtc ggctcctttg 4680
acattcttca ggaattaatt tctgttgacc acatgattta cattgtcaaa tggtctcaca 4740
ggttgagcat cctgtcactg agtggatagc tgaagtaaat ttgcctgcgg ctcaagttgc 4800
tgttggaatg ggtatacccc tttggcagat tccaggtaat gcttcttcat ttagttcctg 4860
ctctttgtta attgaatgag ctcttataca gaccatgaga cacattctac tgttaattca 4920
tagtatcccc tgacttgtta gtgttagaga tacagagatg tatcacaaat tcattgtatc 4980
tcctcaagga ctgtaaaaat cctataatta aatttctgaa aatttgttct tttaagcaga 5040
aaaaaaatct ctaaattatc tccctgtata cagagatcag gcgcttctac ggaatgaacc 5100
atggaggagg ctatgacctt tggaggaaaa cagcagctct agcgactcca tttaactttg 5160
atgaagtaga ttctaaatgg ccaaaaggcc actgcgtagc tgttagaata actagcgagg 5220
atccagatga tgggtttaag cctactggtg gaaaagtaaa ggtgcggttt cctgatgtta 5280
ggtgtatgaa ttgaacacat tgctatattg cagctagtga aatgactgga tcatggttct 5340
cttattttca ggagataagt ttcaagagta aaccaaatgt ttgggcctat ttctcagtaa 5400
aggtagtcct caatattgtt gcactgccac attatttgag ttgtcctaac aattgtgctg 5460
caattgttag ttttcaacta tttgttgttc tgtttggttg actggtaccc tctctttgca 5520
gtctggtgga ggcatccatg aattcgctga ttctcagttc ggtatgtaaa gttaaaagag 5580
taatattgtc tttgctattt atgtttgtcc tcacttttaa aagatattgc cttccattac 5640
aggacatgtt tttgcgtatg gaactactag atcggcagca ataactacca tggctcttgc 5700
actaaaagag gttcaaattc gtggagaaat tcattcaaac gtagactaca cagttgacct 5760
attaaatgta aggactaaat atctgcttat tgaaccttgc tttttggttc cctaatgcca 5820
ttttagtctg gctactgaag aacttatcca tcatgccatt tctgttatct taaattcagg 5880
cctcagattt tagagaaaat aagattcata ctggttggct ggataccagg atagccatgc 5940
gtgttcaagc tgagaggcct ccatggtata tttcagtcgt tggaggggct ttatatgtaa 6000
gacaaactat gccactcatt agcatttatg tgaagcaaat gcggaaaaca tgatcaatat 6060
gtcgtcttat ttaaatttat ttatttttgt gctgcagaaa acagtaactg ccaacacggc 6120
cactgtttct gattatgttg gttatcttac caagggccag attccaccaa aggtactatt 6180
ctgttttttc aggatatgaa tgctgtttga atgtgaaaac cattgaccat aaatccttgt 6240
ttgcagcata tatcccttgt ctatacgact gttgctttga atatagatgg gaaaaaatat 6300
acagtaagtg tgacattctt aatggggaaa cttaatttgt tgtaaataat caatatcata 6360
ttgactcgtg tatgctgcat catagatcga tactgtgagg agtggacatg gtagctacag 6420
attgcgaatg aatggatcaa cggttgacgc aaatgtacaa atattatgtg atggtgggct 6480
tttaatgcag gtaatatctt cttcctagtt aaagaagata tatcttgttc aaagaattct 6540
gattattgat cttttaatgt tttcagctgg atggaaacag ccatgtaatt tatgctgaag 6600
aagaggccag tggtacacga cttcttattg atggaaagac atgcatgtta caggtaatga 6660
tagccttgtt ctttttagtt ctagtcacgg tgtttgcttg ctatttgttg tatctattta 6720
atgcattcac taattactat attagtttgc atcatcaagt taaaatggaa cttctttctt 6780
gcagaatgac catgacccat caaagttatt agctgagaca ccatgcaaac ttcttcgttt 6840
cttggttgct gatggtgctc atgttgatgc tgatgtacca tatgcggaag ttgaggttat 6900
gaagatgtgc atgcccctct tatcacccgc ttctggtgtc atacatgttg taatgtctga 6960
gggccaagca atgcaggtac attcctacat tccattcatt gtgctgtgct gacatgaaca 7020
tttcaagtaa atacctgtaa cttgtttatt attctaggct ggtgatctta tagctaggct 7080
ggatcttgat gacccttctg ctgttaagag agctgagccg ttcgaagata cttttccaca 7140
aatgggtctc cctattgctg cttctggcca agttcacaaa ttatgtgctg caagtctgaa 7200
tgcttgtcga atgatccttg cggggtatga gcatgatatt gacaaggtaa acatcatgtc 7260
ctcttgtttt ttcttttgtt tatcatgcat tcttatgttc atcatgtcct ctggcaaatc 7320
tagattccgc tgtcgtttca cacagatttt tctcattctc ataatggtgc caaacataaa 7380
tatgctgcta tattcatcaa tgttttcact cgatttctaa ttttgctttt gagttttaaa 7440
ctttagtaca atccatatct aatctccttt ggcaacagtg aatccattat atatattttt 7500
attaaactgc tttctttttc aggttgtgcc agagttggta tactgcctag acactccgga 7560
gcttcctttc ctgcagtggg aggagcttat gtctgtttta gcaactagac ttccaagaaa 7620
tcttaaaagt gaggtatatt atggttgaca agatagctag tctcatgctc taaggacttg 7680
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ttttcatgct tagtttgtca atacttcaca tttatcactg acttgtcgag ctaaatgaga 7860
ttttatttga tttctgtgct ccattatttt tgtatatata tatatatatt taactatgac 7920
tatatgttat gcctcaaacg tttcaaactc tttcagttgg agggcaaata tgaggaatac 7980
aaagtaaaat ttgactctgg gataatcaat gatttccctg ccaatatgct acgagtgata 8040
attgaggtca gttattcaat ttgttgtgat aatcactgcc ttaactgttc gttcttttaa 8100
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aggcttgttg agcctcttat gagcctactg aagtcatatg agggtgggag agaaagtcat 8220
gctcactttg ttgtcaagtc cctttttgag gagtatctct atgttgaaga attgttcagt 8280
gatggaattc aggttaactt acctattcgc attaaacaaa tcatcagttg ttttatgata 8340
aagtcaaaat gtttatattt cccattcttc tgtggatcaa atatatcacg gacatgatat 8400
agtttcctta ggctatataa tggttcttca tcaaataata ttgcaggaaa cagtatagca 8460
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gacttcactg cgaatggtta ctgaactgtc ttcttgttct gacaatgtga cttttctttg 8700
tagagtgtta gaaataaaac taagctgata ctaaaactca tggagagtct ggtctatcca 8760
aatcctgctg cctacaggga tcaattgatt cgcttttctt cccttaatca caaagcgtat 8820
tacaaggtga ccaggataaa cataaataaa cgtgaatttt tcaatgacct tttcttctga 8880
catctgaatc tgatgaattt cttgcatatt aatacagttg gcacttaaag ctagtgaact 8940
tcttgaacaa acaaaactta gtgagctccg tgcaagaata gcaaggagcc tttcagagct 9000
ggagatgttt actgaggaaa gcaagggtct ctccatgcat aagcgagaaa ttgccattaa 9060
ggagagcatg gaagatttag tcactgctcc actgccagtt gaagatgcgc tcatttcttt 9120
atttgattgt agtgatacaa ctgttcaaca gagagtgatt gagacttata tagctcgatt 9180
ataccaggta tgagaagaaa gaccttttga aattatttat attaacatat cctagtaaaa 9240
cagcatgctc atcatttctt aaaaaaagtt tacagcacct gatgtttggt tactgaccgc 9300
atcattaaaa taaagttact tgttgtggag agatgtattt tggaacttgt ggcacatgca 9360
gtaacatgct actgctcgat atgtttgcta acttgacaac aatatttttc agcctcatct 9420
tgtaaaggac agtatcaaaa tgaaatggat agaatcgggt gttattgctt tatgggaatt 9480
tcctgaaggg cattttgatg caagaaatgg aggagcggtt cttggtgaca aaagatgggg 9540
tgccatggtc attgtcaagt ctcttgaatc actttcaatg gccattagat ttgcactaaa 9600
ggagacatca cactacacta gctctgaggg caatatgatg catattgctt tgttgggtgc 9660
tgataataag atgcatataa ttcaagaaag gtatgttcat atgctatgtt ggtgctgaaa 9720
tagttatata tgtagttagc tggtggagtt ctggtaatta acctatccca ttgttcagtg 9780
gtgatgatgc tgacagaata gccaaacttc ccttgatact aaaggataat gtaaccgatc 9840
tgcatgcctc tggtgtgaaa acaataagtt tcattgttca aagagatgaa gcacggatga 9900
caatgcgtcg taccttcctt tggtctgatg aaaagctttc ttatgaggaa gagccaattc 9960
tccggcatgt ggaacctcct ctttctgcac ttcttgagtt ggtacgtgat atcatcaaaa 10020
tgataatgtt ttggtatggc attgattatc ttctatgctc tttgtattta ttcagcctat 10080
tgtggataca ggacaagttg aaagtgaaag gatacaatga aatgaagtat accccatcac 10140
gggatcgtca atggcatatc tacacactta gaaatactga aaaccccaaa atgttgcacc 10200
gggtattttt ccgaaccctt gtcaggcaac ccagtgtatc caacaagttt tcttcgggcc 10260
agattggtga catggaagtt gggagtgctg aagaacctct gtcatttaca tcaaccagca 10320
tattaagatc tttgatgact gctatagagg aattggagct tcacgcaatt agaactggcc 10380
attcacacat gtatttgcat gtattgaaag aacaaaagct tcttgatctt gttccagttt 10440
cagggtaagt gcgcatattt ctttttggga acatatgctt gcttatgagg ttggtcttct 10500
caatgatctt cttatcttac tcaggaatac agttttggat gttggtcaag atgaagctac 10560
tgcatattca cttttaaaag aaatggctat gaagatacat gaacttgttg gtgcaagaat 10620
gcaccatctt tctgtatgcc aatgggaagt gaaacttaag ttggactgcg atggtcctgc 10680
cagtggtacc tggaggattg taacaaccaa tgttactagt cacacttgca ctgtggatgt 10740
aagtttaatc ctctagcatt ttgttttctt tggaaaagca tgtgatttta agccggctgg 10800
tcctcatacc cagacctagt gatctttata tagtgtagac atttttctaa ctgcttttaa 10860
ttgttttaga tctaccgtga gatggaagat aaagaatcac ggaagttagt ataccatccc 10920
gccactccgg cggctggtcc tctgcatggt gtggcactga ataatccata tcagcctttg 10980
agtgtcattg atctcaaacg ctgttctgct aggaataata gaactacata ctgctatgat 11040
tttccactgg tgagttgact gctcccttat attcaatgca ttaccatagc aaattcatat 11100
tcgttcatgt tgtcaaaata agccgatgaa aattcaaaac tgtaggcatt tgaaactgca 11160
gtgaggaagt catggtcctc tagtacctct ggtgcttcta aaggtgttga aaatgcccaa 11220
tgttatgtta aagctacaga gttggtattt gcggacaaac atgggtcatg gggcactcct 11280
ttagttcaaa tggaccggcc tgctgggctc aatgacattg gtatggtagc ttggaccttg 11340
aagatgtcca ctcctgaatt tcctagtggt agggagatta ttgttgttgc aaatgatatt 11400
acgttcagag ctggatcatt tggcccaagg gaagatgcat tttttgaagc tgttaccaac 11460
ctagcctgtg agaagaaact tcctcttatt tatttggcag caaattctgg tgctcgaatt 11520
ggcatagcag atgaagtgaa atcttgcttc cgtgttgggt ggtctgatga tggcagccct 11580
gaacgtgggt ttcagtacat ttatctaagc gaagaagact atgctcgtat tggcacttct 11640
gtcatagcac ataagatgca gctagacagt ggtgaaatta ggtgggttat tgattctgtt 11700
gtgggcaagg aagatggact tggtgtggag aatgtacatg gaagtgctgc tattgccagt 11760
gcttattcta gggcatataa ggagacattt acacttacat ttgtgactgg aagaactgtt 11820
ggaataggag cttatcttgc tcgacttggc atccggtgca tacagcgtct tgaccagcct 11880
attattctta caggctattc tgcactgaac aagcttcttg ggcgggaagt gtacagctcc 11940
cacatgcagt tgggtggtcc caaaatcatg gcaactaatg gtgttgtcca tcttactgtt 12000
tcagatgacc ttgaaggcgt ttctaatata ttgaggtggc tcagttatgt tcctgcctac 12060
attggtggac cacttccagt aacaacaccg ttggacccac cggacagacc tgttgcatac 12120
attcctgaga actcgtgtga tcctcgagcg gctatccgtg gtgttgatga cagccaaggg 12180
aaatggttag gtggtatgtt tgataaagac agctttgtgg aaacatttga aggttgggct 12240
aagacagtgg ttactggcag agcaaagctt ggtggaattc cagtgggtgt gatagctgtg 12300
gagactcaga ccatgatgca aactatccct gctgaccctg gtcagcttga ttcccgtgag 12360
caatctgttc ctcgtgctgg acaagtgtgg tttccagatt ctgcaaccaa gactgcgcag 12420
gcattgctgg acttcaaccg tgaaggatta cctctgttca tcctcgctaa ctggagaggc 12480
ttctctggtg gacaaagaga tctttttgaa ggaattcttc aggctggctc gactattgtt 12540
gagaacctta ggacatacaa tcagcctgcc tttgtctaca ttcccatggc tgcagagcta 12600
cgaggagggg cttgggttgt ggttgatagc aagataaacc cagaccgcat tgagtgctat 12660
gctgagagga ctgcaaaagg caatgttctg gaaccgcaag ggttaattga gatcaagttc 12720
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gcaaaactcg aagtagcaaa taaaaatgga agtgctgaca caaaatcgct tcaagaaaat 12840
atagaagctc gaacaaaaca gttgatgcct ctatatactc agattgcgat acggtttgct 12900
gaattgcatg atacatccct cagaatggct gcgaaaggtg tgattaagaa agttgtggac 12960
tgggaagaat cacgatcttt cttctataag agattacgga ggaggatctc tgaggatgtt 13020
cttgcaaaag aaattagagc tgtagcaggt gagcagtttt cccaccaacc agcaatcgag 13080
ctgatcaaga aatggtattc agcttcacat gcagctgaat gggatgatga cgatgctttt 13140
gttgcttgga tggataaccc tgaaaactac aaggattata ttcaatatct taaggctcaa 13200
agagtatccc aatccctctc aagtctttca gattccagct cagatttgca agccctgcca 13260
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ctctagaaga gctcaacttg ttgaagaaat caggaaggtc cttggttgaa tcatatgatg 13500
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ttttgtaggc ataaatgcgt ctgtatgtga aataaattgt ctgttgagtt aacacacaag 13860
atgacaatat gtttgtgctc tactgctatt gtccatgaat actgattgcg gaatcaacca 13920
catgcattat a 13931
<210> 6
<211> 13931
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 6
atgccgatgc ggccgtggga atttattatt ttaggccgca cagcccccat ctctccccca 60
cccctcggga tatccgcctt ctcccgcccg ctccgcctcc gcctccgcct ccgcctcgcc 120
gccgttgtcg acgccgcaag gatccaaacg ccgccccgcg tcgccttctc cgccttcttc 180
ttcttcttct tcttcttctc cgagggtctc tctcgggaag gtacagctgc ccgcctccct 240
gctcttattt atcgcgtgcc gttcattccg tgccttctcc agctccagat ccgcgcgccg 300
cacgccgatc cgcgcccggc cggtgagtcc gccgcgggtt tccgccattg ctgccgtttc 360
tgcgctgcta gggggaggtt tagatgtggg tggtgggagc cgcgtgctgt tgtctgggat 420
gggagagaga gggtttaagg gtgggtgccg gatgcggatg ctcccgcccg ggttttggtc 480
ctgcttgtgg actggcgagg ggctaggggt tgagttgtag ggattcggga tggaaatgga 540
ctggggagct cggatgggga ggtaatgcca cgccggtgaa atgcagctcg ctgttgttgg 600
ttctggttaa tgcctgggtg ttgctggcta tgttactatg ttgcatgcct acgcgagata 660
ctgccatgtg ccattttgcg tgattgtgat attggtttga ggttttagct gcgctcatca 720
tttcctcgcg ttggctcagg gtttaagctc ctctttgtta agtgggacgg tatgcatatg 780
cattgtgttc ttttaggttt aaattctggt tacggtgcca cacaacaagt cgtagatgct 840
cattcttgtt cttttcatgg ggcttatgga attgatggca catggcacac ctttctcctt 900
tttccgtcat gcatgttagt gccatattgt ctacgcaaaa aagaatattc tgcatatttg 960
tttactcact atttttttcc aagagaattg ggttttgcca tgcttcaaaa ggaacatttc 1020
aagctgaaaa agttctcccg atatggaatt agctttagag ttcaggggaa aaaatatgtt 1080
gttgctttgt gcttgtcaag taaccacagt tgcacaggtt ttgactgacc tcatgctact 1140
tgacattatt caccatgata aagttttacc ttttgttttt ttcctttcac taggaacaga 1200
acgaattgtt tgcataacca atttgtagat ttgacatggg gaaatagcat aactgaatat 1260
atctcaacct attactaggc aaaataagaa atgaacctaa gccttaacag gtttgcatca 1320
aattatcctg tgcaaaatga acaaaggtgg cacacaatgt acaagcttgc atttcatttt 1380
tggatcctca aacgtcttaa agacttttgc ataaagtatt tgatgagtaa cgagctggaa 1440
ctaatcattc ttatatattt tcatctgtca gatttcacac atctggggat ttatcttctc 1500
tttgtatggc actacacatt tgagaaaccg tgcaattcta ctgtttggtc agcaggacaa 1560
caatgacatc cacacatgtg gcgacattgg gagttggtgc ccaggcacct cctcgtcacc 1620
agaaaaagtc agctggcact gcatttgtat catctgggtc atcaagaccc tcataccgaa 1680
agaatggtca gcgtactcgg tcacttaggg aagaaagcaa tggaggagtg tctgattcca 1740
aaaagcttaa ccactctatt cgccaaggtg accactagct actttacata tgctataatt 1800
tgtgccaaac ataaacatgc aatggctgct attatttaaa cgttaatgtt gaaatagctg 1860
ctataggata cagcaaaaat atataattga ctgggcaaga tgcaacaatt gtttttcact 1920
aaagttagtt atcttttgct gtaaaagaca actgtttttt acataaaatg gtattaataa 1980
ccttgtaata ttcaatgcaa catgttctca agtaaaaaaa aacattgcct ggttgtataa 2040
gcaaatgtgt cgttgtagac atcttattaa acctttttgt gatatctatt accgtaggga 2100
acaggggagc tgtttaaatc tgttatcata gagtaatatg agaaaagtgg attgtgcgac 2160
tttggcatgt atacctgctc aatttcaaat atatgtctat gtgcaggtct tgctggcatc 2220
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ttataataat tattatataa ttttctgaca tgttttgaga acctcaaaac atgtgattgc 2340
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ggatcacatg tgagccttgt cttctctttt ttagcttatc atcttatctt ttcggtgatg 3660
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tatttatcat gaggctagct gctcaggtgg ggccttttat ggaagttaca ccttttccct 4080
taatgttgag ttattccgga gttattatgg ttatgttctg tatgtttgat ctgtaaatta 4140
ttgaaattca cctccattgg ttctccagat tagcagacct acaattctac atatggttta 4200
tactttataa atactaggat ttagggatct tcatatagtt tatacatggt atttagattt 4260
catttgtaac cctattgaag acatcctgat tgttgtctta tgtagagtcg acatcttgaa 4320
gttcagttgc tttgtgatca atatggcaac gtagcagcac ttcacagtcg agattgcagt 4380
gtacaacggc gacaccaaaa ggtctgctgt ctcagttaaa tcacccctct gaatgatcta 4440
cttcttgcct gctgcgttgg tcagaggaat aatggttgta ttctactgaa cagataatcg 4500
aggaaggacc agttactgtt gctcctcgtg agactgtgaa agagcttgag caggcagcac 4560
ggaggcttgc taaagctgtg ggttatgttg gtgctgctac tgttgaatac ctttacagca 4620
tggaaactgg tgaatattat tttctggaac ttaatccacg gctacaggtc ggctcctttg 4680
acattcttca ggaattaatt tctgttgacc acatgattta cattgtcaaa tggtctcaca 4740
ggttgagcat cctgtcactg agtggatagc tgaagtaaat ttgcctgcgg ctcaagttgc 4800
tgttggaatg ggtatacccc tttggcagat tccaggtaat gcttcttcat ttagttcctg 4860
ctctttgtta attgaatgag ctcttataca gaccatgaga cacattctac tgttaattca 4920
tagtatcccc tgacttgtta gtgttagaga tacagagatg tatcacaaat tcattgtatc 4980
tcctcaagga ctgtaaaaat cctataatta aatttctgaa aatttgttct tttaagcaga 5040
aaaaaaatct ctaaattatc tccctgtata cagagatcag gcgcttctac ggaatgaacc 5100
atggaggagg ctatgacctt tggaggaaaa cagcagctct agcgactcca tttaactttg 5160
atgaagtaga ttctaaatgg ccaaaaggcc actgcgtagc tgttagaata actagcgagg 5220
atccagatga tgggtttaag cctactggtg gaaaagtaaa ggtgcggttt cctgatgtta 5280
ggtgtatgaa ttgaacacat tgctatattg cagctagtga aatgactgga tcatggttct 5340
cttattttca ggagataagt ttcaagagta aaccaaatgt ttgggcctat ttctcagtaa 5400
aggtagtcct caatattgtt gcactgccac attatttgag ttgtcctaac aattgtgctg 5460
caattgttag ttttcaacta tttgttgttc tgtttggttg actggtaccc tctctttgca 5520
gtctggtgga ggcatccatg aattcgctga ttctcagttc ggtatgtaaa gttaaaagag 5580
taatattgtc tttgctattt atgtttgtcc tcacttttaa aagatattgc cttccattac 5640
aggacatgtt tttgcgtatg gaactactag atcggcagca ataactacca tggctcttgc 5700
actaaaagag gttcaaattc gtggagaaat tcattcaaac gtagactaca cagttgacct 5760
attaaatgta aggactaaat atctgcttat tgaaccttgc tttttggttc cctaatgcca 5820
ttttagtctg gctactgaag aacttatcca tcatgccatt tctgttatct taaattcagg 5880
cctcagattt tagagaaaat aagattcata ctggttggct ggataccagg atagccatgc 5940
gtgttcaagc tgagaggcct ccatggtata tttcagtcgt tggaggggct ttatatgtaa 6000
gacaaactat gccactcatt agcatttatg tgaagcaaat gcggaaaaca tgatcaatat 6060
gtcgtcttat ttaaatttat ttatttttgt gctgcagaaa acagtaactg ccaacacggc 6120
cactgtttct gattatgttg gttatcttac caagggccag attccaccaa aggtactatt 6180
ctgttttttc aggatatgaa tgctgtttga atgtgaaaac cattgaccat aaatccttgt 6240
ttgcagcata tatcccttgt ctatacgact gttgctttga atatagatgg gaaaaaatat 6300
acagtaagtg tgacattctt aatggggaaa cttaatttgt tgtaaataat caatatcata 6360
ttgactcgtg tatgctgcat catagatcga tactgtgagg agtggacatg gtagctacag 6420
attgcgaatg aatggatcaa cggttgacgc aaatgtacaa atattatgtg atggtgggct 6480
tttaatgcag gtaatatctt cttcctagtt aaagaagata tatcttgttc aaagaattct 6540
gattattgat cttttaatgt tttcagctgg atggaaacag ccatgtaatt tatgctgaag 6600
aagaggccag tggtacacga cttcttattg atggaaagac atgcatgtta caggtaatga 6660
tagccttgtt ctttttagtt ctagtcacgg tgtttgcttg ctatttgttg tatctattta 6720
atgcattcac taattactat attagtttgc atcatcaagt taaaatggaa cttctttctt 6780
gcagaatgac catgacccat caaagttatt agctgagaca ccatgcaaac ttcttcgttt 6840
cttggttgct gatggtgctc atgttgatgc tgatgtacca tatgcggaag ttgaggttat 6900
gaagatgtgc atgcccctct tatcacccgc ttctggtgtc atacatgttg taatgtctga 6960
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tttcaagtaa atacctgtaa cttgtttatt attctaggct ggtgatctta tagctaggct 7080
ggatcttgat gacccttctg ctgttaagag agctgagccg ttcgaagata cttttccaca 7140
aatgggtctc cctattgctg cttctggcca agttcacaaa ttatgtgctg caagtctgaa 7200
tgcttgtcga atgatccttg cggggtatga gcatgatatt gacaaggtaa acatcatgtc 7260
ctcttgtttt ttcttttgtt tatcatgcat tcttatgttc atcatgtcct ctggcaaatc 7320
tagattccgc tgtcgtttca cacagatttt tctcattctc ataatggtgc caaacataaa 7380
tatgctgcta tattcatcaa tgttttcact cgatttctaa ttttgctttt gagttttaaa 7440
ctttagtaca atccatatct aatctccttt ggcaacagtg aatccattat atatattttt 7500
attaaactgc tttctttttc aggttgtgcc agagttggta tactgcctag acactccgga 7560
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tcttaaaagt gaggtatatt atggttgaca agatagctag tctcatgctc taaggacttg 7680
tacatttcgc cacataggtt aattttccat atcaagttct aatgtacgat ataaaagtag 7740
tactggccta aaacagtatt ggtggttgac tatctttgtt gtgtaagatc aagtatttct 7800
ttttcatgct tagtttgtca atacttcaca tttatcactg acttgtcgag ctaaatgaga 7860
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tatatgttat gcctcaaacg tttcaaactc tttcagttgg agggcaaata tgaggaatac 7980
aaagtaaaat ttgactctgg gataatcaat gatttccctg ccaatatgct acgagtgata 8040
attgaggtca gttattcaat ttgttgtgat aatcactgcc ttaactgttc gttcttttaa 8100
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gatggaattc aggttaactt acctattcgc attaaacaaa tcatcagttg ttttatgata 8340
aagtcaaaat gtttatattt cccattcttc tgtggatcaa atatatcacg gacatgatat 8400
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gacttcactg cgaatggtta ctgaactgtc ttcttgttct gacaatgtga cttttctttg 8700
tagagtgtta gaaataaaac taagctgata ctaaaactca tggagagtct ggtctatcca 8760
aatcctgctg cctacaggga tcaattgatt cgcttttctt cccttaatca caaagcgtat 8820
tacaaggtga ccaggataaa cataaataaa cgtgaatttt tcaatgacct tttcttctga 8880
catctgaatc tgatgaattt cttgcatatt aatacagttg gcacttaaag ctagtgaact 8940
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ggagatgttt actgaggaaa gcaagggtct ctccatgcat aagcgagaaa ttgccattaa 9060
ggagagcatg gaagatttag tcactgctcc actgccagtt gaagatgcgc tcatttcttt 9120
atttgattgt agtgatacaa ctgttcaaca gagagtgatt gagacttata tagctcgatt 9180
ataccaggta tgagaagaaa gaccttttga aattatttat attaacatat cctagtaaaa 9240
cagcatgctc atcatttctt aaaaaaagtt tacagcacct gatgtttggt tactgaccgc 9300
atcattaaaa taaagttact tgttgtggag agatgtattt tggaacttgt ggcacatgca 9360
gtaacatgct actgctcgat atgtttgcta acttgacaac aatatttttc agcctcatct 9420
tgtaaaggac agtatcaaaa tgaaatggat agaatcgggt gttattgctt tatgggaatt 9480
tcctgaaggg cattttgatg caagaaatgg aggagcggtt cttggtgaca aaagatgggg 9540
tgccatggtc attgtcaagt ctcttgaatc actttcaatg gccattagat ttgcactaaa 9600
ggagacatca cactacacta gctctgaggg caatatgatg catattgctt tgttgggtgc 9660
tgataataag atgcatataa ttcaagaaag gtatgttcat atgctatgtt ggtgctgaaa 9720
tagttatata tgtagttagc tggtggagtt ctggtaatta acctatccca ttgttcagtg 9780
gtgatgatgc tgacagaata gccaaacttc ccttgatact aaaggataat gtaaccgatc 9840
tgcatgcctc tggtgtgaaa acaataagtt tcattgttca aagagatgaa gcacggatga 9900
caatgcgtcg taccttcctt tggtctgatg aaaagctttc ttatgaggaa gagccaattc 9960
tccggcatgt ggaacctcct ctttctgcac ttcttgagtt ggtacgtgat atcatcaaaa 10020
tgataatgtt ttggtatggc attgattatc ttctatgctc tttgtattta ttcagcctat 10080
tgtggataca ggacaagttg aaagtgaaag gatacaatga aatgaagtat accccatcac 10140
gggatcgtca atggcatatc tacacactta gaaatactga aaaccccaaa atgttgcacc 10200
gggtattttt ccgaaccctt gtcaggcaac ccagtgtatc caacaagttt tcttcgggcc 10260
agattggtga catggaagtt gggagtgctg aagaacctct gtcatttaca tcaaccagca 10320
tattaagatc tttgatgact gctatagagg aattggagct tcacgcaatt agaactggcc 10380
attcacacat gtatttgcat gtattgaaag aacaaaagct tcttgatctt gttccagttt 10440
cagggtaagt gcgcatattt ctttttggga acatatgctt gcttatgagg ttggtcttct 10500
caatgatctt cttatcttac tcaggaatac agttttggat gttggtcaag atgaagctac 10560
tgcatattca cttttaaaag aaatggctat gaagatacat gaacttgttg gtgcaagaat 10620
gcaccatctt tctgtatgcc aatgggaagt gaaacttaag ttggactgcg atggtcctgc 10680
cagtggtacc tggaggattg taacaaccaa tgttactagt cacacttgca ctgtggatgt 10740
aagtttaatc ctctagcatt ttgttttctt tggaaaagca tgtgatttta agccggctgg 10800
tcctcatacc cagacctagt gatctttata tagtgtagac atttttctaa ctgcttttaa 10860
ttgttttaga tctaccgtga gatggaagat aaagaatcac ggaagttagt ataccatccc 10920
gccactccgg cggctggtcc tctgcatggt gtggcactga ataatccata tcagcctttg 10980
agtgtcattg atctcaaacg ctgttctgct aggaataata gaactacata ctgctatgat 11040
tttccactgg tgagttgact gctcccttat attcaatgca ttaccatagc aaattcatat 11100
tcgttcatgt tgtcaaaata agccgatgaa aattcaaaac tgtaggcatt tgaaactgca 11160
gtgaggaagt catggtcctc tagtacctct ggtgcttcta aaggtgttga aaatgcccaa 11220
tgttatgtta aagctacaga gttggtattt gcggacaaac atgggtcatg gggcactcct 11280
ttagttcaaa tggaccggcc tgctgggctc aatgacattg gtatggtagc ttggaccttg 11340
aagatgtcca ctcctgaatt tcctagtggt agggagatta ttgttgttgc aaatgatatt 11400
acgttcagag ctggatcatt tggcccaagg gaagatgcat tttttgaagc tgttaccaac 11460
ctagcctgtg agaagaaact tcctcttatt tatttggcag caaattctgg tgctcgaatt 11520
ggcatagcag atgaagtgaa atcttgcttc cgtgttgggt ggtctgatga tggcagccct 11580
gaacgtgggt ttcagtacat ttatctaagc gaagaagact atgctcgtat tggcacttct 11640
gtcatagcac ataagatgca gctagacagt ggtgaaatta ggtgggttat tgattctgtt 11700
gtgggcaagg aagatggact tggtgtggag aatatacatg gaagtgctgc tattgccagt 11760
gcttattcta gggcatataa ggagacattt acacttacat ttgtgactgg aagaactgtt 11820
ggaataggag cttatcttgc tcgacttggc atccggtgca tacagcgtct tgaccagcct 11880
attattctta caggctattc tgcactgaac aagcttcttg ggcgggaagt gtacagctcc 11940
cacatgcagt tgggtggtcc caaaatcatg gcaactaatg gtgttgtcca tcttactgtt 12000
tcagatgacc ttgaaggcgt ttctaatata ttgaggtggc tcagttatgt tcctgcctac 12060
attggtggac cacttccagt aacaacaccg ttggacccac cggacagacc tgttgcatac 12120
attcctgaga actcgtgtga tcctcgagcg gctatccgtg gtgttgatga cagccaaggg 12180
aaatggttag gtggtatgtt tgataaagac agctttgtgg aaacatttga aggttgggct 12240
aagacagtgg ttactggcag agcaaagctt ggtggaattc cagtgggtgt gatagctgtg 12300
gagactcaga ccatgatgca aactatccct gctgaccctg gtcagcttga ttcccgtgag 12360
caatctgttc ctcgtgctgg acaagtgtgg tttccagatt ctgcaaccaa gactgcgcag 12420
gcattgctgg acttcaaccg tgaaggatta cctctgttca tcctcgctaa ctggagaggc 12480
ttctctggtg gacaaagaga tctttttgaa ggaattcttc aggctggctc gactattgtt 12540
gagaacctta ggacatacaa tcagcctgcc tttgtctaca ttcccatggc tgcagagcta 12600
cgaggagggg cttgggttgt ggttgatagc aagataaacc cagaccgcat tgagcgctat 12660
gctgagagga ctgcaaaagg caatgttctg gaaccgcaag ggttaattga gatcaagttc 12720
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gcaaaactcg aagtagcaaa taaaaatgga agtgctgaca caaaatcgct tcaagaaaat 12840
atagaagctc gaacaaaaca gttgatgcct ctatatactc agattgcgat acggtttgct 12900
gaattgcatg atacatccct cagaatggct gcgaaaggtg tgattaagaa agttgtggac 12960
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ctgatcaaga aatggtattc agcttcacat gcagctgaat gggatgatga cgatgctttt 13140
gttgcttgga tggataaccc tgaaaactac aaggattata ttcaatatct taaggctcaa 13200
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ctctagaaga gctcaacttg ttgaagaaat caggaaggtc cttggttgaa tcatatgatg 13500
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gttgtttcgc gctagttccg tgatctacta tcatctgtta gacgctgtaa ttagtgagtc 13740
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ttttgtaggc ataaatgcgt ctgtatgtga aataaattgt ctgttgagtt aacacacaag 13860
atgacaatat gtttgtgctc tactgctatt gtccatgaat actgattgcg gaatcaacca 13920
catgcattat a 13931
<210> 7
<211> 13931
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 7
atgccgatgc ggccgtggga atttattatt ttaggccgca cagcccccat ctctccccca 60
cccctcggga tatccgcctt ctcccgcccg ctccgcctcc gcctccgcct ccgcctcgcc 120
gccgttgtcg acgccgcaag gatccaaacg ccgccccgcg tcgccttctc cgccttcttc 180
ttcttcttct tcttcttctc cgagggtctc tctcgggaag gtacagctgc ccgcctccct 240
gctcttattt atcgcgtgcc gttcattccg tgccttctcc agctccagat ccgcgcgccg 300
cacgccgatc cgcgcccggc cggtgagtcc gccgcgggtt tccgccattg ctgccgtttc 360
tgcgctgcta gggggaggtt tagatgtggg tggtgggagc cgcgtgctgt tgtctgggat 420
gggagagaga gggtttaagg gtgggtgccg gatgcggatg ctcccgcccg ggttttggtc 480
ctgcttgtgg actggcgagg ggctaggggt tgagttgtag ggattcggga tggaaatgga 540
ctggggagct cggatgggga ggtaatgcca cgccggtgaa atgcagctcg ctgttgttgg 600
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ctgccatgtg ccattttgcg tgattgtgat attggtttga ggttttagct gcgctcatca 720
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cattgtgttc ttttaggttt aaattctggt tacggtgcca cacaacaagt cgtagatgct 840
cattcttgtt cttttcatgg ggcttatgga attgatggca catggcacac ctttctcctt 900
tttccgtcat gcatgttagt gccatattgt ctacgcaaaa aagaatattc tgcatatttg 960
tttactcact atttttttcc aagagaattg ggttttgcca tgcttcaaaa ggaacatttc 1020
aagctgaaaa agttctcccg atatggaatt agctttagag ttcaggggaa aaaatatgtt 1080
gttgctttgt gcttgtcaag taaccacagt tgcacaggtt ttgactgacc tcatgctact 1140
tgacattatt caccatgata aagttttacc ttttgttttt ttcctttcac taggaacaga 1200
acgaattgtt tgcataacca atttgtagat ttgacatggg gaaatagcat aactgaatat 1260
atctcaacct attactaggc aaaataagaa atgaacctaa gccttaacag gtttgcatca 1320
aattatcctg tgcaaaatga acaaaggtgg cacacaatgt acaagcttgc atttcatttt 1380
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ctaatcattc ttatatattt tcatctgtca gatttcacac atctggggat ttatcttctc 1500
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caatgacatc cacacatgtg gcgacattgg gagttggtgc ccaggcacct cctcgtcacc 1620
agaaaaagtc agctggcact gcatttgtat catctgggtc atcaagaccc tcataccgaa 1680
agaatggtca gcgtactcgg tcacttaggg aagaaagcaa tggaggagtg tctgattcca 1740
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tgtgccaaac ataaacatgc aatggctgct attatttaaa cgttaatgtt gaaatagctg 1860
ctataggata cagcaaaaat atataattga ctgggcaaga tgcaacaatt gtttttcact 1920
aaagttagtt atcttttgct gtaaaagaca actgtttttt acataaaatg gtattaataa 1980
ccttgtaata ttcaatgcaa catgttctca agtaaaaaaa aacattgcct ggttgtataa 2040
gcaaatgtgt cgttgtagac atcttattaa acctttttgt gatatctatt accgtaggga 2100
acaggggagc tgtttaaatc tgttatcata gagtaatatg agaaaagtgg attgtgcgac 2160
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ggatcacatg tgagccttgt cttctctttt ttagcttatc atcttatctt ttcggtgatg 3660
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tactttataa atactaggat ttagggatct tcatatagtt tatacatggt atttagattt 4260
catttgtaac cctattgaag acatcctgat tgttgtctta tgtagagtcg acatcttgaa 4320
gttcagttgc tttgtgatca atatggcaac gtagcagcac ttcacagtcg agattgcagt 4380
gtacaacggc gacaccaaaa ggtctgctgt ctcagttaaa tcacccctct gaatgatcta 4440
cttcttgcct gctgcgttgg tcagaggaat aatggttgta ttctactgaa cagataatcg 4500
aggaaggacc agttactgtt gctcctcgtg agactgtgaa agagcttgag caggcagcac 4560
ggaggcttgc taaagctgtg ggttatgttg gtgctgctac tgttgaatac ctttacagca 4620
tggaaactgg tgaatattat tttctggaac ttaatccacg gctacaggtc ggctcctttg 4680
acattcttca ggaattaatt tctgttgacc acatgattta cattgtcaaa tggtctcaca 4740
ggttgagcat cctgtcactg agtggatagc tgaagtaaat ttgcctgcgg ctcaagttgc 4800
tgttggaatg ggtatacccc tttggcagat tccaggtaat gcttcttcat ttagttcctg 4860
ctctttgtta attgaatgag ctcttataca gaccatgaga cacattctac tgttaattca 4920
tagtatcccc tgacttgtta gtgttagaga tacagagatg tatcacaaat tcattgtatc 4980
tcctcaagga ctgtaaaaat cctataatta aatttctgaa aatttgttct tttaagcaga 5040
aaaaaaatct ctaaattatc tccctgtata cagagatcag gcgcttctac ggaatgaacc 5100
atggaggagg ctatgacctt tggaggaaaa cagcagctct agcgactcca tttaactttg 5160
atgaagtaga ttctaaatgg ccaaaaggcc actgcgtagc tgttagaata actagcgagg 5220
atccagatga tgggtttaag cctactggtg gaaaagtaaa ggtgcggttt cctgatgtta 5280
ggtgtatgaa ttgaacacat tgctatattg cagctagtga aatgactgga tcatggttct 5340
cttattttca ggagataagt ttcaagagta aaccaaatgt ttgggcctat ttctcagtaa 5400
aggtagtcct caatattgtt gcactgccac attatttgag ttgtcctaac aattgtgctg 5460
caattgttag ttttcaacta tttgttgttc tgtttggttg actggtaccc tctctttgca 5520
gtctggtgga ggcatccatg aattcgctga ttctcagttc ggtatgtaaa gttaaaagag 5580
taatattgtc tttgctattt atgtttgtcc tcacttttaa aagatattgc cttccattac 5640
aggacatgtt tttgcgtatg gaactactag atcggcagca ataactacca tggctcttgc 5700
actaaaagag gttcaaattc gtggagaaat tcattcaaac gtagactaca cagttgacct 5760
attaaatgta aggactaaat atctgcttat tgaaccttgc tttttggttc cctaatgcca 5820
ttttagtctg gctactgaag aacttatcca tcatgccatt tctgttatct taaattcagg 5880
cctcagattt tagagaaaat aagattcata ctggttggct ggataccagg atagccatgc 5940
gtgttcaagc tgagaggcct ccatggtata tttcagtcgt tggaggggct ttatatgtaa 6000
gacaaactat gccactcatt agcatttatg tgaagcaaat gcggaaaaca tgatcaatat 6060
gtcgtcttat ttaaatttat ttatttttgt gctgcagaaa acagtaactg ccaacacggc 6120
cactgtttct gattatgttg gttatcttac caagggccag attccaccaa aggtactatt 6180
ctgttttttc aggatatgaa tgctgtttga atgtgaaaac cattgaccat aaatccttgt 6240
ttgcagcata tatcccttgt ctatacgact gttgctttga atatagatgg gaaaaaatat 6300
acagtaagtg tgacattctt aatggggaaa cttaatttgt tgtaaataat caatatcata 6360
ttgactcgtg tatgctgcat catagatcga tactgtgagg agtggacatg gtagctacag 6420
attgcgaatg aatggatcaa cggttgacgc aaatgtacaa atattatgtg atggtgggct 6480
tttaatgcag gtaatatctt cttcctagtt aaagaagata tatcttgttc aaagaattct 6540
gattattgat cttttaatgt tttcagctgg atggaaacag ccatgtaatt tatgctgaag 6600
aagaggccag tggtacacga cttcttattg atggaaagac atgcatgtta caggtaatga 6660
tagccttgtt ctttttagtt ctagtcacgg tgtttgcttg ctatttgttg tatctattta 6720
atgcattcac taattactat attagtttgc atcatcaagt taaaatggaa cttctttctt 6780
gcagaatgac catgacccat caaagttatt agctgagaca ccatgcaaac ttcttcgttt 6840
cttggttgct gatggtgctc atgttgatgc tgatgtacca tatgcggaag ttgaggttat 6900
gaagatgtgc atgcccctct tatcacccgc ttctggtgtc atacatgttg taatgtctga 6960
gggccaagca atgcaggtac attcctacat tccattcatt gtgctgtgct gacatgaaca 7020
tttcaagtaa atacctgtaa cttgtttatt attctaggct ggtgatctta tagctaggct 7080
ggatcttgat gacccttctg ctgttaagag agctgagccg ttcgaagata cttttccaca 7140
aatgggtctc cctattgctg cttctggcca agttcacaaa ttatgtgctg caagtctgaa 7200
tgcttgtcga atgatccttg cggggtatga gcatgatatt gacaaggtaa acatcatgtc 7260
ctcttgtttt ttcttttgtt tatcatgcat tcttatgttc atcatgtcct ctggcaaatc 7320
tagattccgc tgtcgtttca cacagatttt tctcattctc ataatggtgc caaacataaa 7380
tatgctgcta tattcatcaa tgttttcact cgatttctaa ttttgctttt gagttttaaa 7440
ctttagtaca atccatatct aatctccttt ggcaacagtg aatccattat atatattttt 7500
attaaactgc tttctttttc aggttgtgcc agagttggta tactgcctag acactccgga 7560
gcttcctttc ctgcagtggg aggagcttat gtctgtttta gcaactagac ttccaagaaa 7620
tcttaaaagt gaggtatatt atggttgaca agatagctag tctcatgctc taaggacttg 7680
tacatttcgc cacataggtt aattttccat atcaagttct aatgtacgat ataaaagtag 7740
tactggccta aaacagtatt ggtggttgac tatctttgtt gtgtaagatc aagtatttct 7800
ttttcatgct tagtttgtca atacttcaca tttatcactg acttgtcgag ctaaatgaga 7860
ttttatttga tttctgtgct ccattatttt tgtatatata tatatatatt taactatgac 7920
tatatgttat gcctcaaacg tttcaaactc tttcagttgg agggcaaata tgaggaatac 7980
aaagtaaaat ttgactctgg gataatcaat gatttccctg ccaatatgct acgagtgata 8040
attgaggtca gttattcaat ttgttgtgat aatcactgcc ttaactgttc gttcttttaa 8100
caagcggttt tataggaaaa tcttgcatgt ggttctgaga aggagaaggc tacaaatgag 8160
aggcttgttg agcctcttat gagcctactg aagtcatatg agggtgggag agaaagtcat 8220
gctcactttg ttgtcaagtc cctttttgag gagtatctct atgttgaaga attgttcagt 8280
gatggaattc aggttaactt acctattcgc attaaacaaa tcatcagttg ttttatgata 8340
aagtcaaaat gtttatattt cccattcttc tgtggatcaa atatatcacg gacatgatat 8400
agtttcctta ggctatataa tggttcttca tcaaataata ttgcaggaaa cagtatagca 8460
aactatttgt atatactcga gatggaaatt gttagaaaca tcattgacta aatctgtcct 8520
ttgttacgct gtttttgtag tctgatgtga ttgagcgtct gcgccttcaa catagtaaag 8580
acctacagaa ggtcgtagac attgtgttgt cccaccaggt aaatttcttc atggtctgat 8640
gacttcactg cgaatggtta ctgaactgtc ttcttgttct gacaatgtga cttttctttg 8700
tagagtgtta gaaataaaac taagctgata ctaaaactca tggagagtct ggtctatcca 8760
aatcctgctg cctacaggga tcaattgatt cgcttttctt cccttaatca caaagcgtat 8820
tacaaggtga ccaggataaa cataaataaa cgtgaatttt tcaatgacct tttcttctga 8880
catctgaatc tgatgaattt cttgcatatt aatacagttg gcacttaaag ctagtgaact 8940
tcttgaacaa acaaaactta gtgagctccg tgcaagaata gcaaggagcc tttcagagct 9000
ggagatgttt actgaggaaa gcaagggtct ctccatgcat aagcgagaaa ttgccattaa 9060
ggagagcatg gaagatttag tcactgctcc actgccagtt gaagatgcgc tcatttcttt 9120
atttgattgt agtgatacaa ctgttcaaca gagagtgatt gagacttata tagctcgatt 9180
ataccaggta tgagaagaaa gaccttttga aattatttat attaacatat cctagtaaaa 9240
cagcatgctc atcatttctt aaaaaaagtt tacagcacct gatgtttggt tactgaccgc 9300
atcattaaaa taaagttact tgttgtggag agatgtattt tggaacttgt ggcacatgca 9360
gtaacatgct actgctcgat atgtttgcta acttgacaac aatatttttc agcctcatct 9420
tgtaaaggac agtatcaaaa tgaaatggat agaatcgggt gttattgctt tatgggaatt 9480
tcctgaaggg cattttgatg caagaaatgg aggagcggtt cttggtgaca aaagatgggg 9540
tgccatggtc attgtcaagt ctcttgaatc actttcaatg gccattagat ttgcactaaa 9600
ggagacatca cactacacta gctctgaggg caatatgatg catattgctt tgttgggtgc 9660
tgataataag atgcatataa ttcaagaaag gtatgttcat atgctatgtt ggtgctgaaa 9720
tagttatata tgtagttagc tggtggagtt ctggtaatta acctatccca ttgttcagtg 9780
gtgatgatgc tgacagaata gccaaacttc ccttgatact aaaggataat gtaaccgatc 9840
tgcatgcctc tggtgtgaaa acaataagtt tcattgttca aagagatgaa gcacggatga 9900
caatgcgtcg taccttcctt tggtctgatg aaaagctttc ttatgaggaa gagccaattc 9960
tccggcatgt ggaacctcct ctttctgcac ttcttgagtt ggtacgtgat atcatcaaaa 10020
tgataatgtt ttggtatggc attgattatc ttctatgctc tttgtattta ttcagcctat 10080
tgtggataca ggacaagttg aaagtgaaag gatacaatga aatgaagtat accccatcac 10140
gggatcgtca atggcatatc tacacactta gaaatactga aaaccccaaa atgttgcacc 10200
gggtattttt ccgaaccctt gtcaggcaac ccagtgtatc caacaagttt tcttcgggcc 10260
agattggtga catggaagtt gggagtgctg aagaacctct gtcatttaca tcaaccagca 10320
tattaagatc tttgatgact gctatagagg aattggagct tcacgcaatt agaactggcc 10380
attcacacat gtatttgcat gtattgaaag aacaaaagct tcttgatctt gttccagttt 10440
cagggtaagt gcgcatattt ctttttggga acatatgctt gcttatgagg ttggtcttct 10500
caatgatctt cttatcttac tcaggaatac agttttggat gttggtcaag atgaagctac 10560
tgcatattca cttttaaaag aaatggctat gaagatacat gaacttgttg gtgcaagaat 10620
gcaccatctt tctgtatgcc aatgggaagt gaaacttaag ttggactgcg atggtcctgc 10680
cagtggtacc tggaggattg taacaaccaa tgttactagt cacacttgca ctgtggatgt 10740
aagtttaatc ctctagcatt ttgttttctt tggaaaagca tgtgatttta agccggctgg 10800
tcctcatacc cagacctagt gatctttata tagtgtagac atttttctaa ctgcttttaa 10860
ttgttttaga tctaccgtga gatggaagat aaagaatcac ggaagttagt ataccatccc 10920
gccactccgg cggctggtcc tctgcatggt gtggcactga ataatccata tcagcctttg 10980
agtgtcattg atctcaaacg ctgttctgct aggaataata gaactacata ctgctatgat 11040
tttccactgg tgagttgact gctcccttat attcaatgca ttaccatagc aaattcatat 11100
tcgttcatgt tgtcaaaata agccgatgaa aattcaaaac tgtaggcatt tgaaactgca 11160
gtgaggaagt catggtcctc tagtacctct ggtgcttcta aaggtgttga aaatgcccaa 11220
tgttatgtta aagctacaga gttggtattt gcggacaaac atgggtcatg gggcactcct 11280
ttagttcaaa tggaccggcc tgctgggctc aatgacattg gtatggtagc ttggaccttg 11340
aagatgtcca ctcctgaatt tcctagtggt agggagatta ttgttgttgc aaatgatatt 11400
acgttcagag ctggatcatt tggcccaagg gaagatgcat tttttgaagc tgttaccaac 11460
ctagcctgtg agaagaaact tcctcttatt tatttggcag caaattctgg tgctcgaatt 11520
ggcatagcag atgaagtgaa atcttgcttc cgtgttgggt ggtctgatga tggcagccct 11580
gaacgtgggt ttcagtacat ttatctaagc gaagaagact atgctcgtat tggcacttct 11640
gtcatagcac ataagatgca gctagacagt ggtgaaatta ggtgggttat tgattctgtt 11700
gtgggcaagg aagatggact tggtgtggag aatgtacatg gaagtgctgc tattgccagt 11760
gcttattcta gggcatataa ggagacattt acacttacat ttgtgactgg aagaactgtt 11820
ggaataggag cttatcttgc tcgacttggc atccggtgca tacagcgtct tgaccagcct 11880
attattctta caggctattc tgcactgaac aagcttcttg ggcgggaagt gtacagctcc 11940
cacatgcagt tgggtggtcc caaaatcatg gcaactaatg gtgttgtcca tcttactgtt 12000
tcagatgacc ttgaaggcgt ttctaatata ttgaggtggc tcagttatgt tcctgcctac 12060
attggtggac cacttccagt aacaacaccg ttggacccac cggacagacc tgttgcatac 12120
attcctgaga actcgtgtga tcctcgagcg gctatccgtg gtgttgatga cagccaaggg 12180
aaatggttag gtggtatgtt tgataaagac agctttgtgg aaacatttga aggttgggct 12240
aagacagtgg ttactggcag agcaaagctt ggtggaattc cagtgggtgt gatagctgtg 12300
gagactcaga ccatgatgca aactatccct gctgaccctg gtcagcttga ttcccgtgag 12360
caatctgttc ctcgtgctgg acaagtgtgg tttccagatt ctgcaaccaa gactgcgcag 12420
gcattgctgg acttcaaccg tgaaggatta cctctgttca tcctcgctaa ctggagaggc 12480
ttctctggtg gacaaagaga tctttttgaa ggaattcttc aggctggctc gactattgtt 12540
gagaacctta ggacatacaa tcagcctgcc tttgtctaca ttcccatggc tgcagagcta 12600
cgaggagggg cttgggttgt ggttgatagc aagataaacc cagaccgcat tgagcgctat 12660
gctgagagga ctgcaaaagg caatgttctg gaaccgcaag ggttaattga gatcaagttc 12720
aggtcagagg aactccagga ttgcatgagt cggcttgacc caacattaat tgatctgaaa 12780
gcaaaactcg aagtagcaaa taaaaatgga agtgctgaca caaaatcgct tcaagaaaat 12840
atagaagctc gaacaaaaca gttgatgcct ctatatactc agattgcgat acggtttgct 12900
gaattgcatg atacatccct cagaatggct gcgaaaggtg tgattaagaa agttgtggac 12960
tgggaagaat cacgatcttt cttctataag agattacgga ggaggatctc tgaggatgtt 13020
cttgcaaaag aaattagagc tgtagcaggt gagcagtttt cccaccaacc agcaatcgag 13080
ctgatcaaga aatggtattc agcttcacat gcagctgaat gggatgatga cgatgctttt 13140
gttgcttgga tggataaccc tgaaaactac aaggattata ttcaatatct taaggctcaa 13200
agagtatccc aatccctctc aagtctttca gattccagct cagatttgca agccctgcca 13260
cagggtcttt ccatgttact agataaggta attagcttac tgatgcttat ataaattctt 13320
tttcattaca tatggctgga gaactatcta atcaaataat gattataatt ccaatcgttc 13380
tttttatgcc attatgatct tctgaaattt ccttctttgg acacttattc agatggatcc 13440
ctctagaaga gctcaacttg ttgaagaaat caggaaggtc cttggttgaa tcatatgatg 13500
ccaaaactat tattggaggc acaaatagct tgtggaccct gtcggattgt tggtgagtgt 13560
atattggatt tgttagttct gccagatgaa agtgcaagtc tgatgattca tgataccgtc 13620
agttggcaag aacaccggtt aacctgagtg cttgtttaca aatggtcctt tatgacaatc 13680
gttgtttcgc gctagttccg tgatctacta tcatctgtta gacgctgtaa ttagtgagtc 13740
tccgcggatc cacagtatac ggttgagctg ttgattcaat tttggacacg aataatatga 13800
ttttgtaggc ataaatgcgt ctgtatgtga aataaattgt ctgttgagtt aacacacaag 13860
atgacaatat gtttgtgctc tactgctatt gtccatgaat actgattgcg gaatcaacca 13920
catgcattat a 13931

Claims (6)

1.一种赋予植物对除草剂产生抗性的方法或者制备具有除草剂抗性的植物的方法，所述方法包括在植物中引入突变型乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的步骤；其特征在于，所述突变型ACC的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述除草剂为苯丙草酮；所述植物为水稻。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将植物的内源性ACC进行突变从而引入所述突变型ACC的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括采用基因编辑的方法引入所述突变型ACC。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因编辑工具选自CRISPR、TALEN和ZFN中的任意一种。
5.权利要求1-4任一权利要求中的突变型ACC，或编码所述突变型ACC的核酸，或包含所述突变型ACC的融合蛋白，或包含所述突变型ACC的核酸构建体，或包含所述突变型ACC的载体，或包含所述突变型ACC的宿主细胞在制备具有除草剂抗性的植物中的用途，所述除草剂为苯丙草酮；所述植物为水稻。
6.权利要求1-4任一权利要求中的突变型ACC，或编码所述突变型ACC的核酸，或包含所述突变型ACC的融合蛋白，或包含所述突变型ACC的核酸构建体，或包含所述突变型ACC的载体，或包含所述突变型ACC的宿主细胞在制备用于产生除草剂抗性的植物的试剂或试剂盒中的用途，所述除草剂为苯丙草酮；所述植物为水稻。
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利用CRISPR/Cas9技术编辑大麦乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）基因;林萌萌;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (基础科学辑)》;20191215;A006-23页，第3-4、7页 *
稗草对噁唑酰草胺的抗性机理研究;夏向东;《中国博士学位论文全文数据库 (农业科技辑)》;20190115;第D046-137页 *

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