CN105143454A - Acc氧化酶多核苷酸和多肽的组合物和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的转基因组合物和方法降低内源ACC氧化酶基因的表达以改进作物(其可为玉蜀黍)的农艺学特征。观察到由于内源ACC氧化酶水平的降低所致的产量提高和干旱耐受性。ACC氧化酶基因在玉蜀黍、水稻和拟南芥基因组中鉴定到。
Description
背景技术
非生物胁迫是全世界作物损失的主要原因，对主要作物造成超过50％的平均产量损失(Boyer，J.S.(1982)Science218：443-448(Boyer，J.S.，1982年，《科学》，第218卷，第443-448页)；Bray，E.A.etal.(2000)InBiochemistryandMolecularBiologyofPlants，editedbyBuchannan，B.B.etal.，Amer.Soc.PlantBiol.，pp.1158-1249)(Bray，E.A.等人，2000年，载于《植物的生物化学和分子生物学》，Buchannan，B.B.等人编辑，美国植物生物学家学会，第1158-1249页)。植物在各种发育阶段期间暴露于水有限的环境似乎激活各种生理和发育变化。因此，需要了解和操纵有助于干旱胁迫耐受性的生化机制和分子机制。
乙烯(C2H4)是影响植物中的多个发育过程和适应性响应，例如发芽、花和叶衰老、果实成熟、叶脱落、根结瘤、程序性细胞死亡以及对胁迫和病原体攻击的响应的气态植物激素。乙烯支配着植物中的许多过程，并且这些效应有时受到其他植物激素、其他生理信号以及生物环境和非生物环境的作用的影响。
乙烯是通过涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或AdoMet)向环状氨基酸1-氨基环丙烷-1-甲酸(ACC)的转化的生物合成途径从甲硫氨酸产生的，该转化由ACC合酶(ACS)促进。硫在该过程中通过循环5′-甲基硫代腺苷而得到保存。
ACC合酶是一种氨基转移酶，其通过将S-腺苷甲硫氨酸转化成ACC而催化乙烯的形成中的限速步骤。通常，该酶需要磷酸吡哆醛作为辅因子。
1-氨基环丙烷-1-甲酸氧化酶(ACO或ACC氧化酶)催化乙烯生物合成的最后阶段，将ACC和O2转化为乙烯、CO2、氰化物(HCN)和两个H2O。ACO酶是立体特异性的，并且使用辅因子例如Fe+2、O2、抗坏血酸盐等。某些保守位点对于该酶的活性结构和辅因子的结合是重要的。参见例如，Dilleyetal.(October2013).AoBPlants5：plt031(Dilley等人，2013年10月，AoBPlants5：plt031)。ACO的活性可被缺氧和钴离子抑制。
发明内容
本发明提供用于调节植物中的产量、干旱耐受性和/或氮利用效率以及调节(例如降低)植物中的乙烯生成的方法和组合物。本发明提供用于下调植物中的1-氨基环丙烷-1-甲酸氧化酶(ACO或ACC氧化酶)的水平和/或活性的组合物和方法。
某些实施方案提供用于调节植物中的ACO多核苷酸或多肽的表达的方法，包括开发和设置特异性RNAi构建体以产生具有改进的产量和/或改进的非生物胁迫耐受性的植物，所述非生物胁迫耐受性可包括改进的干旱耐受性、改进的密度耐受性和/或改进的NUE(氮利用效率)。在某些实施方案中，所述构建体和方法导致植物性能改进，同时在最佳条件下不损失产量。在某些实施方案中，所述构建体和方法导致不仅非生物胁迫条件下植物性能改进，而且在最佳条件下(例如，良好浇灌的条件下)植物性能改进。
某些实施方案提供改进作物植物的非生物胁迫耐受性的方法，该方法包括降低该作物植物中的ACC氧化酶基因的表达并在植物栽培环境中栽培该作物植物，在该环境中该作物植物暴露于非生物胁迫。
某些实施方案提供改进作物植物的干旱耐受性的方法；该方法包括降低该作物植物中的ACC氧化酶基因的表达并在植物栽培环境中栽培该作物植物，在该环境中该作物植物暴露于干旱胁迫。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因包含编码选自SEQIDNO：21-30、59、61、63、65、67、69、71和81-91的多肽或与所述多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因包含选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，ACC氧化酶基因被RNA干扰构建体下调，该RNA干扰构建体包含靶向从选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列转录的内源mRNA序列的核酸元件。
在一个实施方案中，ACC氧化酶基因包括选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列，并且其中该ACC氧化酶基因通过遗传修饰来下调。
某些实施方案提供耐受非生物胁迫的转基因玉蜀黍植物，该转基因玉蜀黍植物在其基因组中包含能下调内源ACO基因的表达的重组核酸，其中该ACO基因包含编码选自SEQIDNO：21-30和81-91的多肽的多核苷酸。非生物胁迫是干旱或低氮。在一个实施方案中，该重组核酸下调ACO2、ACO5和ACO6的表达。在一个实施方案中，该重组核酸序列包含选自SEQIDNO：41-43的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，在玉蜀黍植物中，ACO2被包含SEQIDNO：41的重组核酸序列抑制，ACO5被包含SEQIDNO：42的重组核酸序列抑制，ACO6被包含SEQIDNO：43的重组核酸序列抑制。在一个实施方案中，玉蜀黍植物在其基因组中包含同时下调ACO2、ACO5和ACO6的表达的核酸。
本发明公开了从本文描述的玉蜀黍植物产生的植物细胞。本发明公开了从本文描述的玉蜀黍植物产生的种子。
某些实施方案提供提高作物植物在干旱条件下的谷粒产量的方法。该方法包括降低作物植物中的乙烯的水平，其中乙烯水平的降低不伴随该作物植物内的ACC水平的降低，并且在作物栽培条件下栽培该作物植物，其中该作物植物暴露于干旱胁迫，从而提高该作物植物的谷粒产量。在一个实施方案中，作物植物是玉蜀黍。在一个实施方案中，通过下调编码ACC氧化酶的基因降低乙烯水平。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因包含编码选自SEQIDNO：21-30、59、61、63、65、67、69、71和81-91的多肽或与所述多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因包含选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，通过靶向ACC氧化酶基因所有效连接的启动子来下调ACC氧化酶基因。该启动子可为SEQIDNO：72-80和99-108中示出的玉蜀黍ACO启动子中的任何一个，或者与所述全长启动子具有至少95％同一性的序列。被下调的ACC氧化酶基因和被靶向的启动子可相对于彼此为天然的或异源的。
某些实施方案提供基因下调构建体，该构建体包含被转录成多个干扰性RNA转录物的分离核酸，其中该干扰性RNA转录物降低编码选自SEQIDNO：21-30、59、61、63、65、67、69、71和81-91的多个多肽或与所述多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列的多个多核苷酸序列的表达。在一个实施方案中，该构建体为发夹构建体。
本发明公开了包含本文所描述的重组核酸和构建体的载体。
某些实施方案提供下调玉蜀黍植物中的内源ACC氧化酶基因的方法；该方法包括表达能降低选自SEQIDNO：1-20的内源ACC氧化酶或所述序列的等位基因变体的表达的重组核酸构建体。在一个实施方案中，通过包含选自SEQIDNO：41-43的多核苷酸序列的重组构建体来降低内源ACC氧化酶基因的表达。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因选自SEQIDNO：3-6、11-12、32-33、36和39或选自作为SEQIDNO：3-6、11-12、32-33、36和39的等位基因变体的核苷酸序列。在一个实施方案中，ACC氧化酶基因是ACO2。在一个实施方案中，ACC氧化酶基因包含编码选自SEQIDNO：22和23的多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，作物植物是单子叶植物。
某些实施方案提供从玉蜀黍植物群体中选择干旱耐受性提高的玉蜀黍植物的方法，该方法包括针对ACO基因的表达的降低来对植物群体进行筛选，该ACO基因选自SEQIDNO：1-20或所述序列的等位基因变体。在一个实施方案中，玉蜀黍群体是近交系群体。
相比于针对乙烯合成途径的较前步骤(特别是在玉蜀黍中)的其他转基因乙烯操纵策略，ACC氧化酶的下调具有优点。例如，ACC在植物中的迁移性可提高通过ACO的定向下调进行定向的、组织特异性的乙烯降低的机会。此外，玉蜀黍ACO转录物水平相对地高于玉蜀黍ACC合酶水平；这提供更多的降低机会和更宽的调节表达水平的范围。此外，ACO的较高的天然转录物水平有利于使用Northern或qPCR方法鉴定有效的下调事件。
附图说明
图1.ACC氧化酶基因的基于所编码的蛋白质的系统树关系。
图2显示对于15个转基因事件(E1-E15)，与对照(Cntrl)比较，靶向ACO2的RNAi构建体有效地降低了内源ACO2转录物水平，如实施例2中所描述。
图3显示对于10个转基因事件(E1-E10)，通过靶向ACO2、ACO5和ACO6的RNAi构建体的表达，与对照(Cntrl)比较，内源ACO2、ACO5和ACO6表达不同程度地降低，如实施例3中所描述。
图4提供来自玉蜀黍和其他物种的ACO和ACO样蛋白序列的系统树。从上到下阅读，各系统树条目对应于SEQIDNO：98、26、25、28、27、82、83、30、84、85、87、86、29、81、22、21、97、96、92、94、93、95、91、90、89、88。
图5提供来自玉蜀黍的ACO蛋白序列的系统树。从上到下阅读，各系统树条目对应于SEQIDNO：98、84、85、86、87、29、81、22、21、83、30、26、25、28、27、82、91、90、89、88。
图6(6A至6I)提供已鉴定的玉蜀黍ACO蛋白序列和来自其他植物物种的已知ACO蛋白序列的比对，参考Swiss-Prot编号。每个分图从上到下阅读，各比对条目对应于SEQIDNO：85、84、86、87、29、25、26、27、28、82、30、83、22、81、21、88、89、90、91、93、95、94、96、97、92。
序列说明
表1.序列的说明
| SEQ ID | 名称 |
| 1 | ZmACO1_被转录 |
| 2 | ZmACO1_cds |
| 3 | ZmACO2-1_被转录 |
| 4 | ZmACO2-1_cDNA |
| 5 | ZmACO2-2_被转录 |
| 6 | ZmACO2-2_cDNA |
| 7 | ZmACO3_被转录 |
| 8 | ZmACO3_cDNA |
| 9 | ZmACO4_被转录 |
| 10 | ZmACO4_cDNA |
| 11 | ZmACO5_被转录 |
| 12 | ZmACO5_cDNA |
| 13 | ZmACO8-1_被转录 |
| 14 | ZmACO8-1_cDNA |
| 15 | ZmACO8-3_被转录 |
| 16 | ZmACO8-3_cDNA |
| 17 | ZmACO6_被转录 |
| 18 | ZmACO6_cDNA |
| 19 | ZmACO9_被转录 |
| 20 | ZmACO9_cDNA |
| 21 | ZmACO1_氨基酸ZmACO1_dpzm07g030150 |
| 22 | ZmACO2-1_氨基酸ZmACO2_dpzm05g069900 |
| 23 | ZmACO2-2_氨基酸 |
| 24 | ZmACO3_氨基酸 |
| 25 | ZmACO4_氨基酸ZmACO4_dpzm10g023650 |
| 26 | ZmACO5_氨基酸ZmACO5_dpzm10g023820 |
| 27 | ZmACO8-1_氨基酸ZmACO8-1_dpzm10g023810 |
| 28 | ZmACO8-3_氨基酸ZmACO8-3_dpzm10g023790 |
| 29 | ZmACO6_氨基酸ZmACO6_dpzm08g039960 |
| 30 | ZmACO9_氨基酸ZmACO9_dpzm04g063220 |
| 31 | ZmACO1_基因组 |
| 32 | ZmACO2-1_基因组 |
| 33 | ZmACO2-2_基因组 |
| 34 | ZmACO3_基因组 |
| 35 | ZmACO4_基因组 |
| 36 | ZmACO5_基因组 |
| 37 | ZmACO8-1_基因组 |
| 38 | ZmACO8-3_基因组 |
| 39 | ZmACO6_基因组 |
| 40 | ZmACO9_基因组 |
| 41 | 构建体_1(ACO2)Zm ACO2(TR1) |
| 42 | 构建体_2(ACO5) |
| 43 | 构建体_3(ACO6) |
| 44 | AT1G03400.1_DNA |
| 45 | AT1G03400.1_氨基酸 |
| 46 | AT1G62380.1_DNA_ACO2 |
| 47 | AT1G62380.1_氨基酸_ACO2 |
| 48 | AT2G19590.1_DNA_ACO1 |
| 49 | AT2G19590.1_氨基酸_ACO1 |
| 50 | AT2G25450.1_DNA |
| 51 | AT2G25450.1_氨基酸 |
| 52 | AT5G43440.1_DNA |
| 53 | AT5G43440.1_氨基酸 |
| 54 | AT5G43440.2_DNA |
| 55 | AT5G43440.2_氨基酸 |
| 56 | AT5G43450.1_DNA |
| 57 | AT5G43450.1_氨基酸 |
| 58 | Os02g0771600_ACO2_DNA |
| 59 | Os02g0771600_ACO2_氨基酸 |
| 60 | Os09g0451000_ACO1_DNA |
| 61 | Os09g0451000_ACO1_氨基酸 |
| 62 | Os09g0451400_DNA |
| 63 | Os09g0451400_氨基酸 |
| 64 | Os01g0580500_DNA |
| 65 | Os01g0580500_氨基酸 |
| 66 | Os11g0186900_DNA |
| 67 | Os11g0186900_氨基酸 |
| 68 | Os05g0149400_DNA |
| 69 | Os05g0149400_氨基酸 |
| 70 | Os05g0149300_DNA |
| 71 | Os05g0149300_氨基酸 |
| 72 | ZmACO1启动子 |
| 73 | ZmACO2启动子 |
| 74 | ZmACO3启动子 |
| 75 | ZmACO4启动子 |
| 76 | ZmACO5启动子 |
| 77 | ZmACO6启动子 |
| 78 | ZmACO8-1启动子 |
| 79 | ZmACO8-2启动子 |
| 80 | ZmACO9启动子 |
| 81 | ZmACO3_dpzm04g050830 |
| 82 | ZmACO8-2_dpzm10g023800 |
| 83 | ZmACO10_dpzm02g042150 |
| 84 | ZmACO11_dpzm05g039600 |
| 85 | ZmACO12_dpzm06g030030 |
| 86 | ZmACO13_dpzm02g059270 |
| 87 | ZmACO14_dpzm09g030560 |
| 88 | ZmACO样1_dpzm09g003610 |
| 89 | ZmACO样2_dpzm10g009300 |
| 90 | ZmACO样3_dpzm10g026560 |
| 91 | ZmACO样4_dpzm03g004590 |
| 92 | 拟南芥_ACCO4(Q06588) |
| 93 | 绿豆_ACO(Q2KTE3) |
| 94 | 番木瓜_ACO2(Q9ZRC9) |
| 95 | 苹果_ACCO1(Q00985) |
| 96 | 矮牵牛_ACCO1(Q08506) |
| 97 | 番茄_ACCO4(P24157) |
| 98 | 根_ZmUbiquitin dpzm05g032140 |
| 99 | ACO8-3启动子 |
| 100 | ACO12启动子 |
| 101 | ACO14启动子 |
| 102 | ACO10启动子 |
| 103 | ACO13启动子 |
| 104 | ACO样-4启动子 |
| 105 | ACO11启动子 |
| 106 | ACO样-1启动子 |
| 107 | ACO样-2启动子 |
| 108 | ACO样-3启动子 |
随本文提供了存储在电子介质中的序列表。遵照美国专利法施行细则第37篇第1.52条(e)项(37CFR1.52(e))，将该序列表的内容以引用方式并入本文。
具体实施方式
ACC氧化酶(ACO)的调节提供操纵ACC以降低乙烯水平从而提高非生物胁迫耐受性特别是干旱耐受性的方法。
ZmACO的调节可与其他方法如ACC合酶(ACS)表达的操纵组合使用，以降低乙烯水平从而提高干旱耐受性。可靶向特定的组织以调节ACO和/或ACS。ACC在植物中具有高度的迁移性，可执行几种选择方案来调节ACC水平，包括例如ACO下调或ACS下调或这两者的组合。ZmACORNAi构建体是有效的，因为内源ZmACO转录物水平相对较高。
在某些实施方案中，本发明涉及含有包含下调构建体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在某些实施方案中，本发明的植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。优选的含有所述多核苷酸的植物包括但不限于玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、番茄和小米。在某些实施方案中，转基因植物是玉蜀黍植物或植物细胞。包含如本文所描述的转基因下调构建体的转基因种子是一个实施方案。在一个实施方案中，植物细胞在相对于对照而言包含改进的干旱耐受性和/或改进的氮利用效率和/或改进的产量的杂种或近交系植物中。植物可包含这类表型的组合。从本发明的植物细胞再生的植物也是一个实施方案。
某些实施方案与对照植物相比具有改进的干旱耐受性。本发明植物的改进的干旱耐受性可反映例如但不限于以下各生理方面：与相应的对照植物相比，(a)至少一种ACO编码mRNA的生成的下降；(b)ACO的生成的下降；(c)ACC的生成的下降；(d)乙烯的生成的下降；(e)植株高度的提高或者(f)(a)-(e)的任何组合。表现出改进的干旱耐受性的植物也可表现出一种或多种另外的非生物胁迫耐受性表型，如改进的氮利用效率或提高的密度耐受性。
某些实施方案提供改进作物植物的非生物胁迫耐受性的方法；该方法包括降低该作物植物中的ACC氧化酶基因的表达并在植物栽培环境中栽培该作物植物，在该环境中该作物植物暴露于非生物胁迫。非生物胁迫可包括营养物胁迫、水胁迫、干旱、寒冷、冷却(chilling)、霜冻、盐、热和氮胁迫。
某些实施方案提供改进作物植物的干旱耐受性的方法；该方法包括降低该作物植物中的ACC氧化酶基因的表达并在植物栽培环境中栽培该作物植物，在该环境中该作物植物暴露于干旱胁迫或在很可能导致水胁迫的条件中栽培。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因包含编码选自SEQIDNO：21-30、59、61、63、65、67、69、71和81-91的多肽或与所述多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因包含选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，ACC氧化酶基因被RNA干扰构建体下调，该RNA干扰构建体包含靶向从或作为选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列转录的内源mRNA序列的核酸元件。
在一个实施方案中，ACC氧化酶基因包含选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列，并且其中该ACC氧化酶基因通过遗传修饰来下调。
某些实施方案提供耐受非生物胁迫的转基因玉蜀黍植物，该转基因玉蜀黍植物在其基因组中包含能下调内源ACO基因的表达的重组核酸，其中该ACO基因包含编码选自SEQIDNO：21-30和81-91的多肽的多核苷酸。非生物胁迫是干旱或低氮。在一个实施方案中，该重组核酸下调ACO2、ACO5和ACO6的表达。在一个实施方案中，该重组核酸序列包含选自SEQIDNO：41-43的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，在玉蜀黍植物中，ACO2被包含SEQIDNO：41的重组核酸序列抑制，ACO5被包含SEQIDNO：42的重组核酸序列抑制，ACO6被包含SEQIDNO：43的重组核酸序列抑制。在一个实施方案中，玉蜀黍植物在其基因组中包含同时下调ACO2、ACO5和ACO6的表达的核酸。
本发明公开了从本文描述的玉蜀黍植物产生的植物细胞。本发明公开了从本文描述的玉蜀黍植物产生的种子。
某些实施方案提供提高作物植物在干旱条件下的谷粒产量的方法；该方法包括降低作物植物中的乙烯的水平，其中乙烯水平的降低不伴随该作物植物内的ACC水平的降低，并且在作物栽培条件下栽培该作物植物，其中该作物植物暴露于干旱胁迫，从而提高该作物植物的谷粒产量。在一个实施方案中，作物植物是玉蜀黍。在一个实施方案中，通过下调编码ACC氧化酶的基因来降低乙烯水平。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因包含编码选自SEQIDNO：21-30、59、61、63、65、67、69、71和81-91的多肽或与所述多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因包含选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列。
某些实施方案提供基因下调构建体，该构建体包含被转录成多个干扰性RNA转录物的分离核酸，其中该干扰性RNA转录物降低编码选自SEQIDNO：21-30、59、61、63、65、67、69、71和81-91的多个多肽或与所述多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列的多个多核苷酸序列的表达。在一个实施方案中，该构建体为发夹构建体。
某些实施方案提供包含本文所描述的重组核酸和构建体的载体。该载体可为植物可表达的载体或含有植物可表达的调节元件。合适的启动子包括干旱诱导型启动子如Rab17和Rd29a。
某些实施方案提供下调玉蜀黍植物中的内源ACC氧化酶基因的方法；该方法包括表达能降低选自SEQIDNO：1-20的内源ACC氧化酶或所述序列的等位基因变体的表达的重组核酸构建体。在一个实施方案中，通过包含选自SEQIDNO：41-43的多核苷酸序列的重组构建体来降低内源ACC氧化酶基因的表达。在一个实施方案中，被下调的ACC氧化酶基因选自SEQIDNO：3-6、11-12、32-33、36和39或选自作为SEQIDNO：3-6、11-12、32-33、36和39的等位基因变体的核苷酸序列。等位基因变异可在基因或基因组基因座的编码区或启动子或内含子区域中出现。在一个实施方案中，ACC氧化酶基因是ACO2。在一个实施方案中，ACC氧化酶基因包含编码选自SEQIDNO：22和23的多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，作物植物是单子叶作物植物，如玉蜀黍、水稻、高粱和小麦。在一个实施方案中，双子叶作物植物包括例如大豆和芸苔属。
某些实施方案提供从玉蜀黍植物群体中选择干旱耐受性提高的玉蜀黍植物的方法；该方法包括针对ACO基因的表达的降低来对植物群体进行筛选，该ACO基因选自SEQIDNO：1-20或所述序列的等位基因变体。在一个实施方案中，玉蜀黍群体是近交系群体。这种筛选还可包括对本文所公开的ACO基因的基因组基因座进行测序。在一个实施方案中，筛选可包括分析ACO的mRNA水平或蛋白质水平。
调节植物的干旱耐受性的方法也是本发明的特征。将不同程度的干旱耐受性引入到植物中的能力给本发明的使用提供了灵活性：例如在具有较长或较干燥的生长季节的地区引入强干旱耐受性以改进灌浆或进行青贮，相比之下在具有较短生长季节的农业地区引入中等的干旱耐受性以进行青贮。本发明的植物的干旱耐受性的调节可反映以下一个或多个方面：与相应的对照植物相比，(a)至少一种ACO编码mRNA的生成的下降；(b)ACO的生成的下降；(c)乙烯的生成的下降；(d)植株高度的提高或者(f)(a)-(e)的任何组合。
例如，方法包括：(a)选择至少一种ACO基因；(b)将靶向该选择的ACO基因的表达的多核苷酸引入到植物中；并且(c)表达该多核苷酸，从而调节该植物的干旱耐受性。由这种方法产生的植物也是本发明的一个特征。引入到植物中的干旱耐受性的程度可通过多种因素来确定，例如，选择哪种ACO基因，所引入的多核苷酸是以杂合状态还是纯合状态存在，或者通过ACO基因家族的被失活的成员的数目来确定，或者通过两个或多个这类因素的组合来确定。
一旦选择了所需的ACO基因，就将靶向该ACO基因的表达的多核苷酸引入到植物中。在某些实施方案中，该多核苷酸通过农杆菌介导的转移、电穿孔、微粒轰击、同源重组或有性杂交来引入。在某些实施方案中，该多核苷酸包含该选择的ACO基因的呈反义、有义或RNA沉默或干扰构型的亚序列。在某些实施方案中，选择超过一种ACO基因进行靶向。在某些实施方案中，多核苷酸可靶向超过一种ACO基因。在某些实施方案中，使用多个多核苷酸来靶向所选择的ACO基因。
靶向ACO基因的多核苷酸的表达可通过多种方式来测定。例如，表达产物的检测是定性进行(是否存在一种或多种目的产物)或定量进行(通过监测一种或多种目的产物的表达水平)。在一个实施方案中，表达产物为RNA表达产物。本发明任选包括监测本文所指出的核酸或多肽的表达水平以检测植物中或植物群体中的ACO。监测乙烯或ACC的水平也可起到检测ACO基因对表达或活性的下调的作用。
所谓“开花胁迫”是指在开花期或开花期前后植物没有水分供应而出现干旱胁迫。
所谓“灌浆胁迫”是指在种子积累贮藏产物(碳水化合物、蛋白质和/或油)的时期植物没有水分供应而出现干旱胁迫。
所谓“雨养条件”是指没有故意地不供应水，也没有人工补充水。
所谓“良好浇灌条件”是指可供给植物的水通常足够以使生长最佳。
可控制玉蜀黍的干旱胁迫条件以导致所定的产量降低目标。例如，通过在植物发育的特定时期提供量好数量的水，可实现比对照植物的产量下降达20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。
“干旱”指对植物的供水下降，这种下降尤其当长时间出现时或当在关键生长期出现时会对该植物造成损害或阻碍它的成功生长(例如，限制植物生长或种子产量)。
“干旱耐受性”反映植物在干旱下生存而不表现出实质的生理或物理退化的能力，和/或植物在干旱期过后重新有水时恢复的能力。
多肽的“干旱耐受性活性”表示该多肽在转基因植物中的过量表达赋予该转基因植物相对于参考或对照植物提高的干旱耐受性。
植物的“提高的干旱耐受性”是相对于参考或对照植物测量的，并且反映该植物在干旱条件下生存且在相似的干旱条件下生理或物理退化比参考或对照植物少的能力，或者该植物在干旱期过后重新有水时恢复得比对照植物更充分和/或更快的能力。
除了提高植物对干旱胁迫的耐受性以外，本发明还可以使得能够以较高的密度种植本发明的植物，从而导致每英亩的产量提高。例如在玉蜀黍中，过去一个世纪以来，每英亩产量的提高大部分是来自于提高对密度的耐受性，密度是一种对植物的胁迫。调节植物胁迫应答例如提高对密度的耐受性的方法，也是本发明的一个特征。例如，本发明的方法可包括：(a)选择至少一种ACO基因；(b)将靶向该选择的ACO基因的表达的多核苷酸引入到植物中；并且(c)表达该多核苷酸，从而调节该植物的密度耐受性。由这种方法产生的植物也是本发明的一个特征。当通过调节ACO基因的表达来降低植物中的乙烯生成时，该植物可具有降低的对密度的感觉和/或应答。因此，本发明的植物可以更高的密度来种植，并且导致种子和/或生物量的产量提高。
除了提高植物对干旱胁迫的耐受性和改进植物的密度耐受性以外，本发明还可提供更高的氮利用效率(NUE)。例如，本发明的方法可包括：(a)选择至少一种ACO基因；(b)将靶向该选择的ACO基因的表达的多核苷酸引入到植物中；并且(c)表达该多核苷酸，从而调节该植物的NUE。由这种方法产生的植物也是本发明的一个特征。NUE反映植物吸收、同化和/或以别的方式利用氮的能力。
NUE得到改进的植物可在氮供应充足的可比条件下比对照植物具有更高的生产率，和/或可在氮供应显著降低的情况下维持生产率。改进的NUE可反映在一个或多个属性，如生物量提高、谷粒产量提高、收获指数提高、光合速率提高和对生物或非生物胁迫的耐受性提高。特别是，改进玉蜀黍中的NUE将提高每单位输入氮肥的可收获产量，这在氮肥供应有限的发展中国家和在氮使用水平保持较高的发达国家都如此。
可通过多种方法，例如基因型法、生物化学法、表型法，或通过这些方法中的两者或更多者的任何组合来筛选和/或表征植物。例如，可对植物进行表征以确定本发明的多核苷酸是否存在和/或表达水平(例如数量、调节，如相比于对照细胞是降低还是提高)；本发明的多肽是否存在、表达和/或酶活性；和/或干旱耐受性的调节、氮利用效率的调节、密度耐受性的调节和/或乙烯生成的调节。
可从细胞提取物回收诸如ACC和乙烯的分子并进行测定。例如，酸性植物提取物中的内部ACC浓度，可通过在碱性次氯酸盐溶液等中进行分解后作为乙烯通过LC-MS(液相色谱-质谱法)进行测定。乙烯的浓度可例如通过气相色谱-质谱法等进行测定。参见例如Nagahama，etal.，(1991)J.Gen.Microbiol.137：22812286(Nagahama等人，1991年，《普通微生物学杂志》，第137卷，第22812286页)。例如，可用装有例如基于氧化铝的柱子(如HP-PLOTA1203毛细管柱(安捷伦技术公司，美国加州圣克拉拉市(AgilentTechnologies，SantaClara，CA)))和火焰离子化检测器的气相色谱仪测量乙烯。
表型分析包括例如分析植物的化学组成、形态或生理性质的变化。例如，表型变化可包括但不限于干旱耐受性的提高、密度耐受性的提高、氮利用效率的提高和乙烯生成的下降。
有多种测定法可用于监测耐旱性和/或NUE。例如，测定法包括但不限于目视检查，监测光合作用测量，以及测量例如叶子在胁迫和非胁迫条件下的叶绿素、DNA、RNA和/或蛋白质含量水平。
例如，将植物在正常和干旱胁迫条件下的田间进行栽培。在正常条件下，给植物浇水，水量足以获得最佳的生长和产量。对于干旱胁迫植物，在授粉前大约一周开始并继续至授粉后三周的时间段内可限制水。在限制水供应的时间段内，受干旱胁迫的植物可能显示出萎蔫和卷叶的可见迹象。胁迫的程度可相对于在良好浇灌的条件下获得的产量按产量下降百分数计算。用便携式TPS-1光合作用系统(PPSystems公司，美国马萨诸塞州埃姆斯伯里镇(PPSystems，Amesbury，MA))测定蒸腾作用、气孔导度和CO2同化。例如在授粉后四十天，可测量植物上的每片叶子。数值通常表示为六次测定的平均值。
术语“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理特征、形态特征、生化特征或物理特征。在一些情况中，这个特征是人眼可见的，如种子或植物大小，或者可通过生化技术测量，如测定种子或叶子的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢过程或生理过程来测量，例如测量对水缺乏或者特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一种或多种基因的表达水平来测量，或者通过农业观察如渗透压胁迫耐受性或产量来测量。
“农艺学特征”是一种可测量的参数，包括但不限于：绿色、谷粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、干旱耐受性、氮吸收、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高度、穗长度、盐耐受性、分蘖数目、圆锥花序大小、早期幼苗活力和低温胁迫下的出苗率。
提高的生物量可例如作为与对照植物相比植物高度、植物总叶面积、植物鲜重、植物干重或植物种子产量的提高来测量。
提高植物的生物量或大小的能力将具有几个重要的商业应用。可开发作物栽培种以产生该植物的营养部分的更高产量，以便用于食品、饲料、纤维和/或生物燃料。
提高的叶子大小可特别有意义。提高的叶子生物量可以用于提高植物衍生的药用或工业产品的生产。提高的分蘖数目可特别有意义，并且可用于提高产量。总植物光合作用的提高通常通过提高该植物的叶面积来实现。额外的光合作用能力可用来提高源自特定的植物组织(包括叶子、根、果实或种子)的产量，或者使得植物可以在降低的光强度下或在高的光强度下生长。
对另一组织如根组织的生物量的修饰可用于改进植物在恶劣环境条件(包括干旱或营养物缺乏)下生长的能力，因为较大的根可更好地接触到或吸收水或营养物。
对于一些观赏植物，提供更多的品种的能力将是非常合乎需要的。对于许多植物，包括结果实的树木、用于生产木材的树木或充当视线屏障或挡风屏障的树木和灌木，提高的植株高度可提供改进的有益效果，如以更大的产量或改进的屏障作用的形式提供改进的有益效果。
“转基因”指任何其基因组已因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及那些通过从最初的转基因事件进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因事件在内。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)变更。
“基因组”应用于植物细胞时，不仅涵盖细胞核内存在的染色体DNA，而且涵盖细胞的亚细胞组分(例如线粒体或者质体)中存在的细胞器DNA。
“后代”包括植物的任何后续各代。
“转基因植物”包括指涉在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独地或者作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。T0植株从转化或再生过程直接回收。T0植株的后代称为T1(第一后代)、T2(第二后代)，以此类推。
指涉序列的“异源”意指起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用，并指单链或双链的RNA或DNA聚合物，其任选含有合成的、非天然的或变更的核苷酸碱基。核苷酸(通常以其5′-单磷酸盐形式存在)用其如下的单字母代码指代：“A”指代腺苷酸或脱氧腺苷酸，“C”指代胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指代鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，分别对于RNA或DNA；“U”指代尿苷酸；“T”指代脱氧胸苷酸；“R”指代嘌呤(A或G)；“Y”指代嘧啶(C或T)；“K”指代G或T；“H”指代A或C或T；“I”指代肌苷；“N”指代任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可以包括如下修饰，包括但不限于：糖基化、脂质连接、以及硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA)”指没有内含子且可被细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补且用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的，或者可用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链形式。
“成熟”蛋白质指翻译后加工的多肽；即，初级翻译产物中存在的任何原肽或者前肽已被移除。
“前体”蛋白质指mRNA的翻译的初级产物；即，仍存在原肽和前肽。原肽和前肽可以是且不限于胞内定位信号。
“分离的”指诸如核酸分子和/或蛋白之类的物质，该物质实质上不含或另外移除了在天然的环境中通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的多核苷酸可从其中它们天然出现的宿主细胞纯化。可使用本领域技术人员知道的常规核酸纯化方法来获得分离的多核苷酸。该术语还涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组的”指序列的两个本来分开的区段例如通过化学合成人工组合在一起，或者通过用遗传工程技术对核酸的分离的区段进行操纵人工组合在一起。“重组”还包括指代已通过引入异源核酸进行了修饰的细胞或载体，或源自经如此修饰的细胞的细胞，但不涵盖天然事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)如不经蓄意人为干预而发生的那些事件对细胞或载体的变更。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中通常存在的方式排列的调节序列和编码序列。
术语“条目克隆(entryclone)”和“条目载体(entryvector)”在本文中可互换使用。
“调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)并且影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷化作用识别序列。术语“调节序列”和“调节元件”在本文中可互换使用。
“启动子”指能够控制另一核酸片段的转录的核酸片段。启动子可与该第二核酸片段有效连接。
“在植物中有功能的启动子”是能够控制植物细胞中的基因的转录的启动子，无论其来源是否为植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织偏好的启动子”可指主要但未必专门在一种组织或器官中表达、但还可在一种特定的细胞或细胞类型中表达的启动子。
“发育调节启动子”指其活性被发育事件决定的启动子。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(例如，导致产生mRNA或功能性RNA的转录)和/或mRNA翻译成前体蛋白质或成熟蛋白质。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
在将核酸片段(例如，重组DNA构建体)插入细胞中的语境中，“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指代将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。在另一个语境中，“引入”通过有性杂交来实现。
“转化细胞”是任何已引入了核酸片段(例如重组DNA构建体)的细胞。
本文所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指核酸片段引入到宿主生物体的基因组中，从而得到遗传上稳定的遗传性。一旦稳定转化，核酸片段稳定整合在宿主生物体和后续任一代的基因组中。
“瞬时转化”指核酸片段引入到宿主生物体的细胞核或含DNA的细胞器中，导致基因表达，但不得到遗传上稳定的遗传性。
“等位基因”是基因的占据染色体上给定基因座的两种或更多种可选形式之一。当双倍体植物中的一对同源染色体上给定基因座处存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果双倍体植物中的一对同源染色体上特定基因座处存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果双倍体植物中的一对同源染色体中的一个染色体上存在转基因，则该植物在该基因座处是半合的。
本领域普通技术人员熟悉用于模拟干旱条件并评估已经历模拟的或天然的干旱条件的植物的干旱耐受性的方案。例如，可以通过在一定时间里给予植物比通常所需的水量少的水或不给予水来模拟干旱条件，并且可通过观察并测量生理条件和/或物理条件的差异来评估干旱耐受性，所述差异包括(但不限于)活力、总体生长、叶颜色、或一种或更多种组织(例如叶或根)的大小和生长速率的差异。其他用于评估干旱耐受性的技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率和气体交换速率。
干旱胁迫实验可涉及长期胁迫(即慢慢干燥)和/或可涉及两次短期胁迫(即突然去除水分)，在两次短期胁迫中间有一两天的恢复期。长期胁迫可持续8至20天。短期胁迫可持续3至15天。在对转基因植物和相关的对照植物进行干旱胁迫处理和良好浇灌处理期间可测量以下变量：
变量“面积变化％_长期胁迫开始-短期胁迫2”是通过可见光谱遥感成像测定的长期胁迫第一天与第二次短期胁迫当天之间总面积的变化百分数的度量。
变量“面积变化％_长期胁迫开始-长期胁迫结束”是通过可见光谱遥感成像测定的长期胁迫第一天与长期胁迫最后一天之间总面积的变化百分数的度量。
变量“面积变化％_长期胁迫开始-收获”是通过可见光谱遥感成像测定的长期胁迫第一天与收获当天之间总面积的变化百分数的度量。
变量“面积变化％_长期胁迫开始-恢复24小时”是通过可见光谱遥感成像测定的长期胁迫第一天与恢复24小时(短期胁迫2之后24小时)之间总面积的变化百分数的度量。
变量“psii_短期胁迫1”是第一个短期胁迫期结束时光合系统II(PSII)效率的度量。它提供光被PSII天线吸收的效率的估计量，并且与叶子内的二氧化碳同化直接相关。
变量“psii_短期胁迫2”是第二个短期胁迫期结束时光合系统II(PSII)效率的度量。它提供光被PSII天线吸收的效率的估计量，并且与叶子内的二氧化碳同化直接相关。
变量“fv/fm_短期胁迫1”是第一个短期胁迫结束时最佳量子产率(Fv/Fm)的度量-(最大和最小荧光之间的可变荧光差/最大荧光)。
变量“fv/fm_短期胁迫2”是第二个短期胁迫结束时最佳量子产率(Fv/Fm)的度量-(最大和最小荧光之间的可变荧光差/最大荧光)。
变量“卷叶_收获”是收获当天顶部图像与侧面图像的比率的度量。
变量“卷叶_恢复24h”是恢复24小时(h)时顶部图像与侧面图像的比率的度量。
变量“比生长速率(SGR)”表示在单日里总植物表面积的变化(通过LemnaTec仪器测量)(Y(t)＝Y0*er*t)。Y(t)＝Y0*er*t相当于Y/Δt的变化百分数，其中各个术语如下：Y(t)＝t时的总表面积；Y0＝最初总表面积(估计)；r＝比生长速率天-1，t＝种植后天数(“DAP”)。
变量“苗干重”是苗在放入104℃烘箱中96h后的重量的度量。
变量“苗鲜重”是苗在刚从植物切下后的重量的度量。
土壤植物分析发展(soilplantanalysesdevelopment，SPAD)值是通过SPAD-502plus(一种叶绿素计，由柯尼卡美能达(KONICAMINOLTA)制造)测量的SPAD读数。SPAD值是叶子叶绿素的相对含量，并且是植物健康的重要指示。许多研究表明在叶子氮含量和SPAD值之间观察到显著正相关性(SwainD.K.andSandipS.J.(2010)JournalofAgronomy9(2)：38-44)(SwainD.K.和SandipS.J.，2010年，《农艺学杂志》，第9卷，第2期，第38-44页)，并且叶子SPAD值被用作作物的氮状态诊断的指标(CaiH.-G.etal.(2010)Actametallurgicasinica16(4)：866-873)(CaiH.-G.等人，2010年，《中国金属学报》，第16卷，第4期，第866-873页)。
SPAD值在低氮处理期间测量。
下文的实施例描述一些用于模拟干旱条件和/或评估干旱耐受性的代表性方案和技术。
还可以通过在模拟的或天然的干旱条件下的大田试验中植物维持充分的产率(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％产率)的能力来评估干旱耐受性(例如，通过测量干旱条件下与非干旱条件相比而言产率实质上等同，或者通过测量干旱条件下产率损失与对照或参考植物所表现出的产率损失相比而言较少)。
诸如基因表达水平、水利用效率、编码的蛋白质的水平或活性的参数以及其他参数通常是对比对照细胞或对照植物来给出。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量其中已针对目的基因实现了遗传变更(如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。本领域普通技术人员当评估或测量本文所描述的转基因植物的农艺特征或表型时会容易地确认所要采用的合适的对照或参考植物。
本发明的转化植株可用于植物育种方案中。植物育种的目的是在单个品种或杂种中组合多种期望的性状。对于田地作物，这些性状可包括例如对病害和昆虫的抗性、对热和干旱的耐受性、对冷却或冰冻的耐受性、作物成熟的时间缩短、较高的产量和更好的农艺品质。随着对许多作物的机械化采收，诸如萌发和建植(standestablishment)、生长速率、成熟度以及植株和穗高之类的植物特性的均匀性是所期望的。传统的植物育种是开发新的和改良的商品作物的重要工具。本发明涵盖通过将第一亲本玉蜀黍植株与第二亲本玉蜀黍植株进行杂交来产生玉蜀黍植株的方法，其中所述亲本玉蜀黍植株中的一者或两者是如本文所述表现出干旱耐受性表型、不育表型、密度耐受性表型等的转化植株。
本领域知道的和玉蜀黍植株育种方案中使用的植物育种技术包括但不限于轮回选择、批量选择(bulkselection)、混合选择、回交、谱系培育、自由授粉育种、限制性片段长度多态性增强的选择、遗传标志物增强的选择、双单倍体和转化。往往使用这些技术的组合。
玉蜀黍植株育种方案中玉蜀黍杂种的开发，一般需要纯合近交系的开发、这些近交系的杂交和杂交后代的评估。有许多分析方法可供评估杂交的结果。最古老和最传统的分析方法是观察表型性状。或者，可检查植物的基因型。
已用转化技术工程转入特定的玉蜀黍植株中的遗传性状，可用植物育种领域公知的传统育种技术转移到另一株系中。例如，常常使用回交方法来将转基因从转化的玉蜀黍植株转移到良种近交系，所得的后代将包含该转基因(一种或多种)。另外，如果将近交系用于转化，则可将转基因植物与另一不同的近交系杂交以产生转基因杂种玉蜀黍植株。视上下文而定，本文所用的“杂交”可指简单的XY杂交或者指回交过程。
玉蜀黍植物育种方案中玉蜀黍杂种的开发涉及以下三个步骤：(1)从各种种质库选择植物进行初始育种杂交；(2)将从育种杂交选择的植物自交数代以产生一系列的自交系，这些自交系虽然各不相同，但却是纯育的和高度纯合的；以及(3)将选定的自交系与不同的自交系杂交以产生杂种。在玉蜀黍的近交处理期间，品系的活力降低。当将两种不同的近交系杂交以产生杂种时，活力恢复。自交系的纯合性和同质性的重要后果是，通过将确定的(defined)一对近交系进行杂交而产生的杂种往往将是相同的。一旦鉴定出能产生优异杂种的近交系，可将杂种种子无限期地繁殖，只要近交亲本的同质性得到保持。
本发明的转基因植株可用于产生例如单交杂种、三交杂种或双交杂种。当使两种近交系杂交以产生F1后代时，单交杂种得以产生。四个近交系成对杂交(A×B和C×D)，然后两个F1杂种再杂交((A×B)与(C×D))，则产生双交杂种。三个近交系中的两个近交系进行杂交(A×B)，然后所得的F1杂种与第三个近交系进行杂交((A×B)×C)，则产生三交杂种。下一代(F2)中失去了F1杂种所表现出的杂种活力和均匀性的大部分。因此，将杂种植物所产生的种子消费掉而不是种植。
在描述本发明时，将采用下面的术语，并旨在以如下所示进行定义。
所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，诸如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(安大略省米西索加市加拿大基因公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如DiagnosticMolecularMicrobiology：PrinciplesandApplications，Persing，etal.，eds.，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC(1993)(《诊断分子微生物学：原理和应用》，Persing等人编辑，美国微生物学会，华盛顿特区，1993年)。扩增的产物称为扩增子。
术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个其中由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每种密码子(AUG除外，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcusrubens)，对于其来说GTG是可以被修饰的甲硫氨酸密码子(Ishizuka，etal.，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32))(Ishizuka等人，1993年，《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页))以获得功能相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用方式并入本文。
至于氨基酸序列，技术人员会认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的各个单独置换、缺失或添加(其使被编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸变更、添加或缺失)在该变更导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换时，为“保守修饰变体”。因而，还可变更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，对于其天然底物而言，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60至90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的六个组各自含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
另参见Creighton，Proteins，W.H.FreemanandCo.(1984)(Creighton，《蛋白质》，W.H.弗里曼公司，1984年)。
如本文所用，“基本上由...组成”意指在如下情况下目标多核苷酸或多肽可包括额外的序列：额外的序列不会严重影响受权利要求保护的多核苷酸或多肽序列的基本功能。
术语“构建体”通常用来指多核苷酸序列的人工组合，即在自然界中不会发生的、通常包含一个或多个调节元件和一个或多个编码序列的组合。该术语可包括指表达盒和/或载体序列，视上下文而定。
“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量其中已针对目的基因实现了遗传变更(如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。
对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即其基因型与用于进行导致产生该受试植物或细胞的遗传变更的起始材料相同的野生型植物或细胞；(b)其基因型与该起始材料相同但已用无效构建体(即用已知对目的性状没有作用的构建体(如包含标志基因的构建体)进行了转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的后代当中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与该受试植物或植物细胞相同但不被暴露于会引发目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于目的基因不被表达的条件下的该受试植物或植物细胞本身。对照植物还可以是用另选的构建体转化的植物。
就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含用于翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可以包含在该核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)或可以缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，当使用这些生物体表达该核酸时，可以使用诸如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)(Yamao，etal.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：2306-9)(Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309页))或纤毛虫大核中存在的通用密码的变体。
当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以引起单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray，etal.，(1989)NucleicAcidsRes.17：477-98(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页，该文献以引用方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉米偏好密码子可由来自玉米的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子用法在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
如本文所用，术语“内源”在参考基因使用时意指通常存在于指定生物体的细胞的基因组中并且以其常态存在于细胞中(即，以其通常存在于自然中的状态存在于基因组中)的基因。
本文中使用的术语“外源”是指被引入细胞的任何材料。术语“外源核酸分子”或“转基因”是指通常不存在于细胞基因组中或被引入细胞中的任何核酸分子。此类外源核酸分子通常为使用如本文所公开的重组DNA方法或者本领域中已知的其他方式生成的重组核酸分子。在各种实施方案中，如本文所公开的转基因非人类生物体可包含，例如，第一转基因和第二转基因。此类第一和第二转基因可引入到细胞中，例如，转基因生物体的祖细胞，作为单独核酸分子或作为单个单元(例如，分别包含在不同载体或包含在单个载体中)。在任一种情况下，可确定待从中得到转基因生物体的细胞包含使用常规和已知方法诸如标记基因的表达，或核酸杂交或PCR分析的两种转基因。作为另外一种选择或除此之外，转基因存在的确定可较晚进行，例如，在植物由推定的转化细胞再生后进行。
如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行了实质性修饰的核酸。例如，有效连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性修饰。异源蛋白可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。
所谓“宿主细胞”意指包含本发明的异源核酸序列、含有载体并能支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、小米和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉蜀黍宿主细胞。
术语“杂交复合体”包括指涉由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。
在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指涉将核酸掺入真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“分离的”指诸如核酸或蛋白之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。术语“非天然出现的”、“突变的”、“重组的”、“重组表达的”、“异源的”或“异源表达的”代表不在其天然环境中存在的生物材料。
指涉植物的“系”意指遗传上相同的植株的集合。
术语“NUE核酸”意指包含编码完全长度或部分长度的赋予氮利用效率的多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“核酸”包括指涉单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且基本上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建在标准的分子生物学参考书有教导，如BergerandKimmel，(1987)GuideToMolecularCloningTechniques(Berger和Kimmel，1987年，“分子克隆技术指导”)，来自系列书籍MethodsinEnzymology，vol.152，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(《酶学方法》，第152卷，学术出版社，美国加州圣地亚哥市)；Sambrook，etal.，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，2nded.，vols.1-3(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，第1-3卷)；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel，etal.，eds，CurrentProtocols，ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates，Inc.andJohnWiley&Sons，Inc.(1994Supplement)(《分子生物学实验手册》，Ausubel等人编辑，实验室操作指南，格林尼出版有限公司和约约翰威利父子有限公司之间合作(1994年补编))
如本文所用，“有效连接”指各核酸片段结合在单一片段中使得一个核酸片段的功能被另一个核酸片段调节，并且包括指涉第一序列(如启动子)和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导对应于第二序列的DNA的转录。一般来讲，有效连接意指被连接的各核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
如本文所用，术语“植物”包括指涉整个植物、植物器官和组织(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的后代。如本文所用，植物细胞包括但不限于存在于植物组织中或与植物组织分离的细胞，包括种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以下属的种：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米(Zeamays)。
本文所用的“产量”可包括指收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数，该值针对谷粒水分(例如，对于玉蜀黍通常是15％)进行了调整，和/或所产生的生物量的体积(对于草料作物诸如苜蓿而言，以及复种作物的植株根尺寸)。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位磅/蒲式耳。生物量被测量为所产生的可收获植物材料的重量。
如本文所用，“多核苷酸”包括指涉脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列实质上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调节基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语可包括指指定的序列及其互补序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的“启动子”包括指涉DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌(诸如农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium))获得的那些启动子。例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子称为“组织偏好的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调节型”启动子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织偏好的启动子、细胞类型偏好的启动子、发育调节的启动子和诱导型启动子是“非组成型”启动子类别的成员。“组成型”启动子为在发育或细胞分化的大多数环境条件和状态下，在植物的基本上所有组织中都有活性的启动子。
术语“多肽”指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“NUE蛋白”包含多肽。除非另有规定，否则术语“NUE核酸”意指包含编码赋予氮利用效率的多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“重组的”包括指涉已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因，或可具有减低的或消除的天然基因表达。如本文所用，术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
如本文所用，“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
术语“选择性杂交”包括指涉在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶核酸序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40％的序列同一性，优选60至90％的序列同一性，且最优选100％的序列同一性(即，互补性)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指涉探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格条件以允许序列中有一定的错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少约30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt试剂来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃用30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50℃至55℃于1X至2XSSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在37℃于40％至45％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交和在55℃至60℃于0.5X至1XSSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃杂交，并在60℃至65℃于0.1XSSC中洗涤。特异性通常与杂交后洗涤密切相关，关键因素为离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可根据MeinkothandWahl，(1984)Anal.Biochem.138：267-84(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)的公式估计：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分数，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％错配，Tm降低约1℃，因而，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，Tm可降低10℃。通常，严格条件选择为比特定序列及其互补序列在限定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃下杂交和/或洗涤。利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员应当理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(含水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可以使用更高的温度。有关核酸的杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，partI，chapter2，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays”，Elsevier，NewYork(1993)(Tijssen，《生物化学和分子生物学中的实验室技术——使用核酸探针的杂交》，第I部分，第2章，“杂交原理及核酸探针测定法策略的综述)”，纽约爱思唯尔出版社，1993年)；CurrentProtocolsinMolecularBiology，chapter2，Ausubel，etal.，eds，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《分子生物学实验手册》，第2章，Ausubel等人编辑，格林尼出版和威利网络科学公司，纽约，1995年)。除非另外指明，否则在本专利申请中，高严格性定义为在65℃下在4XSSC、5XDenhardt试剂(500ml水中的5gFicoll，5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸鲑精DNA和25mM磷酸钠中杂交，并在65℃下在0.1XSSC、0.1％SDS中洗涤。
本文所用的“转基因植物”包括指在其基因组中包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用于包括其基因型已因异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株，包括那些最初经如此改变的转基因植物以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因植物产生的那些。如本文所用，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。
如本文所用，“载体”包括指涉用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体容许插入其中的核酸的转录。
以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分数”和(e)“实质同一性”。
如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完全的cDNA或基因序列。
如本文所用，“比较窗口”意在包括指涉多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该多核苷酸序列可与参考序列比较，并且其中该比较窗口中的该多核苷酸序列的部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。SmithandWaterman，(1981)Adv.Appl.Math2：482(Smith和Waterman，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的局部同源性算法(BESTFIT)可对用于比较的序列进行最佳比对；通过NeedlemanandWunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-53页)的同源性比对算法(GAP)；通过PearsonandLipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页)的相似性搜索方法(Tfasta和Fasta)；通过这些算法的计算机化执行，包括但不限于：Intelligenetics(加州山景城(MountainView，California))的PC/Gene程序中的CLUSTAL，WisconsinGeneticsSoftwarePackage(威斯康星遗传软件包)第8版(可得自遗传计算机小组(GeneticsComputerGroup)(程序(Accelrys公司(加州圣地亚哥(SanDiego，CA)))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。CLUSTAL程序在以下文献中得到很好的描述：HigginsandSharp，(1988)Gene73：237-44(Higgins和Sharp，1988年，《基因》，第73卷，第237-44页)；HigginsandSharp，(1989)CABIOS5：151-3(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-3页)；Corpet，etal.，(1988)NucleicAcidsRes.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-90页)；Huang，etal.，(1992)ComputerApplicationsintheBiosciences8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-65页)；以及Pearson，etal.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-31页)。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(FengandDoolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60(Feng和Doolittle，1987年，《分子进化学杂志》，第25卷，第351-360页)，其类似于HigginsandSharp，(1989)CABIOS5：151-53(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)中描述的方法，将该文献以引用方式并入本文。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；和TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chapter19，Ausubeletal.，eds.，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)(《现代分子生物学实验技术》，第19章，Ausubel等人编辑，GreenePublishingandWiley-Interscience，纽约，1995年)。
GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它可以提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。威斯康星遗传学软件包第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生罚分和空位延伸罚分可以以选自0至100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
GAP给出该家族中的具有最佳比对的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因素：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了将序列进行比对而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。威斯康星遗传学软件包版本10中所用的评分矩阵为BLOSUM62(参见HenikoffandHenikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页)。
除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul，etal.，(1997)NucleicAcidsRes.25：3389-402)(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-402页))；
如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可被模拟为随机序列。然而，许多真实蛋白包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复序列或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(WootenandFederhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)(Wooten和Federhen，1993年，《计算化学杂志》，第17卷，第149-163页))和XNU(ClaverieandStates，(1993)Comput.Chem.17：191-201)(Claverie和States，1993年，《计算化学杂志》，第17卷，第191-201页))低复杂性过滤程序。
在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分比针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调序列同一性百分数以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据MeyersandMiller，(1988)ComputerApplic.Biol.Sci.4：11-17(Meyers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics，MountainView，California，USA))中所实现的。
本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
术语多核苷酸序列的“基本上相同”意指包含这样的序列的多核苷酸，该序列与参考序列相比具有50-100％之间的序列同一性，任选地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性，所述比较是使用所描述的比对程序中的一种并采用标准参数进行的。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调节这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100％之间的序列同一性，诸如至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、最高至100％的同一性。
在肽的情形中术语“实质同一性”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性，诸如与参考序列具有至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、最高至100％的序列同一性的序列。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是实质上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位实质上相同，则它们实质上相同。“实质上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
可用(a)标准的重组方法、(b)合成技术或二者的组合来制备本发明的分离核酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸将从真菌或细菌克隆、扩增或以别的方式构建。
总体来说，已发现翻译效率受RNA的5′非编码或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调节。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)NucleicAcidsRes.15：8125)(Kozak，1987年，《核酸研究》，第15卷，第8125页)和5<G>7甲基GpppGRNA帽结构(Drummond，etal.，(1985)NucleicAcidsRes.13：7375)(Drummond等人，1985年，《核酸研究》，第13卷，第7375页)。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesing，etal.，(1987)Cell48：691)(Muesing等人，1987年，《细胞》，第48卷，第691页)和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)，Rao，etal.，(1988)Mol.andCell.Biol.8：284)(Rao等人，1988年，《分子和细胞生物学》，第8卷，第284页)。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′UTR区。
另外，可修饰本发明多核苷酸的多肽编码区段以改变密码子使用。可采用改变了的密码子用法，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉蜀黍中表达而优化异源序列中的密码子用法。本发明的多核苷酸的编码区中的密码子用法可用可商购获得的软件包，如可得自威斯康星大学遗传学计算机集团(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup)的“密码子偏好性(CodonPreference)”，参见Devereaux，etal.，(1984)NucleicAcidsRes.12：387-395)(Devereaux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387-395页)或MacVector4.1(康涅狄格州纽黑文的伊士曼柯达公司(EastmanKodakCo.，NewHaven，Conn.))进行统计分析。因而，本发明提供了本发明多核苷酸中的至少一者的编码区的密码子使用频率特性。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3至本文所提供的本发明多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
本发明提供了使用本发明多核苷酸进行序列改组的方法以及由此得到的组合物。序列改组在PCT公开No.1996/19256中有描述。也可参见Zhang，etal.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-9(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-9页)和Zhao，etal.，(1998)NatureBiotech16：258-61(Zhao等人，1998年，《自然生物技术》，第16卷，第258-261页)。一般来讲，序列改组提供用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，可对该文库进行选择或筛选。从一群包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区的相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的多核苷酸的亚群。所述特性可以为任何能够被选择用于筛选系统或在筛选系统中检测的性质或属性，并可包括所编码的蛋白质、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白质结合元件等等的性质，例如任何赋予可选择或可检测性质的特征。在一些实施方案中，选择的特性将为相对于本文所提供的野生型蛋白质而言改变了的Km和/或Kca。在其他实施方案中，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸具有的配体结合亲和力将比非改组的野生型多核苷酸的高。在另外其它实施方案中，与非改组的野生型多核苷酸相比，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸将具有改变了的最佳pH。这类性质的提高可为野生型值的至少110％、120％、130％、140％或高于150％。
本发明还提供包含本发明的核酸的重组表达盒。可将编码所需的本发明多核苷酸的核酸序列，例如编码长度足以编码本发明的活性蛋白质的多肽的cDNA或基因组序列用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入所需的宿主细胞。重组表达盒将通常包含有效连接至转录起始调节序列的本发明多核苷酸，所述转录起始调节序列将引导所述多核苷酸在预定的宿主细胞(诸如转化植物的组织)中的转录。
例如，植物表达载体可包含(1)处于5′和3′调节序列的转录控制下的克隆植物基因和(2)显性选择性标记。如果需要，这种植物表达载体还可含有启动子调节区(例如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
可采用会引导本发明多核苷酸在基本上再生植物的所有组织中表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的实例包括源自根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-DNA的1′或2′启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell，etal.，(1985)Nature313：810-2(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-2页)中所描述；水稻肌动蛋白启动子(McElroy，etal.，(1990)PlantCell163-171)(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第163-171页)；遍在蛋白启动子((Christensen，etal.，(1992)PlantMol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：675-89)(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-89页))；pEMU(Last，etal.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8)(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-8页)；MAS(Velten，etal.，(1984)EMBOJ.3：2723-30)(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-30页)和玉蜀黍H3组蛋白启动子(Lepetit，etal.，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85(Lepetit等人，1992年，《分子遗传学与普通遗传学》，第231卷，第276-85页)和Atanassvoa，etal.，(1992)PlantJournal2(3)：291-300(Atanassvoa等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第3期，第291-300页))；ALS启动子，如第WO1996/30530号PCR申请中所描述；以及本领域技术人员已知的来自各种植物基因的其他转录起始区。对于本发明而言，遍在蛋白启动子是用于单子叶植物中表达的优选启动子。
启动子多核苷酸的片段可保持或不保持启动子功能。启动子多核苷酸的片段可用来产生在靶向该启动子的抑制构建体中有用的pIR(启动子反向重复序列，也称发夹)。参见例如Matzke，etal.，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227(Matzke等人，2001年，《遗传学与发育新观点》，第11卷，第221-227页)；Metteetal.，EMBOJ.(2000)19：5194-5201(Mette等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，2000年，第19卷，第5194-5201页)。
或者，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或者可另外在更精确的环境或发育控制下的表达。此类启动子可为“诱导型”启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件包括病原体攻击、无氧条件或光的存在。诱导型启动子的例子是Adh1启动子(其可通过低氧或寒冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可通过热胁迫诱导)和PPDK启动子(其可通过光诱导)。在昼夜节律期间的不同时间都有活性的昼夜启动子也是已知的(美国专利申请公布No.2011/0167517，以引用方式并入本文)。
在发育控制下的启动子的例子包括仅仅或优先在某些组织(诸如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。
如果多肽表达是所需的，则通常期望在多核苷酸编码区的3’-端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源于多种植物基因，或源于T-DNA。待添加的3’端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或者源于另一植物基因，或较不优选地，源自任何其他真核基因。这种调节元件的例子包括但不限于3’终止和/或多腺苷酸化区域，如根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂氨酸合酶(nos)基因(Bevan，etal.，(1983)NucleicAcidsRes.12：369-85)(Bevan等人，1983年，《核酸研究》，第12卷，第369-85页)；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil，etal.，(1986)NucleicAcidsRes.14：5641-50(Keil等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5641-5650页)和An，etal.，(1989)PlantCell1：115-22(An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-122页))和CaMV19S基因(Mogen，etal.，(1990)PlantCell2：1261-72)(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)的那些3’终止和/或多腺苷酸化区域。
可将内含子序列添加至部分编码序列的5’非翻译区或编码序列以增加在胞质溶胶中积聚的成熟信息(maturemessage)的量。在动物和植物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白质水平上都能增加基因表达最高达1000倍(BuchmanandBerg，(1988)Mol.CellBiol.8：4395-4405(Buchman和Berg，1988年，《分子生物学与细胞生物学》，第8卷，第4395-4405页)；Callis，etal.，(1987)GenesDev.1：1183-200)(Callis等人，1987年，《基因学进展》，第1卷，第1183-200页))；当设置在接近转录单位的5’端时，基因表达的这种内含子增强通常是最大的。玉米内含子Adh1-S内含子1、Adh1-S内含子2和Adh1-S内含子6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。主要参见TheMaizeHandbook，Chapter116，FreelingandWalbot，eds.，Springer，NewYork(1994)(《玉蜀黍手册》，第116章，Freeling和Walbot编辑，施普林格出版社，纽约，1994年)。
植物信号序列包括但不限于：编码将蛋白质靶向植物细胞的胞外基质的信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos，etal.，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900)(Dratewka-Kos等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第4896-900页)，如皱叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)扩延基因(DeLoose，etal.，(1991)Gene99：95-100)(Deloose等人，1991年，《基因》，第99卷，第95-100页)；将蛋白质靶向液泡的信号肽，如甘薯sporamin基因(Matsuka，etal.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：834)(Matsuka等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第834页)和大麦凝集素基因(Wilkins，etal.，(1990)PlantCell，2：301-13)(Wilkins等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第301-13页)；促使蛋白质被分泌的信号肽，如PRIb的信号肽(Lind，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：47-53)(Lind等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第47-53页)或大麦α淀粉酶(BAA)(Rahmatullah，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：119)(Rahmatullah等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第119页)或者将蛋白质靶向质体的信号肽，诸如油菜籽烯酰-Acp还原酶的信号肽(Verwaert，etal.，(1994)PlantMol.Biol.26：189-202)(Verwaert等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第189-202页)可用于本发明中。
包含来自本发明多核苷酸的序列的载体将通常包含标记基因，该标记基因可在植物细胞上赋予选择性表型。选择性标记基因可编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对抗生素壮观霉素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因。同样有用的是编码对能抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突变)，编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，如膦丝菌素或basta(例如bar基因)，或者本领域已知的其他此类基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。
本文所述的构建体可包含编码报告基因或标记产物的目的多核苷酸。本领域已知的合适的报道多核苷酸的例子可以见于例如以下文献：Jeffersonetal.(1991)inPlantMolecularBiologyManual，ed.Gelvinetal.(KluwerAcademicPublishers)，pp.1-33(Jefferson等人，1991年，载于《植物分子生物学手册》，Gelvin等人编辑，克吕维尔学术出版社，第1-33页)；DeWetetal.Mol.Cell.Biol.7：725-737(1987)(DeWet等人，《分子生物学与细胞生物学》，第7卷，第725-737页，1987年)；Goffetal.EMBOJ.9：2517-2522(1990)(Goff等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，第9卷，第2517-2522页，1990年)；Kainetal.BioTechniques19：650-655(1995)(Kain等人，《生物技术》，第19卷，第650-655页，1995年)；以及Chiuetal.CurrentBiology6：325-330(1996)(Chiu等人，《当代生物学》，第6卷，第325-330页，1996年)。在某些实施方案中，目的多核苷酸编码选择性报道基因。这些多核苷酸可包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的多核苷酸。合适的选择性标记多核苷酸的例子包括但不限于编码对氯霉素、甲氨蝶呤、潮霉素、链霉素、壮观霉素、博来霉素、磺酰胺、溴苯腈、草甘膦和膦丝菌素的抗性的基因。
在一些实施方案中，本文公开的表达盒包含编码可评分的或可筛选的标记的目的多核苷酸，其中所述多核苷酸的存在产生可测量的产物。例子包括β-葡糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，其编码各种显色底物已知的酶(例如，美国专利No.5,268,463和No.5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶和碱性磷酸酶。其他可筛选的标记包括花青素/类黄酮多核苷酸，包括例如编码调节植物组织中花青素色素(红色)的产生的产物的R-基因座多核苷酸，控制类黄酮色素的生物合成的基因，诸如玉蜀黍C1和C2、B基因、p1基因和bronze基因座基因等。由目的多核苷酸编码的合适的标记的另外的例子包括青色荧光蛋白(CYP)基因、黄色荧光蛋白基因、编码荧光素酶的发光酶基因(其存在可使用例如，X光片、闪烁计数、荧光光度法、微光摄像机、光子计数照相机或多孔发光测定法来检测)、绿色荧光蛋白(GFP)和DsRed2(Clontechniques(《克隆技术》)，2001年)，其中用标记基因转化的植物细胞为红色，并因而为视觉上可选择的。另外的例子包括编码各种显色底物(例如，PADAC、显色头孢菌素)已知的酶的p-内酰胺酶基因、编码可转化显色儿荼酚的儿荼酚双加氧酶的xylE基因、α-淀粉酶基因和编码能够将酪氨酸氧化为多巴和多巴醌(其继而缩合以形成易于检测的化合物黑色素)的酶的酪氨酸酶基因。
表达盒还可包含用于选择转化的细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(Suetal.(2004)BiotechnolBioeng85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术与生物工程》，第85卷，第610-9页)及Fetteretal.(2004)PlantCell16：215-28)(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-28页))、青色荧光蛋白(CYP)(Bolteetal.(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-54页)及Katoetal.(2002)PlantPhysiol129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-42页))和黄色荧光蛋白(得自Evrogen公司的PhiYFPTM，参见Bolteetal.(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-54页))。对于另外的选择性标记，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christophersonetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yaoetal.(1992)Cell71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(《Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页》)；Barkleyetal.(1980)inTheOperon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页)；Huetal.(1987)Cell48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brownetal.(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figgeetal.(1988)Cell52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschleetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerstetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschleetal.(1990)Science248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen，1993年，德国海德尔堡大学博士论文；Reinesetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labowetal.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子生物学与细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambrettietal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Balmetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborskietal.(1991)NucleicAcidsRes.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子结构生物学主题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolbetal.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂与化学疗法》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidtetal.(1988)Biochemistry27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin，1993年德国海德尔堡大学博士论文；Gossenetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Olivaetal.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂与化学疗法》，第36卷，第913-919页)；Hlavkaetal.(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，斯普林格出版社，柏林)；Gilletal.(1988)Nature334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。这些公开内容以引用的方式并入本文。上面关于选择性标记基因的名单并不意指是限制性的。任何选择性标记基因均可用于本文所公开的组合物和方法中。
可用于在高等植物中表达基因的典型载体是本领域公知的，包括衍自根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，如Rogers，etal.，(1987)Meth.Enzymol.153：253-77(Rogers等人，1987年，《酶学方法》，第153卷，第253-77页)。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本发明的示例性的根瘤农杆菌载体是Schardl，etal.，(1987)Gene61：1-11(Schardl等人，1987年，《基因》，第61卷，第1-11页)及Berger，etal.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6(Berger等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第8402-6页)的质粒pKYLX6和pKYLX7。本发明中可用的另一种载体是质粒pBI101.2，其可得自加利福尼亚州帕罗奥图科隆达生物技术实验室有限公司(CLONTECHLaboratories，Inc.(PaloAlto，CA))。
蛋白质在宿主细胞中的表达
使用本发明的核酸，可以在重组工程改造的细胞如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或优选植物细胞中表达本发明的蛋白质。这类细胞在非天然条件下(例如，在数量、组分、位置和/或时间方面)产生蛋白质，因为它们已通过人为干预被遗传改变成在非天然条件下产生蛋白质。
可以预期，本领域的技术人员知晓多种可用于表达编码本发明的蛋白质的核酸的表达体系。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白质的各种方法。
简单概括而言，编码本发明蛋白质的分离核酸的表达通常可通过使例如DNA或cDNA有效连接至启动子、然后整合进表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有可用于调节本发明的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建表达载体，该表达载体在最低程度上含有用以指导转录的强启动子(诸如遍在蛋白启动子)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子。组成型启动子被分类为可提供一系列组成型表达。因而，某些是弱组成型启动子，而另一些是强组成型启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，“强启动子”以“高水平”或者约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物来驱动编码序列的表达。
技术人员将认识到，可对本发明的蛋白质进行修饰而不减低其生物活性。可进行某些修饰以有利于目标分子的克隆、表达或掺入进融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端设置额外的氨基酸(例如多聚His)以产生便利地定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最通常由大肠杆菌的各种菌株代表；然而，也可使用其他微生物菌株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核控制序列，包括诸如β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Chang，etal.，(1977)Nature198：1056)(Chang等人，1977年，《自然》，第198卷，第1056页)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，etal.，(1980)NucleicAcidsRes.8：4057)(Goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057页)和λ衍生PL启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake，etal.，(1981)Nature292：128)(Shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128页)。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择性标记也是有用的。这种标记的例子包括确定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
选择载体以使得将目的基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒感染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。使用芽孢杆菌属(Bacillussp.)和沙门氏菌属(Salmonella)，可获得用于表达本发明蛋白质的表达系统(Palva，etal.，(1983)Gene22：229-35；Mosbach，etal.，(1983)Nature302：543-5)(Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-35页；Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-5页)。得自法玛西亚公司(Pharmacia)的pGEX-4T-1质粒载体是本发明的优选大肠杆菌表达载体。
多种真核表达系统如酵母细胞系、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简单解释的，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施方案中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达系统，用于产生本发明的蛋白质。
异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman，etal.，(1982)MethodsinYeastGenetics，ColdSpringHarborLaboratory(Sherman等人，1982年，《酵母遗传学方法》，冷泉港实验室出版社)是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevtslae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方案是本领域已知的并可从商业供应商(例如英杰公司(Invitrogen))获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列，如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)和复制起始区、终止序列等等。
本发明的蛋白质，一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或离心沉淀物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印记技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。
还可将编码本发明的蛋白质的序列连接到各种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。哺乳动物细胞系统通常会是单层细胞的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液。本领域已开发了多种能够表达完整蛋白质的合适宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子(例如CMV启动子、HSVtk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen，etal.，(1986)Immunol.Rev.89：49)(Queen等人，1986年，《免疫学评论》，第89卷，第49页)和必要的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大TAg多聚A添加位点)和转录终止子序列。可用于产生本发明的蛋白质的其他动物细胞可从例如美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)CatalogueofCellLinesandHybridomas(《细胞系和杂交瘤目录》)(第7版，1992)获得。
用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系，如Schneider细胞系(参见例如Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65)(Schneider，1987年，《胚胎实验形态学杂志》，第27卷，第353-65页))；
如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列掺入到载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的一个例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague，etal.，(1983)J.Virol.45：773-81)(Sprague等人，1983年，《病毒学杂志》，第45卷，第773-81页)。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列掺入到载体，如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些基因序列(Saveria-Campo，“BovinePapillomaVirusDNAaEukaryoticCloningVector，”inDNACloning：APracticalApproach，vol.II，Glover，ed.，IRLPress，Arlington，VA，pp.213-38(1985))(Saveria-Campo，“牛乳头瘤病毒DNA：一种真核克隆载体”，载于《DNA克隆：一种实用方法》，第II卷，Glover编辑，IRL出版社，弗吉尼亚州阿灵顿，第213-38页，1985年)。
另外，可将置于适当植物表达载体中的目的基因用于转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织分离多肽或可将转化的细胞用于再生转基因植物。可收获这种转基因植物，并可对适当的组织(例如，种子或叶)执行大规模蛋白提取和纯化技术。
有多种用于将外源基因引入植物中的方法是公知的并可用来将多核苷酸插入植物宿主中，这包括生物学和物理学的植物转化方案。参见例如Mikietal.，“ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants”，inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，GlickandThompson，eds.，CRCPress，Inc.，BocaRaton，pp.67-88(1993)(Miki等人，“将外来DNA引入植物中的程序”，载于《植物分子生物学和生物技术方法》，Glick和Thompson编辑，CRC出版社，波卡拉顿，第67-88页，1993年)。所选择的方法随宿主植物而变化，包括化学转染方法如磷酸钙介导的基因转移、微生物介导的基因转移如农杆菌介导的基因转移(Horsch，etal.，(1985)Science227：1229-31)(Horsch等人，1985年，《科学》，第227卷，第1229-1231页)、电穿孔、显微注射和生物射弹轰击。
用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation，”inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，supra，pp.89-119(Gruber等人，“植物转化载体”，载于《植物分子生物学和生物技术方法》，出处同上，第89-119页)。
可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这类方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway，etal.，(1986)Biotechniques4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页)和美国专利No.6,300,543)、电穿孔(Riggs，etal.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606)(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页)、直接基因转化(Paszkowskietal.，(1984)EMBOJ.3：2717-2722)(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页)和弹道粒子加速(参见例如Sanford等人，美国专利No.4,945,050；WO1991/10725；和McCabe，etal.，(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))。另参见Tomes，etal.，“DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment”。pp.197-213inPlantCell，TissueandOrganCulture，FundamentalMetrods.eds.GamborgandPhillips.Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork，1995(Tomes等人，“通过微粒轰击直接将DNA转移到完整植物细胞中”，第197-213页，载于《植物细胞、组织和器官培养，基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，施普林格出版社，柏林、海德尔堡、纽约，1995年)；美国专利No.5,736,369(分生组织)；Weissinger，etal.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年评》，第22卷，第421-477页)；Sanford，etal.，(1987)ParticulateScienceandTechnology5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，etal.，(1988)PlantPhysiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；Datta，etal.，(1990)Biotechnology8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein，etal.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein，etal.，(1988)Biotechnology6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；WO91/10725(玉蜀黍)；Klein，etal.，(1988)PlantPhysiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm，etal.，(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)及Gordon-Kamm，etal.，(1990)PlantCell2：603-618(Gordon-Kamm等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第603-618页)(玉蜀黍)；Hooydaas-VanSlogterenandHooykaas，(1984)Nature(London)311：763-764(Hooydaas-VanSlogteren和Hooykaas，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；Bytebierm，etal.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(Bytebierm等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；DeWet，etal.，(1985)InTheExperimentalManipulationofOvuleTissues，ed.G.P.Chapman，etal.，pp.197-209.Longman，NY(DeWet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操纵》，G.P.Chapman等人编辑，第197-209页，朗文出版社，纽约)(花粉)；Kaeppler，etal.，(1990)PlantCellReports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)及Kaeppler，etal.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(晶须介导的转化)；美国专利No.5,693,512(超声处理)；D’Halluin，etal.，(1992)PlantCell4：1495-1505(D’Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，etal.，(1993)PlantCellReports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)及ChristouandFord，(1995)AnnalsofBotany75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，etal.，(1996)NatureBiotech.14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)；农杆菌介导的玉蜀黍转化(美国专利No.5,981,840)；碳化硅晶须方法(Frame，etal.，(1994)PlantJ.6：941-948)(Frame等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第941-948页)；激光方法(Guo，etal.，(1995)PhysiologiaPlantarum93：19-24)(Guo等人，1995年，《植物生理学》，第93卷，第19-24页)；超声处理方法(Bao，etal.，(1997)UltrasoundinMedicine&Biology23：953-959(Bao等人，1997年，《医学和生物学中的超声》，第23卷，第953-959页)；FinerandFiner，(2000)LettApplMicrobiol.30：406-10(Finer和Finer，2000年，《应用微生物学通讯》，第30卷，第406-10页)；Amoah，etal.，(2001)JExpBot52：1135-42(Amoah等人，2001年，《实验植物性杂志》，第52卷，第1135-42页))；聚乙二醇方法(Krens，etal.，(1982)Nature296：72-77)(Krens等人，1982年，《自然》，第296卷，第72-77页)；单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体可用电穿孔(Fromm，etal.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5824-5828)(Fromm等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第5824-5828页)和显微注射(Crossway，etal.，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185)(Crossway等人，1986年，《分子遗传学与普通遗传学》，第202卷，第179-185页))进行转化，这些文献全部以引用的方式并入本文。
最广泛使用的将表达载体引入植物中的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根瘤农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.PlantSci.10：1(Kado，1991年，《植物科学评论，第10卷，第1页》)。如下文献提供了有关用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述：Gruber等人(出处同上)；Miki等人(出处同上)及Moloney，etal.，(1989)PlantCellReports8：238(Moloney等人，1989年，《植物细胞报道》，第8卷，第238页)。
相似地，可将基因插入分别源自根瘤农杆菌或毛根农杆菌的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因而，可使用这些质粒，如上构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如BenfeyandChua，(1989)Science244：174-81(Benfey和Chua，1989年，《科学》，第244卷，第174-81页)。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种靶植物中的组成型或组织偏好的表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这种系统，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因必须也存在，要么与T-DNA部分一起存在，要么通过双元系统存在，在该系统中该vir基因存在于一个另外的载体上。这类系统、在其中使用的载体以及转化植物细胞的方法在以下专利和文献中有描述：美国专利No.4,658,082；1986年10月1日提交的系列号为913,914的美国专利申请，在1993年11月16日授权的美国专利No.5,262,306中引用；和Simpson，etal.，(1986)PlantMol.Biol.6：403-15(Simpson等人，1986年，《植物分子生物学》，第6卷，第403-415页)(也在‘306专利中引用)，所述专利和文献均以引用方式全文并入本文。
一旦构建，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中并将这些载体用于转化植物物种的细胞，所述植物物种的细胞通常对镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染而言是易感的。本发明还可以想到若干其他转基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。大多数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根瘤农杆菌感染是易感的。毛根农杆菌也具有广泛的宿主范围，包括大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员在内。也可转化单子叶植物。欧洲专利申请No.604662A1公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申请No.672752A1公开了使用未成熟胚的盾片用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉蜀黍的方法(NatureBiotechnology14：745-50(1996))(《自然生物技术》，第14卷，第745-50页，1996年)。
一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，整个植物可通过使该植物产生伤口，然后将载体引入该伤口位点来用这些载体进行感染。可使植物的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织诸如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。再生植物组织的此类方法的例子公开于Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40(Shahin，1985年，《理论与应用遗传学》，第69卷，第235-40页)；美国专利No.4,658,082；Simpson等人(出处同上)及均于1986年10月1日提交的美国专利申请序列No.913,913和913,914(在1993年11月16日授权的美国专利No.5,262,306中引用)，将上述文献和专利的全部公开内容以引用方式并入本文。
尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物总体上对该基因转移模式而言是顽拗的，尽管最近已在水稻中获得了一定的成功(Hiei，etal.，(1994)ThePlantJournal6：271-82)(Hiei等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第271-82页)。已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为农杆菌介导的转化的替代方案。
一般适用的植物转化方法是微粒(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在约1至4μm的微抛射体的表面上。用生物射弹装置(biolisticdevice)将表达载体引入植物组织中，该生物射弹装置将微粒加速到300至600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford，etal.，(1987)Part.Sci.Technol.5：27(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》，第5卷，第27页)；Sanford，(1988)TrendsBiotech6：299(Sanford，1988年，《生物技术趋势》，第6卷，第299页)；Sanford，(1990)Physiol.Plant79：206(Sanford，1990年，《植物生理学》，第79卷，第206页)及Klein，etal.，(1992)Biotechnology10：268)(Klein等人，1992年，《生物技术》，第10卷，第268页)。
物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang，etal.，(1991)BioTechnology9：996(Zang等人，1991年，《生物技术》，第9卷，第996页)中所描述的对靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes，etal.，(1985)EMBOJ.4：2731(Deshayes等人，1985年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第4卷，第2731页)及Christou，etal.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3962(Christou等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第3962页)。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中也已有报道。参见例如Hain，etal.，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161(Hain等人，1985年，《分子遗传学与普通遗传学》，第199卷，第161页)及Draper，etal.，(1982)PlantCellPhysiol.23：451(Draper等人，1982年，《植物细胞生理学》，第23卷，第1451页)。
原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn，etal.，(1990)AbstractsoftheVIIthInt’l.CongressonPlantCellandTissueCultureIAPTC，A2-38，p.53(Donn等人，1990年，第七届国际植物细胞和组织培养大会IAPTC摘要，A2-38，第53页)；D’Halluin，etal.，(1992)PlantCell4：1495-505(D’Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-505页)及Spencer，etal.，(1994)PlantMol.Biol.24：51-61(Spencer等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第51-61页)。
提供了方法通过用表达可抑制多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞来降低或消除本发明的多肽的活性。该多核苷酸可通过防止信使RNA的转录或翻译来直接抑制多肽的表达，或者通过编码能抑制编码多肽的基因的转录或翻译的多肽来间接抑制多肽的表达。用于抑制或消除基因在植物中的表达的方法是本领域所熟知的，任何这种方法可用于本发明中来抑制多肽的表达。
根据本发明，可抑制多肽的表达，使得多肽的蛋白质水平为，例如该同一多肽在未经过遗传修饰或诱变以抑制该多肽的表达的植物中的蛋白质水平的不到70％。在本发明的具体实施方案中，该多肽在根据发明的经修饰的植物中的蛋白质水平，为该同一多肽在不属于突变体的植物或者未经过遗传修饰以抑制该多肽的表达的植物中的蛋白质水平的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％或不到2％。多肽的表达水平可例如通过测定在植物细胞或植物中表达的多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量该多肽在植物细胞或植物中的氮吸收活性或通过测量植物中的表型变化来间接测量。进行这种测定的方法在本文的其他地方进行了描述。
在本发明的其他实施方案中，通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除多肽的活性，所述表达盒包含编码可抑制多肽活性的多肽的多核苷酸。如果该多肽的活性为，例如该同一多肽在未经过修饰以抑制该多肽的活性的植物中的活性的不到70％，则根据本发明抑制多肽的活性。在本发明的具体实施方案中，该多肽在根据本发明的经修饰的植物中的活性，为该同一多肽在未经过修饰以抑制该多肽的表达的植物中的活性的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％或不到5％。当多肽的活性不能通过本文其他地方所描述的测定法检测时，则根据本发明该活性被“消除”了。检测多肽的活性的改变的方法在本文其他地方描述。
在其他实施方案中，可通过破坏编码多肽的基因来降低或消除多肽的活性。本发明涵盖携带基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变减少基因的表达或抑制编码的多肽的活性。
因而，有许多方法可用于降低或消除多肽的活性。此外，有不止一种方法可用于减少单种多肽的活性。
在本发明的一些实施方案中，用表达盒转化植物，该表达盒能够表达可抑制本发明的多肽的表达的多核苷酸。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，出于本发明的目的，能够表达可抑制至少一种多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生可抑制本发明的至少一种多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白质或多肽从DNA分子的“表达”或“产生”指该编码序列转录和翻译而产生该蛋白质或多肽，而蛋白质或多肽从RNA分子“表达”或“产生”指该RNA编码序列翻译而产生蛋白质或多肽。
可抑制多肽的表达的多核苷酸的例子在下面给出。
在本发明的一些实施方案中，多肽表达的抑制可通过有义抑制或共抑制获得。对于共抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子以“有义”取向对应于编码多肽的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致该天然基因的表达降低。因此，对用该共抑制表达盒转化的多个植物株系进行筛选以鉴别那些显示出所需的多肽表达抑制程度的植物株系。
用于共抑制的多核苷酸可对应于编码多肽的序列的全部或部分、多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或者编码多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。在其中该多核苷酸包含多肽的编码区的全部或部分的一些实施方案中，将表达盒设计为消除该多核苷酸的起始密码子，使得不会翻译出蛋白质产物。
共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白质而言具有不可检测的蛋白质水平的植物。参见例如Broin，etal.，(2002)PlantCell14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)。共抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白质的表达。参见例如美国专利No.5,942,657。使用共抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Flavell，etal.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3490-3496(Flavell等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第3490-3496页)；Jorgensen，etal.，(1996)PlantMol.Biol.31：957-973(Jorgensen等人，1996年，《植物分子生物学》，第31卷，第957-973页)；JohansenandCarrington，(2001)PlantPhysiol.126：930-938(Johansen和Carrington，2001年，《植物生理学》，第126卷，第930-938页)；Broin，etal.，(2002)PlantCell14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)；Stoutjesdijk，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；Yu，etal.，(2003)Phytochemistry63：753-763(Yu等人，2003年，《植物化学》，第63卷，第753-763页)及美国专利No.5,034,323、No.5,283,184和No.5,942,657，将这些文献和专利以引用方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3′和多腺苷酸化信号的5′位置包括多聚dT区来提高。参见美国专利申请公布No.2002/0048814，将其以引用方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有实质的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见美国专利No.5,283,184和No.5,034,323，将它们以引用方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，对多肽表达的抑制可通过反义抑制获得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子与编码多肽的信使RNA的全部或部分互补。该反义RNA分子的过表达可导致靶基因的表达减少。因此，对用该反义抑制表达盒转化的多个植物株系进行筛选以鉴别那些显示出所需的多肽表达抑制程度的植物株系。
用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码多肽的序列的互补序列的全部或部分、靶转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、或者编码多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或部分。此外，反义多核苷酸可与靶序列完全互补(即与靶序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与靶序列的互补序列的同一性低于100％)。反义抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白质的表达。参见例如美国专利No.5,942,657。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般来讲，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如如下文献和专利中有描述：Liu，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)，以及美国专利No.5,759,829和No.5,942,657，将这些参考文献和专利的每一个以引用方式并入本文。反义抑制的效率可通过在表达盒中在反义序列的3′和多腺苷酸化信号的5′位置处包括多聚dT区来提高。参见美国专利申请公布No.2002/0048814，将其以引用方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，对多肽表达的抑制可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源信使RNA的表达的抑制。
有义和反义分子的表达可通过将表达盒设计为同时包含有义序列和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。然后对用(一个或多个)dsRNA干扰表达盒转化的多个植物株系进行筛选以鉴别显示出所需的多肽表达抑制程度的植物株系。使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Waterhouse，etal.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13959-13964(Waterhouse等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第13959-13964页)，Liu，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)以及WO1999/49029、WO1999/53050、WO1999/61631和WO2000/49035，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，对多肽表达的抑制可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见WaterhouseandHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)及其中引用的参考文献。
对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于由要对其表达进行抑制的基因编码的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。hpRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，并且它们诱导的RNA干扰被植物的后续各代遗传。参见例如ChuangandMeyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)以及WaterhouseandHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然评论遗传学》，第4卷，第29-38页)。使用hpRNA干扰来抑制或沉默基因表达的方法在例如以下文献和专利中有描述：ChuangandMeyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，etal.，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；WaterhouseandHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然评论遗传学》，第4卷，第29-38页)；Pandolfinietal.，BMCBiotechnology3：7(Pandolfini等人，《BMC生物技术》，第3卷，第7页)以及美国专利申请公布No.2003/0175965，将每个文献和专利以引用方式并入本文。hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中描述：Panstruga，etal.，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(Panstruga等人，2003年，《分子生物学报道》，第30卷，第135-140页)，该文献以引用方式并入本文。
或者，碱基配对茎区可对应于控制其表达待抑制的基因的表达的启动子序列的一部分。因而，该分子的碱基配对茎区通常决定RNA干扰的特异性。该启动子序列或其部分还可在下调植物中的天然或转基因多核苷酸的表达的方法中使用，所述下调例如是通过靶向与要下调的多核苷酸有效连接的启动子的启动子反向重复序列构建体来进行。参见例如，国际专利公布WO2008/112970；Mette，etal.，(2000)EMBOJ19：5194-5201)(Mette等人，2000年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷，第5194-5201页)；以及国际专利申请PCT/US2014/023932。通过启动子反向重复序列构建体来进行下调的多核苷酸相对于被靶向的启动子而言可为天然的或异源的。
对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环的大小在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见例如，Smith，etal.，(2000)Nature407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)。事实上，Smith等人证实了使用ihpRNA介导的干扰百分之百抑制了内源基因表达。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法例如在以下文献和专利中有描述：Smith，etal.，(2000)Nature407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)；Wesley，etal.，(2001)PlantJ.27：581-590(Wesley等人，2001年，《植物杂志》，第27卷，第581-590页)；WangandWaterhouse，(2001)Curr.Opin.PlantBiol.5：146-150(Wang和Waterhouse，2001年，《遗传学与发育新观点》，第5卷，第146-150页)；WaterhouseandHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然评论遗传学》，第4卷，第29-38页)；HelliwellandWaterhouse，(2003)Methods30：289-295(Helliwell和Waterhouse，2003年，《方法》，第30卷，第289-295页)以及美国专利申请公开No.2003/0180945，将每个文献和专利以引用方式并入本文。
还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在这个实施方案中，该反义和有义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO2002/00904；Mette，etal.，(2000)EMBOJ19：5194-5201(Mette等人，2000年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷，第5194-5201页)；Matzke，etal.，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227(Matzke等人，2001年，《遗传学与发育新观点》，第11卷，第221-227页)；Scheid，etal.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA99：13659-13662(Scheid等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第13659-13662页)；Aufsaftz，etal.，(2002)Proc.Nat’l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506(Aufsaftz等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第4期，第16499-16506页)；Sijen，etal.，Curr.Biol.(2001)11：436-440(Sijen等人，《当代生物学》，2001年，第11卷，第436-440页)，以上参考文献以引用方式并入本文。
扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有该天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物能指导其自身的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。利用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法例如在如下参考文献和专利中有描述：AngellandBaulcombe，(1997)EMBOJ.16：3675-3684(Angell和Baulcombe，1997年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第16卷，第3675-3684页)，AngellandBaulcombe，(1999)PlantJ.20：357-362(Angell和Baulcombe，1999年，《植物杂志》，第20卷，第357-362页)以及美国专利No.6,646,805，将这些参考文献和专利的每一个以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是多肽的信使RNA特异性的催化性RNA或具有多肽的信使RNA特异性的核酶活性。因而，该多核苷酸引起内源信使RNA的降解，从而导致多肽的表达的降低。这个方法例如在美国专利No.4,987,071中进行了描述，将该专利以引用方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，对多肽的表达的抑制可通过经由编码微RNA(miRNA)的多核苷酸的表达进行的RNA干扰来获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调节剂。miRNA在抑制内源基因的表达方面非常有效。参见例如Javier，etal.，(2003)Nature425：257-263(Javier等人，2003年，《自然》，第425卷，第257-263页)，将该文献以引用方式并入本文。
对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达模仿内源miRNA基因的RNA分子。例如，该miRNA基因编码可形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与内源基因(靶序列)互补的22核苷酸序列。为了抑制NUE表达，从NUE转录物序列选择该22核苷酸序列，其含有有义取向的所述NUE序列的22个核苷酸和与该有义序列互补的相应反义序列的21个核苷酸。育性基因，无论是内源的还是外源的，都可为miRNA靶标。miRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，并且它们诱导的RNA干扰被植物后代遗传。
在一个实施方案中，所述多核苷酸编码与编码多肽的基因结合的锌指蛋白，从而导致所述基因的表达降低。在特定实施方案中，该锌指蛋白结合至基因的调节区。在其他实施方案中，该锌指蛋白结合至编码多肽的信使RNA并防止其翻译。选择被锌指蛋白靶向的位点的方法已例如在美国专利No.6,453,242中进行了描述，利用锌指蛋白来抑制植物中的基因表达的方法例如在美国专利申请公布No.2003/0037355中进行了描述，将这些专利每一个以引用方式全文并入本文。
在一些本发明的实施方案中，多核苷酸编码结合至少一条多肽并且降低多肽的活性的抗体。在另一个实施方案中，抗体的结合导致由细胞质量控制机制进行的抗体-多肽复合物的周转增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体表达并结合至植物细胞中的蛋白质来抑制分子途径是本领域所熟知的。参见例如ConradandSonnewald，(2003)NatureBiotech.21：35-36(Conrad和Sonnewald，2003年，《自然生物技术》，第21卷，第35-36页)，其以引用方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，通过破坏编码多肽的基因，降低或消除多肽的活性。可通过本领域已知的任何方法来破坏编码多肽的基因。例如，在一个实施方案中，通过转座子标签法破坏该基因。在另一个实施方案中，通过利用随机诱变或定向诱变来对植物进行诱变处理并选择具有减低了的氮利用活性的植物来破坏该基因。
在本发明的一个实施方案中，使用转座子标签法降低或消除一个或多个多肽的活性。转座子标签法包括在内源基因内插入转座子以降低或消除所述多肽的表达。
在该实施方案中，通过在编码多肽的基因的调节区或编码区内插入转座子来降低或消除一种或多种多肽的表达。处于基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任何其他调节序列内的转座子可用于降低或消除所编码多肽的表达和/或活性。
用于对植物中的特定基因进行转座子标签的方法是本领域所熟知的。参见例如Maes，etal.，(1999)TrendsPlantSci.4：90-96(Maes等人，1999年，《植物科学趋势》，第4卷，第90-96页)；DharmapuriandSonti，(1999)FEMSMicrobiol.Lett.179：53-59(Dharmapuri和Sonti，1999年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第179卷，第53-59页)；Meissner，etal.，(2000)PlantJ.22：265-274(Meissner等人，2000年，《植物杂志》，第22卷，第265-274页)；Phogat，etal.，(2000)J.Biosci.25：57-63(Phogat等人，2000年，《生物科学杂志》，第25卷，第57-63页)；Walbot，(2000)Curr.Opin.PlantBiol.2：103-107(Walbot，2000年，《植物生物学新观点》，第2卷，第103-107页)；Gai，etal.，(2000)NucleicAcidsRes.28：94-96(Gai等人，2000年，《核酸研究》，第28卷，第94-96页)；Fitzmaurice，etal.，(1999)Genetics153：1919-1928)(Fitzmaurice等人，1999年，《遗传学》，第153卷，第1919-1928页)。此外，用于选择选定基因中的Mu插入序列的TUSC方法已在如下参考文献和专利中进行了描述：Bensen，etal.，(1995)PlantCell7：75-84(Bensen等人，1995年，《植物细胞》，第7卷，第75-84页)；Mena，etal.，(1996)Science274：1537-1540(Mena等人，1996年，《科学》，第274卷，第1537-1540页)以及美国专利No.5,962,764，将这些参考文献和专利的每一个以引用方式全文并入本文。
用于降低或消除植物中的内源基因的表达的另外方法是本领域已知的，并且可类似地应用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和快中子缺失诱变，快中子缺失诱变以反向遗传学方式(使用PCR)用于鉴别其中内源基因已缺失的植物株系。这些方法的例子参见Ohshima，etal.，(1998)Virology243：472-481(Ohshima等人，1998年，《病毒学》，第243卷，第472-481页)；Okubara，etal.，(1994)Genetics137：867-874(Okubara等人，1994年，《遗传学》，第137卷，第867-874页)以及Quesada，etal.，(2000)Genetics154：421-436(Quesada等人，2000年，《遗传学》，第154卷，第421-436页)，将这些参考文献的每一个以引用的方式全文并入本文。此外，一种用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法TILLING(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes(定向诱导基因组局部突变))也适用于本发明，该方法利用变性HPLC或者对选定的PCR产物的选择性内切核酸酶消化。参见McCallum，etal.，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)，该文献以引用方式并入本文。
影响基因表达或干扰所编码的蛋白质的功能的突变是本领域所熟知的。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基的突变在抑制所编码的蛋白质的活性方面是特别有效的。植物多肽的适于以消除活性为目标进行的诱变的保守残基已得到描述。可根据熟知的程序分离这种突变体，并且可通过遗传杂交对不同基因座中的突变进行堆叠。参见例如Gruis，etal.，(2002)PlantCell14：2863-2882(Gruis等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第2863-2882页)。
在本发明的另一个实施方案中，显性突变体由于基因倒位和重复基因座的重组可用于引发RNA沉默。参见例如Kusaba，etal.，(2003)PlantCell15：1455-1467(Kusaba等人，2003年，《植物细胞》，第15卷，第1455-1467页)。
本发明涵盖另外的用于降低或消除一种或多种多肽的活性的方法。用于改变或突变植物中的基因组核苷酸序列的其他方法的例子是本领域已知的，包括但不限于使用RNA：DNA载体、RNA：DNA突变载体、RNA：DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自互补RNA：DNA寡核苷酸以及重组工程寡核碱基(recombinogenicoligonucleobase)。这种载体和使用方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,565,350；No.5,731,181；No.5,756,325；No.5,760,012；No.5,795,972和No.5,871,984，将这些专利中的每一个以引用的方式并入本文。另参见WO1998/49350、WO1999/07865、WO1999/25821以及Beetham，etal.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8774-8778(Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第8774-8778页)，将这些参考文献和专利的每一个以引用方式并入本文。
在特定的方法中，通过提高该多肽在植物中的水平或活性来降低植物中NUE调节剂的水平和/或活性。负调节分子的表达增加可降低下游造成改善的NUE表型的一个或多个基因的表达水平。
提高植物中的多肽的水平和/或活性的方法在本文其他地方进行了论述。简而言之，此类方法包括将本发明的多肽提供给植物，从而提高该多肽的水平和/或活性。在其他实施方案中，可通过这样来提供编码多肽的NUE核苷酸序列：向植物中引入包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸，表达该NUE序列，提高该多肽的活性，并因此减少植物或植物部分中的组织细胞的数目。在其他实施方案中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在其他方法中，植物组织的生长通过降低植物中多肽的水平和/或活性而增加。这种方法在本文其他地方进行了详细公开。在一这样的方法中，将NUE核苷酸序列引入植物中，所述NUE核苷酸序列的表达可降低多肽的活性并从而增加植物或植物部分中的组织生长。在其他实施方案中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
如上面论述的，技术人员将认识到用于调节植物中的NUE的水平/活性的适当启动子。在本文其他地方已经公开了这个实施方案的示例性启动子。
在其他实施方案中，此类植物在其基因组中已稳定地掺入了包含本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子，该NUE核苷酸序列有效连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于初生根的生长速率的改变、新鲜根重量、侧根和不定根形成程度、维管系统、分生组织发育或径向增大。
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所述方法包括调节该多肽在植物中的水平和/或活性。在一种方法中，将本发明的序列提供给植物。在另一种方法中，通过这样来提供核苷酸序列：将包含本发明的核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该序列，从而变更根发育。在另外其他的方法中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定掺入到植物的基因组中。
在其他方法中，通过改变多肽在植物中的水平或活性来调节根发育。活性的改变可导致以下对根发育的改变中的至少一项或多项：包括但不限于根生物量的改变和长度的改变。
本文所用的“根生长”涵盖单子叶植物和双子叶植物中构成根系的不同部分在根系发育的不同阶段的生长的所有方面。应当理解，根生长增强可由其各部分(包括初生根、侧根、不定根等)中的一者或多者的生长增强引起。
测量根系中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如美国专利申请公布No.2003/0074698和Werner，etal.，(2001)PNAS18：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第18卷，第10487-10492页)，将这两篇文献以引用方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识到用于调节植物中的根发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子和根偏好的启动子。示例性的根偏好的启动子已在本文别处公开。
通过降低多肽的活性和/或水平来刺激根生长和增加根的重量也在改善植物的抗倒伏性方面得到应用。术语“耐倒伏性”或“抗倒伏性”指植物使其自身固定至土壤的能力。对于具有竖立或半竖立生长习性的植物，该术语还指在不利环境条件下保持直立位置的能力。该性状涉及根系的尺寸、深度和形态。此外，通过改变多肽的水平和/或活性来刺激根生长和增加根重量在促进外植体的体外繁殖方面得到应用。
此外，较高的根生物量产出对产量具有直接影响，并且对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物产生的化合物的生成具有间接影响。在根培养物中产生的令人感兴趣的化合物的一个例子是紫草素(shikonin)，其产量可通过所述方法有利地增强。
因此，本发明还提供了与对照植物的根发育相比较时具有受调节的根发育的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有提高了的本发明的多肽的水平/活性和具有增强了的根生长和/或根生物量。在其他实施方案中，这种植物在其基因组中稳定掺入了包含本发明的核苷酸序列的核酸分子，该序列有效连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
还提供了用于调节植物中的苗和叶发育的方法。所谓“调节苗和/或叶发育”其意指植物苗和/或叶的发育的任何改变。苗和/或叶发育中的这种改变包括但不限于在苗分生组织发育方面、在叶数目、叶尺寸、叶和茎维管系统、节间长度和叶衰老方面的改变。本文所用的“叶发育”和“苗发育”涵盖在单子叶植物和双子叶植物中分别构成叶系统和苗系统的不同部分在它们发育的不同阶段中的生长的所有方面。测量苗和叶系统中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Wemer，etal.，(2001)PNAS98：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第10487-10492页)和美国专利申请公布No.2003/0074698，将这两篇文献中的每一个以引用方式并入本文。
调节植物中苗和/或叶发育的方法包括调节本发明的多肽的活性和/或水平。在一个实施方案中，提供本发明的序列。在其他实施方案中，可如下来提供该核苷酸序列：将包含本发明的核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该序列，从而变更苗和/或叶发育。在其他实施方案中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在具体的实施方案中，通过改变多肽在植物中的水平和/或活性来调节苗或叶发育。活性的变化可导致与对照植物相比，苗和/或叶发育的以下改变中的至少一项或多项：(包括但不限于)叶数量的变化、叶表面的改变、维管结构的改变、节间和植物生长以及叶衰老的改变。
如上面所论述的，技术人员将会认识到用于调节植物的苗和叶发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、苗偏好的启动子、苗分生组织偏好的启动子和叶偏好的启动子。示例性的启动子已在本文别处公开。
增加植物中本发明的多肽的活性和/或水平可导致节间和生长的改变。因此，本发明的方法可用于产生经修饰的植物。另外，如上所讨论，植物中的活性同时调节根和苗生长。因而，本发明还提供了用于改变根/苗比的方法。可通过改变植物中的多肽的水平和/或活性，来进一步调节苗或叶发育。
因此，本发明还提供了与对照植物相比较时具有受调节的苗和/或叶发育的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有提高了的本发明的多肽的水平/活性。在其他实施方案中，本发明的植物具有降低了的本发明的多肽的水平/活性。
提供了用于调节繁殖组织发育的方法。在一个实施方案中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”意指与其中多肽的活性或水平还未受调节的对照植物相比，植物的繁殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中多肽的活性或水平未受调节的对照植物相比，植物生殖组织发育的时刻的任何改变(例如花发育时刻的延迟或提前)。生殖发育时刻的变化可导致雄性和雌性生殖组织的发育的同步改变。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化：繁殖器官的尺寸、形状、数目或位置，这些结构形成的发育时间段，或者维持或发展经过开花过程的能力。微观改变可包括构成繁殖器官的细胞的类型或形状的改变。
调节植物中的花发育的方法包括调节在植物中的活性。在一个方法中，提供本发明的序列。可以通过这样来提供核苷酸序列：将包含本发明的核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该序列，从而变更花的发育。在其他实施方案中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在具体的方法中，通过增加多肽在植物中的水平或活性来调节花发育。活性的变化可导致与对照植物相比，花发育的以下改变中的至少一项或多项：(包括但不限于)开花的改变、花数量的变化、雄性不育的修饰和结籽的改变。诱导开花延迟或抑制开花可用于增强诸如苜蓿之类的饲料作物的产量。用于测量花发育的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Mouradov，etal.，(2002)ThePlantCellS111-S130(Mouradov等人，2002年，《植物细胞》，第S111-S130页)，将该文献以引用方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的花发育的适当启动子。用于该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗偏好的启动子和花序偏好的启动子。
在其他方法中，通过改变本发明的序列的水平和/或活性来调节花发育。这种方法可包括将核苷酸序列引入植物中并改变多肽的活性。在其他方法中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。改变本发明的序列的表达可调节胁迫期间的花发育。此类方法在本文别处进行了描述。因此，本发明还提供了与对照植物的花发育相比具有受调节的花发育的植物。组合物包括具有改变的本发明的多肽的水平/活性且具有改变的花发育的植物。组合物还包括具有经修饰的本发明多肽水平/活性的植物，其中该植物在胁迫期间保持或继续进行开花过程。
还提供了使用本发明的序列来增加种子尺寸和/或重量的方法。该方法包括提高植物或植物部分(诸如种子)中的序列的活性。种子大小和/或重量的增加包括种子大小或重量增加和/或一个或多个种子部分(包括例如胚、胚乳、种皮、糊粉或子叶)的大小或重量增加。
如上面所论述的，技术人员将认识到用于增加种子大小和/或种子重量的适当启动子。该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子偏好的启动子、胚偏好的启动子和胚乳偏好的启动子。
用于改变植物中的种子尺寸和/或种子重量的方法可增加植物中的活性。在一个实施方案中，可如下来提供核苷酸序列：将包含本发明的核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该序列，从而影响种子重量和/或大小。在某些实施方案中，引入植物中的核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
还认识到，增加种子大小和/或重量可以还伴随有幼苗生长速度的增加或早期活力的增加。如本文所用，术语“早期活力”是指植物在早期发育过程中快速生长的能力，涉及到萌发之后发育良好的根系和发育良好的光合器的成功建立。此外，当与对照比较时，种子大小和/或重量的增加还可导致植物产量的增加。
因此，本发明还提供了当与对照植物比较时具有增加的种子重量和/或种子大小的植物。在其他实施方案中，还提供了具有增加的活力和植物产量的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有经修饰的本发明的多肽的水平/活性和具有增加了的种子重量和/或种子尺寸。在其他实施方案中，这种植物在其基因组中稳定掺入了包含本发明的核苷酸序列的核酸分子，该序列有效连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
本文所公开的核苷酸、表达盒和方法可用于调节任何异源核苷酸序列在宿主植物中的表达以便改变植物表型。有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、变更植物的氨基酸含量、变更植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。
目的基因反映了作物开发的参与者的商业市场和利益。目的作物和市场在变化，并且随着发展中国家打开世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。目的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农艺学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特性和商业产品重要的性状的基因。一般而言，目的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些基因以及影响仁尺寸、蔗糖载量等的那些基因。
在某些实施方案中，可将本发明的核酸序列与其他目的多核苷酸序列联合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。生成的组合可包括目的多核苷酸中的任何一者或多者的多个拷贝。堆叠的多核苷酸或构建体可靶向同一家族的基因，或者靶向同一生物合成途径内的基因。这种堆叠可扩大所需的影响、响应或表型。
有效连接到目的多核苷酸序列的启动子可为在植物细胞中活跃的任何启动子。在一些实施方案中，使用在植物的生殖组织(例如，雄蕊或子房)中活跃(或可被激活)的启动子是特别有利的。同样地，启动子可为，例如，组成型活性启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或发育阶段特异性启动子。另外，外源核酸分子的启动子可与第二外源核酸分子的启动子相同或不同。
本发明的多核苷酸可与任何基因或基因组合进行堆叠以产生具有多种所需的性状组合的植物，包括但不限于对动物饲料而言理想的性状如高油基因(例如，美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionin类(美国专利No.5,990,389；No.5,885,801；No.5,885,802和No.5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson，etal.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)和WO1998/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen，etal.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，etal.，(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)以及Musumura，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：123)(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))；增加的消化性(例如经修饰贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的系列号为10/053,410的美国专利申请)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的系列号为10/005,429的美国专利申请))，将上述文献的公开内容以引用方式并入本文。本发明的多核苷酸还可与昆虫、病害或除草剂抗性所需的性状进行堆叠(例如苏芸金杆菌(Bacillusthuringiensis)毒蛋白(美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,737,514、No.5723,756、No.5,593,881；Geiser，etal.，(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))；凝集素(VanDamme，etal.，(1994)PlantMol.Biol.24：825)(VanDamme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页)；伏马毒素解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒性和病害抗性基因(Jones，etal.，(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，etal.，(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinos，etal.，(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，如草胺膦或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因)；以及对加工或工艺产品而言理想的性状如高油(例如美国专利No.6,232,529)；经修饰的油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO1994/11516))；经修饰的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如美国专利No.5,602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert，etal.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)，上述公开内容以引用方式并入本文。还可以将本发明的多核苷酸与影响诸如雄性不育(例如参见美国专利No.5.583,210)、茎秆强度、开花时间之类的农学性状或诸如细胞周期调节或基因打靶(例如WO1999/61619；WO2000/17364；WO1999/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，将上述文献以引用的方式并入本文。
包含或源自本发明的植物细胞或天然植物的转基因植物可用堆叠性状进一步增强，例如，具有由本文公开的DNA的表达结合除草剂耐受性和/或害虫抗性性状得到的性状增强的作物植物。例如，具有改变的目的性状的植物可与其他目的农学性状堆叠，诸如提供除草剂抗性和/或昆虫抗性的性状，诸如利用来自苏云金芽孢杆菌的基因以提供对鳞翅目、鞘翅目、同翅目、半翅目和其他昆虫中的一者或多者的抗性。已知的赋予对除草剂(诸如，生长素、HPPD、草甘膦、麦草畏、草胺膦、磺酰脲类、溴苯腈和达草灭除草剂)的耐受性的基因可作为分子堆叠或育种堆叠与表达本文所公开性状的植物堆叠。编码涉及除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子包括但不限于：编码用于赋予草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(美国专利No.39,247、6,566,587中公开并且)的多核苷酸分子；编码也是用于提供草甘膦耐受性的草甘膦氧化还原酶(GOX)(美国专利No.5,463,175中公开)和草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)(美国专利No.7,622,641；No.7,462,481；No.7,531,339；No.7,527,955；No.7,709,709；No.7,714,188和No.7,666,643中公开)的多核苷酸分子；用于提供麦草畏耐受性的麦草畏单加氧酶(美国专利No.7,022,896和WO2007/146706A2中公开)；编码用于提供对生长素除草剂(2，4-D)的耐受性的AAD12(美国专利申请公布No.2005/731044或WO2007/053482A2中公开)或AAD1(美国专利申请公布No.2011/0124503A1或美国专利No.7,838,733中公开)的多核苷酸分子；编码用于提供对HPPD抑制剂的耐受性的羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)(在例如美国专利No.7,935,869；美国专利申请公布No.2009/0055976A1和2011/0023180A1中公开的羟基苯基丙酮酸双加氧酶)的多核苷酸分子；将每个出版物以引用方式全文并入本文。
可与本文公开的性状结合的除草剂耐受性性状的其他例子包括由编码外源膦丝菌素乙酰转移酶的多核苷酸赋予的那些性状，如美国专利No.5,969,213、No.5,489,520、No.5,550,318、No.5,874,265、No.5,919,675、No.5,561,236、No.5,648,477、No.5,646,024、No.6,177,616和No.5,879,903中所描述。包含外源草丁膦乙酰转移酶的植物可表现出对抑制谷氨酰胺合成酶的草胺膦除草剂的改善的耐受性。除草剂耐受性性状的其他例子包括由赋予改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的多核苷酸所赋予的那些性状，如美国专利No.6,288,306B1、No.6,282,837B1和No.5,767,373及国际公布WO2001/12825中所描述。包含此类多核苷酸的植物可对靶向原卟啉原氧化酶(也称为“原卟啉原氧化酶抑制剂”)的多种除草剂中的任一种表现出改善的耐受性。
在一个实施方案中，目的序列可改善植物生长和/或作物产量。例如，目的序列包括可导致初生根系或侧根系改善的农学上重要的基因。这类基因包括但不限于营养物质/水转运蛋白和生长诱导物。这类基因的例子包括但不限于玉蜀黍质膜H+-ATP酶(MHA2)(Frias，etal.，(1996)PlantCell8：1533-44)(Frias等人，1996年，《植物细胞》，第8卷，第1533-44页)；AKT1，拟南芥中的钾吸收器的一个组分(Spalding，etal.，(1999)JGenPhysiol113：909-18)(Spalding等人，1999年，《普通生理学杂志》，第113卷，第909-18页)；激活根尖细胞中的细胞分裂周期的RML基因(Cheng，etal.，(1995)PlantPhysiol108：881)(Cheng等人，1995年，《植物生理学》，第108卷，第881页)；玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya，etal.，(1994)PlantMolBiol26：1935-46)(Sukanya等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第1935-46页)和血红蛋白(Duff，etal.，(1997)J.Biol.Chem27：16749-16752(Duff等人，1997年，《生物化学杂志》，第27卷，第16749-16752页)；Arredondo-Peter，etal.，(1997)PlantPhysiol.115：1259-1266(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第115卷，第1259-1266页)；Arredondo-Peter，etal.，(1997)PlantPhysiol114：493-500(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第114卷，第493-500页)及其中引用的参考文献)。目的序列还可用于表达负面影响根发育的基因的反义核苷酸序列。
另外，除了使用传统的育种方法之外，还可用遗传法对农艺上重要的性状如油含量、淀粉含量和蛋白质含量进行改变。修饰包括增加油酸、饱和或不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸以及修饰淀粉。美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389中描述了Hordothionin蛋白修饰，将这些专利以引用方式并入本文。另一个例子是美国专利No.5,850,016中所描述的由大豆2S白蛋白编码的富赖氨酸和/或富硫种子蛋白，和在Williamson，etal.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)中所描述的源自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，以上公开内容以引用的方式并入本文。可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选的氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽的基因(BHL)源于大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，参见于1996年11月1日提交的美国专利申请No.08/740,682和WO1998/20133，将这两篇文献的公开内容以引用的方式并入本文。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白质，如来自葵花籽的蛋白质(Lilley，etal.，(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs，ed.Applewhite(AmericanOilChemistsSociety，Champaign，Illinois)，pp.497-502(Lilley等人，1989年，《植物蛋白在人类食品和动物饲料中的利用世界大会会议录》)，Applewhite编辑(美国油脂化学家协会(AmericanOilChemistsSociety)，伊利诺州香槟市(Champaign，Illinois))，第497-502页；将该文献以引用方式并入本文)；来自玉米的蛋白质(Pedersen，etal.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，etal.，(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)，这两篇文献均以引用方式并入本文)和来自水稻的蛋白质(Musumura，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页)，以引用方式并入本文)。其他农学上重要的基因编码胶乳、Floury2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
昆虫抗性基因可以编码针对严重影响产量的害虫的抗性，所述害虫例如是根虫、切根虫、欧洲玉蜀黍螟等。这类基因例如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白质基因(美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,736,514、No.5,723,756、No.5,593,881以及Geiser，etal.，(1986)Gene48：109)(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页)等等。
编码病害抗性性状的基因包括：解毒基因，如对抗伏马毒素的基因(美国专利No.5,792,931)；毒力(avr)和病害抗性(R)基因(Jones，etal.，(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，etal.，(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)以及Mindrinos，etal.，(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))等等。
除草剂抗性性状可包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变，特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码针对起到抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这类基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变体编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。可以这类方式使用的基因的例子包括雄性组织偏好的基因和具有雄性不育表型的基因如QM，其在美国专利No.5,583,210中进行了描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或者雌性配子体发育有毒的化合物的那些基因。
谷粒的质量反映在诸如以下的性状：饱和及不饱和油的含量和类型、必需氨基酸的质量和数量、纤维素的含量。在玉米中，经修饰的hordothionin蛋白在美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389中进行了描述。
还可在一个或多个基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。转化的植物的另一重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，如在美国专利No.5,602,321中描述的。诸如β-酮基硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰基-CoA还原酶的基因(参见Schubert，etal.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志)，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白质，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。
一般来讲，修饰或改变宿主内源基因组DNA的方法是可用的。这包括改变宿主天然DNA序列或预先存在的转基因序列，所述转基因序列包括调节元件、编码和非编码序列。这些方法也用于使核酸靶向基因组中预先工程改造的靶标识别序列。例如，本文所述的经过遗传修饰的细胞或植物使用“定制的”大范围核酸酶生成，所述大范围核酸酶被产生用于修饰植物基因组(参见例如WO2009/114321；Gao，etal.，(2010)PlantJournal1：176-187)(Gao等人，2010年，《植物杂志》，第1卷，第176-187页))。其他定点工程改造是通过使用锌指结构域识别加上限制性酶的限制特性来进行。参见例如Urnov，etal.，(2010)NatRevGenet.11(9)：636-46(Urnov等人，2010年，《自然评论遗传学》，第11卷，第9期，第636-46页)；Shukla，etal.，(2009)Nature459(7245)：437-41(Shukla等人，2009年，《自然》，第459卷，第7245期，第437-41页)。
“TILLING”或“定向诱导基因组局部突变”是指可用于生成和/或鉴别并且最终分离具有受调节的表达和/或活性的特定核酸的诱变变体的诱变技术(McCallum，etal.，(2000)，PlantPhysiology123：439-442(McCallum等人，2000年，《植物生理学》，第123卷，第439-442页)；McCallum，etal.，(2000)NatureBiotechnology18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)以及Colbert，etal.，(2001)PlantPhysiology126：480-484(Colbert等人，2001年，《植物生理学》，第126卷，第480-484页))。
TILLING将高密度点突变与突变的快速灵敏度检测结合。通常，乙基甲磺酸(EMS)用于诱变植物种子。EMS使鸟嘌呤烷基化，其通常导致错配。例如，将种子浸泡在约10至20m的MEMS溶液中约10至20小时；将种子洗涤然后播种。这一代植物被称为M1。然后M1植物自花受精。存在于形成生殖组织的细胞中的突变由下一代(M2)继承。通常，针对所需基因中的突变和/或针对特定表型筛选M2植物。
TILLING还允许选择携带突变型变体的植物。这些突变型变体可表现出在强度上或在位置上或在时刻上经过修饰的表达(例如，如果突变影响启动子)。这些突变型变体可表现出比由其天然形式的基因所表现出的活性更高或更低的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法结合。通常在TILLING中所遵循的步骤如下：(a)EMS诱变(RedeiandKoncz，(1992)InMethodsinArabidopsisResearch，Koncz，etal.，eds.Singapore，WorldScientificPublishingCo，pp.16-82(Redei和Koncz，1992年，载于《拟南芥研究方法》，Koncz等人编辑，新加坡，世界科学出版社，第16-82页)；Feldmann，etal.，(1994)InArabidopsis.MeyerowitzandSomervilleeds，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，pp137-172(Feldmann等人，1994年，载于《拟南芥》，Meyerowitz和Somerville编辑，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，第137-172页)；LightnerandCaspar(1998)InMethodsonMolecularBiology82：91-104；Martinez-ZapaterandSalinas，eds，HumanaPress，Totowa，N.J.)(Lightner和Caspar，1998年，载于《分子生物学方法》，第82卷，第91-104页，Martinez-Zapater和Salinas编辑，Humana出版社，纽约托托瓦)；(b)个体的DNA制备和集合(pool)；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以便形成异源双链体；(e)DHPLC，其中异源双链体在一个集合中的存在被检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定该突变的个体；并且(g)对突变的PCR产物进行测序。TILLING的方法是本领域中所熟知的(美国专利No.8,071,840)。
也可采用其他诱变方法在所公开的基因中引入突变。用于将基因突变引入植物基因并且选择具有所需性状的植物的方法是熟知的。例如，可根据标准技术用诱变化学物质处理种子或其他植物材料。这类化学物质包括但不限于以下：硫酸二乙酯、乙烯亚胺和N-亚硝基-N-乙基脲。或者，可使用来自源诸如X射线或γ射线的电离辐射。
本发明的实施方案反映了确定生物体的基因型可经修饰以包含显性抑制因子等位基因或转基因构建体，所述显性抑制因子等位基因或转基因构建体抑制(即，减少但不消除)基因的活性，其中生物体的表型基本上不受影响。
杂种种子生产需要消除由雌性亲本产生的花粉或使其失活。花粉的不完全移除或失活提供了自交的可能性，提高了不经意自花授粉的种子将被无意中收获并且与杂种种子包装在一起的风险。一旦种植了种子，可鉴定并选择自交的植物；自交的植物在遗传上与用于产生杂种的雌性近交系等同。通常，自交植物基于其相对于杂种植物减少的活力来进行鉴别和选择。例如，玉蜀黍的雌性自交植物通过其较少活力的植物外观和/或生殖特性，包括较短的植物高度、小的穗尺寸、穗和籽粒形状、穗轴颜色或其他特性来鉴别。自交系也可使用分子标记分析来鉴别(参见例如，SmithandWych，(1995)SeedSci.Technol.14：1-8)(Smith和Wych，1995年，《种子科学技术》，第14卷，第1-8页))；使用此类方法，自花授粉系的纯合性可通过分析在基因组中的不同基因座处的等位基因组成来验证。
因为杂种植物是重要和有价值的大田作物，所以植物育种工作者一直致力于开发基于稳定自交系的农学上无害的高产杂种。此类杂种的可用性允许通过所用的投入产生最大量的作物，同时尽量减少对昆虫和环境胁迫的敏感性。要实现此目标，植物育种工作者必须通过鉴别和选择出现在分离群体中的基因独特个体来开发用于制备杂种的优良自交亲本系。本发明有助于实现此目标，例如通过提供在杂交时生成雄性不育后代的植物来实现，所述后代可用作用于生成杂种植物的雌性亲本植物。
已使用传统方法和较新的高通量方法将大量基因鉴别为在其表达模式中为穗丝偏好的。当方法限于经典的正向或反向基因突变分析时，这些基因的功能与最终产生功能性花粉的重要生物化学或发育过程的相关是困难的。如本文所公开的，玉蜀黍中的抑制方法提供另选的鉴别与玉蜀黍中的花粉发育直接相关的基因的快速方式。
用于表达目的核酸分子的启动子可以根据需要，为已知在植物或动物中有效的众多天然存在的启动子中的任一个。引导在植物的雄性或雌性生殖器官的细胞中表达的启动子可用于生成转基因植物或本发明植物的育种对。可用于本发明的启动子可包括：组成型启动子，其通常在植物的大多数或全部组织中具有活性；诱导型启动子，其通常无活性或表现出低的基础表达水平，而当将细胞与适当的诱导剂接触时可被诱导至相对较高的活性；组织特异性(或组织偏好的)启动子，其通常仅在一种或几种特定的细胞类型(例如植物花药细胞)中表达；以及发育特异性或阶段特异性启动子，其仅在植物的生长或发育的限定时期有活性。如有必要，通常可修饰启动子以改变表达水平。某些实施方案包括对于被操纵的物种而言外源的启动子，尤其是当使用发夹构建体来靶向特定的启动子并且希望降低发夹与非靶标内源玉蜀黍启动子的相互作用的可能性时。
示例性组成型启动子包括35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子(Odell，etal.，(1985)Nature313：810-812)(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))、玉蜀黍遍在蛋白启动子(Christensen，etal.，(1989)PlantMol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；WO1999/43838和美国专利No.6,072,050中公开的Rsyn7启动子的核心启动子及其他组成型启动子；水稻肌动蛋白(McElroy，etal.，(1990)PlantCell2：163-171)(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页)；pEMU(Last，etal.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-588页)；MAS(Velten，etal.，(1984)EMBOJ.3：2723-2730)(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页)；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)；水稻肌动蛋白启动子(美国专利No.5,641,876；WO2000/70067)，玉蜀黍组蛋白启动子(Brignon，etal.，(1993)22(6)：1007-1015(Brignon等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第6期z6(Rasco-Gaunt等人，2003年，《植物细胞报道》，第21卷，第6期，第569-576页))等等。其他组成型启动子包括，例如，在美国专利No.5,608,144和No.6,177,611以及PCT公开No.WO2003/102198中所述的那些。
组织特异性的、组织偏好的或阶段特异性的调节元件还包括例如AGL8/FRUITFULL调节元件，其在成花诱导时被激活(Hempel，etal.，(1997)Development124：3845-3853)(Hempel等人，1997年，《发育》，第124卷，第3845-3853页)；根特异性调节元件，如来自RCP1基因和LRP1基因的调节元件(TsugekiandFedoroff，(1999)Proc.Natl.Acad.，USA96：12941-12946(Tsugeki和Fedoroff，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第12941-12946页)；SmithandFedoroff，(1995)PlantCell7：735-745(Smith和Fedoroff，1995年，《植物细胞》，第7卷，第735-745页))；花特异性调节元件，如来自LEAFY基因和APETALAl基因的调节元件(Blazquez，etal.，(1997)Development124：3835-3844(Blazquez等人，1997年，《发育》，第124卷，第3835-3844页)；Hempel，etal.，supra，1997(Hempel等人，出处同上，1997年))；种子特异性调节元件，如来自油质蛋白基因的调节元件(Plant，etal.，(1994)PlantMol.Biol.25：193-205)(Plant等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第193-205页)以及开裂区特异性调节元件。另外的组织特异性或阶段特异性调节元件包括Zn13启动子，其为花粉特异性启动子(Hamilton，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：211-218)(Hamilton等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第211-218页)；异常花器官(UFO)启动子，其在顶端苗分生组织中有活性；在苗分生组织中有活性的启动子(Atanassova，etal.，(1992)PlantJ.2：291)(Atanassova等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第291页)；cdc2启动子和cyc07启动子(参见例如，Ito，etal.，(1994)PlantMol.Biol.24：863-878(Ito等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第863-878页)；Martinez，etal.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA89：7360(Martinez等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第7360页))；分生组织偏好的meri-5启动子和H3启动子(Medford，etal.，(1991)PlantCell3：359(Medford等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第359页)；Terada，etal.，(1993)PlantJ.3：241(Terada等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第241页))；大麦中的Myb相关基因的分生组织偏好的和韧皮部偏好的启动子(Wissenbach，etal.，(1993)PlantJ.4：411)(Wissenbach等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第411页)；拟南芥cyc3aAt和cyclAt(Shaul，etal.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：4868-4872)(Shaul等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第4868-4872页)；长春花(C.roseus)细胞周期蛋白CYS和CYM(Ito，etal.，(1997)PlantJ.11：983-992)(Ito等人，1997，《植物杂志》，第11卷，第983-992页)；和烟草属(Nicottana)细胞周期蛋白B1(Trehin，etal.，(1997)PlantMol.Biol.35：667-672)(Trehin等人，1997年，《植物分子生物学》，第35卷，第667-672页)；APETALA3基因的启动子，其在花分生组织中有活性(Jack，etal.，(1994)Cell76：703(Jack等人，1994年，《细胞》，第76卷，第703页)；Hempel，etal.，supra，1997)(Hempel等人，出处同上，1997年))；隐花样(agamous-like，AGL)家族成员例如AGL8的启动子，其在过渡到开花时在苗分生组织中有活性(Hempel，etal.，supra，1997)(Hempel等人，出处同上，1997年)；花离区启动子；L1特异性启动子；成熟增强的西红柿聚半乳糖醛酸酶启动子(Nicholass，etal.，(1995)PlantMol.Biol.28：423-435)(Nicholass等人，1995年，《植物分子生物学》，第28卷，第423-435页)、E8启动子(Deikman，etal.，(1992)PlantPhysiol.100：2013-2017)(Deikman等人，1992年，《植物生理学》，第100卷，第2013-2017页)和果实特异性2A1启动子、来自玉蜀黍的U2和U5snRNA启动子、来自编码Z422kD玉米醇溶蛋白的基因的Z4启动子、来自编码10kD玉米醇溶蛋白的基因的Z10启动子、来自编码27kD玉米醇溶蛋白的基因的Z27启动子、来自编码19kD玉米醇溶蛋白的基因的A20启动子等。另外的组织特异性启动子可使用公知的方法分离(参见例如美国专利No.5,589,379)。苗偏好的启动子包括苗分生组织偏好的启动子，如Weigel，etal.，(1992)Cell69：843-859(Weigel等人，1992年，《细胞》，第69卷，第843-859页)中公开的启动子(登录号M91208)；登录号AJ131822；登录号Z71981；登录号AF049870以及McAvoy，etal.，(2003)ActaHort.(ISHS)625：379-385(McAvoy等人，2003年，《园艺学报》(ISHS)，第625卷，第379-385页)中公开的苗偏好的启动子。花序偏好的启动子包括查耳酮合酶的启动子(VanderMeer，etal.，(1992)PlantJ.2(4)：525-535)(VanderMeer等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第4期，第525-535页)、花药特异性LAT52(Twell，etal.，(1989)Mol.Gen.Genet.217：240-245)(Twell等人，1989年，《分子遗传学与普通遗传学》，第217卷，第240-245页)、花粉特异性Bp4(Albani，etal.，(1990)PlantMolBiol.15：605(Albani等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第605页)、玉蜀黍花粉特异性基因Zm13(Hamilton，etal.，(1992)PlantMol.Biol.18：211-218(Hamilton等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第211-218页)；Guerrero，etal.，(1993)Mol.Gen.Genet.Gen.Genet.224：161-168(Guerrero等人，1993年，《分子遗传学与普通遗传学》，第224卷，第161-168页))、小孢子特异性启动子如apg基因启动子(Twell，etal.，(1993)Sex.PlantReprod.6：217-224)(Twell等人，1993年，《植物有性繁殖》，第6卷，第217-224页)和绒毡层特异性启动子如TA29基因启动子(Mariani，etal.，(1990)Nature347：737(Mariani等人，1990年，《自然》，第347卷，第737页)；美国专利No.6,372,967)和其他雄蕊特异性启动子如MS45基因启动子、5126基因启动子、BS7基因启动子、PG47基因启动子(美国专利No.5,412,085；美国专利No.5,545,546；PlantJ3(2)：261-271(1993)(《植物杂志》，第3卷，第2期，第261-271页，1993年))、SGB6基因启动子(美国专利No.5,470,359)、G9基因启动子(美国专利No.5,8937,850；美国专利No.5,589,610)、SB200基因启动子(WO2002/26789)等等。组织偏好的目的启动子还包括向日葵花粉表达基因SF3(Baltz，etal.，(1992)ThePlantJournal2：713-721)(Baltz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第713-721页)、甘蓝型油菜(B.napus)花粉特异性基因(Arnoldo，etal.，(1992)J.Cell.Biochem，AbstractNumberY101204)(Arnoldo等人，1992年，《细胞生物化学杂志》，摘要号Y101204)。组织偏好的启动子还包括由如下文献所报告的那些启动子：Yamamoto，etal.，(1997)PlantJ.12(2)：255-265(psaDb)(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kawamata，etal.，(1997)PlantCellPhysiol.38(7)：792-803(PsPAL1)(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansen，etal.，(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343(ORF13)(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russell，etal.，(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)(waxy或ZmGBS；27kDa玉米醇溶蛋白；ZmZ27；osAGP；osGT1)；Rinehart，etal.，(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页(来自棉花的Fb12A)；VanCamp，etal.，(1996)PlantPhysiol.112(2)：525-535(VanCamp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)(烟草属SodA1和SodA2)；Canevascini，etal.，(1996)PlantPhysiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)(烟草属ltp1)；Yamamoto，etal.，(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)(松属(Pinus)cab-6启动子)；Lam，(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20：181-196(Lam，1994年，《细胞分化中的结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco，etal.，(1993)PlantMolBiol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)(菠菜rubisco活化酶(Rca))；Matsuoka，etal.，(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)(PPDK启动子)和Guevara-Garcia，etal.，(1993)PlantJ.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)(农杆菌pmas启动子)。在雄性或雌性生殖器官的细胞中是活性的组织偏好的启动子可在本发明的某些方面特别有用。
“种子偏好的”启动子包括“种子发育”启动子(那些在种子发育期间活跃的启动子，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(那些在种子萌发期间活跃的启动子)。参见Thompson，etal.，(1989)BioEssays10：108(Thompson等人，1989年，《生物学论文集》，第10卷，第108页)。这种种子偏好的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息基因启动子)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白基因启动子)；milps(肌醇-1-磷酸合酶基因启动子)；参见WO2000/11177和美国专利No.6,225,529。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白-1(Glob-1)基因启动子是代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、22kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、27kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、γ-玉米醇溶蛋白基因启动子、糯性蛋白(waxy)基因启动子、超甜蛋白(shrunken)1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。另参见WO2000/12733和美国专利No.6,528,704，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好的启动子。另外的胚特异性启动子在如下文献中公开：Sato，etal.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.Acad.Sci.93：8117-8122(Sato等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第8117-8122页)(水稻同源盒，OSH1)和Postma-Haarsma，etal.，(1999)PlantMol.Biol.39：257-71(Postma-Haarsma等人，1999年，《植物分子生物学》，第39卷，第257-71页)(水稻KNOX基因)。另外的胚乳特异性启动子在如下文献中公开：Albani，etal.，(1984)EMBO3：1405-15(Albani等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第1405-15页)；Albani，etal.，(1999)Theor.Appl.Gen.98：1253-62(Albani等人，1999年，《理论与应用遗传学》，第98卷，第1253-62页)；Albani，etal.，(1993)PlantJ.4：343-55(Albani等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第343-55页)；Mena，etal.，(1998)ThePlantJournal116：53-62(Mena等人，1998年，《植物杂志》，第116卷，第53-62页)(大麦DOF)；Opsahl-Ferstad，etal.，(1997)PlantJ12：235-46(Opsahl-Ferstad等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第235-46页)(玉蜀黍Esr)和Wu，etal.，(1998)PlantCellPhysiology39：885-889(Wu等人，1998年，《植物细胞生理学》，第39卷，第885-889页)(水稻GluA-3、GluB-1、NRP33、RAG-1)。
诱导型调节元件是能够响应诱导物而直接或者间接激活一个或者多个DNA序列或者基因的转录的调节元件。诱导物可以是化学制剂诸如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或者酚类化合物，或生理胁迫(诸如通过热、冷、盐、或有毒元素直接施加的，或通过病原体或病害制剂诸如病毒的作用或其他生物制剂或物理因素或环境条件而间接施加的)。可通过以下方式使含有可诱导调节元件的植物细胞暴露于诱导物：将该诱导物例如通过喷雾、喷淋、加热或类似方法而外施于该细胞或者植物。用于诱导来自诱导型启动子的表达的诱导剂基于特定的诱导型调节元件进行选择。响应于暴露在诱导剂下，来自诱导型调节元件的转录通常被从头引发或被增加超过基础表达水平或组成型表达水平。通常，特异性结合到诱导型调节元件以激活转录的蛋白因子以无活性形式存在，然后其由诱导物直接或间接转化为活性形式。任何诱导型启动子均可用于本发明(参见Ward，etal.，(1993)PlantMol.Biol.22：361-366)(Ward等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第361-366页))；
诱导型调节元件的例子包括金属硫蛋白调节元件、铜诱导型调节元件或四环素诱导型调节元件，来自所述调节元件的转录可分别响应于二价金属离子、铜或四环素而实现(Furst，etal.，(1988)Cell55：705-717(Furst等人，1988年，《细胞》，第55卷，第705-717页)；Mett，etal.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90：4567-4571(Mett等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第4567-4571页)；Gatz，etal.，(1992)PlantJ.2：397-404(Gatz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第397-404页)；Roder，etal.，(1994)Mol.Gen.Genet.243：32-38)(Roder等人，1994年，《分子遗传学和普通遗传学》，第243卷，第32-38页))；诱导型调节元件还包括蜕皮激素调节元件或糖皮质类固醇调节元件，来自所述调节元件的转录可响应于蜕皮激素或其他类固醇而实现(Christopherson，etal.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Schena，etal.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)；美国专利No.6,504,082)；冷响应调节元件或热休克调节元件，所述调节元件的转录可响应于分别暴露在冷或热下而实现(Takahashi，etal.，(1992)PlantPhysiol.99：383-390)(Takahashi等人，1992年，《植物生理学》，第99卷，第383-390页)；醇脱氢酶基因的启动子(Gerlach，etal.，(1982)PNASUSA79：2981-2985(Gerlach等人，1982年，《美国国家科学院院刊》，第79卷，第2981-2985页)；Walker，etal.，(1987)PNAS84(19)：6624-6628(Walker等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第19期，第6624-6628页))，其可被厌氧条件诱导；以及源自豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因的光诱导启动子(Yamamoto，etal.，(1997)PlantJ.12(2)：255-265)(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；光诱导调节元件(Feinbaum，etal.，(1991)Mol.Gen.Genet.226：449(Feinbaum等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第226卷，第449页)；LamandChua，(1990)Science248：471(Lam和Chua，1990年，《科学》，第248卷，第471页)；Matsuoka，etal.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)；Orozco，etal.，.(1993)PlantMol.Bio.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页))，植物激素诱导型调节元件(Yamaguchi-Shinozaki，etal.，(1990)PlantMol.Biol.15：905(Yamaguchi-Shinozaki等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第905页)；Kares，etal.，(1990)PlantMol.Biol.15：225(Kares等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第225页))等等。诱导型调节元件还可为玉蜀黍In2-1或In2-2基因的启动子，其对应于苯磺酰胺除草剂安全剂(Hershey，etal.，(1991)Mol.Gen.Gene.227：229-237(Hershey等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第227卷，第229-237页)；Gatz，etal.，(1994)Mol.Gen.Genet.Gen.Genet.243：32-38(Gatz等人，1994年，《分子遗传学与普通遗传学》，第243卷，第32-38页))和转座子Tn10的Tet阻遏子(Gatz，etal.，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237)(Gatz等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第227卷，第229-237页))；胁迫诱导型启动子包括盐/水胁迫诱导型启动子如P5CS(Zang，etal.，(1997)PlantSciences129：81-89)(Zang等人，1997年，《植物科学》，第129卷，第81-89页)；冷诱导型启动子如cor15a(Hajela，etal.，(1990)PlantPhysiol.93：1246-1252)(Hajela等人，1990年，《植物生理学》，第93卷，第1246-1252页)、cor15b(Wlihelm，etal.，(1993)PlantMolBiol23：1073-1077)(Wlihelm等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1073-1077页)、wsc120(Ouellet，etal.，(1998)FEBSLett.423：324-328)(Ouellet等人，1998年，FEBSLett.，第423卷，第324-328页)、ci7(Kirch，etal.，(1997)PlantMolBiol.33：897-909)(Kirch等人，1997年，《植物分子生物学》，第33卷，第897-909页)、ci21A(Schneider，etal.，(1997)PlantPhysiol.113：335-45)(Schneider等人，1997年，《植物生理学》，第113卷，第335-45页)；干旱诱导型启动子如Trg-31(Chaudhary，etal.，(1996)PlantMol.Biol.30：1247-57)(Chaudhary等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第1247-57页)、rd29(Kasuga，etal.，(1999)NatureBiotechnology18：287-291)(Kasuga等人，1999年，《自然生物技术》，第18卷，第287-291页)；渗透压诱导型启动子如Rab17(Vilardell，etal.，(1991)PlantMol.Biol.17：985-93)(Vilardell等人，1991年，《植物分子生物学》，第17卷，第985-93页)和渗透蛋白(Raghothama，etal.，(1993)PlantMolBiol23：1117-28)(Raghothama等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1117-1128页)和热诱导型启动子如热休克蛋白(Barros，etal.，(1992)PlantMol.19：665-75(Barros等人，1992年，《植物分子》，第19卷，第665-75页)；Marrs，etal.，(1993)Dev.Genet.14：27-41(Marrs等人，1993年，《发育遗传学》，第14卷，第27-41页))、smHSP(Waters，etal.，(1996)J.ExperimentalBotany47：325-338)(Waters等人，1996年，《实验植物学杂志》，第47卷，第325-338页)和来自欧芹遍在蛋白启动子的热休克诱导型元件(WO03/102198)。其他胁迫诱导型启动子包括rip2(美国专利No.5,332,808和美国专利申请公布No.2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi-Shinozaki，etal.，(1993)Mol.Gen.Genetics236：331-340)(Yamaguchi-Shinozaki等人，1993年，《分子遗传学与普通遗传学》，第236卷，第331-340页)。某些启动子通过创伤诱导，包括农杆菌pmas启动子(Guevara-Garcia，etal.，(1993)PlantJ.4(3)：495-505)(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)和农杆菌ORF13启动子(Hansen，etal.，(1997)Mol.Gen.Genet.254(3)：337-343)(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)。
在某些实施方案中，启动子基于例如是雄性育性还是雌性育性会受到影响来选择。因而，在雄性育性会受到影响的情况下，(例如，BS7基因和SB200基因)，启动子可为例如MS45基因启动子(美国专利No.6,037,523)、5126基因启动子(美国专利No.5,837,851)、BS7基因启动子(WO2002/063021)、SB200基因启动子(WO2002/26789)、TA29基因启动子(Nature347：737(1990))(《自然》，第347卷，第737页，1990年))、PG47基因启动子(美国专利No.5,412,085；美国专利No.5,545,546；PlantJ3(2)：261-271(1993)(《植物杂志》，第3卷，第2期，第261-271页，1993年))、SGB6基因启动子(美国专利No.5,470,359)、G9基因启动子(美国专利No.5,837,850和No.5,589,610)等等。在雌性育性会受到影响的情况下，启动子可靶向雌性生殖基因，例如子房特异性启动子。在某些实施方案中，可使用引导在目的组织中的表达的任何启动子，包括例如，组成型活性启动子，诸如遍在蛋白启动子，其通常影响在大多数或所有植物细胞中的转录。
在植物细胞中有活性并且可用于本发明的方法或组合物的另外的调节元件包括，例如，菠菜亚硝酸盐还原酶基因调节元件(Back，etal.，(1991)PlantMol.Biol.17：9)(Back等人，1991年，《植物分子生物学》，第17卷，第9页)；γ玉米醇溶蛋白启动子、油质蛋白ole16启动子、球蛋白I启动子、肌动蛋白I启动子、肌动蛋白cl启动子、蔗糖合成酶启动子、INOPS启动子、EXM5启动子、球蛋白2启动子、b-32、ADPG-焦磷酸化酶启动子、LtpI启动子、Ltp2启动子、油质蛋白ole17启动子、油质蛋白ole18启动子、肌动蛋白2启动子、花粉特异性蛋白启动子、花粉特异性果胶裂解酶基因启动子或PG47基因启动子、花药特异性RTS2基因启动子、SGB6基因启动子、或G9基因启动子、绒毡层特异性RAB24基因启动子、邻氨基苯甲酸合酶α亚基启动子、α玉米醇溶蛋白启动子、邻氨基苯甲酸合酶β亚基启动子、二氢吡啶二羧酸合酶启动子、Thil启动子、醇脱氢酶启动子、cab结合蛋白启动子、H3C4启动子、RUBISCOSS淀粉分支酶启动子、肌动蛋白3启动子、肌动蛋白7启动子、调节蛋白GF14-12启动子、核糖体蛋白L9启动子、纤维素生物合成酶启动子、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶启动子、过氧化物歧化酶启动子、C-激酶受体启动子、磷酸甘油酸变位酶启动子、根特异性RCc3mRNA启动子、葡萄糖-6磷酸异构酶启动子、焦磷酸-果糖6-磷酸-l-磷酸转移酶启动子、β-酮乙基-ACP合酶启动子、33kDa光合体系11启动子、产氧蛋白质(oxygenevolvingprotein)启动子、69kDa空泡ATP酶亚基启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、ABA-和成熟-诱导样蛋白启动子、苯丙氨酸解氨酶启动子、三磷酸腺苷酶S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶启动子、查尔酮合酶启动子、玉米醇溶蛋白启动子、球蛋白-1启动子、生长素结合蛋白启动子、UDP葡萄糖类黄酮糖基-转移酶基因启动子、NTI启动子、肌动蛋白启动子和奥帕克(opaque)2启动子。
推定的TATA盒可通过如CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel，etal.，eds；JohnWileyandSons，NewYorkpp.4.8.1-4.8.5(1987)(《分子生物学实验手册》，Ausubel等人编辑；约翰·威利父子出版公司，纽约，第4.8.1-4.8.5页，1987年)中所描述的引物延伸分析来鉴定。
基因的调节区如启动子可使用功能分析在基因组亚克隆中鉴定，通常通过观察报道基因表达来验证。调节区位于翻译起始位点的“上游”或5’方向的可能性，可通过将含有该上游区的DNA片段亚克隆到表达载体中进行瞬时表达实验来测试。预期，较小的亚基因组片段可含有表达所必要的区域。例如，已在源自较大的基因组块(genomicpiece)的相对较小的片段中鉴定了CaMV19S和35S启动子的必要区域，如美国专利No.5,352,605中所描述。
用以测试功能表达的适当表达载体的选择将取决于宿主和将表达载体引入到宿主中的方法，而且此类方法是本领域技术人员公知的。对于真核生物，载体中的区域包括控制转录的起始和控制加工的区域。这些区域与报道基因如UidA编码葡糖醛酸酶(GUS)或萤光素酶有效连接。植物表达载体和报道基因的一般描述和例子在以下文献中可找到：Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation”inMethodsinPlantMolecularBiology andBiotechnology；Glick，etal.，eds；CRCPress；pp.89-119；(1993)(Gruber等人，“用于植物转化的载体”，载于《植物分子生物学与生物技术方法》；Click等人编辑；CRC出版社；第89-119页；1993年)。GUS表达载体和GUS基因盒可从位于美国加州帕洛阿尔托市的克隆技术实验室公司(ClontechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)市售获得，而萤光素酶表达载体和萤光素酶基因盒可从位于美国威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司(PromegaCorporation，Madison，WI)市售获得。Ti质粒和其他农杆菌载体在以下文献和专利中有描述：Ishida，etal.，(1996)NatureBiotechnology14：745-750(Ishida等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)和美国专利No.5,591,616。
可将含有位于基因组片段中的推定调节区的表达载体引入到完整组织如阶段性(staged)花药、胚中或引入愈伤组织中。DNA递送方法包括微粒轰击、DNA注射、电穿孔和农杆菌介导的基因转移(参见Gruber，etal.，“VectorsforPlantTransformation”，inMethodsinPlantMolecularBiology andBiotechnology，Glick，etal.，eds.；CRCPress；(1993)(Gruber等人，“用于植物转化的载体”，载于《植物分子生物学与生物技术方法》；Click等人编辑；CRC出版社；1993年)；美国专利No.5,591,616和Ishida，etal.，(1996)NatureBiotechnology14：745-750(Ishida等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页))。培养植物组织的一般方法可在以下文献中找到：Gruber等人，出处同上，及Glick等人，出处同上。
缺失分析可在调节区的5’和3’末端进行：片段可通过定点诱使用聚合酶链式反应的诱变等获得(DirectedMutagenesis：APracticalApproach；IRLPress；(1991)(《定向诱变：实用方法》；IRL出版社；1991年)。调节区的3’末端可通过接近推定的TATA盒或如有必要的话通过3’缺失来界定。然后可将必要区域与选择的核心启动子有效连接。可例如通过接头扫描(一种本领域公知的方法)进行进一步的突变分析。突变可引入功能性的修饰，如在表达的水平上、在表达的时机上或在表达的组织上的修饰。突变还可以是沉默的，对启动子活性没有可观察的作用。
适合本发明目的的植物可为单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于玉蜀黍、小麦、大麦、裸麦、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁甘蓝、小红萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、夏南瓜、南瓜、大麻、西葫芦、苹果、梨、柑橘、甜瓜、李子、樱桃、桃子、蜜桃、杏子、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高梁、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥和木本植物诸如针叶树和落叶树。因而，本发明的转基因植物或经过遗传修饰的植物细胞可以为被子植物或裸子植物。
被子植物基于子叶数目被分为两大类，子叶为通常贮存或吸收食物的种子叶；单子叶被子植物具有单个子叶，而双子叶被子植物具有两个子叶。被子植物产生多种有用的产物，包括材料如木材、橡胶和纸；纤维如棉花和亚麻；药草和药物如奎宁和长春碱；观赏花卉如玫瑰，并且在被包括在本发明的范围内的情况下，兰科植物；以及食物，如谷类、油类、水果类和蔬菜类。被子植物涵盖各种开花植物，包括例如谷类植物、豆科植物、油料植物、阔叶树、结实作物和观赏花卉，这些一般类别不一定具有排他性。谷类植物，其产生可食用谷粒，包括例如，玉米、水稻、小麦、大麦、燕麦、裸麦、鸭茅、羊草和高粱。豆科植物包括碗豆家族(豆科(Fabaceae))的成员并且产生已知为豆类的特征性果实。豆科植物的例子包括，例如，大豆、豌豆、鹰嘴豆、乌头叶菜豆、蚕豆、菜豆、利马豆、兵豆、豇豆、干豆和花生，以及苜蓿、百脉根、三叶草和红豆草。具有用作油的来源的种子的油料植物包括大豆、向日葵、油菜籽(卡诺拉油菜)和棉籽。被子植物还包括阔叶树，其为通常具有单个茎(干)的多年生木本植物。此类树的例子包括桤木、白蜡树、山杨、椴木(椴树)、山毛榉、桦木、樱桃树、三角叶杨、榆树、桉树、山核桃树、刺槐、槭树、橡树、柿子树、白杨、悬铃木、胡桃、红杉和柳树。树可用作，例如，纸浆、纸、结构材料和燃料的来源。
被子植物产生包围在成熟子房内的种子。被子植物果实可适用于人类或动物食用或适用于种子的收集以繁殖物种。例如，蛇麻子为因其在麦芽酒中的风味而享有美誉的桑树科的成员。结实被子植物还包括葡萄、橙、柠檬、柚子、鳄梨、海枣、桃子、樱桃、橄榄、李子、椰子、苹果和梨树，以及黑莓、蓝莓、覆盆子、草莓、菠萝、番茄、黄瓜和茄子植物。观赏花卉为栽培用作装饰用花的被子植物。商业上重要的观赏花卉的例子包括玫瑰、百合、郁金香和菊花、金鱼草、山茶花、康乃馨和矮牵牛花植物并且可包括兰花。将认识到本发明还可使用裸子植物实施，其不会在果实中产生种子。
纯合性为当相同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时存在的遗传条件。杂合性为当不同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时存在的遗传条件。半合子状态为当仅有基因(或一组基因)的一个拷贝，而在姊妹染色体上没有对应等位基因时存在的遗传条件。
本文所用的植物育种方法是本领域技术人员公知的。有关植物育种技术的讨论，参见Poehlman，(1987)BreedingFieldCropsAVIPublicationCo.，WestportConn(Poehlman，1987年，《大田作物育种》，AVI出版公司，美国康涅狄格州韦斯特波特镇)。在这个方法中将为最优选的植物中有许多是通过利用植物的传粉方法的技术来育种的。
可使用回交方法将基因引入植物。该技术已使用了数十年以将性状引入植物。描述该技术的例子以及人们所熟知的其他植物育种方法可在如下参考文献中找到，例如PlantBreedingMethodology，edit.NealJensen，JohnWiley&Sons，Inc.(1988)(《植物育种方法》，NealJensen编辑，约翰·威利父子出版公司，1988年)。在典型的回交方案中，将原始目的品种(回交亲本)与携带待转移的单个目的基因的第二品种(非回交亲本)杂交。然后将这次杂交所得的后代再次与回交亲本杂交，并且重复该过程直至获得这样的植物，其中除了来自非回交亲本的单个转移基因之外，回交亲本的基本所有所需形态和生理特性都在该转换的植物上恢复。
转基因是指已通过基因工程技术被引入细胞的基因组的任何核酸序列。转基因可为天然DNA序列或异源DNA序列。术语天然DNA序列可指天然存在于细胞中但可能已由其初始形式进行了修饰的核苷酸序列。
使用熟知的技术，可基于其序列同源性分离另外的启动子序列。在这些技术中，将已知的启动子序列的全部或者一部分用作探针，所述探针与来自所选生物体的克隆的基因组DNA片段群体(即基因组文库)中存在的其他序列选择性杂交。本领域中现成可用于核酸序列的杂交的方法也可用于获得与如下物种中的这些启动子序列对应的序列，所述物种包括但不限于包括但不限于玉蜀黍(玉米；Zeamays)、卡诺拉油菜(甘蓝型油菜(Brassicanapus)、芜菁(Brassicarapassp.)、苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、裸麦(Secalecereale)、高粱(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musaspp.)、鳄梨(Perseaamericana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、橄榄(Oleaeuropaea)、燕麦、大麦、蔬菜类、观赏植物类和针叶树类。优选地，植物包括玉蜀黍、大豆、向日葵、红花、卡诺拉油菜、小麦、大麦、裸麦、苜蓿和高粱。
整个启动子序列或其一部分可用作能够与对应的启动子序列特异性杂交的探针。为实现在多种条件下的特异性杂交，这类探针包括独特的序列，并且优选地长为至少约10个核苷酸，并且最优选地长为至少约20个核苷酸。此类探针可用于通过熟知的聚合酶链反应(PCR)的过程来扩增来自所选的生物体的对应启动子序列。该技术可用于从所需的生物体分离另外的启动子序列，或用作诊断分析以确定启动子序列在生物体中的存在。例子包括对接种的DNA文库的杂交筛选(无论是噬菌斑还是菌落；参见例如Innis，etal.，(1990)PCRProtocols，AGuidetoMethodsandApplications，eds.，AcademicPress(Innis等人，1990年，《PCR方案，方法与应用指南)，学术出版社编辑)。
一般来讲，对应于本发明的启动子序列并且与本文公开的启动子序列杂交的序列将与所公开的序列具有至少50％同源性、55％同源性、60％同源性、65％同源性、70％同源性、75％同源性、80％同源性、85％同源性、90％同源性、95％同源性和甚至98％同源性或更多。
可操作本文所公开的具体启动子序列的片段以促进有效连接的分离的核苷酸序列的花粉偏好的表达。这些片段将包含本文所公开的具体启动子核苷酸序列的至少约20个连续核苷酸、优选地至少约50个连续核苷酸、更优选地至少约75个连续核苷酸、甚至更优选地至少约100个连续核苷酸。这类片段的核苷酸将通常包含该具体启动子序列的TATA识别序列。这种序列可通过使用限制酶切割本文公开的天然启动子序列来获得；通过从天然DNA序列或用PCR技术合成核苷酸序列来获得。具体参见Mullis，etal.，(1987)MethodsEnzymol.155：335-350(Mullis等人，1987年，《酶学方法》，第155卷，第335-350页)和Erlich，ed.(1989)PCRTechnology(StocktonPress，NewYork)(Erlich编辑，1989年，《PCR技术》，美国纽约斯托克顿出版社)。此外，这些片段的变体，诸如得自定点诱变的那些，都涵盖在本发明的组合物中。
启动子序列的生物活性变体也涵盖在本发明的组合物中。调节“变体”是其中已经修饰、移除或添加一个或多个碱基的启动子的修饰形式。例如，移除DNA序列的一部分的常规方法为结合DNA扩增使用核酸外切酶以生成双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于该目的的商业试剂盒以商品名Exo-SizeTM(美国马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs，Beverly，Mass.))销售。简单地说，该程序需要与DNA一起温育核酸外切酶III，以在3′至5′方向上在DNA模板的5′突出端、钝端或切口处逐步移除核苷酸。然而，核酸外切酶III不能移除3′，4-碱基突出端的核苷酸。用该酶定时的克隆的消化产生单向嵌套缺失。
调节序列变体的一个例子是通过在较大启动子中引起一个或多个缺失形成的启动子。可实现缺失启动子的5′部分直至转录起始位点附近的TATA盒，而不会消除启动子活性，如Zhu，etal.，(1995)ThePlantCell7：1681-89(Zhu等人，1995年，《植物细胞》，第7卷，第1681-89页)所述。此类变体应保持启动子活性，特别是驱动在特定组织中表达的能力。生物活性变体包括例如本发明的具有一个或多个核苷酸置换、缺失或插入的天然调节序列。可通过RNA印迹分析测量活性，当使用转录融合体时测量报告基因活性等等。参见例如Sambrook，etal.，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual(2nded.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，美国纽约冷泉港)，其以引用方式并入本文。
本发明中公开的花粉偏好的启动子的核苷酸序列及其变体和片段在与分离的核苷酸序列有效连接时可用于任何植物的遗传操纵，所述分离的核苷酸序列的表达将受控制以实现所需的表型响应。
有效连接至本文公开的调节元件的核苷酸序列可以为目标基因的反义序列。“反义DNA核苷酸序列”意在指与该核苷酸序列的5’-至-3’正常取向成相反取向的序列。当被递送到植物细胞中时，反义DNA序列的表达能防止目标基因的DNA核苷酸序列的正常表达。该反义核苷酸序列所编码的RNA转录物与目标基因的DNA核苷酸序列的转录所产生的内源信使RNA(mRNA)互补并能够与该内源信使RNA杂交。在这个情况下，由目标基因编码的天然蛋白的产生被抑制，以实现所需的表型响应。因此，受本文权利要求保护的调节序列可有效连接至反义DNA序列以降低或抑制植物中天然或外源蛋白质的表达。
基因表达的调节可根据其对各个细胞的影响来测量。性状的成功调节可通过高严格性，例如影响在特定细胞类型的所有或几乎所有细胞中的表达，或通过低严格性而实现。例如，在特定组织内对98％、95％、90％、80％或更少细胞中的表达的调节可产生所需的表型。
提到的所有参考文献均以引用方式并入本文。
除非另外明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。以下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本发明的范围。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施方案。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施方案，并旨在将修改形式和其他实施方案包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。
单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，否则分别地，核酸以5′至3′取向从左向右书写；氨基酸序列以氨基向羧基取向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。本文定义的术语通过参考本说明书整体得到更完整的定义。
实施例
实施例1.ACO基因的鉴定和分离。
使用生物信息学搜索工具来鉴定具有共同序列或序列元件的多核苷酸或多肽。使用四种ZmACO(玉蜀黍ACO)(SEQIDNO：4，8，10，20)来针对玉蜀黍数据库搜索任何另外的ZmACO序列。鉴定了十二种另外的ZmACO(SEQIDNO：2，6，12，14，16，18，82，83，84，85，86，87)。这些在玉蜀黍中鉴定的ACO具有ACC氧化酶活性的保守位点。还鉴定了四种ACO样序列(SEQIDNO：88，89，90，91)。所述ACO样序列具有那些保守位点中的大多数，但不是具有全部保守位点。
图1、4和5提供系统树以显示各种ZmACO和来自其他物种的ACO之间的关系。
实施例2.ACO2RNAi构建体(PHP583)及结果。
本研究的目的是使用转基因方法来降低玉蜀黍中的乙烯合成，以容许在干旱胁迫下生长和导致谷粒产量的提高。这个目标是通过用ACC氧化酶2发夹构建体沉默ACC氧化酶的表达来实现。
设计并建立了发夹构建体以沉默ACO2的表达。该质粒是通过将遍在蛋白启动子连接到含有ACO2序列的片段(SEQIDNO：41)的反向重复序列来产生，所述片段靶向ACO2基因进行下调。该构建体包括位于反向重复序列之间的ADH1内含子间隔区段。使用本领域已知的和在本文别处提到的方法，通过农杆菌介导的转化将PHP583引入到玉蜀黍中。图2证明靶向ACO2的RNAi构建体与对照相比有效地减低了内源ACO2转录物水平。
在大田产量试验中评估了在转基因玉蜀黍杂种中沉默ACO2的作用。通过用PHP583独立转化玉蜀黍株系产生了多个事件。将得自八个独立事件的转基因株系与适当的测交品系进行顶交。将转基因杂种在受控的干旱胁迫地点和正常的玉米带(Corn-Belt)地点进行测试。将转基因事件的谷粒产量与集团无效比较物(bulknullcomparator)进行对比评估。多位置统计分析表明，在8个事件中有4个相对于比较物具有统计学上显著(P＜0.1)的谷粒产量提高。在受控的干旱胁迫地点对该四个事件测定到显著的产量提高，并且在正常的玉米带地点没有测量到显著的产量损失。
用UBI：ZM-ACO2RNAi转化的转基因杂种事件在大田产量试验中在干旱条件下表现出改进的产量。本实施例证明，下调作物中的ACC氧化酶基因导致了该作物在干旱条件下的谷粒产量显著提高，并且在正常浇灌条件下没有显著的产量损失。
发夹构建体(ACO2(TR1))被设计用来下调ACO1、ACO2和ACO3的表达，ACO1、ACO2和ACO3是ACO家族的密切相关的成员，因此与ZmACO2(TR1)具有非常高的同一性。至今为止鉴定的其他ACO家族成员与该发夹构建体具有一定的同一性，但程度低得多。
表2.ACO家族成员与ZmACO2(TR1)的同一性百分数
ZmACO2(TR1)(299bp)中的同一性百分数位置
实施例3.ACO2-ACO5-ACO6RNAi堆叠构建体(PHP666)及结果
用来降低玉蜀黍中的乙烯合成以容许在干旱胁迫下生长和导致谷粒产量提高的转基因方法包括使用被设计用来同时降低ACO家族多个成员的表达的构建体。设计并建立构建体以经由ACC氧化酶2/5/6发夹沉默几种ACC氧化酶的表达。这个质粒是通过将遍在蛋白启动子连接到反向重复序列来产生，所述反向重复序列含有ACO2、ACO5和ACO6的单独片段(分别为SEQIDNO：41、42和43)，包括反向重复序列之间的ADH1内含子间隔区段在内。所述反向重复序列还靶向对应的亚家族成员：即ACO2发夹靶向ACO1、ACO2-1、ACO2-2和ACO3；ACO5发夹靶向ACO4、ACO5并潜在地靶向ACO8-1和ACO8-2；ACO6发夹靶向ACO6。使用本领域已知的和在本文别处提到的方法，通过农杆菌介导的转化将PHP666引入到玉蜀黍中。
图3显示靶向ACO2、ACO5和ACO6的RNAi构建体相对于对照有效地降低了这些基因的内源转录物水平。
在大田产量试验中评估了在转基因玉蜀黍杂种中降低多种(ACO2、ACO5、ACO6)ACC氧化酶的作用。通过用PHP666独立转化玉蜀黍株系产生了多个事件。将得自七个独立事件的转基因株系与适当的测交品系进行顶交。将转基因杂种在受控的干旱胁迫地点和正常的玉米带(Corn-Belt)地点进行测试。将转基因事件的谷粒产量与集团无效比较物(bulknullcomparator)进行对比评估。多位置统计分析表明，在7个事件中有4个相对于比较物具有统计学上显著(P＜0.1)的谷粒产量提高，并且在任何地点都没有产量损失。
用ZM-ACO2(TR1)/ZM-ACO5(TR1)/ZM-ACO6(TR1)RNAi构建体转化的转基因杂种事件在大田产量试验中在干旱条件下表现出改进的产量。本实施例证明，下调作物中的ACC氧化酶基因的组合导致了该作物在干旱条件下的谷粒产量显著提高，并且在正常浇灌条件下没有显著的产量损失。
实施例4.与玉蜀黍ACO基因天然相关的启动子序列。
使用生物信息学手段已鉴定了与ACO基因相关的调节区，并作为SEQIDNO：72-80和99-108提供。为评估启动子序列的功能，通过将启动子序列在各个位置尤其是在启动子区的最后700个碱基对进行截短制作缺失变体。
使用截短的变体制备构建体，与DS-REDEXPRESS标记和适当的终止子区连接。通过限制性分析确认成功的亚克隆。对转化的组织监测红色荧光的表达。
启动子多核苷酸的片段可保持或不保持启动子功能。启动子多核苷酸的片段可用来产生可在靶向该启动子的抑制构建体中有用的pIR(启动子反向重复序列，也称发夹)，该抑制构建体靶向该启动子导致与该被靶向的启动子有效连接的多核苷酸的下调。
Claims (30)
1.一种改进作物植物中的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括降低所述作物植物中的ACC氧化酶基因的表达并在植物栽培环境中栽培所述作物植物，在所述环境中所述作物植物暴露于非生物胁迫。
2.一种改进作物植物中的干旱耐受性的方法，所述方法包括降低所述作物植物中的ACC氧化酶基因的表达并在植物栽培环境中栽培所述作物植物，在所述环境中所述作物植物暴露于干旱胁迫。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述被下调的ACC氧化酶基因包含编码选自SEQIDNO：21-30、59、61、63、65、67、69、71和81-91的多肽或与所述多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列的多核苷酸。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述被下调的ACC氧化酶基因包含选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述ACC氧化酶基因被RNA干扰构建体下调，所述RNA干扰构建体包含靶向从选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列转录的内源mRNA序列的核酸元件。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述ACC氧化酶基因包含选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列，并且其中所述ACC氧化酶基因通过遗传修饰来下调。
7.一种耐受非生物胁迫的转基因玉蜀黍植物，所述转基因玉蜀黍植物在其基因组中包含下调内源ACO基因的表达的重组核酸，其中所述ACO基因包含编码选自SEQIDNO：21-30和81-91的多肽的多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的玉蜀黍植物，其中所述非生物胁迫是干旱、低氮、热或盐。
9.根据权利要求7所述的玉蜀黍植物，其中所述重组核酸下调ACO2、ACO5和ACO6中的一者或不止一者的表达。
10.根据权利要求9所述的玉蜀黍植物，其中所述重组核酸序列包含选自SEQIDNO：41-43的多核苷酸序列。
11.根据权利要求9所述的玉蜀黍植物，其中所述ACO2被包含SEQIDNO：41的重组核酸序列抑制，所述ACO5被包含SEQIDNO：42的重组核酸序列抑制，并且所述ACO6被包含SEQIDNO：43的重组核酸序列抑制。
12.根据权利要求7所述的玉蜀黍植物，其中所述核酸同时下调ACO2、ACO5和ACO6的表达。
13.一种植物细胞，所述植物细胞从根据权利要求7所述的玉蜀黍植物产生。
14.一种种子，所述种子从根据权利要求7所述的玉蜀黍植物产生。
15.一种提高作物植物在干旱条件下的谷粒产量的方法，所述方法包括降低作物植物中的乙烯的水平，其中所述乙烯水平的降低不伴随着所述作物植物内的ACC水平的降低，并且在作物栽培条件下栽培所述作物植物，其中所述作物植物暴露于干旱胁迫，从而提高所述作物植物的谷粒产量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述作物植物是玉蜀黍。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述乙烯水平通过下调编码ACC氧化酶的基因来降低。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述被下调的ACC氧化酶基因包含编码选自SEQIDNO：21-30、59、61、63、65、67、69、71和81-91的多肽或与所述多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列的多核苷酸。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述被下调的ACC氧化酶基因包含选自SEQIDNO：1-20、31-40、58、60、62、64、66、68和70的多核苷酸或与所述多核苷酸具有至少95％同一性的核苷酸序列。
20.一种基因下调构建体，所述构建体包含被转录成多个干扰性RNA转录物的分离核酸，其中所述干扰性RNA转录物降低编码选自SEQIDNO：21-30、59、61、63、65、67、69、71和81-91的多个多肽或与所述多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列的多个多核苷酸序列的表达。
21.根据权利要求20所述的构建体，其中所述构建体为发夹构建体。
22.一种载体，所述载体包含根据权利要求20所述的构建体。
23.一种下调玉蜀黍植物中的内源ACC氧化酶基因的方法，所述方法包括表达能降低选自SEQIDNO：1-20的内源ACC氧化酶或所述序列的等位基因变体的表达的重组核酸构建体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述内源ACC氧化酶基因的表达是通过包含选自SEQIDNO：41-43的多核苷酸序列的重组构建体来降低。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述被下调的ACC氧化酶基因选自SEQIDNO：3-6、11-12、32-33、36和39或选自作为SEQIDNO：3-6、11-12、32-33、36和39的等位基因变体的核苷酸序列。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述ACC氧化酶基因是ACO2。
27.根据权利要求23所述的方法，其中ACC氧化酶基因包含编码选自SEQIDNO：22和23的多肽的多核苷酸。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述作物植物是单子叶植物。
29.一种从玉蜀黍植物群体中选择干旱耐受性提高的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括针对ACO基因的表达的降低对植物群体进行筛选，所述ACO基因选自SEQIDNO：1-20或所述序列的等位基因变体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述玉蜀黍群体是近交系群体。
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