BR112013019510B1

BR112013019510B1 - Método para obtenção de uma planta de trigo, método para cultivar uma planta de trigo, método para produzir uma planta de trigo, método para identificar uma planta de trigo que é resistente ao herbicida acetil-coa carboxilase, método para conferir resistência a herbicidas accase a uma planta, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucléico, cassete de expressão, método para obtenção de uma planta transgênica e polipeptídeo isolado com atividade accase

Info

Publication number: BR112013019510B1
Application number: BR112013019510-0A
Authority: BR
Inventors: Mike Ostlie; Scott Haley; Philip Westra; Victoria Ashley Valdez
Original assignee: Colorado Wheat Research Foundation, Inc
Priority date: 2011-02-01
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2021-09-21
Also published as: AU2012212301A1; CA2826284A1; EP2670231A1; CN103796507A; US20140250543A1; BR112013019510A2; EA201391113A1; US11130962B2; MX2013008842A; EA030578B1; EP2670231A4; WO2012106321A1; CL2013002178A1; ZA201305738B; AU2012212301B2; US20170166919A1; US20220002745A1; MX347631B; US20190345509A1; US10370678B2

Abstract

MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA PLANTA DE TRIGO CONTENDO INTROGREDIDOS, MÉTODO PARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE TRIGO, MÉTODO PARA IDENTIFICAR UMA PLANTA DE TRIGO QUE É RESISTENTE AO HERBICIDA ACETIL-COA CARBOXILASE, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA PLANTA COM UMA SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO ACCASE MODIFICADO, MÉTODO PARA CONFERIR RESISTÊNCIA A HERBICIDAS ACCASE A UMA PLANTA, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUCTO DE ÁCIDO, CASSETE DE EXPRESSÃO, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO COM ATIVIDADE ACCASE A presente invenção proporciona composições e métodos para a produção de plantas de cultivo resistentes a herbicidas. Em particular, a presente invenção proporciona plantas de trigo, tecidos vegetais e sementes de plantas que contêm genes acetil-CoA carboxilase (ACCase) alterados e proteínas que são resistentes à inibição por herbicidas que normalmente inibem a atividade da proteína ACCase.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade para pedidos provisórios dos EUA N°s 61/438,294 depositado em 01 de fevereiro de 2011 e 61/553,830 depositado em 31 de outubro de 2011, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção proporciona composições e métodos para a produção de plantas de cultivo resistentes a herbicidas. Em particular, a presente invenção proporciona plantas de trigo, tecidos vegetais e sementes de plantas que contêm genes acetil-CoA carboxilase (ACCase) modificados e proteínas e são resistentes à inibição por herbicidas que normalmente inibem a atividade da proteína ACCase.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] O trigo é cultivado em todo o mundo e é o cereal mais amplamente adaptado. Trigos comuns são usados em uma variedade de produtos alimentares, tais como pão, biscoitos, bolos, bolachas e macarrões. Em geral, as classes de trigo duro são moídas em farinha utilizada para pães e as classes de trigo mole são moídas em farinha utilizada para bolos e biscoitos. O amido de trigo é usado nas indústrias de alimentos e de papel, como amidos de roupa, e em outros produtos.

[0004] A principal ameaça à produção de trigo comercial é a competição de plantas daninhas, resultando em diminuição da produção de grãos e na qualidade inferior de grãos. Embora o cultivo possa ser usado para eliminar ervas daninhas, o solo dos campos lavrados é altamente vulnerável a erosão eólica e hídrica. Devido à facilidade de aplicação e eficácia, o tratamento por herbicida é o método preferido de controle de ervas daninhas. Herbicidas também permitem controle de plantas daninhas em cultivo mínimo ou sistemas de cultivo por semeadura direta destinados a deixar altos níveis de resíduos na superfície do solo para evitar a erosão. A competição de ervas daninhas em trigo mais importante vem de gramíneas altamente relacionadas, tais como aveia selvagem e goatgrass juntas, e é difícil conceber estratégias de controle de produtos químicos eficazes para espécies de plantas daninhas problemáticas relacionadas com o ciclo de cultivo uma vez que elas tendem a partilhar sensibilidades a herbicidas. Uma abordagem para solucionar este problema envolve o desenvolvimento de variedades resistentes a herbicidas. Neste sistema, o herbicida é aplicado "na colheita" para controlar ervas daninhas, sem prejudicar as plantas de cultura tolerantes a herbicidas.

[0005] O desenvolvimento da resistência a herbicidas em plantas oferece uma produção significativa e vantagens econômicas, tais como, o uso de herbicidas para controle de plantas daninhas ou plantas em culturas que tornou-se quase uma prática universal. No entanto, a aplicação de tais herbicidas pode também resultar em morte ou redução do crescimento da planta de colheita desejada, fazendo o tempo e o método de aplicação do herbicida críticos ou, em alguns casos, impraticáveis.

[0006] De particular interesse para agricultores é o uso de herbicidas com maior potência, eficácia de amplo espectro de ervas daninhas e rápida degradação do solo. Plantas, tecidos de plantas e sementes com resistência a estes compostos proporcionariam uma solução atraente, permitindo que os herbicidas sejam utilizados para controlar o crescimento de ervas daninhas, sem risco de danos para a safra. Uma dessas classes de herbicidas de largo espectro é aquela dos compostos que inibem a atividade da enzima acetil-CoA carboxilase (ACCase) em uma planta. Tais herbicidas são incluídos nas famílias químicas ariloxifenoxipropionato (FOP) e ciclo- hexanodiona (DIM). Por exemplo, o trigo é suscetível a muitos herbicidas inibidores da ACCase que objetivam as espécies de monocotiledôneas alvo, fazendo com que o uso destes herbicidas para controlar ervas daninhas gramíneas seja quase impossível.

[0007] Devido à importância do trigo como uma planta de colheita a nível mundial, existe uma necessidade por híbridos de trigo que sejam resistentes aos efeitos inibidores de herbicidas ACCase, permitindo assim um maior rendimento da colheita, quando esses herbicidas são utilizados para controlar ervas daninhas de gramíneas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] A presente invenção proporciona composições e métodos para a produção de plantas de trigo que são resistentes a herbicidas. Em particular, a presente invenção proporciona plantas de trigo, variedades, linhagens e híbridos, bem como tecidos vegetais e sementes de plantas que contêm genes acetil-CoA carboxilase (ACCase) alterados e proteínas que são resistentes à inibição por herbicidas que normalmente inibem a atividade da proteína ACCase.

[0009] O trigo cultivado é suscetível a muitos herbicidas inibidores da ACCase que objetivam monocotiledôneas ou espécies de plantas daninhas de gramíneas. No entanto, tal como aqui descrito um genótipo de trigo foi criado que apresenta tolerância aos herbicidas inibidores da ACCase. A análise genética identificou diferenças genéticas dentro de um germoplasma de trigo mutante que resultam em um fenótipo de resistência ao herbicida ACCase.

[0010] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma ou mais plantas de trigo, cujo germoplasma compreende uma mutação que torna a planta tolerante a herbicidas ACCase. Além disso, em outras concretizações a invenção refere-se à descendência (por exemplo, F1, F2, F3, etc), de um cruzamento da referida planta, em que o germoplasma da referida descendência tem a mesma mutação que a planta-mãe. Portanto, concretizações da presente invenção fornecem para as variedades de trigo/híbridos cujo germoplasma contém uma mutação, de tal modo que o fenótipo das plantas resistentes a herbicidas é ACCase. Em algumas concretizações, a dita descendência (por exemplo, F1, F2, F3, etc) é o resultado de um cruzamento entre as linhagens de elite de trigo, pelo menos uma das quais contém um germoplasma compreendendo uma mutação que torna a planta tolerante a herbicidas ACCase.

[0011] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma planta de trigo em que o dito germoplasma de trigo confere resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase nos níveis dos ditos um ou mais herbicidas que normalmente inibem o crescimento de uma planta de trigo. Em algumas concretizações, os ditos um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase são de famílias químicas ariloxifenoxipropionatos (FOP) e ciclo-hexanodiona (DIM). Em algumas concretizações, o dito germoplasma de plantas de trigo que conferem resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase compreende uma ou mais mutações no gene da acetil-CoA carboxilase como encontrado em AF28-A, AF26-B e / ou D-AF10, (ATCC Nos. ).

[0012] Em uma outra concretização, a presente invenção proporciona um método para controlar ervas daninhas na proximidade de uma planta de trigo, ou uma população de plantas, compreendendo fornecer um ou mais herbicidas acetil- CoA carboxilase, aplicando os ditos um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase a um campo compreendendo uma planta de trigo ou população de plantas de trigo, e controlando ervas daninhas na vizinhança da referida planta de trigo ou na população de plantas de trigo tais que o crescimento de ervas daninhas é adversamente afetado pela aplicação dos ditos um ou mais herbicidas e o crescimento da referida planta de trigo ou população da mesma não é adversamente afetado. Em algumas concretizações, os ditos um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase são de famílias químicas ariloxifenoxipropionatos (FOP) e ciclo-hexanodiona (DIM). Em algumas concretizações, a referida planta de trigo ou populações de plantas de trigo compreendem uma ou mais mutações no gene da acetil-CoA carboxilase como encontrado em AF28-A, AF26-B e / ou AF10-D (ATCC Nos. ).

[0013] Em uma outra concretização, a presente invenção proporciona um híbrido de trigo, variedade ou linhagem, em que o referido híbrido de trigo, variedade ou linhagem compreende germoplasma compreendendo uma ou mais mutações no gene da acetil-CoA carboxilase de tal modo que a resistência a um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase é conferida ao referido híbrido, linhagem ou variedade. Em algumas concretizações, o dito híbrido de trigo, variedade ou linhagem é criado por introgressão de germoplasma de trigo que compreende a referida uma ou mais mutações para conferir resistência a um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase. Em algumas concretizações, o dito híbrido de trigo, variedade ou linhagem é criado pela incorporação de um gene heterólogo que compreende uma ou mais mutações para conferir resistência a um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase.

[0014] Em uma outra concretização, a presente invenção proporciona um método para a produção de um híbrido de trigo, variedade ou linhagem resistente a um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase que compreende a identificação de um germoplasma conferindo a referida resistência a herbicida, em que o referido germoplasma resistente a herbicida deriva de uma planta de trigo resistente a herbicidas e introduzindo o dito germoplasma em uma planta híbrida elite de trigo, linhagem ou variedade. Em algumas concretizações, a dita introdução do dito germoplasma na dita planta híbrida elite de trigo, linhagem ou variedade é por introgressão. Em algumas concretizações, a dita introdução do dito germoplasma na referida planta de trigo híbrido de elite, linhagem ou variedade é por introdução de um gene heterólogo.

[0015] Ainda em uma outra concretização, a presente invenção proporciona um híbrido de trigo, variedade ou linhagem, em que o germoplasma do referido híbrido, linhagem ou variedade compreende resistência a um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase e resistência a um ou mais compostos a partir de um ou mais grupos herbicidas que não são inibidores de acetil-CoA carboxilase.

[0016] Ainda em uma outra concretização, a presente invenção proporciona um método para identificar linhagens de plantas de trigo resistentes à herbicidas acetil-CoA carboxilase que compreendem o fornecimento de uma amostra de ácido nucléico a uma planta de trigo, fornecendo iniciadores de amplificação para amplificar uma região do genoma de uma planta de trigo correspondente a um gene acetil -CoA carboxilase presente na referida amostra de ácido nucléico, aplicando-se os referidos iniciadores de amplificação à referida amostra de ácido nucléico de tal modo que a amplificação da referida região do referido gene da acetil-CoA carboxilase ocorre, e identificando as plantas de trigo resistentes à herbicidas acetil-CoA carboxilase com base na presença de uma ou mais mutações que conferem a resistência a herbicida acetil-CoA carboxilase presente na referida amostra de ácido nucléico amplificado.

[0017] Ainda em uma outra concretização, a presente invenção proporciona sementes de trigo em que o referido germoplasma das referidas sementes compreende um gene da acetil-CoA carboxilase mutante de tal forma que a referida mutação confere resistência à inibição por herbicidas acetil- CoA carboxilase. Em algumas concretizações, o germoplasma das referidas sementes de trigo compreendem um gene da acetil-CoA carboxilase mutante como encontrado em AF28-A, AF26-B e / ou D-AF10 (ATCC Nos. ). Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona plantas de trigo cultivadas a partir de sementes e ainda outras partes de plantas que compreendem as referidas plantas de trigo crescidas a partir da referida semente. Em algumas concretizações, o gene da acetil-CoA carboxilase mutante é um fragmento funcional do gene como encontrado em AF28-A, AF26-B e/ou AF10-D (ATCC Nos. ), de tal forma que o fragmento do gene codifica um fragmento de proteína que é suficiente para conferir resistência à inibição por herbicidas de acetil-CoA carboxilase de uma planta de trigo. Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona plantas de trigo que crescem a partir de sementes e ainda partes de plantas que compreendem as referidas plantas de trigo crescidas a partir da referida semente.

[0018] Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona sequências de ácidos nucléicos purificadas e isoladas a partir de trigo, que codificam acetil-CoA carboxilase. De acordo com a invenção, sequências de tipo selvagem que codificam acetil-CoA-carboxilase foram identificadas a partir do genoma B, D, e A, (SEQ ID NOS: 1, 2, e 3, respectivamente). Além disso, mutações de cada genoma foram identificadas as quais proporcionam resistência ao herbicida acetil-CoA carboxilase, SEQ ID NOS: 4, 5 e 6, respectivamente. A mutação representa uma mudança de Ala para Val na posição do aminoácido 2004 (como referenciado por referências de grama preta padrão gi|199600899|emb|AM408429.1| e gi|199600901|emb|AM408430.1 Sequência ID NOS: 13, 14 e 15 16, ver também Figura 9), para cada genoma, genoma A, (SEQ ID NO: 8); genoma B, (SEQ ID NO: 10), genoma D, (SEQ ID NO: 12). A invenção também inclui aminoácidos codificados por essas sequências, incluindo SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, bem como as variantes modificadas de forma conservadora, e fragmentos, que retêm a atividade ACCase, bem como os mutantes que conferem resistência ao herbicida acetil-CoA carboxilase.

[0019] Assim, as composições da invenção incluem um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) a sequência de aminoácidos que compreende SEQ ID NO: 7, 9 ou 11 e SEQ ID NOS: 8, 10 ou 12 e (b) a sequência de aminoácidos que compreende, pelo menos, 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, 9, 11 ou SEQ ID NOS: 8, 10 ou 12, em que o referido polipeptídeo tem atividade ACCase ou proporciona resistência ao herbicida acetil-CoA carboxilase.

[0020] A invenção também inclui uma planta de trigo, que compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga, que é pelo menos 70% homóloga, pelo menos 80% homóloga, pelo menos 85% homóloga, pelo menos 90% homóloga, pelo menos 95% de homologia, pelo menos 97% homóloga ou, pelo menos, 99% homóloga à sequência de acetil-CoA carboxilase da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 ou como estabelecido em AF28-A, AF26_B, e/ou AF10-D (ATCC nos. ). Em algumas concretizações, a sequência de acetil-CoA carboxilase codifica ou compreende uma ou mais substituições de aminoácidos, por exemplo, Ala2004Val como encontrado na SEQ ID NO: 8, como encontrada na SEQ ID NO: 10 ou como encontrada na SEQ ID NO: 12.

[0021] Em uma concretização, a presente invenção proporciona ainda plantas híbridas de trigo que têm todas as características morfológicas e fisiológicas da referida planta de trigo cultivada a partir da referida semente de trigo. Em outras concretizações, a presente invenção proporciona culturas de tecidos e culturas de tecidos regeneradas que surgem a partir da referida semente de trigo ou a referida parte da planta do trigo, que compreende uma mutação no referido gene da acetil-CoA carboxilase como encontrado em AF28-A, AF26-B e/ou AF10-D (ATCC Nos. ).

[0022] Em uma concretização, a presente invenção proporciona um método de produção de sementes de trigo que compreende cruzar uma planta compreendendo um gene de acetil- CoA carboxilase mutante como encontrado em AF28-A, AF26-B e/ou AF10-D (ATCC Nos. ) com ela própria ou uma segunda planta de trigo e coletando sementes do dito cruzamento. Em algumas concretizações, os métodos para produzir a referida semente de trigo compreendem a plantação de uma linhagem-mãe de sementes de trigo em que a referida linhagem-mãe de sementes compreende um germoplasma, que confere resistência a herbicidas acetil-CoA carboxilase com uma linhagem de trigo polinizadora parental em que a referida polinização e/ou linhagem de germoplasma de sementes compreende um germoplasma que confere resistência a herbicidas acetil-CoA carboxilase, crescendo a referida semente-mãe e as plantas de trigo polinizadoras em conjunto, permitindo às referidas plantas de sementes-mãe serem polinizadas pelas referidas plantas polinizadoras-mãe, e colhendo as sementes, que resultaram a partir da referida polinização.

[0023] Ainda em uma outra concretização, a invenção proporciona plantas de trigo geneticamente modificadas que incorporam um constructo de nucleotídeos heterólogo, incluindo as SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 operacionalmente ligadas a sequências reguladoras, tais como cassetes de expressão, constructos de inibição, plantas, células de plantas e sementes. As plantas geneticamente modificadas, células de plantas e sementes da invenção podem apresentar alterações fenotípicas, tais como ACCase modulada ou níveis de ACCase mutantes.

[0024] São fornecidos métodos para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptídeo ACCase em uma planta, que compreende a introdução na planta de um polinucleotídeo selecionado. Em métodos específicos, proporcionar o polinucleotídeo diminui o nível de ACCase na planta.

[0025] Também são fornecidos métodos para aumentar o nível de um polipeptídeo mutante ACCase em uma planta tanto constitutivamente ou em períodos regulados especificamente e tecidos que compreendem a introdução na planta de um polinucleotídeo selecionado com elementos reguladores adequados. Em métodos específicos, a expressão do polinucleotídeo mutante ACCase melhora a tolerância da planta a herbicidas ACCase.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026] A Figura 1 é uma fotografia da primeira planta tolerante a herbicidas descoberta. Esta planta sobreviveu a duas aplicações letais de herbicidas clethodim.

[0027] A Figura 2 é uma fotografia de plantas M3 cultivadas a partir da semente dos dois parentais M2. As plantas foram tratadas com duas doses sequenciais de uma dose letal de quizalofop. As plantas do lado esquerdo sobreviveram a ambas as aplicações de herbicidas, as plantas do lado direito morreram após uma aplicação.

[0028] A Figura 3 é uma fotografia de um estudo de resposta à dose que exibe a maior tolerância das plantas mutantes selecionadas para herbicida quizalofop na geração M3 em comparação com o trigo de inverno não-mutado Hatcher. Colunas 1, 3 e 4 são plantas selecionadas para aumentar a tolerância ao herbicida; coluna 2 é trigo de inverno não mutagenizado Hatcher.

[0029] A Figura 4 são as sequências dos genes ACCase dos genomas A, B e D e um gene mutante ACCase AF28, o mutante AF26-B e o gene mutante AF10-D.

[0030] A Figura 5 é um gráfico que descreve a toxicidade visual dos mutantes M3 derivados de M2 triados com quizalofop. Valores abaixo da linha horizontal são diferentes da verificação do Hatcher não mutagenizado, representados pela barra da esquerda.

[0031] A Figura 6 é um gráfico que descreve um ensaio de resposta à dose com quizalofop comparando a verificação de Hatcher não mutagenizado, representado pela barra da esquerda, com adesões M3 M2-selecionados.

[0032] A Figura 7 é um gráfico que mostra uma comparação de sequências de tipo selvagem e ACCase mutantes no genoma do trigo A, B, D, incluindo um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) não sinônimo em cada sequência mutante.

[0033] A Figura 8 é um gráfico que mostra uma comparação da tolerância a enzima ACCase a concentrações crescentes de quizalofop.

[0034] A Figura 9 apresenta o alinhamento das sequências da invenção para sequência de referência da grama preta e para outras.

DEFINIÇÕES

[0035] A fim de proporcionar uma compreensão clara e consistente do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o âmbito dado a esses termos, as seguintes definições são fornecidas. Unidades, prefixos e símbolos podem ser denotados em sua forma aceita SI. Salvo indicação em contrário, os ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita em orientação 5' para 3'; sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carboxi, respectivamente. Gamas numéricas são inclusivas dos números que definem a gama e incluem cada número inteiro dentro do intervalo definido. Aminoácidos podem ser referidos no presente documento quer pelos seus símbolos vulgarmente conhecidos de três letras ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão da Nomenclatura Bioquímica IUPAC- IUB. Nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos pelos respectivos códigos de uma letra comumente aceitos. Salvo disposição em contrário, termos de software, elétrica, e eletrônica como aqui utilizados são como definidos no The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5a edição, 1993) . Os termos definidos a seguir são mais completamente definidos por referência à especificação como um todo.

[0036] O termo "variantes modificadas de forma conservadora" aplica-se a ambas as sequências de aminoácidos e de ácidos nucléicos. No que diz respeito a determinadas sequências de ácidos nucléicos, as variantes modificadas de forma conservadora referem-se aos ácidos nucléicos que codificam as variantes modificadas de forma conservadora ou idênticas às sequências de aminoácidos. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácidos nucléicos são "variações silenciosas" e representam uma espécie de variação modificada conservadora. Cada sequência de ácido nucléico aqui que codifica para um polipeptídeo também, por referência ao código genético, descreve qualquer possível variação silenciosa do ácido nucléico. Um técnico na arte reconhecerá que cada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, que é normalmente o único códon para metionina e UGG, que é normalmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para originar uma molécula idêntica funcionalmente. Assim, cada variação silenciosa de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da presente invenção está implícita em cada sequência descrita do polipeptídeo e está dentro do âmbito da presente invenção.

[0037] Tal como com as sequências de aminoácidos, um técnico na arte reconhecerá que substituições individuais, deleções ou adições de um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo ou sequência de proteína que altera, adiciona ou elimina um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada são uma "variante modificada de forma conservadora", onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. Portanto, qualquer número de resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo dos inteiros de 1 a 15 pode ser alterado. Assim, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 7, ou 10 alterações podem ser feitas. Variantes modificadas conservadoramente tipicamente proporcionam uma atividade biológica semelhante à da sequência de polipeptídeo não modificado a partir dos quais eles são derivados. Tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica.

[0038] Os seis grupos seguintes contêm, cada um, aminoácidos que são substituições conservativas umas das outras: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

[0039] Veja também, Creighton (1984) Proteins WH Freeman and Company. A referência a uma sequência aqui deve ser interpretada como incluindo as variantes modificadas de forma conservadora.

[0040] Por "codificação"ou "codificada", no que diz respeito a um ácido nucléico especificado, destina-se a compreender a informação de tradução para a proteína especificada. Um ácido nucléico que codifica uma proteína pode compreender sequências não traduzidas (por exemplo, íntrons) dentro de regiões traduzidas do ácido nucléico, ou podem faltar tais sequências intervenientes não traduzidas (por exemplo, como no cDNA). A informação através da qual uma proteína é codificada é especificada através da utilização de códons. Tipicamente, a sequência de aminoácidos é codificada pelo ácido nucléico, utilizando o código genético "universal". No entanto, variantes do código universal, tal como estão presentes em algumas plantas, animais, fungos e mitocôndrias, a bactéria Mycoplasma capricolum, ou o Macronúcleo ciliado, podem ser utilizadas quando o ácido nucléico é aí expresso.

[0041] Quando o ácido nucléico é preparado ou alterado sinteticamente, se pode tirar vantagem de preferências de códons conhecidos do hospedeiro pretendido, onde o ácido nucléico deve ser expresso. Por exemplo, embora as sequências de ácido nucléico da presente invenção possam ser expressas tanto em espécies de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, as sequências podem ser modificadas para ter em conta as preferências de códons específicos e preferências de conteúdo GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, como estas preferências foram mostradas para diferir (Murray et al. Nucl. Acids. Res. 17:477-498 (1989)).

[0042] Tal como aqui utilizado, "heterólogo", em referência a um ácido nucléico é um ácido nucléico que se origina a partir de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificado a partir da sua forma nativa na composição e/ou locus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor ligado operacionalmente a um gene estrutural heterólogo é de uma espécie diferente daquela a partir da qual o gene estrutural foi derivado, ou, se da mesma espécie, um ou ambos sejam substancialmente modificados a partir de sua forma original. Uma proteína heteróloga pode ter origem a partir de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma original por intervenção humana deliberada.

[0043] Por "célula hospedeira"é significado uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor. Células hospedeiras podem ser células procariotas, tais como E. coli, ou células eucarióticas, tais como leveduras, insetos, anfíbios, e células de mamíferos. De preferência, as células hospedeiras são células de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Uma célula hospedeira de monocotiledônea particularmente preferida é uma célula hospedeira de milho.

[0044] O termo "introduzida", no contexto de inserção de um ácido nucléico numa célula, significa "transfecção"ou "transformação"ou "transdução"e inclui a referência à incorporação de um ácido nucléico numa célula eucariótica ou procariótica, onde o ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossoma, DNA de plasmídeo, plastídio ou mitocondrial), convertido numa replicação autônoma, ou expresso transitoriamente (por exemplo, mRNA transfectado).

[0045] O termo "isolado" refere-se ao material, tal como um ácido nucléico ou uma proteína, o qual é: (1) substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com ele conforme encontrado no seu ambiente natural. O material isolado inclui, opcionalmente, material não encontrado com o material no seu ambiente natural, ou (2) se o material está no seu ambiente natural, o material tenha sido sinteticamente (não naturalmente) alterado por intervenção humana deliberada para uma composição e/ou colocado numa localização na célula (por exemplo, genoma ou organela subcelular) não nativa para um material encontrado nesse ambiente. A alteração para produzir o material sintético pode ser realizada sobre o material, dentro ou retirado do seu estado natural. Por exemplo, um ácido nucléico de ocorrência natural torna-se um ácido nucléico isolado, se for alterado, ou se é transcrito a partir de DNA que tenha sido alterado, por meio de intervenção humana realizada dentro da célula a partir da qual se originou. Ver, por exemplo, Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, Patente dos EUA No. 5,565,350; In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling et al., PCT/US93/03868. Da mesma forma, um ácido nucléico de ocorrência natural (por exemplo, um promotor), se isola se for introduzido por meios que não ocorrem naturalmente para um locus do genoma não nativo do que para o ácido nucléico. Os ácidos nucléicos que são "isolados", tal como aqui definido, são também referidos como ácidos nucléicos "heterólogos".

[0046] Tal como aqui utilizado, "ácido nucléico"inclui a referência a um polímero desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo quer na forma de fita simples ou de cadeia dupla, e, a menos que de outro modo limitado, engloba análogos conhecidos possuindo a natureza essencial dos nucleotídeos naturais que hibridizam com ácidos nucléicos de cadeia simples de um modo semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, ácidos nucléicos peptídicos).

[0047] Por "biblioteca de ácido nucléico"entende-se uma coleção de moléculas de DNA ou de cDNA isolado que compreendem e representam substancialmente toda a fração transcrita de um genoma de um organismo específico. Construção de bibliotecas de ácidos nucléicos exemplares, tais como bibliotecas genômicas e de cDNA, é ensinado nas referências padrão de biologia molecular, tais como Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, Califórnia (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2 aedição, vol. 1-3 (1989); e Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc. (1994).

[0048] Tal como aqui utilizado "operacionalmente ligado" inclui a referência a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e media a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as sequências de ácidos nucléicos a serem ligadas são contíguas e, quando necessário para unir duas regiões codificantes de proteínas, contíguas e no mesmo quadro de leitura.

[0049] Salvo indicação em contrário, o termo "ácido nucléico ACCase" significa um ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo (um "polinucleotídeo ACCase") codificando um polipeptídeo ACCase com atividade ACCase e inclui todas as variantes modificadas de forma conservadora, homólogos parálogos e afins. Um "gene ACCase"é um gene da presente invenção e refere-se a uma forma genômica heteróloga de um polinucleotídeo ACCase de comprimento completo.

[0050] Tal como aqui utilizado, o termo "planta" pode incluir uma referência a plantas inteiras, partes de plantas ou órgãos (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc), células de plantas, sementes e descendentes dos mesmos. Célula vegetal, tal como aqui utilizado, inclui, ainda, sem limitação, células obtidas a partir de ou encontrados em: sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecidos de calos, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. Células de plantas também podem ser entendidas para incluir células modificadas, como por exemplo, protoplastos, obtidos a partir dos tecidos acima referidos. A classe de plantas que pode ser utilizada nos métodos da invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores passíveis de técnicas de transformação, incluindo tanto plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Plantas particularmente preferidas incluem milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada e painço.

[0051] Tal como aqui utilizado, "polinucleotídeo"inclui referência a um deoxirribopolinucleotídeo, ribopolinucleotídeo, ou seus análogos que têm a natureza essencial de um ribonucleotídeo natural em que hibridizam, sob condições de hibridização rigorosas, com substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos como nucleotídeos que ocorrem naturalmente e/ou permitem a tradução para o mesmo aminoácido(s) como a(s) sequência(s) de nucleotídeo(s) que ocorre(m) naturalmente. Um polinucleotídeo pode ser de comprimento total ou uma subsequência de um gene nativo, estrutural heterólogo ou regulador. Salvo indicação em contrário, o termo inclui referência à sequência especificada, bem como a sua sequência complementar. Assim, DNAs ou RNAs com cadeias modificadas para estabilidade ou por outras razões como "polinucleotídeos", como esse termo, são aqui pretendidos. Além disso, os DNAs ou RNAs compreendendo bases não usuais, tais como inosina, ou bases modificadas, tais como bases tritilado, para citar apenas dois exemplos, são polinucleotídeos como o termo é aqui utilizado. Será apreciado que uma grande variedade de modificações tem sido feita para DNA e RNA que servem para muitos fins úteis conhecidos dos peritos na arte. O termo polinucleotídeo como é aqui empregado engloba tais formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos, assim como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo, entre outras coisas, células simples e complexas.

[0052] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo"e "proteína" são utilizados alternadamente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um produto químico artificial análogo de um aminoácido correspondente que ocorre naturalmente, bem como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. A natureza essencial desses análogos de aminoácidos de ocorrência natural é que, quando incorporados em uma proteína, a proteína é especificamente reativa com anticorpos produzidos para as mesmas proteínas mas que consiste inteiramente em aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os termos "polipeptídeo", "peptídeo"e "proteína" são também incluídos em modificações, incluindo, mas não limitado a, glicosilação, ligação de lipídeos, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação. Será apreciado, como é bem conhecido e, como mencionado acima, que os polipeptídeos não são inteiramente lineares. Por exemplo, polipeptídeos podem ser ramificados como resultado de ubiquitinação, e podem ser circulares, com ou sem ramificação, geralmente como resultado de acontecimentos pós-tradução, incluindo o caso de processamento natural e eventos provocados por manipulação humana que não ocorram naturalmente. Polipeptídeos circulares, ramificados e circulares ramificados podem ser sintetizados por processos naturais não-tradução bem como por métodos totalmente sintéticos. Além disso, esta invenção contempla a utilização de ambas as variantes amino-terminais da proteína da invenção contendo metionina e menos metionina.

[0053] Como aqui utilizado, "promotor" inclui referência a uma região de DNA a montante do início da transcrição e envolvida no reconhecimento e ligação da RNA-polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um "promotor vegetal"é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais ou a sua origem não é uma célula de planta. Exemplos de promotores de plantas incluem, mas não estão limitados a, aqueles que são obtidos a partir de plantas, vírus de plantas, e bactérias, que compreendem os genes expressos em células de plantas, tais como Agrobacterium ou Rhizobium. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição preferencialmente em determinados tecidos, tais como folhas, raízes, ou sementes. Tais promotores são referidos como "tecido preferido". Promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como "específicos para tecidos". Um promotor específico "tipo de célula"conduz expressão principalmente em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível"ou "repressor"é um promotor que está sob o controle do ambiente. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores indutíveis incluem condições anaeróbias ou a presença de luz. Promotores preferidos de tecido, específicos de tipos celulares, e induzíveis, constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo"é um promotor que é ativo na maioria das condições ambientais.

[0054] Como aqui utilizado, "recombinante" ou "geneticamente modificado" inclui a referência a uma célula ou um vetor, que foi modificado pela introdução de um ácido nucléico heterólogo, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, células recombinantes ou geneticamente modificadas expressam genes que não são encontrados dentro de uma forma idêntica à forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que de outra forma anormalmente expressos, sub-expresso ou não é expresso em todos como um resultado da intervenção humana deliberada. O termo aqui utilizado como "recombinante" ou "geneticamente modificado"não engloba a alteração da célula ou vetor por eventos que ocorrem naturalmente (por exemplo, mutação espontânea, transformação natural/transdução/transposição), tais como aqueles que ocorrem sem a intervenção humana deliberada.

[0055] Como aqui utilizado, um "cassete de expressão" é um constructo de ácido nucléico gerado recombinantemente ou sinteticamente, com uma série de elementos de ácido nucléico especificados que permitem a transcrição de um determinado ácido nucléico numa célula hospedeira. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado num plasmídeo, cromossoma, DNA mitocondrial, DNA plastidial, vírus, ou fragmento de ácido nucléico. Tipicamente, a porção recombinante do cassete expressão de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, um ácido nucléico a ser transcrito e um promotor.

[0056] Os termos "resíduo"ou "resíduo de aminoácido"ou "aminoácido" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a um aminoácido que é incorporado numa proteína, polipeptídeo ou peptídeo (coletivamente "proteína"). O aminoácido pode ser um aminoácido que ocorre naturalmente e, a menos que de outro modo limitado, pode incluir análogos não naturais de aminoácidos naturais que podem funcionar de uma maneira semelhante como aminoácidos que ocorrem naturalmente.

[0057] O termo "hibridiza seletivamente" inclui referência a hibridização, sob condições rigorosas de hibridização, de uma sequência de ácido nucléico para uma sequência de ácido nucléico alvo específico para um grau detectavelmente maior (por exemplo, pelo menos duas vezes mais) do que a sua hibridização com sequências de ácido nucléico não-alvo e para a exclusão substancial dos ácidos nucléicos não alvo. Hibridizar seletivamente sequências normalmente tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, de preferência 90% de identidade de sequência, e mais preferencialmente 100% de identidade de sequência (ou seja, complementarmente) com a outra.

[0058] O termo "condições rigorosas" ou "condições de hibridização rigorosas" inclui a referência a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar com a sua sequência alvo, a um grau detectavelmente maior do que com outras sequências (por exemplo, pelo menos duas vezes mais). Condições rigorosas são dependentes de sequencia e diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando o rigor da hibridização e/ou condições de lavagem, sequências-alvo podem ser identificadas que são 100% complementares da sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algumas inadequações em sequências de modo a que sejam detectados graus inferiores de semelhança (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menos do que cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, opcionalmente, menos de 500 nucleotídeos de comprimento.

[0059] Tipicamente, condições de estringência serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de íons Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íons Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30° C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60° C para sondas longas (por exemplo, maior do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser conseguidas com a adição de agentes de desestabilização tal como a formamida. Exemplos de condições de baixa estringência incluem hibridização com um tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37° C e uma lavagem em SSC 1X a 2X (20xSSC = 3,0 M NaCl/0.3 M de citrato trissódico) a 50 a 55° C. Exemplos de condições de estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37° C e uma lavagem em 0,5 X a 1X SSC a 55 a 50° C. Exemplos de condições de estringência elevada incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37° C e uma lavagem em 0,1 X SSC a 60 a 65° C durante 20 minutos.

[0060] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA- DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem., 138:267-284 (1984): Tm =81.5° C.+16.6 (log M)+0.41 (% GC)-0.61 (% form)-500/L; onde M é a molaridade dos cátions monovalentes, % GC é a percentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a percentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% da sequência-alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente correspondente. Tm é reduzida em cerca de 1° C por cada 1% de inadequações, portanto, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com sequências da identidade desejada. Por exemplo, se as sequências com .gtoreq.90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída a 10° C. Geralmente, condições de estringência são selecionadas para serem cerca de 5° C inferior ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica e o seu complemento a uma força iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, 4, 5, ou 6° C inferior ao ponto de fusão térmico (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 6, 7, 8, 9, ou 10° C inferior ao ponto de fusão térmico (Tm); condições de baixa severidade podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20° C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (Tm). Utilizando a equação, as composições de hibridização e de lavagem, e Tm desejada, os versados compreenderão que variações no rigor da hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de inadequação resulta numa Tm inferior a 45° C (solução aquosa) ou a 32° C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos encontra-se em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acids Probes, Parte I, Capítulo 2, Ausubel et al, Eds, Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque (1995). Em geral, uma lavagem de rigor elevado é 2X 15 min em 0,5 X SSC contendo SDS a 0,1%, a 65° C.

[0061] Tal como aqui utilizado, "planta transgênica" e "planta geneticamente modificada" inclui a referência a uma planta que compreende dentro do seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado estavelmente dentro do genoma de tal forma que o polinucleotídeo é passado a gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado dentro do genoma sozinho ou como parte de um cassete de expressão. "Transgênico"ou "geneticamente modificado"é aqui utilizado para incluir qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte da planta ou planta, o genótipo que foi alterado pela presença de ácido nucléico heterólogo, incluindo aquelas transgênicas inicialmente tão alteradas, bem como aquelas criadas por meio de cruzamentos sexuais ou de propagação assexuada da transgênica inicial. O termo "transgênico"ou "geneticamente modificado" como aqui utilizado não engloba a alteração do genoma (cromossômico ou extra-cromossômico) por meio de métodos convencionais de melhoramento de plantas, ou por eventos de ocorrência natural tais como a fertilização cruzada, infecção viral não recombinante, transformação bacterial não recombinante, transposição não-recombinante, ou mutação espontânea.

[0062] Tal como aqui utilizado, "vetor" inclui a referência a um ácido nucléico utilizado na transfecção de uma célula hospedeira e em que pode ser inserido num polinucleotídeo. Vetores são muitas vezes replicons. Vetores de expressão permitem a transcrição de um ácido nucléico aí inserido.

[0063] Os seguintes termos são usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais ácidos nucléicos ou polinucleotídeos: (a) "sequência de referência", (b), "janela de comparação", (c) "identidade de sequência", "percentagem de identidade de sequência", e (e) "identidade substancial".

[0064] Tal como aqui se utiliza, "sequência de referência" é uma sequência definida usada como base para a comparação de sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada, por exemplo, como um segmento de uma sequência de cDNA ou gene ou o cDNA completo, ou a sequência de cDNA.

[0065] Tal como aqui utilizado, "janela de comparação"inclui a referência a um segmento contíguo e especificado de uma sequência de polinucleotídeo, em que a sequência de polinucleotídeo pode ser comparada com uma sequência de referência, e em que a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, lacunas) comparativamente com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para um alinhamento ótimo das duas sequências. Geralmente, a janela de comparação de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos em comprimento, e opcionalmente pode ser 30, 40, 50, 100, ou mais. Os especialistas na arte entendem que para evitar uma similaridade elevada com uma sequência de referência devido à inclusão de lacunas na sequência de polinucleotídeo, uma pontuação de lacuna é tipicamente introduzida e é subtraída do número de coincidências.

[0066] Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970); pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 (1988); por implementações computadorizadas destes algoritmos, incluindo, mas não limitado a: CLUSTAL no programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Califórnia; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, EUA, o programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins e Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:15565 (1992), e Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994). A família BLAST de programas que pode ser usada para pesquisas de similaridade de banco de dados inclui: BLASTN para sequências de nucleotídeos de consulta de banco de dados contra sequências de nucleotídeos; BLASTX para sequências de consulta de nucleotídeos contra sequências de banco de dados de proteínas; BLASTP para sequências de consulta de proteína contra sequências do banco de dados de proteínas; TBLASTN para sequências de consulta de proteína contra sequências de nucleotídeos de banco de dados, e TBLASTX para sequências de nucleotídeos de consulta contra sequências de banco de dados de nucleotídeos. Ver, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque (1995).

[0067] Salvo disposição em contrário, os valores de sequência de identidade/similaridade aqui fornecidos referem- se ao valor obtido usando o conjunto de programas BLAST 2.0 usando os parâmetros padrão. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997). O software para a realização de análises BLAST está disponível ao público, por exemplo, por meio do National Center for Biotechnology-Information (www.hcbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve a primeira identificação de pares de sequência de pontuação alta (HSPs), através da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que corresponde ou satisfaz alguns valores positivos com limite de pontuação T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de dados. T é referido como o limite da pontuação de palavra vizinha (Altschul et al. supra). Estes acertos de palavras vizinhas iniciais agem como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contenham. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo possa ser aumentada. Pontuações acumuladas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de contagem por um par de resíduos correspondentes, sempre > 0) e N (pontuação de contagem para incompatibilidades de resíduos; sempre <0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de classificação é utilizada para calcular a pontuação cumulativa. Extensão dos acertos de palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação do alinhamento cumulativo cai pela quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou o fim de qualquer sequência é atingido. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) utiliza como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as vertentes. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como defeito um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).

[0068] Além de calcular a percentagem de identidade de sequência, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida da similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorreriam por acaso.

[0069] Pesquisas BLAST supõem que as proteínas podem ser modeladas como sequências aleatórias. No entanto, muitas proteínas reais compreendem regiões de sequências não aleatórias, que podem ser extensões homopoliméricas, repetições de período curto, ou regiões enriquecidas em um ou mais aminoácidos. Tais regiões de baixa complexidade podem ser alinhadas entre as proteínas não relacionadas, embora outras regiões da proteína sejam totalmente diferentes. Uma série de programas de filtragem de baixa complexidade pode ser empregada para reduzir esses alinhamentos de baixa complexidade. Por exemplo, filtros de baixa complexidade SEG (Wooten e Federhen, Comput. Chem., 17: 149-163 (1993)) e XNU (Claverie e States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) podem ser utilizados sozinhos ou em combinação.

[0070] Tal como aqui utilizado, "identidade de sequência"e "identidade" no contexto de duas sequências de ácido nucléico ou polipeptídeo inclui a referência aos resíduos das duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

[0071] Quando a percentagem de identidade de sequência é usada em referência às proteínas, reconhece-se que as posições de resíduos que não são idênticas diferem frequentemente por substituições de aminoácidos conservativos, em que os resíduos de aminoácidos estão substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservativas, a percentagem de identidade de sequência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Sequências que diferem por tais substituições conservadoras dizem ter "similaridade de sequência"ou "semelhança". Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos dos peritos na arte. Tipicamente isto envolve atingir uma substituição conservativa como uma incompatibilidade parcial em vez de total, aumentando desse modo a percentagem de identidade de sequência. Assim, por exemplo, onde a um aminoácido idêntico é atribuída uma pontuação de 1 e a uma substituição não-conservadora é atribuída uma pontuação de zero, uma substituição conservadora é atribuída uma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituições conservativas é calculada, por exemplo, de acordo com o algoritmo de Meyers e Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1988), por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA).

[0072] Tal como aqui utilizado, "percentagem de identidade de sequência"significa o valor determinado por comparação de duas sequências otimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, lacunas), em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucléico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para originar o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência.

[0073] Tal como aqui utilizado, o termo "variedade" e "cultivar" refere-se a plantas que são definidas pela expressão das características resultantes de um dado genótipo ou combinação de genótipos, que se distinguem de qualquer outro conjunto de plantas pela expressão de pelo menos uma das características e consideradas como uma unidade no que diz respeito a sua aptidão para ser reproduzida sem alteração.

[0074] Tal como aqui utilizado, o termo "híbrido"refere-se à prole ou descendentes de plantas parentais geneticamente dissemelhantes ou imagens produzidas como resultado de polinização cruzada controlada, em oposição a uma semente não híbrida produzida como o resultado da polinização natural.

[0075] Tal como aqui utilizado, o termo "progenia" refere- se à geração de uma planta, em que a descendência de geração pode ser rastreada para a referida planta. Tal como aqui utilizado, o termo "progenia" de uma planta resistente ao herbicida inclui tanto a descendência de plantas resistentes ao herbicida, assim como qualquer derivado mutante, recombinante, ou geneticamente modificadas dessa planta, seja da mesma espécie ou de uma espécie diferente, em que a característica(s) de resistência a herbicida da planta resistente a herbicidas original tem sido transferida para a planta descendente.

[0076] Tal como aqui utilizado, o termo "tecido vegetal" inclui tecidos diferenciados e não diferenciados de plantas incluindo aqueles presentes nas raízes, folhas, brotos, pólen, sementes e tumores, assim como células em cultura (por exemplo, células isoladas, protoplastos, embriões, calos, etc.). Tecido vegetal pode ser na planta, em cultura de órgãos, em cultura de tecidos ou cultura de células.

[0077] Tal como aqui utilizado, o termo "parte de planta" como aqui utilizado refere-se a uma estrutura de planta ou um tecido vegetal, por exemplo, pólen, um óvulo, um tecido, uma vagem, uma semente, e uma célula. Em algumas concretizações da presente invenção, plantas transgênicas são plantas de cultura. Tal como aqui utilizado, o termo "colheita" e "planta de colheita"é utilizado no seu sentido mais amplo. O termo inclui, mas não está limitado a, qualquer espécie de planta comestível por seres humanos ou utilizada como um alimento para animais ou peixes ou animais marinhos, ou consumida pelos seres humanos, ou utilizada pelos seres humanos, ou visualizada por humanos, ou qualquer planta utilizada em indústria ou comércio ou educação.

[0078] Tal como aqui utilizado, o termo "germoplasma de elite", em referência a uma planta refere-se ao material hereditário de superioridade genética comprovada.

[0079] Tal como aqui utilizado, o termo "planta de elite", refere-se a qualquer planta que resultou de criação e seleção para o desempenho agronômico superior.

[0080] Tal como aqui utilizado, o termo "característica"refere-se a uma característica observável e / mensurável de um organismo. Por exemplo, a presente invenção descreve plantas que são resistentes a herbicidas FOP e DIM.

[0081] Tais como aqui utilizados, os termos "marcador" e "marcador de DNA" e "marcador molecular", em referência a um "marcador selecionável"referem-se a uma característica morfológica ou fisiológica que pode ser determinada como um marcador para a sua própria seleção ou para a seleção de outras características estreitamente ligadas ao marcador. Por exemplo, tal marcador poderia ser um gene ou traço que se associa com a tolerância a herbicidas, incluindo, mas não limitado a, sequência de repetição simples (SSR), polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), inserções genéticas e/ou deleções e semelhantes.

[0082] Tal como aqui utilizado, os termos "introgredido" e "introgredindo" e "introgressão"referem-se a técnicas convencionais de polinização melhorada (isto é, clássica) para incorporar o material genético estranho em uma linhagem de reprodutores. Por exemplo, a presente invenção proporciona plantas de cultivo de trigo introgredidas com um gene mutante ACCase para a tolerância a herbicida pelo cruzamento de duas gerações de plantas.

[0083] Tais como aqui utilizados, os termos "tipo selvagem", quando feitos em referência a um gene referem-se a um gene funcional comum ao longo de uma população de plantas. Um gene de tipo selvagem funcional é aquele que é mais frequentemente observado na população e é assim designado arbitrariamente a forma "normal" ou "tipo selvagem" do gene.

[0084] Tal como aqui utilizado, o termo "mutante" ou "mutante funcional" quando feito em referência a um gene ou a um produto de gene refere-se, respectivamente, a um gene ou a um produto de gene que exibe modificações na sequência e/ou propriedades funcionais (isto é, características alteradas), quando comparado com o gene de tipo selvagem ou produto do gene. Assim, os termos "modificados" e "mutantes", quando usados em referência a uma sequência de nucleotídeos referem- se a uma sequência de ácido nucléico que difere em um ou mais nucleotídeos a partir de um outro, de sequências de nucleotídeos normalmente relacionados e o termo "mutante funcional" quando usado em referência a um polipeptídeo codifica pelo dito ácido nucléico "modificado" ou "mutante" refere-se a proteína ou polipeptídeo que retém a atividade. No presente pedido, a proteína mutante ACCase, "ou mutante funcional" da mesma é um gene ACCase que retém a sua atividade nativa para criar os aminoácidos essenciais. Além disso, uma sequência de nucleotídeos "modificada"é interpretada como a encontrada no código genético degenerado como é conhecido por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o código genético é degenerado, como há casos em que os diferentes códons especificam o mesmo aminoácido; um código genético em que alguns aminoácidos podem estar cada um codificado por mais de um códon. É contemplado que a presente invenção pode compreender tal degeneração (por exemplo, em que um híbrido de trigo compreende um gene ACCase que é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% de homologia, pelo menos 97% de homologia, ou pelo menos 99% de homologia com as SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou o encontrado em AF28-A, AF26-B e/ou D-AF10 , (ATCC Nos. ) como estabelecido em, por exemplo, o germoplasma de trigo).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0085] Acetil-CoA carboxilase (ACC) é uma enzima biotinilada que catalisa a carboxilação da acetil-CoA para a produção de malonil-CoA. Esta carboxilação é uma reação reversível, de duas etapas, consistindo da carboxilação dependente de ATP do grupo biotina no domínio carboxil pela atividade transportadora de biotina carboxilase seguida pela transferência do grupo carboxila da biotina para acetil-CoA por atividade carboxil-transferase (Nikolau et al., 2003, Arch. Biochem. Biophys. 414: 211-22). Acetil-CoA carboxilase é não somente uma enzima chave em plantas para biossíntese de ácidos graxos, um processo que ocorre nos cloroplastos e mitocôndrias, mas ACCase também desempenha um papel na formação de ácidos graxos de cadeia longa e flavonóides, e em malonilação que ocorre no citoplasma. Existem duas isoformas da ACCase com a contabilização de ACCase cloroplasmática por mais de 80% da atividade total de ACCase (Herbert et al., 1996, Biochem. J. 318:997-1006). Ariloxifenoxipropionatos (FOP) e ciclo-hexanodionas (DIM) são duas classes de compostos químicos que são conhecidas por inibirem seletivamente a ACCase cloroplasmática em gramíneas (Rendina et al., 1990, J. Agric. Food Chem. 38: 1282-1287).

[0086] Sementes de uma variedade de trigo foram expostas ao produto químico mutagênico etano metilsulfonato (EMS), e foram plantadas e avaliadas quanto à tolerância a herbicidas ACCase. Um dos genótipos, AF28-A (SEQ ID NO: 4) expressou elevados níveis de tolerância a cada um dos herbicidas testados. Além disso, foi aqui demonstrado que cruzando AF28-A, AF26-B e/ou AF10-D, com as linhagens de elite parentais proporcionou um bom conjunto de sementes ACCase de resistência a herbicida em plantas descendentes.

[0087] Como tal, uma concretização da presente invenção proporciona um germoplasma de planta que contém genes alterados ACCase e proteínas. Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona a utilização de herbicidas ACCase em plantações de plantas híbridas para reduzir a quantidade de plantas daninhas monocotiledôneas presentes no referido campo de cultura, em que o referido germoplasma híbrido compreende uma enzima ACCase alterada que confere resistência a herbicidas ACCase e as ditas plantas daninhas são suscetíveis a herbicidas ACCase. Plantas preferidas incluem trigo, cevada, arroz e cereais ou outras plantas monocotiledôneas análogas com uma mutação.

[0088] Numa concretização, a presente invenção proporciona uma planta com resistência à inibição por herbicidas ACCase, isoladamente ou em conjugação com outras características de resistência, por exemplo, resistência a insetos contra a broca do caule manchado Chilo partellus (Girijashankar et al., 2005, Plant Cell Rep. 24: 513-522, aqui incorporado na sua totalidade). Em algumas concretizações, por exemplo, um híbrido de trigo cujo germoplasma compreende um gene sintético cryl Ac, a partir de Bacillus thuringiensis (Bt) é um introgredido em uma linhagem de trigo, cujo germoplasma confere resistência a herbicidas ACCase. Além disso, a incorporação de resistência ao herbicida ACCase e resistência dos insetos é realizada através de transgênese em planta do mesmo híbrido de trigo. Um especialista na técnica irá reconhecer as várias técnicas, tais como aqui descritas que são aplicáveis para a incorporação de dois ou mais atributos de resistência na mesma planta.

[0089] Numa concretização, a presente invenção proporciona a resistência a herbicidas em plantas ACCase compreendendo, por exemplo, um germoplasma ACCase designado AF28-A, AF26-B e/ou D-AF10, ATCC Nos. incorporado em variedades elite através de seleção e melhoramento genético de plantas, de modo a permitir o desenvolvimento de plantas tolerantes a herbicidas que toleram o uso de inibidores da ACCase para o controle de ervas daninhas. Implantação desta característica de tolerância ao herbicida nas plantas acima mencionada permite a utilização destes herbicidas para controlar ervas daninhas monocotiledôneas que crescem na presença dessas culturas. Em algumas concretizações, a incorporação do traço de resistência à ACCase em linhagens de elite é através de introgressão, ou métodos de reprodução clássicas. Em algumas concretizações, a incorporação do gene de resistência ACCase em linhagens de elite é através de transgênese de gene heterólogo com constructos de expressão ou de inibição. Em algumas concretizações, a invenção proporciona, de preferência, uma planta de trigo, em que pelo menos um ancestral da planta de trigo compreende um gene resistente à ACCase de germoplasma designado AF28-A, depositado sob o n ° de acesso ATCC: . Em algumas concretizações, o gene resistente a herbicida ACCase inclui uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos 70% homóloga, pelo menos 80% homóloga, pelo menos 85% homóloga, pelo menos 90% homóloga, pelo menos 95% homóloga, pelo menos 97% homóloga, ou pelo menos 99% homóloga a SEQ ID NO: 4, ou o gene resistente ao herbicida ACCase como encontrado em AF28-A, depositado sob o no. ATCC: . Em algumas concretizações, o gene resistente a herbicida ACCase é pelo menos 70% homólogo, pelo menos 80% homólogo, pelo menos 85% homólogo, pelo menos 90% homólogo, pelo menos 95% homólogo, pelo menos 97% homólogo, ou pelo menos 99 % homólogo a SEQ ID NO: 4 ou o gene resistente ao herbicida ACCase como encontrado em AF28-A, depositado sob o n° de acesso ATCC: compreendendo uma substituição de aminoácido Ala2004Val.

[0090] Em algumas concretizações, germoplasma resistente a herbicida ACCase é introgredido numa linhagem de elite de planta utilizando técnicas de criação clássicas. Exemplos de métodos de reprodução clássicos para trigo, cevada, arroz e outras plantas cereais monocotiledôneas podem ser encontrados em, por exemplo, Sleper e Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, Quinta Edição, Blackwell Publishing, aqui incorporado na sua totalidade.

[0091] Numa concretização, o germoplasma resistente a herbicida ACCase é introgredido numa planta, de preferência trigo que fornece alimentos para o consumo humano. Em algumas concretizações, o germoplasma resistente a herbicida ACCase é introgredido em plantas de trigo que servem de alimento para animais (por exemplo, aves domésticas, gado, suínos, ovelhas, etc). Em algumas concretizações, o germoplasma resistente a herbicida ACCase é introgredido em plantas de trigo que são utilizadas em processos industriais como a produção de etanol. Numa concretização, o gene de resistência aos herbicidas ACCase é introduzido no genoma da planta por meio de transgênese usando vetores e tecnologias conhecidos na arte.

[0092] Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona um germoplasma resistente a ACCase de parte de uma planta de trigo de linhagem AF28-A, depositada sob o n° de acesso ATCC: , e a dita parte de planta de trigo é uma um ou mais de pólen, um óvulo, um tecido, uma vagem, uma semente, e um célula. Numa concretização, o presente invento proporciona um híbrido F1 cujo germoplasma compreende um gene de resistência a ACCase como aqui descrito. Em algumas concretizações, o híbrido F1 é um cruzamento entre duas linhagens de elite de trigo, pelo menos, um dos quais contém um germoplasma compreendendo um gene de resistência ACCase como aqui descrito.

[0093] Numa concretização, a presente invenção proporciona métodos para controlar ervas daninhas numa população de plantas. Em algumas concretizações, o controle das ervas daninhas compreende a aplicação de um herbicida ACCase à referida população de plantas, tal que é inibido o crescimento de ervas daninhas, mas o crescimento da planta não é afetado adversamente. Em algumas concretizações, o herbicida ACCase a ser aplicado é da família de herbicidas ariloxifenoxipropionatos (FOP), incluindo, mas não limitados a, clodinafope-propargil, cialofope-butil, diclofop-metil, fenoxaprop-p-etil, fluazifop-b-butil, haloxifop-etoxietil, haloxifop-etotil, haloxifop-P-metil, propaquizafop, quizalofop-p-etil e compostos quizalo-P-refuril. Em algumas concretizações, o herbicida ACCase a ser aplicado é dos herbicidas da família das ciclohexanodionas (DIM) incluindo, mas não limitado a, aloxidim, butroxidim, clefoxidim, cletodim, cicloxidim, profoxidim, setoxidim, tepraloxidim, e compostos de tralcoxidim. Em algumas concretizações, o herbicida ACCase a ser aplicado compreende uma combinação de compostos a partir de ambas as famílias de herbicidas ACCase FOP e DIM, tal como aqui descritas. No entanto, o presente pedido de patente não se limita ao herbicida ACCase utilizado, e um versado na técnica vai apreciar que novos herbicidas ACCase estão sendo descobertos em qualquer momento que inibem a enzima ACCase.

[0094] Numa concretização, a presente invenção proporciona uma planta (por exemplo, F1, F2, F3, F4, etc.), cujo germoplasma confere resistência a herbicidas ACCase e resistência a um ou mais herbicidas adicionais, a partir de um ou mais grupos de herbicidas diferentes. Por exemplo, grupos de herbicidas complementares utilizados para inibir o crescimento de ervas daninhas incluem, mas não estão limitados a, inibidores da síntese de lipídeos (por exemplo, ariloxifenoxipropionatos, ciclohexanodeionas, benzofuranos, ácidos cloro-carbônicos, fosforoditioatos, tiocarbamatos), inibidores da fotossíntese em fotossistema II (por exemplo, fenil-carbamatos, piridazinonas, triazinas, triazinonas, triazolinonas, uracilas, amidas, ureias, nitrilos, benzotiadiazinonas, fenil-piridinas), inibidores da fotossíntese em fotossistema I (por exemplo, bipiridiliums), inibidores da protoporfirinogênio oxidase (por exemplo, éteres difenílicos, N-fenilftalimidas, oxadiazóis, oxizolidinedionas, fenilpirazóis, pirimidindionas, tiadiazóis), inibidores da biossíntese de carotenóides (por exemplo, piridazinonas, piridinecarboxamidas, isoxazolidinonas, triazóis), inibidores de 4-hidroxifenil-piruvato dioxigenase (por exemplo, calistemonas, isoxazóis, pirazóis, triquetonas), inibidores de EPSP-sintase (por exemplo, glicinas), inibidores da glutamina sintetase (por exemplo, ácidos fosfínicos), inibidores da sintase dihidropteroato (por exemplo, carbamatos), inibidores da montagem de microtúbulos (por exemplo, benzamidas, ácidos benzóicos, dinitroanilinas, piridinas, fosforoamidatos), inibidores da divisão celular (por exemplo, acetamidas, cloroacetamidas, oxiacetamidas), inibidores da síntese da parede celular (por exemplo, nitrilos, triazolocarboxamidas) e inibidores de transporte de auxina (por exemplo, ftalamatos, semicarbazonas). Em algumas concretizações, a presente invenção proporciona híbridos F1 a partir de linhagens de plantas de elite que compõem a resistência a um ou mais herbicidas ACCase isoladamente, ou em conjunto com resistência a herbicidas a um ou mais dos grupos herbicidas acima mencionados.

[0095] Numa concretização, a presente invenção proporciona a utilização de uma sequência de nucleotídeos heteróloga compreendendo as SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 que codificam uma proteína ACCase tipo selvagem ou mutante (SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11 ou 12) para fornecer a característica agronômica selecionada de resistência a herbicidas ACCase. Numa concretização, a sequência de nucleotídeos compreende um gene mutante ACCase como encontrado no germoplasma designado AF28- A, AF26-B e/ou D-AF10, depositado sob o n° ATCC . Em algumas concretizações, a sequência de nucleotídeos é pelo menos 70% homóloga, pelo menos 80% homóloga, pelo menos 85% homóloga, pelo menos 90% homóloga, pelo menos 95% homóloga, pelo menos 97% homóloga, ou pelo menos 99% homóloga às SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 6. Em algumas concretizações, a sequência de nucleotídeos ACCase está operacionalmente ligada a uma sequência promotora e faz parte de uma expressão ou uma construção de inibição, e em alguns modelos de realização da sequência de nucleotídeos ACCase é de pelo menos 70% de homologia, pelo menos 80% de homologia, pelo menos 85% de homologia, pelo menos 90% de homologia, pelo menos 95% de homologia, pelo menos 97% de homologia, ou pelo menos 99% de homologia com o gene resistente ao herbicida ACCase como encontrado em AF28-A, AF26-B e/ou D-AF10, ou SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e/ou ID SEQ NO: 6, que compreende uma substituição de aminoácidos Ala Val 2004 no genoma A, B, ou D.

Melhoramento clássico de trigo

[0096] Culturas foram classicamente criadas através de técnicas que aproveitam o(s) método(s) de polinização de plantas. Uma planta é considerada "auto-polinizadora" se o pólen de uma flor pode ser transmitido para a mesma ou a outra flor da mesma planta, enquanto as plantas são consideradas "polinizadoras cruzadas" se o pólen tem que vir de uma flor de uma planta diferente, a fim de que ocorra a polinização. Plantas que são auto-polinizadas e selecionadas ao longo de muitas gerações tornam-se homozigóticas para a maioria, se não todos, os seus loci de genes, produzindo assim uma população uniforme de melhoramento de progenia verdadeira. Um cruzamento entre duas plantas homozigotas de diferentes origens ou duas linhagens homozigotas diferentes produzirá uma população uniforme de plantas híbridas que irá ser mais provavelmente heterozigota para um número de loci genéticos. Um cruzamento de duas plantas que são cada uma heterozigota para um número de loci genéticos irá produzir uma geração de plantas híbridas que são geneticamente diferentes e não são uniformes.

[0097] Plantas de trigo são plantas de auto-polinização, mas também podem ser produzidas por polinização cruzada. O desenvolvimento de híbridos de trigo requer o desenvolvimento de parentais polinizadores (restauradores da fertilidade) e linhagens parentais de sementes que utilizam o sistema restaurador de fertilidade-esterilidade citoplasmática masculina, o cruzamento de sementes parentais e parentais polinizadores, e a avaliação dos cruzamentos. Trigos híbridos também podem ser desenvolvidos utilizando agentes químicos de hibridização que são utilizados para fornecer a esterilidade masculina do progenitor feminino do híbrido. Programas de melhoramento genético de linhagens combinam características desejáveis; no presente pedido a característica desejável sendo resistência de plantas a herbicidas ACCase. Esta característica está para entrar no tanque de criação de uma ou mais linhagens, de tal modo que as novas linhagens endogâmicas são criadas por cruzamento, seguido por seleção de plantas com a característica desejada, seguido por mais cruzamento, etc. Novas linhagens são cruzadas com outras linhagens endogâmicas (por exemplo, linhagens de plantas de elite como as aqui descritas).

[0098] O melhoramento de linhagem começa com o cruzamento de dois genótipos, como AF28-A, AF26-B e/ou AF10-D, e uma linhagem de trigo elite. Se os dois progenitores originais não fornecem todas as características desejadas, então outras fontes podem ser incluídas na população de reprodução. Por exemplo, se é desejado um híbrido de tal modo que ambos os grupos de resistência a herbicidas ACCase e resistência a outro herbicida, tal como aqui descrito foi desejado, então as plantas com ambos esses atributos podem ser cruzadas utilizando técnicas de reprodução clássicas. No método de linhagem, plantas superiores são auto-polinizadas e selecionadas em gerações sucessivas. Nas gerações sucessivas, a condição heterozigota dá lugar a linhagens homogêneas de plantas homozigotas, como resultado da auto-polinização e seleção. Tipicamente, no método de linhagens, cinco ou mais gerações de autopolinização e de seleção são praticadas (por exemplo, S1, S2, S3, S4, S5, etc.).

[0099] Retrocruzamento é usado para melhorar uma linhagem de plantas. Retrocruzamento transfere uma ou mais características desejáveis específicas de uma fonte para outra que não tenha os traços. Isto é conseguido através de, por exemplo, cruzamento de um doador (por exemplo, AF28-A) para uma linhagem pura de elite (por exemplo, uma linhagem de elite). A progênie deste cruzamento é, então, retrocruzada (ou seja, retrocruzando) com a linhagem pura de elite, seguido pela seleção na progênie resultante da característica desejada (por exemplo, resistência a herbicidas ACCase). Depois de cinco ou mais gerações de retrocruzamento com seleção para a característica desejada, a progênie é normalmente heterozigota para o locus (loci) controlando o fenótipo desejado, mas vai parecer como o parental elite para os outros traços genéticos. O último retrocruzamento, em seguida, é normalmente autopolinizado de modo a dar uma progênie pura melhorada quanto ao gene ou genes a serem transferidos.

[0100] Em programas atuais de melhoramento de trigo híbrido, novas linhagens parentais são desenvolvidas para serem linhagens parentais de semente ou linhagens parentais de pólen, dependendo se devem ou não conter genes restauradores da fertilidade; as linhagens parentais de sementes não têm genes de restauração de fertilidade e são masculinas estéreis em certos citoplasmas (também conhecidas como linhagens de plantas "A") e masculinas férteis em outros citoplasmas (também conhecidas como plantas de linhagem "B"), enquanto as linhagens parentais de pólen não são masculinas estéreis e contêm os genes restauradores da fertilidade (também conhecidas como plantas de linhagem "R"). As linhagens parentais de semente normalmente são criadas para serem masculinas estéreis citoplasmaticamente tal que as anteras são mínimas ou inexistentes nessas plantas que exigem, assim, a polinização cruzada. As linhagens parentais de sementes apenas irão produzir sementes, e o citoplasma só é transmitido através do ovo. O pólen para a polinização cruzada é fornecido através das linhagens parentais de pólen que contêm os genes necessários para a completa restauração da fertilidade do híbrido F1, e o cruzamento combina com o parental masculino estéril da semente para produzir um híbrido de cruzamento único de alto rendimento com boa qualidade de grãos.

[0101] Normalmente, este sistema restaurador de esterilidade-fertilidade masculina citoplasmática é realizado para a produção de sementes híbridas com o plantio de blocos de fileiras de plantas masculinas estéreis (semente-parental) e blocos de fileiras de plantas restauradoras de fertilidade (pólen-parental), de tal forma que plantas parentais de sementes são polinizadas pelo vento com o pólen da planta parental de pólen. Este processo produz um híbrido de cruzamento simples vigoroso que é colhido e plantado pelo consumidor. Plantas parentais de sementes, machos estéreis, também podem ser criadas por cruzamento geneticamente recessivo de genes nucleares masculinos estéreis para uma determinada população, mas o sistema restaurador de esterilidade-fertilidade masculina citoplasmática é tipicamente utilizado para o sistema de melhoramento genético de trigo híbrido, no entanto a esterilidade masculina quimicamente induzida também tem sido amplamente usada. Sleper e Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, quinta edição, Blackwell Publishing fornece uma boa revisão dos procedimentos atuais de melhoramento de trigo e é aqui incorporado na sua totalidade.

[0102] A presente invenção não está limitada às linhagens de trigo listadas, e um versado na técnica irá reconhecer que qualquer linhagem de elite de trigo seria igualmente receptiva às composições e métodos como aqui descritos.

Plantas transgênicas

[0103] Composições da presente invenção incluem as sequências para sequências de nucleotídeos de trigo que tenham sido identificadas como sequências que codificam ACCase que estão envolvidas na resposta das plantas aos herbicidas ACCase. Em particular, a presente invenção proporciona moléculas isoladas de ácido nucléico que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8 e 9. Além disso, são fornecidos polipeptídeos possuindo uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucléico aqui descrita, por exemplo, as sequências de nucleotídeos descritas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

[0104] As composições da invenção podem ser usadas em uma variedade de métodos pelos quais os produtos de proteína podem ser expressos em plantas de colheita para funcionar como proteínas resistentes a herbicidas. Tal expressão resulta na alteração ou modulação do nível, tecido, ou momento de expressão para conseguir uma melhor resistência a herbicidas ACCase. As composições da invenção podem ser expressas na mesma espécie a partir da qual se origina o ACCase em particular ou, alternativamente, pode ser expressa em qualquer planta de interesse. Deste modo, a sequência de codificação para o ACCase pode ser usada em combinação com um promotor que é introduzido numa planta de colheita. Numa concretização, um promotor constitutivo expressando altos níveis pode ser utilizado e resultaria em níveis elevados de expressão da ACC. Em outras concretizações, a sequência codificadora pode estar operacionalmente ligada a um promotor específico de tecido para dirigir a expressão de um tecido de planta conhecido por ser susceptível a herbicidas ACCase como folhas. Da mesma forma, manipulação da distribuição de expressão pode ser utilizada. Por exemplo, por escolha judiciosa de promotor, a expressão pode ser melhorada no início do crescimento de plantas para preparar a planta para ser responsiva ao tratamento com herbicida.

[0105] Em concretizações específicas, métodos para aumentar a tolerância ao herbicida em uma planta compreendem a transformação estável de uma planta com um constructo de DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos da invenção, operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão numa planta.

[0106] Plantas transformadas, células vegetais, tecidos vegetais e sementes das mesmas são adicionalmente fornecidos.

[0107] Os métodos da invenção podem ser utilizados com outros métodos disponíveis na arte para melhorar outros traços em plantas. É reconhecido que tais segundas sequências nucleotídicas podem ser usadas quer na orientação senso ou anti-senso, dependendo do resultado desejado.

[0108] É esta a super-expressão de sequências de nucleotídeos mutantes ACCase (SEQ ID NO: 4, 5 e/ou 6) que poderia ser o método preferido de utilização das sequências de nucleotídeos mutantes. As várias vantagens e desvantagens do uso de diferentes promotores para conduzir tal super-expressão são bem conhecidas pelos versados na técnica. No entanto, a título de exemplo, um promotor constitutivo poderia conduzir a expressão, mas um promotor mais ideal poderia atingir tecidos, tais como as folhas.

[0109] Sequências da invenção, como discutido em mais detalhe abaixo, englobam sequências de codificação, sequências anti-senso, e fragmentos e variantes destas. Expressão das sequências da invenção pode ser utilizada para modular ou regular a expressão de proteínas ACCase correspondentes. A invenção engloba o ácido nucléico isolado ou substancialmente purificado, ou composições de proteínas.

[0110] Fragmentos e variantes das sequências nucleotídicas reveladas e proteínas assim codificadas são também englobados pela presente invenção. "Fragmento" designa uma porção da sequência de nucleotídeos ou uma porção da sequência de aminoácidos e consequentemente a proteína por ela codificada. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos pode codificar fragmentos protéicos que conservam a atividade biológica da proteína nativa e, consequentemente, têm uma atividade semelhante a ACC e, assim, afetam a resposta ao herbicida. Alternativamente, fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que são úteis como sondas de hibridização, geralmente não codificam proteínas de fragmentos retendo a atividade biológica. Assim, fragmentos de uma sequência de nucleotídeos pode variar entre, pelo menos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, e até a sequência de nucleotídeos de comprimento completo que codifica as proteínas da invenção.

[0111] Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos ACCase que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína ACCase da invenção irá codificar, pelo menos, 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200 ou 250 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína de comprimento completo da invenção

[0112] As sequências nucleotídicas da invenção podem ser utilizadas para isolar sequências correspondentes a partir de outros organismos, em particular de outras plantas e mais particularmente de outras monocotiledôneas. Deste modo, métodos tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR), a hibridização, e semelhantes podem ser utilizados para identificar tais sequências com base na sua homologia de sequência com as sequências aqui estabelecidas. Sequências isoladas com base na sua identidade de sequência com as sequências inteiras ACCase aqui definidas ou os seus fragmentos estão englobados pela presente invenção. Tais sequências incluem sequências que são ortólogas das sequências descritas. "Ortólogos"significa genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies, como resultado de especiação. Genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando as suas sequências de nucleotídeos e/ou as suas sequências de proteínas codificadas partes compartilham identidade substancial, tal como definido aqui noutro lugar. Funções de ortólogos são muitas vezes altamente conservadas entre as espécies.

[0113] Num modelo de PCR, iniciadores de oligonucleotídeos podem ser concebidos para utilização em reações de PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes a partir de DNAc ou DNA genômico extraído a partir de qualquer planta de interesse. Métodos para conceber iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na arte e são descritos, por exemplo, Sambrook. Ver também Innis et al., Eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque). Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não estão limitados a, métodos que utilizam pares de iniciadores, iniciadores aninhados, iniciadores únicos específicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos do gene, iniciadores específicos do vetor, iniciadores parcialmente incompatíveis, e assim por diante.

[0114] Nas técnicas de hibridização, a totalidade ou parte de uma sequência de nucleotídeos conhecida é usada como sonda que hibridiza seletivamente com outras sequências de nucleotídeos correspondentes presentes numa população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de DNAc (isto é, bibliotecas genômicas ou de DNAc) a partir de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de DNAc, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como P32, ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, sondas para a hibridização podem ser feitas por marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências ACCase da invenção. Métodos para a preparação de sondas para hibridização e para a construção de bibliotecas genômicas e de cDNA são geralmente conhecidos na arte e são divulgados em Sambrook.

[0115] Atividade biológica dos polipeptídeos ACCase (isto é, influenciando a resposta a herbicida ACCase) pode ser testada por qualquer método conhecido na arte e aqui descrito.

[0116] As sequências de ácido nucléico da presente invenção podem ser expressas numa célula hospedeira, tais como bactérias, leveduras, insetos mamíferos, ou de preferência células vegetais. É esperado que os versados na técnica sejam conhecedores dos numerosos sistemas de expressão disponíveis para expressão de um ácido nucléico que codifica uma proteína da presente invenção. Não se fará qualquer tentativa para descrever em pormenor os vários métodos conhecidos para a expressão de proteínas em procariotas ou eucariotas.

[0117] As sequências da presente invenção são fornecidas em cassetes de expressão ou constructos de DNA para expressão na planta de interesse. O cassete irá incluir sequências reguladoras 5' e 3' operacionalmente ligadas a uma sequência ACCase da invenção. O cassete pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser co-transformado no organismo. Alternativamente, o gene (s) adicional pode ser fornecido em vários cassetes de expressão.

[0118] Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da sequência de ACCase a estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode ainda conter genes marcadores selecionáveis.

[0119] O cassete de expressão incluirá, na direção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação de transcrição (ou seja, um promotor), região de iniciação de tradução, um polinucleotídeo da invenção, uma região de terminação da tradução e, opcionalmente, uma região de terminação da transcrição funcional no organismo hospedeiro. As regiões de regulação (isto é, promotores, regiões reguladoras da transcrição, e as regiões de terminação da tradução) e/ou o polinucleotídeo da invenção podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou a cada um. Alternativamente, as regiões de regulação e/ou o polinucleotídeo da invenção podem ser heterólogos para a célula hospedeira ou para outros.

[0120] Embora possa ser preferível expressar as sequências utilizando promotores heterólogos, podem ser utilizadas as sequências de promotores nativos. Tais constructos mudariam os níveis de expressão de ACCase na célula hospedeira (isto é, célula de planta ou planta). Assim, o fenótipo da célula hospedeira (isto é, célula vegetal ou planta) é alterado.

[0121] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse operacionalmente ligada, ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tal como octopina-sintase e regiões de terminação da nopalina sintase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. (1991) 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[0122] Quando apropriado, o gene(s) pode ser otimizado para aumentar a expressão na planta transformada. Ou seja, os genes podem ser sintetizados utilizando códons preferidos de plantas para melhorar a expressão. Estão disponíveis na arte métodos para a síntese de genes preferidos de plantas. Ver, por exemplo, as Patentes dos EUA. Nos. 5.380.831 e 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporada por referência.

[0123] Modificações de sequências adicionais são conhecidas para aumentar a expressão de genes num hospedeiro celular. Estas incluem eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítio de junção exonintron, repetições de transposon e outras tais sequências semelhantes, bem caracterizadas, que possam ser deletérias para a expressão do gene. O conteúdo de GC da sequência pode ser ajustado até níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por referência para genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de RNAm secundárias de grampo preditas.

[0124] Os cassetes de expressão podem ainda conter sequências líder 5' no construto do cassete de expressão. Tais sequências líder podem agir para melhorar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na arte e incluem: líderes picornavirus, por exemplo, líder EMCV (encefalomiocardite região 5'não codificante) (Elroy-Stein et al. (1989) PNAS EUA 86:6126-6130)); por exemplo, líderes potyvirus, líder TEV (Tobacco Etch Virus) (Allison et al. (1986) Virology 154:920); e proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP), (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido do RNAm de proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder do vírus do mosqueado clorótico do milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Veja também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Outros métodos conhecidos para aumentar a transcrição também podem ser utilizados.

[0125] Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação correta e, conforme apropriado, no enquadramento de leitura correto. Para este fim, os adaptadores ou ligantes podem ser utilizados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para proporcionar sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou semelhantes. Para este efeito, mutagênese in vitro, reparo de iniciador, restrição, anelamento, resubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.

[0126] Geralmente, o cassete de expressão irá compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células transformadas ou tecidos. Genes marcadores incluem genes que codificam resistência a antibióticos, tais como os que codificam neomicina- fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, tais como glufosinato, glifosato, amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4- D). Ver em geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al. (1980) em The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tese de Ph.D., University of Heidelberg; Reines et al. Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:33433356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. (1991) Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Tese Ph.D., University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724; e Publicação WO N° 02/36782. Estas divulgações são aqui incorporadas por referência.

[0127] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não se destina a ser limitativa. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado na presente invenção.

[0128] Uma série de promotores pode ser usada na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Isto é, os ácidos nucléicos podem ser combinados com promotores constitutivos preferidos por tecido, ou outros promotores, para expressão na célula hospedeira de interesse. Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor de núcleo de Rsyn7 (WO 99/48338 e Pat. US Nos. 6,072,050); o promotor nuclear 35S de CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol Biol 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); PEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente dos EUA. N° 5.659.026), e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, os revelados nas Patentes dos EUA. Nos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121, 5.569.597, 5.466.785, 5.399.680, 5.268.463, e 5.608.142.

[0129] Assim como a expressão de polipeptídeos ACCase da invenção pode ser orientada para tecidos vegetais específicos ou tipos de células através da utilização de promotores apropriados, pode também ser orientada para diferentes locais dentro da célula através da utilização de informações de alvo ou "marcadores de alvo". Ao contrário do promotor, que atua no nível da transcrição, tal informação de alvo é uma parte do produto de tradução inicial. Dependendo do modo de infecção do agente patogênico ou a função metabólica do tipo de tecido ou célula, a localização da proteína em diferentes compartimentos da célula pode torná-lo mais eficaz contra um dado patógeno ou torná-lo menos interferente com as funções da célula. Por exemplo, pode-se produzir uma proteína precedida por um peptídeo de sinal, que dirige o produto de tradução para o retículo endoplasmático, incluindo no constructo (isto é, cassete de expressão) sequências que codificam um peptídeo de sinal (tais sequências também podem ser chamadas de "sequência sinal"). A sequência de sinal utilizada poderia ser, por exemplo, uma associada com o gene que codifica o polipeptídeo, ou pode ser feita a partir de um outro gene.

[0130] Existem diversos peptídeos de sinal descritos na literatura e eles são amplamente intercambiáveis (Raikhel N, Chrispeels MJ (2000) Protein sorting and vesicle traffic. Em B Buchanan, W Gruissem, R Jones, eds, Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland, pp 160-201, aqui incorporados por referência). A adição de um peptídeo de sinal resultará no produto de tradução entrando no retículo endoplasmático (no processo do qual o peptídeo de sinal é removido a partir do polipeptídeo), mas a localização intracelular final da proteína depende de outros fatores, os quais podem ser manipulados para resultar na localização mais adequada para o tipo de célula e patógeno. A via padrão, isto é, o caminho tomado pelo polipeptídeo se nenhum outro marcador de alvo estiver incluído, resulta na secreção do polipeptídeo através da membrana celular (Raikhel e Chrispeels, supra) para o apoplasto. O apoplasto é a região fora do sistema da membrana plasmática e inclui as paredes celulares, espaços intercelulares, e vasos do xilema, que formam um sistema contínuo, permeável através do qual a água e os solutos podem mover.

[0131] O método de transformação/transfecção não é crítico para a presente invenção, vários métodos de transformação ou transfecção estão disponíveis no momento. Assim como métodos mais recentes estão disponíveis para transformar culturas ou outras células hospedeiras eles podem ser diretamente aplicados. Deste modo, uma ampla variedade de métodos foi desenvolvida para inserir uma sequência de DNA no genoma de uma célula hospedeira para se obter a transcrição e/ou tradução da sequência para afetar as alterações fenotípicas no organismo. Deste modo, qualquer método que é fornecido para transformação/transfecção eficiente pode ser empregado.

[0132] Protocolos de transformação, assim como protocolos para introdução de sequências nucleotídicas em plantas, podem variar em função do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, alvo para transformação. Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de plantas e subsequente inserção no genoma da planta incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. US 83:5602-5606), transformação mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patente dos EUA. No. 5.563.055 e Zhao et al., Patente dos EUA. No. 5.981.840), transferência direta de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) e aceleração de partículas balísticas (ver, por exemplo, Sanford et al., Patente dos EUA N° 4,945,050, Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin); e McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Veja também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen (1991) In vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563; Tomes, Patente dos EUA. No. 5.240.855; Buising et al., Patente dos EUA Nos. 5.322.783 e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763764; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), pp 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporação), Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250255 e Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho através de Agrobacterium tumefaciens), todos os quais são aqui incorporados por referência.

[0133] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, em conformidade com as formas convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas e, ou polinizadas com a mesma estirpe transformada ou diferentes estirpes, e o híbrido resultante, com a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e depois as sementes colhidas para garantir a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada. Um técnico na arte reconhecerá que após o cassete de expressão recombinante ser estavelmente incorporado em plantas transgênicas e confirmado para ser operável, pode ser introduzido noutras plantas por cruzamento sexual. Qualquer número de técnicas de reprodução padrão pode ser usado, dependendo da espécie a ser cruzada.

[0134] Em culturas de propagação vegetativa, plantas transgênicas maduras podem ser propagadas pela tomada de estacas ou por meio de técnicas de cultura de tecidos para a produção de várias plantas idênticas. Seleção dos transgênicos desejável é feita e são obtidas novas variedades e propagadas vegetativamente para uso comercial. Em culturas propagadas por semente, plantas transgênicas maduras podem ser auto-cruzadas para produzir uma planta inata homozigota. A planta pura produz sementes contendo o ácido nucléico heterólogo recentemente introduzido. Estas sementes podem ser cultivadas para produzir plantas que produzem o fenótipo selecionado.

[0135] Partes obtidas a partir da planta regenerada, tais como flores, sementes, folhas, ramos, frutos e similares estão incluídos na invenção, desde que estas partes compreendam células que compreendem o ácido nucléico isolado da presente invenção. A progenia e variantes e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídos dentro do âmbito da invenção, desde que estas partes sejam constituídas pelas sequências de ácido nucléico introduzidas.

[0136] Uma concretização preferida é uma planta transgênica que é homozigota para o ácido nucléico heterólogo adicionado; ou seja, uma planta transgênica que contém duas sequências de ácidos nucléicos de um gene adicionado, no mesmo locus em cada cromossomo do par de cromossomos. Uma planta transgênica homozigota pode ser obtida cruzando sexualmente (autofecundação) uma planta transgênica heterozigota que contém um único ácido nucléico heterólogo adicionado, germinando algumas das sementes produzidas e analisando as plantas resultantes produzidas para alterações na expressão de um polinucleotídeo da presente invenção em relação à uma planta controle (ou seja, nativa, não-transgênica). Retrocruzamento para uma planta parental e cruzamento externo com uma planta não-transgênica também são contemplados.

[0137] A presente invenção pode ser utilizada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não limitado a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não estão limitadas a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), em particular as espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de sementes, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milho (por exemplo, milheto (Pennisetum glaucum), milheto painço (Panicum miliaceum), painço vulpino (Setaria italica), capim pé (Eleusine coracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), cassaya (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), côco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), citros (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figueira (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Olea europaea), mamão papaya (Carica papaya), castanha de caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana de açúcar (Saccharum spp.), aveia (Avena sativa), cevada (Hordeum vulgare), legumes, plantas ornamentais, e coníferas.

[0138] Vegetais incluem tomate (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), feijão verde (Phaseolus vulgaris), feijão lima (Phaseolus limensis), ervilha (Lathyrus spp.), E os membros do género Cucumis como pepino (C. sativus), melão cantalupe (C. cantalupensis) e melão amarelo (C. melo). Ornamentais incluem azaléia (Rhododendron spp.), Hortênsia (Hydrangea macrophylla), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), Tulipas (Tulipa spp.), Narcisos (Narcissus spp.), Petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo. Coníferas que podem ser empregadas na prática da presente invenção incluem, por exemplo, pinheiros tais como o pinheiro de Loblolly (Pinus taeda), pinheiro de corte (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro contorta (Pinus contorta) e pinheiro de Monterey (Pinus radiata), Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); cicuta ocidental (Tsuga canadensis); Sitka spruce (Picea glauca); sequóias (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros como abeto prata (Abies amabilis) e abeto bálsamo (Abies balsamea); e os cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). De preferência, as plantas da presente invenção são plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, açafrão, amendoim, sorgo, trigo, cevada, arroz, milho, tabaco, etc).

[0139] Células procarióticas podem ser utilizadas como hospedeiros para a expressão. Procariotas mais frequentemente são representados por várias estirpes de E. coli, no entanto, podem também ser utilizadas outras estirpes microbianas. Sequências de controle procariótico comumente utilizadas, que são definidas aqui para incluir promotores para a iniciação da transcrição, opcionalmente com um operador, juntamente com sequências de ligação ao ribossomo, incluem promotores vulgarmente usados tais como os sistemas promotores beta lactamase (penicilinase) e lactose (lac) (Chang et al. (1977) Nature 198:1056), o sistema promotor do triptofano (trp), (Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) e o promotor PL derivado de lambda e o sítio de ligação do ribossomo do gene N (Shimatake et al. (1981) Nature 292:128). Exemplos de marcadores de seleção para E. coli incluem, por exemplo, genes que especificam a resistência para ampicilina, tetraciclina ou cloranfenicol.

[0140] O vetor é selecionado para permitir a introdução na célula hospedeira adequada. Vetores bacterianos são tipicamente de origem de plasmídeo ou fago. Células bacterianas adequadas são infectadas com partículas de vetor de fago ou transfectadas com DNA do vetor de fago puro. Se um vetor de plasmídeo é usado, as células bacterianas são transfectadas com o vetor de DNA de plasmídeo. Sistemas de expressão para a expressão de uma proteína da presente invenção estão disponíveis usando Bacillus sp. e Salmonella (Palva et al. (1983) Gene 22:229-235 e Mosbach et al. (1983) Nature 302:543-545).

[0141] Uma variedade de sistemas de expressão eucarióticos, tais como leveduras, linhagens de células de insetos, plantas e células de mamífero, é conhecida dos versados na técnica. Como explicado resumidamente a seguir, um polinucleotídeo da presente invenção pode ser expresso nestes sistemas eucarióticos. Em algumas concretizações, células vegetais transformadas/transfectadas, como discutido infra, são empregadas como sistemas de expressão para a produção das proteínas da presente invenção. Tais proteínas antimicrobianas podem ser usadas para qualquer aplicação, incluindo as superfícies de revestimento, para os micróbios alvo. Desta maneira, os micróbios patogênicos alvo incluem humanos ou microorganismos.

[0142] Síntese de sequências de nucleotídeos heterólogos em levedura é bem conhecida. Sherman, F., et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, é um trabalho bem reconhecido que descreve os vários métodos disponíveis para produzir a proteína em leveduras. Duas leveduras largamente utilizadas para a produção de proteínas eucarióticas são Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Vetores, estirpes e protocolos para expressão em Saccharomyces e Pichia são conhecidos na técnica e estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais (por exemplo, Invitrogen). Vetores adequados normalmente têm sequências de controle de expressão, tais como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou álcool oxidase, e uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes, como desejados.

[0143] Uma proteína da presente invenção, uma vez expressa, pode ser isolada a partir de levedura por lise das células e da aplicação de técnicas padrão de isolamento de proteínas aos lisados. O monitoramento do processo de purificação pode ser realizado através de técnicas de Western blot, radioimunoensaio ou outras técnicas padrão de imunoensaio.

[0144] As sequências de nucleotídeos da presente invenção podem também ser utilizadas na orientação senso para suprimir a expressão de genes endógenos em plantas. Métodos para suprimir a expressão gênica em plantas, utilizando sequências de nucleotídeos na orientação senso são conhecidos na arte. Os métodos geralmente envolvem a transformação de plantas, com um constructo de DNA compreendendo um promotor que dirige a expressão numa planta operacionalmente ligado a pelo menos uma porção de uma sequência de nucleotídeos que corresponde ao transcrito do gene endógeno. Tipicamente, tal sequência de nucleotídeos tem identidade de sequência significativa com a sequência do transcrito do gene endógeno, de preferência superior a cerca de 65% de identidade de sequência, mais preferivelmente maior do que cerca de 85% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente maior do que cerca de 95% de identidade de sequência. Ver Pat. EUA Nos. 5.283.184 e 5.034.323, aqui incorporadas por referência.

[0145] A presente invenção proporciona ainda um método para a modulação (isto é, aumentar ou diminuir) da concentração ou composição dos polipeptídeos da presente invenção, numa planta ou parte da mesma. Aumentando ou diminuindo a concentração e/ou a composição de polipeptídeos em uma planta pode afetar a modulação. Por exemplo, aumentando a razão de polipeptídeos do invento para polipeptídeos nativos pode afetar a modulação. O método compreende: a introdução de um polinucleotídeo da presente invenção numa célula de planta com um cassete de expressão recombinante tal como descrito acima, para se obter uma célula de planta transformada, a cultura da célula de planta transformada sob condições adequadas de crescimento, e a indução ou repressão da expressão de um polinucleotídeo da presente invenção na planta durante um tempo suficiente para modular a concentração e/ou a composição de polipeptídeos na planta ou parte da planta.

[0146] Aumento da atividade e/ou nível de polipeptídeo ACCase

[0147] São proporcionados métodos para aumentar a atividade e/ou nível de um dos polipeptídeos mutantes ACCase para aumentar a tolerância a herbicidas ACCase. Um aumento no nível e/ou atividade do polipeptídeo ACCase mutante pode ser alcançado através do fornecimento para a planta do polipeptídeo ACCase. O polipeptídeo pode ser fornecido através da introdução do polipeptídeo ACCase mutante na planta, introdução na planta de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo mutante ACCase ou, alternativamente, através da modificação de um locus de ACCase genômico que codifica o polipeptídeo da invenção.

[0148] Como discutido aqui em outro lugar, muitos métodos são conhecidos na técnica para proporcionar um polipeptídeo para uma planta, incluindo, mas não limitado a, introdução direta do polipeptídeo na planta, introdução na planta (transitoriamente ou estavelmente) de um constructo de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade ACCase melhorada. Também é reconhecido que os métodos da invenção podem empregar um polinucleotídeo que não é capaz de dirigir, na planta transformada, a expressão de uma proteína ou um RNA. Assim, o nível e/ou atividade de um polipeptídeo mutante ACCase pode ser aumentado alterando o gene que codifica o polipeptídeo mutante ACCase ou seu promotor. Ver, por exemplo, Kmiec, Patente dos EUA 5.565.350; Zarling, et al., PCT/US93/03868. Portanto plantas mutagenizadas com mutações em genes ACCase, em que as mutações aumentam a expressão do gene mutante ACCase ou aumentam a atividade do polipeptídeo codificado são fornecidas.

[0149] Reduzindo a atividade e/ou nível de polipeptídeo ACCase

[0150] Também são fornecidos métodos para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptídeo ACCase transformando uma célula de planta com um cassete de expressão que expressa um polinucleotídeo que inibe a expressão da ACC. O polinucleotídeo pode inibir a expressão da ACCase diretamente, ao impedir a transcrição ou a tradução do RNA mensageiro ACCase sintase, ou indiretamente, através da codificação de um polipeptídeo que inibe a transcrição ou tradução de um gene ACCase que codifica um polipeptídeo ACCase. Métodos para inibir ou eliminar a expressão de um gene numa planta são bem conhecidos na arte, e qualquer método pode ser utilizado na presente invenção para inibir a expressão do polipeptídeo ACCase. Muitos métodos podem ser utilizados para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptídeo ACCase sintase. Além disso, mais do que um método pode ser utilizado para reduzir a atividade de um polipeptídeo único ACCase.

1. Métodos Baseados em Polinucleotídeos:

[0151] Em algumas concretizações da presente invenção, uma planta é transformada com um cassete de expressão que é capaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de um polipeptídeo sintase ACCase da invenção. O termo "expressão", tal como aqui utilizado, refere-se à biossíntese de um produto de gene, incluindo a transcrição e/ou tradução do referido produto do gene. Por exemplo, para os fins da presente invenção, um cassete de expressão capaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de, pelo menos, um polipeptídeo ACCase sintase é um cassete de expressão capaz de produzir uma molécula de RNA que inibe a transcrição e/ou tradução de pelo menos um polipeptídeo ACCase sintase da invenção. A "expressão" ou "produção"de uma proteína ou polipeptídeo a partir de uma molécula de DNA refere-se à transcrição e tradução da sequência codificadora para produzir a proteína ou o polipeptídeo, enquanto que a "expressão"ou "produção"de uma proteína ou de um polipeptídeo a partir da molécula de RNA refere-se à tradução da sequência de codificação de RNA para produzir a proteína ou polipeptídeo.

[0152] Exemplos de polinucleotídeos que inibem a expressão de um polipeptídeo ACCase sintase incluem supressão/co- supressão, em que um cassete de expressão é concebido para expressar uma molécula de RNA que corresponde a toda ou parte de um RNA mensageiro que codifica um polipeptídeo ACCase sintase na orientação "senso" e super expressão da molécula de RNA pode resultar na redução da expressão do gene nativo; Supressão antisenso onde o cassete de expressão é concebido para expressar uma molécula de RNA complementar a todo ou parte de um RNA mensageiro que codifica a expressão de polipeptídeo ACCase sintase e a super expressão da molécula de RNA antisenso pode resultar na redução da expressão do gene nativo; interferência de RNA de cadeia dupla em que uma molécula de RNA senso, como descrita acima para co-supressão e uma molécula de RNA anti-senso que seja totalmente ou parcialmente complementar da molécula de RNA senso são expressas na mesma célula, resultando na inibição da expressão do RNA mensageiro endógeno correspondente; Interferência de RNA grampo e Interferência de RNA grampo contendo íntron, onde o cassete de expressão é concebido para expressar uma molécula de RNA que hibridiza com si mesma para formar uma estrutura de grampo que compreende uma região do laço de cadeia simples e uma haste de bases emparelhadas, RNA interferente pequeno ou Micro RNA, em que o cassete de expressão é concebido para expressar uma molécula de RNA que é modelado num gene miRNA endógeno.

2. Inibição Baseada em Polipeptídeo da Expressão Gênica

[0153] Numa concretização, o polinucleotídeo codifica uma proteína de dedo de zinco que se liga a um gene que codifica um polipeptídeo ACCase, resultando na redução da expressão do gene, métodos de seleção dos sítios para direcionar proteínas de dedo de zinco tem sido descritos, por exemplo, na Patente dos EUA n. 6.453.242, e métodos para a utilização de proteínas de dedo de zinco para inibir a expressão de genes em plantas são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente EUA N° 2003/0037355, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.

3. Inibição Baseada em Polipeptídeo da Atividade da Proteína

[0154] Em algumas concretizações da invenção, o polinucleotídeo codifica para um anticorpo que se liga a pelo menos um ACCase e reduz a atividade do polipeptídeo ACCase sintase. A expressão de anticorpos em células de plantas e a inibição da expressão por vias moleculares e a ligação dos anticorpos às proteínas em células de plantas são bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Conrad e Sonnewald, (2003) Nature Biotech. 21:35-36, aqui incorporada por referência.

4. Rompimento de Gene

[0155] Em algumas concretizações da presente invenção, a atividade de um polipeptídeo ACCase sintase é reduzida ou eliminada por ruptura do gene que codifica o polipeptídeo ACCase sintase. O gene que codifica o polipeptídeo ACCase sintase pode ser rompido por qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, numa concretização, o gene é interrompido por marcação de transposon (transposon tagging). Numa outra concretização, o gene é interrompido por mutagênese de plantas usando mutagênese aleatória ou dirigida, e selecionando as plantas que tenham atividade ACCase reduzida.

[0156] Em certas concretizações as sequências de ácido nucléico da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de sequências polinucleotídicas de interesse, a fim de criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhados com quaisquer outros polinucleotídeos da presente invenção, (SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 ou 6), ou com outros genes envolvidos na resistência a herbicidas. As combinações geradas podem também incluir várias cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser empilhados com qualquer outro gene ou combinação de genes para a produção de plantas com uma variedade de combinações de características desejadas, incluindo, mas não limitadas a características desejáveis para a alimentação de animais, tais como genes de óleo elevados (por exemplo, Patente dos EUA N. 6.232.529); aminoácidos hordotioninas equilibrados (por exemplo, (Patente dos EUA N°s 5.990.389; 5.885.801, 5.885.802, e 5.703.409)); lisina superior de cevada (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122), e as proteínas superiores de metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol Chem 261:6279, Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; Musumura et al. (1989) Plant. Mol. Biol 12: 123)), aumento da digestibilidade (por exemplo, proteínas de armazenagem modificadas (aplicação dos EUA Ser. N°s 10/053,410, depositada em 07 de novembro de 2001)), e tioredoxinas (aplicação dos EUA Ser. N°s 10/005,429, depositada em 03 de dezembro de 2001), as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência.

[0157] Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser empilhados com os traços desejáveis de resistência a insetos, doença ou herbicidas (por exemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patente dos EUA N°s 5.366.892; 5.747.450, 5.737.514, 5.723.756, 5.593.881; Geiser et al. (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol 24:825), genes de desintoxicação de fumonisinas (Patente dos EUA N° 5.792.931); avirulência e genes de resistência a doenças (Jones et al. (1994) Science 266:789, Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes acetolactato sintase (ALS) que conduzem a resistência a herbicidas, tais como mutações S4 e/ou Hra, inibidores da glutamina sintetase como fosfinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar) e resistência ao glifosato (gene EPSPS e gene GAT)), e características desejáveis para processamento de produtos ou processos, como a alta do petróleo (Patente dos EUA N° 6.232.529); óleos modificados (por exemplo, os genes de desaturase de ácido graxo (Patente dos EUA N° 5.952.544; WO 94/11516)), amidos modificados (por exemplo, pirofosforilases ADPG (AGPase), sintases de amido (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE) e enzimas de desramificação de amido (SDBE)), e polímeros ou bioplásticos (Patente dos EUA N° 5.602.321), beta-cetotiolase, polihidroxibutirato-sintase, e acetoacetil- CoA-redutase (Schubert et al. (1988) Bacteriol 170:5837-5847) que facilitam a expressão de poli-hidroxialcanoatos (PHAs)), as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência. Pode-se também combinar os polinucleotídeos da presente invenção com polinucleotídeos fornecendo características agronômicas, tais como esterilidade masculina (ver Pat. EUA N° 5.583.210), força do caule, tempo de floração, ou traços de tecnologia de transformação, como a regulação do ciclo celular ou gene alvo (ver, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência.

[0158] Estas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo, mas não limitado a, sequências polinucleotídicas de interesse podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica que compreende uma ou mais características desejadas pode ser utilizada como alvo para introduzir novas características de transformação posterior. As características podem ser introduzidas simultaneamente num protocolo de co- transformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidos no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser acionada pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que irá suprimir a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isto pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de características na planta.

[0159] A presente invenção proporciona um método de genotipagem de uma planta compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. Genotipagem proporciona um meio de distinguir homólogos de um par de cromossomos e pode ser utilizado para diferenciar segregantes numa população de plantas. Métodos de marcadores moleculares podem ser utilizados para estudos filogenéticos, caracterizando relações genéticas entre variedades de culturas, identificando cruzamentos ou híbridos somáticos, localizando segmentos cromossômicos que influenciam características monogênicas, clonagem baseada em mapas, bem como o estudo da herança quantitativa. Ver, por exemplo, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Capítulo 7, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlim (1997). Para os métodos de marcadores moleculares, ver geralmente, The DNA Revolution by Andrew H. Paterson 1996 (Capítulo 2) em: Genome Mapping in plants (Ed., Andrew H. Paterson) by Academic Press/RG Lands Company, Austin, Tex., pp. 7-21.

[0160] O método particular de genotipagem da presente invenção pode empregar qualquer número de técnicas de análise de marcadores moleculares, tais como, mas não limitados a, polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs). RFLPs são o produto de diferenças alélicas entre os fragmentos de restrição de DNA resultantes da variabilidade da sequência de nucleotídeos. Como é bem conhecido dos técnicos na arte, RFLPs são normalmente detectados por extração de DNA genômico e de digestão com uma enzima de restrição. Geralmente, os fragmentos resultantes são separados de acordo com o tamanho e hibridizados com uma sonda; sondas de cópias únicas são as preferidas. Os fragmentos de restrição a partir de cromossomos homólogos são revelados. Diferenças no tamanho do fragmento entre alelos representam um RFLP. Assim, a presente invenção proporciona ainda um meio para seguir a segregação do gene ou ácido nucléico da presente invenção, bem como sequências cromossômicas geneticamente ligadas a esses genes ou ácidos nucléicos utilizando técnicas tais como análise de RFLP. Sequências cromossômicas ligadas estão dentro de 50 centiMorgans (cM), muitas vezes dentro de 40 ou 30 cM, de preferência no prazo de 20 ou 10 cM, mais preferivelmente dentro de 5, 3, 2 ou 1 cM de um gene da presente invenção.

[0161] Na presente invenção, as sondas de ácidos nucléicos utilizadas para mapeamento de marcador molecular de genomas nucleares vegetais hibridizam, sob condições de hibridização seletiva, com um gene que codifica um polinucleotídeo da presente invenção. Em concretizações preferidas, as sondas são selecionadas a partir de polinucleotídeos da presente invenção. Tipicamente, estas sondas são sondas de cDNA ou clones genômicos tratados com enzimas de restrição (por exemplo, PST I). O comprimento das sondas é tipicamente pelo menos 15 bases de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 35, 40 ou 50 bases de comprimento. Geralmente, contudo, as sondas são menos do que cerca de 1 quilobase de comprimento. De preferência, as sondas são sondas de cópia única que hibridizam com um locus único em um complemento do cromossomo haplóide. Algumas enzimas de restrição exemplares utilizadas no mapeamento de RFLP são EcoRI, EcoRV, e SstI. Tal como aqui utilizado, o termo "enzima de restrição"inclui a referência a uma composição que reconhece e, isoladamente ou em conjunto com outra composição, cliva uma sequência de nucleotídeos específica.

[0162] O método de detecção de um RFLP compreende os passos de (a) digestão do DNA genômico de uma planta com uma enzima de restrição, (b) hibridização de uma sonda de ácido nucléico, sob condições de hibridização seletiva, com uma sequência de um polinucleotídeo da presente invenção de DNA genômico, (c) detectar aí um RFLP. Outros métodos para diferenciar variantes polimórficas (alélica) de polinucleotídeos da presente invenção podem ser através da utilização de técnicas de marcadores moleculares bem conhecidas dos técnicos na arte, incluindo técnicas tais como: 1) análise de conformação de cadeia simples (SSCA); 2) eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE), 3) ensaios de proteção de RNase, 4) oligonucleotídeos específicos para o alelo (ASOs); 5) a utilização de proteínas que reconhecem desfasamentos de nucleotídeos, tais como a proteína mutS de E. coli e 6) PCR específica para o alelo. Outras abordagens baseadas na detecção de discrepâncias entre os dois cordões de DNA complementares incluem eletroforese em gel desnaturante de presa (CDGE), análise heteroduplex (HA), e clivagem de incompatibilidade química (CMC). Assim, a presente invenção proporciona ainda um método de genotipagem compreendendo os passos de colocar em contato, sob condições de hibridização rigorosa, uma amostra que se suspeita que compreenda um polinucleotídeo da presente invenção, com uma sonda de ácido nucléico. Geralmente, a amostra é uma amostra de planta, preferivelmente, uma amostra suspeita compreendendo um polinucleotídeo de milho da presente invenção (por exemplo, genes, mRNA). A sonda de ácido nucléico hibridiza seletivamente, sob condições rigorosas, com uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção, que compreende um marcador polimórfico. Hibridização seletiva da sonda de ácido nucléico com a sequência de ácido nucléico do marcador polimórfico produz um complexo de hibridização. A detecção do complexo de hibridização indica a presença do referido marcador polimórfico na amostra. Em concretizações preferidas, a sonda de ácido nucléico compreende um polinucleotídeo da presente invenção.

[0163] Além disso, é reconhecido que os métodos da invenção podem empregar um constructo de nucleotídeos que é capaz de dirigir, em uma planta transformada, a expressão de pelo menos uma proteína, ou, pelo menos, um RNA, tal como, por exemplo, um RNA anti-senso que é complementar a pelo menos uma porção de um mRNA. Tipicamente, tal constructo de nucleotídeos compreende uma sequência que codifica para uma proteína ou um RNA operacionalmente ligado a regiões reguladoras da transcrição 5' e 3'. Alternativamente, é também reconhecido que os métodos da invenção podem empregar um constructo de nucleotídeos que não é capaz de dirigir, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou um RNA.

[0164] Além disso, é reconhecido que os métodos da presente invenção não dependem da incorporação de todo o construto de nucleotídeos no genoma, mas apenas que a planta ou célula da mesma esteja alterada como resultado da introdução do construto de nucleotídeos numa célula. Em uma concretização da invenção, o genoma pode ser alterado com a introdução do construto de nucleotídeos numa célula. Por exemplo, o constructo de nucleotídeos, ou qualquer parte do mesmo, pode incorporar no genoma da planta. Alterações no genoma da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, adições, deleções e substituições de nucleotídeos no genoma. Embora os métodos da presente invenção não dependam de adições, deleções ou substituições de qualquer número particular de nucleotídeos, é reconhecido que essas adições, deleções ou substituições compreendem pelo menos um nucleotídeo.

[0165] Os exemplos seguintes são proporcionados para demonstrar e ilustrar mais certas concretizações preferidas e aspectos da presente invenção e não é para serem interpretados como limitando o seu âmbito.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[0166] Um trigo tolerante inibidor de Acetil Co-Enzima A Carboxilase (Triticum aestivum L.) para uso em um Sistema de Cultivo Tolerante a Herbicidas

[0167] O trigo de inverno (Triticum aestivum L.), com tolerância para a classe de herbicidas inibidores acetil Co- enzima A Carboxilase (ACC) foi desenvolvido através do seguinte método:

[0168] Sementes de trigo de Inverno, variedade Hatcher, foram submetidas a um agente mutagênico químico potente (método não-transgênico), etano metilsulfonato (EMS), a uma taxa de 0,75%, durante 2,5 horas. Esta semente é aqui denotada M1, cada geração subsequente das sementes será denotada com um número crescente sequencialmente após o M. Isto resultou numa frequência de mutação no genoma de trigo de cerca de 1 a mutação por 96 kb (calculada na geração M2). Este trigo foi plantado em fevereiro e colhido em julho. A semente M2 resultante foi plantada no campo em setembro em uma população total de 2,5 milhões de plantas.

[0169] Em Maio do ano seguinte, o campo foi dividido em duas seções, uma seção foi tratada com uma dose letal de quizalofope (~ 1 milhões de plantas) e a outra parte foi tratada com uma dose letal de cletodim (~ 1,5 milhões de plantas). Quizalofope e cletodim são inibidores altamente eficazes de ACCase (inibidor de síntese de lipídeo). A porção quizalofope do campo foi tratada uma segunda vez em Junho. 46 sobreviventes dequizalofop e 167 de herbicida cletodim foram coletados do campo em Julho.

[0170] Ao mesmo tempo uma pequena porção de sementes M2 foi plantada na estufa de Jan-Abril. Aproximadamente 75.000 e 175.000 plantas foram rastreadas com doses letais de quizalofop e cletodim, respectivamente. Após a aplicação, um pequeno subconjunto de sobreviventes ao cletodim (7 plantas) que pareceram mais saudáveis do que os demais foram selecionados pela segunda vez. Esta foi a primeira incidência documentada de melhor tolerância a herbicida na nossa população mutante (Figura 1), em Maio. No total, 26 sobreviventes ao quizalofope e 42 ao herbicida cletodim foram colhidos a partir de ambos os conjuntos de plantas.

[0171] A geração M3 coletada em campo já foi exibida na estufa (agosto-outubro) para quizalofop e cletodim com duas taxas sequenciais de uma dose letal de herbicida (Figura 2). Alguns acessos apresentaram uma elevada taxa de sobrevivência em comparação com outras plantas mutantes e a verificação não- mutada. Alguns estudos de caracterização preliminares que investigam as várias mutações começaram. A Figura 3 mostra alguns acessos tolerantes a ACCase M3 em relação à testemunha não-mutada.

[0172] Estes rastreios fornecem prova inequívoca de que este trigo adquiriu resistência a ACCase que é hereditária e funcional.

EXEMPLO 2

[0173] Um trigo tolerante a um inibidor da Acetil Co-Enzima Carboxilase A (Triticum aestivum L.) para uso em um Sistema de Cultivo Tolerante a Herbicidas

[0174] O trigo de inverno (Triticum aestivum L.), com tolerância para a classe de herbicidas inibidores da acetil Co-enzima A Carboxilase (ACC), foi caracterizado através dos seguintes métodos:

[0175] As plantas que exibem um aumento da tolerância ao herbicida quizalofope foram rastreadas com vários métodos para identificar e caracterizar a causa de aumento. As plantas foram selecionadas para lesão visual, diferenças de tolerância ao quizalofope em toda a planta, resistência cruzada a outros herbicidas, e avaliadas genotipicamente e enzimática.

[0176] Avaliação visual. 18 adesões tolerantes ao quizalofop foram tratadas com 21,05 g ia ha-1 de quizalofop, uma dose de discriminação com base em estudos anteriores. As plantas foram avaliadas 28 dias após o tratamento (DAT) para danos visíveis para quizalofope numa escala de 0 a 100%, sendo 0 nenhum dano e 100 é a dessecação completa. Quase todos os acessos avaliados neste estudo apareceram mais tolerantes ao quizalofope do que o trigo Hatcher não mutante (Figura 5). Os acessos continham poucas plantas completamente mortas, com exceção de um acesso não diferente de base.

[0177] Dose-resposta. Um estudo de resposta à dose foi completado com 11, 23, 46, 92, e 184 g ha-1 de quizalofop. Os topos das 7 plantas DAT foram cortados acima do ponto de crescimento acima do solo mais recente. Avaliação binomial de sobrevivência das plantas foi realizada a 28 DAT. As diferenças foram descobertas em toda a sensibilidade de plantas para aumento das taxas de aplicação de quizalofop. LD 50 's variando desde 10 g ha-1, com a não-tratada, a 76 g de ia ha-1 (Figura 6). Resistentes a proporções sensíveis para esta experiência variaram de 1,6 a 7,5 com base na sobrevivência/morte das plantas.

[0178] Resistência cruzada. Um estudo de resistência cruzada foi realizado dentro do modo herbicida ACCase de ação usando herbicidas normalmente letais ao trigo. Cletodim, setoxidim e fluazifop foram utilizados em taxas de 65, 264 e 361 g ia ha-1, além de um tratamento de cletodim e 10,5 g ia ha-1 de quizalofop. Topos das 7 plantas DAT foram cortados acima do ponto de crescimento acima do solo mais recente. Avaliação binomial de sobrevivência das plantas foi realizada 28 DAT. Tolerância de mutantes quizalofope para cletodim e setoxidim foi baixa (Tabela 1). A presença de qualquer tolerância cruzada apresenta evidência de que a combinação de múltiplos genes ACCase resistentes homólogos numa única planta pode conduzir a resistência a herbicidas adicionais. Nesta fase, apenas um terço do total de ACCase na planta teria uma mutação e conteria a tolerância a inibidores ACCase se a mutação fosse baseada no local de destino.

[0179] Sequenciamento de DNA. DNA foi coletado de 26 fenótipos tolerantes a quizalofop. Iniciadores específicos do genoma foram desenvolvidos para amplificar sequências a partir dos genomas de trigo ancestral A, B e D. Resultados da sequência foram comparados com as sequências de trigo não mutantes previamente clonadas para determinar a presença de substituições de nucleotídeos. Ao comparar as sequências de Hatcher não-mutantes com fenótipos mutantes, três mutações não sinônimas foram reveladas no domínio carboxiltransferase ACCase, todos na posição 2004 no sistema de numeração de aminoácido Alopecurus myosuroides. Esta mutação no genoma A foi encontrada em oito acessos, com o genoma B em nove acessos e, no genoma D em nove acessos. Nenhum acesso teve mais de um desses SNPs. A mutação foi uma substituição C para T, resultando em uma alteração de alanina para valina na sequência de aminoácidos (Figura 7). Cada acesso com maior sobrevida do que o fundo continha um desses SNPs. Com base nos padrões de cromatografia, a maioria destes SNPs também se acredita ser homozigota na planta.

[0180] Caracterização da enzima ACCase. Um ensaio de enzima in vitro foi realizado para observar ACCase em conjunto com quizalofop diretamente para determinar se a presença de mutações ACCase diminui a capacidade de herbicidas para inibir a atividade ACCase. Quatro concentrações de quizalofop de 0,1, 1, 10 e 100 μM foram incluídas no ensaio, juntamente com um controle não-tratado. O experimento incluiu quatro acessos que incluiu um representante das três mutações detectadas e trigo não mutado. Trigo de inverno não mutagenizado Hatcher tinha maior sensibilidade ao quizalofop que os acessos mutantes (Figura 8). As plantas com substituição nos nucleotídeos do genoma B e D resultaram em níveis superiores ao fundo da tolerância ao quizalofop aos 10 uM, e as plantas com a substituição de nucleotídeos no genoma A e D tiveram maior tolerância de fundo que a concentração de 100 μM, com o LSD's (α = 0,05) de 14,5 e 21,6, respectivamente. Calculada ao nível I 25, a resistência a valor suscetível para o A genoma foi 4,57, o genoma B foi 3,57 e o genoma D foi 10,86.

[0181] Com base nestas experiências, o maior fator de tolerância das plantas ao quizalofop é a presença de uma substituição de nucleotídeo C para T na posição 2004.

[0182] Tabela 1. Sobreviventes mutantes tolerantes ao Quizalofope após a aplicação de outros herbicidas ACCase. Acesso 0 é a verificação não-mutante.

[0183] Todas as publicações e patentes mencionadas na presente aplicação são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos descritos e as composições da invenção serão evidentes para os versados na técnica sem nos afastarmos do escopo e do espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em ligação com concretizações preferidas específicas, deverá ser entendido que a invenção como reivindicada não deverá ser indevidamente limitada a tais concretizações específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias para os técnicos nos campos relevantes têm a intenção de estarem dentro do âmbito das seguintes reivindicações.

DECLARAÇÃO DE DEPÓSITO

[0184] Um depósito de sementes da variedade de trigo AF28, AF26 e A10 aqui divulgadas, é e tem sido mantido pela Colorado State University, Fort., Colorado 80523 desde antes da data de apresentação deste pedido e todas as aplicações provisórias referenciadas e aqui incorporadas. O acesso a este depósito estará disponível durante a pendência do pedido para o Comissário de Patentes e Marcas Registradas e pessoas determinadas pelo Comissário para ter direito aos mesmos, mediante solicitação. Ao subsídio de quaisquer reivindicações no pedido, o requerente(s) vai disponibilizar ao público sem restrição de um depósito de pelo menos 2.500 sementes de cada variedade ou linhagem com a American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, 20852. As sementes depositadas na ATCC serão pegas a partir do mesmo depósito mantido na Colorado State University, como descrito acima. Além disso, o Requerente(s) vai atender todas as exigências do 37 CFR § 1,801-1,809, incluindo o fornecimento de uma indicação da viabilidade da amostra quando o depósito for feito. Este depósito das variedades de trigo referidas será mantido no depositário ATCC, que é um depósito público, por um período de 30 anos, ou cinco anos após a requisição mais recente, ou pela vida executória da patente, o que for maior, e será substituído se ele nunca se tornar viável durante esse período. O Requerente não irá impor quaisquer restrições sobre a disponibilidade do material depositado a partir da ATCC, no entanto, o Requerente não tem autoridade para renunciar a quaisquer restrições impostas pela lei sobre a transferência de material biológico ou de seu transporte no comércio.

Claims

1. Método para obtenção de uma planta de trigo caracterizado por compreender: a) transformar uma célula de planta com um ácido nucleico acetil-CoA carboxilase que codifica uma proteína acetil- CoA carboxilase que confere resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase nos níveis dos ditos um ou mais herbicidas que normalmente inibem o crescimento de uma planta de trigo, em que a dita proteína acetil-CoA carboxilase compreende a substituição do aminoácido Ala2004Val quando referenciado à grama preta, SEQ ID NO: 14 ou 16, e em que o dito ácido nucleico acetil-CoA carboxilase compreende a SEQ ID NO: 4, 5 ou 6; b) cultivar dita célula de planta sob condições de crescimento de célula de planta; e c) regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transformada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os referidos um ou mais herbicidas acetil- CoA carboxilase serem de um grupo consistindo de ariloxifenoxipropionatos, ciclohexanodionas e fenilpirazolinas (DENs).

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína compreender a SEQ ID NO: 8, 10, ou 12.

4. Método para cultivar uma planta de trigo tendo uma sequência de ácido nucléico acetil-CoA carboxilase que codifica uma proteína acetil-CoA carboxilase que compreende uma substituição do aminoácido Ala2004Val quando comparado à sequência de referência da grama preta SEQ ID NO: 14 ou 16, e em que a dita sequência de ácido nucleico acetil-CoA carboxilase compreende a SEQ ID NO: 4, 5 ou 6 caracterizado por compreender: a. proporcionar um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase, b. aplicar os referidos um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase à planta de trigo e sua vizinhança em concentração suficiente para inibir o crescimento de ervas daninhas, e em que o crescimento da referida planta de trigo não é afetado adversamente.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por os referidos um ou mais herbicidas acetil- CoA carboxilase serem de um grupo consistindo de ariloxifenoxipropionatos, ciclohexanodionas e fenilpirazolinas (DENs).

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida planta de trigo que compreende resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase ser introduzida no referido germoplasma de plantas de trigo por introgressão.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida planta de trigo ser criada pela introdução na referida planta de uma sequência de ácido nucléico heteróloga que codifica uma proteína ACCase com uma substituição do aminoácido Ala2004Val quando referenciado à grama preta, SEQ ID NO: 14 ou 16 que confere resistência a um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase.

8. Método para produzir uma planta de trigo resistente a um ou mais herbicidas acetil-CoA carboxilase caracterizado por compreender: a) introduzir na referida planta uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína ACCase que compreende uma substituição de aminoácido Ala2004Val, quando comparada com a sequência de referência do tipo grama selvagem e grama preta (SEQ ID NO: 14 ou 16), em que a dita sequência de ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 4, 5 ou 6, e em que a referida proteína ACCase confere resistência à inibição por um ou mais herbicidas acetil- CoA carboxilase nos níveis dos ditos um ou mais herbicidas que normalmente inibem o crescimento de uma planta de trigo.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a referida introdução ser por retrocruzamento.

10. Método para identificar uma planta de trigo que é resistente ao herbicida acetil-CoA carboxilase caracterizado por compreender: a) obter uma amostra de ácido nucléico a partir de uma planta de trigo, b) ensaiar a referida amostra de ácido nucléico para detectar a presença de uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína ACCase que inclui uma ou mais mutações que conferem resistência a herbicidas de acetil- CoA carboxilase presentes na referida amostra de ácido nucléico amplificado, em que a dita uma ou mais mutações codificam uma substituição do aminoácido Ala2004Val quando comparado à sequência de referência da grama preta SEQ ID NO: 14 ou 16, e em que a dita sequência de ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 4, 5 ou 6.

11. Método para obtenção de uma planta de trigo caracterizado por compreender: a) cruzar uma primeira planta de trigo com uma segunda planta de trigo, dita segunda planta de trigo tendo uma sequência de polinucleotídeo ACCase modificada, referida sequência codifica um polipeptídeo ACCase tendo uma valina na posição 2004, quando comparada à sequência de referência da grama preta SEQ ID NO: 14 ou 16, e em que a dita sequência de polinucleotídeo ACCase modificada compreende a SEQ ID NO: 4, 5 ou 6; b) ceifar a semente a partir do dito cruzamento; e c) crescimento da dita semente.

12. Método para conferir resistência a herbicidas ACCase a uma planta, caracterizado por compreender modular a atividade de uma proteína ACCase em uma planta através da introdução na planta de um constructo de ácido nucléico compreendendo um ácido nucléico ACCase operacionalmente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão em uma célula de planta, em que referido constructo de ácido nucléico inclui uma sequência de ácido nucléico das SEQ ID NO: 4, 5, ou 6.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o cassete de expressão ser introduzido através de um método selecionado a partir de um dos seguintes procedimentos: eletroporação, bombardeamento com micro- projétil e transferência mediada por Agrobacterium.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o promotor que funciona em plantas ser um promotor preferido por tecido, promotor específico de tecido ou um promotor indutível.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a planta ser Arabidopsis, trigo, arroz, sorgo, cevada, aveia, grama lawn grass, centeio, soja, canola, Brassica, girassol, milho, sorgo, alfafa, algodão, milheto, amendoim ou cacau.

16. Polinucleotídeo isolado caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) uma sequência de ácido nucléico estabelecida nas SEQ ID NO: 4, 5, ou 6; (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 8, 10 ou 12; e (c) uma sequência de ácido nucléico que compreende o complemento de comprimento total de (a) ou (b).

17. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido polinucleotídeo ser otimizado para expressão em uma planta.

18. Constructo de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo isolado conforme definido na reivindicação 16, caracterizado por o referido polinucleotídeo estar operacionalmente ligado a um promotor que dirige a expressão em uma célula hospedeira, em uma orientação anti-senso para o referido promotor.

19. Cassete de expressão caracterizado por compreender o constructo de DNA conforme definido na reivindicação 16.

20. Método para obtenção de uma planta transgênica caracterizado por compreender: a) transformar uma célula de planta incorporando estavelmente no seu genoma o constructo de DNA conforme definido na reivindicação 18; b) cultivar dita célula de planta sob condições de crescimento de célula de planta; e c) regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transformada.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por referida planta ser selecionada a partir do grupo consistindo de: milho, soja, trigo, arroz, alfafa, cevada, milheto, girassol, sorgo, canola e algodão.

22. Polipeptídeo isolado com atividade ACCase caracterizado por ser selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 8, 10 ou 12; e (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência apresentada nas SEQ ID NO: 4, 5, ou 6.