EA030578B1 - РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ, ВОЗДЕЙСТВУЮЩИМ НА АЦЕТИЛ-КоА КАРБОКСИЛАЗУ - Google Patents

РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ, ВОЗДЕЙСТВУЮЩИМ НА АЦЕТИЛ-КоА КАРБОКСИЛАЗУ Download PDF

Info

Publication number
EA030578B1
EA030578B1 EA201391113A EA201391113A EA030578B1 EA 030578 B1 EA030578 B1 EA 030578B1 EA 201391113 A EA201391113 A EA 201391113A EA 201391113 A EA201391113 A EA 201391113A EA 030578 B1 EA030578 B1 EA 030578B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
plant
acc
wheat
polypeptide
Prior art date
Application number
EA201391113A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391113A1 (ru
Inventor
Майк Остлай
Скотт Хейли
Филип Уэстра
Виктория Эшли Валдез
Original Assignee
Колорадо Уит Рисерч Фаундейшн, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Колорадо Уит Рисерч Фаундейшн, Инк. filed Critical Колорадо Уит Рисерч Фаундейшн, Инк.
Publication of EA201391113A1 publication Critical patent/EA201391113A1/ru
Publication of EA030578B1 publication Critical patent/EA030578B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4678—Triticum sp. [wheat]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/54—1,3-Diazines; Hydrogenated 1,3-diazines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01002—Acetyl-CoA carboxylase (6.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение представляет композиции и способы для получения растений сельскохозяйственной культуры, которые устойчивы к гербицидам. В частности, изобретение представляет растения пшеницы, а также растительные ткани и семена растений пшеницы, содержащие измененные гены и белки ацетил-КоА карбоксилазы и устойчивые к ингибирующему действию гербицидов, которые обычно ингибируют активность белка ацетил-КоА карбоксилазы.

Description

Настоящее изобретение относится к композициям и способам получения растений сельскохозяйственных культур, устойчивых к гербицидам. В частности, настоящее изобретение представляет растения пшеницы, а также растительные ткани и семена пшеницы, которые содержат модифицированные гены и белки ацетил-КоА карбоксилазы (АКК) и являются устойчивыми к ингибированию гербицидами, которые обычно ингибируют активность белка АКК (АКК гербициды).
Уровень техники
Пшеницу выращивают во всем мире, и она является наиболее широко адаптированной зерновой сельскохозяйственной культурой. Обычно растения пшеницы используются в различных пищевых продуктах, таких как хлеб, печенье, торты, крекеры и лапша. Как правило, пшеницу твердых сортов измельчают в муку, используемую для хлебной продукции, а пшеницу мягких сортов измельчают в муку, используемую для выпечки и крекеров. Пшеничный крахмал используется в пищевой и бумажной промышленности, в качестве крахмала для стирки и в других продуктах.
Основной опасностью для коммерческого производства пшеницы является конкуренция сорняков, которая приводит к снижению урожая и получению зерна низкого качества. Хотя для уничтожения сорняков может использоваться культивация почвы, почва возделанных полей очень уязвима к ветровой и водной эрозии. Благодаря легкости применения и эффективности гербицидная обработка является предпочтительным способом контроля сорной растительности. Гербициды также позволяют бороться с сорной растительностью в системах земледелия с применением сниженной подготовкой почвы к посеву или прямого высева, которые разработаны для сохранения высоких уровней остатков на поверхности почвы для предотвращения ее эрозии. Наиболее серьезную конкуренцию пшенице среди сорной растительности создают травянистые сорняки родственных пшенице видов, такие как овсюг и колленица, и трудно разработать эффективную стратегию химического контроля для этих проблемных видов сорной растительности, родственных сельскохозяйственной культуре, поскольку культура также чувствительна к гербициду. Один из подходов к решению этой проблемы включает разработку сортов, устойчивых к гербицидам. В такой системе гербицид применяется по культуре для борьбы с сорной растительностью без ущерба для устойчивых к гербициду растений культуры.
Выработка устойчивости растений к гербицидам представляет значительные производственные и экономические преимущества; и, по существу, применение гербицидов для борьбы с сорной растительностью в культурах стало почти общепринятой практикой. Однако применение таких гербицидов может также вызывать гибель или снижение роста целевых растений сельскохозяйственных культур, приводя к тому, что время и способ применения гербицидов становятся критическими или, в некоторых случаях, неосуществимыми.
Особый интерес для фермеров представляет применение гербицидов с более высокой активностью, широким спектром действия и быстрым разложением в почве. Растения, растительные ткани и семена с устойчивостью к этим соединениям обеспечили бы привлекательное решение, позволяющее применять гербициды для контроля роста сорной растительности без риска повреждения сельскохозяйственной культуры. Одним таким классом гербицидов широкого спектра действия являются соединения, которые ингибируют активность энзима ацетил-КоА-карбоксилазы (АКК) в растении. Такие гербициды относятся к химическим классам арилоксифеноксипропионатов (БОР) и циклогександионов (ΌΙΜ).
Однако пшеница, например, чувствительна ко многим гербицидам, ингибирующим АКК, целевыми видами которых является однодольная (злаковая) травянистая растительность, что делает применение этих гербицидов для контроля сорной растительности в пшенице практически невозможным.
Вследствие важности пшеницы в качестве сельскохозяйственной культуры в мировом масштабе, существует потребность в гибридах пшеницы, устойчивых к гербицидам, ингибирующим АКК, что обеспечит больший урожай при применении этих гербицидов для контроля злаковой сорной растительности.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение представляет композиции и способы получения растений пшеницы, устойчивых к гербицидам. В частности, настоящее изобретение представляет растения, сорта, линии и гибриды пшеницы, а также растительные ткани и семена пшеницы, которые содержат гены и белки измененной ацетил-КоА карбоксилазы (АКК), устойчивой к ингибированию гербицидами, которые обычно ингибируют активность белка АКК.
Пшеница, которая является сельскохозяйственной культурой, чувствительна ко многим гербицидам, ингибирующим АКК, целевыми видами которых являются однодольные или злаковые виды сорной растительности. Однако, как описано в данном изобретении, создан генотип пшеницы, который проявляется устойчивость к гербицидам, ингибирующим АКК. Генетический анализ идентифицировал генетиче- 1 030578 ские отличия в зародышевой плазме мутантной пшеницы, которые приводят к фенотипу устойчивости к АКК гербицидам.
В одном варианте осуществления данное изобретение представляет одно или несколько растений пшеницы, зародышевая плазма которых несет мутацию, приводящую к устойчивости растения к АКК гербицидам. Кроме того, в дальнейших вариантах осуществления настоящее изобретение относится к потомкам (например, Р1, Р2, Р3 и т.д.) гибридов указанных растений, где зародышевая плазма в указанных потомках имеет такую же мутацию, как и в родительском растении. Следовательно, варианты осуществления данного изобретения предоставляют сорта/гибриды пшеницы, чья зародышевая плазма содержит мутацию, которая определяет, что фенотипом растений является устойчивость к АКК гербицидам. В некоторых вариантах осуществления указанные потомки (например, Р1, Р2, Р3 и т.д.) являются результатом скрещивания между элитными линиями пшеницы, в которых по меньшей мере одна линия содержит в зародышевой плазме мутацию, приводящую к устойчивости к АКК гербицидам.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет растение пшеницы, где зародышевая плазма указанного растения пшеницы придает устойчивость к ингибированию одним или несколькими воздействующими на ацетил-КоА карбоксилазу гербицидами в дозах, при которых указанные один или несколько гербицидов обычно ингибируют рост растения пшеницы. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный один или несколько воздействующих на ацетил-КоА карбоксилазу гербицидов являются представителями химических классов арилоксифеноксипропионатов (РОР) и циклогександионов (ΌΙΜ). В некоторых вариантах осуществления изобретения зародышевая плазма указанного растения пшеницы, которая придает устойчивость к ингибированию одним или несколькими воздействующими на ацетил-КоА карбоксилу гербицидами, включает в себя одну или несколько мутаций в гене ацетил-КоА карбоксилазы, как обнаружено в АР28-А, АР26-В или АР10-И (АТСС).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ контроля сорной растительности вблизи растения пшеницы или совокупности растений пшеницы, который включает предоставление одного или нескольких воздействующих на ацетил-КоА карбоксилазу гербицидов; нанесение указанных одного или нескольких действующих на ацетил-КоА карбоксилазу гербицидов на поле с растением пшеницы или совокупностью растений пшеницы таким образом, что применения указанных одного или нескольких гербицидов не оказывает неблагоприятное действие на рост сорной растительности, а на рост указанного растения пшеницы или совокупность растений пшеницы неблагоприятного действия не оказывает. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные один или несколько воздействующих на ацетил-КоА карбоксилазу гербицидов являются представителями химических классов арилоксифеноксипропионатов (РОР) и циклогександионов (ΌΙΜ). В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное растение пшеницы или совокупность растений пшеницы включает одну или несколько мутаций в гене ацетил-КоА карбоксилазы, как обнаружено в АР28-А, АР26-В и/или АР10-И (АТСС).
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет гибрид, линию или сорт пшеницы, где указанные гибрид, линия или сорт пшеницы содержат зародышевую плазму, включающую в себя одну или несколько мутаций в гене ацетил-КоА карбоксилазы, так что указанным гибриду, линии или сорту придается устойчивость к одному или нескольким воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу гербицидам. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные гибрид, линия или сорт созданы посредством интрогрессии зародышевой плазмы пшеницы, которая включает указанные одну или несколько мутаций для придания устойчивости к одному или нескольким гербицидам, воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные гибрид, линия или сорт пшеницы созданы посредством введения гетерологичного гена, включающего в себя одну или несколько мутаций для придания устойчивости к одному или нескольким гербицидам, воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения гибрида, линии или сорта пшеницы, устойчивых к одному или нескольким воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу гербицидам, включающий идентифицирование зародышевой плазмы, придающей указанную устойчивость к гербициду, где указанная устойчивая к гербициду зародышевая плазма получена из устойчивого к гербициду растения пшеницы, и введение указанной зародышевой плазмы в элитный гибрид, элитную линию или элитный сорт растения пшеницы. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное введение указанной зародышевой плазмы в указанный элитный гибрид, растительную линию или элитный сорт растения пшеницы проводится путем интрогрессии. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное введение указанной зародышевой плазмы в указанные элитный гибрид растения пшеницы, элитную линию или элитный сорт пшеницы проводится путем введения гетерологичного гена.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет гибрид, линию или сорт пшеницы, где зародышевая плазма указанных гибрида, линии или сорта обладает предоставленной устойчивостью к одному или нескольким гербицидам, воздействующим на ацетил-КоА-карбоксилазу, и устойчивостью к одному или нескольким соединениям из одной или нескольких групп гербицидов, которые не являются ингибиторами ацетил-КоА-карбоксилазы.
- 2 030578
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ идентификации растительных линий пшеницы, устойчивых к гербицидам, воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу, которые включает получение образца нуклеиновой кислоты из растения пшеницы, предоставление амплификационных праймеров для амплификации участка генома растения пшеницы, соответствующего гену ацетил-КоА карбоксилазы, присутствующему в указанном образце нуклеиновой кислоты, применение указанных амплификационных праймеров к указанному образцу нуклеиновой кислоты таким образом, что происходит амплификация указанного участка указанного гена ацетил-КоА карбоксилазы, и идентификацию растений пшеницы, устойчивых к гербицидам, воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу, на основании наличия в указанном образце нуклеиновой кислоты одной или нескольких мутаций, которые придают устойчивость к гербицидам, воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет семена пшеницы, где указанная зародышевая плазма указанных семян включает мутантный ген ацетил-КоА карбоксилазы так, что указанная мутация придает устойчивость к ингибированию гербицидами, воздействующими на ацетил-КоА карбоксилазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения зародышевая плазма указанных семян пшеницы включает мутантный ген ацетил-КоА карбоксилазы, как обнаружено в АР28-А, АР26-В и/или АР10-Э (АТСС). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет растения пшеницы, выращенные из указанных семян и других частей указанных растений пшеницы, выращенных из указанных семян. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный ген ацетил-КоА карбоксилазы является функциональным фрагментом гена, как обнаружено в АР28-А, АР26В и/или АР10-Э (АТСС), так что фрагмент гена кодирует фрагмент белка, который является достаточным, чтобы придать растениям пшеницы устойчивость к ингибированию гербицидами, воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет растения пшеницы, выращенные из указанных семян и других частей указанных растений пшеницы, выращенных из указанных семян.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет очищенные и выделенные из пшеницы последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют ацетил-КоАкарбоксилазу. Согласно изобретению, последовательности дикого типа, кодирующие ацетил-КоАкарбоксилазу, были идентифицированы из В, Ό и А геномов (8ЕЦ ГО N0: 1, 2 и 3 соответственно). Далее, были идентифицированы мутации каждого генома, которые обеспечивают устойчивость к гербицидам, воздействующим на ацетил-КоА-карбоксилазу, 8ЕЦ ГО N0: 4, 5 и 6 соответственно. Мутация представляет переход от А1а к Vа1 в аминокислотном положении 2004 (на который указывают стандартные ссылки лисохвоста мышехвостниковидного §1|199600899|етЬ|АМ408429.1| и §1|199600901|ешЬ|АМ408430.1 последовательности ГО N0: 13, 14 15 и 16, см. также фиг. 9) для каждого генома, А генома (8ЕЦ ГО N0: 8); В генома (8ЕЦ ГО N0: 10), Ό генома (8ЕЦ ГО N0: 12). Изобретение также включает аминокислоты, кодированные данными последовательностями, включая §ЕЦ ГО N0: 711 или 12, консервативно модифицированные варианты и фрагменты, которые сохраняют АКК активность, а также мутанты, которые обеспечивают устойчивость к гербицидам, воздействующим на ацетилКоА-карбоксилазу.
Таким образом, композиции согласно настоящему изобретению включают изолированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей (а) аминокислотную последовательность, в том числе 8ЕЦ ГО N0: 7, 9 или 11 и §ЕЦ ГО N0: 8, 10 или 12, и (Ь) аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 95 или 99% последовательности §ЕЦ ГО N0: 7, 9, 11 или §ЕЦ ГО N0: 8, 10 или 12, где указанный полипептид обладает АКК активностью или представляет устойчивость к гербициду, воздействующему на ацетил-КоАкарбоксилазу.
Изобретение также включает растение пшеницы, которое содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70% гомологична, по меньшей мере на 80% гомологична, по меньшей мере на 85% гомологична, по меньшей мере на 90% гомологична, по меньшей мере на 95% гомологична, по меньшей мере на 97% гомологична или по меньшей мере на 99% гомологична последовательности ацетил-КоА-карбоксилазы §ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или как обнаружено в АР28-А, АР26-В и/или АР10ГО (АТСС). В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность ацетил-КоА-карбоксилазы кодирует или включает в себя одно или несколько аминокислотных замещений, например А1а2004Vа1, как обнаружено в §ЕЦ ГО N0: 8, 10, или 12.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно представляет гибридные растения пшеницы, которые обладают всеми физиологическими и морфологическими характеристиками указанного растения пшеницы, выращенного из указанного семени пшеницы. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение представляет культуры тканей и регенерированные культуры тканей, которые происходят из указанного семени пшеницы или указанной части растения пшеницы, которые включают мутацию в указанном гене ацетил-КоА-карбоксилазы, как обнаружено в АР28-А, АР26-В и/или АР10-И (АТСС).
- 3 030578
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения семени пшеницы, включающий в себя скрещивание растения, содержащего мутантную форму гена ацетилКоА карбоксилазы, которая обнаружена в АЕ28-А, АЕ26-В и/или ΑΡ10-Ό (АТСС), с самими собой или со вторым растением пшеницы и сбор указанного семени, полученного в результате указанного скрещивания. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы получения указанного семени пшеницы включают в себя посадку семени родительской семенной линии пшеницы, где указанная родительская семенная линия содержит зародышевую плазму, которая придает устойчивость к гербицидам, воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу, с родительской линией опылителя пшеницы, где указанная зародышевая плазма указанных опылителя и/или семенной линии содержит зародышевую плазму, придающую устойчивость к гербицидам, воздействующим на ацетил-КоА карбоксилазу, совместное выращивание указанных родительского семени и опылительных растений пшеницы, что позволяет указанным родительским семенным растениям опыляться указанными родительскими растениями-опылителями, и сбор семени, являющегося результатом указанного опыления.
В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает для генетически модифицированных растений пшеницы введение гетерологичного нуклеотидного конструкта, включающего в себя §ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5 или 6, функционально связанные с регуляторными последовательностями, такими как экспрессионные кассеты, конструкты ингибирования, растения, растительные клетки и семена. Генетически модифицированные растения, растительные клетки и семена согласно настоящему изобретению могут проявлять изменения фенотипа, такие как модулированная АКК или уровни содержания мутантной АКК.
Представлены способы снижения или устранения активности АКК полипептида в растении, включающие введение в растение выбранного полинуклеотида. В специфических способах представленный полинуклеотид снижает уровень содержания АКК в растении.
Представлены также способы повышения уровня мутантного АКК полипептида в растении конститутивно или в специфически регулируемые промежутки времени и ткани, включающие введение в растение выбранного полинуклеотида с подходящими регуляторными элементами. В специфических способах экспрессия мутантного АКК полинуклеотида улучшает устойчивость растения к АКК гербицидам.
Описание фигур
Фиг. 1 представляет собой фотографию первого выявленного растения, устойчивого к действию гербицида. Данное растение выжило после двух применений гербицида клетодима в летальных дозах.
Фиг. 2 представляет собой фотографию М3 растений, выращенных из двух М2 родителей. Растения были дважды последовательно обработаны хизалофопом в летальных дозах. Растения слева выжили после двух применений гербицида. Растения справа погибли после одного применения.
Фиг. 3 представляет собой фотографию исследования зависимости доза-эффект, показывающую повышенную устойчивость отобранных мутантных растений к гербициду хизалофопу в М3 поколении по сравнению с немутагенными растениями озимой пшеницы сорта На1сйег. В 1, 3 и 4 колонках представлены растения, отобранные для получения повышенной устойчивости к гербицидам; в колонке 2 представлена немутагенизированная озимая пшеница сорта На1сйет.
На фиг. 4 представлены последовательности АКК генов из А, В и Ό геномов и мутантного АКК гена АЕ28-А, мутантного АКК гена АЕ26-В и мутантного АКК гена АЕ26ГО.
Фиг. 5 представляет собой график, описывающий визуальные повреждения М3 мутантов, полученных от М2 и отобранных с использованием хизалофопа. Значения ниже горизонтальной линии отличаются от значения, полученного для немутагенного контрольного растения сорта Хетчера и представленного левым прямоугольником.
Фиг. 6 представляет собой график, описывающий результаты испытаний мутагенных растений для определения зависимости доза-эффект с использованием хизалофопа по сравнению со значениями для немутагенного контроля сорта Хетчера, представленного левым прямоугольником, с М2-отобранным М3 растениями.
Фиг. 7 представляет собой график, показывающий сравнение АКК последовательностей дикого типа и мутантных АКК последовательностей в геномах пшеницы А, В и Ό, включающих вновь открытый несинонимический однонуклеотидный полиморфизм (8ш§1е иес1еойбеи ройтпогрйБт - δΝΡ) в каждой мутантной последовательности.
Фиг. 8 представляет собой график сравнения устойчивости энзима АКК к возрастающим концентрациям хизалофопа.
Фиг. 9 показывает выравнивание последовательностей согласно изобретению относительно справочной последовательности лисохвоста мышехвостниковидного и между собой.
- 4 030578
Определения
Для обеспечения четкого и последовательного понимания описания и формулы изобретения, включая раздел, отведенный для таких терминов, предоставлены следующие определения. Единицы, приставки и символы могут быть обозначены в соответствии с их 81 принятой формой. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты, записаны слева направо в направлении от 5' до 3'; аминокислотные последовательности записаны слева направо в направлении от аминогруппы к карбоксильной группе соответственно. Интервалы числовых значений включают значения, определяющие диапазон, и включают каждое целое число в пределах определенного интервала значений. Аминокислоты могут обозначаться в описании либо тремя известными буквенными символами, либо одной буквой, как рекомендовано Комиссией по биохимической номенклатуре ШРАС-ШВ. Нуклеотиды, аналогично, могут обозначаться их общепринятыми однобуквенными кодами. Если иное не предусмотрено, термины программных обеспечений, а также электротехники и электроники, используемые в данном описании, представляют собой термины, определенные в ТЬе №ν ΙΕΕΕ 81аийатй Όίείίοηατγ οί Е1сс1г1са1 аий Е1сс1гошс5 Тспт (5'1' сйШои, 1993). Термины, определенные ниже, более подробно определены ссылкой на спецификацию в целом.
Термин консервативно модифицированные варианты относится к последовательностям аминокислот и нуклеиновых кислот. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновых кислот, термин консервативно модифицированные варианты относится к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или стабильно модифицированные варианты аминокислотных последовательностей. Вследствие вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой белок. Например, кодоны ОСА, ОСС, ОСО и ОСИ кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, на каждой позиции, где аланин определен кодоном, этот кодон может быть заменен любым из соответствующих описанных кодонов без изменения кодированного полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются молчащими (бессимптомными) вариациями и представляют собой один из видов консервативно модифицированных вариаций. В данном описании каждая последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует полипептид, также посредством ссылки на генетический код описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением АИО, который обычно представляет собой только кодон метионина, и ИОО, который обычно представляет собой только кодон триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид согласно настоящему изобретению, является скрытой в каждой описанной полипептидной последовательности и охватывается областью настоящего изобретения.
Что касается аминокислотных последовательностей, специалисту данной области техники будет понятно, что отдельные замещения, делеции или добавления в последовательность нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которая изменяет, добавляет или удаляет единственную аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодированной последовательности, представляет собой консервативно модифицированные вариант, где альтерация приводит к замещению аминокислоты химически подобной аминокислотой. Таким образом, может быть изменено любое число аминокислотных остатков, выбранное из группы, включающей целые числа от 1 до 15. Соответственно, может быть выполнено, например, 1, 2, 3, 4, 5, 7 или 10 альтераций. Консервативно модифицированные варианты обычно обеспечивают аналогичную биологическую активность, как и немодифицированная полипептидная последовательность, из которой они получены. Таблицы консервативных замещений, обеспечивающих получение функционально подобных аминокислот, хорошо известны в данной области техники.
Ниже представлены шесть групп, каждая из которых содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замещения друг друга:
1) аланин (А), серин (8), треонин (Т);
2) аспарагиновая кислота (Ό), глютаминовая кислота (Ε);
3) аспарагин (Ν), глютамин (О);
4) аргинин (К), лизин (К);
5) изолейцин (I), лейцин (Ь), метионин (М), валин (V);
6) фенилаланин (Р), тирозин (Υ), триптофан (V).
См. также СТсфЬЮп (1984) РгоЮиъ XV. Н. Ргсстап аий Сотрапу. Ссылка на любую последовательность в данном описании должна интерпретироваться как последовательность, включающая консервативно модифицированные варианты.
Термин кодирующая или кодированная по отношению к указанной нуклеиновой кислоте означает включение информации для трансляции в указанный белок. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок, может включать нетранслируемые последовательности (например, интроны) внутри транслируемых областей нуклеиновой кислоты или может не содержать таких промежуточных нетранслируемых последовательностей (например, как в кДНК). Информация, посредством которой кодируется белок, определяется посредством использования кодонов. Обычно аминокислотная последовательность кодируется нуклеиновой кислотой с использованием универсального генетического кода. Однако варианты универсального кода, такие как присутствующие в некоторых митохондриях растений, животных и грибов,
- 5 030578 бактериях Мусор1акта саргюо1ит или реснитчатых Масгопис1еик, могут использоваться при экспрессировании нуклеиновой кислоты.
Когда нуклеиновая кислота получена или изменена синтетически, можно извлечь преимущество известных кодоновых предпочтений предполагаемого хозяина, куда должна экспрессироваться нуклеиновая кислота. Например, несмотря на то что последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут экспрессироваться как в однодольные, так и в двудольные растения, последовательности могут модифицироваться для учета специфических предпочтений кодона и предпочтений содержания ОС однодольных или двудольных, поскольку, как было показано, эти предпочтения различаются (Миггау апй а1. Ашйк Кек. 17:477-498 (1989)).
Термин гетерологичная, используемый в данном описании в отношении нуклеиновой кислоты, означает нуклеиновую кислоту, которая происходит из инородных видов или, если из таких же видов, существенно модифицирована относительно своей природной формы в композиции и/или геномном локусе преднамеренным вмешательством человека. Например, промотор, функционально связанный с гетерологичным структурным геном, происходит из видов, отличных от тех, из которых был получен указанный структурный ген, или, если происходит из того же вида, один из них или оба существенно модифицированы относительно исходной формы. Гетерологичный белок может происходить из инородных видов или, если происходит из того же вида, существенно модифицирован относительно исходной формы посредством преднамеренного вмешательства человека.
Термин клетка-хозяин означает клетку, которая содержит вектор и поддерживает репликацию и/или экспрессию вектора. Клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические клетки, такие как Е.соП, или эукариотические клетки, такие как клетки дрожжей, насекомых, амфибий или млекопитающих. Предпочтительно клетки-хозяева представляют собой клетки однодольных или двудольных растений. Особенно предпочтительной клеткой-хозяином однодольного растения является клетка-хозяин кукурузы.
Термин введенная в контексте вставки нуклеиновой кислоты в клетку означает трансфекцию, трансформацию или трансдукцию и относится внедрению нуклеиновой кислоты в эукариотические или прокариотические клетки, где нуклеиновая кислота может быть внедрена в геном клетки (например, хромосому, плазмиду, пластиду или митохондриальную ДНК), преобразована в автономный репликон или временно экспрессирована (например, трансфицированная мРНК).
Термин выделенный (изолированный) относится к материалу, такому как нуклеиновая кислота или белок, который (1) главным образом или по существу свободен от компонентов, которые обычно сопровождают его или взаимодействуют с ним и обнаружены в его естественной окружающей среде. Выделенный материал необязательно содержит материал, не обнаруженный с ним в его естественной окружающей среде; или (2) находится в своей естественной окружающей среде и был синтетически (не природным образом) изменен преднамеренным вмешательством человека в композицию и/или помещен в местоположение в клетке (например, геном или субклеточную органеллу), которое не является родным для материала, найденного в этой среде. Альтерация для получения синтетического материала может проводиться с материалом в его естественном состоянии или после удаления из его естественного состояния. Например, существующая в природе нуклеиновая кислота становится выделенной нуклеиновой кислоты, если она изменена или транскрибирована из ДНК, которая была изменена посредством вмешательства человека, выполненного внутри клетки, из которой она происходит (см., например, Сотроипйк апй Ме!йойк Гог Зйе Оиес1ей Ми1адепек1к ίη Еикагуойс Се11к, Кт1ес, патент США № 5565350; 1п Угуо Ното1одоик Зесщепсе Тагдейпд ш Еикагуойс Се11к; ΖοΗπίβ е! а1. РСТ/иЗ93/03868). Аналогично, существующая в природе нуклеиновая кислота (например, промотор) становится выделенной, если она введена с помощью не существующих в природе средств в локус генома, который не является родным для данной нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты, которые являются выделенными, как определено в описании, также называются гетерологичными нуклеиновыми кислотами.
Термин нуклеиновая кислота, используемый в данном описании, относится к дезоксирибонуклеотидному или рибонуклеотидному полимеру в одноцепочечной или двухцепочечной форме и, если не указано иное, включает известные аналоги, обладающие, по существу, природой нуклеотидов в том, что они гибридизуются до одноцепочечных нуклеиновых кислот способом, аналогичным способу гибридизации природных нуклеотидов (например, пептидным нуклеиновым кислотам).
Термин библиотека нуклеиновых кислот означает коллекцию молекул выделенных ДНК или кДНК, которые включают и, по существу, представляют полную транскрибированную фракцию генома указанного организма. Способы конструирования типичных библиотек нуклеиновых кислот, таких как геномные библиотеки и библиотеки кДНК, описаны в стандартных ссылках по молекулярной биологии, таких Вегдег апй Штте1, Ошйе !о Мо1еси1аг С1отп§ ТесНпкщек. Ме!йойк т Еп/уто1оду. Уо1. 152, Асайетю Ргекк, 1пс., Зап О1едо, СайГ. (Вегдег); ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд-А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2пй ей., Уо1. 1-3 (1989); Сштеп! Рго1осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду, Р.М. АикиЬе1 е! а1., Ейк., Сштеп! Рго1осо1к, а .(от! уеп!иге ЬеЕуееп Огеепе РиЬйкЫпд Аккоаа!ек, 1пс. апй 1оЬп \УПеу & Зопк, 1пс. (1994).
Термин функционально (оперативно, операбельно) связанный, когда используется в данном описании, относится к функциональной связи между промотором и второй последовательностью, где после- 6 030578 довательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующую второй последовательности. Обычно термин функционально связанный означает, что последовательности связанных нуклеиновых кислот являются смежными и, когда необходимо соединить две белок-кодирующих области, смежными и в одной рамке считывания.
Если не указано иное, термин АКК нуклеиновая кислота означает нуклеиновую кислоту, содержащую полинуклеотид (АКК полинуклеотид), кодирующий АКК полипептид с АКК активностью, и включает в себя все консервативно модифицированные варианты, гомологи, паралоги и т.п. Термин АКК ген означает ген согласно настоящему изобретению и относится к гетерологичной геномной форме АКК полинуклеотида полной длины.
Термин растение, когда используется в данном описании, может относиться к целым растениям, частям или органам растений (например, листьям, стеблям, корням и т.д.), растительные клеткам, семенам растений и их потомству. Термин растительная клетка, когда используется в данном описании, дополнительно включает, но без ограничения, клетки, полученные из семян, суспензионных культур, эмбрионов, меристематических областей, каллусной ткани, листьев, корней, побегов, гаметофитов, спорофитов, пыльцы и микроспор или обнаруженные в указанных тканях. Следует также понимать, что термин растительные клетки включает модифицированные клетки, такие как протопласты, полученные из вышеупомянутых тканей. Класс растений, которые могут быть использованы в способах согласно изобретению, как правило, является таким же широкими, как и класс высших растений, поддающихся методикам трансформации, включая как однодольные, так и двудольные растения. Особенно предпочтительные растения включают кукурузу, сою, подсолнечник, сорго, канолу, пшеницу, люцерну, хлопчатник, рис, ячмень и просо.
Термин полинуклеотид, когда используется в данном описании, относится к полидезоксирибонуклеотиду, полирибонуклеотиду или их аналогам, которые имеют, по существу, природу натурального рибонуклеотида, в который они гибридизуются в жестких условиях гибридизации, по существу, до такой же нуклеотидной последовательности, как и природные нуклеотиды, и/или дают возможность осуществлять трансляцию в ту же аминокислоту(ы), что и существующий(е) в природе нуклеотид(ы). Полинуклеотид может представлять собой последовательность полной длины или последовательность природного или гетерологичного структурного или регуляторного гена. Если не указано иное, термин относится к специфической последовательности, а также к ее комплементарной последовательности. Таким образом, в данном описании подразумевается, что термин полинуклеотиды включает ДНК или РНК с остовами макромолекул, модифицированными для стабильности или по другим причинам. Кроме того, термин полинуклеотиды, когда используется в данном описании, включает ДНК или РНК, содержащие необычные основания, такие как, например, инозин, или модифицированные основания, такие как, например, тритилированные основания, названные в данном описании только в качестве двух примеров, являются полинуклеотидами, когда данный термин используется в описании. Следует понимать, что большое количество разнообразных модификаций сделано в ДНК и РНК, которые служат множеству полезных целей, известных специалистам в данной области техники. Термин полинуклеотид, когда используется в данном описании, включает такие химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, а также химические формы характеристических ДНК и РНК вирусов и клеток, в том числе, среди прочих, простых и сложных клеток.
Термины полипептид, пептид и белок используются в данном описании взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляет собой искусственный химический аналог соответствующей существующей в природе аминокислоты, а также существующим в природе аминокислотным полимерам. Основная природа таких аналогов природных аминокислот такова, что белок, в который они вводятся, становится специфически реакционноспособным по отношению к антителам, выявленным к такому же белку, но состоящему исключительно из существующих в природе аминокислот. Термины полипептид, пептид и белок также охватывают модификации, включая, но без ограничения, гликозилирование, присоединение липида, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глютаминовой кислоты, гидроксилирование и АЦФ-рибозилирование. Следует понимать, как хорошо известно и как указано выше, что полипептиды не являются полностью линейными. Например, полипептиды могут быть разветвленными в результате убиквитинирования, и они могут быть кольцевыми с разветвлениями или без, которые обычно являются результатом посттрансляционных событий, включая событие естественной переработки и события, вызванные манипуляцией, проводимой человеком, которые не встречаются в природе. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут быть синтезированы посредством нетрансляционного природного процесса, а также полностью синтетическими способами. Кроме того, данное изобретение предусматривает применение метионинсодержащих и не содержащих метионина аминоконцевых вариантов белка согласно настоящему изобретению.
Термин промотор, когда используется в данном описании, относится к области ДНК, которая расположена выше начала транскрипции и участвует в распознавании и связывании РНК-полимеразы и других белков для инициации транскрипции. Термин растительный промотор означает промотор, спо- 7 030578 собный инициировать транскрипцию в растительных клетках, независимо от того, является ли растительная клетка источником его происхождения или нет. Примеры растительных промоторов включают, но без ограничения, промоторы, полученные из растений, растительных вирусов и бактерий, которые содержат гены, экспрессированные в клетках растений, таких как ЛдгоЬасЮгшт и РЫ/оЬшт. Примеры промоторов под контролем развития (ипбст бсус1ортсп1 сои!то1) включают промоторы, которые предпочтительно инициируют транскрипцию в определенных тканях, таких как листья, корни или семена. Такие промоторы называют тканепредпочтительными. Промоторы, которые инициируют транскрипцию только в определенной ткани, называют тканеспецифическими. Промотор специфического типа клеток в первую очередь стимулирует экспрессию в клетках определенного типа, в одном или нескольких органах, например сосудистых клетках в корнях или листьях. Индуцибельный или репрессируемый промотор представляет собой промотор, который находится под контролем окружающей среды. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию за счет индуцируемых промоторов, включают анаэробные условия или присутствие света. Тканеспецифические промоторы, тканепредпочтительные промоторы, промоторы специфических типов клеток и индуцибельные промоторы составляют класс неконститутивных промоторов. Конститутивный промотор представляет собой промотор, который является активным в любых условиях окружающей среды.
Термин рекомбинантный или генетически модифицированный, используемый в данном описании, относится к клетке или вектору, которые были изменены путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты, или к клетке, полученной из модифицированной таким образом клетки. Следовательно, рекомбинантные или генетически модифицированные клетки, например, экспрессируют гены, которые не обнаружены в идентичной форме внутри природной (нерекомбинантной) формы клетки, или экспрессируют природные гены, которые иначе неправильно экспрессированы, недостаточно экспрессированы (иийсг-схргс88сй) или вообще не экспрессированы в результате преднамеренного вмешательства человека. Термин рекомбинантный или генетически модифицированный, когда используется в данном описании, не охватывает альтерацию клетки или вектора в результате естественных событий (таких как, например, естественная мутация, природная трансформация/трансдукция/транспозиция), т.е. событий, которые происходят без преднамеренного вмешательства человека.
Термин экспрессионная кассета, когда используется в данном описании, означает конструкт нуклеиновой кислоты, генерированный рекомбинантно или синтетически, с серией специфических элементов нуклеиновых кислот, которые обеспечивают транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин. Рекомбинантная экспрессионная кассета может быть включена в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Обычно часть рекомбинантной экспрессионной кассеты вектора экспрессии включает, помимо других последовательностей, нуклеиновую кислоту, подлежащую транскрибированию, и промотор.
Термины остаток, аминокислотный остаток или аминокислота используются в данном описании взаимозаменяемо и относятся к аминокислоте, которая включена в белок, полипептид или пептид (общее определение: белок). Аминокислота может представлять собой существующую в природе аминокислоту и, если не ограничено иным образом, может охватывать неприродные аналоги природных аминокислот, которые могут функционировать таким же образом, как и природные аминокислоты.
Термин селективно гибридизуется означает гибридизацию в жестких условиях последовательности нуклеиновой кислоты с указанной целевой аминокислотной последовательностью в большей степени, которую можно определить (например, по меньшей мере в 2 раза по сравнению с фоновой гибридизацией), чем ее гибридизация с нецелевыми аминокислотными последовательностями, и, по существу, до исключения нецелевых нуклеиновых кислот. Селективно гибридизующиеся последовательности обычно обладают по меньшей мере примерно 80% идентичностью, предпочтительно 90% идентичностью и наиболее предпочтительно 100% идентичностью последовательности (т.е. комплементарны) по отношению друг к другу.
Термин жесткие (строгие) условия или жесткие условия гибридизации относится к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью в определяемой большей степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в два раза большей степени по сравнению с фоновой гибридизацией). Жесткие условия зависят от нуклеотидной последовательности и различны в разных условиях. Посредством контроля жесткости условий гибридизации и/или промывки могут быть идентифицированы целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). Альтернативно, жесткость условий можно регулировать таким образом, чтобы допустить некоторое несовпадение последовательностей для обнаружения более низких степеней сходства (гетерологичное зондирование). Обычно зонд составляет менее чем приблизительно 1000 нуклеотидов в длину, необязательно менее 500 нуклеотидов в длину.
Обычно жесткими условиями будут условия, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,5 М ионов натрия, как правило, концентрация ионов натрия (или других солей) составляет приблизительно от 0,01 до 1,0 М при значении рН от 7,0 до 8,3 и температуре по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, содержащих от 10 до приблизительно 50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, содержащих более 50
- 8 030578 нуклеотидов). Жесткие условия могут быть также достигнуты при добавлении дестабилизующих агентов, таких как формамид. Типичные примеры условий низкой жесткости включают гибридизацию с буферным раствором, содержащим от 30 до 35% формамида, 1 М ЫаС1, 1% 8Ό8 (додецилсульфат натрия) при 37°С с промывкой раствором от IX до 2Х 88С (20х88С=3,0 М ЫаС1/0,3 М тринатрийцитрат) при температуре от 50 до 55°С. Иллюстративные примеры условий умеренной жесткости включают гибридизацию в растворе, содержащем 40 до 45% формамида, 1 М ЫаС1, 1% 8Ό8, при 37°С и промывку раствором от 0,5X до 1Х 88С при температуре от 55 до 50°С. Типичные примеры условий высокой жесткости включают гибридизацию в растворе, содержащем 50% формамида, 1 М ЫаС1, 1% 8Ό8 при 37°С и промывку раствором 0,1Х 88С при температуре от 60 до 65°С в течение 20 мин.
Специфичность, как правило, является функцией послегибридизационной промывки, причем критическими факторами являются ионная сила и температура конечного промывочного раствора. Для ДНК-ДНК гибридов Тт может быть аппроксимирована из уравнения Мешков и ХУакк Апа1. ВюсЬет, 138:267-284 (1984). Тт=81,5°С+16,6 (1о§ М)+0,41 (%СС)-0,61 (% форм.)-500/Ь, где М представляет собой молярность одновалентных катионов, %СС представляет процент нуклеотидов гуанозина и цитозина в ДНК, % форм. представляет процент формамида в растворе для гибридизации и Ь представляет собой длину гибрида в парах оснований. Тт представляет собой температуру (при определенных ионной силе и рН), при которой 50% комплементарно целевой последовательности гибридизуется с идеально подходящим зондом. Тт снижается примерно на 1°С на каждый 1% несоответствия; таким образом, Тт гибридизации и/или промывки может регулироваться для гибридизации с последовательностями нужной идентичности. Например, если целью являются последовательности 90% идентичности, Тт может быть снижена на 10°С. Как правило, жесткие условия выбираются таким образом, чтобы быть примерно на 5°С ниже температуры плавления (Тт) конкретной последовательности и ее комплемента при определенной ионной силе и определенном значении рН. Тем не менее, строго жесткие условия могут использоваться для гибридизации и/или промывки при температуре на 1, 2, 3, 4, 5 или 6°С ниже температуры плавления (Тт); умеренно строгие условия могут использоваться для гибридизации и/или промывки при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже температуры плавления (Тт); условия низкой жесткости могут использоваться для гибридизации и/или промывки при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже температуры плавления (Тт). Используя уравнение, гибридизацию и композицию промывного раствора, а также нужную Тт, специалисту будут понятны вариации жесткости гибридизации и/или раствора для промывки, которые, по существу, описаны выше. Если желаемая степень несоответствия приводит к Тт ниже 45°С (водный раствор) или 32°С (формамидный раствор), предпочтительно увеличить концентрацию 88С так, чтобы можно было использовать более высокие температуры. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в публикации Туккеп, БаЪогаЮгу ТесЬтциек ίη ВюсЬет181ту апб Мо1еси1аг Вюкду-НуЪпШ/аОоп \νΜι Ыис1ею Ашбк РгоЪек, Рай I, СЬар1ег 2, АикиЪе1, е1 а1., Ебк., Стеепе РиЪЬкЫпд апб ^беуНШеткшепсе, №\ν Уотк (1995). Обычно, условиями высокой жесткости промывки являются 2Х 15 мин. в 0,5Х 88С, содержащем 0,1% 8Ό8, при 65°С.
Термин трансгенное растение или генетически модифицированное растение, когда используется в данном описании, относится к растению, которое содержит в своем геноме гетерологичный полинуклеотид. Обычно гетерологичный полинуклеотид стабильно интегрирован в геном таким образом, что полинуклеотид передается в последующие поколения.
Гетерологичный полинуклеотид может быть интегрирован в геном отдельно или как часть экспрессионной кассеты. Термины трансгенная(ый, ое) или генетически модифицированная(ый, ое), используемые в данном описании, относятся к любой клетке, клеточной линии, каллусу, ткани, части растения или растению, генотип которых был изменен присутствием гетерологичной нуклеиновой кислоты, в том числе трансгенным, первоначально измененным таким образом, а также созданным половым скрещиванием или бесполым размножением из исходных трансгенных. Термин трансгенный или генетически модифицированный, используемый в данном описании, не включает изменение генома (хромосомное или внехромосомное) обычными методами селекции растений или естественными событиями, такими как случайное перекрестное опыление, нерекомбинантная вирусная инфекция, нерекомбинантная бактериальная трансформация, нерекомбинантная транспозиция или спонтанная мутация.
Термин вектор, используемый в данном описании, означает нуклеиновую кислоту, используемую в трансфекции клетки-хозяина, в которую может быть вставлен полинуклеотид. Векторы зачастую являются репликонами. Векторы экспрессии позволяют осуществить транскрипцию нуклеиновой кислоты, вставленной в него.
Для описания взаимосвязи между последовательностями двух или нескольких нуклеиновых кислот или полинуклеотидов используются следующие термины: (а) сравнительная (эталонная) последовательность, (Ъ) окно сравнения, (с) идентичность последовательностей, (б) процент идентичности последовательностей и (е) существенная идентичность.
Термин сравнительная (эталонная) последовательность, используемый в данном описании, означает определенную последовательность, используемую в качестве основы для сравнения последовательностей. Сравнительная последовательность может представлять собой часть указанной последовательности или всю указанную последовательность; например, сегмент полноразмерной кДНК или генной по- 9 030578 следовательности или полную кДНК или генную последовательность.
Термин окно сравнения, используемый в данном описании, означает сегмент полинуклеотидной последовательности соединенных и точно определенных нуклеотидов, где полинуклеотидную последовательность можно сравнить с эталонной последовательностью и где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может включать добавления или делеции (т.е. пробелы) в сравнении с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Обычно окно сравнения представляет собой по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов в длину и необязательно может представлять собой 30, 40, 50, 100 нуклеотидов или более. Специалистам в данной области понятно, что во избежание высокого сходства с эталонной последовательностью за счет включения пробелов в полинуклеотидную последовательность обычно вводится штраф (дар реиа11у) пробелов, который вычитают из количества совпадений.
Методы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться с использованием алгоритма локальной гомологичности Смита и Уотермана (см. διηίΐΐι аиб ХУаЮгтап, Λάν. Арр1. Ма1Ь. 2:482 (1981)); с помощью алгоритма гомологического выравнивания Нидлемана и Уансша (см. №еб1етап апб ^ипкеЬ, 1. Мо1. Βίο1. 48:443 (1970)); метода исследования сходства Пирсона и Липмана (см. Реагкоп апб Ыртап, Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. δει. 85:2444 (1988)); с помощью компьютерной реализации этих алгоритмов, включая, но без ограничения: СЬ^ТАЬ ш (Не РС/Сепе ргодгат Ьу 1п!е1йдепейск, Моийат У1е№, СаПГ; САР, ΒΕδΤΡΙΤ, ΒΕΑδΤ, ΡΑδΤΑ, апб ΤΡΑδΤΑ ш 1Ье ХУйсопкш Сепейск 5оП\уаге Раскаде, Сепейск Сотри1ет Сгоир (ССС), 575 5аепсе Ότ., Маб1коп, νίκ., υδΑ; программа ί'.ΈυδΤΑΕ подробно описана: Шддшк апб δίκιη}, Сепе, 73:237-244 (1988); Шддшк апб δ^ιρ, СΑΒIΟδ 5:151-153 (1989); Сотре!, е! а1., ШсШс Ас1бк КекеагсН, 16:10881-90 (1988); Ниапд, е! а1. Сотри!ег Аррйсайопк ш 1йе Вюкшепсек 8:155-65 (1992); Реагкоп, е! а1. Ме!Нобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, 24:307-331 (1994). Группа программ ΒΕΑδΤ, которые могут применяться для исследования базы данных по идентичности, включает следующие программы: ΒΕΑδΤΝ для исследования изучаемых нуклеотидных последовательностей относительно нуклеотидных последовательностей базы данных; ΒΕΑδΤΧ для исследования изучаемых нуклеотидных последовательностей относительно белковых последовательностей базы данных; Β^ΑδΤР для исследования изучаемых белковых последовательностей относительно белковых последовательностей базы данных; ΤΒΕΑδΤΝ для исследования изучаемых белковых последовательностей относительно нуклеотидных последовательностей базы данных и ΤΒΕΑδΤΧ для исследования изучаемых нуклеотидных последовательностей относительно нуклеотидных последовательностей базы данных (см., Сштеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Β^ο1οду, СЬар!ет 19, АикиЬе1, е! а1., Ебк., Сгеепе РиЬйкЫпд апб ^беу-1п!егкс1епсе, №ν Уотк (1995)).
Если не указано иное, показатели идентичности/сходства последовательностей, приведенные в данном описании, относятся к величине, полученной с помощью пакета программ ΒΕΑδΤ 2.0 с использованием параметров по умолчанию (см. А1!ксЬи1 е! а1., ШсШс Ас1бк Кек. 25:3389-3402 (1997)). Программное обеспечение для проведения ΒΕΑδΤ анализов является общедоступным, например, через Национальный центр биотехнологической информации (№Юопа1 Сеп!ег Гог Β^ο!есЬпο1οду-IпГο^тайοп) (\у\у\у.НсЫ.п1т.1иН.до\'/). Этот алгоритм включает в первую очередь выявление пар последовательностей с высокой оценкой (ЖР) путем идентификации коротких слов длины V в исследуемой последовательности, которые совпадают или удовлетворяют некоторым положительно оцененным пороговым значениям Τ при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. Τ называют пороговой оценкой близкого слова (А1!ксЬи1 е! а1., кирга). Эти исходные выборки близкого слова используются в качестве затравки для инициации поиска, предназначенного для нахождения включающих их более длинных ЖР. Затем выборки слова удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может увеличиваться кумулятивный (накопительный) балл. Кумулятивные баллы для нуклеотидных последовательностей вычисляют с использованием параметров М (призовой балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). В аминокислотных последовательностях для вычисления кумулятивного балла используют матрицу баллов. Удлинение выборки слова в каждом направлении прекращается в том случае, если кумулятивный балл при сравнительном анализе снижается на величину Χ от своего максимального достигнутого значения; если кумулятивный балл снижается до нуля или ниже вследствие накопления одного или нескольких отрицательных баллов при сравнительном анализе остатков; или если достигается конец какой-либо последовательности. Параметры алгоритма ΒΕΑδΤ: V, Τ и X - определяют чувствительность и скорость сравнительного анализа. В программе ΒΕΑδΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) в качестве задаваемых по умолчанию параметров используются длина слова (V), равная 11, ожидание (Е), равное 10, предельное значение 100, М=5, N=-4, при этом производится сравнение обеих цепочек. Для аминокислотных последовательностей в программе ΒΕΑδΊΓ используются в качестве задаваемых по умолчанию параметров длина слова (V), равная 3, ожидание (Е), равное 10, и матрица баллов ΒΕΘδυМ62 (см. НешкоГГ и НешкоГГ, Ргос. Νού. Асаб. 8с1. υδΑ, 89: 10915 (1989)).
Помимо вычисления процента идентичности последовательностей, алгоритм ΒΕΑδΤ также проводит статистический анализ подобия двух последовательностей (см., например, Катйп & А1!ксЬи1, Ргос.
- 10 030578
Ν;·ι11. Асаб. δοί. И8А, 90:5873-5787 (1993)). Одним из критериев подобия, предоставленных ВЬА§Т алгоритмом, является наименьшая суммарная вероятность (Ρ(Ν)), которая показывает вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайно.
ВЬА§Т исследования предполагают, что белки могут быть смоделированы как случайные последовательности. Однако множество реальных белков содержит области неслучайных последовательностей, которые могут быть гомополимерными участками, повторениями с коротким периодом или областями, обогащенными одной или несколькими аминокислотами. Такие области низкой сложности могут выравниваться между несвязанными белками, даже если другие участки белка совершенно не похожи. Ряд программ, фильтрующих низкую сложность, могут использоваться для уменьшения таких выравниваний низкой сложности. Например, фильтры низкой сложности 8ΕΟ (\Уоо1еп апб РебегЬеп, Сотри!. СЬет., 17: 149-163 (1993)) и ΧΝυ (С’1ауепе апб §1а!ек, Сотри!. СЬет., 17: 191-201 (1993)) могут использоваться отдельно или в комбинации.
Термин идентичность последовательностей или идентичность, когда используется в данном описании в отношении двух нуклеиновых кислот или полипептидов, относится к остаткам двух последовательностей, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия в заданном окне сравнения. Когда процент идентичности последовательностей используется по отношению к белкам, признается, что положения остатков, которые не являются идентичными, часто отличаются консервативными аминокислотными замещениями, где аминокислотные остатки замещены на другие аминокислотные остатки со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью) и, следовательно, не изменяют функциональных свойств молекулы. Когда последовательности отличаются такими консервативными замещениями, процент идентичности последовательности может быть скорректирован в сторону повышения для коррекции консервативной природы замещения. Считается, что последовательности, которые отличаются такими консервативными замещениями, обладают сходством последовательностей или сходством. Средства для такой корректировки хорошо известны специалистам данной области техники. Обычно это включает в себя оценку консервативного замещения как частичного, а не полного ошибочного спаривания, что повышает процент идентичности последовательностей. Таким образом, например, если идентичной аминокислоте дается оценка 1, а неконсервативному замещению дана оценка, равная 0, консервативное замещение имеет оценку между 0 и 1. Бальная оценка консервативных замещений вычисляется, например, в соответствии с алгоритмом Мейерса и Миллера (Меуегк аиб МШег, Сотри!ег АррЬс. Вю1. 8сг, 4:11-17 (1988)), как это реализовано в программе РС/ΟΕΝΕ (1и!е1ЬдеиеЬс5, МоиШши У1е\у. Са1Г, И8А).
Термин процент идентичности последовательностей, когда используется в данном описании, означает, что данное значение определено путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т. е. пробелы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывается путем определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты или идентичный остаток аминокислоты встречается в обеих последовательностях, для получения числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей.
Термины сорт и культивар, когда используются в данном описании, относятся к растениям, которые определены экспрессией характеристик, полученных из данного генотипа или комбинации генотипов, отличаются от любой другой группы растений степенью выраженности по меньшей мере одной из характеристик и рассматриваются как целое с точки зрения пригодности для размножения неизменными.
Термин гибрид, когда используется в данном описании, относится к потомку или потомству генетически различных растений-родителей или к стоку, произведенному в результате контролируемого перекрестного опыления в отличие от негибридного семени, произведенного в результате естественного опыления.
Термин потомство, когда используется в данном описании, относится к поколениям растения, в которых происхождение поколения может быть прослежено обратно к указанному растению. Термин потомство растения, устойчивого к гербициду, когда используется в данном описании, относится к потомству указанного растения, устойчивого к гербицидам, а также любому мутантному, рекомбинантному или генно-инженерному производному такого растения того же вида или различных видов, где характеристика(и) устойчивости к гербицидам исходного растения, устойчивого гербициду, было передано растению-потомку.
Термин растительная ткань, когда используется в данном описании, включает дифференцированные и недифференцированные ткани растений, включая те, которые присутствуют в корнях, побегах, листьях, пыльце, семенах и опухолях, а также клетки в культуре (например, единичные клетки, протопласты, эмбрионы, каллусы и т.д.). Растительная ткань может быть в растениях, в органной культуре, тканевой культуре или в клеточной культуре.
- 11 030578
Термин часть растения, когда используется в данном описании, относится к структурной части растения или растительной ткани, например пыльце, яйцеклетке, ткани, кожуре, семени и клетке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения трансгенные растения являются растениями сельскохозяйственных культур. Термины сельскохозяйственная культура и растение сельскохозяйственной культуры, когда используются в данном описании, используются в самом широком смысле. Термины включают, но без ограничения, любой вид растений, съедобный для людей или используемый в качестве корма для животных, рыбы или морских животных, потребляемых людьми, используемый для обозрения людьми или любое растение, используемое в промышленности, в торговле или в образовании.
Термин элитная зародышевая плазма, когда используется в данном описании в отношении растений, относится к наследственному материалу с доказанным наследственным превосходством.
Термин элитное растение, когда используется в данном описании, относится к любому растению, которое было получено выведением и селекцией для наилучшей агрономической продуктивности.
Термин признак, когда используется в данном описании, относится к наблюдаемой и/или измеримой характеристике организма. Например, настоящее изобретение описывает растения, которые устойчивы к ТОР и ΌΙΜ гербицидам.
Термины маркер, ДНК маркер и молекулярный маркер, когда используются в данном описании в отношении селектируемого маркера, относятся к физиологическому или морфологическому признаку, который может быть определен как маркер для его собственной селекции или для селекции других признаков, близко связанных с маркером. Например, таким маркером мог бы быть ген или признак, ассоциированный с устойчивостью к гербицидам, включающий, но без ограничения, типичные повторы с простой структурой (51шр1е кесщепсе гереа! - 88К), однонуклеотидный полиморфизм (ктфе иис1еойбе ро1утогрЫкт - 8ΝΡ), генетические вставки и/или делеции и т.п.
Термины интрогрессировать, интрогрессирование и интрогрессия, когда используются в данном описании, относятся к традиционным (т. е. классическим) методикам селекции опылением для вставки инородного генетического материала в линию производителей. Например, настоящее изобретение представляет растения сельскохозяйственной культуры пшеницы, интрогрессированные мутантным АКК геном устойчивости к гербициду путем скрещивания двух генераций растений.
Термин дикий тип, когда используется в данном описании по отношению к гену, относится к функциональному гену, который является общим для популяции растений. Функциональный ген дикого типа - это ген, который наиболее часто наблюдается в популяции и, таким образом, произвольно определяет нормальную форму гена или форму гена дикого типа.
Термины мутант или функциональный мутант, когда используются в данном описании по отношению к гену или генному продукту, относятся соответственно к гену или продукту гена, которые демонстрируют изменения в последовательности и/или в функциональных свойствах (например, измененные характеристики) по сравнению с геном или продуктом гена дикого типа. Таким образом, термины модифицированная или мутантная, когда используются по отношению к нуклеотидной последовательности, относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, которая отличается на один или несколько нуклеотидов от другой, обычно родственной последовательности нуклеиновой кислоты, а термин функциональный мутант, когда используется по отношению к полипептиду, кодируемому указанной модифицированной или мутантной нуклеиновой кислотой, относится к белку или полипептиду, который сохраняет активность. В настоящем изобретении мутантный АКК белок или функциональный мутант представляет собой АКК ген, который сохраняет свою природную активность для создания необходимых аминокислот. Кроме того, термин модифицированная нуклеотидная последовательность интерпретируется как последовательность на основе вырожденного генетического кода, как известно специалистам в данной области. Например, генетический код является вырожденным, поскольку существуют примеры, в которых разные кодоны точно определяют одну и ту же аминокислоту; также существуют примеры, когда в генетическом коде некоторые аминокислоты могут кодироваться более чем одним кодоном каждая. Предполагается, что настоящее изобретение может охватывать такую вырожденность, например, когда гибрид пшеницы включает АКК ген, который гомологичен по меньшей мере на 70%, гомологичен по меньшей мере на 80%, гомологичен по меньшей мере на 85%, гомологичен по меньшей мере на 90%, гомологичен по меньшей мере на 95%, гомологичен по меньшей мере на 97% и гомологичен по меньшей мере на 99% последовательности нуклеотидов 5>Еф ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5 или 6 либо который обнаружен, например, в АР28-А, АР26-В и/или ΆΡΊ0-Ό (АТСС), как обнаружено, например, в зародышевой плазме пшеницы.
- 12 030578
Подробное описание изобретения
Ацетил-КоА карбоксилаза (АКК) является биотинилированным энзимом, который катализирует карбоксилирование ацетил-КоА для получения малонил-КоА. Это карбоксилирование является двухступенчатой, обратимой реакцией, включающей в себя АТФ-зависимое карбоксилирование биотиновой группы на карбоксильном домене-переносчике с помощью биотин-карбоксилазной активности и последующий перенос карбоксильной группы из биотина на ацетил-КоА посредством карбоксилтрансферазной активности (№ко1аи е! а1., 2003, АгсН. ВюсНет. ВюрНук 414:211-22). В растениях ацетилКоА карбоксилаза является не только ключевым энзимом для биосинтеза жирных кислот, процесса, идущего в хлоропластах и митохондриях, но и играет важную роль в образовании длинноцепочечных жирных кислот и флавоноидов, а также в малонилировании, протекающем в цитоплазме. Существует две изоформы АКК, и АКК хлоропластов ответственна более чем за 80% общей активности АКК (НегЬег! е! а1., 1996, ВюсНет. 1. 318:997-1006). Арилоксифеноксипропионаты (РОР) и циклогександионы (ΌΙΜ) представляют два класса химических веществ, которые, как известно, селективно ингибируют хлоропластную форму АКК в травах (Кепйша е! а1., 1990, 1. Адпс. Роой СНет. 38: 1282-1287).
Семена вариетета пшеницы подвергались воздействию химического мутагена этанметилсульфоната (еШаи теШуКиПопаЮ - ΕΜδ), высаживались и оценивались на устойчивость к АКК гербицидам. Один из генотипов, АР28-А (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4) экспрессировал высокие уровни устойчивости к каждому из испытанных гербицидов. Кроме того, в данном изобретении было показано, что скрещивание АР28-А, АР26-В и/или АР10ГО с элитными родительскими линиями приводит к получению множества хороших семян и устойчивости к АКК гербицидам у потомства растений.
По существу, один вариант осуществления настоящего изобретения представляет зародышевую плазму растения, которая содержит измененные гены и белки АКК. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет применение АКК гербицидов на полях гибридных растений для уменьшения количества однодольной сорной растительности, присутствующей на указанном поле культуры, где указанная зародышевая плазма указанного гибрида включает измененный энзим АКК, который придает устойчивость к АКК гербицидам, а указанные сорняки являются чувствительными к АКК гербицидам. Предпочтительные растения сельскохозяйственных культур включают пшеницу, рис и ячмень или другие однодольные зерновые растения с аналогичной мутацией.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет растение с устойчивостью к ингибированию АКК гербицидами, отдельно или в сочетании с другими признаками устойчивости, например резистентность к насекомому - огневке СЫ1о рат1е11и8 (СицакНапкаг е! а1., 2005, Р1ап! Се11 Кер. 24:513-522, данная публикация включена в настоящее описание во всей полноте). В некоторых вариантах осуществления изобретения, например, гибрид пшеницы, зародышевая плазма которого содержит синтетический ген сгу1 Ас из ВасШик Ошппщещй (В!), интрогрессируется в линию пшеницы, зародышевая плазма которой придает устойчивость к АКК гербицидам. Также включение в один и тот же гибрид устойчивости к АКК гербицидам и устойчивости к насекомым достигается с помощью трансгенеза. Специалисту данной области техники будут понятны различные методики, описанные в настоящем изобретении, которые применимы для введения двух или нескольких характерных признаков устойчивости в одно и то же растение.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет устойчивость к АКК гербицидам в растениях, содержащих, например, АКК зародышевую плазму, обозначенную АР28-А, АР26-В и/или АР10ГО (АТСС), введенную в элитные сорта путем размножения и отбора, тем самым обеспечивая создание устойчивых к гербицидам растений, которые будут выдерживать применение гербицидов, ингибирующих АКК, для контроля роста сорной растительности. Введение этого признака устойчивости к гербицидам в указанные выше растения позволяет применять эти гербициды для контроля однодольных сорняков, которые растут в присутствии данных сельскохозяйственных культур. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение зародышевой плазмы с устойчивостью к АКК гербицидам в элитные линии представляет собой интрогрессию или классические способы селекции. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение гена устойчивости к АКК гербицидам в элитные линии представляет собой трансгенез гетерологичного гена с экспрессией или конструкторами ингибирования. В некоторых вариантах осуществления изобретение представляет растение, предпочтительно растение пшеницы, у которого, по меньшей мере, один предок содержит ген устойчивости к АКК гербицидам из зародышевой плазмы АР28-А, депонированной под инвентарным номером АТСС. В некоторых вариантах осуществления ген устойчивости к АКК гербицидам включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая гомологична по меньшей мере на 70%, гомологична по меньшей мере на 80%, гомологична по меньшей мере на 85%, гомологична по меньшей мере на 90%, гомологична по меньшей мере на 95%, гомологична по меньшей мере на 97% и гомологична по меньшей мере на 99% последовательности 5ΕΟ ГО ΝΟ: 4, или ген устойчивости к АКК гербицидам, обнаруженный в АР28-А, депонированной под инвентарным номером АТСС. В некоторых вариантах осуществления ген устойчивости к АКК гербицидам гомологичен по меньшей мере на 70%, гомологичен по меньшей мере на 80%, гомологичен по меньшей мере на 85%, гомологичен по меньшей мере на 90%, гомологичен по меньшей мере на 95%, гомологичен по меньшей мере на 97% или гомологичен по меньшей мере на 99% последовательности
- 13 030578
5>ΕΟ ΙΌ N0: 4 или гену устойчивости к АКК гербицидам, обнаруженному в АР28-А, депонированной под инвентарным номером АТСС, который включает аминокислотное замещение А1а2004Уа1.
В некоторых вариантах осуществления зародышевая плазма, устойчивая к АКК гербицидам, интрогрессирована в элитную линию растения с использованием классических способов селекции. Примеры классических способов селекциии пшеницы, ячменя, риса и других однодольных зерновых растений могут быть найдены, например, в публикации §1ерег апб РоеЫшаи, 2006, ВгееШпд Είοΐά Сгорв. ΕίΓιΠ Εάίίίοη, В1аск\уе11 РиЬйвЫпд, содержание которой введено в данное описание во всей полноте.
В одном варианте осуществления изобретения, зародышевая плазма с устойчивостью к АКК гербицидам интрогрессирована в растение, предпочтительно растение пшеницы, используемое для употребления в пищу человеком. В некоторых вариантах осуществления изобретения зародышевая плазма с устойчивостью к АКК гербицидам интрогрессирована в растения пшеницы, используемые для корма домашнего скота (например, для домашней птицы, крупного рогатого скота, свиней, овец и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения зародышевая плазма, устойчивая к АКК гербицидам, интрогрессирована в растения пшеницы, используемые в промышленных процессах, таких как производство этанола. В одном варианте осуществления изобретения ген устойчивости к АКК гербицидам введен в геном растения путем трансгенеза с помощью векторов и методов, известных в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет устойчивую к АКК гербицидам зародышевую плазму частей растений пшеницы линии АЕ28-А, депонированной под инвентарным номером АТСС, где указанная часть растения пшеницы представляет собой одну или несколько частей растения, выбранную из пыльцы, яйцеклетки, ткани, плода, семян и клетки. В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет гибриды поколения Е1, зародышевая плазма которых содержит ген устойчивости к АКК гербицидам, как описано в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления изобретения Е1-гибриды являются результатом скрещивания двух элитных линий пшеницы, из которых по меньшей мере одна содержит ген устойчивости к АКК гербицидам, как описано в настоящем изобретении.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способы контроля сорной растительности на полях с совокупностью культурных растений. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения контроль сорной растительности включает применение АКК гербицида по указанной совокупности растений таким образом, что рост сорной растительности ингибируется, а рост культурных растений не подвергается неблагоприятному воздействию. В некоторых вариантах осуществления изобретения применяемый АКК гербицид принадлежит к семейству гербицидов класса арилоксифеноксипропионатов (Е0Р), включая, но без ограничения, клодинафоп-пропаргил, цигалофопбутил, диклофоп-метил, феноксапроп-п-этил, флуазифоп-Ь-бутил, галоксифоп-этоксиэтил, галоксифопэтотил, галоксифоп-К-метил, пропахизафоп, хизалофоп-р-этил и хизало-Р-рефурил. В некоторых вариантах осуществления изобретения применяемый АКК гербицид принадлежит к семейству гербицидов класса циклогександионов (ΌΙΜ), включая, но без ограничения, аллоксидим, бутроксидим, клефоксидим, клетодим, циклоксидим, профоксидим, сетоксидим, тепралоксидим и тралкоксидим. В некоторых вариантах осуществления изобретения применяемый АКК гербицид включает комбинацию АКК гербицидов химических соединений классов Е0Р и ΌΙΜ, как описывается в настоящем изобретении. Однако применение согласно настоящему изобретению не ограничивается используемыми АКК гербицидами, и специалисту данной области техники будет понятно, что в любой момент времени могут быть открыты новые АКК гербициды, которые ингибируют энзим АКК.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет растение (например, Е1, Е2, Е3, Е4 и т.д.), зародышевая плазма которого придает устойчивость к АКК гербицидам и устойчивость к одному или нескольким дополнительным гербицидам, принадлежащим к одной или нескольким различным группам гербицидов. Например, дополнительные группы гербицидов, используемых для ингибирования роста сорной растительности, включают, но без ограничения, ингибиторы синтеза липидов (например, арилоксифеноксипропионаты, циклогександионы (сус1оЬехапобеюие8), бензофураны, хлорзамещенные карбоновые кислоты, фосфордитиоаты, тиокарбаматы), ингибиторы фотосинтеза фотосистемы ΙΙ (например, фенилкарбаматы, пиридазиноны, триазины, триазиноны, триазолиноны, урацилы, амиды, мочевины, бензотиадиазиноны, нитрилы, фенилпиридины), ингибиторы фотосинтеза фотосистемы Ι (например, бипиридилиумы), ингибиторы протопорфириногеноксидазы (например, дифенилэфиры, Νфенилфталимиды, оксадиазолы, оксизолидиндионы, фенилпиразолы, пиримидиндионы, тиадиазолы), ингибиторы биосинтеза каротиноидов (например, пиридазиноны, пиридинкарбоксамиды, изоксазолидиноны, триазолы), ингибиторы 4-гидрксифенилпируватдиоксигеназы (например, каллистемоны, изоксазолы, пиразолы, трикетоны), ингибиторы ЕПТТТП синтазы (например, глицины), ингибиторы глутаминсинтазы (например, фосфиновые кислоты), ингибиторы дигидроптероатсинтазы (например, карбаматы), ингибиторы сборки микротрубочек (например, бензамиды, бензойные кислоты, динитроанилины, фосфороамидаты, пиридины), ингибиторы клеточного деления (например, ацетамиды, хлороацетамиды, оксиацетамиды), ингибиторы синтеза клеточной стенки (например, нитрилы, триазолкарбоксамиды) и ингибиторы транспорта ауксина (например, фталаматы, семикарбазоны). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет Ε1 гибриды элитных линий растений, которые включают ус- 14 030578 тойчивость к одному или нескольким АКК гербицидам отдельно или в сочетании с устойчивостью к гербицидам из одной или нескольких из указанных групп гербицидов.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет применение гетерологичной нуклеотидной последовательности, включающей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5 или 6, кодирующей АКК белок дикого типа или мутантный АКК белок (8ЕЦ ГО N0: 7-11 или 12) для обеспечения выбранного агрономического признака устойчивости к АКК гербицидам. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность включает мутантный АКК ген, обнаруженный в зародышевой плазме, обозначенной как АР28-А, АР26-В и/или АР10-И и депонированной под инвентарными номерами АТСС. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность является гомологичной по меньшей мере на 70%, гомологичной по меньшей мере на 80%, гомологичной по меньшей мере на 85%, гомологичной по меньшей мере на 90%, гомологичной по меньшей мере на 95%, гомологичной по меньшей мере на 97%, гомологичной по меньшей мере на 99% последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения АКК нуклеотидная последовательность функционально связана с промоторной последовательностью и образует часть экспрессии или конструкта ингибирования, и в некоторых вариантах осуществления изобретения АКК нуклеотидная последовательность является гомологичной по меньшей мере на 70%, гомологичной по меньшей мере на 80%, гомологичной по меньшей мере на 85%, гомологичной по меньшей мере на 90%, гомологичной по меньшей мере на 95%, гомологичной по меньшей мере на 97%, гомологичной по меньшей мере на 99% к гену, устойчивому к АКК гербицидам, как обнаружено в АР28-А, АР26-В и/или АР10-И и/или 8ЕЦ ГО N0: 6, включающей аминокислотное замещение А1а2004Уа1 в А, В или И геноме.
Классическое размножение пшеницы.
Полевые культуры были выведены классическим способом на основе подходов, в которых использовались преимущества метода(ов) опыления растений. Растение считается самоопыляющимся, если пыльца из одного цветка может быть перенесена на этот же или другой цветок этого же растения, в то время как перекрестно опыляемыми считаются растения, у которых, для того чтобы опыление могло произойти, пыльца должна быть перенесена с цветка другого растения. Растения, которые самоопылялись и отбирались в течение многих поколений, становятся гомозиготными по большинству, если не по всем генным локусам, продуцируя, таким образом, однородную популяцию истинного племенного потомства. Скрещивание двух гомозиготных растений разного происхождения или двух разных гомозиготных линий будет давать однородную популяцию гибридных растений, которые, более чем вероятно, будут гомозиготными в большом количестве генных локусов. Скрещивание двух растений, каждое из которых является гетерозиготным по ряду генных локусов, будет давать поколение гибридных растений, которые генетически различны и не являются однородными.
Растения пшеницы являются самоопыляющимися растениями, но их также можно разводить перекрестным опылением. Разработка гибридов пшеницы требует разработки родителей-опылителей (восстановителей плодородия) и семенных инбредных родителей с помощью системы мужской стерильности - восстановления фертильности, скрещивания семенных родителей и родителей-опылителей, а также оценки результатов скрещивания. Гибриды пшеницы также могут быть разработаны с использованием агентов химической гибридизации, которые применяются для обеспечения мужской стерильности женского родителя гибрида. Программы чистопородного разведения объединяют желаемые признаки; в настоящем изобретении желаемым признаком является устойчивость растения к АКК гербицидам. Этот признак помещается в пул разведения, состоящий из одной или нескольких линий, так что новые инбредные линии создаются путем скрещивания и последующим отбором растений с желаемым признаком, последующими дополнительными скрещиваниями и т.д. Новые инбредные особи скрещиваются с другими инбредными линиями (например, с элитными растительными линиями, как описано в настоящем описании).
Селекционное разведение начинается со скрещивания двух генотипов, таких как АР28-А, АР26-В и/или АР10-И. и элитной линии пшеницы. Если два исходных родителя не обеспечивают все требуемые характеристики, то в селекционную популяцию могут быть включены и другие источники. Например, если желателен гибрид, устойчивый к АКК гербицидам и гербицидам другой группы, как описано в изобретении, то могут скрещиваться растения с этими признаками с использованием классических методов селекции. В методе селекции высшие растения являются самоопыляемыми и отбираются в последующих поколениях. В последующих поколениях гетерозиготное состояние дает путь к однородным линиям гомозиготных растений как результат самоопыления и селекции. Как правило, в методе селекции на практике получают пять или более поколений самоопыления и селекции (например, 81, 82, 83, 84, 85 и т.д.).
Обратное скрещивание используется для улучшения растительной линии. Обратное скрещивание переносит специфический желаемый признак из одного источника в другой, который нуждается в данном признаке. Это достигается, например, скрещиванием донора (например, АР28-А) с элитной инбредной линией (например, с элитной линией). Потомство этого скрещивания затем скрещивается обратно (т.е. проводится обратное скрещивание) с элитной инбредной линией с последующим отбором в получившемся потомстве по желаемому признаку (например, устойчивости к АКК гербицидам). После пяти или большего количества поколений обратного скрещивания с отбором по желаемому признаку потом- 15 030578 ство становится типично гетерозиготным по локусу, контролирующему желаемый фенотип, но будет походить на элитного родителя по другим генетическим признакам. Последнее обратное скрещивание обычно проводится с самим растением для создания чистого селекционного (племенного) потомства для передачи гена.
В использующихся в настоящее время программах разведения гибридов пшеницы разрабатываются новые родительские линии для получения семенных родительских линий или линий родителейопылителей в зависимости от того, содержат ли они гены восстановления фертильности; семенные родительские линии не имеют генов восстановления фертильности, обладают мужской стерильностью в определенных цитоплазмах (также известные как растения А линии) и обладают мужской фертильностью в других цитоплазмах (также известные как растения В линии), тогда как линии родителей-опылителей не обладают мужской стерильностью и содержат гены восстановления фертильности (также известные как растения К линии). Семенные родительские линии обычно создаются так, чтобы они обладали цитоплазматической мужской стерильностью и чтобы пыльники в этих растениях были либо минимального размера, либо отсутствовали вообще и, следовательно, требовалось перекрестное опыление. Семенные родительские линии будут производить только семя, и цитоплазма переносится только через яйцеклетку. Пыльца для перекрестного опыления представляется линиями родителей-опылителей, которые содержат гены, необходимые для полного восстановления фертильности в гибридах Р1, и скрещивание объединяет этих родителей с обладающим мужской стерильностью семенным родителем для получения высокоурожайного простого гибрида с хорошим качеством зерна.
Обычно такая система цитоплазматической стерильности/восстановления фертильности используется для получения гибридного семени путем высаживания блоков грядок с растениями с мужской стерильностью (семенными родителями) и блоков грядок с растениями восстановителями фертильности (родителями-опылителями), так чтобы растения семенных родителей опылялись с помощью ветра пыльцой с растения родителя-опылителя. Этот процесс дает мощный простой гибрид, который собирается и выращивается потребителем. Обладающие мужской стерильностью растения семенных родителей могут быть также созданы с помощью генетической селекции в определенной популяции рецессивных ядерных генов мужской стерильности, однако цитоплазматическая система мужской стерильностивосстановления фертильности является основной системой, используемой при выведении гибрида пшеницы, хотя широко используется и химически индуцированная мужская стерильность. Слепер и Поельман (см. §1ерег апб РоеЫшаи, 2006, Вгеебшд Пе1б Сгорк, ΕίΓΠι Еб., В1аск\уе11 РиЪНкЫпд) представили хороший обзор современных методик по селекции растений пшеницы, и данная публикация включена в настоящее описание во всей полноте в виде ссылки.
Настоящее изобретение не ограничивается перечисленными линиями пшеницы, и квалифицированному специалисту данной области техники будет понятно, что любая элитная линия пшеницы в равной степени подходит для композиций и способов, описанных в настоящем описании.
Трансгенез растений.
Композиции согласно настоящему изобретению включают последовательности для нуклеотидных последовательностей пшеницы, которые были идентифицированы как АКК кодирующие последовательности и которые вовлечены в реакцию растений на действие АКК гербицидов. В частности, настоящее изобретение представляет молекулы выделенных нуклеиновых кислот, включающие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, показанные в §ЕЦ ГО N0: 5, 6, 7, 8 и 9. Представлены также полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, кодированную молекулой нуклеиновой кислоты, описанной в данном изобретении, например нуклеотидными последовательностями, показанными §ЕЦ ГО N0: 1, 2, 4, 5 или 6.
Композиции согласно настоящему изобретению могут применяться в различных способах, посредством которых белковые продукты могут экспрессироваться в культурные растения для функционирования в качестве устойчивых к гербицидам белков. Такая экспрессия приводит к альтерации или модулированию уровня, ткани или продолжительности экспрессии для достижения улучшенной устойчивости к АКК гербицидам. Композиции согласно настоящему изобретению могут экспрессироваться в те же виды, из которых происходит ацетил-КоА карбоксилаза, или, альтернативно, могут экспрессироваться в любое растение, представляющее интерес. В данном способе кодирующая последовательность для АКК может использоваться в комбинации с промотором, который вводится в культурное растение. В одном варианте осуществления изобретения может применяться конститутивный промотор высокого уровня экспрессии, что должно приводить к высоким уровням экспрессии АКК. В других вариантах осуществления изобретения кодирующая последовательность может оперативно связываться с тканеспецифическим промотором для инициирования экспрессии в растительной ткани, которая, как известно, является чувствительной к АКК гербицидам, такой как листья. Аналогично может применяться манипуляция тайминга экспрессии. Например, посредством разумного выбора промотора экспрессия может быть повышена на ранней стадии роста растения, когда растение должно быть чувствительно к гербицидной обработке.
- 16 030578
В конкретных вариантах осуществления изобретения способы повышения устойчивости к действию гербицида в растении включают стабильное трансформирование растения с помощью ДНК конструкта, включающего нуклеотидную последовательность согласно изобретению, функционально связанную с промотором, который стимулируют экспрессию в растении.
Представлены также трансформированные растения, растительные клетки, растительные ткани и семена.
Способы согласно настоящему изобретению могут применяться с другими способами, доступными в данной области техники для улучшения других признаков в растении. Понятно, что такие вторые нуклеотидные последовательности могут применяться для повышения смысловой и антисмысловой ориентации в зависимости от желаемого результата.
Именно такая сверхэкспрессия мутантных нуклеотидных последовательностей АКК (δΕΟ ГО N0: 4, 5 и/или 6) была бы предпочтительным способом применения мутантных нуклеотидных последовательностей. Различные преимущества и недостатки применения различных промоторов для стимулирования такой сверхэкспрессии хорошо известны специалисту данной области техники. Однако, например, конститутивный промотор мог бы стимулировать экспрессию, но более идеальным промотором был бы промотор целевой ткани, такой как листья.
Последовательности согласно настоящему изобретению, как более подробно обсуждено ниже, включают кодирующие последовательности, антисмысловые последовательности и их фрагменты и варианты. Экспрессия последовательностей согласно настоящему изобретению может применяться для модулирования или регулирования экспрессии соответствующих АКК белков. Настоящее изобретению включает выделенные или по существу очищенные композиции нуклеиновых кислот или белков.
Фрагменты и варианты раскрытых нуклеотидных последовательностей и белков, кодированных с их помощью, включены в область настоящего изобретения. Термин фрагмент означает часть нуклеотидной последовательности или часть аминокислотной последовательности и, следовательно, белка, кодируемого с ее помощью. Фрагменты нуклеотидной последовательности могут кодировать фрагмента белка, которые сохраняют биологическую активность природного белка, следовательно, обладают АККподобной активностью и, таким образом, влияют на чувствительность к гербицидам.
Альтернативно, фрагменты нуклеотидной последовательности, которые могут применяться в качестве зондов гибридизации, обычно не кодируют фрагменты белков, сохраняющих биологическую активность. Таким образом, фрагменты нуклеотидной последовательности могут содержать по меньшей мере от примерно 20 нуклеотидов, от примерно 50 нуклеотидов, от примерно 100 нуклеотидов и до нуклеотидной последовательности полной длины, кодирующей белки согласно настоящему изобретению.
Фрагмент АКК нуклеотидной последовательности, который кодирует биологически активную часть АКК белка согласно изобретению, будет кодировать по меньшей мере от 15, 25, 30, 50, 100, 150 или 250 сопряженных аминокислот до полного количества аминокислот, присутствующих в белке полной длины согласно настоящему изобретению.
Нуклеотидные последовательности согласно изобретению могут применяться для выделения соответствующих последовательностей из других организмов, в частности из других растений, точнее из других однодольных растений. В данном случае способы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), гибридизация и т.п., могут применяться для идентификации таких последовательностей на основании их гомологии с последовательностями, находящимися в этих организмах. Последовательности, выделенные на основе идентичности таких последовательностей к полным АКК последовательностям, представленным в них, или к их фрагментам, включены в объем настоящего изобретения. Такие последовательности включают последовательности, которые являются ортологами раскрытых последовательностей. Термин ортолог означает гены, которые полученные из обычных анцестральных генов и которые обнаружены в других видах как результат видообразования. Гены, обнаруженные в других видах, считаются ортологами, когда их нуклеотидные последовательности и/или кодируемые последовательности белков проявляют по существу идентичность, как определено в данном описании. Функции ортологов зачастую являются высококонсервативными среди видов.
В ПЦР подходе оригонуклеотидные праймеры могут быть разработаны для применения в ПЦР реакции для амплификации ДНК последовательностей из кДНК или геномных ДНК, извлеченных из любого растения, представляющего интерес. Способы разработки ПЦР праймеров и ПЦР клонирования хорошо известны в данной области техники и раскрыты, например, 8атЬгоок (см. также Ιηηΐ8 е1 а1., еб8. (1990), РСК РгоЮсоБ: А Сшбе Ю Мебюбз апб Аррйсабопз (Асабепис Рге88, Νον Уогк); Ιηηίδ апб Ое1Гапб, еб8. (1995), РСК <1га1ед1е8 (Асабепис Рге88, Νσν Уогк); Ιηηίδ аиб СейаМ, еб8. (1999), РСК Ме1йоб8 Маша1 (Асабетк Рге88, №ν Уогк)). Известные способы ПЦР включают, но без ограничения, способы, использующие спаренные праймеры, вложенные праймеры, единственные специфические праймеры, дегенеративные праймеры, ген-специфические праймеры, вектор-специфические праймеры, частично ошибочно спаренные праймеры (рагйа11у-т18та1сйеб рптег8) и т.п.
В методиках гибридизации вся известная нуклеотидная последовательность или ее часть используется в качестве зонда, который селективно гибридизуется с другими соответствующими нуклеотидными последовательностями, присутствующими в популяции клонированных геномных ДНК фрагментов или
- 17 030578 кДНК фрагментах (например, геномных или кДНК библиотеках). Зонды гибридизации могут представлять собой геномные ДНК фрагменты, кДНК фрагменты, РНК фрагменты или другие олигонуклеотиды, и могут быть помечены выявляемой группой, такой как 32Р, или любым другим обнаруживаемым маркером. Таким образом, например, зонды гибридизации могут быть получены с помощью вводящих метку синтетических олинуклеотидов на основании АКК последовательностей согласно изобретению. Способы получения зондов для гибридизации и конструкции кДНК и геномных библиотек в целом хорошо известны в данной области техники и описаны в 8атЬгоок.
Биологическая активность АКК полипептидов (т.е. влияние на АКК гербицидный ответ) может быть оценена способом, известным в данной области техники и описанным в данном изобретении.
Последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут быть экспрессированы в клетке-хозяине, такой как клетки бактерий, дрожжей, насекомых, млекопитающих и предпочтительно растений. Предполагается, что специалистам в этой области техники хорошо известны многочисленные системы экспрессии, доступные для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок согласно настоящему изобретению. Не будет предпринято никаких попыток подробно описать различные способы, известные для экспрессии белков в прокариотах и эукариотах.
Последовательности согласно настоящему изобретению предоставлены в экспрессионных кассетах или ДНК конструктах для экспрессии в представляющих интерес растениях. Кассета может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, предназначенный для совместной трансформации в организм. Альтернативно, дополнительный(е) ген(ы) может(гут) быть предоставлен(ы) на кассетах множественной экспрессии.
Такая кассета экспрессии предоставлена с множеством сайтов рестрикции для вставки АКК последовательности с транскрипционной регуляцией регуляторными областями. Кассета экспрессии может дополнительно содержать селектируемые маркерные гены.
Экспрессионная кассета может включать в 5'-3' направлении транскрипции область инициирования транскрипции (т.е. промотор), область инициирования трансляции, полинуклеотид согласно изобретению, область завершения трансляции и, необязательно область завершения транскрипции в организмехозяине. Регуляторные области (т.е. промоторы, области регулирования транскрипции и области терминации трансляции) и/или полинуклеотид согласно изобретению могут быть природными/аналогичными клетке-хозяину или друг другу. Альтернативно, регуляторные области и/или полинуклеотид согласно изобретению могут быть гетерологичными клетке-хозяину или друг другу.
Хотя может быть предпочтительно экспрессировать последовательности с использованием гетерологичных промоторов, могут использоваться и природные промоторные последовательности. Такие конструкты должны изменять уровни экспрессии АКК в клетке-хозяине (т.е. растении или растительной клетке). Таким образом, фенотип клетки-хозяина (т.е. растения или растительной клетки) изменяется.
Область терминации может быть родной области инициирования транскрипции, может быть родной оперативно связанной ДНК последовательности, представляющей интерес, или может происходить из другого источника. Традиционные области терминации доступны из Ίι-плазмида Л.ЦппсГаспспк. таких как области терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также Оиегшеаи с1 а1. (1991), Мо1. Оеп. Оепе1. 262:141-144; РгоибГоо! (1991), Се11, 64:671-674; 8апГасоп с1 а1. (1991), Оепек Эе\. 5:141-149; Модеп е1 а1. (1990), Р1ап1 Се11, 2:1261-1272; Мипгое е1 а1. (1990), Оепе, 91:151-158; Ва11ак е1 а1. (1989), ЫисПс Аабк Кек. 17:7891-7903 апб 1окЫ е1 а1. (1987), №с1ею Лс1б Кек. 15:9627-9639.
Когда приемлемо, ген(ы) может(ут) оптимизироваться для повышенной экспрессии в трансформированном растении. То есть, гены могут синтезироваться с использованием растение-предпочтительных кодонов для улучшенной экспрессии. Указанные способы доступны в данной области техники для синтезирования растение-предпочтительных генов. См., например патенты США № 5380831 и 5436391 и Миггау е1 а1. (1989), Хис1е1с Аабк Кек. 17:477-498, содержание которых введено в данное описание во всей полноте в виде ссылки.
Дополнительные модификации последовательностей, как известно, усиливают экспрессию гена в клеточном хозяине. Они включают элиминацию последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналы сайтов сплайсинга экзон-интрон, транспозон-подобные повторы, и других подобных хорошо известных последовательностей, которые могут быть вредными для экспрессии генов. О-С содержание последовательности может быть доведено до уровней, средних для данного клеточного хозяина, которые рассчитаны для известных генов, экспрессированных в клетке-хозяине. Когда это возможно, последовательность модифицируется, чтобы избежать предсказанных вторичных структур мРНК в виде петли (шпильки).
Кассеты экспрессии могут дополнительно содержать 5'-лидерные последовательности в конструкте экспрессионной кассеты. Такие лидерные последовательности могут действовать, усиливая трансляцию. Лидеры трансляции известны в данной области и включают пикорновирусные лидерные последовательности, например ЕМСУ лидер (энцефаломиокардит 5'-некодирующая область) (Е1гоу-81еш е1 а1. (1989), ΡΝΑδ υδΛ 86:6126-6130); противовирусные лидерные последовательности, например ТЕУ лидерная последовательность (последовательность вируса гравировки табака - ТоЬассо Е1сЬ У1гик) (АШкоп е1 а1. (1986), У1го1оду 154:9-20); и человеческий белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулинов (ΒίΡ),
- 18 030578 (Мзсе]зк е1 з1. (1991), №!иге, 353:90-94); нетранслируемая лидерная последовательность мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (ΆΜν КИЛ 4) (ЛоЬ 1ίη§ е1 а1. (1987), №Ииге. 325:622-625); лидерная последовательность вируса табачной мозаики ((ТМУ) (СаШе е1 з1. (1989), ίη Мо1еси1аг В1о1оду оГ К А, ей. Сеск (Ь188, №\ν Уогк), р. 237-256); лидерная последовательность вируса хлоротичной пятнистости кукурузы ((МСМУ) (Ьоште1 е1 а1. (1991), У1го1оду, 81:382-385). См. также Оека-Сюрра е1 а1. (1987), Р1зй РЬу8ю1. 84:965-968. Могут использоваться и другие известные способы повышения транскрипции.
При подготовке экпрессионной кассеты можно манипулировать различными фрагментами ДНК таким образом, чтобы обеспечить последовательности ДНК в надлежащей ориентации и, когда это подходит, в надлежащей рамке считывания. С этой целью могут использоваться адаптеры или линкеры для объединения фрагментов ДНК или могут вовлекаться другие манипуляции для обеспечения удобных сайтов рестрикции, удаления ненужной ДНК, удаления сайтов рестрикции или т.п. Для этого могут использоваться ίη уйго мутагенез, репарация праймеров, рестрикция, восстановление замещений, например могут задействоваться транзиции и трансверсии.
Обычно экспрессионные кассеты будут включать селектируемый маркерный ген для селекции трансформированных клеток. Селектируемые маркерные гены используются для отбора трансформированных клеток или тканей. Гены-маркеры включают гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (№0) и гигромицинфосфотрансферазу (НРТ), а также гены, придающие устойчивость к гербицидным соединениям, таким как глюфосинат, глифосат, аммоний, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорофеноксиацетат (2,4-Ό). См. Уаггап1оп (1992), Сигг. 0ρίη. Вю1еск. 3:506-511; СЬг181оркег8оп е1 а1. (1992), Ргос. №11. Асай. δα. ИЗА, 89:6314-6318; Уао е1 а1. (1992), Се11, 71:63-72; Ке/ткоГГ (1992), Мо1. МсгоЬю1. 6:2419-2422; Вагк1еу е1 а1. (1980), ίη Тке Ορе^оη, р. 177-220; Ни е1 а1. (1987), Се11, 48:555-566; Вю\п е1 а1. (1987), Се11, 49:603-612; Пдде е1 а1. (1988), Се11, 52:713-722; Оеи8ск1е е1 а1. (1989), Ргос. №И. Асай. Ас1. ИЗА, 86:5400-5404; Риег81 е1 а1. (1989), Ргос. №н1. Асай. δα. ИЗА, 86:2549-2553; Оеи8ск1е е1 з1. (1990), Зае^е, 248:480-483; Со88еη (1993), РкГО. Тке818, Ишуегеку оГ Не1йе1Ьегд; Кеше8 е1 з1. (1993), Ргос. №н1. Асай. δα. ИЗА, 90:1917-1921;
1.аЬ<ш е1 а1. (1990), Мо1. Се11. Вю1. 10:3343-3356; 2атЬгек1 е1 а1. (1992), Ргос. №ί1. Асай. За. ИЗА, 89:3952-3956; Ват е1 а1. (1991), Ргос. №ί1. Асай. δοΐ. ИЗА, 88:5072-5076; А\Ьог8к| е1 а1. (1991), №с1ею Аай8 Ке8. 19:4647-4653; 411^11311+^188111311 (1989), Торю8 Мо1. Зкис. Вю1. 10:143-162; Оеде11ко1Ь е1 а1. (1991), Ай^сгоЬ. Адейк Скето1кег. 35:1591-1595; К1ет8скйй1 е1 а1. (1988), Вюскет18ку,. 27:1094-1104; Вошп (1993), Рк.О. Тке818, Ийуегеку оГ Не1йе1Ьегд; Со88еη е1 а1. (1992), Ргос. №и1. Асай. δα. ИЗА, 89:5547-5551; 0куа е1 а1. (1992) Ай^сгоЬ. Адей8 Скетойег. 36:913-919; Н1аука е1 з1. (1985), НаηйЬоок оГ Е.хрептейа1 Ркагтасо1оду, Уо1. 78 (Зргтдег-Уег1ад, ВегНи); СН1 е1 з1. (1988), №йге, 334:721-724 и публикация № \У0 02/36782. Содержание указанных публикаций включено в настоящее описание в виде ссылки.
Приведенный выше список выбираемых маркерных генов не является ограничением. Любой селектируемый маркерный ген может использоваться согласно настоящему изобретению.
Ряд промоторов моет использоваться при практическом применении настоящего изобретения. Промоторы могут выбираться исходя из желаемого результата. То есть нуклеиновые кислоты могут объединяться с конститутивными, тканепредпочтительными или другими промоторами для экспрессии в представляющей интерес клетке-хозяине. Такие конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор К8уп7 (\У0 99/48338 и патент США № 6072050); коровый промотор 35З СзМУ (0йе11 е1 а1. (1985), №йге, 313:810-812); промотор актина риса (МсЕ1гоу е1 з1. (1990), Р1зй Се11, 2:163-171); промотор убиквитина (Ск^^8ΐеη8еη е1 з1. (1989), Р1зй Мо1. Вю1. 12:619-632 и Ск^^8ΐеη8еη е1 з1. (1992), Р1зй Мо1. Вю1. 18:675-689); промотор рЕМИ (Ьа81 е1 а1. (1991), Ткеог. Арр1. Сеаек 81:581-588); промотор МАЗ (Уекеη е1 з1. (1984), ЕМВ0 I. 3:2723-2730); промотор АЬЗ (патент США № 5659026) и т.п. Другие конститутивные промоторы включают, например, промоторы, описанные, в патентах США № 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463 и 5608142. И так же, как экспрессия АКК полипептидов согласно настоящему изобретению может быть нацелена на конкретные растительные ткани или типы клеток через использование соответствующих промоторов, она также может быть направлена на различные местоположения внутри клетки с помощью нацеливающей информации или нацеливающих меток. В отличие от промотора, который действует на уровне транскрипции, такая нацеливающая информация является частью продукта исходной трансляции. В зависимости от способа инфекции патогена или метаболический функции ткани или клеточного типа, местоположение белка в различных компартментах клетки может сделать его более эффективным против данного патогена или сделать его приносящим меньшие помехи функции клетки. Например, можно получить белок, предшествующий сигнальному пептиду, который направляет трансляцию продукта в эндоплазматический ретикулум путем включения в конструкт (т. е. экспрессионную кассету) последовательностей, кодирующих сигнальный пептид (такие последовательности могут также называться сигнальными последовательностями). Используемая сигнальная последовательность может представлять собой, например, последовательность, связанную с геном, кодирующим полипептид, или она может быть взята из другого гена.
Существует большое количество сигнальных пептидов, которые описаны в литературе, и они в значительной степени являются взаимозаменяемыми (Кйкке1 Ν, Скп8рее18 М.1. (2000) Рго1еш 8ог1тд зпй
- 19 030578 уск1с1с 1гаГПс. Ιη В. ВисЬаиаи, V. Огшккст, К. 1оиск, сйк., Вюскстййу аий Мо1сси1аг Вю1оду оГ Р1аи!к. Атспсаи 8ос1с1у оГ Р1аи! РЬук1о1о§1к!к, КоскуШс, Мй., р. 160-201, содержание указанной публикации введено в данное описание в виде ссылки). Добавление сигнального пептида будет приводить к трансляционному продукту, поступающему в эндоплазматический ретикулюм (в процессе чего сигнальный пептид сам удаляется из полипептида), но конечное внутриклеточное местоположение белка зависит и от других факторов, которыми можно манипулировать для получения местоположения, наиболее подходящего для патогена и клеточного типа. Путь по умолчанию, т.е. путь, принятый полипептидами, если не включены никакие другие нацеливающие метки, приводит к секреции полипептида через клеточную мембрану (Ка1кЬс1 и СНпкрсск кирга) в апопласт. Апопласт представляет собой область вне системы плазматической мембраны и включает в себя клеточные стенки, межклеточные пространства и сосуды ксилемы, образующие непрерывную проницаемую систему, через которую могут двигаться вода и растворенные вещества.
Метод трансформации/трансфекции не является критическим для настоящего изобретения; различные методы трансформации или трансфекции доступны в настоящее время. По мере появления новых методов для преобразования культур или других клеток-хозяев эти новые методы также могут применяться. Таким образом, широкий спектр методов был разработан для вставки последовательности ДНК в геном клетки-хозяина с целью получения транскрипции и/или трансляции последовательности для воздействия на фенотипические изменения в организме. Таким образом, может применяться любой метод, который обеспечивает эффективную трансформацию/трансфекцию.
Протоколы трансформации, а также протоколы введения нуклеотидных последовательностей в растениях могут изменяться в зависимости от вида растений, т.е. однодольных или двудольных, или растительных клеток, подлежащих трансформации. Подходящие способы введения нуклеотидных последовательностей в растительные клетки и последующей вставки в геном растения включают микроинъекции (Сгоккуау с! а1. (1986), ВюЮскшциск 4:320-334), электропорации (К1§§к с! а1. (1986), Ргос. ЫаИ. Асай. 8а. И8А 83:5602-5606), агробактериальную трансформацию (Тоуиксий с! а1., патент США № 5563055, 2Ьао с! а1., патент США № 5981840), прямой перенос гена (Рак/ко\ук1<1 с! а1. (1984), ΕМВΟ I. 3:2717-2722) и баллистическое ускорение частиц (см., например, 8аиГогй с! а1. патент США № 4945050; Тотск с! а1. (1995) Эйсс! ΌΝΛ ТгаикГсг т!о 1и1ас! Р1аи! Сс11к У1а М1сгорго.)ссШс ВотЪагйтси!, т Р1аи! Сс11, Т1ккис, аий Огдаи Си1!игс: Риийатси!а1 Мс!Ьойк, сй. ОатЪогд аий РЫШрк (8ргшдсг- ναΕίβ. Всгйи); МсСаЪс с! а1. (1988), Вю!ссйио1оду 6:923-926). См. также να^ί^α с! а1. (1988), Аии. Ксу. Осис!. 22:421-477; 8аиГогй с! а1. (1987), Рагйси1а!с 8асисс аий ТссЬио1оду, 5:27-37 (отои); СЬг1к!ои с! а1. (1988), Р1аи! РЬукю1. 87:671674 (коуЪсаи); МсСаЪс с! а1. (1988), Вю/Тссйио1оду, 6:923-926 (коуЪсаи); Ртсг аий МсМи11си (1991), 1и уйго Сс11 Осу. Вю1. 27Р: 175-182 (коуЪсаи); 8тдй с! а1. (1998) ТЬсог. Арр1. Осис!. 96:319-324 (коуЪсаи); Эа11а с! а1. (1990), Вю!ссйио1оду, 8:736-740 (псс); К1сш с! а1. (1988), Ргос. Ν·ιΐ1. Асай. 8а. И8А, 85:43054309 (та1/с); К1сш с! а1. (1988), Вю!ссйио1оду, 6:559-563 (та1/с); Тотск, патент США № 5240855; Вшкшд с! а1. патенты США № 5322783 и 5324646; К1сш с! а1. (1988), Р1аи! РЬукю1. 91: 440-444 (ики/с); Рготт с! а1. (1990), Вю!ссйио1оду, 8:833-839 (та1/с); Нооукаак^аи 81од!сгси с! а1. (1984), №-Иигс (Ьоийои), 311:763764; Ву!сЫсг с! а1. (1987), Ргос. Ν·ιΐ1. Асай. 8ск И8А, 84:5345-5349 (ЬШассас); Ос να с! а1. (1985), ш ТЬс Εxрс^^тси!а1 Матри1а!юи оГ Оуи1с Тйкиск, сй. СЬартаи с! а1. (Ьоидтаи, Υο^к), р. 197-209 (ро11си); Касрр1сг с! а1. (1990), Р1аи! Сс11 Ксройк, 9:415-418; Касрр1сг с! а1. (1992), ТЬсог. Арр1. Осис!. 84:560-566 (уЫкксг-тсШа!сй !гаикГогта!юи); Э'На11иЙ1 с! а1. (1992), Р1аи! Сс11, 4:1495-1505 (с1сскгорога!юи); Ы с! а1. (1993), Р1аи! Сс11 Ксройк, 12:250-255; СЬпк!ои аий Рогй (1995), Аииа1к оГ Вокаиу, 75:407-413 (пес); Ок)ойа с! а1. (1996), №!игс Вю!ссйио1оду, 14:745-750 (та1/с У1а АдгоЪас!сгшт !итсГаасик); которые введены в настоящее описание в виде ссылок.
Из клеток, которые были трансформированы, могут быть выращены растения в соответствии с обычными способами. См., например, МсСогтюк с! а1. (1986), Р1аи! Сс11 Ксройк, 5:81-84. Эти растения можно выращивать и опылять такой же трансформированной линией или другими линиями и идентифицировать гибриды с конститутивной экспрессией нужного фенотипического признака. Два или больше поколений могут быть выращены для гарантии того, что конститутивная экспрессия нужного фенотипического признака стабильно поддерживается и наследуется, а затем собирают семена для обеспечения конститутивной экспрессии нужного фенотипического признака. Специалисту будет понятно, что после того, как рекомбинантная экспрессионная кассета стабильно введена в трансгенные растения и подтверждено, что является действующей, она может вводиться в другие растения путем полового скрещивания (ксхиа1 сгоккшд). Любая методика из числа стандартных методик может быть использована в зависимости от вида, подлежащего скрещиванию.
В вегетативно размножающихся культурах зрелые трансгенные растения можно размножать черенками или методами культуры тканей для получения множества идентичных растений. Проводят отбор желательных трансгенных растений и новые сорта получают и размножают вегетативно для коммерческого применения. В культурах, размножающихся семенами, зрелые трансгенные растения могут быть подвергнуты самоскрещиванию для получения гомозиготных инбредных растений. Инбредное растение производит семена, содержащие вновь введенную гетерологичную нуклеиновую кислоту. Эти семена можно выращивать для получения растений, которые будут производить выбранный фенотип.
- 20 030578
Части, полученные из регенерированного растения, такие как цветы, семена, листья, ветви, плоды и т.п., включены в изобретение при условии, что эти части включают клетки, содержащие выделенную нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению. Потомство и варианты, а также мутанты регенерированных растений также включены в объем настоящего изобретения при условии, что эти части включают введенные последовательности нуклеиновых кислот.
Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой трансгенное растение, которое является гомозиготным для добавленной гетерологичной нуклеиновой кислоты; т.е. трансгенное растение, которое содержит две добавленные последовательности нуклеиновых кислот, один ген в том же локусе на каждой хромосоме из пары хромосом. Гомозиготное трансгенное растение может быть получено путем полового скрещивания (самоопыления) гетерозиготного трансгенного растения, которое содержит единственную добавленную гетерологичную нуклеиновую кислоту, выращиванием некоторых из полученных семян и анализом растений, полученных для измененной экспрессии полинуклеотида согласно настоящему изобретению относительно контрольного растения (то есть, естественного, нетрансгенного растения). Обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением также рассматриваются.
Настоящее изобретение может применяться для трансформации растений любых видов, включая, но без ограничения, однодольные и двудольные растения. Примеры представляющих интерес растений, включают, но без ограничения, следующие: кукуруза (2еа Мау8), капустовые растения (Вга881са 8р.) (например, В. парик, В. тара, В. щпсеа). особенно те, которые применяются в качестве источников растительного масла, люцерна (Мебюадо 8айуа), рис (Огу/а §айуа), рожь (§еса1е Сегеа1е), сорго (8огдйит Ысо1от, §отдйит уифаге), просо (например, пеннисетум сизый (Репш8е1ит д1аисит), просо посевное (Рашсит тШасеит), щетинник итальянский (5>е1апа Пайса), токуса или коракан (Е1еи8ше согасапа)), подсолнечник (Нейаййик Лпииик), сафлор красильный (Саййатик Йпс1отш8), пшеница мягкая (Тййсит аекйуит), соя культурная (О1усше тах), табак обыкновенный (№сойапа !аЬасит), картофель (§о1апит Тийегокит), арахис (ЛтасЫк йуродаеа), хлопчатник (Ооккуршт ЬатЬабепке, Ооккуршт НйъиШт), батат или сладкий картофель (1ротоеа Ьа1а1и8), маниок (Матйо! е8си1еп!а), кофе (СоГГеа 8рр.), кокос орехоносный (Сосок писйега), ананас хохлатый (Апапа8 сото8И8), цитрусовые деревья (Сйги8 8рр.), какао (ТйеоЬтота сасао), чай (СатеШа 8шеп818), банан (Ми8а 8рр.), авокадо или персея американская (Рег8еа атепсапа), инжир или фикус карийский (Рюи8 са81са), гуава или псидиум гуйява (Р81бшт §иа.)ауа), магнифера индийская (манго) (МапдГега тбюа), олива европейская (О1еа еигораеа), папайя (Санса рарауа), кешью (анакардиум западный) (Апасагбшт осс1беп!а1е), макадамия (Масабат1а ш1едй£ойа), миндаль (Ртипи8 атудба1и8), сахарная свекла (Ве1а уц1даЙ8), сахарный тростник (§ассйатит 8рр.), овес (Ауепа 8айуа), ячмень (Ногбеит уи1дате), овощные культуры, декоративные растения и деревья хвойных пород.
Овощные культуры включают томаты (Ьусорегасоп Е8си1еп1ит), салат (например, Ьас1иса 8айуа), фасоль обыкновенную (Рйа8ео1и8 уц1даЙ8), фасоль лимскую (Рйа8ео1и8 йтеп818), горох (Ъа1йут8 8рр.) и представителей рода Сисит18, такие как огурец обыкновенный (С. 8аЙУИ8), дыня обыкновенная (канталуп) (С. сап1а1иреп818) и дыня столовая (С. те1о).
Декоративные растения включают кустарник рододендрон (Кйобобепбтоп 8рр.), гортензию крупноцветковую (Масторйуйа йубтапдеа), гибискус китайский (Н1Ь18си8 го8а8апеп818), розы (Ко8а 8рр.), тюльпаны (Тийра 8рр.), нарциссы (Ыагс188И8 8рр.), петунию гербидную (Репина йуЬйба), гвоздику садовую (О1апбш8 сатуорйу11и8), молочай прекраснейший или пуансеттию прекраснейшую (ЕирйотЫа рЫсйетта) и хризантемы (Сйту8ап1йетцт).
Хвойные деревья, которые могут использоваться в практике настоящего изобретения, включают, например, сосны, такие как сосна ладанная (Рти8 !аеба), сосна Эллиона (Рти8 е1йо!й), сосна желтая (Рти8 ропбего8а), сосна скрученная (Рши8 сопЮПа) и сосна лучистая (Рши8 габ1а1а); псевдотсугу Мензиса (Р8еибо18ида теп71е81), тсугу канадскую (Т8ида сапабеп818); ель канадскую (Рюеа д1аиса); секвою вечнозеленую (или красное дерево) (5>ес|ио1а 8етретуиеп8); пихты настоящие, такие как пихта миловидная (АЫе8 атаЫЙ8) и пихта бальзамическая (АЫе8 Ьа18атеа); и туи и кипарисы, такие как туя складчатая (Тйфа рйса!а) и кипарис нутканский (Сйатаесурай8 поо1ка1еп818).
Предпочтительно растения согласно настоящему представляют собой растения сельскохозяйственных культур (например, кукурузу, люцерну, подсолнечник, капусту, сою, хлопчатник, подсолнечник, арахис, сорго, пшеницу, ячмень, рис, просо, табак и т.д.).
Прокариотические клетки могут быть использованы в качестве хозяев для экспрессии. Прокариоты наиболее часто представлены различными штаммами кишечной палочки Е.сой, однако могут также использоваться и другие микробные штаммы. Обычно используемые прокариотические контрольные последовательности, которые определены в данном описании для включения промоторов инициации транскрипции, необязательно с оператором, наряду с рибосомными связывающими последовательностями включают такие обычно используемые промоторы, как бета-лактамазные (пенициллиназа) и лактозные (1ас) промоторные системы (Сйаид е! а1. (1977), №1иге, 198:1056), триптофановые (!гр) промоторные системы (Ооеббе1 е! а1. (1980), Ыискю Ас1б8 Ке8. 8:4057), а также лямбда-производный Р Ь промотор и Ν-генный рибосомный сайт связывания (§Ыта1аке е! а1.. (1981), Ыа1иге, 292:128). Примеры маркеров селекции для Е.сой, включают, например, гены, задающие устойчивость к ампициллину, тетрациклину или
- 21 030578 хлорамфениколу.
Вектор выбирают таким образом, чтобы позволить осуществить введение в подходящую клеткухозяин. Бактериальные векторы, как правило, происходят из плазмиды или фага. Подходящие бактериальные клетки инфицируют частицами фагового вектора или трансфицируют голой ДНК фагового вектора. Если используется плазмидный вектор, бактериальные клетки трансфицируют ДНК плазмидного вектора. Системы экспрессии для экспрессии белка согласно настоящему изобретению доступны при использовании ВасШик кр. и §а1тоис11а (Ра1уа с! а1. (1983), Осис, 22:229-235 аиб МокЬасЬ с! а1. (1983), ХаПис. 302:543-545).
Разнообразие эукариотических систем экспрессии, таких как дрожжи, клеточные линии насекомых, клетки растений и млекопитающих, известны специалистам данной области. Как кратко пояснено ниже, полинуклеотид согласно настоящему изобретению может экспрессироваться в этих эукариотических системах. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения трансформированные/трансфицированные клетки растений, как обсуждается ниже, используются в качестве системы экспрессии для получения белков согласно настоящему изобретению. Такие противомикробные белки могут использоваться для любого применения, включая покрытие поверхностей целевых микробов. В этом случае целевые микробы включают человеческие патогены или микроорганизмы.
Синтез гетерологичных нуклеотидных последовательностей в дрожжах хорошо известен. Публикация: §Ьсгтаи, Р., с! а1. (1982), МсШобк т Усак! ОсисБск, Со1б 8ргшд НагЬог БаЬогаЮгу - является хорошо известной работой, в которой описываются различные методы, которые могут использоваться для получения белка в дрожжах. Двумя видами дрожжей, широко используемыми для производства эукариотических белков, являются §ассЬаготусск сстсуШас и РюЫа РакЮпк. Векторы, штаммы и методики экспрессии в §ассЬаготусск и РюЫа известны в данной области и доступны из коммерческих источников (например, 1иуФодси). Подходящие векторы, как правило, содержат последовательности контроля экспрессии, такие как промоторы, включая 3-фосфоглицераткиназы или спиртовую оксидазу, а также источник (точку начала) репликации, последовательности терминации и т. п., как это нужно.
Белок согласно настоящему изобретению сразу после экспрессирования может быть выделен из дрожжей путем лизиса клеток и применением стандартных методов выделения белка в лизатах. Мониторинг процесса очистки осуществляться с помощью методик Вестерн-блот-анализа (^ск!сги Ь1о!), радиоиммуноанализа или других стандартных методов иммуноанализа.
Нуклеотидные последовательности согласно настоящему изобретению могут также применяться в смысловой ориентации для подавления экспрессии эндогенных генов в растениях. Методы подавления генной экспрессии в растениях с использованием нуклеотидных последовательностей в смысловой ориентации хорошо известны в данной области техники. Методы обычно включают трансформацию растений с помощью ДНК конструкта, включающего промотор, стимулирующий экспрессию в растении и оперативно связанный по меньшей мере с частью нуклеотидной последовательности, которая соответствует транскрипту эндогенного гена. Обычно такая нуклеотидная последовательность обладает по существу идентичностью к последовательности транскрипта эндогенного гена, предпочтительно больше чем примерно 65% идентичностью последовательности, более предпочтительно больше чем примерно 85% идентичностью последовательности, наиболее предпочтительно более чем приблизительно 95% идентичностью последовательности. См. патенты США № 5283184 и 5034323, которые введены в данное описание в виде ссылки.
Настоящее изобретение также относится к способу модуляции (т.е. увеличения или уменьшения) концентрации или композиции полипептидов согласно настоящему изобретению в растении или его части. Увеличение или уменьшение концентрации и/или изменение композиции полипептидов в растении может влиять на модуляцию. Например, увеличение доли полипептидов согласно изобретению относительно природных полипептидов может влиять на модуляцию. Этот способ включает введение полинуклеотида согласно настоящему изобретению в растительную клетку с рекомбинантной экспрессионной кассетой, как описано выше, для получения трансформированных растительных клеток, выращивание трансформированной растительной клетки при соответствующих условиях роста и индукцию или подавление экспрессии полинуклеотида согласно настоящему изобретению в растении в течение времени, достаточного для модуляции концентрации и/или композиции полипептидов в части растения или растительного.
Повышение активности и/или уровня АКК полипептида.
Представлены способы повышения активности и/или уровня мутантных АКК полипептидов для повышения устойчивости к АКК гербицидам. Повышение уровня и/или активности АКК мутантного полипептида может быть достигнуто посредством предоставления растению АКК полипептида. Полипептид может быть предоставлен путем введения мутантного АКК полипептида в растение, введения в растение нуклеотидной последовательности, кодирующей мутантный АКК полипептид, или, альтернативно, путем изменения геномного локуса, кодирующего АКК полипептид согласно изобретению.
Как обсуждалось в настоящем изобретении, в данной области техники известно большое количество способов предоставления полипептида в растение, включая, но без ограничения, прямое введение полипептида в растение, введение в растение (временно или стабильно) полинуклеотидного конструкта,
- 22 030578 кодирующего полипептид, обладающий повышенной АКК активностью. Признано также, что в способах согласно настоящему изобретению может использоваться полинуклеотид, который не способен направлять в трансформированном растении экспрессию белка или РНК. Таким образом, уровень и/или активность АКК мутантного полипептида могут быть повышены видоизменением гена, кодирующего мутантный АКК полипептид или его промотор. См., например, Кт1ес, патент США № 5565350; Ζαιΐίπβ е! а1. РСТ/И893/03868. Следовательно, предоставлены мутагенезированные растения, которые несут мутации в АКК генах, где мутации повышают экспрессию мутантного АКК гена АКК или повышают активность кодируемого полипептида.
Снижение активности и/или уровня АКК полипептида.
Представлены также способы снижения или устранения активности АКК полипептида трансформацией растительной клетки с помощью экспрессионной кассеты, которая экспрессирует полинуклеотид, ингибирующий экспрессию АСС. Полинуклеотид может ингибировать экспрессию АКК напрямую, путем предотвращения транскрипции или трансляции мессенджерной РНК АКК синтазы, или опосредованно, кодированием полипептида, который ингибирует транскрипцию или трансляцию АКК гена, кодирующего АКК полипептид. Способы ингибирования или устранения экспрессии гена в растении хорошо известны в данной области техники, и в настоящем изобретении для ингибирования экспрессии АКК полипептида может использоваться любой такой способ. Для уменьшения или устранения активности полипептида АКК синтазы может использоваться множество способов. Кроме того, несколько способов могут использоваться для снижения активности единственного АКК полипептида.
1. Способы на основе полинуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения растение трансформируется экспрессионной кассетой, способной экспрессировать полинуклеотид, который ингибирует экспрессию полипептида АКК синтазы согласно изобретению. Термин экспрессия, когда используется в данном описании, относится к биосинтезу генного продукта, включая транскрипцию и/или трансляцию указанного генного продукта. Например, для целей настоящего изобретения экспрессионная кассета, способная экспрессировать полинуклеотид, который ингибирует экспрессию по меньшей мере одного полипептида АКК синтазы, представляет собой экспрессионную кассету, способную продуцировать молекулу РНК, которая ингибирует транскрипцию и/или трансляцию по меньшей мере одного полипептида АКК синтазы согласно настоящему изобретению. Термин экспрессия или продуцирование белка или полипептида из молекулы ДНК относится к транскрипции и трансляции кодирующей последовательности для получения белка или полипептида, тогда как термин экспрессии или продуцирование белка или полипептида из молекулы РНК относится к трансляции РНК кодирующей последовательности для продуцирования белка или полипептида.
Примеры полинуклеотидов, которые ингибируют экспрессию полипептида АКК синтазы, включают смысловую супрессию/косупрессию, где экспрессионная кассета предназначена для экспрессии молекулы РНК, соответствующей всей или части мессенжерной РНК, кодирующей АКК синтазный полипептид в смысловой ориентации, и через экспрессию молекулы РНК может приводить к снижению экспрессии природного гена; антисмысловую супрессию, где экспрессионная кассета предназначена для экспрессии молекулы РНК, комплементарный ко всей или части РНК, кодирующей АКК синтазный полипептид и через экспрессию антисмысловой РНК молекулы может приводить к снижению экспрессии природного гена; интерференцию двухцепочечной РНК, где молекула смысловой РНК, подобная описанной выше для косупрессии и антисмысловой молекуле РНК, которая полностью или частично комплементарна молекуле смысловой РНК, экспрессирована в той же самой клетке, что приводит к ингибированию экспрессии соответствующей эндогенной мессенжерной мРНК, шпилечную РНК интерференцию и интрон-содержащую шпилечную РНК-интерференцию, где экспрессионная кассета предназначена для экспрессии молекулы РНК, которая самогибридизуется для образования структуры шпильки, которая включает область одноцепочечной петли и ствол спаренной основы; малую интерферирующую РНК или микро РНК, где экспрессионная кассета предназначена для экспрессии молекулы РНК, которая смоделирована по эндогенному гену т1РНК.
2. Ингибирование экспрессии гена на основе полипептида.
В одном варианте осуществления изобретения полинуклеотид кодирует белок цинковый палец, который связывается с геном, кодирующим АКК полипептид, приводя к снижению экспрессии гена. Методы отбора участков для нацеливания с помощью белка цинковый палец были описаны, например, в патенте США № 6453242, а методы применения белков цинковый палец для ингибирования экспрессии генов в растениях описаны, например, в патентной публикации США № 2003/0037355, где указанные патенты включены в настоящее описание в виде ссылки.
3. Ингибирование активности белка на основе полипептида.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотид кодирует антитело, которое связывается по меньшей мере с одной АКК и снижает активность полипептида АКК синтазы. Экспрессия антител в растительных клетках и ингибирование молекулярных путей посредством экспрессии и связывания антител с белками в растительных клетках хорошо известны в данной области техники. См., например, публикацию Сопгай апй 8оппе^а1й (2003), Ыа!иге Вю!есП. 21:35-36, которая включена в данное
- 23 030578 описание в виде ссылки.
4. Разрыв гена.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активность полипептида АКК синтазы снижена или устранена путем разрыва гена, кодирующего полипептид АКК синтазы. Ген, кодирующий полипептид АКК синтазы, может быть разрушен любым способом, известным в данной области. Например, в одном варианте осуществления изобретения ген разрушен посредством мечения транспозона. В другом варианте осуществления изобретения ген разрушен посредством мутагенеза растений с использованием случайного или направленного мутагенеза и отбором растений, обладающих сниженной АКК активностью.
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут быть собраны с любой комбинацией полинуклеотидных последовательностей, представляющих интерес для создания растений желаемого фенотипа. Например, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть уложены с любыми другими полинуклеотидами согласно настоящему изобретению (§Еф ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5 или 6) или с другими генами, вовлеченными в устойчивость к гербицидам. Генерируемые комбинации также могут включать множество копий любого одного из полинуклеотидов, представляющих интерес. Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению также могут быть уложены с любым другим геном или любой комбинацией генов для получения растений с множеством различных комбинаций желаемых признаков, включая, но без ограничения, признаки, желательные для кормления животных, таких как высокое содержание масличных генов (например, патент США № 6232529); сбалансированное содержание аминокислот (например, гордотионинов (патенты США № 5990389; 5885801; 5885802 и 5703409)); ячмень с высоким содержанием лизина (^Шаткой е! а1. (1987) Еиг. I. ВюсЬет. 165:99-106; и \УО 98/20122), а также высокометиониновые белки (Ребегкеп е! а1. (1986), I. Вю1. СЬет. 261:6279; КтЬага е! а1. (1988), Оеие, 71:359; Микитига е! а1. (1989), Р1ап! Мо1. Вю1. 12:123)); повышенная перевариваемость (например, модифицированные накапливаемые белки (тобШеб к!огаде рго!ешк) (заявка на патенте США, серийный № 10/053410, заявленная 7 ноября 2001 г.)) и тиоредоксины (заявка на патент США, серийный № 10/005429, заявленная 3 декабря 2001 г.), где содержание представленных выше публикаций включено в данное описание в виде ссылки.
Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению также могут быть уложены с признаками, желательными для устойчивости к насекомым, заболеваниям или гербицидам (например, токсичные для насекомых белки ВасШик ТЬигшфепык (патенты США № 5366892; 5747450; 5737514; 5723756; 5593881; Ое1кег е! а1 (1986), Оепе 48:109); лектины (Уап Патте е! а1. (1994), Р1ап! Мо1. Вю1. 24:825); гены детоксикации фумонизина (патенты США № 5792931); гены авирулентности и устойчивости к болезням (1опек е! а1. (1994), §аепсе, 266:789; Магйп е! а1. (1993), §аепсе, 262:1432; Мшбгшок е! а1. (1994), Се11, 78:1089); ацетолактатсинтазные (АЬ§) мутанты, которые приводят к устойчивости к гербицидам, такие как §4 и/или Нга мутации; ингибиторы глутаминсинтазы, такие как фосфинотрицин или Баста (например, Ьаг депе) и устойчивость к глифосату (ЕЧЧ гена и ОАТ ген)), и признаки, желательные для технологических или производимых продуктов, такие как высокое содержание масла (патент США № 6232529); модифицированные масла (например, гены десатуразы жирных кислот (патент США № 5952544; \УО 94/11516)), модифицированные крахмалы (например, АЭРО-пирофосфорилаза (АГФ), крахмалсинтаза (§§), ветвящие ферменты крахмала (§ВЕ) и деветвящие ферменты крахмала (§ОВЕ)), а также полимеры или биопластики (патенты США № 5602321); бета-кетотиолаза, полигидроксибутиратсинтаза и ацетоацетил-КоА-редуктаза (ЗсЬиЬей е! а1. (1988), I. Вас!егю1. 170:5837-5847), которые способствуют экспрессии полиоксиалканоатов (ПГА)), где содержание указанных публикаций включено в данное описание в виде ссылки. Можно также объединить полинуклеотиды согласно настоящему изобретению с полинуклеотидами, обеспечивающими агрономические признаки, такие как мужская стерильность (см. патент США № 5583210), сильный стебель, время цветения или признаки изменения технологических свойств, такие как регуляции клеточного цикла или целенаправленное изменение генов (см. XV О 99/61619, XV О 00/17364, XVО 99/25821), где содержание указанных публикаций включено в настоящее описание посредством ссылки.
Эти уложенные комбинации могут быть созданы любым способом, включая, но без ограничения, представляющие интерес полинуклеотидные последовательности, которые могут быть объединены в любое время и в любом порядке. Например, трансгенное растение, включающее один или несколько желаемых признаков, может быть использовано в качестве мишени для введения дополнительных признаков последующей трансформацией. Признаки могут вводиться одновременно в соответствии с протоколом совместной трансформации с представляющими интерес полинуклеотидами, предоставленными любой комбинацией кассет трансформации. Например, если будут введены две последовательности, эти две последовательности могут содержаться в отдельных кассетах трансформации (транс) или содержаться в одной кассете трансформации (цис). Экспрессия последовательностей может стимулироваться одним и тем же промотором или разными промоторами. В некоторых случаях может быть желательно ввести кассету трансформации, которая будет подавлять экспрессию полинуклеотида, представляющего интерес. Она может объединяться с любой комбинацией других кассет супрессии или кассет сверхэкспрессии для
- 24 030578 генерации желаемой комбинации признаков в растении.
Настоящее изобретение представляет способ генотипирования растения, включающего полинуклеотид согласно настоящему изобретению. Генотипирование обеспечивает средства распознавания различий гомологов хромосомных пар и может использоваться для различения сегрегантов в популяции растений. Способы молекулярных маркеров могут использоваться для филогенетических исследований, характеризующих генетическую взаимосвязь вариантов сортов сельскохозяйственных культур, идентификации скрещиваний или соматических гибридов, локализацию хромосомных сегментов, влияющих на моногенные признаки, основанные на картах клонирования, и изучение наследственность количественных признаков. См., например, Р1аи! Мо1еси1аг Вю1оду: А ЬаЪогаФгу Маииа1, СНар1ег 7, С1агк, Еб., 8ргшдег-Уег1ад, Вег1ш (1997). Методы молекулярных маркеров см., в целом, в публикации ТНе ΌΝΑ Кеуо1ибои Ъу Аибгете Н. Ра1егкои, 1996 (Скар!ег 2) ίη Оеиоте Марршд ίη р1аи1к (Еб., Аибгете Н. Ра1егкои) Ъу Асабетю Ргекк/К.С. Ьаибк Сотраиу, АикИи, Тех., р. 7-21.
В конкретном способе генотипирования в настоящем изобретении может использоваться любое количество аналитических методов молекулярных маркеров, таких как, но без ограничения, методы полиморфизма длин рестриктных фрагментов (ПДРФ). ПДРФ являются результатом аллельных различий между фрагментами рестриктных ДНК, которые являются результатом изменчивости нуклеотидных последовательностей. Как хорошо известно специалистам данной области техники, ПДРФ обычно обнаруживаются посредством экстракции геномной ДНК и расщепления ферментом рестрикции. Обычно образующиеся фрагменты разделяют по размеру и гибридизуют с зондом; предпочтительны зонды единственной копии (кшфе сору ргоЪе). Выявляют рестриктные фрагменты из гомологичных хромосом. Различия в размере фрагментов аллелей представляют ПДРФ. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно представляет средства для последующей сегрегации гена или нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, а также хромосомных последовательностей, генетически связанных с этими генами или нуклеиновых кислот с использованием таких методов, как ПДРФ-анализ. Размеры связанных хромосомных последовательностей находится в пределах 50 сантиморган (сМ), зачастую в пределах 40 или 30 сМ, предпочтительно в пределах 20 или 10 сМ, более предпочтительно в пределах 5, 3, 2 или 1 сМ гена согласно настоящему изобретению.
В настоящем изобретении зонды нуклеиновых кислот, используемые для картирования молекулярных маркеров растительных ядерных геномов, гибридизуются в условиях селективной гибридизации с геном, кодирующим полинуклеотид согласно настоящему изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения зонды выбраны из полинуклеотидов согласно настоящему изобретению. Обычно эти зонды представляют собой кДНК-зонды или геномные клоны, обработанные рестриктными ферментами (например, Р8Т I). Длина зонда обычно составляет по меньшей мере 15 гетероциклических оснований нуклеиновой кислоты в длину, более предпочтительно по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40 или 50 гетероциклических оснований нуклеиновой кислоты в длину. Однако обычно зонды составляют менее чем примерно 1 килобазу в длину. Предпочтительно зонды представляют собой зонды одной копии, которые гибризируются с уникальным локусом в гаплоидном хромосомном комплименте. Некоторые типичные примеры рестриктных ферментов, используемых в ПДРФ картировании, представляют собой ЕсоКб, ЕсоКУ и §§ТЬ. Термин фермент рестрикции, рестриктный фермент, когда используется в данном описании, относится к композиции, которая распознает и сама по себе или в сочетании с другой композицией расщепляет в определенном месте нуклеотидную последовательность.
Способ обнаружения ПДРФ включает следующие стадии: (а) расщепление геномной ДНК растения с помощью фермента рестрикции, (Ъ) гибридизация зонда нуклеиновой кислоты в условиях селективной гибридизации с последовательностью полинуклеотида согласно настоящему изобретению геномной ДНК, (с) выявление ПДРФ. Можно получить и другие методы дифференциации полиморфных (аллельных) вариантов полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, используя методы молекулярных маркеров, хорошо известные специалистам данной области, включая такие методы, как 1) одноцепочечный конформационный анализ (88СА), 2) метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ЭССЕ). 3) анализы защиты от РНКазы, 4) метод аллель-специфических олигонуклеотидов (А8О);
5) использование белков, которые распознают нуклеотидные несовпадения, таких как белок Е.соН, ιηιιΐδ;
6) метод аллель-специфической ПЦР. Другие подходы, основанные на обнаружении несоответствия между двумя комплементарными цепями ДНК, включают фиксированно денатурирующий гельэлектрофорез (СЭСЕ), гетеродуплексный анализ (НА) и химическое расщепление ошибочного спаривания (СМС). Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу генотипирования, включающему стадии контактирования образца в жестких условиях гибридизации, предположительно содержащего полинуклеотид согласно настоящему изобретению, с зондом нуклеиновой кислоты. Обычно, образец представляет собой растительный образец, предпочтительно образец, предположительно содержащий полинуклеотид кукурузы согласно настоящему изобретению (например, ген, мРНК). Зонд нуклеиновой кислоты селективно гибридизуется в жестких условиях с подпоследовательностью полинуклеотида согласно настоящему изобретению, содержащей полиморфный маркер. Селективная гибридизации зонда нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты полиморфного маркера приводит к получению гибридизационного комплекса. Обнаружение гибридизационного комплекса ука- 25 030578 зывает на присутствие этого полиморфного маркера в образце. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения зонд нуклеиновой кислоты включает полинуклеотид согласно настоящему изобретению.
Кроме того, признано, что в способах согласно изобретению может использоваться нуклеотидный конструкт, который способен побуждать в трансформированном растении экспрессию по меньшей мере одного белка или по меньшей мере одной РНК, такой как, например, антисмысловая РНК, которая является комплементарной по меньшей мере части мРНК. Обычно такой нуклеотидный конструкт состоит из последовательности, кодирующей белок или РНК, функционально связанную с 5'- и 3'-транскрипцинальными регуляторными областями. Кроме того, также признано, что в способах согласно изобретению может использоваться нуклеотидный конструкт, который не способен стимулировать в трансформированном растении экспрессию белка или РНК.
Признано также, что способы согласно настоящему изобретению не зависят от введения полного нуклеотидного конструкта в геном, если растение или его клетка не изменяется в результате введения нуклеотидного конструкта в клетку. В одном варианте осуществления изобретения геном может быть изменен после введения нуклеотидного конструкта в клетку. Например, нуклеотидный конструкт или любая его часть может вводиться в геном растения. Изменения в геноме согласно настоящему изобретению включают, но без ограничения, добавления, делеции и замены нуклеотидов в геноме. Хотя способы согласно настоящему изобретению не зависят от добавлений, делеций или замещений любого конкретного числа нуклеотидов, признается, что такие добавления, делеции или замещения включают по меньшей мере один нуклеотид.
Далее для демонстрации и дополнительной иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления изобретения и его аспектов представлены примеры, которые не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1.
Пшеница (Тгйюит аекйуит Ь.), устойчивая к ингибитору фермента ацетил-КоА карбоксилазы, для применения в системе возделывания сельскохозяйственных культур, устойчивых к гербицидам.
Озимую пшеницу (Тгйюит асЧй'ит Ь.), устойчивую к гербицидам класса ингибиторов фермента ацетил-КоА карбоксилазы (АКК), получают посредством следующего способа.
Семена озимой пшеницы сорта НаЮйсг подвергают воздействию мощного химического мутагена (нетрансгенный метод), этанметилсульфоната (ЕМ8), в дозе 0,75% в течение 2,5 ч. Полученные семена обозначают как Μ1, а каждое последующее поколение семян будет обозначаться с последовательным увеличением цифры после Μ. Это приводит к частоте мутаций в геноме пшеницы примерно 1 мутации на 96 тыс. нуклеотидов (тн) (рассчитывается в М2-поколении). Эту пшеницу высевают в феврале и урожай собирают в июле. Полученные Μ2 семена высаживают в поле в сентябре при общей численности популяции 2,5 млн растений.
В мае следующего года поле разделяют на две части: одну часть обрабатывали летальной дозой хизалофопа (~1 млн растений), а другую часть обрабатывают летальной дозой клетодима (~1,5 млн растений). Хизалофоп и клетодим являются высокоэффективными ингибиторами АКК (ингибиторы синтеза липидов). Часть поля, обработанную хизалофопом, обрабатывают во второй раз в июне. В июле с поля собирают 46 выживших колосков, обработанных хизалофопом, и 167 выживших колосков, обработанных клетодимом.
Одновременно небольшую часть семян Μ2 выращивают в теплице с января по апрель. Примерно 75000 и 175000 растений отбирают после обработки летальными дозами хизалофопа и клетодима соответственно. После применения небольшую часть растений, выживших после обработки клетодимом (7 растений), которые, как оказалось, являются более здоровыми, чем остальные, отбирают во второй раз. Это первый документально подтвержденный показатель улучшенной устойчивости к гербицидам в полученной мутантной популяции (фиг. 1), май. В общей сложности из этих растений собирают 26 растений, выживших после обработки хизалофопом, и 42 растения, выживших после обработке клетодимом.
Μ3 поколение собирают с поля в теплице (август-октябрь) и отбирают для обработки хизалофопом и клетодимом с двумя последовательными смертельными дозами гербицидов (фиг. 2). Некоторые растения проявляют высокую выживаемость по сравнению с другими мутантными растениями и немутагенизированным контролем. Начинают некоторые предварительные характеристические исследования по изучению различных мутаций. На фиг. 3 показаны некоторые Μ3 растения, устойчивые к АССгербицидам, в сравнении с немутагенизированным контролем.
Эти скрининги обеспечивают четкое доказательство того, что растения пшеницы приобрели устойчивость к АКК гербицидам, которая является наследуемой и функциональной.
Пример 2.
Пшеница (Тгйюит аекйуит Ь.), устойчивая к ингибитору фермента ацетил-КоА карбоксилазы, для применения в системе возделывания сельскохозяйственных культур, устойчивых к гербицидам.
Озимую пшеницу (Тгйюит аекйуит Ь.) с устойчивостью к гербицидам класса ингибиторов фермента ацетил-КоА карбоксилазы (АКК), характеризуют с помощью следующих методов.
- 26 030578
Растения, проявляющие повышенную толерантность к гербициду хизалофопу, подвергают скринингу несколькими методами для идентификации и характеристики причины такого повышения устойчивости. Растения обследуют на наличие визуальных повреждений, различий устойчивости к хизаолофопу в целом, перекрестную устойчивость к другим гербицидам и оценивают генотипически и ферментативно.
Визуальная оценка. 18 устойчивых к хизалофопу растений из прироста обрабатывают хизалофопом в дозе 21,05 г аи/га, доза выбрана на основе предыдущих исследований. Растения оценивают через 28 дней после обработки (ΌΛΤ) на наличие видимых повреждений хизалофопом по шкале от 0 до 100%, где 0 означает отсутствие повреждений и 100 означает полное засыхание растения. Почти все растения, оцененные в данном исследовании, оказываются более устойчивыми к хизалофопу, чем растения немутантной пшеницы сорта На1сйег (фиг. 5).
Полученные растения содержат несколько полностью погибших растений, за исключением одного растения, которое не отличалось от фона.
Доза-эффект. Исследование зависимости доза-эффект проводят с использованием хизалафопа в дозах с 11, 23, 46, 92 и 184 г/г. Через семь дней после обработки верхние части растений срезают выше самого молодого надземного побега. Биноминальную оценку выживания растений проводят через 28 дней после обработки. Выявляют различия в чувствительности растения в целом к возрастающим дозам хизалофопа. БОю находится в интервале от 10 г аи/га (для необработанных) до 76 г аи/га (фиг. 6). Соотношения устойчивых и чувствительных растений для данного эксперимента находится в интервале от 1,6 до 7,5 из расчета на соотношение выжившие/погибшие растения.
Перекрестная устойчивость. Исследование перекрестной устойчивости проводят с использованием гербицидов, воздействующих на ацетил-КоА карбоксилазу, в дозах, обычно летальных для пшеницы. Клетодим, сетоксидим и флуазифоп используют в дозах 65, 264 и 361 г аи/га с обработкой клетодимом в сочетании с хизалофопом в дозе 10,5 г аи/га. Через семь дней после обработки верхние части растений срезают выше самого молодого надземного побега. Биномиальную оценку выживания растений проводят через 28 дней после обработки. Устойчивость хизалофопных мутантов к клетодиму и сетоксидиму является низкой (см. таблицу). Наличие любой перекрестной устойчивости представляет доказательства того, что объединение нескольких гомологичных устойчивых к АКК гербицидам генов в одном растении может привести к дополнительной устойчивости к гербицидам. На этой стадии только треть от всей АКК в растении будет содержать мутации и показывать устойчивость к ингибиторам АКК, если мутация основана на целевом сайте.
Секвенирование ДНК. ДНК собирают из 26 хизалофоп-устойчивых фенотипов. Разрабатывают геном-специфичные праймеры для амплификации последовательностей из А, В и Ό анцестральных геномов пшеницы. Полученные последовательности сравнивают с ранее клонированный немутантной последовательностью пшеницы для определения наличия нуклеотидных замещений. При сравнении последовательностей из немутантного сорта На1сйег с мутантным фенотипом три несинонимичные мутации выявляют в АКК карбоксилтрансферазном домене, все в положении 2004 в системе аминокислотной нумерации А1оресиги8 туо8иго1бе8. Эта мутация в А геноме обнаружена в восьми образцах, в В геноме в девяти образцах, а в Ό геноме в девяти образцах. Нет образцов с более чем одной из этих δΝδ. Мутация представляет собой замещение С на Т, что приводит к замене аланина на валин в аминокислотной последовательности (фиг. 7). Каждое новое поколение обладает более высокой выживаемостью, чем исходное поколение, содержащее один из этих полиморфизмов. Исходя из хроматографической картины полагают, что большинство этих δΝδ также являются гомозиготными.
Получение характеристик фермента АКК. Ферментный анализ ίη уйго проводят для исследования АККазы в сочетании с хизалофопом непосредственно для определения наличия мутации АККазы, которая снижает способность гербицидов ингибировать активность АККазы. В анализ вместе с необработанным контролем включены четыре концентрации хизалофопа: 0,1, 1, 10 и 100 мкМ. Эксперимент включает в себя четыре образца, которые включают по одному представителю от трех выявленных мутаций и не мутагенизированную пшеницу. Немутагенизированная озимая пшеница сорта Накйег проявляет большую чувствительность к хизалофопу, чем мутантное поколение (фиг. 8). Растения с В и Ό геномными нуклеотидными замещениями показывают более высокие уровни устойчивости к хизалофопу при 10 мкМ, чем фон, а растения с А и Ό геномными нуклеотидными замещениями проявили большую, чем фон, устойчивость к хизалофопу в концентрации 100 мкМ, при ЙБЭ (а=0,05) 14,5 и 21,6 соответственно. Рассчитанное при уровне Ι25 значение устойчивых к восприимчивым для генома А равно 4,57, для генома В равно 3,57 и для генома Ό равно 10,86.
На основании этих экспериментов установлено, что основным фактором растения, устойчивого к хизалофопу, является наличие нуклеотидного замещения С на Т в положении 2004.
- 27 030578
Выживание мутанта, устойчивого к хизалофопу, после применения других АКК гербицидов
Образец Гербицидная обработка
Клетодим Сетоксидим Флуазифоп Клет.+хиз.
№№ % % % %
0 0 0 0 0
1 10 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 0 0
4 0 0 0 0
5 0 0 0 0
6 0 0 0 0
7 0 0 0 0
8 25 0 0 0
9 17 0 0 0
10 0 0 0 0
11 0 8 0 0
12 17 8 0 0
13 0 0 0 0
14 0 0 0 0
15 0 0 0 0
16 0 0 0 0
17 0 0 0 0
ЪЗО=16
Все публикации и патенты, упомянутые в настоящем документе, включены в данное описание в виде ссылки. Различные модификации и изменения описанных способов и композиций по изобретению будут очевидными для специалистов данной области техники без выделения их объема и сущности настоящего изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение не должно быть ограничено такими конкретными вариантами его осуществления. В самом деле, подразумевается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые являются очевидными для специалистов в соответствующих областях техники, находятся в объеме представленной ниже формулы изобретения.
Хранение
Семена сортов пшеницы АР28, АР26, А10, описанных в данном изобретении, хранятся и хранились в Университете штата Колорадо, (Ρΐ. СоШиз, Со1огабо 80523) вплоть до даты подачи заявки на данный патент и всех предварительных заявок на патенты, указанных в ссылках и введенных в данное описание. Доступ к этому депозиту будет предоставлен на время рассмотрения заявления Комиссаром по патентам и товарным знакам и лицами, определенными комиссаром как имеющими право по запросу. После признания любых пунктов формулы изобретения заявитель(и) предоставит(ят) общественности, без ограничений, депозит в размере не менее 2500 семян каждого сорта или линии в Американской коллекции типовых культур (АТСС), КоскуШе, Магу1аиб, 20:852. Семена, депонированные в АТСС, будут взяты из того же депозита, содержащегося в Университете штата Колорадо, который указан выше. Кроме того, заявитель(и) будет(ут) удовлетворять всем требованиям 37 СРК § 1,801-1,809, включая предоставление указания жизнеспособности образца, когда сделан депозит. Этот запас вышеупомянутых сортов пшеницы будет содержаться в АТСС, который является государственным депозитарием, в течение 30 лет или 5 лет после последнего запроса, либо в течение срока действия патента, каким бы продолжительным он ни был, и будет заменен, если в течение этого периода семена станут нежизнеспособными. Заявитель не будет накладывать никаких ограничений на доступность депозитного материала из АТСС, однако заявитель не вправе отказаться от любых ограничений, установленных законом о передаче биологического материала или его транспортировке для коммерческих целей.
- 28 030578
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Со1огабо ИйеаЕ Кезеагсй ЕоипЩаЕ1оп, 1пс ϋδΐΐίθ, М1сйае1 На1еу, БсоЕЕ ИезЕга, РЫНр Уа1Де2, У1сЕог1а <120> РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ, ВОЗДЕЙСТВУЮЩИМ НА АЦЕТИЛКАРБОКСИЛАЗУ <130> 11-046 Р09844И301 <150> 61/438,294 <151> 2011-02-01 <150> 61/553,830 <151> 2011-10-31 <160> 16 <170> Патент версии 3.5 <210> 1 <211> 1152 <212> ДНК <213> Тг1Е1сит аезЕксит <400> 1
сдЕдЕЕддаЕ ддЕсЕдаЕда ЕддсадсссЕ даасдЕдддЕ ЕЕсадЕасаЕ ЕЕаЕсЕдасЕ
даадаадасс аЕдсЕсдЕаЕ ЕадсасЕЕсЕ дЕЕаЕадсдс асаадаЕдса дсЕЕдаЕааЕ
ддЕдаааЕЕа ддЕдддЕЕаЕ сдаЕЕсЕдЕЕ дЕддддаадд аддаЕдддсЕ аддЕдЕддад
аасаЕасаЕд даадЕдсЕдс ЕаЕЕдссадЕ дссЕаЕЕсЕа дддссЕаЕда ддадасаЕЕЕ
асдсЕЕасаЕ ЕЕдЕдасЕдд асддасЕдЕЕ ддааЕаддад саЕаЕсЕЕдс ЕсдасЕЕддс
аЕасддЕдса ЕасадсдЕас Едассадссс аЕЕаЕссЕаа сЕдддЕЕсЕс ЕдссЕЕдаас
аадсЕЕсЕЕд дссдддаадЕ ЕЕасадсЕсс сасаЕдсадЕ ЕдддЕддссс сааааЕЕаЕд
дсдасааасд дЕдЕЕдЕсса ЕсЕдасадЕЕ ЕсадаЕдасс ЕЕдааддЕдЕ аЕсЕааЕаЕа
ЕЕдаддЕддс ЕсадсЕаЕдЕ ЕссЕдссаас аЕЕддЕддас сЕсЕЕссЕаЕ ЕасааааЕсЕ
ЕЕддасссас сЕдасадасс сдЕЕдсЕЕас аЕсссЕдада аЕасаЕдсда ЕссЕсдЕдсЕ
дссаЕсадЕд дсаЕЕдаЕда Еадссааддд аааЕддЕЕдд ддддсаЕдЕЕ сдасааадас
- 29 030578
адЕЕЕЕдЕдд адасаЕЕЕда аддаЕдддсд аадЕсадЕЕд ЕЕасЕддсад адсЕааасЕс
ддадддаЕЕс сддЕдддЕдЕ ЕаЕадсЕдЕд дадасасада сЕаЕдаЕдса дсЕсаЕсссЕ
дсЕдаЕссад дссадсЕЕда ЕЕсссаЕдад сддЕсЕдЕЕс сЕсдЕдсЕдд дсаадЕсЕдд
ЕЕЕссадаЕЕ садсЕасЕаа дасадсдсад дсааЕдсЕдд асЕЕсаассд ЕдааддаЕЕа
ссЕсЕдЕЕса ЕссЕЕдсЕаа сЕддададдс ЕЕсЕсЕддЕд дасааадада ЕсЕЕЕЕЕдаа
ддааЕссЕЕс аддсЕдддЕс аасааЕЕдЕЕ дадаассЕЕа ддасаЕасаа ЕсадссЕдсс
ЕЕЕдЕаЕаЕа Ессссааддс ЕдсададсЕа сдЕддадддд сЕЕдддЕсдЕ даЕЕдаЕадс
аадаЕаааЕс садаЕсдсаЕ ЕдадЕЕсЕаЕ дсЕдададда сЕдсаааддд сааЕдЕЕсЕс
даассЕсаад дд <210> 2 <211> 1161 <212> ДНК <213> ТгьЕьсит. аезЕУлит
<400> 2 аЕсЕЕдсЕЕс сдЕдЕЕддаЕ ддЕсЕдаЕда ЕддсадсссЕ даасдЕдддЕ ЕЕсааЕаЕаЕ
ЕЕаЕсЕдасЕ даадаадасс аЕдсЕсдЕаЕ ЕадсдсЕЕсЕ дЕЕаЕадсдс асаадаЕдса
дсЕЕдаЕааЕ ддЕдаааЕЕа ддЕдддЕЕаЕ ЕдаЕЕсЕдЕЕ дЕадддаадд аддаЕдддсЕ
аддЕдЕддад аасаЕасаЕд даадЕдсЕдс ЕаЕЕдссадЕ дссЕаЕЕсЕа дддссЕаЕда
ддадасаЕЕЕ асдсЕЕасаЕ ЕЕдЕдасЕдд ааддасЕдЕЕ ддааЕаддад саЕаЕсЕЕдс
ЕсдасЕЕддс аЕасддЕдса ЕЕсадсдЕас Едассадссс аЕЕаЕссЕаа сЕдддЕЕЕЕс
ЕдссЕЕдаас аадсЕЕсЕЕд дссдддаадЕ дЕасадсЕсс сасаЕдсадЕ ЕдддЕддссс
сааааЕЕаЕд дссасааасд дЕдЕЕдЕсса ЕсЕдасадЕЕ ЕсадаЕдасс ЕЕдааддЕдЕ
аЕсЕааЕаЕа ЕЕдаддЕддс ЕсадсЕаЕдЕ ЕссЕдссаас аЕЕддЕддас сЕсЕЕссЕаЕ
ЕасааааЕсЕ ЕЕддасссас сЕдасадасс сдЕЕдсЕЕас аЕсссЕдада аЕасаЕдЕда
- 30 030578
кссксдкдса дссаксадкд дсаккдакда кадссааддд ааакддккдд ддддсакдкк
сдасааадас адккккдкдд адасакккда аддакдддсд аадксадкад ккаскддсад
адсдаааскс ддадддаккс сддкдддкдк какадскдкд дадасасада скакдакдса
дсксакссск дскдакссад дксадсккда кксссакдад сддкскдккс сксдкдскдд
дсаадкскдд кккссадакк садскаскаа дасадсдсад дсаакдскдд аскксаассд
кдааддакка сскскдккса кссккдскаа скддададдс ккскскддкд ддсааадада
кскккккдаа ддаакссккс аддскдддкс аасааккдкк дадаасскка ддасакасаа
ксадсскдсс кккдкакака кссссааддс кдсададска сдкддадддд сккдддксдк
даккдакадс аадакааакс садаксдсак кдадккскак дскдададда скдсаааддд
саакдккскд аассксаадд д <210> 3 <211> 1129 <212> ДНК <213> ТгШсит аезНуит
<400> 3
дкдккддакд дкскдакдак ддсадссскд аасдкдддкк ксадкасакк какскдаскд
аадаадасса кдсксдкакк адсасккскд ккакадсдса саадакдсад сккдакаакд
дкдаааккад дкдддккакк даккскдккд кддддаадда ддакдддска ддкдкддада
асакасакдд аадкдскдск аккдссадкд сскаккскад ддсскакдад дадасаккка
сдсккасакк кдкдаскдда сддаскдккд даакаддадс акаксккдск сдасккддса
касддкдсак асадсдкаск дассадссса ккаксскаас сдддккскск дскккдааса
адскксккдд ссдддаадкд касадскссс асакдсадкк дддкддсссс ааааккакдд
сдасааасдд кдккдкссак скдасадккк садакдасск кдааддкдкд кскаакакак
кдаддкддск садскакдкк сскдссааса ккддкддасс кскксскакк асаааакскк
- 31 030578
Ёддасссасс ссаЁсадЁдд дЁЁЁЁдЁдда дадддаЁЁсс сЁдаЁссадд
ЁЁссадаЁЁс сЁсЁдЁЁсаЁ дааЁссЁЁса
ЁЁдЁаЁаЁаЁ адаЁаааЁсс <210>
<211>
<212>
<213>
<400> 4 даЁдаадЁаа
ЁЁсадЁасаЁ асаадаЁдса аддаЁдддсЁ дддссЁаЁда саЁаЁсЁЁдс ссдддЁЁсЁс
ЁдддЁддссс
Ёдасадассс саЁЁдаЁдаЁ дасаЁЁЁдаа ддЁдддЁдЁЁ ссадсЁЁдаЁ адсЁасЁаад ссЁЁдсЁаас ддсЁдддЁса ссссааддсЁ дЁЁдсаЁаЁа адссааддда ддаЁдддсда аЁадсЁдЁдд
ЁсссаЁдадс асадсЁсаад
ЁддададдсЁ асааЁЁдЁЁд дсададсЁас адаЁсдааЁЁ
1188
ДНК
ТгШсит аезЁгуит.
ааЁсдЁдсЁЁ
ЁЁаЁсЁдасЁ дсЁЁдаЁааЁ аддЁдЁддад ддадасаЁЁЁ
ЁсдасЁЁддс
ЁдсЁЁЁдаас сааааЁЁаЁд
ЁсссЁдадаа ааЁддЁЁддд адЁсадЁадЁ адасасадас ддЁсЁдЁЁсс сааЁдсЁдда
ЁсЁсЁддЁдд адаассЁЁад дЁддаддддс дадЁЁсЁаЁд сдЁдЁЁддаЁ даадаадасс ддЁдаааЁЁа аасаЁасаЁд асдсЁЁасаЁ аЁасддЁдса аадсЁЁсЁЁд дсдасааасд
ЁасаЁдЁдаЁ дддсаЁдЁЁс
ЁасЁддсада
ЁаЁдаЁдсад
ЁсдЁдсЁддд сЁЁсаассдЁ дсааададаЁ дасаЁасааЁ
ЁЁдддЁсдЁд сЁдададдас ддЁсЁдаЁда аЁдсЁсдЁаЁ ддЁдддЁЁаЁ даадЁдсЁдс
ЁЁдЁдасЁдд
ЁасадсдЁас дссдддаадЁ дЁдЁЁдЁсса
ЁддсадсссЁ
ЁадсасЁЁсЁ
ЁдаЁЁсЁдЁЁ
ЁаЁЁдссадЁ асддасЁдЁЁ
Ёдассадссс дЁасадсЁсс
ЁсЁдасадЁЁ ссЁсдЁдсад дасааадаса дсдааасЁсд сЁсаЁсссЁд саадЁсЁддЁ дааддаЁЁас сЁЁЁЁЁдаад садссЁдссЁ аЁЁдаЁадса
Ёдсаааддд даасдЁдддЁ дЁЁаЁадсдс дЁддддаадд дссЁаЁЁсЁа ддааЁаддад аЁЁаЁссЁаа сасаЁдсадЁ
ЁсадаЁдасс
- 32 030578
ЕЕдааддЕдЕ дЕсЕааЕаЕа ЕЕдаддЕддс ЕсадсЕаЕдЕ ЕссЕдссаас аЕЕддЕддас
сЕсЕЕссЕаЕ ЕасааааЕсЕ ЕЕддасссас сЕдасадасс сдЕЕдсаЕаЕ аЕсссЕдада
аЕасаЕдЕда ЕссЕсдЕдса дссаЕсадЕд дсаЕЕдаЕда Еадссааддд аааЕддЕЕдд
ддддсаЕдЕЕ сдасааадас адЕЕЕЕдЕдд адасаЕЕЕда аддаЕдддсд аадЕсадЕад
ЕЕасЕддсад адсдааасЕс ддадддаЕЕс сддЕдддЕдЕ ЕаЕадсЕдЕд дадасасада
сЕаЕдаЕдса дсЕсаЕсссЕ дсЕдаЕссад дссадсЕЕда ЕЕсссаЕдад сддЕсЕдЕЕс
сЕсдЕдсЕдд дсаадЕсЕдд ЕЕЕссадаЕЕ садЕЕасЕаа дасадсЕсаа дсааЕдсЕдд
асЕЕсаассд ЕдааддаЕЕа ссЕсЕдЕЕса ЕссЕЕдсЕаа сЕддададдс ЕЕсЕсЕддЕд
ддсааадада ЕсЕЕЕЕЕдаа ддааЕссЕЕс аддсЕдддЕс аасааЕЕдЕЕ дадаассЕЕа
ддасаЕасаа ЕсадссЕдсс ЕЕЕдЕаЕаЕа Ессссааддс ЕдсададсЕа сдЕддадддд
сЕЕдддЕсдЕ даЕЕдаЕадс аадаЕаааЕс садаЕсдааЕ ЕдадЕЕсЕаЕ дсЕдададда
сЕдсаааддд ЕааЕдЕЕсЕЕ даассЕсаад ддЕЕдаЕЕда даЕассад
<210> 5 <211> 1194 <212> ДНК <213> Тг1Е1сит. аезЕклит <400> 5
ддсаЕадсад аЕдаадЕада дЕсЕЕдсЕЕс сдЕдЕЕддаЕ ддЕсЕдаЕда ЕддсадсссЕ
даасдЕдддЕ ЕЕсадЕасаЕ ЕЕаЕсЕдасЕ даадаадасс аЕдсЕсдЕаЕ ЕадсасЕЕсЕ
дЕЕаЕадсдс асаадаЕдса дсЕЕдаЕааЕ ддЕдаааЕЕа ддЕдддЕЕаЕ сдаЕЕсЕдЕЕ
дЕддддаадд аддаЕдддсЕ аддЕдЕддад аасаЕасаЕд даадЕдсЕдс ЕаЕЕдссадЕ
дссЕаЕЕсЕа дддссЕаЕда ддадасаЕЕЕ асдсЕЕасаЕ ЕЕдЕдасЕдд асддасЕдЕЕ
ддааЕаддад саЕаЕсЕЕдс ЕсдасЕЕддс аЕасддЕдса ЕасадсдЕас Едассадссс
аЕЕаЕссЕаа сЕдддЕЕсЕс ЕдссЕЕдаас аадсЕЕсЕЕд дссдддаадЕ ЕЕасадсЕсс
- 33 030578 сасаЕдсадЕ
ЕсадаЕдасс аЕЕддЕддас аЕсссЕдада аааЕддЕЕдд аадЕсадЕЕд дадасасада сддЕсЕдЕЕс дсааЕдсЕдд
ЕЕсЕсЕддЕд дадаассЕЕа сдЕддадддд дсЕдададда <210>
<211>
<212>
<213>
<400> 6
ЕдаадЕаааа
ЕсааЕаЕаЕЕ саадаЕдсад ддаЕдддсЕа ддссЕаЕдад аЕаЕсЕЕдсЕ
ЕдддЕддссс
ЕЕдааддЕдЕ сЕсЕЕссЕаЕ аЕасаЕдсда ддддсаЕдЕЕ
ЕЕасЕддсад сЕаЕдаЕдса сЕсдЕдсЕдд асЕЕсаассд дасааадада ддасаЕасаа сЕЕдддЕсдЕ сЕдсаааддд сааааЕЕаЕд аЕсЕааЕаЕа
ЕасааааЕсЕ
ЕссЕсдЕдсЕ сдасааадас адсЕааасЕс дсЕсаЕсссЕ дсаадЕсЕдд
ЕдааддаЕЕа
ЕсЕЕЕЕЕдаа
ЕсадссЕдсс даЕЕдаЕадс
1184
ДНК
ТгтЕтсиш. аезЕтуит
ЕсЕЕдсЕЕсс
ЕаЕсЕдасЕд сЕЕдаЕааЕд ддЕдЕддада дадасаЕЕЕа сдасЕЕддса дсдасааасд дЕдЕЕдЕсса
ЕсЕдасадЕЕ
ЕЕдаддЕддс
ЕсадсЕаЕдЕ
ЕссЕдссаас
ЕЕддасссас сЕдасадасс сдЕЕдсЕЕас дссаЕсадЕд адЕЕЕЕдЕдд ддадддаЕЕс дсЕдаЕссад
ЕЕЕссадаЕЕ ссЕсЕдЕЕса ддааЕссЕЕс
ЕЕЕдЕаЕаЕа аадаЕаааЕс сааЕдЕЕсЕс дЕдЕЕддаЕд аадаадасса дЕдаааЕЕад асаЕасаЕдд сдсЕЕасаЕЕ
ЕасддЕдсаЕ дсаЕЕдаЕда адасаЕЕЕда сддЕдддЕдЕ дссадсЕЕда садЕЕасЕаа
ЕссЕЕдсЕаа аддсЕдддЕс
Ессссааддс садаЕсдсаЕ даассЕсаад дЕсЕдаЕдаЕ
ЕдсЕсдЕаЕЕ дЕдддЕЕаЕЕ аадЕдсЕдсЕ
ЕдЕдасЕдда
ЕсадсдЕасЕ
Еадссааддд аддаЕдддсд
ЕаЕадсЕдЕд
ЕЕсссаЕдад дасадсдсад сЕддададдс аасааЕЕдЕЕ
ЕдсададсЕа
ЕдадЕЕсЕаЕ ддЕЕдаЕЕда ддсадсссЕд адсдсЕЕсЕд даЕЕсЕдЕЕд аЕЕдссадЕд аддасЕдЕЕд дассадссса даЕд аасдЕдддЕЕ
ЕЕаЕадсдса
Еадддаадда ссЕаЕЕсЕад дааЕаддадс
ЕЕаЕссЕаас
- 34 030578
ЕдддЕЕЕЕсЕ дссЕЕдааса адсЕЕсЕЕдд ссдддаадЕд ЕасадсЕссс асаЕдсадЕЕ
дддЕддсссс ааааЕЕаЕдд ссасааасдд ЕдЕЕдЕссаЕ сЕдасадЕЕЕ садаЕдассЕ
ЕдааддЕдЕа ЕсЕааЕаЕаЕ ЕдаддЕддсЕ садсЕаЕдЕЕ ссЕдссааса ЕЕддЕддасс
ЕсЕЕссЕаЕЕ асааааЕсЕЕ Еддасссасс Едасадассс дЕЕдсЕЕаса ЕсссЕдадаа
ЕасаЕдЕдаЕ ссЕсдЕдсад ссаЕсадЕдд саЕЕдаЕдаЕ адссааддда ааЕддЕЕддд
дддсаЕдЕЕс дасааадаса дЕЕЕЕдЕдда дасаЕЕЕдаа ддаЕдддсда адЕсадЕадЕ
ЕасЕддсада дсдааасЕсд дадддаЕЕсс ддЕдддЕдЕЕ аЕадсЕдЕдд адасасадас
ЕаЕдаЕдсад сЕсаЕсссЕд сЕдаЕссадд ЕсадсЕЕдаЕ ЕсссаЕдадс ддЕсЕдЕЕсс
ЕсдЕдсЕддд саадЕсЕддЕ ЕЕссадаЕЕс адЕЕасЕаад асадсдсадд сааЕдсЕдда
сЕЕсаассдЕ дааддаЕЕас сЕсЕдЕЕсаЕ ссЕЕдсЕаас ЕддададдсЕ ЕсЕсЕддЕдд
дсааададаЕ сЕЕЕЕЕдаад дааЕссЕЕса ддсЕдддЕса асааЕЕдЕЕд адаассЕЕад
дасаЕасааЕ садссЕдссЕ ЕЕдЕаЕаЕаЕ ссссааддсЕ дсададсЕас дЕддаддддс
ЕЕдддЕсдЕд аЕЕдаЕадса адаЕаааЕсс адаЕсдсаЕЕ дадЕЕсЕаЕд сЕдададдас
Едсааадддс ааЕдЕЕсЕЕд аассЕсаадд дЕЕдаЕЕдад аЕдс
<210> 7 <211> 375 <212> РКТ <213> Тг1Е1сит аезЕксит <400> 7
Уа1 1 О1у Тгр Зег Азр Азр 5 О1у Зег Рго О1и 10 Агд О1у РЬе О1п Туг 15 11е
Туг Ьеи ТЬг О1и О1и Азр Н1з А1а Агд 11е Зег ТЬг Зег Уа1 11е А1а
20 25 30
Нтз Ьуз МеЕ О1п Ьеи Азр Азп О1у О1и 11е Агд Тгр Уа1 11е Азр Зег
35 40 45
- 35 030578
ναι Уа1 50 О1у Ьуз О1и Азр О1у 55 Ьеи О1у Уа1 О1и Азп 60 11е Н1з О1у Зег
А1а А1а 11е А1а Зег А1а Туг Зег Агд А1а Туг О1и О1и ТЬг РЬе ТЬг
65 70 75 80
Ьеи ТЬг РЬе Уа1 ТЬг О1у Агд ТЬг Уа1 О1у 11е О1у А1а Туг Ьеи А1а
85 90 95
Агд Ьеи О1у 11е Агд Суз 11е О1п Агд ТЬг Азр О1п Рго 11е 11е Ьеи
100 105 110
ТЬг О1у РЬе Зег А1а Ьеи Азп Ьуз Ьеи Ьеи О1у Агд О1и Уа1 Туг Зег
115 120 125
Зег Ηΐ3 МеЬ О1п Ьеи О1у О1у Рго Ьуз 11е МеЬ А1а ТЬг Азп О1у Уа1
130 135 140
ναι Ηΐ3 Ьеи ТЬг Уа1 Зег Азр Азр Ьеи О1и О1у Уа1 Зег Азп 11е Ьеи
145 150 155 160
Агд Тгр Ьеи Зег Туг Уа1 Рго А1а Азп 11е О1у О1у Рго Ьеи Рго 11е
165 170 175
ТЬг Ьуз Зег Ьеи Азр Рго Рго Азр Агд Рго Уа1 А1а Туг 11е Рго О1и
180 185 190
Азп ТЬг Суз Азр Рго Агд А1а А1а 11е Зег О1у 11е Азр Азр Зег О1п
195 200 205
О1у Ьуз Тгр Ьеи О1у О1у МеЬ РЬе Азр Ьуз Азр Зег РЬе Уа1 О1и ТЬг
210 215 220
РЬе О1и О1у Тгр А1а Ьуз Зег Уа1 Уа1 ТЬг О1у Агд А1а Ьуз Ьеи О1у
225 230 235 240
О1у 11е Рго Уа1 О1у Уа1 11е А1а Уа1 О1и ТЬг О1п ТЬг МеЬ МеЬ О1п
245 250 255
Ьеи 11е Рго А1а Азр Рго О1у О1п Ьеи Азр Зег ΗΪ8 О1и Агд Зег Уа1
260 265 270
Рго Агд А1а О1у О1п Уа1 Тгр РЬе Рго Азр Зег А1а ТЬг Ьуз ТЬг А1а
275 280 285
О1п А1а МеЬ Ьеи Азр РЬе Азп Агд О1и О1у Ьеи Рго Ьеи РЬе 11е Ьеи
290 295 300
- 36 030578
А1а 305 Азп Тгр Агд О1у РЬе 310 Зег О1у О1у О1п Агд Азр 315 Ьеи РЬе О1и О1у 320
11е Ьеи С1п А1а О1у Зег ТЬг 11е Уа1 О1и Азп Ьеи Агд ТЬг Туг Азп
325 330 335
С1п Рго А1а РЬе Уа1 Туг 11е Рго Ьуз А1а А1а О1и Ьеи Агд О1у О1у
340 345 350
А1а Тгр Уа1 Уа1 11е Азр Зег Ьуз 11е Азп Рго Азр Агд 11е О1и РЬе
355 360 365
Туг А1а О1и Агд ТЬг А1а Ьуз
370 375
<210> ! 3
<211> : 394
<212> РКТ
<213> ' Гг1Ь1сит аезЬЬиит
<400> ! 3
Зег Ьуз 11е Уа1 Ьеи Агд Уа1 О1у Тгр Зег Азр Азр О1у Зег Рго О1и
1 5 10 15
Агд О1у РЬе О1п Туг 11е Туг Ьеи ТЬг О1и О1и Азр ΗΪ8 А1а Агд 11е
20 25 30
Зег ТЬг Зег Уа1 11е А1а ΗΪ8 Ьуз МеЬ О1п Ьеи Азр Азп О1у О1и 11е
35 40 45
Агд Тгр Уа1 11е Азр Зег Уа1 Уа1 О1у Ьуз О1и Азр О1у Ьеи О1у Уа1
50 55 60
О1и Азп 11е Ηΐ3 О1у Зег А1а А1а 11е А1а Зег А1а Туг Зег Агд А1а
65 70 75 30
Туг О1и О1и ТЬг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг РЬе Уа1 ТЬг О1у Агд ТЬг Уа1 О1у
35 90 95
11е О1у А1а Туг Ьеи А1а Агд Ьеи О1у 11е Агд Суз 11е С1п Агд ТЬг
100 105 110
Азр С1п Рго 11е 11е Ьеи ТЬг О1у РЬе Зег А1а Ьеи Азп Ьуз Ьеи Ьеи
115 120 125
О1у Агд О1и Уа1 Туг Зег Зег ΗΪ8 МеЬ О1п Ьеи О1у О1у Рго Ьуз 11е
130 135 140
- 37 030578
МеЬ 145 А1а ТЬг Азп О1у Уа1 150 Уа1 ΗΪ8 Ьеи ТЬг Уа1 155 Зег Азр Азр Ьеи О1и 160
О1у Уа1 Зег Азп 11е Ьеи Агд Тгр Ьеи Зег Туг Уа1 Рго А1а Азп 11е
165 170 175
О1у О1у Рго Ьеи Рго 11е ТЬг Ьуз Зег Ьеи Азр Рго Рго Азр Агд Рго
180 185 190
Уа1 А1а Туг 11е Рго О1и Азп ТЬг Суз Азр Рго Агд А1а А1а 11е Зег
195 200 205
О1у 11е Азр Азр Зег О1п О1у Ьуз Тгр Ьеи О1у О1у МеЬ РЬе Азр Ьуз
210 215 220
Азр Зег РЬе Уа1 О1и ТЬг РЬе О1и О1у Тгр А1а Ьуз Зег Уа1 Уа1 ТЬг
225 230 235 240
О1у Агд А1а Ьуз Ьеи О1у О1у 11е Рго Уа1 О1у Уа1 11е А1а Уа1 О1и
245 250 255
ТЬг О1п ТЬг МеЬ МеЬ О1п Ьеи 11е Рго А1а Азр Рго О1у О1п Ьеи Азр
260 265 270
Зег Ηΐ3 О1и Агд Зег Уа1 Рго Агд А1а О1у О1п Уа1 Тгр РЬе Рго Азр
275 280 285
Зег Уа1 ТЬг Ьуз ТЬг А1а О1п А1а МеЬ Ьеи Азр РЬе Азп Агд О1и О1у
290 295 300
Ьеи Рго Ьеи РЬе 11е Ьеи А1а Азп Тгр Агд О1у РЬе Зег О1у О1у О1п
305 310 315 320
Агд Азр Ьеи РЬе О1и О1у 11е Ьеи О1п А1а О1у Зег ТЬг 11е Уа1 О1и
325 330 335
Азп Ьеи Агд ТЬг Туг Азп О1п Рго А1а РЬе Уа1 Туг 11е Рго Ьуз А1а
340 345 350
А1а О1и Ьеи Агд О1у О1у А1а Тгр Уа1 Уа1 11е Азр Зег Ьуз 11е Азп
355 360 365
Рго Азр Агд 11е О1и РЬе Туг А1а О1и Агд ТЬг А1а Ьуз О1у Азп Уа1
370 375 380
Ьеи О1и Рго О1п О1у Ьеи 11е О1и 11е Рго
- 38 030578
385 390 <210> 9 <211> 384 <212> РКТ <213> ТгЮРсит аезЬ'.ллп <400> 9
Агд Уа1 1 О1у Тгр Зег 5 А3р Азр О1у Зег Рго О1и Агд О1у РЬе О1п Туг
10 15
11е Туг ^еи ТЬг О1и О1и Азр Н1з А1а Агд 11е Зег ТЬг Зег Уа1 11е
20 25 30
А1а Ηΐ3 ^уз Ме5 О1п ^еи Азр Азп О1у О1и 11е Агд Тгр Уа1 11е Азр
35 40 45
Зег Уа1 Уа1 О1у ^уз О1и Азр О1у ^еи О1у Уа1 О1и Азп 11е Н1з О1у
50 55 60
Зег А1а А1а 11е А1а Зег А1а Туг Зег Агд А1а Туг О1и О1и ТЬг РЬе
65 70 75 80
ТЬг ^еи ТЬг РЬе Уа1 ТЬг О1у Агд ТЬг Уа1 О1у 11е О1у А1а Туг ^еи
85 90 95
А1а Агд ^еи О1у 11е Агд Суз 11е О1п Агд ТЬг Азр О1п Рго 11е 11е
100 105 110
^еи ТЬг О1у РЬе Зег А1а ^еи Азп ^уз ^еи ^еи О1у Агд О1и Уа1 Туг
115 120 125
Зег Зег Ηΐ3 Ме5 О1п ^еи О1у О1у Рго ^уз 11е Ме5 А1а ТЬг Азп О1у
130 135 140
Уа1 Уа1 Ηΐ3 ^еи ТЬг Уа1 Зег Азр Азр ^еи О1и О1у Уа1 Зег Азп 11е
145 150 155 160
^еи Агд Тгр ^еи Зег Туг Уа1 Рго А1а Азп 11е О1у О1у Рго ^еи Рго
165 170 175
11е ТЬг ^уз Зег ^еи А3р Рго Рго Азр Агд Рго Уа1 А1а Туг 11е Рго
180 185 190
О1и Азп ТЬг Суз А3р Рго Агд А1а А1а 11е Зег О1у 11е Азр Азр Зег
195 200 205
О1п О1у ^уз Тгр ^еи О1у О1у Ме5 РЬе Азр ^уз Азр Зег РЬе Уа1 О1и
- 39 030578
210 215 220
ТЬг 225 РЬе О1и О1у Тгр А1а 230 ^уз Зег Уа1 Уа1 ТЬг 235 О1у Агд А1а ^уз ^еи 240
О1у О1у 11е Рго Уа1 О1у Уа1 11е А1а Уа1 О1и ТЬг О1п ТЬг МеЕ МеЕ
245 250 255
О1п ^еи 11е Рго А1а Азр Рго О1у О1п ^еи Азр Зег Н1з О1и Агд Зег
260 265 270
Уа1 Рго Агд А1а О1у О1п Уа1 Тгр РЬе Рго Азр Зег А1а ТЬг ^уз ТЬг
275 280 285
А1а О1п А1а МеЕ ^еи Азр РЬе Азп Агд О1и О1у ^еи Рго ^еи РЬе 11е
290 295 300
^еи А1а Азп Тгр Агд О1у РЬе Зег О1у О1у О1п Агд Азр ^еи РЬе О1и
305 310 315 320
О1у 11е ^еи О1п А1а О1у Зег ТЬг 11е Уа1 О1и Азп ^еи Агд ТЬг Туг
325 330 335
Азп О1п Рго А1а РЬе Уа1 Туг 11е Рго ^уз А1а А1а О1и ^еи Агд О1у
340 345 350
О1у А1а Тгр Уа1 Уа1 11е Азр Зег ^уз 11е Азп Рго Азр Агд 11е О1и
355 360 365
РЬе Туг А1а О1и Агд ТЬг А1а ^уз О1у Азп Уа1 ^еи О1и Рго О1п О1у
370 375 380
<210> 10
<211> 398
<212> РКТ
<213> Тг1Е1сит аезЕтуит
<400> 10
О1у 11е А1а Азр О1и Уа1 О1и Зег Суз РЬе Агд Уа1 О1у Тгр Зег Азр
1 5 10 15
Азр О1у Зег Рго О1и Агд О1у РЬе О1п Туг 11е Туг ^еи ТЬг О1и О1и
20 25 30
Азр Ηΐ3 А1а Агд 11е Зег ТЬг Зег Уа1 11е А1а Н1з ^уз МеЕ О1п ^еи
35 40 45
Азр Азп О1у О1и 11е Агд Тгр Уа1 11е Азр Зег Уа1 Уа1 О1у ^уз О1и
- 40 030578
55 60
Азр 65 О1у ^еи О1у Уа1 О1и 70 Азп 11е Ньз О1у Зег А1а А1а 75 11е А1а Зег 80
А1а Туг Зег Агд А1а Туг О1и О1и ТЬг РЬе ТЬг ^еи ТЬг РЬе Уа1 ТЬг
85 90 95
О1у Агд ТЬг Уа1 О1у 11е О1у А1а Туг ^еи А1а Агд ^еи О1у 11е Агд
100 105 110
Суз 11е О1п Агд ТЬг Азр О1п Рго 11е 11е ^еи ТЬг О1у РЬе Зег А1а
115 120 125
^еи Азп ^уз ^еи ^еи О1у Агд О1и Уа1 Туг Зег Зег Ньз МеЕ О1п ^еи
130 135 140
О1у О1у Рго ^уз 11е МеЕ А1а ТЬг Азп О1у Уа1 Уа1 Ньз ^еи ТЬг Уа1
145 150 155 160
Зег Азр Азр ^еи О1и О1у Уа1 Зег Азп 11е ^еи Агд Тгр ^еи Зег Туг
165 170 175
Уа1 Рго А1а Азп 11е О1у О1у Рго ^еи Рго 11е ТЬг ^уз Зег ^еи Азр
180 185 190
Рго Рго Азр Агд Рго Уа1 А1а Туг 11е Рго О1и Азп ТЬг Суз Азр Рго
195 200 205
Агд А1а А1а 11е Зег О1у 11е Азр Азр Зег О1п О1у ^уз Тгр ^еи О1у
210 215 220
О1у МеЕ РЬе Азр ^уз Азр Зег РЬе Уа1 О1и ТЬг РЬе О1и О1у Тгр А1а
225 230 235 240
^уз Зег Уа1 Уа1 ТЬг О1у Агд А1а ^уз ^еи О1у О1у 11е Рго Уа1 О1у
245 250 255
Уа1 11е А1а Уа1 О1и ТЬг О1п ТЬг МеЕ МеЕ О1п ^еи 11е Рго А1а Азр
260 265 270
Рго О1у О1п ^еи Азр Зег Ньз О1и Агд Зег Уа1 Рго Агд А1а О1у О1п
275 280 285
Уа1 Тгр РЬе Рго Азр Зег Уа1 ТЬг ^уз ТЬг А1а О1п А1а МеЕ ^еи Азр
290 295 300
- 41 030578
РЬе 305 Азп Агд О1и О1у Ьеи 310 Рго Ьеи РЬе 11е Ьеи 315 А1а Азп Тгр Агд О1у 320
РЬе Зег О1у О1у О1п Агд Азр Ьеи РЬе О1и О1у 11е Ьеи О1п А1а О1у
325 330 335
Зег ТЬг 11е Уа1 О1и Азп Ьеи Агд ТЬг Туг Азп О1п Рго А1а РЬе Уа1
340 345 350
Туг 11е Рго Ьуз А1а А1а О1и Ьеи Агд О1у О1у А1а Тгр Уа1 Уа1 11е
355 360 365
Азр Зег Ьуз 11е Азп Рго Азр Агд 11е О1и РЬе Туг А1а О1и Агд ТЬг
370 375 380
А1а Ьуз О1у Азп Уа1 Ьеи О1и Рго О1п О1у Ьеи 11е О1и МеЬ
385 390 395
<210> 11
<211> 386
<212> РКТ
<213> ' Тг1Ь1сит аезЮтеит
<400> 11
Зег Суз РЬе Агд Уа1 С1у Тгр Зег Азр Азр О1у Зег Рго О1и Агд О1у
1 5 10 15
РЬе С1п Туг 11е Туг Ьеи ТЬг О1и О1и Азр ΗΪ8 А1а Агд 11е Зег А1а
20 25 30
Зег Уа1 11е А1а ΗΪ8 Ьуз МеЬ О1п Ьеи Азр Азп О1у О1и 11е Агд Тгр
35 40 45
Уа1 11е Азр Зег Уа1 Уа1 С1у Ьуз О1и Азр О1у Ьеи О1у Уа1 О1и Азп
50 55 60
11е Ηΐ3 О1у Зег А1а А1а 11е А1а Зег А1а Туг Зег Агд А1а Туг О1и
65 70 75 80
О1и ТЬг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг РЬе Уа1 ТЬг О1у Агд ТЬг Уа1 О1у 11е О1у
85 90 95
А1а Туг Ьеи А1а Агд Ьеи С1у 11е Агд Суз 11е О1п Агд ТЬг Азр О1п
100 105 110
Рго 11е 11е Ьеи ТЬг С1у РЬе Зег А1а Ьеи Азп Ьуз Ьеи Ьеи О1у Агд
115 120 125
- 42 030578
О1и Уа1 130 Туг Зег Зег Н1з МеЬ 135 О1п Ьеи О1у О1у Рго 140 Ьуз 11е МеЬ А1а
ТЬг Азп О1у Уа1 Уа1 Н1з Ьеи ТЬг Уа1 Зег Азр Азр Ьеи О1и О1у Уа1
145 150 155 160
Зег Азп 11е Ьеи Агд Тгр Ьеи Зег Туг Уа1 Рго А1а Азп 11е О1у О1у
165 170 175
Рго Ьеи Рго 11е ТЬг Ьуз Зег Ьеи Азр Рго Рго Азр Агд Рго Уа1 А1а
180 185 190
Туг 11е Рго О1и Азп ТЬг Суз Азр Рго Агд А1а А1а 11е Зег О1у 11е
195 200 205
Азр Азр Зег О1п О1у Ьуз Тгр Ьеи С1у О1у МеЬ РЬе Азр Ьуз Азр Зег
210 215 220
РЬе Уа1 О1и ТЬг РЬе О1и О1у Тгр А1а Ьуз Зег Уа1 Уа1 ТЬг О1у Агд
225 230 235 240
А1а Ьуз Ьеи О1у О1у 11е Рго Уа1 О1у Уа1 11е А1а Уа1 О1и ТЬг О1п
245 250 255
ТЬг МеЬ МеЬ О1п Ьеи 11е Рго А1а Азр Рго О1у О1п Ьеи Азр Зег Н1з
260 265 270
О1и Агд Зег Уа1 Рго Агд А1а С1у О1п Уа1 Тгр РЬе Рго Азр Зег А1а
275 280 285
ТЬг Ьуз ТЬг А1а О1п А1а МеЬ Ьеи Азр РЬе Азп Агд О1и О1у Ьеи Рго
290 295 300
Ьеи РЬе 11е Ьеи А1а Азп Тгр Агд О1у РЬе Зег О1у О1у О1п Агд Азр
305 310 315 320
Ьеи РЬе О1и О1у 11е Ьеи О1п А1а О1у Зег ТЬг 11е Уа1 О1и Азп Ьеи
325 330 335
Агд ТЬг Туг Азп О1п Рго А1а РЬе Уа1 Туг 11е Рго Ьуз А1а А1а О1и
340 345 350
Ьеи Агд О1у О1у А1а Тгр Уа1 Уа1 11е Азр Зег Ьуз 11е Азп Рго Азр
355 360 365
Агд 11е О1и РЬе Туг А1а О1и Агд ТЬг А1а Ьуз О1у Азп Уа1 Ьеи Азп
370 375 380
- 43 030578
Ьеи Ьуз 385 <210> 12 <211> 394 <212> РКТ <213> Тг1Е1сит аезЕтуит <400> 12
О1и Уа1 1 Ьуз Зег Суз 5 РЬе Агд Уа1 О1у Тгр 10 Зег Азр Азр О1у Зег 15 Рго
О1и Агд О1у РЬе О1п Туг 11е Туг Ьеи ТЬг О1и О1и Азр Н1з А1а Агд
20 25 30
11е Зег А1а Зег Уа1 11е А1а Н1з Ьуз МеЕ О1п Ьеи Азр Азп О1у О1и
35 40 45
11е Агд Тгр Уа1 11е Азр Зег Уа1 Уа1 О1у Ьуз О1и Азр О1у Ьеи О1у
50 55 60
Уа1 О1и Азп 11е Н1з О1у Зег А1а А1а 11е А1а Зег А1а Туг Зег Агд
65 70 75 80
А1а Туг О1и О1и ТЬг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг РЬе Уа1 ТЬг О1у Агд ТЬг Уа1
85 90 95
О1у 11е О1у А1а Туг Ьеи А1а Агд Ьеи О1у 11е Агд Суз 11е О1п Агд
100 105 110
ТЬг Азр О1п Рго 11е 11е Ьеи ТЬг О1у РЬе Зег А1а Ьеи Азп Ьуз Ьеи
115 120 125
Ьеи О1у Агд О1и Уа1 Туг Зег Зег Н1з МеЕ О1п Ьеи О1у О1у Рго Ьуз
130 135 140
11е МеЕ А1а ТЬг Азп О1у Уа1 Уа1 Н1з Ьеи ТЬг Уа1 Зег Азр Азр Ьеи
145 150 155 160
О1и О1у Уа1 Зег Азп 11е Ьеи Агд Тгр Ьеи Зег Туг Уа1 Рго А1а Азп
165 170 175
11е О1у О1у Рго Ьеи Рго 11е ТЬг Ьуз Зег Ьеи Азр Рго Рго Азр Агд
180 185 190
Рго Уа1 А1а Туг 11е Рго О1и Азп ТЬг Суз Азр Рго Агд А1а А1а 11е
195 200 205
- 44 030578
Зег О1у 11е Азр Азр Зег О1п 215 О1у Ьуз Тгр Ьеи О1у 220 О1у МеЕ РЬе Азр
210
Ьуз Азр Зег РЬе Уа1 О1и ТЬг РЬе О1и О1у Тгр А1а Ьуз Зег Уа1 Уа1
225 230 235 240
ТЬг О1у Агд А1а Ьуз Ьеи О1у О1у 11е Рго Уа1 О1у Уа1 11е А1а Уа1
245 250 255
О1и ТЬг О1п ТЬг МеЕ МеЕ О1п Ьеи 11е Рго А1а Азр Рго О1у О1п Ьеи
260 265 270
Азр Зег Н1з О1и Агд Зег Уа1 Рго Агд А1а О1у О1п Уа1 Тгр РЬе Рго
275 280 285
Азр Зег Уа1 ТЬг Ьуз ТЬг А1а О1п А1а МеЕ Ьеи Азр РЬе Азп Агд О1и
290 295 300
О1у Ьеи Рго Ьеи РЬе 11е Ьеи А1а Азп Тгр Агд О1у РЬе Зег О1у О1у
305 310 315 320
О1п Агд Азр Ьеи РЬе О1и О1у 11е Ьеи О1п А1а О1у Зег ТЬг 11е Уа1
325 330 335
О1и Азп Ьеи Агд ТЬг Туг Азп О1п Рго А1а РЬе Уа1 Туг 11е Рго Ьуз
340 345 350
А1а А1а О1и Ьеи Агд О1у О1у А1а Тгр Уа1 Уа1 11е Азр Зег Ьуз 11е
355 360 365
Азп Рго Азр Агд 11е О1и РЬе Туг А1а О1и Агд ТЬг А1а Ьуз О1у Азп
370 375 380
Уа1 Ьеи О1и Рго О1п О1у Ьеи 11е О1и МеЕ
385 390 <210> 13 <211> 12753 <212> ДНК <213> А1оресигиз туозиготЬез Иид.з
60 <400> 13 ЕсадЕЕЕаЕд дсадЕсЕдЕд ЕЕЕдаадаас асЕдсаасЕс сдсЕдЕсЕдЕ ссааадддад
120 дасдаЕддда ЕссасасаЕс ЕдсссаЕЕдЕ сдддЕЕЕааЕ дсаЕссасаа сассаЕсдсЕ
аЕссасЕсЕЕ сдссадаЕаа асЕсадсЕдс ЕдсЕдсаЕЕс сааЕсЕЕсдЕ ссссЕЕсаад
180
- 45 030578
дксакссаад аадаааадсс дасдкдккаа дксаакаадд дакдакддсд акддаадсдк
дссадассск дсаддссакд дссадкскак ксдссааддк даасссадда ссаксксскк
асккккккдк сдксаасскс адасккдсак адакккаскк ксккдаккда дадсакдскк
дккккадкдк аадакакскс аакаскдкак сасаааакда кадккаадаа сааассаска
сассаакскк сасакаккдк ксккаккддд кккдскааак сккадкксдс аккадакккк
кккакдкска кдксдасасс скдадссксс ссдкдкскск дсаккдадак ксаадсаддд
акаддддааа ксасдаскдд акссккадсс акааккааак скскдксаас ккаддкдкад
акддаскскд кккккаакак ксадкакдак дкккксккаа дддададдда сасааааака
сакдкакдкк дсадкккаад аакккакдас кдаакдкккк дакдакакаа кадккскдда
ааадааддак дсскадаккк кдкакккккд акааакдкад ккакаааакк сдаааддккд
дсааассакк дскксккскк адскаккдкд ккддсккдск садкккссаа кдсакакскд
дакдкаддкс ксдскддсак саксдасскс ссаааддадд дсдсаксадс кссадакдкд
дасаккксас адкаадкасс ксадсасаск сасаккакад сккадксскс ккдааадаас
аддсааааак дкакаасдса кдкакааккс скадакккса сккдксккак каксдккасд
скдааакдкк даадккдкаа акксдккакк сксакадакк касасскска кдкасаксак
адккакдсас какдсасскд скдкдадккс кддаааккда ассакксадс дсаскдсаак
скдкааддкк ккдкккккак акаакакддк какаааксак дкксаасскс кдсакскаса
асаккаккка кдкдкддкак адкакакадк аакдккасад ддкдадаккк кдскакакаа
дккакдааас ккдкдкккаа скккдкааад ддааасаксс ксааасскдк ксккадкддк
касадсссад дсасакддсс дккдсаскдк акддадкакк дккдддсаск касадаасак
кккаккддаа адаскккккс акакаадкак кдкккааакк кааккдссаа скдааассск
- 46 030578
ЁасссддаЁа асаадаЁдаа ЁаасссасЁЁ дсдЁЁЁЁЁда ЁЁсаЁасЁад дсаЁЁасЁаЁ
дЁсаЁаЁдЁа ЁЁасддЁдас сдсадЁааЁа асЁЁЁдсЁсЁ ЁЁсЁЁЁЁсЁа дЁдддЁсЁда
адассасаад дссЁссЁасс аааЁдааЁдд даЁасЁдааЁ дааЁсасаЁа асдддаддса
сдссЁсЁсЁд ЁсЁааадЁЁЁ аЁдааЁЁЁЁд сасддааЁЁд ддЁддааааа сассааЁЁса
садЁдЁаЁЁа дЁсдссааса аЁддааЁддс адсадсЁаад ЁЁсаЁдсдда дЁдЁссддас
аЁдддсЁааЁ даЁасаЁЁЁд ддЁсададаа ддсдаЁЁсад ЁЁдаЁадсЁа ЁддсаасЁсс
ддаадасаЁд адааЁаааЁд сададсасаЁ ЁадааЁЁдсЁ даЁсадЁЁЁд ЁЁдаадЁасс
ЁддЁддааса аасааЁааса асЁаЁдсааа ЁдЁссаасЁс аЁадЁддадд ЁсадЁасЁдд
ЁсаЁсссЁЁд аЁдЁдсадЁЁ аЁдсасаадс ЁссЁсЁЁЁдд ЁсЁЁЁадсаЁ дасаЁддсаа
сЁЁсасЁЁЁЁ дсадаЁадса дададаасЁд дЁдЁсЁссдс сдЁЁЁддссЁ ддЁЁддддсс
аЁдсаЁсЁда дааЁссЁдаа сЁЁссадаЁд сасЁаасЁдс ааааддааЁЁ дЁЁЁЁЁсЁЁд
ддссассадс аЁсаЁсааЁд аасдсасЁад дсдасааддЁ ЁддЁЁсадсЁ сЁсаЁЁдсЁс
аадсадсадд ддЁЁсссасЁ сЁЁдсЁЁдда дЁддаЁсаса ЁдЁаадссЁс асаЁЁсЁсЁс
ЁдаЁаааЁса ЁсассЁдаЁа ЁЁЁаЁддЁдд аЁдсаЁЁаЁд ЁаассЁаЁда саЁЁЁЁЁаЁЁ
сЁаддЁддаа аЁЁссаЁЁад аасЁЁЁдЁЁЁ ддасЁсдаЁа ссЁдаддада ЁдЁаЁаддаа
адссЁдЁдЁЁ асаассдсЁд аЁдаадсадЁ ЁдсаадЁЁдЁ садаЁдаЁЁд дЁЁасссЁдс
саЁдаЁсаад дсаЁссЁддд дЁддЁддЁдд ЁааадддаЁЁ адаааддЁас аЁЁаЁЁсаЁЁ
ЁдаЁЁддасЁ дЁасасаада даЁЁдЁдЁдд дсЁдЁдаЁаЁ ЁЁЁдЁдсаса дЁдЁЁадссс
ЁаассЁЁЁЁЁ аасаЁаЁЁаа сЁсдаЁаЁсЁ сЁЁдсаддЁЁ ааЁааЁдаЁд асдаддЁдаа
адсасЁдЁЁЁ аадсаадЁас адддЁдаадЁ ЁссЁддсЁсс ссдаЁаЁЁЁа ЁсаЁдадасЁ
ЁдсаЁсЁсад дЁЁадасЁЁс ЁсЁддаадЁЁ сЁаЁЁЁЁсса адсдЁдсЁдЁ аЁсЁдддЁЁд
- 47 030578
какаккдкас дкакддаадс кккакккдск сккксккаса ддскаааакк дкаксскдка
акскдкаска акаккдкаак ккксакккаа аксссксксс сскккссккк кдкададксд
ксаксккдаа дкссадскдс кккдкдакда акакддсаак дкадсадсас кксасадксд
кдаккдсадк дкдсаасдас дасассаааа ддкакдскдс кссаааскда ааксаксаск
кккаккксдд ккскдсккка сдкдкадккк кдаксааакд дкксааскдк дкссаккккд
кккдкккака асадаккакс даддааддас садккаскдк кдскссксдк дааасадкда
аададскада дсаадсадса аддаддсккд скааддссдк дддккасдкс ддкдскдска
скдккдаака кскскасадс акддадаскд дкдаакаска ккккскддад сккаакссас
ддккдсаддк ккдккскккк ддасаскскс саддасккск аккккдккдд садксдккка
саккдккааа кддкскакак ксаддккдад сасссадкса ссдадксдак адскдаадка
аакккдсскд садсссаадк кдсадккддд акдддкакас ссскккддса даккссаддк
аакаакаака ксаккдкааа дадккксдкк кскдксссак дккскккскд кскааскакс
кссккаккса дадаксадас дкккскасдд аакддасаак ддаддаддск акдакакккд
даддааааса дсадсксксд скаскссакк сааскккдак даадкадакк сксаакддсс
даадддксак кдкдкддсад ккаддакаас садкдадаак ссадакдакд дакксаадсс
каскддкдда ааадкааадд кдддаккксс каакдккака кскакдкккс ааккасаска
сддккадкаа аскдакскда ксккдакккк ккксдкакак кксаддадак аадккккааа
адкаадссаа акдкскдддд акакккскса дккааддкаа дскдкксака дскскдккдс
адддксакск кдккккдадк кссдсадаад аккадкскдс аадаккккка кксдааккад
какксксакк ккддкккккд аскаадкакк дакссаакса асааакаккд кскскссскк
сакскдкккк садкскддкд даддсаккса кдаакккдсд дакксксадк ккддкакдка
- 48 030578
аааЕдЕаасд ЕааЕдааЕаЕ ЕссЕсЕЕЕдс ЕаЕЕсдЕасЕ даЕссЕЕаса ЕЕддааЕЕдс
ЕссЕЕЕсаЕЕ асаддасасд ЕЕЕЕЕдссЕа ЕддададасЕ адаЕсадсад сааЕаассад
саЕдЕсЕсЕЕ дсасЕаааад адаЕЕсаааЕ ЕсдЕддадаа аЕЕсаЕасаа асдЕЕдаЕЕа
сасддЕЕдаЕ сЕсЕЕдааЕд ЕаадЕаасаа ЕаасааЕЕЕд ЕЕдааЕссЕа сЕЕЕЕдаЕдЕ
даЕасаасса ЕЕЕЕасаЕсс ддсЕЕЕссЕЕ сааааЕааЕс ссаЕЕсЕдЕд дЕЕЕсЕсдЕа
ЕсЕЕЕааЕЕс аддссссада сЕЕсададаа аасасдаЕсс аЕассддЕЕд дсЕддаЕасс
адааЕадсЕа ЕдсдЕдЕЕса адсЕдададд ссЕсссЕддЕ аЕаЕЕЕсадЕ ддЕЕддадда
дсЕсЕаЕаЕд ЕаадаЕаЕда аасЕаЕдЕЕа аЕдЕЕасЕдс аасЕЕЕЕддс аадссааЕсЕ
Едааааасас ЕадЕдЕЕЕаа ЕЕдаааЕааЕ ЕдЕЕЕЕдЕдс ЕдЕадаааас ааЕаассасс
ааЕдсддада ссдЕЕЕсЕда аЕаЕдЕЕадс ЕаЕсЕсаЕса адддЕсадаЕ Ессассааад
дЕадЕдЕсЕЕ ааЕдддсЕЕа аасЕсЕдЕаЕ аЕЕдсЕЕдаа ддЕддасаЕЕ дсЕдассадЕ
дЕЕЕЕЕдЕдс адсасаЕаЕс ссЕЕдЕссаЕ ЕсаасЕаЕЕЕ сЕЕЕдааЕаЕ ададдааадс
аааЕаЕасад ЕаадЕдЕдас аЕЕссЕЕааа аааадасЕсЕ садЕЕасааЕ даааЕдаЕас
ЕЕасасЕдаЕ дсЕсаЕсЕас ассаЕдссас адаЕЕдадаЕ ЕдЕдаддадЕ ддасадддЕа
дсЕасадаЕЕ дадасЕдааЕ ддаЕсасЕЕа ЕЕдаадссаа ЕдЕасаааса ЕЕаЕдЕдаЕд
даддссЕЕЕЕ ааЕдсаддЕа ссЕЕсЕЕЕсЕ ЕЕЕасЕЕдсЕ саЕаааЕдЕд аЕаЕааЕдЕс
ЕдсЕдаааЕа дЕЕсЕдаЕЕс ЕЕЕадЕЕдЕа аЕдЕсЕссад сЕддаЕддаа аЕадссаЕдЕ
ЕаЕЕЕаЕдсЕ даадаадаад сдддЕддЕас асддсЕЕсЕЕ аЕЕдаЕддаа ааасаЕдсЕЕ
дсЕасаддЕа адааЕаЕЕсЕ дЕЕЕдЕЕЕдс ЕссЕЕЕаЕаа ЕсЕЕадЕдЕЕ ЕдаЕддЕадд
асЕЕЕаЕаЕЕ сЕЕаЕЕЕдЕд асЕЕЕЕЕада дсаЕссасаа сссааадсдс ЕЕаддЕадас
дсЕЕаааЕас аааааааЕаа аЕасЕЕаааа ададЕаааас ддаЕаададЕ ЕдсЕассЕдс
- 49 030578
аасдсссддс дсЬЬааЬсЬд аддсдсЬЬаа ЬссддЬаЬад сЬасаддссд ЬсдсЬдссЬЬ
ЬЬЬдсЬдсаа ааадаааддд ЬаадсдЬсад дсдсаЬасЬЬ ЬддсдЬсдаЬ дЬсаЬсссда
сдсЬаддаЬЬ ЬдЬдддсаЬа ассдЬсдддЬ ЬддссаддаЬ ЬЬЬсЬЬссЬа дсаЬсддадд
сЬаадсдссс сдЬЬдЬддсЬ дсЬсЬЬасЬд саЬЬсассЬс ЬЬдассаЬЬа дсасЬЬсаЬЬ
ЬЬЬЬасасЬЬ саЬсЬдЬаЬЬ дсЬЬсЬдсЬд ЬЬЬсЬсааЬЬ аЬадЬЬаЬЬс сааЬдассас
ЬсЬЬЬадЬаа ЬЬЬЬаасааЬ ЬдссааЬЬЬа ЬсаЬааЬасд дддсаааааа дЬаддсдЬсс
ЬЬаасассаЬ дЬсаЬдЬаас сЬаЬааЬаад сЬЬдЬдаЬаа ааЬсаЬЬЬдЬ даЬасааЬад
аасадЬЬдаа ЬасЬЬЬаЬда ЬЬЬсЬЬЬсЬЬ асаЬдааЬас ЬЬЬаЬдаЬЬс ЬЬдаЬдасдс
ЬдсасЬдЬаЬ ссЬаадсЬас аЬаааЬЬаса ааЬсдЬЬЬЬд садааЬдасс аЬдаЬссдЬс
ааддЬЬаЬЬа дсЬдадасас ссЬдсааасЬ ЬсЬЬсдЬЬЬс ЬЬдаЬЬдссд аЬддЬдсЬса
ЬдЬЬдаЬдсЬ даЬдЬассаЬ асдсддаадЬ ЬдаддЬЬаЬд аадаЬдЬдса ЬдссссЬсЬЬ
дЬсдссЬдсЬ дсЬддЬдЬса ЬЬааЬдЬЬЬЬ дЬЬдЬсЬдад ддссаддсда ЬдсаддЬЬаЬ
аЬЬасЬдссс ЬЬЬЬдЬЬдсЬ ЬсЬдсЬдЬЬа ааадссаЬЬд саЬдсдаадс аЬсЬдаасЬЬ
ааЬаЬаЬЬЬЬ дЬЬЬсаддсЬ ддЬдаЬсЬЬа ЬадсдадасЬ ЬдаЬсЬсдаЬ дасссЬЬсЬд
сЬдЬдаадад адссдадсса ЬЬЬдааддаЬ сЬЬЬЬссада ааЬдадссЬЬ ссЬаЬЬдсЬд
сЬЬсЬддсса адЬЬсасааа адаЬдЬдсЬд саадЬЬЬдаа сдсЬдсЬсда аЬддЬссЬЬд
саддаЬаЬда ссаЬдсддсс аасааадЬаа асаЬсаадас аЬЬЬЬаЬсЬс аЬдЬЬЬссЬд
сЬЬЬЬсЬсаа аЬассаЬЬсЬ ЬЬааЬадЬаЬ дааЬЬсЬдда ЬЬаЬЬсЬдас ЬЬаЬЬддсаЬ
ЬЬЬсЬдссЬЬ ЬЬдсЬассаа аЬддЬЬЬсЬа аЬсЬаЬадаа дЬЬсЬЬдадс ЬЬдЬсЬЬЬдс
аааЬсЬЬдаЬ ЬЬааЬдсЬЬЬ ЬсЬЬдЬаЬдЬ ЬсаЬсаЬасЬ саЬЬЬаЬдаЬ аддЬЬдсаЬЬ
ЬаЬссЬЬсЬд сЬаЬЬЬЬссЬ ЬЬсЬсЬсадЬ аааЬсаЬдаЬ ддаЬдсЬсЬЬ ЬсЬдЬЬаЬдЬ
- 50 030578
ЕсаЕсаЕдсЕ дЕсЕаЕЕаЕс сЕЕдЕдсЕаЕ ЕЕЕЕсЕаЕЕЕ ссадЕадЕдд аЕдЕаЕЕддЕ
ЕЕааЕааЕЕс сЕдаЕсааас ЕЕЕдЕаЕЕЕЕ дЕЕдЕЕаЕЕЕ аЕасЕЕддсЕ сссЕЕЕЕсад
дЕЕдЕдсаад аЕЕЕддЕаЕд дЕдссЕЕдаЕ асассЕдсЕс ЕЕссЕЕЕссЕ асааЕдддаа
дадсЕЕаЕдЕ сЕдЕЕЕЕадс аасЕадасЕЕ ссаадасдЕс ЕЕаададсда ддЕаЕдЕдаЕ
ааЕЕдаЕаЕд аЕаЕдсадаа ЕсаддсаЕаа адддасаЕЕд аЕасаЕЕЕаа ЕЕЕаЕдаЕаЕ
адаадддЕсЕ ЕсаЕссЕсда ЕЕаааадаЕс ааЕЕсасЕЕа ЕсаЕдаЕЕЕа саЕЕсЕасаЕ
ЕдЕЕдааЕса ссЕЕддЕааЕ ЕЕдссдЕаас ЕЕаЕЕдддса асЕаЕЕадсЕ ЕЕЕсЕааЕаа
сдЕааЕсааа аЕЕсадааЕа ЕЕЕЕасЕЕса аЕЕсЕЕсдЕа асаЕддааса ЕЕЕддЕасЕЕ
сдЕсЕсаЕЕЕ аЕЕЕдсасЕд ЕасдсЕдЕЕЕ ЕадЕЕддЕЕЕ дссаЕЕсЕаа сЕдааЕсЕЕЕ
ааадЕЕсЕЕа сЕЕаЕЕЕддЕ ЕЕЕаасссад аЕсЕЕдЕЕЕа ЕЕЕаЕсЕЕЕЕ аЕаасЕЕЕсЕ
ЕаЕдЕЕсЕдс сЕсаасддЕЕ ЕаЕасЕЕЕЕЕ аЕдсаЕссад ЕЕддадддса ааЕасааЕда
аЕасаадЕЕа ааЕдЕЕдасс аЕдЕдаадаЕ сааддаЕЕЕс ссЕассдада ЕдсЕЕадада
дасааЕсдад дЕсадЕЕЕЕЕ дЕЕЕсЕЕаЕд дсассссадЕ сЕаааЕЕаЕа сЕаЕЕЕЕЕЕд
ЕаасаадЕЕЕ ЕсЕЕЕЕадда аааЕсЕЕдса ЕдЕдЕЕЕссд адааддаааЕ ддЕдасааЕЕ
дададдсЕЕд ЕЕдасссЕсЕ даЕдадссЕд сЕдаадЕсаЕ асдадддЕдд дададааадс
саЕдсссасЕ ЕЕаЕЕдЕсаа дЕсссЕЕЕЕЕ даддадЕаЕс ЕсЕсддЕЕда ддаасЕаЕЕс
адЕдаЕддса ЕЕсаддЕЕаЕ сЕаасасЕЕс ЕааасЕдадс адаЕсЕасЕа дадЕсаЕЕЕЕ
сЕаадддЕса ЕааЕЕЕЕсса даассЕсЕЕд ддЕдаЕЕаад ЕадсаааааЕ ааЕЕЕдЕаса
сдасЕЕасда сЕЕдсЕЕссЕ ЕсдааасасЕ ЕЕЕсасЕсаЕ ЕаЕЕЕЕссЕс ааааЕдЕдсс
аЕЕЕЕдЕадЕ сЕдасдЕдаЕ ЕдаасдссЕд сдссЕасааЕ аЕадЕааада ссЕссадаад
дЕЕдЕадаса ЕЕдЕЕЕЕдЕс ЕсассаддЕа аасЕасЕЕЕЕ ЕддссЕааЕд асЕЕддЕдса
- 51 030578
аакдаксаса дааасаакск ккдккаскда кадкккдакк кдккскаддд кдкдадааас
аааасааадс кдакасксдс дсксакддад аааскддкск акссааассс кдскдсскас
ададаксадк кдакксдскк кксккссскс аассакаааа дакаккакаа ддкдасаакд
дсдасскааа дкаакддаад скккккдакк аакккдккдк дакаккккад дскаакдаак
касккксакк дкааккакдс адккддскск кааадскадк дааскксккд аасааассаа
дсксадсдаа скссдсасаа дсаккдсаад даасскккса дсдскддака кдкксассда
ддааааддса даккксксск кдсаадасад ааааккддсс аккаакдада дсакдддада
кккадксаск дссссаскдс садккдаада кдсасккдкк кскккдкккд аккдкаскда
ксаааскскк садсададад кдаккдадас акасакакск сдаккакасс аддкаккаса
кдадскаккк ккккскддак кккаккакас ксксксксад сакккскдда адсакаааск
ааддкксска акдааакаад акасксадкд ккксаккаад акаааксска дакаакскад
дсдкдддаад акккдаккка даасккдкад дсакдккаск дскскдкаад ккддскааск
кдссаакдак акккксадсс ксаасккдкд ааддакадса кссадскдаа акаксаддак
кскддкдкка ккдскккакд ддаакксаск дааддааакс акдадаадад аккдддкдск
акддккаксс кдаадксаск адаакскдкд ксаасадсса ккддадскдс кскаааддак
дсаксасакк акдсаадскс кдсдддсаас асддкдсака ккдскккдкк ддакдскдак
асссааскда акасааскда адакаддкак дкксакдкдс адкаккадкд садакдадкк
какккддкдс ааааакаадк каакскаккк сккксадкдд кдакаакдас саадсксаад
асаадакдда каааскккск кккдкаскда аасаадакдк кдксакддск дакскасдкд
скдскдакдк сааддккдкк адккдсаккд кксааадада кддадсаакс акдсскакдс
дссдкасскк ссксккдкса даддааааас кккдккасда ддаададссд аккскксддс
- 52 030578
аЕдЕддадсс ЕссасЕЕЕсЕ дсасЕЕсЕЕд адЕЕддЕаЕд саасЕссаЕс ааасЕдасЕа
сдЕдсЕдЕЕЕ ЕдаЕаЕаЕЕЕ ЕааЕдсЕЕЕс аЕЕЕЕдЕЕаЕ ЕЕдсЕасЕЕд ЕаЕЕсасЕЕа
дсЕЕдсЕдЕд даЕасаддаЕ аааЕЕдааад ЕдаааддаЕа сааЕдадаЕд аадЕаЕасас
сдЕсасдЕда ЕсдЕсадЕдд саЕаЕаЕаса сасЕЕадааа ЕасЕдааааЕ ссаааааЕдс
ЕдсасадддЕ аЕЕЕЕЕссда асасЕЕдЕса дасаасссад Едсаддсаас аддЕЕЕасаЕ
садассаЕаЕ сасЕдаЕдЕЕ даадЕаддас аЕдсададда ассЕсЕЕЕса ЕЕЕасЕЕсаа
дсадсаЕаЕЕ ааааЕсдЕЕд аЕдаЕЕдсЕа аадаадааЕЕ ддадсЕЕсас дсдаЕсадда
сЕддссаЕЕс ЕсаЕаЕдЕас ЕЕдЕдсаЕаЕ Едааададса ааадсЕЕсЕЕ дассЕЕдЕЕс
сЕдЕЕЕсадд дЕаадссЕдс асаЕсдЕЕсЕ ЕЕЕЕдсадаа саЕдЕаЕЕсс ЕЕдсЕсЕЕдЕ
дЕЕсЕдссЕЕ сЕсааЕдадс ЕЕЕЕсаЕсдЕ асЕсаддаас асЕдЕЕдЕдд аЕдЕЕддЕса
адаЕдаадсЕ асЕдсаЕдсЕ сЕсЕЕЕЕдаа адаааЕддсЕ ЕЕааадаЕас аЕдаасЕЕдЕ
ЕддЕдсаада аЕдсаЕсаЕс ЕЕЕсЕдЕаЕд ссадЕдддаа дЕдааасЕЕа адЕЕддЕдад
сдаЕдддссЕ дссадЕддЕа дсЕддададЕ ЕдЕаасаасс ааЕдЕЕасЕд дЕсасассЕд
сасЕдЕддаЕ дЕдадЕЕЕЕа ЕсЕссЕЕдсЕ ЕссЕдЕЕЕЕЕ сЕдсаЕддаа сЕааЕдааас
ЕдаадЕдаас аЕаЕЕаЕаЕа ЕдЕдасаЕас аЕаддасЕаЕ саЕсЕЕЕдаЕ ЕаЕсаЕаааа
ааадаасЕаЕ саЕсЕЕсдЕЕ ЕсдЕЕЕдЕЕд ЕсаЕЕЕссас сЕсаЕЕЕЕЕд дЕсЕдааЕсЕ
саЕддЕдсЕЕ ЕЕааЕдсЕЕЕ ЕадаЕсЕасс дддаддЕсда адаЕасадаа Есасадааас
ЕадЕаЕасса сЕссассдса ЕЕдЕсаЕсЕд дЕссЕЕЕдса ЕддЕдЕЕдса сЕдааЕасЕЕ
сдЕаЕсаасс ЕЕЕдадЕдЕЕ аЕЕдаЕЕЕаа аасдЕЕдсЕс Едссаддаас аасаааасЕа
саЕасЕдсЕа ЕдаЕЕЕЕсса ЕЕддЕЕадЕа ЕсЕаЕсЕсЕа ЕаЕдЕаЕЕаЕ дЕЕадсаддЕ
ЕсЕЕаЕЕддЕ аЕЕасаЕдЕс сЕаааЕсЕда саасаасЕса аааЕдЕадас аЕЕЕдаадсЕ
- 53 030578
дсадЕдсада адЕсдЕддЕс ЕаасаЕЕЕсс адЕдааааса ассааЕдЕЕа ЕдЕЕааадсд
асададсЕЕд ЕдЕЕЕдсЕда ааадааЕддд ЕсдЕддддса сЕссЕаЕааЕ ЕссЕаЕдсад
сдЕдсЕдсЕд ддсЕдааЕда саЕЕддЕаЕд дЕадссЕдда ЕсЕЕддасаЕ дЕссасЕссЕ
дааЕЕЕссса дсддсадаса даЕсаЕЕдЕЕ аЕсдсаааЕд аЕаЕЕасаЕЕ ЕададсЕдда
ЕсаЕЕЕддсс саадддаада ЕдсаЕЕЕЕЕс даадсЕдЕаа ссаассЕддс ЕЕдЕдадаад
аадсЕЕссас ЕЕаЕсЕасЕЕ ддсЕдсааас ЕсЕддЕдсЕс ддаЕЕддсаЕ ЕдсЕдаЕдаа
дЕааааЕсЕЕ дсЕЕссдЕдЕ ЕддаЕддасЕ даЕдаЕадса дсссЕдаасд ЕддаЕЕЕадд
ЕасаЕЕЕаЕа ЕдасЕдасда адассаЕдаЕ сдЕаЕЕддсЕ сЕЕсадЕЕаЕ адсасасаад
аЕдсадсЕад аЕадЕддсда даЕсаддЕдд дЕЕаЕсдаЕЕ сЕдЕЕдЕддд аааададдаЕ
ддасЕаддЕд ЕддадаасаЕ асаЕддаадЕ дсЕдсЕаЕЕд ссадЕдссЕа ЕЕсЕадддсд
Еасдаддада саЕЕЕасасЕ ЕасаЕЕсдЕЕ асЕддасдаа сЕдЕЕддааЕ сддадссЕаЕ
сЕЕдсЕсдас ЕЕддсаЕасд дЕдсаЕасад сдЕаЕЕдасс адсссаЕЕаЕ ЕЕЕдасЕддд
ЕЕЕЕсЕдссс ЕдаасаадсЕ ЕсЕЕдддсдд даддЕдЕаса дсЕсссасаЕ дсадЕЕдддЕ
ддЕсссаааа ЕсаЕддсдас дааЕддЕдЕЕ дЕссаЕсЕда сЕдЕЕссада ЕдассЕЕдаа
ддЕдЕЕЕсЕа аЕаЕаЕЕдад дЕддсЕсадс ЕаЕдЕЕссЕд сааасаЕЕдд ЕддассЕсЕЕ
ссЕаЕЕасаа ааЕсЕЕЕдда сссааЕадас адасссдЕЕд саЕасаЕссс ЕдадааЕаса
ЕдЕдаЕссЕс дЕдсадссаЕ садЕддсаЕЕ даЕдасадсс аадддаааЕд дЕЕдддЕддс
аЕдЕЕЕдаса аадасадЕЕЕ ЕдЕддадаса ЕЕЕдааддаЕ дддсдаадас адЕадЕЕасЕ
ддсададсаа аасЕЕддадд даЕЕссЕдЕЕ ддЕдЕЕаЕад сЕдЕддадас асадассаЕд
аЕдсадсЕсд ЕссссдсЕда Ессаддссад ссЕдаЕЕссс асдадсддЕс ЕдЕЕссЕсдЕ
дсЕдддсаад ЕЕЕддЕЕЕсс адаЕЕсЕдсЕ ассаадасад сдсаддсдаЕ дЕЕддасЕЕс
- 54 030578
аассдЁдаад даЁЁассЁсЁ дЁЁсаЁасЁЁ дсЁаасЁдда даддсЁЁсЁс Ёддадддсаа
ададаЁсЁЁЁ ЁЁдааддааа ЁсЁдсаддсЁ дддЁсаасаа ЁЁдЁЁдадаа ссЁЁаддаса
ЁасааЁсадс сЁдссЁЁЁдЁ аЁаЁаЁсссс ааддсЁдсад адсЁасдЁдд аддадссЁдд
дЁсдЁдаЁЁд аЁадсаадаЁ ааасссадаЁ сдсаЁсдадЁ дсЁаЁдсЁда даддасЁдса
аадддЁааЁд ЁЁсЁсдаасс ЁсаадддЁЁд аЁЁдадаЁса адЁЁсаддЁс ададдаасЁс
ааадааЁдса ЁдддЁаддсЁ ЁдаЁссадаа ЁЁдаЁадаЁс Ёдааадсаад асЁссаддда
дсаааЁддаа дссЁаЁсЁда ЁддадааЁсс сЁЁсадаада дсаЁадаадс Ёсддаадааа
садЁЁдсЁдс сЁсЁдЁасас ссаааЁсдсд дЁасдЁЁЁЁд сддааЁЁдса сдасасЁЁсс
сЁЁадааЁдд сЁдсЁааадд ЁдЁдаЁсадд ааадЁЁдЁад асЁдддаада сЁсЁсддЁсЁ
ЁЁсЁЁсЁаса ададаЁЁасд даддаддсЁа Ёссдаддасд ЁЁсЁддсааа ддадаЁЁада
ддЁдЁааЁЁд дЁдадаадЁЁ ЁссЁсасааа ЁсадсдаЁсд адсЁдаЁсаа даааЁддЁас
ЁЁддсЁЁсЁд аддсадсЁдс адсаддаадс ассдасЁддд аЁдаЁдасда ЁдсЁЁЁЁдЁс
дссЁддаддд адаасссЁда ааасЁаЁаад дааЁаЁаЁса аададсЁЁад ддсЁсааадд
дЁаЁсЁсддЁ ЁдсЁсЁсада ЁдЁЁдсаддс ЁссадЁЁсдд аЁЁЁасаадс сЁЁдссдсад
ддЁсЁЁЁсса ЁдсЁасЁада ЁааддЁасдс аЁасЁЁасад ЁЁЁЁассЁдс аЁсЁдЁЁЁаЁ
ЁЁдсаадЁаЁ ЁЁЁаЁсдадд ЁЁдадЁаЁдЁ ссЁдсЁаЁсЁ ЁаЁЁсаааЁа ЁадЁаЁсЁЁа
ссаааЁааЁа ЁсЁаадасдс ЁддаЁасЁЁЁ дЁЁсадаЁдд аЁсссЁсЁаа дададсасад
ЁЁЁаЁсдадд аддЁсаЁдаа ддЁссЁдааа ЁдаЁсаааЁд аЁассаасас аЁссааЁаса
дЁаЁдЁдсаЁ даЁаЁсЁдЁЁ ЁсЁсЁЁдаад ЁасаЁаЁаЁа даЁддаЁаса аддсддсЁдЁ
аасЁдаЁддЁ адсЁааЁсЁд ддссаассаЁ ЁасЁЁЁЁдЁд аасЁЁдсЁдд ЁддЁсЁЁЁаЁ
ЁаЁЁсааддс асадсЁсдсс ЁЁсддасссс сЁс
- 55 030578 <210> 14 <211> 2320 <212> РКТ <213> А1оресигиз туозиго1Эез НиЭз <400> 14
МеЕ 1 О1у Зег ТЬг Н1з 5 Ьеи Рго 11е Уа1 О1у 10 РЬе Азп А1а Зег ТЬг 15 ТЬг
Рго Зег Ьеи Зег ТЬг Ьеи Агд О1п 11е Азп Зег А1а А1а А1а А1а РЬе
20 25 30
О1п Зег Зег Зег Рго Зег Агд Зег Зег Ьуз Ьуз Ьуз Зег Агд Агд Уа1
35 40 45
Ьуз Зег 11е Агд Азр Азр О1у Азр О1у Зег Уа1 Рго Азр Рго А1а О1у
50 55 60
Н1з О1у О1п Зег 11е Агд О1п О1у Ьеи А1а О1у 11е 11е Азр Ьеи Рго
65 70 75 80
Ьуз О1и О1у А1а Зег А1а Рго Азр Уа1 Азр 11е Зег Н1з О1у Зег О1и
85 90 95
Азр Н1з Ьуз А1а Зег Туг О1п МеЕ Азп О1у 11е Ьеи Азп О1и Зег Н1з
100 105 110
Азп О1у Агд Н1з А1а Зег Ьеи Зег Ьуз Уа1 Туг О1и РЬе Суз ТЬг О1и
115 120 125
Ьеи О1у О1у Ьуз ТЬг Рго 11е Н1з Зег Уа1 Ьеи Уа1 А1а Азп Азп О1у
130 135 140
МеЕ А1а А1а А1а Ьуз РЬе МеЕ Агд Зег Уа1 Агд ТЬг Тгр А1а Азп Азр
145 150 155 160
ТЬг РЬе О1у Зег О1и Ьуз А1а 11е О1п Ьеи 11е А1а МеЕ А1а ТЬг Рго
165 170 175
О1и Азр МеЕ Агд 11е Азп А1а О1и Н1з 11е Агд 11е А1а Азр О1п РЬе
180 185 190
Уа1 О1и Уа1 Рго О1у О1у ТЬг Азп Азп Азп Азп Туг А1а Азп Уа1 О1п
195 200 205
Ьеи 11е Уа1 О1и 11е А1а О1и Агд ТЬг О1у Уа1 Зег А1а Уа1 Тгр Рго
210 215 220
- 56 030578
О1у 225 Тгр О1у Ηιβ А1а Зег О1и Азп 230 Рго О1и Ьеи 235 Рго Азр А1а Ьеи ТЬг 240
А1а Ьуз О1у 11е Уа1 РЬе Ьеи О1у Рго Рго А1а Зег Зег МеЬ Азп А1а
245 250 255
Ьеи О1у Азр Ьуз Уа1 О1у Зег А1а Ьеи 11е А1а О1п А1а А1а О1у Уа1
260 265 270
Рго ТЬг Ьеи А1а Тгр Зег О1у Зег Ηίβ Уа1 О1и 11е Рго Ьеи О1и Ьеи
275 280 285
Суз Ьеи Азр Зег 11е Рго О1и О1и МеЬ Туг Агд Ьуз А1а Суз Уа1 ТЬг
290 295 300
ТЬг А1а Азр О1и А1а Уа1 А1а Зег Суз О1п МеЬ 11е О1у Туг Рго А1а
305 310 315 320
МеЬ 11е Ьуз А1а Зег Тгр О1у О1у О1у О1у Ьуз О1у 11е Агд Ьуз Уа1
325 330 335
Азп Азп Азр Азр О1и Уа1 Ьуз А1а Ьеи РЬе Ьуз О1п Уа1 О1п О1у О1и
340 345 350
Уа1 Рго О1у Зег Рго 11е РЬе 11е МеЬ Агд Ьеи А1а Зег О1п Зег Агд
355 360 365
Η18 Ьеи О1и Уа1 О1п Ьеи Ьеи Суз Азр О1и Туг О1у Азп Уа1 А1а А1а
370 375 380
Ьеи Ηί.8 Зег Агд Азр Суз Зег Уа1 О1п Агд Агд Ηίβ О1п Ьуз 11е 11е
385 390 395 400
О1и О1и О1у Рго Уа1 ТЬг Уа1 А1а Рго Агд О1и ТЬг Уа1 Ьуз О1и Ьеи
405 410 415
О1и О1п А1а А1а Агд Агд Ьеи А1а Ьуз А1а Уа1 О1у Туг Уа1 О1у А1а
420 425 430
А1а ТЬг Уа1 О1и Туг Ьеи Туг Зег МеЬ О1и ТЬг О1у О1и Туг Туг РЬе
435 440 445
Ьеи О1и Ьеи Азп Рго Агд Ьеи О1п Уа1 О1и Ηίβ Рго Уа1 ТЬг О1и Зег
450 455 460
11е А1а О1и Уа1 Азп Ьеи Рго А1а А1а О1п Уа1 А1а Уа1 О1у МеЬ О1у
- 57 030578
465 470 475 480
11е Рго Ьеи Тгр О1п 485 11е Рго О1и 11е Агд 490 Агд РЬе Туг О1у МеЬ 495 Азр
Азп О1у О1у О1у Туг Азр 11е Тгр Агд Ьуз ТЬг А1а А1а Ьеи А1а ТЬг
500 505 510
Рго РЬе Азп РЬе Азр О1и Уа1 Азр Зег О1п Тгр Рго Ьуз О1у Нтз Суз
515 520 525
Уа1 А1а Уа1 Агд 11е ТЬг Зег О1и Азп Рго Азр Азр О1у РЬе Ьуз Рго
530 535 540
ТЬг О1у О1у Ьуз Уа1 Ьуз О1и 11е Зег РЬе Ьуз Зег Ьуз Рго Азп Уа1
545 550 555 560
Тгр О1у Туг РЬе Зег Уа1 Ьуз Зег О1у О1у О1у 11е Нтз О1и РЬе А1а
565 570 575
Азр Зег О1п РЬе О1у Нтз Уа1 РЬе А1а Туг О1у О1и ТЬг Агд Зег А1а
580 585 590
А1а 11е ТЬг Зег МеЬ Зег Ьеи А1а Ьеи Ьуз О1и 11е О1п 11е Агд О1у
595 600 605
О1и 11е Нтз ТЬг Азп Уа1 Азр Туг ТЬг Уа1 Азр Ьеи Ьеи Азп А1а Рго
610 615 620
Азр РЬе Агд О1и Азп ТЬг 11е Нтз ТЬг О1у Тгр Ьеи Азр ТЬг Агд 11е
625 630 635 640
А1а МеЬ Агд Уа1 О1п А1а О1и Агд Рго Рго Тгр Туг 11е Зег Уа1 Уа1
645 650 655
О1у О1у А1а Ьеи Туг Ьуз ТЬг 11е ТЬг ТЬг Азп А1а О1и ТЬг Уа1 Зег
660 665 670
О1и Туг Уа1 Зег Туг Ьеи 11е Ьуз О1у О1п 11е Рго Рго Ьуз Нтз 11е
675 680 685
Зег Ьеи Уа1 Нтз Зег ТЬг 11е Зег Ьеи Азп 11е О1и О1и Зег Ьуз Туг
690 695 700
ТЬг 11е О1и 11е Уа1 Агд Зег О1у О1п О1у Зег Туг Агд Ьеи Агд Ьеи 705 710 715 720
- 58 030578
Азп О1у Зег Ьеи 11е 725 О1и А1а Азп Уа1 О1п 730 ТЬг Ьеи Суз Азр О1у 735 О1у
Ьеи Ьеи МеЕ О1п Ьеи Азр О1у Азп Зег Н1з Уа1 11е Туг А1а О1и О1и
740 745 750
О1и А1а О1у О1у ТЬг Агд Ьеи Ьеи 11е Азр О1у Ьуз ТЬг Суз Ьеи Ьеи
755 760 765
О1п Азп Азр Н1з Азр Рго Зег Агд Ьеи Ьеи А1а О1и ТЬг Рго Суз Ьуз
770 775 780
Ьеи Ьеи Агд РЬе Ьеи 11е А1а Азр О1у А1а Н1з Уа1 Азр А1а Азр Уа1
785 790 795 800
Рго Туг А1а О1и Уа1 О1и Уа1 МеЕ Ьуз МеЕ Суз МеЕ Рго Ьеи Ьеи Зег
805 810 815
Рго А1а А1а О1у Уа1 11е Азп Уа1 Ьеи Ьеи Зег О1и О1у О1п А1а МеЕ
820 825 830
О1п А1а О1у Азр Ьеи 11е А1а Агд Ьеи Азр Ьеи Азр Азр Рго Зег А1а
835 840 845
Уа1 Ьуз Агд А1а О1и Рго РЬе О1и О1у Зег РЬе Рго О1и МеЕ Зег Ьеи
850 855 860
Рго 11е А1а А1а Зег О1у О1п Уа1 Н1з Ьуз Агд Суз А1а А1а Зег Ьеи
865 870 875 880
Азп А1а А1а Агд МеЕ Уа1 Ьеи А1а О1у Туг Азр Н1з А1а А1а Азп Ьуз
885 890 895
Уа1 Уа1 О1п Азр Ьеи Уа1 Тгр Суз Ьеи Азр ТЬг Рго А1а Ьеи Рго РЬе
900 905 910
Ьеи О1п Тгр О1и О1и Ьеи МеЕ Зег Уа1 Ьеи А1а ТЬг Агд Ьеи Рго Агд
915 920 925
Агд Ьеи Ьуз Зег О1и Ьеи О1и О1у Ьуз Туг Азп О1и Туг Ьуз Ьеи Азп
930 935 940
Уа1 Азр Н1з Уа1 Ьуз 11е Ьуз Азр РЬе Рго ТЬг О1и МеЕ Ьеи Агд О1и
945 950 955 960
ТЬг 11е О1и О1и Азп Ьеи А1а Суз Уа1 Зег О1и Ьуз О1и МеЕ Уа1 ТЬг
965 970 975
- 59 030578
11е О1и Агд Ьеи Уа1 Азр Рго Ьеи МеЕ Зег Ьеи Ьеи Ьуз Зег Туг О1и 980 985 990
О1у О1у Агд О1и Зег Н1з А1а Н1з РЬе 11е Уа1 Ьуз Зег Ьеи РЬе О1и 995 1000 1005
О1и Туг 1010 Ьеи Зег Уа1 О1и О1и 1015 Ьеи РЬе Зег Азр О1у 1020 11е О1п Зег
Азр Уа1 11е О1и Агд Ьеи Агд Ьеи О1п Туг Зег Ьуз Азр Ьеи О1п
1025 1030 1035
Ьуз Уа1 Уа1 Азр 11е Уа1 Ьеи Зег Н1з О1п О1у Уа1 Агд Азп Ьуз
1040 1045 1050
ТЬг Ьуз Ьеи 11е Ьеи А1а Ьеи МеЕ О1и Ьуз Ьеи Уа1 Туг Рго Азп
1055 1060 1065
Рго А1а А1а Туг Агд Азр О1п Ьеи 11е Агд РЬе Зег Зег Ьеи Азп
1070 1075 1080
Н1з Ьуз Агд Туг Туг Ьуз Ьеи А1а Ьеи Ьуз А1а Зег О1и Ьеи Ьеи
1085 1090 1095
О1и О1п ТЬг Ьуз Ьеи Зег О1и Ьеи Агд ТЬг Зег 11е А1а Агд Азп
1100 1105 1110
Ьеи Зег А1а Ьеи Азр МеЕ РЬе ТЬг О1и О1и Ьуз А1а Азр РЬе Зег
1115 1120 1125
Ьеи О1п Азр Агд Ьуз Ьеи А1а 11е Азп О1и Зег МеЕ О1у Азр Ьеи
1130 1135 1140
Уа1 ТЬг А1а Рго Ьеи Рго Уа1 О1и Азр А1а Ьеи Уа1 Зег Ьеи РЬе
1145 1150 1155
Азр Суз ТЬг Азр О1п ТЬг Ьеи О1п О1п Агд Уа1 11е О1и ТЬг Туг
1160 1165 1170
11е Зег Агд Ьеи Туг О1п Рго О1п Ьеи Уа1 Ьуз Азр Зег 11е О1п
1175 1180 1185
Ьеи Ьуз Туг О1п Азр Зег О1у Уа1 11е А1а Ьеи Тгр О1и РЬе ТЬг
1190 1195 1200
О1и О1у Азп Нтз О1и Ьуз Агд Ьеи О1у А1а МеЕ Уа1 11е Ьеи Ьуз
1205 1210 1215
- 60 030578
Зег ^еи 1220 О1и Зег Уа1 Зег ТЬг 1225 А1а 11е О1у А1а А1а 1230 ^еи ^уз Азр
А1а Зег Ньз Туг А1а Зег Зег А1а О1у Азп ТЬг Уа1 Ньз 11е А1а
1235 1240 1245
^еи ^еи Азр А1а Азр ТЬг О1п ^еи Азп ТЬг ТЬг О1и Азр Зег О1у
1250 1255 1260
Азр Азп Азр О1п А1а О1п Азр ^уз МеЕ Азр ^уз ^еи Зег РЬе Уа1
1265 1270 1275
^еи ^уз О1п Азр Уа1 Уа1 МеЕ А1а Азр ^еи Агд А1а А1а Азр Уа1
1280 1285 1290
^уз Уа1 Уа1 Зег Суз 11е Уа1 О1п Агд Азр О1у А1а 11е МеЕ Рго
1295 1300 1305
МеЕ Агд Агд ТЬг РЬе ^еи ^еи Зег О1и О1и ^уз ^еи Суз Туг О1и
1310 1315 1320
О1и О1и Рго 11е ^еи Агд Ньз Уа1 О1и Рго Рго ^еи Зег А1а ^еи
1325 1330 1335
^еи О1и ^еи Азр ^уз ^еи ^уз Уа1 ^уз О1у Туг Азп О1и МеЕ ^уз
1340 1345 1350
Туг ТЬг Рго Зег Агд Азр Агд О1п Тгр Ньз 11е Туг ТЬг ^еи Агд
1355 1360 1365
Азп ТЬг О1и Азп Рго ^уз МеЕ ^еи Ньз Агд Уа1 РЬе РЬе Агд ТЬг
1370 1375 1380
^еи Уа1 Агд О1п Рго Зег А1а О1у Азп Агд РЬе ТЬг Зег Азр Ньз
1385 1390 1395
11е ТЬг Азр Уа1 О1и Уа1 О1у Ньз А1а О1и О1и Рго ^еи Зег РЬе
1400 1405 1410
ТЬг Зег Зег Зег 11е ^еи ^уз Зег ^еи МеЕ 11е А1а ^уз О1и О1и
1415 1420 1425
^еи О1и ^еи Ньз А1а 11е Агд ТЬг О1у Ньз Зег Ньз МеЕ Туг ^еи
1430 1435 1440
Суз 11е ^еи ^уз О1и О1п ^уз ^еи ^еи Азр ^еи Уа1 Рго Уа1 Зег
- 61 030578
1445 1450 1455
О1у Азп 1460 ТЬг Уа1 Уа1 Азр Уа1 1465 О1у О1п Азр О1и А1а 1470 ТЬг А1а Суз
Зег ^еи ^еи ^уз О1и МеЕ А1а ^еи ^уз 11е Н1з О1и ^еи Уа1 О1у
1475 1480 1485
А1а Агд МеЕ Н1з Н1з ^еи Зег Уа1 Суз О1п Тгр О1и Уа1 ^уз ^еи
1490 1495 1500
^уз ^еи Уа1 Зег Азр О1у Рго А1а Зег О1у Зег Тгр Агд Уа1 Уа1
1505 1510 1515
ТЬг ТЬг Азп Уа1 ТЬг О1у Н1з ТЬг Суз ТЬг Уа1 Азр 11е Туг Агд
1520 1525 1530
О1и Уа1 О1и Азр ТЬг О1и Зег О1п ^уз ^еи Уа1 Туг Н1з Зег ТЬг
1535 1540 1545
А1а ^еи Зег Зег О1у Рго ^еи Н1з О1у Уа1 А1а ^еи Азп ТЬг Зег
1550 1555 1560
Туг О1п Рго ^еи Зег Уа1 11е Азр ^еи ^уз Агд Суз Зег А1а Агд
1565 1570 1575
Азп Азп ^уз ТЬг ТЬг Туг Суз Туг Азр РЬе Рго ^еи ТЬг РЬе О1и
1580 1585 1590
А1а А1а Уа1 О1п ^уз Зег Тгр Зег Азп 11е Зег Зег О1и Азп Азп
1595 1600 1605
О1п Суз Туг Уа1 ^уз А1а ТЬг О1и ^еи Уа1 РЬе А1а О1и ^уз Азп
1610 1615 1620
О1у Зег Тгр О1у ТЬг Рго 11е 11е Рго МеЕ О1п Агд А1а А1а О1у
1625 1630 1635
^еи Азп Азр 11е О1у МеЕ Уа1 А1а Тгр 11е ^еи Азр МеЕ Зег ТЬг
1640 1645 1650
Рго О1и РЬе Рго Зег О1у Агд О1п 11е 11е Уа1 11е А1а Азп Азр
1655 1660 1665
11е ТЬг РЬе Агд А1а О1у Зег РЬе О1у Рго Агд О1и Азр А1а РЬе
1670 1675 1680
- 62 030578
РЬе О1и 1685 А1а Уа1 ТЬг Азп Ьеи 1690 А1а Суз О1и Ьуз Ьуз 1695 Ьеи Рго Ьеи
11е Туг Ьеи А1а А1а Азп Зег О1у А1а Агд 11е О1у 11е А1а Азр
1700 1705 1710
О1и Уа1 Ьуз Зег Суз РЬе Агд Уа1 О1у Тгр ТЬг Азр Азр Зег Зег
1715 1720 1725
Рго О1и Агд О1у РЬе Агд Туг 11е Туг Мек ТЬг Азр О1и Азр ΗΪ8
1730 1735 1740
Азр Агд 11е О1у Зег Зег Уа1 11е А1а ΗΪ8 Ьуз Мек О1п Ьеи Азр
1745 1750 1755
Зег О1у О1и 11е Агд Тгр Уа1 11е Азр Зег Уа1 Уа1 О1у Ьуз О1и
1760 1765 1770
Азр О1у Ьеи О1у Уа1 О1и Азп 11е ΗΪ8 О1у Зег А1а А1а 11е А1а
1775 1780 1785
Зег А1а Туг Зег Агд А1а Туг О1и О1и ТЬг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг РЬе
1790 1795 1800
Уа1 ТЬг О1у Агд ТЬг Уа1 О1у 11е О1у А1а Туг Ьеи А1а Агд Ьеи
1805 1810 1815
О1у 11е Агд Суз 11е О1п Агд 11е Азр О1п Рго 11е 11е Ьеи ТЬг
1820 1825 1830
О1у РЬе Зег А1а Ьеи Азп Ьуз Ьеи Ьеи О1у Агд О1и Уа1 Туг Зег
1835 1840 1845
Зег Ηΐ3 Мек О1п Ьеи О1у О1у Рго Ьуз 11е Мек А1а ТЬг Азп О1у
1850 1855 1860
Уа1 Уа1 Ηΐ3 Ьеи ТЬг Уа1 Рго Азр Азр Ьеи О1и О1у Уа1 Зег Азп
1865 1870 1875
11е Ьеи Агд Тгр Ьеи Зег Туг Уа1 Рго А1а Азп 11е О1у О1у Рго
1880 1885 1890
Ьеи Рго 11е ТЬг Ьуз Зег Ьеи Азр Рго 11е Азр Агд Рго Уа1 А1а
1895 1900 1905
Туг 11е Рго О1и Азп ТЬг Суз Азр Рго Агд А1а А1а 11е Зег О1у
1910 1915 1920
- 63 030578
11е Азр 1925 Азр Зег О1п О1у Ьуз 1930 Тгр Ьеи О1у О1у МеЕ 1935 РЬе Азр Ьуз
Азр Зег РЬе Уа1 О1и ТЬг РЬе О1и О1у Тгр А1а Ьуз ТЬг Уа1 Уа1
1940 1945 1950
ТЬг О1у Агд А1а Ьуз Ьеи О1у О1у 11е Рго Уа1 О1у Уа1 11е А1а
1955 1960 1965
Уа1 О1и ТЬг О1п ТЬг МеЕ МеЕ О1п Ьеи Уа1 Рго А1а Азр Рго О1у
1970 1975 1980
О1п Рго Азр Зег Н1з О1и Агд Зег Уа1 Рго Агд А1а О1у О1п Уа1
1985 1990 1995
Тгр РЬе Рго Азр Зег А1а ТЬг Ьуз ТЬг А1а О1п А1а МеЕ Ьеи Азр
2000 2005 2010
РЬе Азп Агд О1и О1у Ьеи Рго Ьеи РЬе 11е Ьеи А1а Азп Тгр Агд
2015 2020 2025
О1у РЬе Зег О1у О1у О1п Агд Азр Ьеи РЬе О1и О1у Азп Ьеи О1п
2030 2035 2040
А1а О1у Зег ТЬг 11е Уа1 О1и Азп Ьеи Агд ТЬг Туг Азп О1п Рго
2045 2050 2055
А1а РЬе Уа1 Туг 11е Рго Ьуз А1а А1а О1и Ьеи Агд О1у О1у А1а
2060 2065 2070
Тгр Уа1 Уа1 11е Азр Зег Ьуз 11е Азп Рго Азр Агд 11е О1и Суз
2075 2080 2085
Туг А1а О1и Агд ТЬг А1а Ьуз О1у Азп Уа1 Ьеи О1и Рго О1п О1у
2090 2095 2100
Ьеи 11е О1и 11е Ьуз РЬе Агд Зег О1и О1и Ьеи Ьуз О1и Суз МеЕ
2105 2110 2115
О1у Агд Ьеи Азр Рго О1и Ьеи 11е Азр Ьеи Ьуз А1а Агд Ьеи О1п
2120 2125 2130
О1у А1а Азп О1у Зег Ьеи Зег Азр О1у О1и Зег Ьеи О1п Ьуз Зег
2135 2140 2145
11е О1и А1а Агд Ьуз Ьуз О1п Ьеи Ьеи Рго Ьеи Туг ТЬг О1п 11е
2150 2155 2160
- 64 030578
А1а Уа1 Агд РЬе А1а О1и ^еи 2170 Н1з Азр ТЬг Зег ^еи 2175 Агд МеЕ А1а
2165
А1а ^уз О1у Уа1 11е Агд ^уз Уа1 Уа1 Азр Тгр О1и Азр Зег Агд
2180 2185 2190
Зег РЬе РЬе Туг ^уз Агд ^еи Агд Агд Агд ^еи Зег О1и Азр Уа1
2195 2200 2205
^еи А1а ^уз О1и 11е Агд О1у Уа1 11е О1у О1и ^уз РЬе Рго Н1з
2210 2215 2220
^уз Зег А1а 11е О1и ^еи 11е ^уз ^уз Тгр Туг ^еи А1а Зег О1и
2225 2230 2235
А1а А1а А1а А1а О1у Зег ТЬг Азр Тгр Азр Азр Азр Азр А1а РЬе
2240 2245 2250
Уа1 А1а Тгр Агд О1и Азп Рго О1и Азп Туг ^уз О1и Туг 11е ^уз
2255 2260 2265
О1и ^еи Агд А1а О1п Агд Уа1 Зег Агд ^еи ^еи Зег Азр Уа1 А1а
2270 2275 2280
О1у Зег Зег Зег Азр ^еи О1п А1а ^еи Рго О1п О1у ^еи Зег МеЕ
2285 2290 2295
^еи ^еи Азр ^уз МеЕ Азр Рго Зег ^уз Агд А1а О1п РЬе 11е О1и
2300 2305 2310
О1и Уа1 МеЕ ^уз Уа1 ^еи ^уз
2315 2320 <210> 15 <211> 12683 <212> ДНК <213> А1оресигиз туозиголбез Нибз
60 <400> 15 ЕсадЕЕЕаЕд дсадЕсЕдЕд ЕЕЕдаадаас асЕдсаасЕс сдсЕдЕсЕдЕ ссааадддад
120 дасдаЕддда ЕссасасаЕс ЕдсссаЕЕдЕ сдддЕЕЕааЕ дсаЕссасаа сассаЕсдсЕ
180 аЕссасЕсЕЕ сдссадаЕаа асЕсадсЕдс ЕдсЕдсаЕЕс сааЕсЕЕсдЕ ссссЕЕсаад
дЕсаЕссаад аадаааадсс дасдЕдЕЕаа дЕсааЕаадд даЕдаЕддсд аЕддаадсдЕ
240
- 65 030578
дссадасссЁ дсаддссаЁд дссадЁсЁаЁ ЁсдссааддЁ даассЁадда ссаЁсЁссЁЁ
асЁЁЁЁЁЁдЁ сдЁсаассЁс адасЁЁдсаЁ адаЁЁЁасЁЁ ЁсЁЁдаЁЁда дадсаЁдсЁЁ
дЁЁЁЁадЁдЁ аадаЁаЁсЁс ааЁасЁдЁаЁ сасааааЁда ЁадЁЁаадаа саааЁсасЁа
сассааЁсЁЁ сасаЁаЁЁдЁ ЁсЁЁаЁЁддд ЁЁЁдсЁаааЁ сЁЁадЁЁсдс аЁЁадаЁЁЁЁ
ЁЁЁаЁдЁсЁа ЁдЁсдасасс сЁдадссЁсс ссдЁдЁсЁсЁ дсаЁЁдадаЁ Ёсаадсаддд
аЁЁадддааа ЁсасдасЁдд аЁсадааддс аадсассаЁс дссЁЁадсса ЁааЁЁаааЁс
ЁсЁдЁсаасс ЁаддЁдЁада ЁддасЁсЁдЁ ЁЁЁЁааЁаЁЁ садЁаЁдаЁд ЁЁЁЁсЁЁаад
ддададддас асаааааЁаЁ адЁаадЁада адссЁЁассЁ ЁсддааааЁа сссаЁЁЁаас
сЁсЁдддадс аЁЁЁдсЁасЁ дссЁадаааа аЁссасЁЁЁЁ ЁааадЁЁЁса аЁааЁЁдсаа
адасаадЁЁа сЁаЁдЁдаЁа дЁасааадЁЁ ЁддЁддадаа асаасЁЁЁЁЁ ддЁсЁаЁдЁа
аЁаааааада саааЁаЁаЁд асасаЁдЁаЁ дЁЁдсадЁЁЁ аадааЁЁЁаЁ дасЁдааЁдЁ
ЁЁЁдаЁдаЁа ЁааЁадЁЁсЁ ддаааадаад даЁдссЁада ЁЁЁЁдЁЁЁЁЁ ЁдаЁаааЁдЁ
адЁЁаЁаааа ЁЁсдаааддЁ Ёддсааасса ЁЁдсЁЁсЁЁс ЁЁадсЁаЁЁд ЁдЁЁддсЁЁд
сЁсадЁЁЁсс ааЁдсаЁаЁс ЁддаЁдЁадд ЁсЁсдсЁддс аЁсаЁсдасс Ёсссааадда
дддсдсаЁса дсЁссадаЁд ЁддасаЁЁЁс асадЁаадЁа ссЁсадсаса сЁсасаЁЁаЁ
адсЁЁадЁЁс ЁсЁЁдааада асадсааааа ЁдЁаЁаасдс аЁдЁаЁадЁЁ ссЁадаЁЁЁс
асЁЁдЁсЁЁа ЁЁаЁсдЁЁас дсЁдаааЁдЁ ЁдаадЁЁдЁа ааЁЁсдЁЁаЁ ЁсЁсаЁадаЁ
ЁЁасассЁсЁ аЁдЁасаЁсЁ аЁдсасЁаЁд сассЁдсЁдЁ дадЁЁсЁдда ааЁЁдаасса
ЁЁсадсдсас ЁдсааЁсЁдЁ ааддЁЁЁЁдЁ ЁЁЁЁаЁаЁаа ЁаЁддЁЁаЁа ааЁсаЁдЁЁс
аассЁсЁдса ЁсЁасаасаЁ ЁаЁЁЁаЁдЁд ЁддЁаЁадЁа ЁаЁадЁааЁд ЁЁасадддЁд
адаЁЁЁЁдсЁ аЁаЁаадЁЁа ЁдааасЁЁдЁ дЁЁсаасЁЁЁ дЁааадддаа асаЁссЁсаа
- 66 030578
ассЕдЕЕсЕЕ адЕддЕЕаса дсссаддсас аЕддссдЕЕд сасЕдЕаЕдд адЕаЕЕдЕЕд
ддсасЕЕаса ааасаЕЕЕЕа ЕЕддааадаЕ ЕЕЕЕЕдаЕаЕ аадЕаЕЕдЕЕ ЕаааЕЕЕааЕ
ЕдссаасЕда аасссЕЕасс сддаЕаасаа даЕдааЕаас ссасЕЕдсдЕ ЕЕЕЕдаЕЕса
ЕасЕаддсаЕ ЕасЕасдЕса ЕаЕдЕаЕЕас ддЕдассдса дЕааЕаасЕЕ ЕдсЕсЕЕЕсЕ
ЕЕЕсЕадЕдд дЕсЕдаадас сасааддссЕ ссЕассаааЕ дааЕдддаЕа сЕдааЕдааЕ
сасаЕаасдд даддсасдсс ЕсЕсЕдЕсЕа аадЕЕЕаЕда аЕЕЕЕдсасд дааЕЕдддЕд
дааааасасс ааЕЕсасадЕ дЕаЕЕадЕсд ссаасааЕдд ааЕддсадса дсЕаадЕЕса
ЕдсддадЕдЕ ссддасаЕдд дсЕааЕдаЕа саЕЕЕдддЕс ададааддсд аЕЕсадЕЕда
ЕадсЕаЕддс аасЕссддаа дасаЕдадаа ЕаааЕдсада дсасаЕЕада аЕЕдсЕдаЕс
адЕЕЕдЕЕда адЕассЕддЕ ддаасаааса аЕаасаасЕа ЕдсаааЕдЕс саасЕсаЕад
ЕддаддЕсад ЕасЕддЕсаЕ сссЕЕдаЕдЕ дсадЕЕаЕдс асаадсЕссЕ сЕЕЕддЕсЕЕ
ЕадсаЕдаса ЕддсаасЕЕс асЕЕЕЕдсад аЕадсадада даасЕддЕдЕ сЕссдссдЕЕ
ЕддссЕддЕЕ ддддссаЕдс аЕсЕдадааЕ ссЕдаасЕЕс садаЕдсасЕ аасЕдсаааа
ддааЕЕдЕЕЕ ЕЕсЕЕдддсс ассадсаЕса ЕсааЕдаасд сасЕаддсда сааддЕЕддЕ
ЕсадсЕсЕса ЕЕдсЕсаадс адсаддддЕЕ сссасЕсЕЕд сЕЕддадЕдд аЕсасасдЕа
адссЕсасаЕ ЕсЕсЕсЕдаЕ аааЕсаЕсас сЕдаЕаЕЕЕд ЕддЕддаЕдс аЕЕаЕдЕаас
сЕаЕдасаЕЕ ЕЕЕаЕЕаЕад дЕддаааЕЕс саЕЕадаасЕ ЕЕдЕЕЕддас ЕсдаЕассЕд
аддадаЕдЕа Еаддааадсс ЕдЕдЕЕасаа ссдсЕдаЕда адсадЕЕдса адЕЕдЕсада
ЕдаЕЕддЕЕа сссЕдссаЕд аЕсааддсаЕ ссЕддддЕдд ЕддЕддЕааа дддаЕЕадаа
аддЕасаЕЕа ЕЕсаЕЕЕдаЕ ЕддасЕдЕас асаададаЕЕ дЕдЕдддсЕд ЕдаЕаЕЕЕЕд
ЕдсасадЕдЕ ЕадсссЕаас сЕЕЕЕЕааса ЕаЕЕаасЕсд аЕаЕсЕсЕЕд саддЕЕааЕа
- 67 030578
аЕдаЕдасда ддЕдааадса сЕдЕЕЕаадс аадЕасаддд ЕдаадЕЕссЕ ддсЕссссда
ЕаЕЕЕаЕсаЕ дадасЕЕдса ЕсЕсаддЕЕа дасЕЕсЕсЕа даадЕЕсЕаЕ ЕЕЕссаадсд
ЕдсЕдЕаЕсЕ дддЕЕдЕаЕа ЕЕдЕасдЕаЕ ддаадсЕЕЕа ЕЕЕдсЕсЕЕЕ сЕЕасаддсЕ
ааааЕЕдЕаЕ ссЕдЕааЕсЕ дЕасЕааЕаЕ ЕдЕааЕЕЕЕс аЕЕЕаааЕсс сЕсЕссссЕЕ
ЕсссЕЕЕдЕа дадЕсдЕсаЕ сЕЕдаадЕсс адсЕдсЕЕЕд ЕдаЕдааЕаЕ ддсааЕдЕад
садсасЕЕса садЕсдЕдаЕ ЕдсадЕдЕдс аасдасдаса ссааааддЕа ЕдсЕдсЕсса
аасЕдаааЕс аЕсасЕЕЕЕа ЕЕЕсддЕЕсЕ дсЕЕЕасдЕд ЕадЕЕЕЕдаЕ саааЕддЕЕс
аасЕдЕдЕсс аЕЕЕЕдЕЕЕд ЕЕЕаЕаасад аЕЕаЕсдадд ааддассадЕ ЕасЕдЕЕдсЕ
ссЕсдЕдааа садЕдааада дсЕададсаа дсадсаадда ддсЕЕдсЕаа ддссдЕдддЕ
ЕасдЕсддЕд сЕдсЕасЕдЕ ЕдааЕаЕсЕс ЕасадсаЕдд адасЕддЕда аЕасЕаЕЕЕЕ
сЕддадсЕЕа аЕссасддЕЕ дсаддЕЕЕдЕ ЕсЕЕЕЕддас асЕсЕссадд асЕЕсЕаЕЕЕ
ЕдЕЕддсадЕ сдЕЕЕасаЕЕ дЕЕаааЕддЕ сЕаЕаЕЕсад дЕЕдадсасс садЕсассда
дЕсдаЕадсЕ даадЕаааЕЕ ЕдссЕдсадс ссаадЕЕдса дЕЕдддаЕдд дЕаЕассссЕ
ЕЕддсадаЕЕ ссаддЕааЕа аЕааЕаЕсаЕ ЕдЕааададЕ ЕЕсдЕЕЕсЕд ЕсссаЕдЕЕс
ЕЕЕсЕдЕсЕа асЕаЕсЕссЕ ЕаЕЕсадада ЕсадасдЕЕЕ сЕасддааЕд дасааЕддад
даддсЕаЕда ЕаЕЕЕддадд аааасадсад сЕсЕсдсЕас ЕссаЕЕсаас ЕЕЕдаЕдаад
ЕадаЕЕсЕса аЕддссдаад ддЕсаЕЕдЕд ЕддсадЕЕад даЕаассадЕ дадааЕссад
аЕдаЕддаЕЕ саадссЕасЕ ддЕддаааад ЕаааддЕддд аЕЕЕссЕааЕ дЕЕаЕаЕсЕа
ЕдЕЕЕсааЕЕ асасЕасддЕ ЕадЕааасЕд аЕсЕдаЕсЕЕ даЕЕЕЕЕЕЕс дЕаЕаЕЕЕса
ддадаЕаадЕ ЕЕЕаааадЕа адссаааЕдЕ сЕддддаЕаЕ ЕЕсЕсадЕЕа аддЕаадсЕд
ЕЕсаЕадсЕс ЕдЕЕдсаддд ЕсаЕсЕЕдЕЕ ЕЕдадЕЕссд садаадаЕЕа дЕсЕдсаада
- 68 030578
ЬЬЬЬЬаЬЬсд ааЬЬадЬаЬЬ сЬсаЬЬЬЬдд ЬЬЬЬЬдасЬа адЬаЬЬдаЬс сааЬсаасаа
аЬаЬЬдЬсЬс ЬсссЬЬсаЬс ЬдЬЬЬЬсадЬ сЬддЬддадд саЬЬсаЬдаа ЬЬЬдсддаЬЬ
сЬсадЬЬЬдд ЬаЬдЬааааЬ дЬдасдЬааЬ дааЬаЬЬссЬ сЬЬЬдсЬаЬЬ сдЬаЬЬдаЬс
сЬЬасаЬЬдд ааЬЬдсЬссЬ ЬЬсаЬЬасад дасаЬдЬЬЬЬ ЬдссЬаЬдда дадасЬадаЬ
садсадсааЬ аассадсаЬд ЬсЬсЬЬдсас ЬаааададаЬ ЬсаааЬЬсдЬ ддадаааЬЬс
аЬасааасдЬ ЬдаЬЬасасд дЬЬдаЬсЬсЬ ЬдааЬдЬаад ЬаасааЬаас ааЬЬЬдЬЬда
аЬссЬасЬЬЬ ЬдаЬдЬдаЬа саассаЬЬЬЬ асаЬссддЬЬ ЬЬссЬЬсааа аЬааЬсссаЬ
ЬсЬдЬддЬЬЬ сЬсдЬаЬсЬЬ ЬааЬЬсаддс сссадасЬЬс ададааааса сдаЬссаЬас
сддЬЬддсЬд даЬассадаа ЬадсЬаЬдсд ЬдЬЬсаадсЬ дададдссЬс ссЬддЬаЬаЬ
ЬЬсадЬддЬЬ ддаддадсЬс ЬаЬаЬдЬаад аЬаЬдааасЬ аЬдЬЬааЬдЬ ЬасЬдсаасЬ
ЬЬЬддсаадс сааЬсЬЬдаа ааасадЬадЬ дЬЬЬааЬЬда ааЬааЬЬдЬЬ ЬЬдЬдсЬдЬа
даааасааЬа ассассааЬд сддадассдЬ ЬЬсЬдааЬаЬ дЬЬадсЬаЬс ЬсаЬсааддд
ЬсадаЬЬсса ссаааддЬад ЬдЬсЬЬааЬд ддсЬЬааасЬ сЬдЬаЬаЬЬд сЬЬдааддЬд
дасаЬЬдсЬд ассаЬЬдЬЬЬ ЬЬдЬдсадса ЬаЬаЬсссЬЬ дЬссаЬЬсаа сЬаЬЬЬсЬЬЬ
дааЬаЬадад дааадсаааЬ аЬасадЬаад ЬдЬдасаЬЬс сЬЬааааааа дасЬсЬсадЬ
ЬасааЬдааа ЬдаЬасЬЬас асЬдаЬдсЬс аЬсЬасасса ЬдссасадаЬ ЬдадаЬЬдЬд
аддадЬддас адддЬадсЬа садаЬЬдада аЬдааЬддаЬ сасЬЬаЬЬда адссааЬдЬа
сааасаЬЬаЬ дЬдаЬддадд ссЬЬЬЬааЬд саддЬассЬЬ сЬЬЬсЬЬЬЬа сЬЬдсЬсаЬа
ааЬдЬдаЬаЬ ааЬдЬсЬдсЬ дааададЬЬс ЬдаЬЬсЬЬЬа дЬЬдЬааЬдЬ сЬссадсЬдд
аЬддаааЬад ссаЬдЬЬаЬЬ ЬаЬдсЬдаад аадаадсддд ЬддЬасасад сЬЬсЬЬаЬЬд
аЬддааааас аЬдсЬЬдсЬа саддЬаадаа ЬаЬЬсЬдЬЬЬ дЬЬЬдсЬссЬ ЬЬаЬааЬсЬЬ
- 69 030578
адЁдЁЁЁдаЁ ддЁаддасЁЁ ЁаЁаЁЁсЁЁа ЁЁЁдЁдасЁЁ ЁЁЁасЁдсаЁ ЁсассЁсЁЁд
ассаЁЁадса сЁЁсаЁЁЁЁЁ ЁасасЁЁсаЁ сЁдЁаЁЁдсЁ ЁсЁдсЁдЁЁЁ сЁсааЁЁаЁа
дЁЁаЁЁссаа ЁдассасЁсЁ ЁЁадЁааЁЁЁ ЁаасааЁЁдс сааЁЁЁаЁса ЁааЁасдддд
саааааадЁа ддЁдЁссЁЁа асассаЁдЁс аЁдЁаассЁа ЁааЁаадсЁЁ дЁдаЁааааЁ
саЁЁЁдЁдаЁ аЁааЁадаас ааЁЁдааЁас ЁЁЁаЁдаЁЁЁ сЁЁЁсЁЁаса ЁдааЁасЁЁЁ
аЁдаЁЁсЁЁд аЁдасдсЁдс асЁдЁаЁссЁ ааасЁасаЁа ааЁЁасаааЁ сдЁЁЁЁдсад
ааЁдассаЁд аЁссдЁсаад дЁЁаЁЁадсЁ дадасасссЁ дсааасЁЁсЁ ЁсдЁЁЁсЁЁд
аЁЁдссдаЁд дЁдсЁсаЁдЁ ЁдаЁдсЁдаЁ дЁассаЁасд сддаадЁЁда ддЁЁаЁдаад
аЁдЁдсаЁдс сссЁсЁЁдЁс дссЁдсЁдсЁ ддЁдЁсаЁЁа аЁдЁЁЁЁдЁЁ дЁсЁдадддс
саддсдаЁдс аддЁЁаЁаЁЁ асЁдсссЁЁЁ ЁдЁЁдсЁЁсЁ дсЁдаЁаааа дссаЁЁдсаЁ
дЁдаадсаЁс ЁдаасЁЁааЁ аЁаЁЁЁЁдЁЁ ЁсаддсЁддЁ даЁсЁЁаЁад сдадасЁЁда
ЁсЁсдаЁдас ссЁЁсЁдсЁд Ёдаадададс ЁдадссаЁЁЁ дааддаЁсЁЁ ЁЁссадаааЁ
дадссЁЁссЁ аЁЁдсЁдсЁЁ сЁддссаадЁ Ёсасаааада ЁдЁдсЁдсаа дЁЁЁдаасдс
ЁдсЁсдааЁд дЁссЁЁдсад даЁаЁдасса Ёдсддссаас ааадЁаааса ЁсаадасаЁЁ
ЁЁаЁсЁсаЁд ЁЁЁссЁдсЁЁ ЁЁсЁсаааЁа ссаЁЁсЁЁЁа аЁадЁаЁдаа ЁЁсЁддаЁЁа
ЁЁсЁдасЁЁа ЁЁддсаЁЁЁЁ сЁдссЁЁЁЁд сЁассаааЁд дЁЁЁсЁааЁс ЁаЁадаадЁЁ
сЁЁдадсЁЁд ЁсЁЁЁдсааа ЁсЁсдаЁЁЁа аЁдсЁЁЁЁсЁ ЁдЁаЁдЁЁса ЁсаЁасЁсаЁ
ЁЁаЁдаЁадд ЁЁдсаЁЁЁаЁ ссЁЁсЁдсЁа ЁЁЁЁссЁЁЁс ЁсЁсадЁааа ЁсаЁдаЁдда
ЁдсЁсЁЁЁсЁ дЁЁаЁдЁЁса ЁсаЁдсЁдЁс ЁаЁЁаЁссЁЁ дЁдсЁаЁЁЁЁ ЁсЁаЁЁЁсса
дЁадЁддаЁд ЁаЁЁддЁЁЁа аЁааЁЁссЁд аЁсааасЁЁЁ дЁаЁЁЁЁдЁЁ дЁЁаЁЁЁаЁа
сЁЁддсЁЁсс ЁЁЁЁсаддЁЁ дЁдсаадаЁЁ ЁддЁаЁддЁд ссЁЁдаЁаса ссЁдсЁсЁЁс
- 70 030578
сЕЕЕссЕаса аЕдддаадад сЕЕаЕдЕсЕд ЕЕЕЕадсаас ЕадасЕЕсса адасдЕсЕЕа
ададсдаддЕ аЕдЕдаЕааЕ ЕдаЕаЕдаЕа ЕдсадааЕса ддсаЕааадд дасаЕЕдаЕа
саЕЕЕааЕЕЕ аЕдаЕаЕада адддЕсЕЕса ЕссЕсдаЕЕа ааадаЕсааЕ ЕсасЕЕаЕса
ЕдаЕЕЕасаЕ ЕсЕасаЕЕдЕ ЕдааЕсассЕ ЕддЕааЕЕЕд ссдЕаасЕЕа ЕЕдддсаасЕ
аЕЕадсЕЕЕЕ сЕааЕаасдЕ ааЕсааааЕЕ садааЕаЕЕЕ ЕасЕЕсааЕЕ сЕЕсдЕааса
ЕддаасаЕЕЕ ддЕасЕЕсдЕ сЕсаЕЕЕаЕЕ ЕдсасЕдЕас дсЕдЕЕЕЕад ЕЕддЕЕЕдсс
аЕЕсЕаасЕд ааЕсЕЕЕааа дЕЕсЕЕасЕЕ аЕЕЕддЕЕЕЕ аасссадаЕс ЕЕдЕЕЕаЕЕЕ
аЕсЕЕЕЕаЕа асЕЕЕсЕЕаЕ дЕЕсЕдссЕс аасддЕЕсаЕ асЕЕЕЕЕаЕд саЕссадЕЕд
дадддсаааЕ асааЕдааЕа саадЕЕаааЕ дЕЕдассаЕд ЕдаадаЕсаа ддаЕЕЕсссЕ
ассдадаЕдс ЕЕадададас ааЕсдаддЕс адЕЕЕЕЕдЕЕ ЕсЕЕаЕддса ЕсссадЕсЕа
ааЕЕаЕасЕа ЕЕЕЕЕЕдЕаа саадЕЕЕЕсЕ ЕЕЕаддаааа ЕсЕЕдсаЕдЕ дЕЕЕссдада
аддаааЕддЕ дасааЕЕдад аддсЕЕдЕЕд асссЕсЕдаЕ даассЕдсЕд аадЕсаЕасд
адддЕдддад адааадссаЕ дсссасЕЕЕа ЕЕдЕсаадЕс ссЕЕЕЕЕдад дадЕаЕсЕсЕ
сддЕЕдадда асЕаЕЕсадЕ даЕддсаЕЕс аддЕЕаЕсЕа асасЕЕсЕаа асЕдадсада
ЕсЕасЕадад ЕсаЕЕЕЕсЕа адддЕсаЕаа ЕЕЕЕссадаа ссЕсЕЕдддЕ даЕЕаадЕад
саааааЕааЕ ЕЕдЕасасда сЕЕасдасЕЕ асЕЕссЕЕсд ааасасЕЕЕЕ сасЕсаЕЕаЕ
ЕЕЕссЕсааа аЕдЕдссаЕЕ ЕЕдЕадЕсЕд асдЕдаЕЕда асдссЕдсдс сЕасааЕаЕа
дЕааадассЕ ссадааддЕЕ дЕадасаЕЕд ЕЕЕЕдЕсЕса ссаддЕааас ЕасЕЕЕЕЕдд
ссЕааЕдасЕ ЕддЕдсаадЕ даЕсасадаа асааЕсЕЕЕд ЕЕасЕдаЕад ЕЕЕдаЕЕЕдЕ
ЕсЕадддЕдЕ дадааасааа асааадсЕда ЕасЕсдсдсЕ саЕддадааа сЕддЕсЕаЕс
сааасссЕдс ЕдссЕасада даЕсадЕЕда ЕЕсдсЕЕЕЕс ЕЕсссЕсаас саЕаааадаЕ
- 71 030578
аЕЕаЕааддЕ дасааЕддсд ассЕааадЕа аЕддаадсЕЕ ЕЕЕдаЕЕааЕ ЕЕдЕЕдЕдаЕ
аЕЕЕЕаддсЕ ааЕдааЕЕас ЕЕЕсаЕЕдЕа аЕЕсЕдсадЕ ЕддсЕсЕЕаа адсЕадЕдаа
сЕЕсЕЕдаас ааассаадсЕ садсдаасЕс сдсасаадса ЕЕдсааддаа ссЕЕЕсаасд
сЕддаЕаЕдЕ Есассдадда аааддсадаЕ ЕЕсЕссЕЕдс аадасадааа аЕЕддссаЕЕ
ааЕдададса ЕдддадаЕЕЕ адЕсасЕдсс ссасЕдссад ЕЕдаадаЕдс асЕЕдЕЕЕсЕ
ЕЕдЕЕЕдаЕЕ дЕасЕдаЕса аасЕсЕЕсад садададЕда ЕЕдадасаЕа саЕаЕсЕсда
ЕЕаЕассадд ЕаЕЕасаЕда дсЕаЕЕЕЕЕЕ ЕсЕддаЕЕЕЕ аЕЕаЕасЕсЕ сЕсЕсадсаЕ
ЕЕсЕддаадс аЕааасЕаад дЕЕссЕааЕд аааЕаадаЕа сЕсадЕдЕЕЕ саЕЕаадаЕа
ааЕссЕадаЕ ааЕсЕаддсд ЕдддаадаЕЕ ЕдаЕЕЕадаа сЕЕдЕаддса ЕдЕЕасЕдсЕ
сЕдЕаадЕЕд дсЕаасЕЕдс сааЕдаЕаЕЕ ЕЕсадссЕса асЕЕдЕдаад даЕадсаЕсс
адсЕдаааЕа ЕсаддаЕЕсЕ ддЕдЕЕаЕЕд сЕЕЕаЕддда аЕЕсасЕдаа ддаааЕсаЕд
адаададаЕЕ дддЕдсЕаЕд дЕЕаЕссЕда адЕсасЕада аЕсЕдЕдЕса асадссаЕЕд
дадсЕдсЕсЕ аааддаЕдса ЕсасаЕЕаЕд саадсЕсЕдс дддсаасасд дЕдсаЕаЕЕд
сЕЕЕдЕЕдда ЕдсЕдаЕасс саасЕдааЕа саасЕдаада ЕаддЕаЕдЕЕ саЕдЕдсадЕ
аЕЕадЕдсад аЕдадЕЕЕаЕ ЕЕддЕдсааа ааЕаадЕЕаа ЕсЕаЕЕЕсЕЕ ЕсадЕддЕда
ЕааЕдассаа дсЕсаадаса адаЕддаЕаа асЕЕЕсЕЕЕЕ дЕасЕдааас аадаЕдЕЕдЕ
саЕддсЕдаЕ сЕасдЕдсЕд сЕдаЕдЕсаа ддЕЕдЕЕадЕ ЕдсаЕЕдЕЕс ааададаЕдд
адсааЕсаЕд ссЕаЕдсдсс дЕассЕЕссЕ сЕЕдЕсадад дааааасЕЕЕ дЕЕасдадда
ададссдаЕЕ сЕЕсддсаЕд ЕддадссЕсс асЕЕЕсЕдса сЕЕсЕЕдадЕ ЕддЕаЕдсаа
сЕссаЕсааа сЕдасЕасдЕ дсЕдЕЕЕЕда ЕаЕаЕЕЕЕаа ЕдсЕЕЕсасЕ ЕЕдЕЕаЕЕЕд
сЕасЕЕдЕаЕ ЕсасЕЕадсЕ ЕдсЕдЕддаЕ асаддаЕааа ЕЕдааадЕда ааддаЕасаа
- 72 030578
ЬдадаЬдаад ЬаЬасассдЬ сасдЬдаЬсд ЬсадЬддсаЬ аЬаЬасасас ЬЬадаааЬас
ЬдааааЬсса ааааЬдсЬдс асадддЬаЬЬ ЬЬЬссдааса сЬадЬсадас аасссадЬдс
аддсаасадд ЬЬЬасаЬсад ассаЬаЬсас ЬдаЬдЬЬдаа дЬаддасасд сададдаасс
ЬсЬЬЬсаЬЬЬ асЬЬсаадса дсаЬаЬЬааа аЬсдЬЬдаЬд аЬЬдсЬааад аадааЬЬдда
дсЬЬсасдсд аЬсаддасЬд дссаЬЬсЬса ЬаЬдЬасЬЬд ЬдсаЬаЬЬда аададсаааа
дсЬЬсЬЬдас сЬЬдЬЬссЬд ЬЬЬсадддЬа адссЬдсаса ЬсдЬЬсЬЬЬЬ ЬдсадаасаЬ
дЬаЬЬссЬЬд сЬсЬЬдЬдЬЬ ЬЬдссЬЬсЬс ааЬдадсЬЬЬ ЬсаЬсдЬасЬ саддаасасЬ
дЬЬдЬддаЬд ЬЬддЬсаада ЬдаадсЬасЬ дсаЬдсЬсЬс ЬЬЬЬдааада ааЬддсЬЬЬа
аадаЬасаЬд аасЬЬдЬЬдд ЬдсаадааЬд саЬсаЬсЬЬЬ сЬдЬЬЬдсса дЬдддаадЬд
ааасЬЬаадЬ ЬддЬдадсда ЬдддссЬдсс адЬддЬадсЬ ддададЬЬдЬ аасаассааЬ
дЬЬасЬддЬс асассЬдсас ЬдЬддаЬдЬд адЬЬЬЬаЬсЬ ссЬЬдсЬЬсс ЬдЬЬЬЬЬсЬд
саЬддаасЬа аЬдааасЬда адЬдаасаЬа ЬЬаЬаЬаЬдЬ дасаЬасаЬа ЬдасЬаЬсаЬ
сЬЬЬдаЬЬаЬ саЬааааааа даасЬаЬсаЬ сЬЬсдЬЬЬад ЬЬЬдЬЬдЬса ЬЬЬссассЬс
аЬЬЬЬЬддЬс ЬдааЬсЬсаЬ ддЬдсЬЬЬЬа аЬдсЬЬЬЬад аЬсЬассддд аддЬсдаада
ЬасадааЬса садааасЬад ЬаЬассасЬс сассдсаЬЬд ЬсаЬсЬддЬс сЬЬЬдсаЬдд
ЬдЬЬдсасЬд ааЬасЬЬсдЬ аЬсадссЬЬЬ дадЬдЬЬаЬЬ даЬЬЬаааас дЬЬдсЬсЬдс
саддаасаас аааасЬасаЬ асЬдсЬаЬда ЬЬЬЬссаЬЬд дЬЬадЬаЬсЬ аЬсЬсЬсЬсЬ
аЬаЬдЬаЬЬа ЬдЬЬадсадд ЬЬсЬЬаЬЬдд ЬаЬЬасаЬдЬ ссЬаааЬсЬд асаасаасЬс
ааааЬдЬада саЬЬЬдаадс ЬдсадЬдсад аадЬсдЬддЬ сЬаасаЬЬЬс садЬдаааас
аассааЬдЬЬ аЬдЬЬааадс дасададсЬЬ дЬдЬЬЬдсЬд аааадааЬдд дЬсдЬддддс
асЬссЬаЬаа ЬЬссЬаЬдса дсдЬдсЬдсЬ дддсЬдааЬд асаЬЬддЬаЬ ддЬадссЬдд
- 73 030578
аЁсЁЁддаса ЁдЁссасЁсс ЁдааЁЁЁссс адсддсадас адаЁсаЁЁдЁ ЁаЁсдсаааЁ
даЁаЁЁасаЁ ЁЁададсЁдд аЁсаЁЁЁддс ссаадддаад аЁдсаЁЁЁЁЁ сдаадсЁдЁа
ассаассЁдд сЁЁдЁдадаа даадсЁЁсса сЁЁаЁсЁасЁ ЁддсЁдсааа сЁсЁддЁдсЁ
сддаЁЁддса ЁЁдсЁдаЁда адЁааааЁсЁ ЁдсЁЁссдЁд ЁЁддаЁддас ЁдаЁдаЁадс
адсссЁдаас дЁддаЁЁЁад дЁасаЁЁЁаЁ аЁдасЁдасд аадассаЁда ЁсдЁаЁаддс
ЁсЁЁсадЁЁа Ёадсасасаа даЁдсадсЁа даЁадЁддсд адаЁсаддЁд ддЁЁаЁсдаЁ
ЁсЁдЁЁдЁдд даааададда ЁддасЁаддЁ дЁддадааса ЁасаЁддаад ЁдсЁдсЁаЁЁ
дссадЁдссЁ аЁЁсЁадддс дЁасдаддад асаЁЁЁасас ЁЁасаЁЁсдЁ ЁасЁддасда
асЁдЁЁддаа ЁсддадссЁа ЁсЁЁдсЁсда сЁЁддсаЁас ддЁдсаЁаса дсдЁаЁЁдас
садсссаЁЁа ЁЁЁЁдассдд дЁЁЁЁсЁдсс сЁдаасаадс ЁЁсЁЁдддсд ддаддЁдЁас
адсЁсссаса ЁдсадЁЁддд ЁддЁсссааа аЁсаЁддсда сдааЁддЁдЁ ЁдЁссаЁсЁд
асЁдЁЁссад аЁдассЁЁда аддЁдЁЁЁсЁ ааЁаЁаЁЁда ддЁддсЁсад сЁаЁдЁЁссЁ
дсааасаЁЁд дЁддассЁсЁ ЁссЁаЁЁаса аааЁсЁЁЁдд асссааЁада садасссдЁЁ
дсаЁасаЁсс сЁдадааЁас аЁдЁдаЁссЁ сдЁдсадсса ЁсадЁддсаЁ ЁдаЁдасадс
саадддаааЁ ддЁЁдддЁдд саЁдЁЁЁдас ааадасадЁЁ ЁЁдЁддадас аЁЁЁдаадда
Ёдддсдаада садЁадЁЁас Ёддсададса ааасЁЁддад ддаЁЁссЁдЁ ЁддЁдЁЁаЁа
дсЁдЁддада сасадассаЁ даЁдсадсЁс дЁссссдсЁд аЁссаддсса дссЁдаЁЁсс
саЁдадсддЁ сЁдЁЁссЁсд ЁдсЁдддсаа дЁЁЁддЁЁЁс садаЁЁсЁдс Ёассаадаса
дсдсаддсда ЁдЁЁддасЁЁ саассдЁдаа ддаЁЁассЁс ЁдЁЁсаЁасЁ ЁдсЁаасЁдд
ададдсЁЁсЁ сЁддадддса аададаЁсЁЁ ЁЁЁдааддаа аЁсЁдсаддс ЁдддЁсааса
аЁЁдЁЁдада ассЁЁаддас аЁасааЁсад ссЁдссЁЁЁд ЁаЁаЁаЁссс сааддсЁдса
- 74 030578
дадсЕасдЕд даддадссЕд ддЕсдЕдаЕЕ даЕадсаада Еааасссада ЕсдсаЕсдад
ЕдсЕаЕдсЕд ададдасЕдс ааадддЕааЕ дЕЕсЕсдаас сЕсаадддЕЕ даЕЕдадаЕс
аадЕЕсаддЕ сададдаасЕ сааадааЕдс аЕдддЕаддс ЕЕдаЕссада аЕЕдаЕадаЕ
сЕдааадсаа дасЕссаддд адсаааЕдда адссЕаЕсЕд аЕддадааЕс ссЕЕсадаад
адсаЕадаад сЕсддаадаа асадЕЕдсЕд ссЕсЕдЕаса сссаааЕсдс ддЕасдЕЕЕЕ
дсддааЕЕдс асдасасЕЕс ссЕЕадааЕд дсЕдсЕааад дЕдЕдаЕсад дааадЕЕдЕа
дасЕдддаад асЕсЕсддЕс ЕЕЕсЕЕсЕас аададаЕЕас ддаддаддсЕ аЕссдаддас
дЕЕсЕддсаа аддадаЕЕад аддЕдЕааЕЕ ддЕдадаадЕ ЕЕссЕсасаа аЕсадсдаЕс
дадсЕдаЕса адаааЕддЕа сЕЕддсЕЕсс даддсадсЕд садсаддаад сассдасЕдд
даЕдасдасд аЕдсЕЕЕЕдЕ сдссЕддадд дадаасссЕд аааасЕаЕаа ддадЕаЕаЕс
ааададсЕЕа дддсЕсааад ддЕаЕсЕсдд ЕЕдсЕсЕсад аЕдЕЕдсадд сЕссадЕЕсд
даЕЕЕасаад ссЕЕдссдса дддЕсЕЕЕсс аЕдсЕасЕад аЕааддЕасд саЕасЕЕаса
дЕЕЕЕассЕд саЕсЕдЕЕЕа ЕЕЕдсаадЕа ЕЕЕЕаЕсдад дЕЕдадЕааа аЕдсЕдсЕаЕ
сЕЕсаЕаЕас асЕЕдЕаЕдЕ ссЕдсЕаЕсЕ ЕаЕЕсаааЕа ЕадЕаЕсЕЕа ссаааЕааЕа
ЕсЕаадасдс ЕддаЕасЕЕЕ дЕЕсадаЕдд аЕсссЕсЕаа дададсасад ЕЕЕаЕсдадд
аддЕсаЕдаа ддЕссЕдааа ЕдаЕсаааЕд аЕассаасас аЕссааЕаса дЕаЕдЕдсаЕ
даЕаЕсЕдЕЕ ЕсЕсЕЕдаад ЕасаЕаЕаЕа даЕддаЕаса аддсддсЕдЕ аасЕдаЕддЕ
адсЕааЕсЕд ддссаассаЕ ЕасЕЕЕЕдЕд аасЕЕдсЕдд ЕддЕсЕЕЕаЕ ЕаЕЕсааддс
асадсЕсдсс ЕЕсддасссс сЕс
<210> 16 <211> 2320 <212> РКТ <213> А1оресигиз туозигогЭез НиЭз
- 75 030578 <400> 16
МеЕ 1 О1у Зег ТЬг Ηΐ3 5 ^еи Рго 11е Уа1 О1у 10 РЬе А3п А1а Зег ТЬг 15 ТЬг
Рго Зег ^еи Зег ТЬг ^еи Агд О1п 11е А3п Зег А1а А1а А1а А1а РЬе
20 25 30
О1п Зег Зег Зег Рго Зег Агд Зег Зег ^уз ^уз ^уз Зег Агд Агд Уа1
35 40 45
^уз Зег 11е Агд А3р А3р О1у А3р О1у Зег Уа1 Рго А3р Рго А1а О1у
50 55 60
Ηΐ3 О1у О1п Зег 11е Агд О1п О1у ^еи А1а О1у 11е 11е А3р ^еи Рго
65 70 75 80
^уз О1и О1у А1а Зег А1а Рго А3р Уа1 А3р 11е Зег Η13 О1у Зег О1и
85 90 95
Азр Ηΐ3 ^уз А1а Зег Туг О1п МеЕ А3п О1у 11е ^еи А3п О1и Зег Η13
100 105 110
Азп О1у Агд Η13 А1а Зег ^еи Зег ^уз Уа1 Туг О1и РЬе Су3 ТЬг О1и
115 120 125
^еи О1у О1у ^уз ТЬг Рго 11е Η13 Зег Уа1 ^еи Уа1 А1а А3п А3п О1у
130 135 140
МеЕ А1а А1а А1а ^уз РЬе МеЕ Агд Зег Уа1 Агд ТЬг Тгр А1а А3п А3р
145 150 155 160
ТЬг РЬе О1у Зег О1и ^уз А1а 11е О1п ^еи 11е А1а МеЕ А1а ТЬг Рго
165 170 175
О1и Азр МеЕ Агд 11е А3п А1а О1и Η13 11е Агд 11е А1а А3р О1п РЬе
180 185 190
Уа1 О1и Уа1 Рго О1у О1у ТЬг А3п А3п А3п А3п Туг А1а А3п Уа1 О1п
195 200 205
^еи 11е Уа1 О1и 11е А1а О1и Агд ТЬг О1у Уа1 Зег А1а Уа1 Тгр Рго
210 215 220
О1у Тгр О1у Η13 А1а Зег О1и А3п Рго О1и ^еи Рго А3р А1а ^еи ТЬг
225 230 235 240
- 76 030578
А1а Ьуз О1у 11е Уа1 245 РЬе Ьеи О1у Рго Рго 250 А1а Зег Зег МеЕ Азп А1а 255
Ьеи О1у Азр Ьуз Уа1 О1у Зег А1а Ьеи 11е А1а О1п А1а А1а О1у Уа1
260 265 270
Рго ТЬг Ьеи А1а Тгр Зег О1у Зег Н1з Уа1 О1и 11е Рго Ьеи О1и Ьеи
275 280 285
Суз Ьеи Азр Зег 11е Рго О1и О1и МеЕ Туг Агд Ьуз А1а Суз Уа1 ТЬг
290 295 300
ТЬг А1а Азр О1и А1а Уа1 А1а Зег Суз О1п МеЕ 11е О1у Туг Рго А1а
305 310 315 320
МеЕ 11е Ьуз А1а Зег Тгр О1у О1у О1у О1у Ьуз О1у 11е Агд Ьуз Уа1
325 330 335
Азп Азп Азр Азр О1и Уа1 Ьуз А1а Ьеи РЬе Ьуз О1п Уа1 О1п О1у О1и
340 345 350
Уа1 Рго О1у Зег Рго 11е РЬе 11е МеЕ Агд Ьеи А1а Зег О1п Зег Агд
355 360 365
Н1з Ьеи О1и Уа1 О1п Ьеи Ьеи Суз Азр О1и Туг О1у Азп Уа1 А1а А1а
370 375 380
Ьеи Н1з Зег Агд Азр Суз Зег Уа1 О1п Агд Агд Н1з О1п Ьуз 11е 11е
385 390 395 400
О1и О1и О1у Рго Уа1 ТЬг Уа1 А1а Рго Агд О1и ТЬг Уа1 Ьуз О1и Ьеи
405 410 415
О1и О1п А1а А1а Агд Агд Ьеи А1а Ьуз А1а Уа1 О1у Туг Уа1 О1у А1а
420 425 430
А1а ТЬг Уа1 О1и Туг Ьеи Туг Зег МеЕ О1и ТЬг О1у О1и Туг Туг РЬе
435 440 445
Ьеи О1и Ьеи Азп Рго Агд Ьеи О1п Уа1 О1и Н1з Рго Уа1 ТЬг О1и Зег
450 455 460
11е А1а О1и Уа1 Азп Ьеи Рго А1а А1а О1п Уа1 А1а Уа1 О1у МеЕ О1у
465 470 475 480
11е Рго Ьеи Тгр О1п 11е Рго О1и 11е Агд Агд РЬе Туг О1у МеЕ Азр
485 490 495
- 77 030578
Азп О1у О1у О1у Туг Азр 11е Тгр Агд 505 ^уз ТЬг А1а А1а ^еи 510 А1а ТЬг
500
Рго РЬе Азп РЬе Азр О1и Уа1 Азр Зег О1п Тгр Рго ^уз О1у Н1з Суз
515 520 525
Уа1 А1а Уа1 Агд 11е ТЬг Зег О1и Азп Рго Азр Азр О1у РЬе ^уз Рго
530 535 540
ТЬг О1у О1у ^уз Уа1 ^уз О1и 11е Зег РЬе ^уз Зег ^уз Рго Азп Уа1
545 550 555 560
Тгр О1у Туг РЬе Зег Уа1 ^уз Зег О1у О1у О1у 11е Н1з О1и РЬе А1а
565 570 575
Азр Зег О1п РЬе О1у Н1з Уа1 РЬе А1а Туг О1у О1и ТЬг Агд Зег А1а
580 585 590
А1а 11е ТЬг Зег МеЕ Зег ^еи А1а ^еи ^уз О1и 11е О1п 11е Агд О1у
595 600 605
О1и 11е Н1з ТЬг Азп Уа1 Азр Туг ТЬг Уа1 Азр ^еи ^еи Азп А1а Рго
610 615 620
Азр РЬе Агд О1и Азп ТЬг 11е Н1з ТЬг О1у Тгр ^еи Азр ТЬг Агд 11е
625 630 635 640
А1а МеЕ Агд Уа1 О1п А1а О1и Агд Рго Рго Тгр Туг 11е Зег Уа1 Уа1
645 650 655
О1у О1у А1а ^еи Туг ^уз ТЬг 11е ТЬг ТЬг Азп А1а О1и ТЬг Уа1 Зег
660 665 670
О1и Туг Уа1 Зег Туг ^еи 11е ^уз О1у О1п 11е Рго Рго ^уз Н1з 11е
675 680 685
Зег ^еи Уа1 Н1з Зег ТЬг 11е Зег ^еи Азп 11е О1и О1и Зег ^уз Туг
690 695 700
ТЬг 11е О1и 11е Уа1 Агд Зег О1у О1п О1у Зег Туг Агд ^еи Агд МеЕ
705 710 715 720
Азп О1у Зег ^еи 11е О1и А1а Азп Уа1 О1п ТЬг ^еи Суз Азр О1у О1у
725 730 735
^еи ^еи МеЕ О1п ^еи Азр О1у Азп Зег Н1з Уа1 11е Туг А1а О1и О1и
740 745 750
- 78 030578
О1и А1а О1у О1у ТЬг О1п Ьеи Ьеи 760 11е Азр О1у Ьуз ТЬг 765 Суз Ьеи Ьеи
755
О1п Азп Азр Нтз Азр Рго Зег Агд Ьеи Ьеи А1а О1и ТЬг Рго Суз Ьуз
770 775 780
Ьеи Ьеи Агд РЬе Ьеи 11е А1а Азр О1у А1а Нтз Уа1 Азр А1а Азр Уа1
785 790 795 800
Рго Туг А1а О1и Уа1 О1и Уа1 МеЬ Ьуз МеЬ Суз МеЬ Рго Ьеи Ьеи Зег
805 810 815
Рго А1а А1а О1у Уа1 11е Азп Уа1 Ьеи Ьеи Зег О1и О1у О1п А1а МеЬ
820 825 830
О1п А1а О1у Азр Ьеи 11е А1а Агд Ьеи Азр Ьеи Азр Азр Рго Зег А1а
835 840 845
Уа1 Ьуз Агд А1а О1и Рго РЬе О1и О1у Зег РЬе Рго О1и МеЬ Зег Ьеи
850 855 860
Рго 11е А1а А1а Зег О1у О1п Уа1 Нтз Ьуз Агд Суз А1а А1а Зег Ьеи
865 870 875 880
Азп А1а А1а Агд МеЬ Уа1 Ьеи А1а О1у Туг Азр Нтз А1а А1а Азп Ьуз
885 890 895
Уа1 Уа1 О1п Азр Ьеи Уа1 Тгр Суз Ьеи Азр ТЬг Рго А1а Ьеи Рго РЬе
900 905 910
Ьеи О1п Тгр О1и О1и Ьеи МеЬ Зег Уа1 Ьеи А1а ТЬг Агд Ьеи Рго Агд
915 920 925
Агд Ьеи Ьуз Зег О1и Ьеи О1и О1у Ьуз Туг Азп О1и Туг Ьуз Ьеи Азп
930 935 940
Уа1 Азр Нтз Уа1 Ьуз 11е Ьуз Азр РЬе Рго ТЬг О1и МеЬ Ьеи Агд О1и
945 950 955 960
ТЬг 11е О1и О1и Азп Ьеи А1а Суз Уа1 Зег О1и Ьуз О1и МеЬ Уа1 ТЬг
965 970 975
11е О1и Агд Ьеи Уа1 Азр Рго Ьеи МеЬ Азп Ьеи Ьеи Ьуз Зег Туг О1и
980 985 990
О1у О1у Агд О1и Зег Нтз А1а Нтз РЬе 11е Уа1 Ьуз Зег Ьеи РЬе О1и
- 79 030578
995 1000 1005
О1и Туг 1010 Ьеи Зег Уа1 О1и О1и 1015 Ьеи РЬе Зег Азр О1у 1020 11е О1п Зег
Азр Уа1 11е О1и Агд Ьеи Агд Ьеи О1п Туг Зег Ьуз Азр Ьеи О1п
1025 1030 1035
Ьуз Уа1 Уа1 Азр 11е Уа1 Ьеи Зег Н1з О1п О1у Уа1 Агд Азп Ьуз
1040 1045 1050
ТЬг Ьуз Ьеи 11е Ьеи А1а Ьеи МеЬ О1и Ьуз Ьеи Уа1 Туг Рго Азп
1055 1060 1065
Рго А1а А1а Туг Агд Азр О1п Ьеи 11е Агд РЬе Зег Зег Ьеи Азп
1070 1075 1080
Н1з Ьуз Агд Туг Туг Ьуз Ьеи А1а Ьеи Ьуз А1а Зег О1и Ьеи Ьеи
1085 1090 1095
О1и О1п ТЬг Ьуз Ьеи Зег О1и Ьеи Агд ТЬг Зег 11е А1а Агд Азп
1100 1105 1110
Ьеи Зег ТЬг Ьеи Азр МеЬ РЬе ТЬг О1и О1и Ьуз А1а Азр РЬе Зег
1115 1120 1125
Ьеи О1п Азр Агд Ьуз Ьеи А1а 11е Азп О1и Зег МеЬ О1у Азр Ьеи
1130 1135 1140
Уа1 ТЬг А1а Рго Ьеи Рго Уа1 О1и Азр А1а Ьеи Уа1 Зег Ьеи РЬе
1145 1150 1155
Азр Суз ТЬг Азр О1п ТЬг Ьеи О1п О1п Агд Уа1 11е О1и ТЬг Туг
1160 1165 1170
11е Зег Агд Ьеи Туг О1п Рго О1п Ьеи Уа1 Ьуз Азр Зег 11е О1п
1175 1180 1185
Ьеи Ьуз Туг О1п Азр Зег О1у Уа1 11е А1а Ьеи Тгр О1и РЬе ТЬг
1190 1195 1200
О1и О1у Азп Н1з О1и Ьуз Агд Ьеи О1у А1а МеЬ Уа1 11е Ьеи Ьуз
1205 1210 1215
Зег Ьеи О1и Зег Уа1 Зег ТЬг А1а 11е О1у А1а А1а Ьеи Ьуз Азр
1220 1225 1230
- 80 030578
А1а Зег 1235 Н1з Туг А1а Зег Зег 1240 А1а О1у Азп ТЬг Уа1 1245 Н1з 11е А1а
Ьеи Ьеи Азр А1а Азр ТЬг О1п Ьеи Азп ТЬг ТЬг О1и Азр Зег О1у
1250 1255 1260
Азр Азп Азр О1п А1а О1п Азр Ьуз МеЁ Азр Ьуз Ьеи Зег РЬе Уа1
1265 1270 1275
Ьеи Ьуз С1п Азр Уа1 Уа1 МеЁ А1а Азр Ьеи Агд А1а А1а Азр Уа1
1280 1285 1290
Ьуз Уа1 Уа1 Зег Суз 11е Уа1 О1п Агд Азр О1у А1а 11е МеЁ Рго
1295 1300 1305
МеЁ Агд Агд ТЬг РЬе Ьеи Ьеи Зег О1и О1и Ьуз Ьеи Суз Туг О1и
1310 1315 1320
О1и О1и Рго 11е Ьеи Агд Н1з Уа1 О1и Рго Рго Ьеи Зег А1а Ьеи
1325 1330 1335
Ьеи О1и Ьеи Азр Ьуз Ьеи Ьуз Уа1 Ьуз О1у Туг Азп О1и МеЁ Ьуз
1340 1345 1350
Туг ТЬг Рго Зег Агд Азр Агд О1п Тгр Н1з 11е Туг ТЬг Ьеи Агд
1355 1360 1365
Азп ТЬг О1и Азп Рго Ьуз МеЁ Ьеи Н1з Агд Уа1 РЬе РЬе Агд ТЬг
1370 1375 1380
Ьеи Уа1 Агд О1п Рго Зег А1а О1у Азп Агд РЬе ТЬг Зег Азр Н1з
1385 1390 1395
11е ТЬг Азр Уа1 О1и Уа1 О1у Н1з А1а О1и О1и Рго Ьеи Зег РЬе
1400 1405 1410
ТЬг Зег Зег Зег 11е Ьеи Ьуз Зег Ьеи МеЁ 11е А1а Ьуз О1и О1и
1415 1420 1425
Ьеи О1и Ьеи Н1з А1а 11е Агд ТЬг О1у Н1з Зег Н1з МеЁ Туг Ьеи
1430 1435 1440
Суз 11е Ьеи Ьуз О1и О1п Ьуз Ьеи Ьеи Азр Ьеи Уа1 Рго Уа1 Зег
1445 1450 1455
О1у Азп ТЬг Уа1 Уа1 Азр Уа1 О1у О1п Азр О1и А1а ТЬг А1а Суз
1460 1465 1470
- 81 030578
Зег Ьеи 1475 Ьеи Ьуз О1и МеЬ А1а 1480 Ьеи Ьуз 11е Ηί.5 О1и 1485 Ьеи Уа1 О1у
А1а Агд МеЬ Ηί5 Ηί5 Ьеи Зег Уа1 Суз О1п Тгр О1и Уа1 Ьуз Ьеи
1490 1495 1500
Ьуз Ьеи Уа1 Зег Азр О1у Рго А1а Зег О1у Зег Тгр Агд Уа1 Уа1
1505 1510 1515
ТЬг ТЬг Азп Уа1 ТЬг О1у Ηί5 ТЬг Суз ТЬг Уа1 Азр 11е Туг Агд
1520 1525 1530
О1и Уа1 О1и Азр ТЬг О1и Зег О1п Ьуз Ьеи Уа1 Туг Ηί.5 Зег ТЬг
1535 1540 1545
А1а Ьеи Зег Зег О1у Рго Ьеи Η15 О1у Уа1 А1а Ьеи Азп ТЬг Зег
1550 1555 1560
Туг О1п Рго Ьеи Зег Уа1 11е Азр Ьеи Ьуз Агд Суз Зег А1а Агд
1565 1570 1575
Азп Азп Ьуз ТЬг ТЬг Туг Суз Туг Азр РЬе Рго Ьеи ТЬг РЬе О1и
1580 1585 1590
А1а А1а Уа1 О1п Ьуз Зег Тгр Зег Азп 11е Зег Зег О1и Азп Азп
1595 1600 1605
О1п Суз Туг Уа1 Ьуз А1а ТЬг О1и Ьеи Уа1 РЬе А1а О1и Ьуз Азп
1610 1615 1620
О1у Зег Тгр О1у ТЬг Рго 11е 11е Рго МеЬ О1п Агд А1а А1а О1у
1625 1630 1635
Ьеи Азп Азр 11е О1у МеЬ Уа1 А1а Тгр 11е Ьеи Азр МеЬ Зег ТЬг
1640 1645 1650
Рго О1и РЬе Рго Зег О1у Агд О1п 11е 11е Уа1 11е А1а Азп Азр
1655 1660 1665
11е ТЬг РЬе Агд А1а О1у Зег РЬе О1у Рго Агд О1и Азр А1а РЬе
1670 1675 1680
РЬе О1и А1а Уа1 ТЬг Азп Ьеи А1а Суз О1и Ьуз Ьуз Ьеи Рго Ьеи
1685 1690 1695
11е Туг Ьеи А1а А1а Азп Зег О1у А1а Агд 11е О1у 11е А1а Азр
1700 1705 1710
- 82 030578
О1и Уа1 Ьуз Зег Суз РЬе Агд 1720 Уа1 О1у Тгр ТЬг Азр 1725 Азр Зег Зег
1715
Рго О1и Агд О1у РЬе Агд Туг 11е Туг МеЕ ТЬг Азр О1и Азр Н1з
1730 1735 1740
Азр Агд 11е О1у Зег Зег Уа1 11е А1а Н1з Ьуз МеЕ О1п Ьеи Азр
1745 1750 1755
Зег О1у О1и 11е Агд Тгр Уа1 11е Азр Зег Уа1 Уа1 О1у Ьуз О1и
1760 1765 1770
Азр О1у Ьеи О1у Уа1 О1и Азп 11е Н1з О1у Зег А1а А1а 11е А1а
1775 1780 1785
Зег А1а Туг Зег Агд А1а Туг О1и О1и ТЬг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг РЬе
1790 1795 1800
Уа1 ТЬг О1у Агд ТЬг Уа1 О1у 11е О1у А1а Туг Ьеи А1а Агд Ьеи
1805 1810 1815
О1у 11е Агд Суз 11е О1п Агд 11е Азр О1п Рго 11е 11е Ьеи ТЬг
1820 1825 1830
О1у РЬе Зег А1а Ьеи Азп Ьуз Ьеи Ьеи О1у Агд О1и Уа1 Туг Зег
1835 1840 1845
Зег Н1з МеЕ О1п Ьеи О1у О1у Рго Ьуз 11е МеЕ А1а ТЬг Азп О1у
1850 1855 1860
Уа1 Уа1 Н1з Ьеи ТЬг Уа1 Рго Азр Азр Ьеи О1и О1у Уа1 Зег Азп
1865 1870 1875
11е Ьеи Агд Тгр Ьеи Зег Туг Уа1 Рго А1а Азп 11е О1у О1у Рго
1880 1885 1890
Ьеи Рго 11е ТЬг Ьуз Зег Ьеи Азр Рго 11е Азр Агд Рго Уа1 А1а
1895 1900 1905
Туг 11е Рго О1и Азп ТЬг Суз Азр Рго Агд А1а А1а 11е Зег О1у
1910 1915 1920
11е Азр Азр Зег О1п О1у Ьуз Тгр Ьеи О1у О1у МеЕ РЬе Азр Ьуз
1925 1930 1935
Азр Зег РЬе Уа1 О1и ТЬг РЬе О1и О1у Тгр А1а Ьуз ТЬг Уа1 Уа1
- 83 030578
1940 1945 1950
ТЬг О1у Агд А1а Ьуз Ьеи О1у О1у 11е Рго Уа1 О1у Уа1 11е А1а
1955 1960 1965
Уа1 О1и ТЬг О1п ТЬг МеЕ МеЕ О1п Ьеи Уа1 Рго А1а Азр Рго О1у
1970 1975 1980
О1п Рго Азр Зег Н1з О1и Агд Зег Уа1 Рго Агд А1а О1у О1п Уа1
1985 1990 1995
Тгр РЬе Рго Азр Зег А1а ТЬг Ьуз ТЬг А1а О1п А1а МеЕ Ьеи Азр
2000 2005 2010
РЬе Азп Агд О1и О1у Ьеи Рго Ьеи РЬе 11е Ьеи А1а Азп Тгр Агд
2015 2020 2025
О1у РЬе Зег О1у О1у О1п Агд Азр Ьеи РЬе О1и О1у Азп Ьеи О1п
2030 2035 2040
А1а О1у Зег ТЬг 11е Уа1 О1и Азп Ьеи Агд ТЬг Туг Азп О1п Рго
2045 2050 2055
А1а РЬе Уа1 Туг 11е Рго Ьуз А1а А1а О1и Ьеи Агд О1у О1у А1а
2060 2065 2070
Тгр Уа1 Уа1 11е Азр Зег Ьуз 11е Азп Рго Азр Агд 11е О1и Суз
2075 2080 2085
Туг А1а О1и Агд ТЬг А1а Ьуз О1у Азп Уа1 Ьеи О1и Рго О1п О1у
2090 2095 2100
Ьеи 11е О1и 11е Ьуз РЬе Агд Зег О1и О1и Ьеи Ьуз О1и Суз МеЕ
2105 2110 2115
О1у Агд Ьеи Азр Рго О1и Ьеи 11е Азр Ьеи Ьуз А1а Агд Ьеи О1п
2120 2125 2130
О1у А1а Азп О1у Зег Ьеи Зег Азр О1у О1и Зег Ьеи О1п Ьуз Зег
2135 2140 2145
11е О1и А1а Агд Ьуз Ьуз О1п Ьеи Ьеи Рго Ьеи Туг ТЬг О1п 11е
2150 2155 2160
А1а Уа1 Агд РЬе А1а О1и Ьеи Нтз Азр ТЬг Зег Ьеи Агд МеЕ А1а
2165 2170 2175
- 84 030578
А1а Ьуз 2180 О1у Уа1 11е Агд Ьуз 2185 Уа1 Уа1 Азр Тгр О1и 2190 Азр Зег Агд
Зег РЬе РЬе Туг Ьуз Агд Ьеи Агд Агд Агд Ьеи Зег О1и Азр Уа1
2195 2200 2205
Ьеи А1а Ьуз О1и 11е Агд О1у Уа1 11е О1у О1и Ьуз РЬе Рго Н1з
2210 2215 2220
Ьуз Зег А1а 11е О1и Ьеи 11е Ьуз Ьуз Тгр Туг Ьеи А1а Зег О1и
2225 2230 2235
А1а А1а А1а А1а О1у Зег ТЬг Азр Тгр Азр Азр Азр Азр А1а РЬе
2240 2245 2250
Уа1 А1а Тгр Агд О1и Азп Рго О1и Азп Туг Ьуз О1и Туг 11е Ьуз
2255 2260 2265
О1и Ьеи Агд А1а О1п Агд Уа1 Зег Агд Ьеи Ьеи Зег Азр Уа1 А1а
2270 2275 2280
О1у Зег Зег Зег Азр Ьеи О1п А1а Ьеи Рго О1п О1у Ьеи Зег МеЕ
2285 2290 2295
Ьеи Ьеи Азр Ьуз МеЕ Азр Рго Зег Ьуз Агд А1а О1п РЬе 11е О1и
2300 2305 2310
О1и Уа1 МеЕ Ьуз Уа1 Ьеи Ьуз
2315 2320

Claims (32)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенный полинуклеотид, придающий растениям устойчивость к ингибированию роста одним или несколькими гербицидами, воздействующими на ацетил-КоА карбоксилазу (АКК), содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) последовательности 8Ε0 ГО N0: 4, 5 или 6;
    (b) последовательности, которая кодирует полипептид с активностью АКК, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ГО N0: 7-11 или 12;
    (c) последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична по всей длине последовательности 8Ε0 ГО N0: 4, 5 или 6, где указанная последовательность кодирует полипептид с активностью АКК;
    (й) фрагмента последовательности, который кодирует полипептид, сохраняющий активность АКК и устойчивость к АКК гербициду, где последовательность полипептида по меньшей мере на 95% идентична последовательности 8Ε0 ГО N0: 7-11 или 12; и (с) последовательности, которая комплементарна по всей длине любой последовательности по (а)(й), где указанная аминокислотная последовательность включает аминокислотное замещение А1а2004Vа1, определяемое путем выравнивания последовательности белка с последовательностью дикого типа и стандартной последовательностью лисохвоста мышехвостниковидного (8Ε0 ГО N0: 14 или 16).
  2. 2. Выделенный полинуклеотид по п.1, где указанный полинуклеотид содержит предпочтительные для растений кодоны.
  3. 3. ДНК конструкция, содержащая выделенный полинуклеотид по п.1, функционально связанный в смысловой или антисмысловой ориентации с промотором, который обеспечивает экспрессию полипептида, кодируемого указанным полинуклеотидом, в клетке-хозяине.
  4. 4. Экспрессионная кассета, включающая ДНК конструкцию по п.3.
    - 85 030578
  5. 5. Клетка-хозяин, содержащая стабильно встроенную в ее геном по меньшей мере одну ДНК конструкцию по п.3.
  6. 6. Клетка-хозяин по п.5, которая представляет собой растительную клетку.
  7. 7. Трансгенное растение, имеющее устойчивость к ингибированию роста одним или несколькими гербицидами, воздействующими на ацетил-КоА карбоксилазу, содержащее стабильно введенную в его геном ДНК конструкцию по п.3.
  8. 8. Трансгенное растение по п.7, выбранное из группы, включающей кукурузу, сою, пшеницу, рис, люцерну, ячмень, просо, подсолнечник, сорго, канолу и хлопчатник.
  9. 9. Выделенный полипептид, кодируемый выделенным полинуклеотидом по п.1 и имеющий активность АКК, выбранный из группы, состоящей из:
    (a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность 5Ε0 ГО N0: 7-11 или 12;
    (b) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью 5Ε0 ГО N0: 4, 5 или 6;
    (c) полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности 5Ε0 ГО N0: 4, 5 или 6;
    (б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности 5Ε0 ГО N0: 7-11 или 12; и (е) полипептида, включающего аминокислотную последовательность по меньшей мере из 50 последовательных аминокислот по любому из (а)-(б), где аминокислотная последовательность указанного полипептида включает аминокислотное замещение А1а2004Уа1, определяемое путем выравнивания последовательности белка с последовательностью дикого типа и стандартной последовательностью лисохвоста мышехвостниковидного (5>Е0 ГО N0: 14 или 16).
  10. 10. Растение пшеницы, имеющее устойчивость к ингибированию одним или несколькими гербицидами, воздействующими на ацетил-КоА карбоксилазу в дозах, в которых обычно эти гербициды ингибируют рост растения пшеницы, где растение содержит полинуклеотид по пп.1, 2.
  11. 11. Растение пшеницы по п.10, где гербициды выбраны из группы, включающей арилоксифеноксипропионаты, циклогександионы и фенилпиразолин (ЭЕЩ.
  12. 12. Растение пшеницы по п.10, где указанный полинуклеотид введен в указанное растение пшеницы селекцией.
  13. 13. Растение пшеницы по п.10, где указанный полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует АКК, причем указанная АКК включает аминокислотное замещение А1а2004Уа1, определяемое путем выравнивания последовательности АКК с аминокислотной последовательностью лисохвоста мышехвостниковидного 5Ε0 ГО N0: 14 или 16, приведенной в качестве сравнения.
  14. 14. Растение пшеницы по п.13, где указанная АКК представляет собой 5Ε0 ГО N0: 8, 10 или 12 или их консервативно модифицированные варианты, которые включают А1а2004Уа1 замещение.
  15. 15. Растение пшеницы по п.10, где указанное растение пшеницы включает мутации в гене ацетилКоА карбоксилаза, приведенные на фиг. 4.
  16. 16. Растение пшеницы по п.15, где мутации введены в указанное растение обратным скрещиванием.
  17. 17. Растение пшеницы по п.10, где указанное растение пшеницы включает последовательность нуклеиновой кислоты 5Ε0 ГО N0: 4, 5 или 6.
  18. 18. Растение пшеницы по п.17, где последовательности введены в указанное растение пшеницы селекцией.
  19. 19. Растение пшеницы по п.10, где указанный полипептид является гетерологичным.
  20. 20. Способ борьбы с сорной растительностью вблизи растения по п.10, включающий а) нанесение одного или нескольких гербицидов, воздействующих на ацетил-КоА карбоксилазу, на поле с растением пшеницы по п.10, причем указанное нанесение неблагоприятно влияет на рост сорной растительности, но не оказывает неблагоприятного воздействия на рост указанного растения пшеницы.
  21. 21. Способ по п.20, где указанные гербициды выбраны из группы, включающей арилоксифеноксипропионаты, циклогександионы и фенилпиразолин (ЭЕЩ.
  22. 22. Способ получения растения пшеницы по п.10, включающий а) введение в исходное растение пшеницы полинуклеотида по пп.1, 2, который кодирует АКК, включающую аминокислотное замещение А1а2004Уа1, определяемое путем выравнивания последовательности АКК с последовательностью дикого типа и стандартной последовательностью лисохвоста мышехвостниковидного (5>Е0 ГО N0: 14 или 16), где указанная АКК придает растению устойчивость к ингибированию одним или несколькими гербицидами, воздействующими на АКК, при применении в дозах, обычно ингибирующих рост растения пшеницы.
  23. 23. Способ по п.22, где указанное введение осуществляют путем обратного скрещивания.
  24. 24. Способ по п.22, где указанное введение осуществляют путем введения гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты.
  25. 25. Способ по п.23, где указанное обратное скрещивание включает получение растения пшеницы с мутациями в гене АКК, приведенными на фиг. 4, скрещивание указанного растения с элитным растением пшеницы для создания потомства растений пшеницы, отбор растений пшеницы с устойчивостью к АКК
    - 86 030578 гербицидам, в которых регенерировали морфологические и физиологические характеристики указанного элитного растения.
  26. 26. Способ идентификации растения пшеницы по п.10, включающий а) получение образца нуклеиновой кислоты из растения пшеницы, Ь) анализ указанного образца нуклеиновой кислоты на присутствие последовательности, которая кодирует АКК, включающую одну или несколько мутаций, которые придают устойчивость к гербицидам, воздействующим на АКК, и которые присутствуют в указанном образце нуклеиновой кислоты, где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
    (a) последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 4, 5 или 6;
    (b) последовательности, которая кодирует полипептид с активностью АКК, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ГО N0: 7-11 или 12;
    (c) последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична по всей длине последовательности δΕΟ ГО N0: 4, 5 или 6, где указанная последовательность кодирует полипептид с активностью АКК;
    (б) фрагмента последовательности, который кодирует полипептид, сохраняющий активность АКК и устойчивость к АКК гербициду, где последовательность полипептида по меньшей мере на 95% идентична последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 7-11 или 12; и (с) последовательности, которая комплементарна по всей длине любой последовательности по (а)(б), где указанная аминокислотная последовательность включает аминокислотное замещение Л1а2004Уа1, определяемое путем выравнивания последовательности белка с последовательностью дикого типа и стандартной последовательностью лисохвоста мышехвостниковидного (δΕΟ ГО N0: 14 или 16).
  27. 27. Способ по п.26, где выявляют мутации в гене АКК, приведенные на фиг. 4, где указанные одна или несколько мутаций кодируют аминокислотное замещение Л1а2004Уа1, определяемое путем выравнивания последовательности белка с последовательностью лисохвоста мышехвостниковидного δΕΟ ГО N0: 14 или 16, приведенной в качестве сравнения.
  28. 28. Способ по п.27, где выявляют последовательность δΕΟ ГО N0: 4, 5 или 6.
  29. 29. Растение с модифицированной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей АКК, придающей растению устойчивость к ингибированию роста одним или несколькими гербицидами, воздействующими на АКК, причем указанная последовательность кодирует АКК, включающую аминокислотное замещение Л1а2004Уа1 при сравнении с контрольной последовательностью лисохвоста мышехвостниковидного δΕΟ ГО N0: 14 или 16, где указанная полинуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
    (a) последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 4, 5 или 6;
    (b) последовательности, которая кодирует полипептид с активностью АКК, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ГО N0: 7-11 или 12;
    (c) последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична по всей длине последовательности δΕΟ ГО N0: 4, 5 или 6, где указанная последовательность кодирует полипептид с активностью АКК;
    (б) фрагмента последовательности, который кодирует полипептид, сохраняющий активность АКК и устойчивость к АКК гербициду, где последовательность полипептида по меньшей мере на 95% идентична последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 7-11 или 12; и (с) последовательности, которая комплементарна по всей длине любой последовательности по (а)(б).
  30. 30. Культура ткани, полученная из протопластов или клеток растения по пп.7, 10 и 29, где указанные клетки или протопласты получены из части растения, выбранной из группы, включающей лист, пыльцу, яйцеклетку, зародыш, семядолю, гипокотиль, меристематическую клетку, корень, кончик корня, пестик, пыльник, цветок, семя, росток, стебель, коробочку и черешок.
  31. 31. Способ получения семени растения пшеницы по п.10, включающий скрещивание двух растений пшеницы и сбор полученных семян пшеницы, где по меньшей мере одно растение пшеницы представляет собой растение пшеницы по п.10.
  32. 32. Способ по п.31, где по меньшей мере одно из указанных растений пшеницы является трансгенным.
    - 87 030578
EA201391113A 2011-02-01 2012-01-31 РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ, ВОЗДЕЙСТВУЮЩИМ НА АЦЕТИЛ-КоА КАРБОКСИЛАЗУ EA030578B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161438294P 2011-02-01 2011-02-01
US201161553830P 2011-10-31 2011-10-31
PCT/US2012/023298 WO2012106321A1 (en) 2011-02-01 2012-01-31 Acetyl co-enzyme a carboxylase herbicide resistant plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391113A1 EA201391113A1 (ru) 2014-07-30
EA030578B1 true EA030578B1 (ru) 2018-08-31

Family

ID=46603056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391113A EA030578B1 (ru) 2011-02-01 2012-01-31 РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ, ВОЗДЕЙСТВУЮЩИМ НА АЦЕТИЛ-КоА КАРБОКСИЛАЗУ

Country Status (11)

Country Link
US (4) US9578880B2 (ru)
EP (2) EP3682731A1 (ru)
CN (2) CN107603960A (ru)
BR (1) BR112013019510B1 (ru)
CA (1) CA2826284C (ru)
CL (1) CL2013002178A1 (ru)
EA (1) EA030578B1 (ru)
MX (1) MX347631B (ru)
UA (1) UA123491C2 (ru)
WO (1) WO2012106321A1 (ru)
ZA (1) ZA201305738B (ru)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA123491C2 (uk) * 2011-02-01 2021-04-14 Колорадо Уіт Рісерч Фаундейшн, Інк. РОСЛИНА, СТІЙКА ДО КВІЗАЛОФОП-р-ЕТИЛУ, ТА СПОСІБ ЇЇ ОДЕРЖАННЯ
US9303270B2 (en) 2011-07-22 2016-04-05 Ricetec Aktiengesellschaft Rice resistant to HPPD and accase inhibiting herbicides
EP2734616A4 (en) 2011-07-22 2015-04-22 Ricetec Ag METHOD AND COMPOSITIONS FOR PREPARING ACCASE INHIBITORS RESISTANT RICE
WO2014113846A1 (en) * 2013-01-25 2014-07-31 Adelaide Research & Innovation Pty Ltd Herbicide tolerant barley
EP3416487A4 (en) * 2016-02-08 2019-12-11 Colorado Wheat Research Foundation, Inc. HERBICIDAL SAFENER COMBINATIONS FOR ACETYLCOENZYME-A-CARBOXYLASE-HERBICIDE-RESISTANT PLANTS
PT3494224T (pt) 2016-08-05 2022-06-02 Ricetec Inc Métodos e composições para combinações de mutações associadas à resistência/tolerância a herbicidas em arroz
JP2020519310A (ja) * 2017-05-11 2020-07-02 インスティテュート・オブ・ジェネティクス・アンド・ディヴェロプメンタル・バイオロジー、チャイニーズ・アカデミー・オブ・サイエンシズＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 除草剤耐性遺伝子の創出およびその使用
CN108359646A (zh) * 2018-01-12 2018-08-03 江苏省农业科学院 使植物具有除草剂抗性的ACCase突变型蛋白及其应用
CN113817691B (zh) * 2018-11-28 2024-04-26 江苏省农业科学院 一种小麦ACCase突变型基因及其在植物抗除草剂中的应用
US11576381B2 (en) 2019-02-25 2023-02-14 Albaugh, Llc Composition and a method of using the composition to increase wheat yield
CN114480697B (zh) * 2020-10-23 2023-10-03 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） 茶树谷氨酰胺合成酶基因ssr分子标记引物及应用
CN113201557B (zh) * 2021-05-10 2023-04-07 安徽省农业科学院水稻研究所 一种引导编辑系统介导作物产生内源除草剂抗性的方法
AU2022369384A1 (en) 2021-10-19 2024-05-02 Limagrain Europe Targeted gene integration in plants
CN114507696B (zh) * 2022-03-15 2024-03-15 浙江工业大学 一种高粱素的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6222099B1 (en) * 1993-02-05 2001-04-24 Regents Of The University Of Minnesota Transgenic plants expressing maize acetyl COA carboxylase gene and method of altering oil content
US6306636B1 (en) * 1997-09-19 2001-10-23 Arch Development Corporation Nucleic acid segments encoding wheat acetyl-CoA carboxylase
US20040216190A1 (en) * 2003-04-28 2004-10-28 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US542901A (en) 1895-07-16 Cabinet
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
EP0452269B1 (en) 1990-04-12 2002-10-09 Syngenta Participations AG Tissue-preferential promoters
WO1991016433A1 (en) 1990-04-26 1991-10-31 Plant Genetic Systems N.V. New bacillus thuringiensis strains and their genes encoding insecticidal toxins
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
ES2124738T3 (es) 1991-08-02 1999-02-16 Mycogen Corp Nuevo microorganismo e insecticida.
EP0600993B1 (en) 1991-08-27 1999-11-10 Novartis AG Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
TW261517B (ru) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
DK0616644T3 (da) 1991-12-04 2003-10-27 Du Pont Fedtsyredesaturase-gener fra planter
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
US5341001A (en) 1992-02-13 1994-08-23 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Sulfide-selenide manganese-zinc mixed crystal photo semiconductor and laser diode
EP0652965A1 (en) 1992-07-27 1995-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
US5539092A (en) * 1992-10-02 1996-07-23 Arch Development Corporation Cyanobacterial and plant acetyl-CoA carboxylase
DK0668919T3 (da) 1992-11-17 2003-09-15 Du Pont Gener for mikorsomale delta-12-fedtsyredesaturaser og beslægtede enzymer fra planter
WO1994012014A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
AU6162294A (en) 1993-01-13 1994-08-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. High lysine derivatives of alpha-hordothionin
US6414222B1 (en) * 1993-02-05 2002-07-02 Regents Of The University Of Minnesota Gene combinations for herbicide tolerance in corn
US5583210A (en) 1993-03-18 1996-12-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for controlling plant development
US5559220A (en) * 1993-09-14 1996-09-24 Midwest Research Institute Gene encoding acetyl-coenzyme A carboxylase
NZ278490A (en) 1993-12-09 1998-03-25 Univ Jefferson Chimeric polynucleotide with both ribo- and deoxyribonucleotides in one strand and deoxyribonucleotides in a second strand
JPH07177130A (ja) 1993-12-21 1995-07-14 Fujitsu Ltd エラーカウント回路
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
CN1192239A (zh) 1995-06-02 1998-09-02 先锋高级育种国际公司 α-hordothionin的高甲硫氨酸衍生物
EP0828835A1 (en) 1995-06-02 1998-03-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. HIGH THREONINE DERIVATIVES OF $g(a)-HORDOTHIONIN
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
JP3441899B2 (ja) 1996-11-01 2003-09-02 理化学研究所 完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成方法
US6232529B1 (en) 1996-11-20 2001-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
AU757672B2 (en) 1997-11-18 2003-02-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. A method for directional stable transformation of eukaryotic cells
JP3646510B2 (ja) 1998-03-18 2005-05-11 セイコーエプソン株式会社 薄膜形成方法、表示装置およびカラーフィルタ
CA2329056A1 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cell cycle genes, proteins and uses thereof
US6518487B1 (en) 1998-09-23 2003-02-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7151201B2 (en) 2000-01-21 2006-12-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
UA86918C2 (ru) 2000-10-30 2009-06-10 Вердиа, Инк. Изолированный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий активность глифосат-n-ацетилтрансферазы (gat)
WO2004063715A2 (en) * 2003-01-10 2004-07-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of using crystal structure of carboxyltransferase domain of acetyl-coa carboxylase, modulators thereof, and computer methods
US6989481B2 (en) * 2004-05-10 2006-01-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Wheat variety XW02M
GB0413500D0 (en) * 2004-06-16 2004-07-21 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
CA2591992A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 The Salk Institute For Biological Studies Compositions and methods for producing recombinant proteins
CN101336294B (zh) * 2005-12-01 2016-08-03 阿则耐克斯公司 赋予除草剂抗性的grg23和grg51基因
RU2457674C2 (ru) * 2007-01-12 2012-08-10 Канзас Стейт Юниверсити Рисерч Фаундейшн СОРГО, УСТОЙЧИВОЕ К ГЕРБИЦИДАМ, ДЕЙСТВУЮЩИМ НА АЦЕТИЛ-КоА КАРБОКСИЛАЗУ
NL1033850C2 (nl) 2007-05-15 2008-11-18 3Force B V Brandersysteem met voorgemengde branders en vlam-overdrachtsmiddelen.
CN102083303A (zh) * 2008-06-20 2011-06-01 乔治亚大学研究基金会公司 抗除草剂的草类物种的开发
AU2009308236B2 (en) * 2008-10-23 2016-06-30 Lumen Bioscience, Inc. Modified photosynthetic microorganisms for producing triglycerides
TW201113376A (en) 2009-09-01 2011-04-16 Basf Agrochemical Products Bv Herbicide-tolerant plants
UA123491C2 (uk) * 2011-02-01 2021-04-14 Колорадо Уіт Рісерч Фаундейшн, Інк. РОСЛИНА, СТІЙКА ДО КВІЗАЛОФОП-р-ЕТИЛУ, ТА СПОСІБ ЇЇ ОДЕРЖАННЯ

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6222099B1 (en) * 1993-02-05 2001-04-24 Regents Of The University Of Minnesota Transgenic plants expressing maize acetyl COA carboxylase gene and method of altering oil content
US6306636B1 (en) * 1997-09-19 2001-10-23 Arch Development Corporation Nucleic acid segments encoding wheat acetyl-CoA carboxylase
US20040216190A1 (en) * 2003-04-28 2004-10-28 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBL Accession Number AM 408430, Alopecurus myosuroides accase gene for acetyl-coenzyme A carboxylase, variety Plant E490, exons 1-33; 11 September 2008, downloaded from the Internet 5 May 2012 at http://www.ebi.ac.uk/tools/dbfetch/emblfetch?style=html&id=AM408430 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107603960A (zh) 2018-01-19
MX2013008842A (es) 2014-08-27
ZA201305738B (en) 2014-04-30
US20170166919A1 (en) 2017-06-15
US20220002745A1 (en) 2022-01-06
EP2670231A1 (en) 2013-12-11
AU2012212301B2 (en) 2016-01-28
BR112013019510A2 (pt) 2020-06-30
MX347631B (es) 2017-05-04
CN103796507A (zh) 2014-05-14
CL2013002178A1 (es) 2014-05-09
CA2826284C (en) 2021-06-08
US20140250543A1 (en) 2014-09-04
US11130962B2 (en) 2021-09-28
BR112013019510B1 (pt) 2021-09-21
US9578880B2 (en) 2017-02-28
UA123491C2 (uk) 2021-04-14
WO2012106321A1 (en) 2012-08-09
AU2012212301A1 (en) 2013-08-15
US20190345509A1 (en) 2019-11-14
EA201391113A1 (ru) 2014-07-30
US10370678B2 (en) 2019-08-06
EP2670231A4 (en) 2015-04-29
US11932865B2 (en) 2024-03-19
CA2826284A1 (en) 2012-08-09
CN103796507B (zh) 2017-09-01
EP3682731A1 (en) 2020-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA030578B1 (ru) РАСТЕНИЯ, УСТОЙЧИВЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ, ВОЗДЕЙСТВУЮЩИМ НА АЦЕТИЛ-КоА КАРБОКСИЛАЗУ
Vetriventhan et al. Genetic and genomic resources, and breeding for accelerating improvement of small millets: current status and future interventions
KR101787776B1 (ko) Ａａｄ-１ 이벤트 ｄａｓ-４０２７８-９, 관련 트랜스제닉 옥수수 식물주, 및 그의 이벤트-특이적 확인
EA029891B1 (ru) Кукурузный хромосомный сайт-мишень и способ получения трансгенного растения кукурузы
UA126903C2 (uk) Об&#39;єкт кукурудзи mon 87411
RU2610664C2 (ru) Способы борьбы с сорняками с использованием растений aad-1 и предпосевного и/или довсходового внесения гербицидов
EA021187B1 (ru) Хромосомный целевой сайт кукурузы и способ получения трансгенной кукурузы
EA025843B1 (ru) Устойчивое к гербициду растение brassica juncea, способ борьбы с сорняками и способы получения и идентификации устойчивого к гербициду растения brassica juncea
CN109694872A (zh) 调控基因表达的方法
CN107624135A (zh) 具有修饰的种子油组成的芸苔属植物
UA126433C2 (uk) Ген стійкості до іржі стебел пшениці і спосіб його застосування
CA3083297A1 (en) Maize gene krn2 and uses thereof
US11781192B2 (en) Double-flowering dwarf Calibrachoa
Vikal et al. Identification of genomic regions associated with shoot fly resistance in maize and their syntenic relationships in the sorghum genome
CN113365494B (zh) 能够发生种子败育型的果实形成的茄子科植物
CN112654234A (zh) Aco2基因的突变等位基因
Sarmah et al. Cisgenesis: engineering plant genome by Harnessing compatible gene pools
US20240180095A1 (en) Stay green cucurbitaceae plant
Mainak et al. Cisgenics as New Horizon in Crop Improvement
WO2022207114A1 (en) Stay green cucurbitaceae plant
AU2012212301B9 (en) Acetyl Co-Enzyme A carboxylase herbicide resistant plants
WO2022241461A1 (en) Modified autoflower cannabis plants with value phenotypes
EA032843B1 (ru) Растения solanum lycopersicum, имеющие нетрансгенные модификации в гене acs4
CN114786474A (zh) 灼烧病毒抗性基因

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU