JP2020519310A - 除草剤耐性遺伝子の創出およびその使用 - Google Patents
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Abstract
CRISPR/Cas9システムによる除草剤耐性植物を創出するための方法が提供される。植物において除草剤耐性を付与することができる内在性遺伝子突然変異部位をスクリーニングするための方法および作物交雑における特定された内在性遺伝子突然変異部位の使用も提供される。
Description
本発明は、植物遺伝子工学の分野に属する。具体的には、本発明は、塩基編集技術によって新規の除草剤耐性植物を創出するための方法、および植物において除草剤耐性を付与することができる内在性遺伝子突然変異をスクリーニングするための方法に関する。本発明は、作物交雑における特定された内在性遺伝子突然変異の使用にも関する。
雑草は、作物に対する主な脅威であり、作物の収量および品質に影響するだけでなく、農業上の有害生物および疾患も移す。それゆえ、有効な雑草防除は、農業における高い収量を達成することにとって必須である。伝統的な手作業の除草は、非効率的であり、高いコストをもたらし、したがって、作物の成長中に除草性化学物質を噴霧することに徐々に置き換えられてきた。現在、中国の農業生産において、適用される除草剤の面積および量は、殺虫剤および真菌剤をすでに超過している。
除草剤の作用機序は、3つの区分へと分けることができる。第1は、植物光合成系に関与する酵素を抑制することであり、第2は、アミノ酸または脂肪酸の合成の阻害など、細胞代謝を抑制することであり、第3は、微小管重合の抑制または植物ホルモン系への干渉を含む、細胞成長/分裂を抑制することである。除草剤が抑制する酵素はまた、多くの作物において感受性があり、それゆえ多くの除草剤は、雑草を防除しながら、作物に対する重大な損傷を発生させる可能性がある。それゆえ、除草剤に対する作物の耐性を改善することは大いに意義がある。
除草剤に対する作物耐性を上昇させるための2つの主要な戦略がある。1つは、標的耐性であり、これは、除草剤が酵素の生理活性を有効に抑制することができないように、除草剤によって抑制された酵素が突然変異していることを意味する。この戦略は概して、イミダゾリノン、グリホサート、スルホニル尿素、アトラジンおよびこれらに類するものに対する耐性を包含する。第2は、解毒であり、すなわち、除草剤の迅速な分解を通じて標的酵素の生理学的機能を保護することである。この戦略は概して、植物の内在性P450酵素系ならびに導入遺伝子によるグルホシナート、2,4−D、ジカムバおよびこれらに類するものに対する耐性を包含する。
植物内で除草剤耐性を達成することに対して、現在2つの異なる技術的アプローチ、すなわち、i)化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発などを含む伝統的な作物交雑、およびii)導入遺伝子、すなわち、関心対象の植物内への除草剤耐性遺伝子の組込みがある。しかしながら、伝統的な交雑農産物によって除草剤耐性突然変異(特に、同じ情報における複数の突然変異)を取得する確率は非常に低く、連関した望ましくない突然変異を生じることが可能である。導入遺伝子技術は、公知の除草剤耐性遺伝子を関心対象の植物内へ導入して、期待される除草剤耐性を付与することしかできない。
除草剤耐性植物および新たな除草剤耐性遺伝子を取得するためのより単純な、かつより効率的な方法について、当技術分野において必要性がなおもある。
I.定義
本発明において、特に示されていない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を指す。また、タンパク質およびヌクレオチドの化学、分子生物学、細胞および組織の培養、微生物学、免疫学に関する本明細書で使用する用語および実験手順はすべて、当技術分野で概して使用される用語および従来方法に属する。例えば、本明細書で使用される標準的なDNA組換えおよび分子クローン化技術は、当業者に周知であり、次の参考文献において詳細に説明されている:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989(以後、「Sambrook et al」と称する)。その一方で、本発明をより良好に理解するために、関連用語についての定義および説明を以下に提供する。
本発明において、特に示されていない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を指す。また、タンパク質およびヌクレオチドの化学、分子生物学、細胞および組織の培養、微生物学、免疫学に関する本明細書で使用する用語および実験手順はすべて、当技術分野で概して使用される用語および従来方法に属する。例えば、本明細書で使用される標準的なDNA組換えおよび分子クローン化技術は、当業者に周知であり、次の参考文献において詳細に説明されている:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989(以後、「Sambrook et al」と称する)。その一方で、本発明をより良好に理解するために、関連用語についての定義および説明を以下に提供する。
「Cas9ヌクレアーゼ」および「Cas9」は、本明細書で相互交換可能に使用されることができ、RNA特異的ヌクレアーゼ(RNA directed nuclease)と称し、Cas9タンパク質またはその断片(Cas9の活性のあるDNA開裂ドメインおよび/またはCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質など)を含む。Cas9は、CRISPR/Cas(クラスター化され規則正しく間の空いた短いパリンドロームリピートおよびその関係する系)ゲノム編集システムの構成要素であり、DNA標的配列を標的としかつ開裂させ、ガイドRNAの誘導下でDNA二本鎖切断(DSB)を形成する。
「ガイドRNA」および「gRNA」は、本明細書で相互交換可能に使用されることができ、典型的には、部分的な相補体を通じて複合体を形成するcrRNA分子およびtracrRNA分子から構成され、crRNAは、ハイブリッド形成のための標的配列と十分相補的であり、かつCRISPR複合体(Cas9+crRNA+tracrRNA)に向かい、標的配列へ特異的に結合する配列を含む。しかしながら、crRNAおよびtracrRNAの両方の特徴を含む一本鎖ガイドRNA(sgRNA)が設計されることができることは当技術分野において公知である。
「デアミナーゼ」は、脱アミノ反応を触媒する酵素を称する。本発明のいくつかの実施形態において、デアミナーゼは、シチジンまたはデオキシシチジンからそれぞれウラシルまたはデオキシウリジンへの脱アミノを触媒するシチジンデアミナーゼを称する。
植物細胞へ適用される場合の「ゲノム」は、核内で認められる染色体DNAだけでなく、細胞の細胞内構成要素(例えば、ミトコンドリア、色素体)内で認められる細胞小器官DNAも包含する。
本明細書で使用する場合、「植物」という用語には、植物全体および何らかの後代、植物の細胞、組織、または部分が含まれる。「植物部分」という用語には、例えば、種子(成熟種子および未成熟種子を含む)、植物挿木、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官(例えば、花粉、胚、花、果実、芽、葉、根、茎および外植片)を含むがこれに限定されない植物の何らかの部分(複数可)が含まれる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造単位もしくは機能単位へと組織化された植物細胞の何らかの他の群であってもよい。植物の細胞または組織培養物は、細胞または組織が取得された植物の生理学的特徴および形態学的特徴を有する植物を再生することができることがあり、かつ該植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができることがある。対照的に、いくつかの植物細胞は、植物を作出するよう再生することができない。植物の細胞または組織培養物における再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織的細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、シルク、花、仁、穂、穂軸、殻、または柄であってもよい。
植物部分には、収穫可能な部分、および後代植物の増殖に有用な部分が含まれる。増殖に有用な植物部分には、例えば、種子、果実、挿木、芽、塊茎、および根茎が含まれるが、これらに限定されない。植物の収穫可能な部分は、例えば、花、花粉、芽、塊茎、葉、茎、果実、種子、および根を含むがこれらに限定されない植物の何らかの有用な部分であってもよい。
植物細胞とは、植物の構造的かつ生理学的な単位であり、細胞壁を有さないプロトプラスト細胞と細胞壁を有する植物細胞とを含む。植物細胞は、単離された単一の細胞、または細胞の凝集体の形態であってもよく(例えば、脆いカルスおよび培養された細胞)、より高度の組織化された単位(例えば、植物組織、植物器官、および植物)の部分であってもよい。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または植物全体へと再生することができる細胞もしくは細胞の収集物であってもよい。このように、複数の植物細胞を含み、かつ植物全体へと再生することができる種子は、本明細書では実施形態において、「植物細胞」とみなされる。
「プロトプラスト」という用語は、本明細書で使用される場合、その細胞壁が完全にまたは部分的に除去され、その脂質二重膜がむき出しになった植物細胞を称し、したがって、細胞壁が完全に除去されたプロトプラストと、細胞壁が部分的にしか除去されていないスフェロプラストとを含むが、これらに限定されない。典型的には、プロトプラストとは、細胞培養物または植物全体への再生のための能力を有する、細胞壁を有さない単離された植物細胞である。
植物の「後代」は、植物の何らかのその後の世代を含む。
「遺伝子改変された植物」には、そのゲノム内に外来性ポリヌクレオチドを含む植物が含まれる。例えば、外来性ポリヌクレオチドは、ゲノム内に安定して組み込まれており、それにより該ポリヌクレオチドは連続的な世代へと伝えられる。外来性ポリヌクレオチドは、単独でまたは組換えDNAコンストラクトの一部としてゲノム内へと組み込まれることができる。改変された遺伝子または発現調節配列は、植物ゲノム内に、該配列が1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を含むことを意味する。例えば、本発明によって取得された遺伝子改変された植物は、野生型植物(遺伝子改変されていない対応する植物)に対して、1つ以上のCからTへの置換を含有することができる。
配列に関する「外来性の」という用語は、外来種から生じる配列、または同じ種からの場合、人為的なヒト介在による組成および/またはゲノムの遺伝子座におけるその本来の形態から実質的に改変されている配列を意味する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸フラグメント」は、合成の非天然ヌクレオチド塩基または変化したヌクレオチド塩基を場合により含有する一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAのポリマーを称するよう相互交換可能に使用される。ヌクレオチド(その5’−一リン酸形態で通常認められる)は、次のように一文字表記によって称される:「A」は、アデニル酸またはデオキシアデニル酸(それぞれ、RNAまたはDNAについて)、「C」は、シチジル酸またはデオキシシチジル酸、「G」は、グアニル酸またはデオキシグアニル酸、「U」は、ウリジル酸、「T」は、デオキシチミジル酸、「R」は、プリン(AまたはG)、「Y」は、ピリミジン(CまたはT)、「K」は、GまたはT、「H」は、AまたはCまたはT、「I」はイノシン、および「N」は何らかのヌクレオチドを表す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」は、本明細書では相互交換可能に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを称する。該用語は、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに、および天然のアミノ酸ポリマーに適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」という用語は、グルタミン酸残基のグリコシル化、脂質付着、硫酸化、ガンマ−カルボキシル化と、ヒドロキシル化と、ADP−リボシル化とを含むがこれらに限定されない修飾も含む。
本明細書で使用する場合、「発現コンストラクト」は、組換えベクターなど、植物における関心対象のヌクレオチド配列の発現に適したベクターを称する。「発現」は、機能的生成物の生成を称する。例えば、ヌクレオチド配列の発現は、ヌクレオチド配列の転写(mRNAまたは機能的RNAを生成するよう転写するなど)および/またはRNAからタンパク質前駆体もしくは成熟タンパク質への翻訳を称することができる。
本発明の「発現コンストラクト」は、線状核酸フラグメント、環状プラスミド、ウイルスベクター、またはいくつかの実施形態においては、翻訳されることができるRNA(mRNAなど)であることができる。
本発明の「発現コンストラクト」は、異なる源に由来する関心対象の調節配列およびヌクレオチド配列、または同じ源に由来するが、自然界で通常認められるのとは異なる様式で配置された関心対象の調節配列およびヌクレオチド配列を含むことができる。
「調節配列」または「調節因子」は、相互交換可能に使用されており、コード配列内の上流(5’非コード配列)、またはコード配列の下流(3’非コード配列)に位置し、かつ転写、RNAのプロセシングもしくは安定性、または関係するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を称する。植物発現調節因子は、植物における転写、RNAのプロセシングもしくは安定性、または関心対象のヌクレオチド配列の翻訳を制御することができるヌクレオチド配列を称する。
調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が含まれることができるが、これらに限定されない。
「プロモーター」は、別の核酸フラグメントの転写を制御することができる核酸フラグメントを称する。本発明のいくつかの実施形態において、該プロモーターは、その起源が植物細胞由来であろうとなかろうと、植物細胞における遺伝子転写を制御することができるプロモーターである。プロモーターは、構成プロモーターまたは組織特異的プロモーターまたは発生上調節されるプロモーターまたは誘導性プロモーターであることができる。
「構成プロモーター」は、たいていの状況におけるたいていの細胞型における遺伝子発現を概して生じるプロモーターを称する。「組織特異的プロモーター」および「組織に好ましいプロモーター」は、相互交換可能に使用され、1つの組織内または器官内で主としてだが必ずしも排他的ではなく発現するが、1つの特異的な細胞内または細胞型内で発現することもできるプロモーターを称する。「発生上調節されるプロモーター」は、発生事象によって活性が決定されるプロモーターを称する。「誘導性プロモーター」は、内在性または外来性の刺激(環境、ホルモン、または化学シグナルなど)に応じて、該プロモーターへ操作可能に連結されたDNA配列を選択的に発現する。
本明細書で使用する場合、「操作可能に連結された」という用語は、調節因子(例えば、プロモーター配列、転写終結配列などだがこれらに限定されない)が核酸配列(コード配列またはオープンリーディングフレーム)と会合し、それによりヌクレオチド配列の転写が転写調節因子によって制御および調節されることを意味する。調節因子領域を核酸分子へ操作可能に連結するための技術は、当技術分野において公知である。
植物内への核酸分子(プラスミド、線状核酸フラグメント、RNAなど)またはタンパク質の「導入」は、植物細胞を核酸またはタンパク質で形質転換し、それにより核酸またはタンパク質が植物細胞において機能することができることを意味する。本明細書で使用される場合の「形質転換」には、安定した形質転換および一過性の形質転換が含まれる。
「安定した形質転換」は、外来性のヌクレオチド配列を植物ゲノム内へと導入して、結果的に遺伝上安定した遺伝を生じることを称する。いったん安定して形質転換されると、外来性核酸配列は、植物およびその何らかの連続した世代のゲノム内へと安定して組み込まれる。
「一過性の形質転換」は、植物細胞内へ核酸分子またはタンパク質を導入して、安定した遺伝なしでその機能を実行することを称する。一過性の形質転換において、外来性核酸配列は、植物ゲノム内へ組み込まれることはない。
II.除草剤耐性植物を作出するための塩基編集システム
本発明は、次の(i)〜(v)、すなわち
i)塩基編集融合タンパク質、およびガイドRNA、
ii)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ガイドRNAとを含む発現コンストラクト、
iii)塩基編集融合タンパク質、およびガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
iv)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
v)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とガイドRNAをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
のうちの少なくとも1つを含む、植物のゲノム内の除草剤耐性関連遺伝子の塩基編集のためのシステムを提供し、ここで、該塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型CRISPRヌクレアーゼドメイン(ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインなど)およびデアミナーゼドメインを含有し、該ガイドRNAは、植物ゲノム内の除草剤耐性関連遺伝子における標的配列へ該塩基編集融合タンパク質を向かわせることができる。
本発明は、次の(i)〜(v)、すなわち
i)塩基編集融合タンパク質、およびガイドRNA、
ii)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ガイドRNAとを含む発現コンストラクト、
iii)塩基編集融合タンパク質、およびガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
iv)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
v)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とガイドRNAをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
のうちの少なくとも1つを含む、植物のゲノム内の除草剤耐性関連遺伝子の塩基編集のためのシステムを提供し、ここで、該塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型CRISPRヌクレアーゼドメイン(ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインなど)およびデアミナーゼドメインを含有し、該ガイドRNAは、植物ゲノム内の除草剤耐性関連遺伝子における標的配列へ該塩基編集融合タンパク質を向かわせることができる。
除草剤耐性関連遺伝子は、除草剤によって抑制されることができる、植物における重要な生理学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。このような除草剤耐性関連遺伝子における突然変異は、除草剤の抑制を逆転させることができ、その生理学的活性を保有することができる。あるいは、除草剤耐性関連遺伝子は、除草剤を分解することができるタンパク質をコードすることができる。このような除草剤と関係する遺伝子の発現を上昇させること、またはその分解活性を増強させることは、除草剤に対する耐性の上昇を結果的に生じることができる。
本発明のいくつかの実施形態において、除草剤耐性関連遺伝子には、PsbA遺伝子(アトラジンなどに対して耐性)、ALS(アセトラクタートシンターゼ)遺伝子(スルホニル尿素、イミダゾリジノンなどに対して耐性)、EPSPS(5−エノールピルビン酸オキサラート−3−リン酸シンターゼ)遺伝子(グリホサートに対して耐性)、ACCアーゼ(アセチル−CoAカルボキシラーゼ)遺伝子(セトキシジムなどに対して耐性)、PPO(プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ)遺伝子(カルフェントラゾン−エチルなどに対して耐性)およびHPPD(p−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ)遺伝子(メソトリオンなどに対して耐性)、PDS(フィトエンデヒドロゲナーゼ)(ジフルフェニカンなどに対して耐性)、GS(グルタミンシンテターゼ)(グルホシナートなどの除草剤の標的)、DOXPS(クロマゾンなどの除草剤の標的)、P450(除草剤の分解に関与)が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、配列番号19〜配列番号78のうちの1つ以上を標的とする。
本発明において使用されることができるヌクレアーゼ不活性型CRISPRヌクレアーゼに特に限定することはないが、ただし、gRNAの誘導下での特定のDNAを標的とする性能を保有することを条件とし、例えば、Cas9、Cpf1およびこれらに類するものに由来するヌクレアーゼ不活性型CRISPRヌクレアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼ不活性型Cas9ヌクレアーゼが好ましい。
Cas9ヌクレアーゼのDNA開裂ドメインは、2つのサブドメイン、すなわちHNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvCサブドメインを含有することが公知である。HNHサブドメインは、gRNAに相補的である鎖を開裂するのに対し、RuvCサブドメインは、非相補鎖を開裂する。これらのサブドメインにおける突然変異は、Cas9ヌクレアーゼを不活性化させて、「ヌクレアーゼ不活性型Cas9」を形成することができる。ヌクレアーゼ不活性型Cas9は、gRNAによって命令されるDNA結合性能を保有する。したがって、原則として、追加のタンパク質と融合したとき、ヌクレアーゼ不活性型Cas9は、該追加のタンパク質をほぼいかなるDNA配列に対しても、適切なガイドRNAとの共発現を通じて単純に標的とすることができる。
シチジンデアミナーゼは、DNAにおけるシチジン(C)の脱アミノを触媒して、ウラシル(U)を形成することができる。ヌクレアーゼ不活性型Cas9がシチジンデアミナーゼと融合する場合、この融合タンパク質は、ガイドRNAの命令を通じて植物のゲノムにおける標的配列を標的とすることができる。DNA二本鎖は、Cas9ヌクレアーゼ活性の喪失によって開裂されることがないのに対し、融合タンパク質におけるデアミナーゼドメインは、Cas9−ガイドRNA−DNA複合体の形成の間に生じる一本鎖DNAのシチジンからUへと転換することができ、次いで、CからTへの置換は塩基ミスマッチ修復によって達成されることがある。
それゆえ、本発明のいくつかの実施形態において、このデアミナーゼとは、アポリポタンパク質BmRNA編集複合体(APOBEC)ファミリーデアミナーゼなどのシチジンデアミナーゼである。特に、本明細書で説明するデアミナーゼとは、一本鎖DNAを基質として受け入れることができるデアミナーゼである。
本発明において使用することができるシチジンデアミナーゼの例としては、APOBEC1デアミナーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ(AID),APOBEC3G、またはCDA1が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、シチジンデアミナーゼは、配列番号10または配列番号11の位置9〜位置235において示されるアミノ酸配列を含む。
本発明のヌクレアーゼ不活性型Cas9は、異なる種のCas9に由来することができ、例えば、S.pyogenes Cas9(SpCas9、アミノ酸配列は配列番号5に示されている)に由来することができる。SpCas9のHNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvCサブドメインの両方における突然変異(例えば、D10A突然変異およびH840A突然変異を含む)は、ヌクレアーゼ死滅Cas9(dCas9)において結果的に生じるS.pyogenes Cas9ヌクレアーゼを不活性化する。突然変異によるサブドメインのうちの1つの不活性化によって、Cas9がニッカーゼ活性を獲得することができ、すなわち、Cas9ニッカーゼ(nCas9)、例えば、D10A突然変異のみを有するnCas9を結果的に生じる。
それゆえ、本発明のいくつかの実施形態において、本発明のヌクレアーゼ不活性型Cas9は、野生型Cas9と比較して、アミノ酸置換D10Aおよび/またはH840Aを含む。
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、本発明のヌクレアーゼ不活性型Cas9は、ニッカーゼ活性を有する。いかなる理論によっても縛られることなく、真核生物のミスマッチ修復は、DNA鎖におけるミスマッチした塩基の除去および修復のために、該DNA鎖上のニックを使用する。シチジンデアミナーゼによって形成されるU:Gミスマッチは、C:Gへと修復されることができる。編集されていないGを含有する鎖の上のニックの導入を通じて、U;Gミスマッチを所望のU:AまたはT:Aに優先的に修復することは可能であることになる。それゆえ、好ましくは、ヌクレアーゼ不活性型Cas9は、Cas9のHNHサブドメインの開裂活性を保有するのに対し、RuvCサブドメインの開裂活性が不活性化されるCas9ニッカーゼである。例えば、ヌクレアーゼ不活性型Cas9は、野生型Cas9と比較してアミノ酸置換D10Aを含有する。
本発明のいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ不活性型Cas9は、配列番号6のアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ不活性型Cas9は、配列番号7のアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインのN末端へ融合する。いくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインのC末端へ融合する。
本発明のいくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインおよびヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインは、リンカーを通じて融合する。リンカーは、長さ1〜50(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または20〜25、25〜50)またはそれより多数のアミノ酸である二次以上の構造を有さない非機能的アミノ酸配列であることができる。例えば、リンカーは、GGGGS、GS、GAP、(GGGGS)×3、GGS、(GGS)×7、およびこれらに類するものなどの可撓性リンカーであってもよい。いくつかの好ましい実施形態において、リンカーは、配列番号8において示されるXTENリンカーである。
本発明のいくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインおよびヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインは、リンカーを通じて融合する。リンカーは、長さ1〜50(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または20〜25、25〜50)またはそれより多数のアミノ酸である二次以上の構造を有さない非機能的アミノ酸配列であることができる。例えば、リンカーは、GGGGS、GS、GAP、(GGGGS)×3、GGS、(GGS)×7、およびこれらに類するものなどの可撓性リンカーであってもよい。いくつかの好ましい実施形態において、リンカーは、配列番号8において示されるXTENリンカーである。
細胞内で、ウラシルDNAグリコシラーゼは、DNAからのUの除去を触媒し、塩基切除修復(BER)を開始し、このことは結果的にU:GからC:Gへの修復を生じる。それゆえ、いかなる理論的な制限もなく、本発明の塩基編集融合タンパク質または本発明のシステムにおいてウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤を含むことは、塩基編集の効率性を高めることができることになる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤(UGI)をさらに含む。いくつかの実施形態において、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号9において明らかにされるアミノ酸配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の塩基編集融合タンパク質は、核局在配列(NLS)をさらに含む。概して、塩基編集融合タンパク質における1つ以上のNLSは、塩基編集機能に十分な量で、植物細胞の核内での塩基編集融合タンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有するべきである。概して、核局在活性の強度は、NLSの数および位置、ならびに塩基編集融合タンパク質において使用される1つ以上の具体的なNLS、またはこれらの組み合わせによって決定される。
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の塩基編集融合タンパク質のNLSは、N末端および/またはC末端に局在することができる。いくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多数のNLSを含む。いくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、N末端にまたはN末端の近くに約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多数のNLSを含む。いくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、C末端にまたはC末端の近くに約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多数のNLSを含む。いくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、N末端における1つ以上のNLSおよびC末端における1つ以上のNLSなど、これらの組み合わせを含む。1つよりも多くのNLSがある場合、各NLSは、他のNLSとは独立しているものとして選択されることができる。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、2つのNLSを含み、例えば、2つのNLSは、それぞれN末端およびC末端に位置する。
概して、NLSは、タンパク質の表面上に曝露された正に帯電したリジンまたはアルギニンの1つ以上の短い配列からなるが、他の種類のNLSも当技術分野で公知である。NLSの非限定例としては、KKRKV(ヌクレオチド配列5’−AAGAAGAGAAAGGTC−3’)、PKKKRKV(ヌクレオチド配列5’−CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG−3’またはCCAAAGAAGAAGAGGAAGGTT)、またはSGGSPKKKRKV(ヌクレオチド配列5’−TCGGGGGGGAGCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTG−3’)が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質のN末端は、PKKKRKVによって示されるアミノ酸配列を有するNLSを含む。本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質のC末端は、SGGSPKKKRKVによって示されるアミノ酸配列を有するNLSを含む。
加えて、本発明の塩基編集融合タンパク質には、編集されることになっているDNAの位置に応じて、細胞質局在配列、葉緑体局在配列、ミトコンドリア局在配列、およびこれらに類するものなど、他の局在配列も含むことができる。
本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、配列番号10または配列番号11において明らかにされるアミノ酸配列を含む。
植物内に効率的な発現を取得するために、本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、塩基編集されることになっている植物についてコドンが最適化されている。
コドンの最適化は、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然の配列の少なくとも1つのコドン(例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、もしくは約1超、2超、3超、4超、5超、10超、15超、20超、25超、50超、またはそれより多数のコドン)を該宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによる、関心対象の宿主細胞内での発現増強のために核酸配列を修飾する方法を称する。種々の種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス(生体間でのコドンの使用における差)はしばしば、伝令RNA(mRNA)の翻訳の効率と相関しており、このことは順に、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移RNA(tRNA)分子の有用性によると考えられている。細胞内での選択されたtRNAの優先性とは概して、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドンの最適化に基づく所与の生体内での最適な遺伝子発現について適合することができる。コドンの使用の表は、例えば、www.kazusa.orjp/codon/において入手可能な「Codon Usage Database」において容易に入手可能であり、これらの表は、多くの方法において応用することができる。Nakamura,Y.,et al.“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl.Acids Res.28:292(2000)を参照されたい。
本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質をコードするコドンの最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号12または配列番号13に記載されている。
本発明のいくつかの実施形態において、ガイドRNAは、一本鎖ガイドRNA(sgRNA)である。所与の標的配列による適切なsgRNAを構築する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Wang,Y.et al.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew.Nat.Biotechnol.32,947−951(2014)、Shan,Q.et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR−Cas system.Nat.Biotechnol.31,686−688(2013)、Liang,Z.et al.Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system.J Genet Genomics.41,63−68(2014)を参照されたい。
本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列および/またはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターなど植物発現調節因子へ操作可能に連結される。
本発明において使用されることができるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(Odell et al.(1985)Nature 313: 810−812)、トウモロコシUbi−1プロモーター、コムギU6プロモーター、コメU3プロモーター、トウモロコシU3プロモーター、コメアクチンプロモーター、TrpPro5プロモーター(2005年3月16日出願の米国特許出願公開第10/377,318号明細書)、pEMUプロモーター(Last et al.Theor.Appl.Genet.81:581−588)、MASプロモーター(Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723−2730)、トウモロコシH3ヒストンプロモーター(Lepetit et al.Mol.Gen.Genet.231:276−285およびAtanassova et al.(1992)Plant J.2(3):291−300)、およびBrassica napus ALS3(PCT出願国際公開第97/41228号)プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用されることのできるプロモーターには、Moore et al.(2006)Plant J.45(4):651−683において総説されているような共通して使用される組織特異的プロモーターも含まれる。
III.塩基編集によって除草剤耐性植物を作出するための方法
別の態様において、本発明は、除草剤耐性植物へ、該植物のゲノム内で除草剤耐性関連遺伝子を塩基編集するための本発明のシステムを導入し、それによりガイドRNAが該植物内で除草剤耐性関連遺伝子の標的配列への塩基編集融合タンパク質を標的とし、結果的に、標的配列において1つ以上のヌクレオチド置換を生じることを含む、該植物を作出するための方法を提供する。
別の態様において、本発明は、除草剤耐性植物へ、該植物のゲノム内で除草剤耐性関連遺伝子を塩基編集するための本発明のシステムを導入し、それによりガイドRNAが該植物内で除草剤耐性関連遺伝子の標的配列への塩基編集融合タンパク質を標的とし、結果的に、標的配列において1つ以上のヌクレオチド置換を生じることを含む、該植物を作出するための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、該方法は、除草剤耐性について植物をスクリーニングする工程をさらに含む。
いくつかの実施形態において、除草剤耐性関連遺伝子は、除草剤耐性関連タンパク質をコードする。本発明のいくつかの実施形態において、除草剤耐性関連タンパク質には、PsbA(アトラジンなどに対して耐性)、ALS(スルホニル尿素、イミダゾリジノンなどに対して耐性)、EPSPS(グリホサートに対して耐性)、ACCアーゼ(セトキシジムなどに対して耐性)、PPO(カルフェントラゾン−エチルなどに対して耐性)およびHPPD(メソトリオンなどに対して耐性)、PDS(ジフルフェニカンなどに対して耐性)、GS(グルホシナートなどの除草剤の標的)、DOXPS(クロマゾンなどの除草剤の標的)、P450(除草剤の分解に関与)が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド置換とは、CからTへの置換である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド置換とは、CからAへの置換またはCからGへの置換である。いくつかの実施形態において、発現調節領域など、除草剤耐性遺伝子における非コード領域内に位置するヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド置換は、遺伝子によってコードされる除草剤耐性タンパク質におけるアミノ酸置換を結果的に生じる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド置換および/またはアミノ酸置換は、除草剤耐性を植物に付与する。
本発明のいくつかの実施形態において、除草剤耐性を植物に付与するヌクレオチド置換および/またはアミノ酸置換は、除草剤耐性関連遺伝子において除草剤耐性を植物に付与する何らかの公知の置換であってもよい。本発明の方法によって、除草剤耐性を付与することのできる単一の突然変異、二重突然変異または多重突然変異は、導入遺伝子の必要性なく、生体内原位置で植物において創出されることができる。突然変異は、当技術分野で公知であってもよく、または本発明の方法によって新たに特定されていてもよい。
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてALS遺伝子を修飾し、その結果として、除草剤耐性を植物に付与するALSにおける1つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、A122T、P197S、P197L、P197F、R198C、D204N、A205T、D204N+A205T、G654K、G655D、G655S、G655N、G654K+G655D、G654K+G655S、G654K+G655N、G659N、P197S、P197L、P197F、D204N、A205T、D204N+A205T、G654D、G654S、G654N、G655D、G655S、G655N、G654D+G655D、G654D+G655S、G654D+G655N、G654S+G655D、G654S+G655S、G654S+G655N、G654N+G655D、G654N+G655S、G654N+G655N、A122T、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号2(シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(Genbank受入番号NP_190425)におけるALSのアミノ酸配列)を参照する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、P197A、P197F、P197S、P197Y、P197F+R198C、G654E+G655S、G654K+G655S、G654E+G659N、P197F+G654E+G655S、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号2(シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(Genbank受入番号NP_190425)におけるALSのアミノ酸配列)を参照する。
したがって、いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、A122、P197、R198、D204、A205、G654、G655、G659、またはこれらの何らかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸(複数可)をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号2(シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(Genbank受入番号NP_190425)におけるALSのアミノ酸配列)を参照する。
いくつかの実施形態において、ALSとは、コメALSであり、かつその野生型配列は、配列番号16に示されている。いくつかの実施形態において、ALSとは、コムギALSであり、かつその野生型配列は、配列番号17に示されている(部分的配列)(genbank ID:AAO53548.1)。
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてPsbA遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するPsbAにおける1つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてEPSPS遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するEPSPSにおける1つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、T102I、A103V、T102I+A103Vからなる群から選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号4を参照する(コムギAゲノムEPSPSアミノ酸配列(GenBank受入番号ALK27163))。
それゆえ、いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、T102および/またはA103からなる群から選択されるアミノ酸(複数可)をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号4を参照する。
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてACCアーゼ遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するACCアーゼにおける1つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、S1768F、R1793K、A1794T、R1793K+A1794T、R1825H、D1827N、R1825H+D1827N、L1815F、A1816V、R1817終止、L1815F+R1817終止、A1816V+R1817終止、L1815F+A1816V、L1815F、A1816V、+R1817終止、A1837V、G1854D、G1855D、G1855S、G1854N、G1854D+G1855D、G1854D+G1855S、G1854D+G1855N、D1971N、D1972N、D1971N+D1972N、G1983D、P1993S、P1993L、P1993F、R1994C、P1993S+R1994C、P1993L+R1994C、P1993F+R1994C、S2003F、A2004V、T2005I、S2003F+A2004V、S2003F+T2005I、A2004V+T2005I、T2007I、A2008V、T2007I+A2008V、R2028K、W2027C、G2029D、G2029S、G2029N、R2028K+G2029D、R2028K+G2029S、R2028K+G2029N、T2047I、R2070Q、G2071R、R2070Q+G2071R、A2090T、E2091K、A2090T+E2091K、A2090V、E2106K、S2119N、R2220Q、S2119N+R2220Q、A1813V、R1793K、A1794T、R1793K+A1794T、E1796K、E1797K、E1796K+E1797K、T1800M、L1801F、T1800M+L1801F、A1813V、G1854D、G1854S、G1854N、G1855D、G1855S、G1855N、G1854D+G1855D、G1854D+G1855S、G1854D+G1855N、G1854S+G1855D、G1854S+G1855S、G1854S+G1855N、G1854N+G1855D、G1854N+G1855S、G1854N+G1855N、S1849F、H1850Y、S1849F+H1850Y、D1874N、D1875N、D1874N+D1875N、R2028K、G2029D、G2029S、G2029N、R2028K+G2029D、R2028K+G2029S、R2028K+G2029N、L2024F、T2047I、R2070C、A2090V、G1983D、E1989K、R1990Q、E1989K+R1990Q、P1993S、P1993L、P1993F、R1994C、P1993S+R1994C、P1993L+R1994C、P1993F+R1994C、T2007I、A2008V、T2007I+A2008V、S2003L、A2004V、T2005I、S2003L+A2004V、S2003L+T2005I、A2004V+T2005I、S2003L、A2004V+T2005I、L2099F、E2106K、R2220K、G2119D、R2220K+G2119D、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号1を参照する(ノスズメノテッポウ(Alopecurus myosuroides)ACCアーゼアミノ酸配列(GenBank受入番号CAC84161.1))。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、W2027C、W2027C+R2028Kから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号1を参照する(ノスズメノテッポウ(Alopecurus myosuroides)ACCアーゼアミノ酸配列(GenBank受入番号CAC84161.1))。
それゆえ、いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、S1768、R1793、A1794、R1825、D1827、L1815、A1816、R1817、A1837、G1854、G1855、D1971、D1972、G1983、P1993、R1994、S2003、A2004、T2005、T2007、A2008、R2028、G2029、T2047、R2070、G2071、A2090、E2091、E2106、S2119、R2220、A1813、E1796、E1797、T1800、L1801、S1849、H1850、D1874、D1875、L2024、E1989、R1990、L2099、またはこれらの何らかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸(複数可)をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号1を参照する。
いくつかの実施形態において、ACCアーゼとは、コメACCアーゼであり、かつその野生型配列は、配列番号14に示されている(genbank ID:B9FK36)。いくつかの実施形態において、ACCアーゼとは、コムギACCアーゼであり、その野生型配列は、配列番号15に示されている(genbank ID:ACD46684.1)。
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてPPO遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するPPOにおいて1つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてHPPD遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するHPPDにおいて1つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、P277S、P277L、V364M、C413Y、G414D、G414S、G414N、G415E、G415R、G415K、G414D+G415E、G414D+G415R、G414D+G415K、G414S+G415E、G414S+G415R、G414S+G415K、G414N+G415E、G414N+G415R、G414N+G415K、C413Y+G415E、C413Y+G415R、C413Y+G415K、C413Y+G414D、C413Y+G414S、C413Y+G414N、C413Y+G414D+G415E、C413Y+G414D+G415R、C413Y+G414D+G415K、C413Y+G414S+G415E、C413Y+G414S+G415R、C413Y+G414S+G415K、C413Y+G414N+G415E、C413Y+G414N+G415R、C413Y+G414N+G415K、P277S、P277L、V366I、C413Y、G414D、G414S、G414N、G415E、G415R、G415K、G414D+G415E、G414D+G415R、G414D+G415K、G414S+G415E、G414S+G415R、G414S+G415K、G414N+G415E、G414N+G415R、G414N+G415K、C413Y+G415E、C413Y+G415R、C413Y+G415K、C413Y+G414D、C413Y+G414S、C413Y+G414N、C413Y+G414D+G415E、C413Y+G414D+G415R、C413Y+G414D+G415K、C413Y+G414S+G415E、C413Y+G414S+G415R、C413Y+G414S+G415K、C413Y+G414N+G415E、C413Y+G414N+G415R、C413Y+G414N+G415K、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号3を参照する(コメHPPDアミノ酸配列(Genbank受入番号XP_015626163))。
したがって、いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、P277、V364、C413、G414、G415、V366、またはこれらの何らかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸(複数可)をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号3を参照する。
Cas9とガイドRNAとの複合体によって認識されかつ標的とされ得る標的配列の設計は、当業者の工業的な技能のうちである。概して、標的配列とは、ガイドRNAにおいて含まれる約20個のヌクレオチドのリーダー配列に相補的である配列であり、その3’末端は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)であるNGGのすぐ隣にある。
例えば、本発明のいくつかの実施形態において、標的配列は、構造5’−NX−NGG−3’を有し、式中、Nは、A、G、C、およびTから独立して選択され、Xは、14≦X≦30の整数であり、NXは、X個の連続したヌクレオチドを表し、かつNGGは、PAM配列である。本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Xは20である。
いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、配列番号19〜配列番号78のうちの1つ以上を標的とする。
本発明の塩基編集システムは、植物における広範な脱アミノウィンドウ、例えば、長さ7ヌクレオチドの脱アミノウィンドウを有する。本発明の方法のいくつかの実施形態において、標的配列の位置3〜位置9内の1個以上のC塩基は、Tと置換される。例えば、存在する場合、標的配列における位置3〜位置9内のいずれか1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個のCは、Tと置き換えられることができる。例えば、標的配列の位置3〜位置9内に4個のCがある場合、いずれか1個、2個、3個、4個のCがTによって置き換えられることができる。C塩基は、連続していてもよく、または他のヌクレオチドによって分離されていてもよい。それゆえ、標的配列において複数のCがある場合、種々の突然変異の組み合わせは、本発明の方法によって取得されることができる。
本発明の方法のいくつかの実施形態において、所望のヌクレオチド置換を有する植物をスクリーニングすることをさらに含む。植物におけるヌクレオチド置換は、T7EI、PCR/REまたは配列決定方法によって検出されることができ、例えば、Shan,Q.,Wang,Y.,Li,J.& Gao,C.Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system.Nat.Protoc.9,2395−2410(2014)を参照されたい。
本発明の方法において、塩基編集システムは、当業者に周知の種々の方法によって植物内へと導入されることができる。本発明の塩基編集システムを植物内へと導入するために使用されることのできる方法には、粒子衝撃、PEG仲介性プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介性形質転換、植物ウイルス媒介性形質転換、花粉管アプローチ、および子房注入アプローチが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、塩基編集システムは、一過性形質転換によって植物内へと導入される。
本発明の方法において、標的配列の修飾は、単に植物細胞内で塩基編集融合タンパク質およびガイドRNAを導入または生成することによって達成されることができ、修飾は、塩基編集システムを用いた植物の安定した形質転換の必要性なく安定して遺伝することができる。このことは、安定した塩基編集システムの潜在的なオフターゲット効果を回避し、かつ植物ゲノム内への外来性ヌクレオチド配列の組込みも回避し、それにより結果的により高い生物安全性を生じる。
いくつかの好ましい実施形態において、この導入は、選択的圧力の非存在下で実施され、それにより、植物ゲノム内での外来性ヌクレオチド配列の組込みを回避する。
いくつかの実施形態において、この導入は、本発明の塩基編集システムを、単離された植物細胞または単離された組織内へと形質転換すること、次いで形質転換された植物細胞または組織を未処置の植物へと再生することを含む。好ましくは、この再生は、選択的圧力の非存在下で実施され、すなわち、発現ベクター上に担持される選択的遺伝子に対する選択的薬剤は、組織培養中に何ら使用されない。選択的薬剤の使用なしで、植物の再生効率は、外来性ヌクレオチド配列を含有しない改変された植物を取得するために上昇させることができる。
他の実施形態において、本発明の塩基編集システムは、葉、茎頂、花粉管、若穂(young ear)、または胚軸など、未処置の植物の特定部位へと形質転換されることができる。このことは、組織培養によって再生することが困難である植物の形質転換に特に適している。
本発明のいくつかの実施形態において、試験管内で発現するタンパク質および/または試験管内で転写されるRNA分子は、植物内へと直接形質転換される。該タンパク質および/またはRNA分子は、植物細胞内での塩基編集を達成することができ、かつ細胞によってその後分解されて、植物ゲノム内への外来性ヌクレオチド配列の組込みを回避することができる。
したがって、いくつかの実施形態において、除草剤耐性植物は、導入遺伝子非含有である。
本発明の方法において使用されることのできる植物には、単子葉類および双子葉類が含まれる。例えば、該植物は、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、カノーラ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、ミレー、トウキビ、トマト、タバコ、タピオカ、またはジャガイモなどの作物植物であってもよい。該植物はまた、キャベツ、ケール、キュウリ、トマトを含むがそれらに限定されない野菜作物であってもよい。該植物はまた、カーネーション、ペオニア、バラ、およびこれらに類するものを含むがそれらに限定されない花作物であってもよい。該植物はまた、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、カンキツ、モモを含むがこれらに限定されない果実作物であってもよい。該植物はまた、板藍根(Radix isatidis)、リコリス、チョウセンニンジン、およびトウスケボウフウ(Saposhnikovia divaricata)を含むがこれらに限定されない中国産生薬であってもよい。該植物はまた、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)であることができる。
本発明のいくつかの実施形態において、該方法は、除草剤耐性植物の後代を取得することをさらに含む。
別の態様において、本発明は、除草剤耐性植物またはその後代もしくは部分も提供し、ここで、該植物は、本発明の上述の方法によって取得される。いくつかの実施形態において、除草剤耐性植物は、導入遺伝子非含有である。
別の態様において、本発明は、本発明の上述の方法によって取得された第一の除草剤耐性植物を、除草剤耐性をまったく有さない第二の植物と交雑させることと、それにより除草剤耐性を第二の植物内へ導入することとを含む、植物交雑方法も提供する。
本発明は、本発明の方法によって取得された除草剤耐性植物またはその後代も包含する。
IV.除草剤耐性関連タンパク質の変異体を特定すること
本発明の方法によって、除草剤耐性関連遺伝子の多数の突然変異体は、除草剤耐性関連遺伝子の標的とされた塩基修飾によって容易に取得されることができ、次いで、新規の除草剤耐性突然変異は、耐性スクリーニングを通じて特定されることができる。
本発明の方法によって、除草剤耐性関連遺伝子の多数の突然変異体は、除草剤耐性関連遺伝子の標的とされた塩基修飾によって容易に取得されることができ、次いで、新規の除草剤耐性突然変異は、耐性スクリーニングを通じて特定されることができる。
したがって、本発明は、以下、すなわち
i)先の第III節の方法によって除草剤耐性植物を作出することと、
ii)結果として生じる除草剤耐性植物における除草剤耐性関連遺伝子および/またはコードされた除草剤耐性関連タンパク質の配列を決定し、それにより変異体の配列を特定すること
とを含む、除草剤耐性を植物へ付与することのできる除草剤耐性関連タンパク質の変異体を特定する方法も提供する。
i)先の第III節の方法によって除草剤耐性植物を作出することと、
ii)結果として生じる除草剤耐性植物における除草剤耐性関連遺伝子および/またはコードされた除草剤耐性関連タンパク質の配列を決定し、それにより変異体の配列を特定すること
とを含む、除草剤耐性を植物へ付与することのできる除草剤耐性関連タンパク質の変異体を特定する方法も提供する。
V.除草剤耐性関連タンパク質変異体、その核酸、発現コンストラクトおよび使用
本発明は、本発明の先の第IV節による方法によって特定される除草剤耐性関連タンパク質の変異体も提供する。
本発明は、本発明の先の第IV節による方法によって特定される除草剤耐性関連タンパク質の変異体も提供する。
本発明は、野生型ACCアーゼと比較して、植物ACCアーゼ変異体も提供し、該ACCアーゼ変異体は、1768、1793、1796、1797、1794、1800、1801、1813、1813、1815、1825、1827、1815、1816、1817、1837、1838、1849、1850、1854、1855、1874、1875、1971、1872、1983、1989、1990、1993、1994、2003、2004、2005、2007、2008、2024、2027、2028、2029、2047、2070、2071、2090、2091、2090、2106、2099、2106、2119、2220から選択される、1つまたは複数の位置でのアミノ酸の突然変異を含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号1を参照し、該変異体は、除草剤耐性を植物に付与する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、S1768F、R1793K、A1794T、R1793K+A1794T、R1825H、D1827N、R1825H+D1827N、L1815F、A1816V、R1817終止、L1815F+R1817終止、A1816V+R1817終止、L1815F+A1816V、L1815F、A1816V、+R1817終止、A1837V、G1854D、G1855D、G1855S、G1854N、G1854D+G1855D、G1854D+G1855S、G1854D+G1855N、D1971N、D1972N、D1971N+D1972N、G1983D、P1993S、P1993L、P1993F、R1994C、P1993S+R1994C、P1993L+R1994C、P1993F+R1994C、S2003F、A2004V、T2005I、S2003F+A2004V、S2003F+T2005I、A2004V+T2005I、T2007I、A2008V、T2007I+A2008V、R2028K、G2029D、G2029S、G2029N、R2028K+G2029D、R2028K+G2029S、R2028K+G2029N、T2047I、R2070Q、G2071R、R2070Q+G2071R、A2090T、E2091K、A2090T+E2091K、A2090V、E2106K、S2119N、R2220Q、S2119N+R2220Q、A1813V、R1793K、A1794T、R1793K+A1794T、E1796K、E1797K、E1796K+E1797K、T1800M、L1801F、T1800M+L1801F、A1813V、G1854D、G1854S、G1854N、G1855D、G1855S、G1855N、G1854D+G1855D、G1854D+G1855S、G1854D+G1855N、G1854S+G1855D、G1854S+G1855S、G1854S+G1855N、G1854N+G1855D、G1854N+G1855S、G1854N+G1855N、S1849F、H1850Y、S1849F+H1850Y、D1874N、D1875N、D1874N+D1875N、W2027C、R2028K、W2027C+R2028K、G2029D、G2029S、G2029N、R2028K+G2029D、R2028K+G2029S、R2028K+G2029N、L2024F、T2047I、R2070C、A2090V、G1983D、E1989K、R1990Q、E1989K+R1990Q、P1993S、P1993L、P1993F、R1994C、P1993S+R1994C、P1993L+R1994C、P1993F+R1994C、T2007I、A2008V、T2007I+A2008V、S2003L、A2004V、T2005I、S2003L+A2004V、S2003L+T2005I、A2004V+T2005I、S2003L、A2004V+T2005I、L2099F、E2106K、R2220K、G2119D、R2220K+G2119D、またはこのいずれかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は配列番号1を参照する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、W2027C、W2027C+R2028Kから選択され、ここで、アミノ酸の位置は配列番号1を参照する。
いくつかの実施形態において、ACCアーゼとは、コメACCアーゼであり、その野生型配列は、配列番号14に示される(genbank ID:B9FK36)。いくつかの実施形態において、ACCアーゼとは、コムギACCアーゼであり、その野生型配列は、配列番号15に示される(genbank ID:ACD46684.1)。
このような変異体の発現によって、植物(コメ、トウモロコシ、コムギおよび他の単子葉植物)は、シクロへキセノン除草剤(クレトジムなど)、アリールオキシフェノキシプロピオン酸除草剤(ハロキシホップ−P−メチルなど)、フェニルピラゾリン除草剤(オキサゾリンなど)および他のACCアーゼ阻害剤除草剤に対する、単一の耐性(1つの除草剤に対する耐性)または交差耐性(2つ以上の除草剤に対して耐性がある)を取得することができる。ACCアーゼは、植物の脂肪酸合成経路における鍵となる酵素であり、その活性の阻害は究極的には、脂肪酸欠乏による植物の死滅をもたらす。
本発明は、野生型ALSと比較して、植物ALS変異体も提供し、該ALS変異体は、122、197、204、205、653、654、655、659から選択される、1つまたは複数の位置でのアミノ酸の突然変異を含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号2を参照し、該変異体は除草剤耐性を植物に付与する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、A122T、P197A、P197Y、P197S、P197L、P197F、D204N、A205T、D204N+A205T、E654K、G655D、G655S、G655N、E654K+G655D、E654K+G655S、E654K+G655N、G659N、P197S、P197L、P197F、D204N、A205T、D204N+A205T、G654D、G654S、G654N、G655D、G655S、G655N、G654D+G655D、G654D+G655S、G654D+G655N、G654S+G655D、G654S+G655S、G654S+G655N、G654N+G655D、G654N+G655S、G654N+G655N、A122T、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は配列番号2を参照する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、P197A、P197F、P197S、P197Y、P197F+R198C、G654E+G655S、G654K+G655S、G654E+G659N、P197F+G654E+G655S、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は配列番号2を参照する。
いくつかの実施形態において、ALSとはコメALSであり、その野生型配列は配列番号16に示されている。いくつかの実施形態において、ALSとはコムギALSであり、その野生型配列は配列番号17に示されている(部分的な配列)(genbank ID:AAO53548.1)。
このような変異体の発現によって、植物(例えば、コメ、トウモロコシ、コムギなどの単子葉植物、ならびにダイズ、ワタ、カノーラ、およびヒマワリなどの双子葉植物)は次の除草剤、すなわち、イミダゾリノン除草剤(イマザメスなど)、スルホニル尿素除草剤(ニコスルフロンなど)、トリアゾリノン除草剤(フルカルバゾンナトリウムなど)、トリアゾロピリミジン除草剤(例えば、ペノキスラム)、ピリミジンサリチラート除草剤(例えば、ビスピリバック−ナトリウム)のうちの1つ以上に対してより高レベルの除草剤耐性を有することができる可能性がある。ALSは、植物における分枝鎖アミノ酸の合成における鍵となる酵素であり、その活性の阻害は究極的には、分枝鎖アミノ酸の欠如による植物の死滅を結果的に生じる。
本発明は、植物HPPD変異体も提供し、野生型HPPDと比較して、該HPPDは、277、364、366、413、414、415から選択される、1つまたは複数の位置でのアミノ酸の突然変異を含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号3を参照し、該変異体は、除草剤耐性を植物に付与する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、P277S、P277L、V364M、C413Y、G414D、G414S、G414N、G415E、G415R、G415K、G414D+G415E、G414D+G415R、G414D+G415K、G414S+G415E、G414S+G415R、G414S+G415K、G414N+G415E、G414N+G415R、G414N+G415K、C413Y+G415E、C413Y+G415R、C413Y+G415K、C413Y+G414D、C413Y+G414S、C413Y+G414N、C413Y+G414D+G415E、C413Y+G414D+G415R、C413Y+G414D+G415K、C413Y+G414S+G415E、C413Y+G414S+G415R、C413Y+G414S+G415K、C413Y+G414N+G415E、C413Y+G414N+G415R、C413Y+G414N+G415K、P277S、P277L、V366I、C413Y、G414D、G414S、G414N、G415E、G415R、G415K、G414D+G415E、G414D+G415R、G414D+G415K、G414S+G415E、G414S+G415R、G414S+G415K、G414N+G415E、G414N+G415R、G414N+G415K、C413Y+G415E、C413Y+G415R、C413Y+G415K、C413Y+G414D、C413Y+G414S、C413Y+G414N、C413Y+G414D+G415E、C413Y+G414D+G415R、C413Y+G414D+G415K、C413Y+G414S+G415E、C413Y+G414S+G415R、C413Y+G414S+G415K、C413Y+G414N+G415E、C413Y+G414N+G415R、C413Y+G414N+G415K、またはこれらの何らかの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、HPPDとはコメHPPDであり、その野生型配列は配列番号3において示される。いくつかの実施形態において、HPPDとはコムギHPPDであり、その野生型配列は配列番号18において示される。
このような変異体の発現によって、植物(例えば、コメ、トウモロコシ、コムギなどの単子葉植物、ならびにダイズ、ワタ、ナタネ、およびヒマワリなどの双子葉植物)は1つ以上のHPPD阻害剤除草剤(例えば、メソトリオン、トプラメゾン)に対するより高レベルの耐性を取得することができる可能性がある。HPPDは、植物におけるクロロフィル合成経路の鍵となる酵素である。HPPDの活性の阻害は究極的には、植物の白化および死滅をもたらす。
本発明は、野生型EPSPSと比較した、植物EPSPS変異体も提供し、該EPSPSは、102および103から選択される、1つまたは複数の位置でのアミノ酸の突然変異を含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号4を参照し、該変異体は、除草剤耐性を植物に付与する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、T102I、A103V、T102I+A103Vからなる群から選択される。EPSPS酵素は、植物における芳香属アミノ酸の合成における鍵となる酵素であり、その活性の阻害は究極的には、芳香族アミノ酸の欠如による植物の死滅をもたらす。
いくつかの実施形態において、EPSPSとはコムギEPSPSであり、その野生型配列は配列番号4に示されている。
このような変異体の発現は、植物(例えば、コメ、トウモロコシ、コムギなどの単子葉類、ならびにダイズ、ワタ、ナタネ、およびヒマワリなどの双子葉類)におけるグリホサートに対する耐性を有意に上昇させることができる。
いくつかの実施形態において、本発明の変異体は、除草剤耐性を植物に付与することのできる、当技術分野で公知の他のアミノ酸の突然変異も含む。
本発明は、本発明の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸も提供する。
本発明は、調節配列へ操作可能に連結された本発明の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットも提供する。
本発明は、本発明の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトも提供し、該ヌクレオチド配列は、調節配列へ操作可能に連結される。
本発明は、除草剤耐性植物の作出における本発明の変異体、単離された核酸、発現カセットおよび発現コンストラクトの使用も提供する。
本発明は、本発明の単離された核酸、本発明の発現カセット、および/または本発明の発現コンストラクトを植物内へ導入することを含む、除草剤耐性植物を作出する方法も提供する。
本発明は、本発明の発現カセットを含むまたは該発現カセットによって形質転換する除草剤耐性植物も提供する。本発明は、除草剤耐性植物の後代も網羅する。
該植物には、単子葉類および双子葉類が含まれる。例えば、該植物は、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、カノーラ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、ミレー、トウキビ、トマト、タバコ、タピオカ、またはジャガイモなどの作物植物であってもよい。該植物はまた、キャベツ、ケール、キュウリ、トマトを含むがこれらに限定されない野菜作物であってもよい。該植物はまた、カーネーション、ペオニア、バラ、およびこれらに類するものを含むがそれらに限定されない花作物であってもよい。該植物はまた、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、カンキツ、モモを含むがこれらに限定されない果実作物であってもよい。該植物はまた、板藍根(Radix isatidis)、リコリス、チョウセンニンジン、およびトウスケボウフウ(Saposhnikovia divaricata)を含むがこれらに限定されない中国産生薬であってもよい。該植物はまた、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)であることができる。
実施例1.塩基編集ベクターの構築
本実施例において、異なる作物のためのALS、ACCアーゼ、EPSPS、およびHPPDなどの除草剤耐性関連遺伝子のための塩基編集ベクターを構築した。
本実施例において、異なる作物のためのALS、ACCアーゼ、EPSPS、およびHPPDなどの除草剤耐性関連遺伝子のための塩基編集ベクターを構築した。
コメ:
Yuan Zong(Zong,Y.et al.Precise base editing in rice,wheat and maize with a Cas9− cytidine deaminase fusion.Nat.Biotechnol.2017,doi:10.1038/nbt.3811)に従って、OsALS遺伝子、OsACCアーゼ遺伝子、およびOsHPPD遺伝子を標的とする塩基編集ベクターを、pH−nCas9− PBEコンストラクトを用いて構築した。とりわけ、OsALSにおける4個の標的単一部位(R1〜R4)、OsALS遺伝子の3個の標的二重部位(R25〜R27)、およびOsACCアーゼ遺伝子の20個の標的単一部位(R5〜R24)、OsHPPDの4個の標的単一部位(R28〜R30)とした。本実験におけるsgRNA標的配列を表1に示す。潜在的な耐性突然変異を表3に示す。
Yuan Zong(Zong,Y.et al.Precise base editing in rice,wheat and maize with a Cas9− cytidine deaminase fusion.Nat.Biotechnol.2017,doi:10.1038/nbt.3811)に従って、OsALS遺伝子、OsACCアーゼ遺伝子、およびOsHPPD遺伝子を標的とする塩基編集ベクターを、pH−nCas9− PBEコンストラクトを用いて構築した。とりわけ、OsALSにおける4個の標的単一部位(R1〜R4)、OsALS遺伝子の3個の標的二重部位(R25〜R27)、およびOsACCアーゼ遺伝子の20個の標的単一部位(R5〜R24)、OsHPPDの4個の標的単一部位(R28〜R30)とした。本実験におけるsgRNA標的配列を表1に示す。潜在的な耐性突然変異を表3に示す。
コムギ:
Yuan Zong(Zong,Y.et al.Precise base editing in rice,wheat and maize with a Cas9− cytidine deaminase fusion.Nat.Biotechnol.2017,doi:10.1038/nbt.3811)に従って、TaALS、TaACCアーゼ、TaEPSPSおよびTaHPPD遺伝子を標的とする塩基編集ベクターを、pTaU6を用いて構築した。とりわけ、TaALS遺伝子における4個の標的単一部位(W1〜W3、W16)、TaALS遺伝子における3個の標的二重部位(W31〜W33)、TaACCアーゼ遺伝子の20個の標的単一部位(W4〜W15、W17〜W24)、TaEPSPS遺伝子の3個の標的単一部位(W25〜W27)およびTaHPPD遺伝子の3個の標的単一部位(W28〜W30)、ならびにTaALS遺伝子およびTaACCアーゼの1個の同時の標的二重部位(W34)とした。本実験におけるsgRNA標的配列を表2に示す。潜在的な耐性突然変異を表4に示す。
Yuan Zong(Zong,Y.et al.Precise base editing in rice,wheat and maize with a Cas9− cytidine deaminase fusion.Nat.Biotechnol.2017,doi:10.1038/nbt.3811)に従って、TaALS、TaACCアーゼ、TaEPSPSおよびTaHPPD遺伝子を標的とする塩基編集ベクターを、pTaU6を用いて構築した。とりわけ、TaALS遺伝子における4個の標的単一部位(W1〜W3、W16)、TaALS遺伝子における3個の標的二重部位(W31〜W33)、TaACCアーゼ遺伝子の20個の標的単一部位(W4〜W15、W17〜W24)、TaEPSPS遺伝子の3個の標的単一部位(W25〜W27)およびTaHPPD遺伝子の3個の標的単一部位(W28〜W30)、ならびにTaALS遺伝子およびTaACCアーゼの1個の同時の標的二重部位(W34)とした。本実験におけるsgRNA標的配列を表2に示す。潜在的な耐性突然変異を表4に示す。
実施例2.コメおよびコムギの形質転換
コメ(アグロバクテリウム(Agrobacterium)系形質転換):
pH−nCas9−PBEベクターをアグロバクテリウム株AGL1内へと電気穿孔法によって形質転換した。Zhonghua 11のアグロバクテリウム媒介性形質転換、組織培養および再生をShanら(Shan,Q.et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR−Cas system.Nat.Biotechnol.31,686−688(2013))に従って実施した。ヒグロマイシン選択(50μg/ml)をその後の組織培養すべての間に使用した。
コメ(アグロバクテリウム(Agrobacterium)系形質転換):
pH−nCas9−PBEベクターをアグロバクテリウム株AGL1内へと電気穿孔法によって形質転換した。Zhonghua 11のアグロバクテリウム媒介性形質転換、組織培養および再生をShanら(Shan,Q.et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR−Cas system.Nat.Biotechnol.31,686−688(2013))に従って実施した。ヒグロマイシン選択(50μg/ml)をその後の組織培養すべての間に使用した。
コムギ(粒子衝撃形質転換):
すでに説明されているとおり(Zhang,K.,Liu,J.,Zhang,Y.,Yang,Z.& Gao,C.Biolistic genetic transformation of a wide range of Chinese elite wheat(Triticum aestivum L.)varieties.J.Genet Genomics.42,39−42(2015))、プラスミドDNA(pnCas9−PBEベクターおよびpTaU6ベクターをそれぞれ等しく混合した)を用いて、Kenong 199の胚に粒子を当てた。衝撃後、胚をZhang,Kらに従って加工したが、組織培養中に選択剤を全く使用しなかった。
すでに説明されているとおり(Zhang,K.,Liu,J.,Zhang,Y.,Yang,Z.& Gao,C.Biolistic genetic transformation of a wide range of Chinese elite wheat(Triticum aestivum L.)varieties.J.Genet Genomics.42,39−42(2015))、プラスミドDNA(pnCas9−PBEベクターおよびpTaU6ベクターをそれぞれ等しく混合した)を用いて、Kenong 199の胚に粒子を当てた。衝撃後、胚をZhang,Kらに従って加工したが、組織培養中に選択剤を全く使用しなかった。
実施例3.形質転換した植物についての耐性スクリーニング条件を確立すること
表5に列挙された除草剤を選択して、異なる濃度の除草剤を含有する1/2MS培地を、野生型コメおよび野生型コムギの組織培養の芽ばえをスクリーニングするために調製した。7日後、植物の成長を抑制する最小除草剤濃度を、形質転換した植物のその後のスクリーニングのために選択した。
表5に列挙された除草剤を選択して、異なる濃度の除草剤を含有する1/2MS培地を、野生型コメおよび野生型コムギの組織培養の芽ばえをスクリーニングするために調製した。7日後、植物の成長を抑制する最小除草剤濃度を、形質転換した植物のその後のスクリーニングのために選択した。
実施例4.耐性植物のスクリーニングおよび特定
実施例3において取得された形質転換植物を、対応する除草剤スクリーニング培地(表5)上で成長させ、表現型を観察し、かつ耐性植物を選択した(図1〜図3)。
実施例3において取得された形質転換植物を、対応する除草剤スクリーニング培地(表5)上で成長させ、表現型を観察し、かつ耐性植物を選択した(図1〜図3)。
耐性植物のDNAを抽出した後、T7EIおよびPCR/REを実施した。最後に、標的遺伝子の突然変異をSangerの配列決定によって確認した。
結果として、植物内在性タンパク質ALSおよびACCアーゼにおける次の突然変異を除草剤耐性突然変異として特定した。CからTへの突然変異に加えて、本発明の塩基編集システムは、CからG/Aへの突然変異も生じることができ、そのため、予期せぬ耐性突然変異をスクリーニングした。
Claims (24)
- 除草剤耐性植物、好ましくは導入遺伝子非含有除草剤耐性植物を作出するための方法であって、前記植物内に除草剤耐性関連遺伝子を塩基編集するためのシステムを導入し、それによりガイドRNAが前記植物内の除草剤耐性関連遺伝子の標的配列との塩基編集融合タンパク質を標的とし、結果的に前記標的配列内の1つ以上のヌクレオチド置換を生じることを含み、前記システムが、次の(i)〜(v);
i)塩基編集融合タンパク質およびガイドRNA、
ii)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とガイドRNAとを含む発現コンストラクト、
iii)塩基編集融合タンパク質、およびガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
iv)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
v)塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とガイドRNAをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
のうちの少なくとも1つを含み、前記塩基編集融合タンパク質がヌクレアーゼ不活性型CRISPRヌクレアーゼ(ヌクレアーゼ不活性型Cas9など)ドメインおよびデアミナーゼドメインを含有し、前記ガイドRNAが前記植物ゲノム内での前記除草剤耐性関連遺伝子における標的配列との前記塩基編集融合タンパク質を標的とすることができ、
前記1つ以上のヌクレオチド置換が、前記植物に除草剤耐性を付与し、
場合により、前記方法が、除草剤耐性について前記植物をスクリーニングする工程をさらに含む、方法。 - 前記除草剤耐性関連遺伝子が、PsbA、ALS、EPSPS、ACCアーゼ、PPO、HPPD、PDS、GS、DOXPS、P450から選択される除草剤耐性関連タンパク質についてコードする、請求項1記載の方法。
- 前記塩基編集融合タンパク質が、配列番号10または配列番号11に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
- 前記ガイドRNAが、配列番号19〜配列番号78のうちの1つ以上を標的とする、請求項1記載の方法。
- 前記除草剤耐性関連遺伝子がACCアーゼについてコードし、前記1つ以上のヌクレオチド置換がW2027およびW2027+R2028から選択されるACCアーゼ内アミノ酸置換を結果的に生じ、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号1に示されている、請求項1記載の方法。
- 前記除草剤耐性関連遺伝子がALSについてコードし、前記1つ以上のヌクレオチド置換がP197A、P197F、P197S、P197Y、P197F+R198C、G654E+G655S、G654K+G655S、G654E+G659N、P197F+G654E+G655S、またはこれらのいずれかの組み合わせから選択されるALS内アミノ酸置換を結果的に生じ、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号2に示されている、請求項1記載の方法。
- 前記除草剤耐性関連遺伝子がALSについてコードし、前記ガイドRNAがA122、P197、R198、D204、A205、G654、G655、G659、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸(複数可)をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号2に示されている、請求項1記載の方法。
- 前記除草剤耐性関連遺伝子がACCアーゼについてコードし、前記ガイドRNAがS1768、R1793、A1794、R1825、D1827、L1815、A1816、R1817、A1837、G1854、G1855、D1971、D1972、G1983、P1993、R1994、S2003、A2004、T2005、T2007、A2008、R2028、G2029、T2047、R2070、G2071、A2090、E2091、E2106、S2119、R2220、A1813、E1796、E1797、T1800、L1801、S1849、H1850、D1874、D1875、L2024、E1989、R1990、L2099、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、1つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号1に示されている、請求項1記載の方法。
- 前記除草剤耐性関連遺伝子がEPSPSについてコードし、前記ガイドRNAがT102および/またはA103からなる群から選択される、1つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号4に示されている、請求項1記載の方法。
- 前記除草剤耐性関連遺伝子がHPPDについてコードし、前記ガイドRNAがP277、V364、C413、G414、G415、V366、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、1つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号3に示されている、請求項1記載の方法。
- 除草剤耐性関連タンパク質の変異体を同定する方法であって、前記変異体は、除草剤耐性を植物に付与することができるものであり、
i)除草剤耐性植物を請求項1記載の方法によって作出することと、
ii)結果として生じる除草剤耐性植物における前記除草剤耐性関連遺伝子の配列および/またはコードされた除草剤耐性関連タンパク質の配列を決定し、それにより、前記変異体の配列を同定すること
とを含む、方法。 - 前記除草剤耐性関連除草剤耐性関連タンパク質が、PsbA、ALS、EPSPS、ACCアーゼ、PPO、HPPD、PDS、GS、DOXPS、P450から選択される、請求項11記載の方法。
- 請求項11または請求項12記載の方法によって同定される除草剤耐性関連タンパク質の変異体であって、除草剤耐性を植物に付与することができる、変異体。
- 野生型ACCアーゼと比較して、ACCアーゼ変異体が、1768、1793、1796、1797、1794、1800、1801、1813、1813、1815、1825、1827、1815、1816、1817、1837、1838、1849、1850、1854、1855、1874、1875、1971、1872、1983、1989、1990、1993、1994、2003、2004、2005、2007、2008、2024、2027、2028、2029、2047、2070、2071、2090、2091、2090、2106、2099、2106、2119、2220から選択される、1つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ACCアーゼ変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号1に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ACCアーゼ変異体。
- 野生型ALSと比較して、ALS変異体が、122、197、204、205、653、654、655、659から選択される、1つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ALS変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号2に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ALS変異体。
- 野生型HPPDと比較して、前記HPPDが277、364、366、413、414、415から選択される、1つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、HPPD変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号3に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、HPPD変異体。
- 野生型EPSPSと比較して、前記EPSPSが102および103から選択される、1つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、EPSPS変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号4に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、EPSPS変異体。
- 請求項13から請求項17までのいずれか1項記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
- 調節配列へ操作可能に連結された請求項13から請求項17までのいずれか1項記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
- 請求項13から請求項17までのいずれか1項記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトであって、前記ヌクレオチド配列が調節配列へ操作可能に連結されている、発現コンストラクト。
- 除草剤耐性植物の作出における請求項13から請求項17までのいずれか1項記載の変異体、請求項18記載の単離された核酸、請求項19記載の発現カセット、および請求項20記載の発現コンストラクトの、使用。
- 請求項18記載の単離された核酸、請求項19記載の発現カセット、および/または請求項20記載の発現コンストラクトを植物内へ導入することを含む、除草剤耐性植物を作出する方法。
- 請求項1もしくは請求項22記載の方法によって得られたか、請求項19記載の発現カセットを含むか、あるいは請求項18記載の単離された核酸もしくは請求項20記載の発現コンストラクトを用いて形質転換された、除草剤耐性植物。
- 前記植物が、単子葉植物および双子葉植物から選択され、例えば、前記植物が、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、カノーラ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、ミレー、トウキビ、トマト、タバコ、タピオカ、ジャガイモ、キャベツ、ケール、キュウリ、トマト、カーネーション、ペオニア、バラ、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、カンキツ、モモ、板藍根(Radix isatidis)、リコリス、チョウセンニンジン、トウスケボウフウ(Saposhnikovia divaricata)、およびシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)から選択される、請求項1から請求項10までのいずれか1項記載の方法、請求項13から請求項17までのいずれか1項記載の変異体、請求項21記載の使用、請求項22記載の方法、および請求項23記載の除草剤耐性植物。
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