ES2538471T3 - Hidroxi fenil piruvato dioxigenasas (HPPD) derivadas de plantas y resistentes frente a herbicidas tricetónicos, y plantas transgénicas que contienen estas dioxigenasas - Google Patents

Abstract

Un método para seleccionar un polinucleótido que codifica una enzima de HPPD resistente a herbicidas tricetónicos que comprende cribar una población de secuencias que codifican una enzima de HPPD y seleccionar como secuencias que codifican una enzima de HPPD resistente a tricetonas aquellas secuencias que codifican una enzima que, en comparación con una enzima de HPPD de control tiene al menos una resistencia incrementada 2,5 o, preferiblemente, cuatro veces a herbicidas tricetónicos seleccionados entre herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas**Fórmula** y sus sales agroquímicamente aceptables, donde los grupos Ar A, B, D y E se escogen independientemente entre fenilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, donde los sustituyentes opcionales para los grupos A, B, D y E incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, - COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H, en los que R >= alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1 o R2, o ambos, son H y tanto R3 como R4 son H y R5 o R6, o ambos, son H, donde tanto R8 como R9 son H y R10 o R11, o ambos, son H, donde R12 o R13, o ambos, son H y R14 o R15, o ambos, son H y donde R1-R17 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H en los que R >= alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4; en comparación con herbicidas seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula**Fórmula** y sus sales agronómicamente aceptables, donde R1-R6 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H, en los que R >= alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, o es al menos 2,5 o preferiblemente 4 veces más resistente a herbicidas tricetónicos seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula**Fórmula**

Description

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codificada por la secuencia a orgánulos subcelulares tales como el cloroplasto o mitocondria, y la mencionada proteína dirigida puede tener la secuencia de (i) un péptido de tránsito de cloroplasto o (ii) un péptido de tránsito de cloroplasto-porción N-terminal de una proteína de cloroplasto-péptido de tránsito de cloroplasto.

El mencionado polinucleótido puede comprender además una secuencia que codifica una enzima que degrada o que destoxifica de otro modo un herbicida que inhibe HPPD, y/o una proteína capaz de otro modo de unirse específicamente al mencionado herbicida inhibidor de HPPD.

El polinucleótido puede comprender además una región que codifica (i) la diana para un herbicida no inhibidor de HPPD y/o (ii) una enzima que degrada o que destoxifica de otro modo un herbicida no inhibidor de HPPD y/o una región que codifica una proteína capaz de conferir, en material vegetal transformado con la región, resistencia a insectos, hongos y/o nematodos.

La dicha diana o enzima se puede seleccionar del grupo que consiste en citocromo p450, una glutationa S transferasa, glifosato oxidasa (GOX), fosfinotricina acetil transferasa (PAT), 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), acetolactato sintasa (ALS), protoporfirinógeno oxidasa (PPGO) y fiteno desaturasa (PD), o sus formas mutagenizadas o de otro modo modificadas.

También se describe una planta completa fértil morfológicamente normal obtenida mediante cualquiera de los métodos que se describen anteriormente.

También se describe el uso del polinucleótido que se puede seleccionar de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente en la producción de tejidos vegetales y/o plantas completas fértiles morfológicamente normales que son transgénicas para la enzima de HPPD resistente al inhibidor.

También se describe un método para controlar selectivamente malas hierbas en un locus que comprende plantas de cultivo y malas hierbas, en el que las plantas se obtienen mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente, en el que el método comprende aplicar al locus de una mala hierba una cantidad de control de un inhibidor de HPPD. El inhibidor de HPPD se puede seleccionar del grupo que consiste en herbicidas que tienen las Fórmulas 1 a 4 como se indican anteriormente. También se puede aplicar al locus un plaguicida seleccionado del grupo que consiste en un insecticida, un fungicida y un herbicida no inhibidor de HPPD.

La presente solicitud describe además el uso del polinucleótido que se puede seleccionar de acuerdo con cualquier método descrito anteriormente en la producción de una diana herbicida para el cribado in vivo de alto rendimiento de herbicidas potenciales. En particular, las regiones del polinucleótido que codifican la proteína se pueden expresar heterólogamente en E. coli o levaduras.

En un aspecto, se describen métodos para la selección de polinucleótidos que comprenden una región que codifica enzimas de HPPD que muestran un nivel de tolerancia inherente a ciertos herbicidas que es útil para la aplicación en plantas tolerantes a herbicidas. Además de mostrar un nivel elevado de tolerancia inherente a un inhibidor de HPPD seleccionado (valores koff, Ki o Kd) una enzima de HPPD codificada por un polinucleótido también puede, preferiblemente, poseer una estabilidad elevada y actividad catalítica elevada cuando la actividad catalítica se expresa mediante el parámetro kcat/Km.

Los métodos para medir la Km respecto al hidroxifenilpiruvato de enzimas de HPPD son muy conocidos. Sin embargo, hasta el momento, la inestabilidad relativa de HPPD ha impedido mediciones de valores de kcat reales, con una disminución relativamente nula. Por lo tanto, en un aspecto adicional, se describen métodos para la selección de polinucleótidos que comprenden una región que codifica enzimas de HPPD que muestran valores de kcat/Km comprendidos en un intervalo útil y determinado.

Se apreciará que se dispone de muchos métodos muy conocidos por los expertos para obtener polinucleótidos candidatos adecuados para el cribado y la selección que comprenden una región que codifica una HPPD procedente de diversos organismos fuente potenciales que incluyen microbios, plantas, hongos, algas, cultivos mixtos, etc. así como también fuentes medioambientales de ADN tales como el suelo. Estos métodos incluyen, entre otros, la preparación de ADNc o colecciones de ADN genómico, el uso de cebadores oligonucleotídicos degenerados de manera adecuada, el uso de sondas basadas en secuencias conocidas o ensayos de complementación (por ejemplo, para el cultivo con tirosina) así como también el uso de mutagénesis y reordenamiento con el fin de proporcionar secuencias que codifican HPPD recombinadas o reordenadas.

En ciertos aspectos de la selección, los polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican HPPD de control y candidatos se expresan en levaduras, en una cepa hospedante bacteriana, en un alga o en una planta superior tal como el tabaco o Arabidopsis y los niveles relativos de tolerancia inherente de las secuencias que codifican HPPD se criban de acuerdo con un fenotipo indicador visible de la planta o la cepa transformadas en presencia de diferentes concentraciones de los inhibidores de HPPD seleccionados. Las dosis respuesta y los desplazamientos relativos en las dosis respuesta asociados con estos fenotipos indicadores (formación de color marrón, inhibición del crecimiento, efecto herbicida, etc.) se expresan convenientemente en función de, por ejemplo, los valores de GR50 (concentración para una reducción del crecimiento de un 50%) o MIC (concentración inhibidora mínima) donde incrementos en los valores corresponden a incrementos en la tolerancia inherente de la HPPD expresada.

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transitoria de tejidos son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, infiltración foliar, infiltración a vacío e infección con Agrobacterium o bombardeo de los tejidos diana con partículas recubiertas con ADN.

En estos métodos de ensayo transitorios, el tejido tratado, por ejemplo, se transfiere de manera adecuada a medio que contiene un intervalo de concentraciones de los herbicidas seleccionados después de aproximadamente 0,1-7 días tras la transformación y se evalúan para determinar signos visibles de blanqueamiento después de unos 1-5 d adicionales. Con el fin de proporcionar un control interno que permita determinar diferencias en la expresión transitoria, los constructos utilizados para la transformación también pueden comprender un gen tal como GUS que expresa un producto fácilmente cuantificable. Aunque es un método preferido, una limitación de los métodos que se basan en la transformación estable de plantas para la selección de polinucleótidos incluye el número relativamente elevado de eventos (preferentemente superior a 25) requeridos, una escala temporal de varios meses requerida para conseguir datos y el cultivo selectivo adicional, el análisis de la segregación y en ensayo de generaciones adicionales que se requiere idealmente para resolver las variabilidades biológicas y para realizar comparaciones entre los genes de HPPD alternativos expresados a partir de diferentes constructos.

En aspectos particularmente preferidos adicionales de los métodos de selección se seleccionan polinucleótidos que comprenden una región candidata que codifica una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD en función de las mediciones in vitro de los niveles de resistencia inherentes comparativos del candidato expresado y de las enzimas de HPPD de control.

La combinación particular de métodos in vitro y criterio utilizados en la presente es nueva. Se ha observado en la presente que los principios activos de los herbicidas de HPPD que son, o que tienen el potencial de ser, comercialmente útiles también tienden a ser unos inhibidores de las enzimas de HPPD tan potentes que no se pueden obtener los valores de Ki y otros parámetros cinéticos útiles para comparar la resistencia inherente de las enzimas de HPPD a partir de una cinética enzimática de estado estacionario o métodos de ensayo enzimáticos basados en la IC50, como se ha descrito generalmente en la bibliografía de HPPD.

En general, los valores de IC50 aparente se pueden determinar mediante parámetros experimentales arbitrarios tales como la concentración de enzima utilizada en el ensayo y el tiempo que se permite para cada reacción. Tampoco, ni tan siquiera con el uso de métodos más apropiados, se sabía hasta la fecha que los procesos descritos hasta la fecha para purificar parcial o totalmente HPPD causaban un daño tal a la enzima que alteraba los valores de los parámetros cinéticos y hasta un grado tal que impedía la comparación útil entre las tolerancias inherentes de las enzimas de HPPD. En particular, el efecto de una proporción elevada de las moléculas de enzima dañadas y de la actividad catalítica disminuida (expresada en función de los sitios activos) como resultado de la purificación parcial consiste en reducir la fuerza aparente medida de las interacciones de unión a HPPD con inhibidores.

A modo de ilustración no limitante de los métodos in vitro preferidos en la presente, las secuencias de HPPD se pueden expresar convenientemente en una levadura o en E. coli utilizando, por ejemplo, la expresión con un promotor de la polimerasa T7 u otros métodos adecuados que son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar extractos adecuados para los experimentos in vitro mediante ruptura celular, eliminación de deshechos celulares y proteínas insolubles por centrifugación e intercambio de la fracción que contiene la enzima de HPPD soluble expresada en un tampón adecuado. El extracto preparado de esta manera puede, opcionalmente, congelarse en perlas y almacenarse a la temperatura del nitrógeno líquido hasta que se necesiten para su uso. Las enzimas de HPPD de control se preparan de una manera similar. Preferiblemente, se minimizan la manipulación y purificación parcial de la HPPD ya que, como se observa en la presente, la mayoría de los métodos para intentar purificar, u opcionalmente reconstituir con iones de hierro, conllevan pérdidas de actividad y capacidad de unión al inhibidor que podrán entorpecer las comparaciones deseadas entre la resistencia inherente y el nivel de actividad.

Opcionalmente, la enzima puede estar purificada en parte en presencia de inhibidores tales como los de estructura VIII (consulte más adelante) que tengan un efecto estabilizante pero que no se unan tan fuertemente que sean difíciles de eliminar posteriormente. Se han llevado a cabo de manera adecuada mediciones in vitro, por ejemplo, en extractos de E. coli donde la HPPD expresada procedente del transgén constituye, por ejemplo, un 0,25-10% de la proteína soluble total. En un aspecto particular de los métodos para la selección de polinucleótidos, se evalúa in vitro la resistencia inherente de las enzimas de HPPD expresadas en función de la velocidad de disociación del complejo enzima/herbicida (valor de koff) y/o de acuerdo con la constante de disociación (Kd) del complejo enzima/herbicida.

Por lo tanto, en un aspecto se describe un método para seleccionar polinucleótidos que comprenden una región que codifica una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD que comprende cribar una población de secuencias que codifican HPPD y seleccionar como secuencias que codifican una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD aquellas que codifican una enzima capaz de formar un complejo con inhibidores de HPPD herbicidas seleccionados entre la Fórmula 1 y/o la Fórmula 2 donde, en agua a pH 7,0 y a 25 ºC, la disociación de dicho complejo está gobernada por una constante de disociación (Kd) en el intervalo de 1-30 nM y/o una constante de la velocidad de disociación (koff) en el intervalo de 4 x 10-5 a 2 x 10-3 s-1 y donde el inhibidor de HPPD seleccionado tiene al menos un cuarto de la actividad herbicida de la mesotriona contra plantas dicotiledóneas. La actividad frente a plantas dicotiledóneas se refiere en la presente a la actividad herbicida promediada a lo largo de un intervalo de 6

o más de esas malezas dicotiledóneas y especies de cultivo utilizadas normalmente en las cribas utilizadas para descubrimiento de compuestos en la comunidad agroquímica. La actividad herbicida frente a las plantas dicotiledóneas también se refiere en la presente a la actividad debida al inhibidor per se más que a la debida a algunos metabolitos de este, potencialmente más herbicidas, que se puedan formar en la planta o de otra manera.

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relativos, que son todo lo que se necesita para determinar las relaciones requeridas de los valores de Kd de los inhibidores de HPPD seleccionados, se estiman indirectamente mediante competición con la unión de un patrón conocido u otro ligando “sustituto”. Un ligando sustituto de este tipo podría ser cualquier molécula incluido un péptido, opcionalmente, seleccionado inicialmente a partir de un colección de presentación en fagos, un aptámero de ARN o un fragmento de un anticuerpo. Preferentemente, es un inhibidor de HPPD marcado. Por lo tanto, se puede utilizar la estructura I o IV o V como un patrón marcado y diseñar experimentos donde los valores de Kd relativos de los inhibidores de HPPD seleccionados se evalúan en función de su capacidad para competir con la cantidad de patrón marcado unido a la HPPD de ensayo o de control y hacerla disminuir.

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ESTRUCTURA II. 3-[[2-metil-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.1]-octano-2,4-diona

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ESTRUCTURA III. 3-[[2-(etoximetil)-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.1]-octano-2,4-diona

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ESTRUCTURA IV. 1-[2-(metanosulfonil)-4-(trifluorometil)fenil]-3-ciclopropil-2-ciano-propano-1,3-diona

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sitios activos de HPPD frente a una concentración fijada de inhibidor marcado, es posible definir un gráfico de dilución del extracto frente a la cantidad de marca unida y, de esta manera, obtener la concentración de sitios de unión del inhibidor o “sitios activos”. Para monitorizar la reacción de unión son adecuados muchos métodos que incluyen, por ejemplo, la utilización de radiomarcas, RMN EPR, Biacore (Pharmacia), etc.

Debido a que la unión de algunos inhibidores de HPPD es bifásica es importante llevar a cabo la titulación de la unión cuidadosamente y variar el inhibidor y el tiempo ya que, en algunos casos, el resultado obtenido será cercano a “la mitad de los sitios” más que a una cuantificación total de la concentración de sitios activos. La reacción de unión que se utiliza para la titulación necesita que se permita, tanto como sea posible, que alcance el equilibrio con las modificaciones debidas a consideraciones prácticas de la estabilidad enzimática. Se apreciará que son posibles muchos métodos, más o menos rigurosos, para realizar las comparaciones cinéticas deseadas que puede que no conlleven la determinación explícita de kcat/Km pero que, basándose en los mismos principios básicos, lograrán el mismo resultado en lo que se refiere a la clasificación de las eficacias relativas de polinucleótidos que comprenden regiones que codifican una enzima de HPPD. Por ejemplo, los valores de kcat y por lo tanto los de kcat/Km se pueden obtener utilizando anticuerpos generados para polipéptidos de HPPD purificados por SDS PAGE con el fin de cuantificar la cantidad de polipéptido de HPPD en extractos brutos activos utilizando ensayos de tipo ELISA o Western fluorescente cuantitativo. Sin embargo, los métodos basados en la cuantificación del polipéptido son independientes de si el material representa enzima activa y, por esta razón, se prefieren los métodos para la determinación de kcat basados en la unión al inhibidor debido a que, para los inhibidores que se asemejan a intermedios de la reacción catalítica, la retención de esta capacidad de unirse fuertemente es equivalente a la retención de la función catalítica. Según se purifica adicionalmente la HPPD y se pierde más actividad, la enzima dañada aún se une al inhibidor marcado pero, según disminuye la actividad, una proporción creciente de esta unión se vuelve más débil y se intercambia más rápidamente. Por lo tanto, en un aspecto preferido del método, la fracción de sitios de unión del inhibidor que experimentan un intercambio relativamente rápido se descuenta en el cálculo de la kcat. Por lo tanto, por ejemplo, en extractos brutos de HPPD de Arabidopsis se observa habitualmente que, de la capacidad de unión total medida para la mesotriona (Estructura I), aproximadamente un 20-30% se intercambia rápidamente (t ½ ~30-40 min para la disociación de la mesotriona a 25 ºC, pH 7,0 en un 25% v/v de glicerol) mientras que un 80% se supone en la presente que corresponde a enzima activa que se intercambia lentamente (t ½ ~ 4 d para la disociación de mesotriona a 25 ºC, pH 7,0 en un 20% v/v de glicerol). Por lo tanto, en este caso, la Kcat se puede basar en la determinación de sitios activos calculada como ~ 80% de la capacidad de unión total medida, aunque los valores citados en esta solicitud no tienen en cuenta ese ajuste del potencial.

En un aspecto, la presente solicitud describe enzimas de HPPD resistentes a inhibidores de HPPD que no se obtienen a partir del maíz, trigo o cebada y que se caracterizan por la capacidad de la enzima de formar un complejo con la mesotriona donde la disociación de dicho complejo en agua a pH 7,0 y a 25 ºC está gobernada por una constante de disociación (Kd) que tiene un valor en el intervalo de 1,0 a 30 nM y/o donde la disociación de dicho complejo está gobernada por una constante de velocidad (koff) que tiene un valor en el intervalo de 4 x 10-5 a 2 x 10

3. En un aspecto adicional, la enzima resistente al inhibidor de HPPD mencionada se caracteriza adicionalmente por

tener un valor de kcat/Km en el intervalo de 0,1 a 5 s-1 µM-1 y, más preferentemente, en el intervalo de 0,8 a 5 s-1 µM-1

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En un aspecto adicional una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 o una secuencia que tiene, basándose en el método Clustal de alineación y cuando se compara a lo largo de cualquier fragmento concreto de 150 aminoácidos de la alineación, al menos un 93% de identidad con la secuencia de las SEC ID Nos 8, 10, 12, 14, 16 o 18 o una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD con la SEC ID No 4 o una secuencia que tiene, basándose en el método Clustal de alineación y cuando se compara a lo largo de cualquier fragmento concreto de 150 aminoácidos de la alineación, al menos un 91% de identidad con la secuencia de la SEC ID No 4.

Las estructuras de inhibidores de HPPD citadas en esta memoria descriptiva y en algunos de los aspectos preferidos de la descripción son como siguen. Obsérvese que independientemente de qué estructuras se dibujen en una forma ceto, estas estructuras también pueden existir en una forma enólica, y que todas estas formas y todas las otras formas tautómeras también están incluidas.

De acuerdo con aspectos particularmente preferidos (i) se pueden seleccionar polinucleótidos para codificar enzimas de HPPD resistentes a inhibidores de HPPD y ii) se pueden producir plantas que son sustancialmente tolerantes a ejemplos representativos del herbicida de Fórmula 4, tal como

2-[2-nitro-4-clorobenzoil]-4,4,6,6-tetrametilciclohexano-1,3,5-triona y/o

2-[2-metil-4-cianobenzoil]-4,4,6,6-tetrametilciclohexano-1,3,5-triona y/o

3-[[2-metil-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]-4,4,6,6-tetrametilciclohexano-1,3,5-triona.

Las estructuras de los inhibidores de HPPD específicos citadas como Estructuras numeradas I a VIII ya se han descrito. De acuerdo con aspectos preferidos particulares (i) se pueden seleccionar polinucleótidos para codificar enzimas de HPPD resistentes a HPPD y (ii) se pueden producir plantas que son sustancialmente tolerantes a una o más de estas estructuras. Obsérvese que independientemente de qué estructuras se dibujen en una forma ceto,

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estas estructuras también pueden existir en una forma enólica, y que todas estas formas y todas las otras formas tautómeras están también incluidas.

Se apreciará que las plantas transformadas, y de este modo el material vegetal transformado, de la presente descripción son tolerantes o resistentes a múltiples herbicidas dentro de los grupos de inhibidores de HPPD representados por las Fórmulas 1, 2, 3 y 4, así como a herbicidas que inhiben HPPD fuera de estos agrupamientos, tales como 5-metil-2-(2-cloro-3-etoxi-4-metanosulfonilbenzoil)-ciclohexano-1,3-diona.

También se apreciará que aquellas plantas que son tolerantes a inhibidores de HPPD seleccionados entre las Fórmulas 1 y 2 serán generalmente menos tolerantes o resistentes a herbicidas, representativos de las Fórmulas 3 y 4 tal como la estructura V. En consecuencia, aquellas plantas que son tolerantes a los inhibidores de HPPD seleccionados entre las Fórmulas 3 y 4 serán generalmente menos tolerantes o resistentes a herbicidas, representativos de las Fórmulas 1 y 2 tales como la estructura I (mesotriona). Allí donde las plantas son plantas transgénicas, el herbicida se puede aplicar pre-o post-emergencia, según las técnicas habituales para la aplicación de herbicidas.

La solicitud describe aún más una proteína codificada por los polinucleótidos actualmente descritos, y un vector que comprende estos polinucleótidos que comprenden una secuencia de HPPD bajo el control de expresión de un promotor derivado del gen que codifica la subunidad pequeña de rubisco, un promotor vírico de cestrum, un promotor de actina, un promotor de poliubiquitina, el promotor FMV35S, un promotor de plastocianina, un promotor de histona, el promotor CaMV35S y el promotor GST1. En un aspecto preferido adicional, en el que la mencionada planta es una monocotiledónea, la secuencia de HPPD está bajo el control de expresión de un promotor de poliubiquitina de maíz o un promotor vírico de cestrum. En todavía un aspecto preferido adicional, en el que la mencionada planta es una planta de cultivo dicotiledónea, la secuencia de HPPD está bajo el control de expresión de una subunidad pequeña de arabidopsis del promotor de rubisco, un promotor de actina de arabidopsis o un promotor vírico de cestrum.

El material vegetal transformado se puede someter a un primer inhibidor de HPPD – tal como un herbicida de tricetona – y se puede seleccionar visualmente en base a una diferencia de color entre el material transformado y no transformado cuando se somete al mencionado herbicida. El material no transformado se pone blanco y permanece blanco cuando se somete al procedimiento de selección, mientras que el material transformado se pone blanco pero más tarde se vuelve verde, o puede permanecer verde, igualmente, cuando se somete al mencionado procedimiento de selección. Las técnicas de transformación, selección y regeneración vegetal, que pueden requerir modificación normal con respecto a una especie vegetal particular, son bien conocidas para la persona experta. En aspectos preferidos del método de selección, el mencionado ADN (que distingue plantas transformadas de plantas no transformadas) comprende una región seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19, o comprende una región que codifica una HPPD, región la cual es complementaria a aquella que cuando se incuba a una temperatura entre 60 y 65ºC en una disolución salina tamponada con citrato de fuerza 0,3 que contiene 0,1% de SDS, seguido del aclarado a la misma temperatura con disolución salina tamponada con citrato de fuerza 0,3 que contiene 0,1% de SDS, todavía se hibrida con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19.

Cuando las secuencias de ensayo y de la invención son bicatenarias, el ácido nucleico que constituye la secuencia de ensayo tiene preferiblemente una TM dentro de 10ºC de la de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. En el caso de que la secuencia de ensayo y la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 se mezclen juntas y se desnaturalicen simultáneamente, los valores de TM de las secuencias están preferiblemente en 5ºC entre sí. Más preferiblemente, la hibridación se realiza en condiciones relativamente restrictivas, estando preferiblemente las secuencias de ensayo o de la invención soportadas. De este modo, una secuencia de ensayo o de la invención desnaturalizada se une preferiblemente primero a un soporte, y la hibridación se efectúa durante un período de tiempo específico a una temperatura de entre 60 y 65ºC en una disolución salina tamponada con citrato de fuerza 0,3 que contiene 0,1% de SDS, seguido del aclarado del soporte a la misma temperatura pero con una disolución salina tamponada con citrato de fuerza 0,1. Cuando la hibridación implica un fragmento de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19, las condiciones de hibridación pueden ser menos restrictivas, como será obvio para el experto.

En el caso de que el polinucleótido codifique más de una proteína, cada región codificante de la proteína puede estar bajo el control transcripcional de un promotor operable vegetal y terminador. Se puede desear dirigir los productos de traducción del polinucleótido hacia compartimientos subcelulares específicos dentro de la célula vegetal, en cuyo caso el polinucleótido comprende secuencias que codifican péptidos de tránsito de cloroplasto, secuencias que se dirigen a la pared celular, etc., inmediatamente 5’ de las regiones que codifican los mencionados productos de traducción maduros.

La expresión traduccional de las secuencias que codifican proteínas y que están contenidas en la mencionada secuencia de ADN se puede potenciar relativamente incluyendo secuencias potenciadoras de la traducción no traducibles conocidas 5’ de dichas secuencias que codifican proteínas. El experto está muy familiarizado con tales secuencias potenciadoras, que incluyen las secuencias derivadas de TMV conocidas como omega, y omega prima,

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de complejos con diversas enzimas de HPPD. Cada línea representa datos de un conjunto experimental individual diferente.

Estructura del inhibidor

HPPD de Arabidopsis. koff (s1) –glycerol (koff(s-1) +glicerol) HPPD de trigo koff (s-1) -glicerol (koff (s-1) +glicerol) HPPD de P. fluorescens koff (s-1) -glicerol (koff (s-1) +glicerol)

I

3,3x10-6 (2,0x10-6) 1,0x10-3 (3,8x10-4) 2x10-6 (8x10-6)

II

1,16x10-5 8,6x10-6 2,5x10-4 3,5x10-4 -5x10-5

III

1,1x10-5 >2,0x10-4

IV

(1,6x10-6) 8,3x10-6 (1,66x10-5) 6,2x10-5 (4,2x10-5) 1,8x10-4

V

1,25x10-6 (2,7x10-7) 4,2x10-6 >2 x 10-4

VI

2,0x10-6 2,5x10-5 >4 x10-4

VII

1x10-6 8,3x10-6 >3 x 10-4

De este modo, se puede observar, entre otros, que, según el método, los polinucleótidos que comprenden una región que codifica una enzima de HPPD se criban vía un procedimiento de expresión y ensayo in vitro con respecto a velocidades de disociación de enzima de HPPD/inhibidor de HPPD (valores de koff). Se puede observar además a partir del ejemplo anterior que un polinucleótido que comprende una región que codifica HPPD de trigo se selecciona como aquel que codifica una HPPD resistente a inhibidores, debido a que se encuentra que la relación (koff1/koff3) del valor de koff para el complejo de la HPPD de trigo expresada con estructura I (un compuesto seleccionado de la Fórmula 1) a aquella para el complejo formado con la estructura IV (un compuesto seleccionado de Fórmula 3) es 22,9 o 16,13, lo que es >>2,5 veces mayor que la relación derivada de forma similar de 1,25 ó 0,38 observada con respecto a la disociación del mismo par de inhibidores de la enzima de control de Arabidopsis. Como se puede observar, el cribado y la comparación se podrían haber hecho igualmente también, por ejemplo, con respecto a la estructura II (un compuesto seleccionado de la Fórmula 2) y estructura VII (un compuesto seleccionado de la fórmula 4), con el mismo resultado de que se seleccione un polinucleótido que comprende una región que codifica HPPD de trigo. En este caso, la relación koff2/koff4 con respecto a HPPD de trigo es 30 ó 42, que nuevamente es >2,5 veces mayor que la relación equivalente de 11 u 8,6 con respecto a la enzima de control de Arabidopsis. Como alternativa, un polinucleótido que comprende una región que codifica HPPD de trigo se criba y se selecciona en base a que codifica una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD capaz de formar un complejo en agua a pH 7,0 y a 25ºC con un inhibidor de HPPD herbicida, en este caso la estructura I o estructura II, en el que la disociación del mencionado complejo está gobernada por una constante de velocidad (koff) en el intervalo de 4 x 10-5 a 2 x 10-3 s-1 (en este caso, 3,8 x 10-4 ó 1,0 x 10-3 y 2,5 x 10-4/s o 3,5 x 10-4, respectivamente), y en el que el inhibidor de HPPD seleccionado tiene al menos un cuarto de la actividad herbicida de mesotriona frente a plantas dicotiledóneas (siendo esto cierto de la estructura II como, obviamente, de la propia mesotriona).

Como alternativa, el ejemplo ilustra que, según el método, un polinucleótido que comprende una región que codifica HPPD de Pseudomonas se selecciona como aquel que codifica una HPPD resistente a inhibidores, debido a que se encuentra que la relación (koff4/koff1) del valor de koff para el complejo de la HPPD de Pseudomonas expresada con la estructura VI (un compuesto seleccionado de fórmula 4) a aquella para el complejo formado con la estructura I (un compuesto seleccionado de fórmula 1) es >21,7 o >100, lo que es >>2,5 veces mayor que la relación derivada de forma similar de 0,6 observada con respecto a la disociación del mismo par de inhibidores de la enzima de control de Arabidopsis. Como se puede ver, el cribado y la comparación se podrían haber hecho igualmente también, por ejemplo, con respecto a la estructura IV (un compuesto seleccionado de fórmula 3) y la estructura I (un compuesto seleccionado de la fórmula 1), con el mismo resultado de que se seleccione un polinucleótido que comprende una región que codifica HPPD de Pseudomonas. En este caso, la relación koff3/koff1 con respecto a HPPD de Pseudomonas es 5,25 ó 90, lo que nuevamente es >2,5 veces mayor que la relación equivalente de 0,8 ó 2,5 con respecto a la enzima de control de Arabidopsis. Como alternativa, un polinucleótido que comprende una región que codifica HPPD de Pseudomonas se criba y se selecciona en base a que codifica una enzima de HPPD resistente a inhibidores de HPPD capaz de formar un complejo en agua a pH 7,0 y a 25ºC con un inhibidor de HPPD herbicida,

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