CN112654234A

CN112654234A - Aco2基因的突变等位基因

Info

Publication number: CN112654234A
Application number: CN201980058115.7A
Authority: CN
Inventors: C·范德马斯; C·哈灵
Original assignee: Ruixwang Seedling Group Corp
Current assignee: Ruixwang Seedling Group Corp; Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2021-04-13
Also published as: EP3829293A1; WO2020025133A1; US20210214707A1; MX2021001112A; CA3107217A1; WO2020025632A1

Abstract

本发明涉及突变ACO2基因等位基因，所述突变ACO2基因等位基因形成仅产生雄花的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株。本发明还涉及包含突变ACO2基因等位基因的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株。所述突变ACO2等位基因提供仅产生雄花的植株。本发明进一步涉及ACO2基因的突变等位基因用于鉴定和培育仅产生雄花的葫芦科植株(尤其是黄瓜植株)的用途。

Description

ACO2基因的突变等位基因

技术领域

本发明涉及决定葫芦科(Cucurbitacea)，尤其是黄瓜(Cucumis sativus)的花的性别类型的ACO2基因的突变等位基因，具有所述突变等位基因的植株，以及鉴定和培育此类植株的方法。

背景技术

黄瓜种的黄瓜植物属于黄瓜属，其不仅包含重要的粮食作物黄瓜(Cucumissativus)，还包含多种多样的甜瓜类型(大部分包括在甜瓜(Cucumis melo)内)，以及几个其他的不太为人所知的黄瓜种。黄瓜是大葫芦科的一部分。

黄瓜植物被认为起源于亚洲，它们很早被驯化并在非洲和亚洲国家已经栽培了几千年。黄瓜目前在全世界以大量的类型栽培，这些类型一般在尺寸、颜色和果皮类型方面有所不同。黄瓜生产在相对温暖的气候下最为成功，因为它偏好的温度为约18–25℃。黄瓜是一年生草本二倍体植物物种，具有7对染色体。

在黄瓜植株上雄花和雌花的比率可以根据基因型而变化，并且基于该比率，分为5个不同类型；雌雄同株、雌株、雄全同株、雌雄同花和雄株。雌雄同株植株具有雌花和雄花两者，雌株植株仅有雌花，雄全同株植株具有雄花和两性花，雌雄同花植株仅具有两性花，雄株植株仅具有雄花。

黄瓜中花的性别表达在遗传上由本领域中已知的三个主要基因控制，这些基因命名为F(雌性)和M(雄全同株)和A(雄株)基因。F基因促进雌性特征，并且是部分显性的，M基因影响花的两性，“mm”(隐性等位基因m)植株具有两性花而非雌花。总之，F和M相互作用以产生雌株(F-M-)或雌雄同株(ffM-)或雌雄同花(FFmm)或雄全同株(ffmm)性别表型。另一基因A与F联合作用。当A和F作为隐性等位基因存在时，植株是雄株。

在现代园艺学中，大多数使用仅产生雌花的雌株黄瓜栽培品种，由此有助于最佳产量，因为仅雌花可以发育成具有适合销售的质量的果实。为了获得这些类型的黄瓜栽培品种，存在不同的可以用于生产黄瓜种子的系统，但使用纯雌系并将其与另一纯雌系杂交以产生黄瓜杂交品种是最常见的系统之一。优选这两个雌株自交系对F基因是纯合的，因为那样使得得到的杂交品种对F基因也是纯合的，由此对于雌株性别表达更为稳定(与由纯雌系x雌雄同株系得到的杂交品种相比)。为了维持黄瓜的纯雌系或将两个纯雌系杂交，通过利用GA或硝酸银喷雾来诱导雄花。

性别表达也可以通过激素因素(主要通过乙烯)和环境因素(氮水平、光强度、夜晚温度)来改变。已知植物激素乙烯有助于对瓜类的花性别表型的控制，并且它已经在园艺学中用于诱导雌花。乙烯的生物合成由下列步骤组成。蛋氨酸转化成S-腺苷蛋氨酸(SAM),SAM转化成1-氨基环丙烷-1-甲酸酯(ACC)，ACC氧化成乙烯。此最后一步，氧化为乙烯由1-氨基环丙烷-1-甲酸酯氧化酶(ACC氧化酶或ACO)执行。

发明内容

本发明的目的是提供仅产生雄花的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株，以及鉴定和/或培育此类植株的方法和标志物。仅产生雄花的植株尤其适合作为育种计划和杂交种子生产中的传粉植株。

本发明人鉴定了黄瓜植株中ACO2基因的单个核苷酸缺失和仅产生雄花的能力(也称为雄性)之间的连锁。

ACO2基因包括两个结构域，即所谓的DIOX_N结构域和20G_Fell_Oxy结构域。本发明人发现的缺失位于DIOX_N结构域中。

包含纯合存在的所述缺失的黄瓜植株仅产生雄花(雄株植株)。包含纯合存在的所述突变的黄瓜植株可以产生雄花和雌花。

与黄瓜(Cucumis sativus)类似，也可以通过改变作为葫芦科植物科成员的其他作物中的ACO2基因来影响雄性，所述作物诸如例如甜瓜(Cucumis melo)、西瓜(Citrulluslanatus)、西葫芦(Cucurbita pepo)(例如，南瓜(pumpkin)和南瓜小果(squash))、笋瓜(Cucurbita maxima)和中国南瓜(Cucurbita moschata)。因此，当在本文中提到黄瓜ACO2基因的野生型核苷酸序列或黄瓜ACO2蛋白的野生型氨基酸序列时，其可以分别用葫芦科中的任一种的ACO2基因的野生型核苷酸序列和ACO2蛋白的野生型氨基酸序列来代替。通过使用黄瓜的ACO2基因的野生型序列(SEQ ID No:1)，技术人员可以容易地在葫芦科的其他物种中鉴定同源物。

本发明因此涉及ACO2基因的突变等位基因，所述突变等位基因包含在具有SEQ IDNO:1的核苷酸序列的野生型ACO2基因或具有显示与SEQ ID NO:1至少85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列的野生型ACO2基因的DIOX_N结构域中的突变，其中所述突变如果纯合地存在于葫芦科植株(尤其是黄瓜植株)的基因组中则形成仅产生雄花的植株。

ACO2基因的突变等位基因当在本文中使用时是指与ACO2基因的野生型核苷酸序列相比改变的或突变的ACO2基因的核苷酸序列。所述改变或突变可以是任何改变或突变，包括但不限于缺失。ACO2基因的野生型等位基因由SEQ ID NO:1示出，参见表1。ACO2基因的突变等位基因在SEQ ID NO:3中示出，也参见表1，所述突变等位基因如果纯合地存在于黄瓜植株中会导致所述黄瓜植株仅产生雄花。

术语“等位基因”当在本文中使用时是指基因的变体形式，所述变体形式可以通过遗传分析或通过其影响的表型来检测。

术语“野生型”当在本文中使用时一般是指生物体、基因、蛋白质或性状如其在自然界中存在那样的形式，与突变的或修饰的形式相对。在本申请中，“野生型”专门指ACO2基因的天然存在形式和ACO2蛋白的天然存在形式。ACO2基因和ACO2蛋白的天然存在形式在表1中示出。

术语“突变体”、“突变等位基因”、“修饰的等位基因”、“突变的ACO2基因”和“修饰的ACO2基因”当在本文中使用时是指ACO2基因的野生型等位基因中的一个或多个核苷酸改变，所述改变形成该基因的野生型等位基因的突变的或修饰的形式。所述突变或修饰可以是任何突变或修饰，包括但不限于缺失。

术语雄性当在本文中使用时是指仅产生雄花，在本文中也进一步是指由包含在野生型序列SEQ ID NO:1中的突变的ACO2等位基因所产生的本发明的性状。更具体地，产生本发明的性状的突变是DIOX_N结构域中的缺失。所述性状以隐性的方式遗传。

词语“性状”在本申请的上下文中是指植物的表型。特别地，词语“性状”是指本发明的性状，更特别地是在葫芦科的植株，尤其是黄瓜植株中仅产生雄花的性状。

突变在本文中定义为改变基因的序列，产生基因的变体形式(等位基因)，所述变体形式可以传递到后代，所述改变可以通过改变DNA中的单个碱基单位，或较大段的基因或染色体的缺失、插入或重排来形成。修饰在本文中用作突变的同义词。

如在本发明中所定义，插入缺失标记(indel)是用于生物体的DNA中碱基的插入或缺失的术语，在本发明中所述生物体是黄瓜(Cucumis sativus)植株。如果插入缺失标记存在于基因组的编码区，它将产生移码突变，只要插入缺失标记的长度不是3的倍数即可。

在一个实施方案中，核苷酸序列SEQ ID NO:1的DIOX_N结构域中的突变导致SEQID NO:2的氨基酸序列的改变。ACO2基因的野生型氨基酸序列SEQ ID NO:2在表1中示出。所述突变形成突变的氨基酸序列SEQ ID NO:4，该序列也在表1中示出。

在一个实施方案中，核苷酸序列SEQ ID NO:1的DIOX_N结构域中的突变形成提前终止密码子。终止密码子是给出信号终止翻译成蛋白质的核苷酸三联体，或密码子。核苷酸序列的DIOX_N结构域中的突变形成提前终止密码子,或转录的mRNA中的所谓的“无义”密码子并最终形成截短的、不完全的且通常是无功能的蛋白质。

在一个实施方案中，核苷酸序列SEQ ID NO:1的DIOX_N结构域中的突变包含缺失。

特别地，所述缺失包括移码。移码是开放阅读框中的改变，导致氨基酸序列翻译成完全不同的蛋白质。序列中缺失发生越早，蛋白质改变的越多。移码突变也将改变序列中遇到的第一个终止密码子("UAA","UGA"或"UAG")的位置。由于移码形成的多肽可以是异常短的或异常长的，并且最可能是无功能的。

在一个实施方案中，核苷酸序列SEQ ID NO:1的DIOX_N结构域中的突变包含至少单个胸腺嘧啶核苷酸的缺失。ACO2基因的突变等位基因包含核苷酸序列SEQ ID NO:3。野生型核苷酸序列SEQ ID NO:1和突变的核苷酸序列SEQ ID NO:3之间的差异是胸腺嘧啶核苷酸的缺失。

在一个实施方案中，核苷酸序列SEQ ID NO:1的DIOX_N结构域中的突变是在SEQID NO:1的野生型核苷酸序列中的位置278处的核苷酸的缺失。

在一个实施方案中，ACO2基因的突变等位基因包含SEQ ID NO:3。

本发明进一步涉及ACO2基因的突变等位基因用于培育仅产生雄花的黄瓜植株的用途。如本文所述的ACO2基因的突变等位基因可以通过使用现代技术(诸如例如CRISPR/Cas系统)以及通过使用传统的转基因方法引入至黄瓜植株中。

本发明进一步涉及ACO2基因的突变等位基因用于赋予黄瓜植株以雄性的用途，所述突变等位基因如存在于以保藏号NCIMB 42987保藏的种子中。

本发明还涉及黄瓜植株作为ACO2基因的突变等位基因的受体的用途，所述突变等位基因存在于以保藏号NCIMB 42987保藏的种子中。

本发明还涉及包含本发明的ACO2基因的突变等位基因的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株。当所述突变纯合地存在于葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的基因组中时，所述植株仅产生雄花。

由ACO2基因的突变等位基因所产生的性状是隐性的，这意味着该性状将仅在所述等位基因纯合地存在时才表达。

因此，在一个实施方案中，葫芦科植株，尤其是黄瓜植株，包含纯合存在的ACO2基因的突变等位基因。此类植株仅产生雄花。

如果ACO2基因的突变等位基因杂合地存在，则该性状将不会被表达，原因在于其是隐性的。由ACO2基因的突变等位基因所赋予的雄性性状的隐性性质使得其非常适合于用于黄瓜杂交种子生产。黄瓜杂交品种优选地应当产生雌花，因为那些会发育成黄瓜果实。使用一个包含纯合存在的ACO2突变等位基因的黄瓜亲本系作为传粉者，将产生包含杂合存在的ACO2基因的黄瓜杂交品种，因此不会表达雄性性状。将没必要用GA或硝酸银处理雌株黄瓜系来诱导雄花。

尽管存在与黄瓜花的性别表达有关的其他基因，但如果本发明的突变ACO2等位基因纯合地存在，雄性性状将会表达，并且黄瓜植株将在主茎和侧枝两者中仅产生雄花。

然而，具有杂合状态的ACO2基因的突变等位基因的植株仍然是本发明的植株，因为此类植株是ACO2基因的突变等位基因的潜在来源。当与另一植株(其任选地也具有纯合或杂合存在的该突变等位基因)杂交时，或当与其自身杂交时，可以产生具有纯合存在的该突变等位基因并且显示仅产生雄花的性状的子代植株。

在一个实施方案中，本发明的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株是农艺优良植株。

在本发明的上下文中，农艺优良植株是具有通过人为干预进行定向杂交和选择而导致可区分的和期望的农艺性状的积累的基因型的植株，所述农艺性状允许生产者收获具有商业意义的产品。因此，其是栽培植株。在培育携带突变的ACO2等位基因的新黄瓜植株的过程中，期望的农艺性状可以独立于突变的ACO2等位基因被引入到所述黄瓜植株中。

本发明的植株可以是自交系、杂交种、双单倍体的植株，或分离群体的植株。如本文所用，自交系的植株是三轮或更多轮自交，或回交所产生的植株群体的植株；或所述植株是双单倍体。自交系可以例如是用于生产商业杂交种的亲本系。

本发明还涉及本发明的黄瓜植株作为作物、作为种子来源或作为繁殖材料来源的用途。

本发明还涉及本发明的葫芦科植株(尤其是黄瓜植株)的细胞，所述细胞包含本发明的突变ACO2等位基因。

通过将包含突变ACO2等位基因的葫芦科植株(尤其是黄瓜植株)与第二种葫芦科植株(尤其是黄瓜植株)杂交可获得包含突变ACO2等位基因的葫芦科植株(尤其是黄瓜植株)，并因此可获得其细胞，其中所述ACO2等位基因包含在SEQ ID NO:1的野生型ACO2基因核苷酸序列的DIOX_N结构域中的突变。对于黄瓜，DIOX_N结构域中的突变优选地是在以保藏号NCIMB 42987保藏的种子中存在的SEQ ID NO:1的野生型核苷酸序列中位置278处的核苷酸缺失。

本发明进一步涉及包含本发明的ACO2基因的突变等位基因的葫芦科种子，尤其是黄瓜种子。可以由所述种子长成的植株也包含本发明的ACO2基因的突变等位基因。如果所述突变纯合地存在，则所述植株仅产生雄花。

本发明还涉及生产种子的方法，包括从本发明的种子生长植株，通过允许传粉使所述植株产生种子，并收获种子。所述种子的生产合适地通过杂交或自交完成。

此外，本发明还涉及葫芦科种子，尤其是黄瓜种子用于将仅产生雄花的性状传递至葫芦科的其他植株，尤其是黄瓜植株的用途，所述种子包含突变的ACO2等位基因，其中所述突变等位基因包在含SEQ ID NO:1的野生型ACO2基因核苷酸序列的DIOX_N结构域中的突变。

本发明还涉及以保藏号NCIMB 42987保藏的种子用于将雄性传递到另一黄瓜植株的用途。

包含纯合存在的本发明的ACO2基因的突变等位基因的植株可以在与其他黄瓜植株的任何杂交中仅充当雄性亲本，除非它们用乙烯利或其他植物激素处理。

此外，本发明涉及杂交种子，并涉及生产此类杂交种子的方法，所述方法包括使第一亲本植株与第二亲本植株杂交并收获得到的杂交种子，其中所述第一亲本植株和/或所述第二亲本植株具有本发明的ACO2基因的突变等位基因。由得到的包含本发明的ACO2基因的突变等位基因的种子生长而得到的杂交种子也是本发明的植株。

本发明还涉及包含本发明的ACO2基因的突变等位基因的繁殖材料，其中所述繁殖材料选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生细胞、原生质体或它们的细胞或组织培养物。

在一个实施方案中，所述繁殖材料包含纯合存在的本发明的ACO2基因的突变等位基因，其中所述繁殖材料选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生细胞、原生质体或它们的细胞或组织培养物。

作为本发明的一部分，考虑黄瓜植株作为作物的用途，所述黄瓜植株包含本发明的ACO2基因的突变等位基因，所述突变等位基因如存在于由以保藏号NCIMB 42987保藏的种子生长的黄瓜植株中。

本发明还涉及包含ACO2基因的突变等位基因的黄瓜植株作为种子来源的用途，所述突变等位基因如存在于由以保藏号NCIMB 42987保藏的种子生长的黄瓜植株中。

此外，涉及包含ACO2基因的突变等位基因的黄瓜植株作为繁殖材料来源的用途，所述突变等位基因如存在于由以保藏号NCIMB 42987保藏的种子生长的黄瓜植株中。

还涉及包含ACO2基因的突变等位基因的黄瓜植株用于消费的用途，所述突变等位基因如存在于由以保藏号NCIMB 42987保藏的种子生长的黄瓜植株中。包含具有本发明的突变等位基因的葫芦科尤其是黄瓜果实或其部分的食品或加工食品也是本发明所考虑的一部分。所述食品可以经历一个或多个加工步骤。此类加工步骤可以包括但不限于下列处理中的任一个或其组合：削皮、切削、洗涤、榨汁、蒸煮、冷却。可以获得的加工形式也是本发明的一部分。

本发明进一步涉及用于鉴定包含ACO2基因的突变等位基因的黄瓜植株的标志物，其中所述标志物鉴定在SEQ ID NO:1的ACO2基因核苷酸序列的野生型等位基因的位置278处的核苷酸的缺失。专业技术人员还知晓如何基于本发明所述的信息开发与突变ACO2等位基因连锁且因此可以用来鉴定包含突变ACO2等位基因的黄瓜植株的其他标志物。

本发明还涉及用于生产或获得仅产生雄花的植株的方法，其中所述植株的基因组包含纯合存在的本发明的ACO2基因的突变等位基因，所述方法包括：

a)将包含本发明的ACO2基因的突变等位基因的植株与包含或不包含本发明的ACO2基因的突变等位基因的第二植株杂交，获得F1群体；

b)任选地进行一轮或多轮自交和/或将来自所述F1的植株杂交以获得下一代群体；

c)选择仅产生雄花并且包含纯合存在的本发明的ACO2基因的突变等位基因的植株。

在一个实施方案中，选择具有仅产生雄花的性状的植株在F1或任何后代中通过使用突变ACO2等位基因序列SEQ ID NO:3作为标志物完成。在本发明的另一方面，对本发明的性状的选择在杂交系或可选地在回交系的F2中开始。对F2中的植株的选择可以通过表型以及通过使用所述一种或多种标志物完成，所述标志物直接地或间接地检测作为所述性状的基础的ACO2基因的突变等位基因。

在一个实施方案中，对具有仅产生雄花的性状的植株的选择在F3或后续的代中开始。

在植株性相容时，本发明的ACO2基因的突变等位基因可以通过普遍使用的育种技术引入到另一植株中，所述育种技术诸如杂交和选择。为了获得具有纯合存在的ACO2基因的突变等位基因的植株，包含杂合存在的所述突变等位基因的植株可以自交或可以与包含ACO2基因的至少一个突变等位基因的另一植株杂交。此类导入可以来自可以容易地杂交的相同物种的植株，或来自相关物种的植株。杂交的难点可以通过本领域中已知的技术来克服，诸如胚挽救。

备选地，ACO2基因的突变等位基因可以例如通过转基因方式从另一性不相容的植株传递。可以适合地使用的技术包括专业技术人员知晓的通用植物转化技术，诸如使用农杆菌介导的转化法。

基因组编辑法诸如使用CRISPR/Cas系统也可以用来获得具有本发明的突变等位基因的植株。

本发明另外地提供将另一期望的性状引入至本发明的黄瓜植株中的方法，包括：

a)将本发明的黄瓜植株与包含期望性状的第二黄瓜植株杂交以产生F1子代；

b)选择包含所述期望性状的F1子代；

c)将所选择的F1子代与本发明的黄瓜植株杂交以产生回交子代；

d)选择包含所述期望性状以及本发明的ACO2基因的等位基因和形状的回交子代；以及

e)任选地重复步c)和d)一次或连续多次以产生包含所述期望性状以及本发明的ACO2基因的等位基因和性状的所选的第四或更高的回交子代。本发明包括通过此方法产生的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株。

本发明进一步提供了生产具有仅产生雄花的性状的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的方法，该方法通过对包含本发明的ACO2基因的突变等位基因的植株使用双单倍体生成技术以生成包含所述性状的双单倍体系。

在一个实施方案中，本发明涉及生产具有仅产生雄花的性状的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的方法，包括使第一亲本植株与第二亲本植株杂交，收获得到的杂交种子，以及使所述种子生长成具有仅产生雄花的性状的植株，其中所述第一亲本植株和第二亲本植株两者均具有ACO2基因的至少一个突变等位基因，当所述突变等位基因纯合地存在于植株中时，导致仅产生雄花。

本发明还涉及生产具有仅产生雄花的性状的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的方法，该方法通过使用包含纯合存在的本发明的ACO2基因的突变等位基因的种子以生长成所述植株。

在一个实施方案中，本发明涉及生产具有仅产生雄花的性状的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的方法，该方法通过使用来自包含纯合存在的本发明的ACO2基因的突变等位基因的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的组织培养物进行。

此外，本发明涉及生产具有仅产生雄花的性状的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的方法，该方法通过使用包含本发明的ACO2基因的突变等位基因的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的至少一部分的营养繁殖进行。

在一个实施方案中，本发明涉及生产具有仅产生雄花的性状的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的方法，该方法通过使用将本发明的ACO2基因的突变等位基因渗入至植株中的方法进行。遗传修饰包括使用来自不可杂交物种的基因或合成基因的转基因修饰或转基因，以及使用来自作物植株本身或来自性相容供体植株的编码(农业)性状的天然基因的同源转基因修饰(cisgenic modification)或同源转基因(cisgenesis)进行。

本发明还涉及培育具有仅产生雄花的性状的黄瓜植株的育种方法，其中使用包含本发明的等位基因的种质。此类种质存在于以保藏号NCIMB 42987保藏的种子中。

在进一步的实施方案中，本发明涉及生产具有仅产生雄花的性状的葫芦科植株，尤其是黄瓜植株的方法，其中包含本发明的ACO2突变等位基因的植株的子代或繁殖材料用作将所述性状渗入至另一葫芦科植株，尤其是黄瓜植株中的来源。

此外，本发明涉及从植株群体中选择仅产生雄花的黄瓜植株的方法，包括检测植株群体中的植株的基因组中在野生型ACO2等位基因序列SEQ ID NO:1的位置278处的核苷酸缺失，并且选择包含纯合存在的所述缺失的植株。

所述选择可以通过使用与突变ACO2等位基因序列SEQ ID NO:3连锁的标志物来完成。

本发明进一步涉及鉴定、检测、基因型分型或选择包含本发明的ACO2突变等位基因的黄瓜植株的方法，包括确定、检测、测量、定量或定性地探查或测定植株中存在或不存在基因组核苷酸序列或其部分，其中所述序列按照增加的偏好性顺序与SEQ ID NO:3具有95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性，并且其中所述序列包含在野生型ACO2等位基因序列SEQ ID NO:1的位置278处的核苷酸缺失。

因此，本发明包含并包括表征黄瓜植株携带或不携带ACO2基因的突变等位基因，包括确定或检测或测量或定量或定性地探查或测定黄瓜植株中存在或不存在基因组核苷酸序列或其部分，其中所述序列按照增加的偏好性顺序与SEQ ID NO:3具有95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性，所述方法可以包括提取或获得所述植株的DNA或RNA并分析其中存在或不存在核苷酸序列或其部分，其中所述序列按照增加的偏好性顺序与SEQ ID NO:3具有95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性，并且其中所述序列包含在野生型ACO2等位基因序列SEQ ID NO:1的位置278处的核苷酸缺失。

进一步要理解，在本发明的范围内，还可以分析黄瓜植株的表达产物，诸如编码序列或蛋白或其部分，以探查由所述植株表达一种或多种产物，由其可以确定所述植株是否具有(或不具有)与SEQ ID NO:3具有序列相似性的基因组核苷酸序列或其部分。这样的编码序列按照增加的偏好性顺序与SEQ ID NO:3将具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性，并且其中所述序列包含在野生型ACO2等位基因序列SEQ ID NO:1的位置278处的核苷酸缺失。这样的蛋白质具有按照增加的偏好性顺序与SEQ ID NO:4有95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列，并且其包含由野生型ACO2等位基因序列SEQ ID NO:1的位置278处的核苷酸缺失所导致的修饰。

如本文所用，“期望性状”包括但不限于例如，提高的产量、改良的叶形状、增加的种子数量、增加的种子尺寸、提高的植物活力、增加的植物高度、改善的抽苔和提高的对一种或多种病害或引起病害的生物体的抗性。这些期望性状中的任一个可以与突变的ACO2等位基因组合。

保藏

包含纯合存在的ACO2突变等位基因的黄瓜Cucumis sativus EX5016-27-103的种子于2018年3月15日保藏在国家工业、食品和海洋微生物保藏中心(NCIMB Ltd,FergusonBuilding,Craibstone Estate,Bucksburn,阿伯丁AB21 9YA,英国)，保藏号为NCIMB42987。

表

表1–ACO2基因的基因组序列，由ACO2基因编码的蛋白质序列，野生型和变体形式。

本发明进一步在后面的实施例中进行说明，所述实施例仅用于举例说明目的。所述实施例不意在以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1

鉴定黄瓜中的ACO2基因突变

在建立黄瓜基因组的新基因图谱的研究中，获得植株群体，在所述植株群体中一些植株仅产生雄花。对此杂交群体进行的分析表明6号染色体上的QTL使得包含该QTL的植株仅产生雄花。对内部开发的标志物的测序表明在该标志物序列中存在插入/缺失(“插入缺失标记”)。在杂交群体中该特定序列是多态性的。借助于BLAST鉴定6号染色体上的主QTL的核苷酸序列。对该序列的最佳BLAST命中全部与ACO2黄瓜基因的序列相似。

表1示出了ACO2基因的编码序列以及伴随的蛋白质序列，均示出了两者的野生型和突变形式。

实施例2

与ACO2突变连锁的标志物的验证

在进一步研究期间，测试标志物以检查它们是否与在突变ACO2等位基因中发现的插入缺失标记连锁。发现标志物CS05484与表型雄性(仅产生雄花的能力)100％相关。为了检查该插入缺失标记的频率，测试54个内参照亲本系中的该标志物。结果是54个内参照亲本系中有53个被评分为“A”，“A”与ACO2基因的野生型形式连锁。被测试的亲本系中仅有一个显示“B”评分，该54个内参照亲本系中仅有的亲本系携带ACO2基因中的突变。

此外，测试了竞争者/其他育种公司的多种杂交品种种子，它们全部对此标志物评分为“A”。表2示出了亲本系和杂交品种以及它们针对标志物CS05484的评分。表3示出了标志物CS05484的野生型和突变体序列，即SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

表2–在各种黄瓜品种和内参照黄瓜系中对标志物CS05484的评分。

表3-标志物CS05484的野生型和突变形式的序列。

序列表

<110> 瑞克斯旺种苗集团公司

<120> ACO2基因的突变等位基因

<130> P125747PC01

<140>

<141>

<160> 6

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 黄瓜（Cucumis sativus）

<220>

<223> 野生型ACO2

<400> 1

atggagatgg atttccctgt catcaacatg aacaacctca atggcgaaag cagagtatct 60

gtcctgaacc aaatcaacga cgcctgcgaa aactggggtt tttttgagtt ggtgaatcat 120

gggataccac atgagctgat ggacaaagtg gagaagatga caaaggaaca ttatagaaag 180

tgcatggagc agaggtttaa agaaatggta gcttccaaag ggttggattc agtggaaact 240

gagatcaacg acactgattg ggaaagcact ttttttttac gccatcttcc agtttcaaac 300

atgtcagaaa ttggtgatct ggatgaggag tacaagaagg tgatgaagga atttgcagct 360

gaactggaga aattagcgga ggaaattctg aacttgttgt gtgagaatct tgggcttgaa 420

aaggggtatt tgaaaaaagt gttttatgga tcaaaaggcc caaactttgg gacaaaagtt 480

agcaattacc ctccatgtcc taaacctgag cttattaaag gacttagagc ccataccgat 540

gctggtggtc ttattcttct gtttcaagat gataaagtga gtgggcttca gctgctcaaa 600

gatggaaaat gggttgatgt tcctccgatg catcactcca ttgttatcaa tttaggagac 660

cagcttgaag taataacaaa tggaaaatac aagagtgtaa tgcacagagt gatagcacag 720

gaggatggaa acagaatgtc gatagcatca ttctacaatc caggaaacga cgccgtaatc 780

tatccggcgc cggcgctggt cgagggagag caggagaaaa ccaaacttta cccaaaattt 840

gtgttcgatg attacatgaa gctgtatatg gggcttaagt ttcaagcaaa agagccaagg 900

tttgaggcca tgaaagccat ggagtccacc aatatcaata tgggtccaat tgcaactgtc 960

tga 963

<210> 2

<211> 320

<212> PRT

<213> 黄瓜

<220>

<223> 野生型ACO2

<400> 2

Met Glu Met Asp Phe Pro Val Ile Asn Met Asn Asn Leu Asn Gly Glu

1 5 10 15

Ser Arg Val Ser Val Leu Asn Gln Ile Asn Asp Ala Cys Glu Asn Trp

20 25 30

Gly Phe Phe Glu Leu Val Asn His Gly Ile Pro His Glu Leu Met Asp

35 40 45

Lys Val Glu Lys Met Thr Lys Glu His Tyr Arg Lys Cys Met Glu Gln

50 55 60

Arg Phe Lys Glu Met Val Ala Ser Lys Gly Leu Asp Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Ile Asn Asp Thr Asp Trp Glu Ser Thr Phe Phe Leu Arg His Leu

85 90 95

Pro Val Ser Asn Met Ser Glu Ile Gly Asp Leu Asp Glu Glu Tyr Lys

100 105 110

Lys Val Met Lys Glu Phe Ala Ala Glu Leu Glu Lys Leu Ala Glu Glu

115 120 125

Ile Leu Asn Leu Leu Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Lys Gly Tyr Leu

130 135 140

Lys Lys Val Phe Tyr Gly Ser Lys Gly Pro Asn Phe Gly Thr Lys Val

145 150 155 160

Ser Asn Tyr Pro Pro Cys Pro Lys Pro Glu Leu Ile Lys Gly Leu Arg

165 170 175

Ala His Thr Asp Ala Gly Gly Leu Ile Leu Leu Phe Gln Asp Asp Lys

180 185 190

Val Ser Gly Leu Gln Leu Leu Lys Asp Gly Lys Trp Val Asp Val Pro

195 200 205

Pro Met His His Ser Ile Val Ile Asn Leu Gly Asp Gln Leu Glu Val

210 215 220

Ile Thr Asn Gly Lys Tyr Lys Ser Val Met His Arg Val Ile Ala Gln

225 230 235 240

Glu Asp Gly Asn Arg Met Ser Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Pro Gly Asn

245 250 255

Asp Ala Val Ile Tyr Pro Ala Pro Ala Leu Val Glu Gly Glu Gln Glu

260 265 270

Lys Thr Lys Leu Tyr Pro Lys Phe Val Phe Asp Asp Tyr Met Lys Leu

275 280 285

Tyr Met Gly Leu Lys Phe Gln Ala Lys Glu Pro Arg Phe Glu Ala Met

290 295 300

Lys Ala Met Glu Ser Thr Asn Ile Asn Met Gly Pro Ile Ala Thr Val

305 310 315 320

<210> 3

<211> 963

<212> DNA

<213> 黄瓜

<220>

<223> 突变ACO2

<220>

<221> misc_feature

<222> 278

<223> /注释="n = a或t或c或g"

<400> 3

atggagatgg atttccctgt catcaacatg aacaacctca atggcgaaag cagagtatct 60

gtcctgaacc aaatcaacga cgcctgcgaa aactggggtt tttttgagtt ggtgaatcat 120

gggataccac atgagctgat ggacaaagtg gagaagatga caaaggaaca ttatagaaag 180

tgcatggagc agaggtttaa agaaatggta gcttccaaag ggttggattc agtggaaact 240

gagatcaacg acactgattg ggaaagcact tttttttnac gccatcttcc agtttcaaac 300

atgtcagaaa ttggtgatct ggatgaggag tacaagaagg tgatgaagga atttgcagct 360

gaactggaga aattagcgga ggaaattctg aacttgttgt gtgagaatct tgggcttgaa 420

aaggggtatt tgaaaaaagt gttttatgga tcaaaaggcc caaactttgg gacaaaagtt 480

agcaattacc ctccatgtcc taaacctgag cttattaaag gacttagagc ccataccgat 540

gctggtggtc ttattcttct gtttcaagat gataaagtga gtgggcttca gctgctcaaa 600

gatggaaaat gggttgatgt tcctccgatg catcactcca ttgttatcaa tttaggagac 660

cagcttgaag taataacaaa tggaaaatac aagagtgtaa tgcacagagt gatagcacag 720

gaggatggaa acagaatgtc gatagcatca ttctacaatc caggaaacga cgccgtaatc 780

tatccggcgc cggcgctggt cgagggagag caggagaaaa ccaaacttta cccaaaattt 840

gtgttcgatg attacatgaa gctgtatatg gggcttaagt ttcaagcaaa agagccaagg 900

tttgaggcca tgaaagccat ggagtccacc aatatcaata tgggtccaat tgcaactgtc 960

tga 963

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 黄瓜

<220>

<223> 突变ACO2

<400> 4

Met Glu Met Asp Phe Pro Val Ile Asn Met Asn Asn Leu Asn Gly Glu

1 5 10 15

Ser Arg Val Ser Val Leu Asn Gln Ile Asn Asp Ala Cys Glu Asn Trp

20 25 30

Gly Phe Phe Glu Leu Val Asn His Gly Ile Pro His Glu Leu Met Asp

35 40 45

Lys Val Glu Lys Met Thr Lys Glu His Tyr Arg Lys Cys Met Glu Gln

50 55 60

Arg Phe Lys Glu Met Val Ala Ser Lys Gly Leu Asp Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Ile Asn Asp Thr Asp Trp Glu Ser Thr Phe Phe Tyr Ala Ile Phe

85 90 95

Gln Phe Gln Thr Cys Gln Lys Leu Val Ile Trp Met Arg Ser Thr Arg

100 105 110

Arg

<210> 5

<211> 154

<212> DNA

<213> 黄瓜

<220>

<223> 野生型标志物CS05484

<400> 5

aatggtagct tccaaagggt tggattcagt ggaaactgag atcaacgaca ctgattggga 60

aagcactttt tttttacgcc atcttccagt ttcaaacatg tcagaaattg gtgatctgga 120

tgaggagtac aagaaggtga tgaaggaatt tgca 154

<210> 6

<211> 154

<212> DNA

<213> 黄瓜

<220>

<223> 突变标志物CS05484

<220>

<221> misc_feature

<222> 75

<223> /注释="n = a或c或t或g"

<400> 6

aatggtagct tccaaagggt tggattcagt ggaaactgag atcaacgaca ctgattggga 60

aagcactttt ttttnacgcc atcttccagt ttcaaacatg tcagaaattg gtgatctgga 120

tgaggagtac aagaaggtga tgaaggaatt tgca 154

PCT/RO/134表

Claims

1.ACO2基因的突变等位基因，所述突变等位基因包含在SEQ ID NO:1的野生型ACO2基因核苷酸序列的DIOX_N结构域中的突变，其中所述突变如果纯合地存在于黄瓜植株的基因组中时形成仅产生雄花的黄瓜植株。

2.根据权利要求1所述的ACO2基因的突变等位基因，其中所述核苷酸序列SEQ ID NO:1的DIOX_N结构域中的所述突变导致SEQ ID NO:2的野生型ACO2蛋白质序列中的改变。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的ACO2基因的突变等位基因，其中所述核苷酸序列SEQ ID NO:1的DIOX_N结构域中的所述突变形成提前终止密码子。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的ACO2基因的突变等位基因，其中所述核苷酸序列SEQ ID NO:1的DIOX_N结构域中的所述突变包含缺失。

5.根据权利要求4所述的ACO2基因的突变等位基因，其中所述缺失是至少单个胸腺嘧啶核苷酸的缺失。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的ACO2基因的突变等位基因，其中所述突变是在SEQID NO:1的野生型核苷酸序列中的位置278处的核苷酸的缺失。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的ACO2基因的突变等位基因，所述突变等位基因包含SEQ ID NO:3。

8.一种黄瓜植株，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的ACO2基因的突变等位基因。

9.根据权利要求8所述的黄瓜植株，其包含纯合存在的所述ACO2基因的突变等位基因，并且所述植株仅产生雄花。

10.根据权利要求8或9所述的黄瓜植株，其中所述黄瓜植株是农艺优良植株。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的黄瓜植株，其中所述黄瓜植株是杂交品种植株或自交系植株。

12.一种黄瓜种子，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的ACO2基因的突变等位基因。

13.根据权利要求12所述的黄瓜种子，其包含纯合存在的所述ACO2基因的突变等位基因，并且其中由所述种子长成的植株仅产生雄花。

14.繁殖材料，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的ACO2基因的突变等位基因，并且其中所述繁殖材料选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生细胞、原生质体、或它们的细胞或组织培养物。

15.根据权利要求14所述的繁殖材料，其包含纯合存在的所述ACO2基因的突变等位基因，并且其中由所述繁殖材料得到的植株仅产生雄花。

16.用于鉴定包含突变ACO2等位基因的黄瓜植株的标志物，其中所述标志物包含在SEQID NO:1的野生型ACO2基因核苷酸序列的位置278处的核苷酸的缺失。

17.根据权利要求16所述的标志物，其包含SEQ ID NO:6。

18.获得仅产生雄花的植株的方法，所述方法包括：

a)将包含根据权利要求1-7中任一项所述的ACO2基因的突变等位基因的植株与包含或不包含所述ACO2基因的突变等位基因的植株杂交，获得F1群体；

b)进行一轮或多轮自交和/或将来自所述F1的植株杂交以进一步获得下一代群体；

c)选择仅产生雄花并且包含纯合存在的所述ACO2基因的突变等位基因的植株。

19.从植株群体中选择仅产生雄花的黄瓜植株的方法，所述方法包括检测植株群体中的植株的基因组中SEQ ID NO:1的位置278处的核苷酸缺失，并且选择包含纯合存在的所述缺失的植株。

20.鉴定、检测、基因型分型或选择包含根据权利要求1-7中任一项所述的ACO2基因的突变等位基因的黄瓜植株的方法，所述方法包括确定、检测、测量、定量或定性地探查或测定植株中存在或不存在基因组核苷酸序列或其部分，其中所述序列按照增加的偏好性顺序与SEQ ID NO:3具有95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。