JPH09509319A

JPH09509319A - Ｒｎａ修正酵素およびその使用方法

Info

Publication number: JPH09509319A
Application number: JP7521999A
Authority: JP
Inventors: カズコニシクラ，
Original assignee: ザ・ウイスター・インステイテユート・オブ・アナトミー・アンド・バイオロジー
Priority date: 1994-02-17
Filing date: 1995-02-16
Publication date: 1997-09-22
Also published as: US5643778A; US5677428A; CA2183253A1; EP0748376A4; EP0748376A1; WO1995022604A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規のヒトポリヌクレオチド配列およびそれによりコードされる組換えヒトＤＲＡＤＡ蛋白質、およびそれらの使用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＲＮＡ修正酵素およびその使用方法本発明は、米国厚生省からの助成金番号ＧＭ４０５３６号、ＣＡ０９１７１号、およびＣＡ１０８１５号による資金援助を受けた。米国政府は本発明においてある一定の権利を有する。発明の分野本発明は一般的には遺伝子工学的技術を介する蛋白質の産生に関し、そしてより具体的には新規のＲＮＡ修正酵素のクローニングおよび使用に関する。発明の背景二本鎖アデノシンデアミナーゼ（ＤＲＡＤＡ）は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に特異的なアデノシンデアミナーゼである［ＢａｓｓａｎｄＷｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｃｅｌｌ、５５：１０８９−１０９８（１９８８）；Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：２６４７− ２６５１（１９８９）］。ＤＲＡＤＡは複数のアデノシン（Ａ）残基を加水分解的脱アミノ化反応によりイノシン（Ｉ）に脱アミノ化させるが［Ａ．Ｇ．Ｐｏｌｓｏｎｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０：１１５０７（１９９１）］、その反応は分子間および分子内ｄｓＲＮＡの両方で行われ［Ｎｉｓｈｉｋｕｒａｅｔａｌ．、ＥＭＢＯＪ．、１０：３５２３（１９９１）］、この反応によりｄｓＲＮＡ内にＩ−Ｕ不適正塩基対が形成される。ｄｓＲＮＡ内での広域にわたる不適正Ｉ−Ｕ塩基対の蓄積によりＲＮＡ二重らせんの巻き戻しがもたらされる。ＤＲＡＤＡは最初のかつこれまででは唯一のＲＮＡ−巻き戻し活性をもつものであり、この活性により基質ＲＮＡにおける付随的塩基の改変がもたらされる。このｄｓＲＮＡ巻き戻し／改変活性酵素は更に、その酵素がｄｓＲＮＡに特異的に結合するものとみなせる点において他のｄｓＲＮＡ巻き戻し／改変活性酵素もしくはＲＮＡヘリカーゼ類とは異なる。細胞ならびにウイルスの遺伝子転写物とのこの酵素活性のインビボ相互作用の数々の実例が既に報告されている［ＫｉｍａｎｄＮｉｓｈｉｋｕｒａ、Ｓｅｍｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、４：２８５−２９３（１９９３）］。例えば、母性繊維芽細胞成長因子遺伝子およびそのアンチセンス転写物までもが、減数分裂を受けるゼノパス（キセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ））卵巣細胞中ではＤＲＡＤＡによる広範囲な改変を受けているようである［ＫｉｍｅｌｍａｎａｎｄＫｉｒｓｃｈｎｅｒ、Ｃｅｌｌ、５９：６８７（１９８８）］。この酵素は偏った高突然変異誘発を伴う欠損麻疹ウイルスの発生の原因となっており、このことにより致死的ヒトＣＮＳ疾患、すなわち麻疹封入体脳炎がもたらされる［Ｃａｔｔａｎｅｏｅｔａｌ．、Ｖｉｒｏｌ．、５５：２５５（１９８８）；Ｂａｓｓｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ、５６：３３１（１９８９）］。それに加え、ＨＩＶＴＡＲの短いステム構造内に位置するアデノシンがｔａｔ依存的様式でＤＲＡＤＡによりイノシンへの改変を受けることが報告されている［Ｓｈａｒｍｅｅｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８８：８０９６（１９９１）］。この酵素はその基質となるＲＮＡの配列に変化をもたらすため、ＤＲＡＤＡがＲＮＡの修正過程にかかわっていることが予期される［ＫｉｍａｎｄＮｉｓｈｉｋｕｒａ、ＲＮＡＥｄｉｔｉｎｇ中、Ｒ．Ｂｅｎｎｅ、Ｅｄ（ＳｉｍｏｎａｎｄＳｃｈｕｓｔｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３）、ｐｐ．１７６−１９２、を参照されたい］。実際、ＤＲＡＤＡは現在のところ少なくともグルタミン酸−ゲート化イオンチャネルサブユニット類（グルタミン酸レセプター、ＧｌｕＲ）のＲＮＡ修正の原因となっているらしく、これは哺乳類の脳におけるニューロンの高速興奮の原因となっている［Ｍ．Ｈｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ、７５：１３６１ −１３７０（１９９３）］。従ってＤＲＡＤＡは哺乳類の脳におけるニューロン伝達の機能不全もしくは欠損機能（例えば、卒中、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ’ｓ）舞踏病、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病のような疾患、および他のそのような神経学的症状）を特徴とする症状もしくは障害への関連が示唆され、かつ更には老齢化にも関連する可能性もある。当該技術分野においては、遺伝子工学における使用、有用な蛋白質の組換え体産生、ならびに薬剤の開発およびスクリーニングを可能にさせるような、ＤＲＡＤＡについて記載される酵素活性を示す蛋白質の単離および該蛋白質産生組換え体についての要望が存在する。発明の要約ある態様では本発明は、ヒトＤＲＡＤＡ蛋白質をコードする新規の単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。これらの蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列が図１Ａ−１Ｊ［配列番号１］に詳細に記載されている。これらの配列の断片も更に本発明の態様とされる。これらのポリヌクレオチド配列もしくはそれらの断片は更に、場合によっては診断もしくは研究用の使用のために通常用いられるラベルと組み合わしてもよい。他の態様では本発明は、ＲＮＡ修正活性を有することを特徴とするヒトＤＲＡＤＡ蛋白質を提供する。これらの蛋白質はそれらが天然の状態で結合している他の細胞性物質から単離され、かつＤＲＡＤＡ−様ＲＮＡ修正機能に関与する生物学的活性を有する。これらのＤＲＡＤＡ蛋白質（図２Ａ〜２Ｃに略図的に説明されている）は、本明細書では１４０ｋＤの蛋白質［配列番号２の内のアミノ酸１ −１２２６］、約９３ｋＤの蛋白質［配列番号２の内のアミノ酸４０４−１２２６］、および約８８ｋＤの蛋白質［配列番号２の内のアミノ酸４４０−１２２６］として表示される。約８３ｋＤの蛋白質もまたポリアクリルアミドゲル上で同定され、かつ生化学的に精製された。有利なことにこれらの蛋白質の内の一種もしくは複数を組換え的に産生することが可能である。更に別の態様では本発明は、少なくとも先に記載されるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、そのような発現ベクターで形質転換させた宿主細胞、およびそれらのベクターおよび宿主細胞をＤＲＡＤＡ蛋白質の組換え体産生に用いる方法が提供される。更に別の態様では本発明は、免疫原としてのそれらのヒトＤＲＡＤＡ蛋白質もしくはその断片の内の一つの使用により作製されるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を提供する。更に別の態様では本発明は、例えばＤＮＡプローブのような診断用試薬、すなわち本発明の蛋白質の内の一つをコードするポリヌクレオチド配列もしくはその相補鎖から取得されるオリゴヌクレオチド断片）を提供する。これらの試薬は場合によっては検出用ラベルと結合させることができる。更に別の態様では本発明は、先に記載されるポリ−もしくはオリゴ−ヌクレオチド配列、蛋白質もしくは抗体を、欠損もしくは異常ＤＲＡＤＡを特徴とする障害を治療するための治療用組成物中の作用物質として用いるための様々な方法を提供する。更に別の態様では本発明は、中枢神経系に影響を及ぼすことが可能な神経学的障害もしくは疾患（例えば、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、ＨＩＶ、もしくは亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ））の治療のための治療剤として有用な化合物を開発およびスクリーニングする際の、それらの新規の先に同定されている蛋白質、配列、および抗体の使用のための方法を提供する。更に別の方法では本発明は、先の方法の使用により産生される化合物もしくは薬剤を提供する。本発明の他の態様および利点は、本発明の好ましい態様の以下の詳細な記述において更なる記載がなされている。図面の簡単な説明図１Ａ−１Ｊは、ヒトＤＲＡＤＡ蛋白質の連続的ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列［配列番号１および２］を詳細に説明する。仮想的二部構造性核局在化シグナルを四角で囲んである。９３ｋＤおよび８８ｋＤの蛋白質のＮ−末端配列を矢印により示してある。ｄｓＲＮＡ結合性モチーフ（ＤＲＢＭ）の３つの反復構造に下線を施してある。図２Ａは、ヒトＤＲＡＤＡの１４０ｋＤ形態のためのの読み取り枠（ＯＲＦ）と共に、黒四角により示される仮想的核局在化シグナルおよびハッチングにより示されるｄｓＲＮＡ結合性モチーフ（ＤＲＢＭ）を棒グラフで図示する。図２Ｂは、ヒトＤＲＡＤＡの９３ｋＤの切断形態のためのＯＲＦと共にハッチングにより示されるＤＲＢＭを棒グラフで図示する。図２Ｃは、ヒトＤＲＡＤＡの８８ｋＤの切断形態のためのＯＲＦと共に、ハッチングにより示されるＤＲＢＭを棒グラフで図示する。図３は、ヒトＤＲＡＤＡ蛋白質のＯＲＦの制限マップを図示しており、エンドヌクレアーゼ酵素制限部位および開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＧ）翻訳コドン、ならびに重複性ヒトｃＤＮＡクローン、ＨＵＣ１〜４も共に図示する。図４Ａは、黒四角により示される仮想的核局在化シグナル（ＮＵＣ）およびハッチングにより表されるＤＲＢＭと共に、プラスミドｐＶＬＤＲＡＤＡ１４０のプラスミドを棒グラフで図示する。図４Ｂは、黒四角により示される仮想的核局在化シグナル（ＮＵＣ）およびハッチングにより表されるｄｓＲＮＡ結合性モチーフ（ＤＲＢＭ）を共に、プラスミドｐＶＬＤＲＡＤＡΔのプラスミドを棒グラフで図示する。図５は、ＤＲＡＤＡ−１［配列番号３］、ＤＲＡＤＡ−２［配列番号４］、およびＤＲＡＤＡ−３［配列番号５］とし、かつ図１Ａ〜１Ｊ中に下線を施すことにより示されるヒトＤＲＡＤＡの３つのＤＲＢＭと、ＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースから取得される他のｄｓＲＮＡ結合性蛋白質のＤＲＢＭ（Ｐ６８キナーゼ−１［配列番号６］、Ｐ６８キナーゼ−２［配列番号７］、ＴＩＫキナーゼ−１［配列番号８］、ＴＩＫキナーゼ −２［配列番号９］、ＨｕＴＲＢＰ−１［配列番号１０］、ＨｕＴＲＢＰ−１［配列番号１１］、ＨｕＴＲＢＰ−３［配列番号１２］、Ｘ１ＴＲＢＰ−１［配列番号１３］、Ｘ１ＴＲＢＰ−２［配列番号１４］、Ｘ１ＴＲＢＰ−３［配列番号１５］、Ｓｔａｕｆｅｎ−１［配列番号１６］、Ｓｔａｕｆｅｎ−２［配列番号１７］、Ｓｔａｕｆｅｎ−３［配列番号１８］、Ｓｔａｕｆｅｎ−４［配列番号１９］、Ｓｔａｕｆｅｎ−５［配列番号２０］、Ｈｕｓｏｎ−ａ［配列番号２１］、Ｅ３Ｌ［配列番号２２］、Ｎｓ３４［配列番号２３］、Ｐａｃ１［配列番号２４］、ＲＮａｓｅＩＩＩ［配列番号２５］、およびこれら全配列に基づくコンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列［配列番号２６］を含む）との比較を図示する。太字体のアミノ酸は、この図にリストされる配列間の共通の位置において最も高頻度で生じるアミノ酸を表す。α−ヘリックスの位置も示されている。発明の詳細な記述本発明は、二本鎖ＲＮＡアデノシンデアミナーゼ酵素（ＤＲＡＤＡ）をコードする、単離および特性決定のなされているヒトＤＮＡ配列およびその断片を提供する。ＤＲＡＤＡおよびその蛋白質断片は、グルタミン酸−ゲート化イオンチャンネルサブユニットの生成のｍＲＮＡ修正の原因となっている。本発明のポリヌクレオチド配列を提供することにより、組換え宿主細胞内での前記配列の発現によりＤＲＡＤＡ蛋白質を産生することが可能となる。それらの蛋白質は組換え技術により産生されるため、ヌクレオチド配列および得られる発現された蛋白質の両方共、他の配列、細胞性物質、もしくは蛋白質物質の混入を生じることがない（天然の状態ではこれらの物質と共にそのヌクレオチドおよび蛋白質は生じるてくる）。Ｉ．ＤＲＡＤＡ蛋白質ＤＲＡＤＡ蛋白質は、約１２２６のアミノ酸蛋白質配列および約１４０ｋＤの見かけ上の分子量を特徴とする［配列番号２］（図１Ａ〜１Ｊを参照されたい）。このＤＲＡＤＡ蛋白質の断片も本発明に含まれる。好ましくは、１４０ｋＤのＤＲＡＤＡおよびそれらの断片はｄｓＲＮＡデアミナーゼ活性を共有することにより特徴付けられる。本発明のＤＲＡＤＡ断片は生物学的に活性であり、かつ全長ヒトＤＲＡＤＡと類似の生物学的活性を有する。ＤＲＡＤＡのＮ−末端切断型であることが既に判明している以下の断片が特に好ましい。すなわち、それらは配列番号２のアミノ酸４０４〜１２２６にまたがり、かつ９３ｋＤの見かけ上の分子量を有するＤＲＡＤＡ蛋白質；および配列番号２のアミノ酸４４０〜１２２６にまたがり、かつ８８ｋＤの見かけ上の分子量を有するＤＲＡＤＡ蛋白質、である。ポリアクリルアミドゲル上で８３ｋＤの見かけ上の分子量を有し、かつ生化学的に精製されたＤＲＡＤＡ蛋白質も同定された。更に本明細書で提供されるＤＲＡＤＡ蛋白質のアナログもしくは改変体も本発明に含まれる。典型的にはこのようなアナログはほんの１、２、３、もしくは４のコドン変化による差異を生じており、かつＤＲＡＤＡ−様生物活性により特徴付けられる。これらの例には、ＤＲＡＤＡの説明されるアミノ酸配列（図１Ａ〜１Ｊ；配列番号２）からの主要でないアミノ酸変異（特に保存的アミノ酸置換）を伴うポリペプチドが含まれる。保存的置換は、それらの側鎖および化学特性に関連するアミノ酸一族内で生じるものである。その上、本発明のＤＲＡＤＡ蛋白質［配列番号２］を改変させて、例えばその産生を改善させるか、蛋白質の安定性もしくは他の特性（例えば、結合性活性もしくは生物学的利用能）を高めるか、競合的化合物をスクリーニングするためのその使用を向上させるか、あるいはその蛋白質に他の幾つかの所望される特徴を付与することもできる。例えば、配列番号のアミノ酸のおおよそ７９７〜１２２６のカルボキシル末端に位置するＤＲＡＤＡの触媒ドメインを個別に切り出して化合物のスクリーニングに一層有用なＤＲＡＤＡ蛋白質を取得することができる。別法では本発明のＤＲＡＤＡ蛋白質を切断もしくは改変させて、配列番号２のアミノ酸１６９−１７０および１８１−１８５に存在する図１Ａ−１Ｊに示される仮想的核局在化シグナルを除去することができる。同様に、所望される場合には図３中、配列番号２のアミノ酸５０２−５７３（ＤＲＢＭ１）、配列番号２のアミノ酸６１３−６８４（ＤＲＢＭ２）、および配列番号２のアミノ酸７２５−７９６（ＤＲＢＭ３）において下線によりに示されるｄｓＲＮＡ結合部位を、一つもしくは複数のアミノ酸残基の欠失もしくは修飾により改変させて、その結合部位への結合およびＤＲＡＤＡの機能の阻害が可能である化合物のスクリーニングのための別の標的を提供することができる。同様にＤＲＡＤＡのリン酸化部位（これは多様な通常のコンピュータープログラムにおけるそれらの既知のモチーフにより同定することができる）を、化合物の結合もしくは不活化のためのスクリーニングにおける使用のために切り出すもしくは変化させることができる。配列分析により、ＤＲＡＤＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合性蛋白質一族の新規のメンバーであることが示される。クローン化ｃＤＮＡによりコードされるＤＲＡＤＡ蛋白質のアデノシンからイノシンへの転化活性は、昆虫細胞における組換え発現により確認された。分子プローブとしてのクローン化ＤＮＡの使用により哺乳類全体に及ぶ配列保存が示され、かつ分析が施された全ヒト組織のＲＮＡ中に７ｋｂの単一転写物が検出された。ヒトＤＲＡＤＡの演繹される一次構造により、二部構造性核局在化シグナル、ｄｓＲＮＡ結合性モチーフの３つの反復構造、およびデアミナーゼ類（アポリポ蛋白質ＢのＲＮＡ修正に関わるシチジンデアミナーゼを初めとする）の触媒中心に保存される配列の存在が明らかにされた。ＤＲＡＤＡが他の遺伝子系に関与していること、およびグルタミン酸−ゲート化イオンチャネルのサブタイプであるＧｌｕＲ−Ｂ転写物に加え、複数の標的遺伝子が異なる組織内に存在するということが期待される。ＤＲＡＤＡはそれらの追加的標的についての修正能という点で用いられることがある。スポドプテラフルギペルデイア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄｅｉａ）昆虫細胞もしくは２９３哺乳類細胞のいずれかにおいて本発明の組換え的に発現されるＤＲＡＤＡ蛋白質を用いることで、本発明者は、ＤＲＡＤＡがＧｌｕＲ−ＢＲＮＡをインビトロで修正することが可能であることを直接的に証明した。本発明のＤＲＡＤＡ蛋白質は治療用組成物として有用であり、それは以下のパートＶＩにおいて一層詳細に記載される。これらの蛋白質は更に診断用適用において、ならびに例えば抗−ＤＲＡＤＡ抗体のような他の治療用および診断用試薬の作製用にも有用である可能性がある。他の蛋白質と共通し、一般的にこれらの新規に同定されたＤＲＡＤＡ蛋白質はやはり、分子量標識として、もしくは他の態様ではスクリーニングアッセイとして、もしくは研究用の道具としても有用であることがある。このＤＲＡＤＡ蛋白質がＤＲＡＤＡの作用を防止もしくは促進させるのに有用であり、かつそのことによりイオンチャネル発現を矯正する化学的治療用作用物質のスクリーニングおよび開発にも有用であることが一層望ましい。ＩＩ．ＤＲＡＤＡポリヌクレオチド配列ＤＲＡＤＡ遺伝子は８０ｋｂ塩基対にわたって広がり、かつ１６のエキソンを含んでいる。典型的なＴＡＴＡボックスを含む仮想的プロモーター領域により稼働されるＤＲＡＤＡ遺伝子の転写は、翻訳開始コドンの約１８０ヌクレオチド上流で開始する。各々が約７０アミノ酸残基の長さである３つのｄｓＲＮＡ結合性モチーフすなわちドメインは２つのエキソンによりコードされており、一つの介在性配列が相同のアミノ酸の位置で各モチーフを中断しており；従ってこのことにより、そのｄｓＲＮＡ結合性ドメインが２つの個別の機能的サブドメインからできていることが示される。染色体ｌｑ２１領域の長腕に対する蛍光インサイチューハイブリダイゼーションはＤＲＡＤＡ遺伝子に局在していた。ヒトＤＲＡＤＡｃＤＮＡの約６６７１ｂｐのポリヌクレオチド配列が図１Ａ〜１Ｊ［配列番号１］に提供されている。これらの配列はＧｅｎＢａｎｋデータベース（受託番号Ｕ１０４３９号）に寄託してある。この配列は全長ＤＲＡＤＡ蛋白質のための約１２２６アミノ酸蛋白質配列をコードし、かつこのポリヌクレオチド配列の部分は９３、８８、および８３ｋＤの見かけ上の分子量を有するＤＲＡＤＡのＮ−末端欠損蛋白質をコードする。ＤＲＡＤＡのヌクレオチド配列は短い５’非翻訳領域（１５４ｂｐ）、および長い３’ 非翻訳領域（３３３６ｂｐ）を含み、その３’非翻訳領域には９９塩基のポリアデニル化領域が含まれる。現在の時点ではこのＤＮＡがＤＲＡＤＡｍＲＮＡの５’末端もしくはキャップ部位を含むか否かは未知である。図２Ａに示されるように、ＤＲＡＤＡは単一ＯＲＦ（細い白枠）を含む。既述の切断されたＤＲＡＤＡ蛋白質配列をコードするポリヌクレオチド断片に加え、これらの配列の他の断片が多種多様な用途にとって有用であること判明する可能性もある。これらの断片が少なくとも約１５ヌクレオチドの長さのものであり、かつ所望されるアミノ酸配列（例えば、エピトープ、もしくはＤＲＡＤＡ −様生物学的活性を特徴とすることが所望の治療的に有用なペプチドなど）をコードすることが望まれる。本発明のこれらのヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応もしくはクローニング技術（例えば以下に記載される実施例１および３においてウシおよびヒトの配列を取得する際に記載されるもののようなもの）の通常の使用により単離できる。別法ではこれらの配列は通常の遺伝子工学的技術もしくは化学合成的技術を用いて構築することができる。本発明に従うと、先に記載されかつ図１Ａ〜１Ｊに提供されるコード化ＤＲＡＤＡ蛋白質［配列番号２］をコードする核酸配列［配列番号１］は改変できる。これらの図における配列データを用いることで、本発明の蛋白質をコードする他のポリヌクレオチド配列を取得することは当業者の技術範囲内に含まれる。核酸レベルでのそのような改変には例えば、サイレントであるか、あるいは例えば発現もしくは分泌を改善させるためにアミノ酸を変化させるヌクレオチド配列への改変が含まれる。更に他の別法では、ポリヌクレオチド配列が、所望される場合には定量を容易にさせる目的で容易にアッセイすることが可能な標識を付加することで修飾してもよい。ヌクレオチドは、例えばインビトロ突然変異誘発およびプライマー修復を初めとする既知の技術により置換、挿入、もしくは欠失を施されることがある。遺伝子コードの天然の縮重により生じる対立遺伝子変異体もそれらに含まれる。本明細書に記載されるＤＲＡＤＡ蛋白質［配列番号２］をコードする単離された核酸配列［配列番号１］に加えて、本発明は更に他の核酸配列を含み、それらには例えばアンチセンス配列のような説明されるＤＮＡ配列に相補的なものが含まれる。有用なＤＮＡ配列には更に、高緊縮性もしくは中程度に高い緊縮性条件下で［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）、ページ３８７〜３８９、を参照されたい］図１Ａ〜１Ｊに説明されるＤＮＡ配列にハイブリダイズする配列も含まれる。高緊縮ハイブリダイゼーション条件の一例は、４×ＳＳＣ、６５℃ でのハイブリダイゼーション、およびその後の０．１×ＳＳＣ、６５℃で１時間の洗浄である。別法では例示的な高緊縮ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、４２℃である。他の中程度に高い緊縮条件も有用であると判明することがあり、それは例えば、４×ＳＳＣ、５５℃でのハイブリダイゼーション、およびその後の０．１×ＳＳＣ、３７℃で１時間の洗浄である。別法では例示的な中程度に高い緊縮性ハイブリダイゼーション条件は５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣで３０分のものである。これらの蛋白質をコードする核酸配列はそれ自体、多様な診断的および治療的使用に有用である。有利なことにこれらの核酸配列は、ＤＲＡＤＡ酵素とグルタミン酸−ゲート化イオンチャネルとのコミュニケーションの欠損もしくは異常を特徴とする多様な遺伝子障害の検出および診断における使用のための診断用プローブおよびアンチセンスプローブの開発に有用である。オリゴヌクレオチドプローブは、サザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）およびポリメラーゼ連鎖反応のような標準的診断技術において有用であることがある。以下のパートＶおよびＶＩにおける検討を参照されたい。本発明の核酸配列は更に、ヒトＤＥＡＤＡ蛋白質の産生においても有用である。以下の実施例１に更なる詳細が記載される要領で一旦構築もしくは単離したら、これらのＤＮＡ配列もしくは適切な断片を利用して本発明の蛋白質を取得することが好ましい。ＩＩＩ．ＤＲＡＤＡの組換え発現本発明の組換えＤＲＡＤＡ蛋白質を産生するためには、本発明のＤＮＡ配列を適切な発現系内に挿入する。ＤＲＡＤＡをコードするポリヌクレオチド配列がヒトのＤＲＡＤＡ蛋白質の発現を可能にさせる異種発現制御配列に操作可能に連結される組換え分子すなわちベクターを構築することが所望される。哺乳類（ヒトを含む）発現、昆虫（例えば、バキュロウイルス）の発現、イースト、真菌類、および細菌の発現のための、標準的分子生物学的技術による多くのタイプの適切な発現ベクターおよび宿主細胞系が当該技術分野において知られている。これらのベクターの適切な宿主細胞内への形質転換により、選択されたＤＲＡＤＡ蛋白質の発現をもたらすことが可能である。当該技術分野において知られる多数のタイプの内の他の適切な発現ベクターもこの目的に有用であことも可能である。この方法によるトランスフェクションに適切な宿主細胞もしくは細胞株には、例えばスポドプテラフルギペデラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｄｅｒａ）（Ｓｆ９）細胞のような昆虫細胞が含まれる。このような宿主細胞の構築および形質転換のための方法は熟知されている。［例えば、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８：２７７−２９８（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ１９８６）およびそこに引用されている引用文献を参照されたい］。同様に例えばヒト２９３細胞、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒ）の卵巣細胞（ＣＨＯ）、サルＣＯＳ−１細胞株、あるいはスイス（Ｓｗｉｓｓ）、Ｂａｌｂ−ｃ、もしくはＮＩＨマウスから取得されるマウス３Ｔ３細胞のような哺乳類細胞を用いることができる。形質転換、培養、増幅、スクリーニング、ならびに産物の産生および精製に適切な哺乳類宿主細胞および方法が当該技術分野において知られている。［例えば、ＧｅｔｈｉｎｇａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０−６２５（１９８１）、もしくは別法ではＫａｕｆｍａｎｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５（７）：１７５０−１７５９（１９８５）、あるいはＨｏｗｌｅｙｅｔａｌ．、米国特許第４，４１９，４４６号、を参照されたい］。他の適切な哺乳類細胞株はＣＶ−１細胞株である。細菌細胞は本発明に適する宿主細胞として同様に有用である。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の様々な株（例えば、ＨＢ１０１、ＨＣ１０６１、および以下の実施例において用いられる株）は生物工学の分野における宿主細胞として熟知されている。Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、および他の杆菌なども本方法において利用することができる。当業者に知られるイースト細胞の多くの株も、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。他の真菌類細胞も発現系として利用することができる。従って本発明は組換えヒトＤＲＡＤＡ蛋白質を産生するための方法を提供し、その方法は転写調節配列の制御下にヒトＤＲＡＤＡ蛋白質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの発現ベクターで宿主細胞を形質転換させることを必要とし、その形質転換は一例では例えばトランスフェクションもしくは電気穿孔法のような通常の手法により行われる。その後に形質転換細胞を、ヒトＤＲＡＤＡ蛋白質の発現を可能にさせる適切な条件下で培養する。発現された蛋白質を、その後に当業者に知られる適切な手法により回収し、単離し、そして培養培地から（もしくは細胞内で発現される場合には細胞から）精製する。例えばこれらの蛋白質を、可溶性形態では細胞溶解後に単離するか、もしくは塩化グアニジン中で抽出する。所望される場合には、本発明のＤＲＡＤＡを融合蛋白質として産生することができる。例えば、このようなＤＲＡＤＡ融合蛋白質を産生するか、選択された宿主細胞内でのその蛋白質の発現を促進させるか、もしくは精製度を改善することが望ましいこともある。本発明のＤＲＡＤＡ蛋白質に適する融合相手は当業者に熟知されており、かつ中でもβ−ガラクトシダーゼおよびポリヒスチジンがそれに含まれる。ＩＶ．抗−ＤＲＡＤＡ抗体の産生本発明のＤＲＡＤＡ蛋白質は更に、ＤＲＡＤＡもしくはＤＲＡＤＡ蛋白質の様々な部分（例えば、ＤＲＢＭもしくは触媒領域）に特異的な抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）の創製のための抗原としても有用である。抗体はＤＲＡＤＡの改変型もしくはアナログに対しても創製することができる。これらの抗体は通常の方法により作製することができ、それらの方法にはＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術、組換え技術（例えば、Ｈｕｓｅｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１（１９８８）により記載されるもの）、もしく当該技術分野に知られるもののいずれかの他の改変法が含まれる。Ｖ．診断用試薬本発明の蛋白質、抗体、およびポリヌクレオチド配列（アンチセンスポリヌクレオチド配列を含む）は所定の神経学的もしくは中枢神経系障害（例えば、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ’ｓ）舞踏病、ＳＳＰＥ、麻疹封入体脳炎、卒中、および他の症状（加齢を含む）（これらは、ＤＲＡＤＡの異常もしくは欠損発現に関連することが見いだされている）を診断するための診断用試薬として有用であることがある。例えば本発明の蛋白質、抗体、もしくはポリヌクレオチドを、そのような症状を特徴とするＤＲＡＤＡの天然に存在する突然変異を診断するのに利用することができる。これらの試薬は、場合によって診断もしくは治療方法において通常に用いられる診断用ラベル（例えば、放射活性ラベル、および比色酵素ラベル系など）を用いてラベル化されることがある。これらの試薬は通常の診断用アッセイ（例えば、サザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）およびウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット、ならびにポリメラーゼ連鎖反応など）において選択された哺乳類組織中の異常ＤＲＡＤＡレベルの測定もしくは突然変異体ＤＲＡＤＡ酵素の検出を行うことができる。例えば診断用作用物質としてこれらのポリヌクレオチド配列を利用して、正常もしくは突然変異体のＤＲＡＤＡｍＲＮＡを検出もしくは定量するか、あるいは患者の試料内の標的遺伝子ＲＮＡ中の突然変異を検出することができる。適切なアッセイフォーマットおよびラベル系の選択は当業者の技術範囲内に含まれ、かつ診断領域における豊富な技術に頼る追加的な説明を必要とすることなく容易に選択することができる。従って本発明は、神経学的症状（例えば、グルタミン酸−ゲート化イオンチャネルの機能不全）を特徴とする障害の診断もしくは遺伝子疾患の検出の際のこれらの蛋白質、抗体、もしくはポリヌクレオチド試薬の使用のための方法を提供する。これらの方法には、選択された哺乳類組織（例えば、皮膚、脳脊髄液、もしくは他の細胞）を選択された試薬、蛋白質、抗体、もしくはＤＮＡ配列と接触させ、そしてその試薬のその組織への結合もしくはハイブリダイゼーションに基づく選択されたアッセイフォーマットにおいてその組織中に存在するＤＲＡＤＡの量を測定もしくは検出することを必要とする。ＶＩ．治療用試薬別法では、ＤＲＡＤＡ蛋白質もしくはヌクレオチド配列は、哺乳類組織、の、生物学的に活性なＤＲＡＤＡの輸送用の治療用試薬として有用であることがある。一例として組換え蛋白質をそれ自体、薬剤学的組成物中に含まれた状態で適切な経路により投与して、グルタミン酸−ゲート化イオンチャネルにおける機能不全もしくは欠損（このことにより、例えばアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ’ｓ）病、心因性発作、および卒中のような神経学的障害がもたらされることが可能である）を矯正することができる。別法では、本発明の所望のＤＲＡＤＡ核酸配列を適切なベクターもしくは他の輸送系内に組み込ませることができる。適切な輸送系は当業者には熟知されている。そのような配列を含むベクターを投与し、そのことにより本発明の蛋白質のインビボ発現を介してＤＲＡＤＡの欠損を治療することができる。このような輸送系により所望のＤＲＡＤＡ遺伝子を標的細胞内に取り込ませ、そしてその細胞により翻訳させることが可能となる。更に別の方法は、遺伝子療法用のＤＲＡＤＡポリヌクレオチド配列の使用を必要とする。この方法ではＤＲＡＤＡ配列が、ＤＲＡＤＡ遺伝子内に欠損を保持する細胞への輸送に適するベクター内に組み込まれる。通常の遺伝子工学技術によりＤＥＡＤＡ遺伝子配列を組み込ませ、組換えにより現存する遺伝子に突然変異を生じさせるか、もしくは不活化遺伝子に加えてそれを置換することができる。既述の方法に従うと、本発明の組換えＤＲＡＤＡ蛋白質をある細胞、特にＤＲＡＤＡにおける欠陥を特徴とする症状を有する個体中の細胞に提供することが可能である。神経学的症状を特徴とし、かつ哺乳類組織中の活性ＤＲＡＤＡの欠損あるいは異常もしくは不活化ＤＲＡＤＡの存在により少なくとも部分的に生じる障害のためのこのような治療的使用が期待される。例えば、ＤＲＡＤＡ活性化レベルが加齢過程中に変化する可能性があることが予期される。このような状況では本発明の治療剤を利用してＤＲＡＤＡ活性化を一層所望されるレベルに調節することができる。本明細書において特定される場合には、本発明の治療剤は本発明のＤＲＡＤＡ抗体を含むことができ、その抗体を使用して不適切なＤＲＡＤＡ活性を遮断することができ、それは例えば基質結合性部位、特にＤＲＢＭ１もしくはＤＲＢＭ３でのＤＲＡＤＡの結合を遮断することによる。ＶＩＩ．薬剤のスクリーニングおよび開発本発明の蛋白質、抗体、およびポリヌクレオチド配列を更に、神経学的障害（例えば、先に同定されているようなもの）の治療のための治療剤としての利用性を有する化学的化合物もしくは蛋白質のスクリーニングおよび開発に用いることもできる。一例として、ＤＲＡＤＡに結合し、かつその生物学的活性の防止もしくは亢進のいずれかを行うことが可能である化合物は、イオンチャネル発現の欠損を特徴とする神経学的障害あるいは例えばＳＳＰＥもしくは麻疹封入体脳炎のような疾患の治療もしくは予防に有用な薬剤構成成分であることがある。この前者の事例ではその薬剤は、チャネル発現を矯正することにより作用することができる。後者の事例ではその薬剤は、そのＤＲＡＤＡ酵素が比較的無害の麻疹ウイルスの致死形態への突然変異を妨害することにより作用することがある。追加的には、ＤＲＡＤＡＤＲＢＭと、ＨＩＶＴＲＡ結合性蛋白質、ＨｕＴＲＢＰ、および他のｄｓＲＮＡ蛋白質内の配列の類似性に基づき、ＤＲＡＤＡＤＲＢＭもしくは触媒性ドメインに結合する、および／または遮断するとして同定された化合物はＨＩＶ［Ｓｈａｒｍｅｅｎｅｔａｌ、（先に引用されている）］もしくは他の疾患の作用物質（類似の配列を介して哺乳類細胞を侵害する）の治療のための有用な薬剤構成成分であることがある（図５を参照されたい）。最近ではＤＲＡＤＡの選択された領域（例えば、ＤＲＢＭもしくは触媒性ドメイン）に競合的に結合することが可能な薬剤のスクリーニングおよび開発のための通常のアッセイおよび技術が存在する。これらには、ＤＲＡＤＡ蛋白質もしくはその部分（例えば、ＤＲＢＭ）を発現するか、あるいは有望な結合性化合物の結合性調査のための蛋白質を産生させる目的で形質転換させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは他の微生物の培養物を用いるためのファージ呈示系の使用が含まれる。例えば、Ｇ．Ｃｅｓａｒｉｎｉ、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、３０７（１）：６６−７０（Ｊｕｌｙ１９９２）；Ｈ．Ｇｒａｍｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１６１：１６９−１７６（１９９３）；Ｃ．Ｓｕｍｍｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８９：３７５６−３７６０（１９９２年５月）（これらは引用により本明細書に取り込まれる）において記載される技術を参照されたい。他の通常の薬剤スクリーニング技術は、本発明の蛋白質、抗体、もしくはポリヌクレオチド配列を用いて利用することができる。一例として、ＤＲＡＤＡＤＮＡ配列に特異的に結合する化合物を同定するための方法は、単に選択されたＤＲＡＤＡＤＮＡ配列（例えば、配列番号１のＤＲＢＭ断片）を検査化合物と接触させて、その検査化合物のそのＤＮＡ断片への結合を可能にさせる段階；およびあるとすればそのＤＮＡ断片に結合する検査化合物の量を決定する段階を含むことが可能である。このような方法は、その検査化合物と固体支持体上に固定化されるＤＲＢＭＤＮＡ断片とのインキュベーションを必要とすることがある。ＤＲＡＤＡＤＮＡ結合性配列に特異的に結合する化合物を同定する他の方法は、固体支持体上に固定化させたＤＲＡＤＡＤＲＢＭＤＮＡ断片を、検査化合物とＤＲＡＤＡＤＲＢＭの通常の結合相手である蛋白質配列の両方と接触させて、その通常の結合性相手である蛋白質のＤＲＡＤＡＤＮＡ断片への結合を可能にさせる段階；およびそのＤＮＡ断片に結合する通常の結合相手蛋白質の量を決定する段階を含むことが可能である。そのことによる検査化合物による通常の蛋白質の結合の阻害により、ＤＲＡＤＡＤＲＢＭＤＮＡ配列への検査化合物の結合性が示される。薬剤スクリーニングの更に他の通常の方法は、適切なコンピュータープログラムを利用してＤＲＡＤＡＤＲＢＭのものに類似するかもしくは相補的な化学構造を有する化合物を決定し、そしてＤＲＡＤＡＤＲＢＭに対して競合的に結合するかどうかについてそれらの化合物をスクリーニングし、および／または以下に記載される塩基改変アッセイを用いてその選択された化合物の存在下でＤＲＡＤＡ活性の亢進もしくは減少を検出することを必要とすることが可能である。従ってこのような方法の使用を通して本発明は、ＤＲＡＤＡもしくはその部分と相互作用し、かつ所望される場合にはその生物学的活性を亢進もしくは減少させるかのいずれかを行うことが可能である化合物を提供することが期待される。そのような化合物は本発明に含まれるものと見なされる。当業者は、最も所望される通常のスクリーニング方法のタイプ、ならびに本発明の試薬（例えば、ＤＲＡＤＡ蛋白質、ヌクレオチド配列もしくはその断片、あるいはそのようなＤＲＡＤＡ蛋白質の使用により創製される抗体）を容易に選択することができることが理解されるべきである。ヒトＤＲＡＤＡのクローニングおよび発現を開示する以下の実施例は、説明目的のみのものであり、かついずれにしても本発明の制約として解釈されるべきではない。実施例１−ウシＤＲＡＤＡ蛋白質の単離アデノシンから転化されたイノシンを検出するために設計された以下に記載される改変化塩基のためのアッセイを使用し、かつＷａｇｎｅｒおよびＮｉｓｈｉｋｕｒａ、（１９８８）、ならびにＷａｇｎｅｒｅｔａｌ．、（１９８９）（両方とも先に引用されている）により記載される方法に従って、ＤＲＡＤＡ同族体を以下の要領でウシ肝臓核抽出物から単離した：Ａ．核抽出物の調製核抽出は、以下の改変事項を加えたＤｉｇｎａｍｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１１：１４７５−１４８６（１９８３）により記載される方法によりウシ肝臓から調製した。全過程は４℃下で実施した。地域の屠殺場から取得した新鮮なウシ肝臓（１ｋｇ）を、ミキサーを用いてひき肉にし、そして更に、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、０．１５ｍＭのスペルミン、０．５ｍＭのスペルミジン、１ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍのスクロース、および１０％のグリセロールを含む圧縮細胞容量の３倍の緩衝液中でモーター稼働性のＰｏｔｔｅｒ−ホモジナイザーにより均一化させた。Ｔｙｐｅ４５ＴｉＢｅｃｋｍａｎローター中での３０，０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離後、核ペレットを、０．０２ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、０．４２ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５％のグリセロール、０．５Ｍｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む高張緩衝液中に懸濁させた。ガラス製のダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）−ホモジナイザー内での２度のストロークの後、蛋白質抽出物を３０，０００ｒｐｍでの３０分の遠心分離により破片から分離させて清澄化させた。活性分画は、固形（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を５０％飽和（０．３３ｇ／ｍｌ）になるまで添加して沈殿させ、そして４℃で１時間撹拌させた。３５，０００ｒｐｍでの１時間の遠心分離の後、ペレットを少量（最初の細胞ペレットの約１／１０容量）の緩衝液Ａ［０．０２ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１７％のグリセロール、および０．２５ｍＭのＰＭＳＦ］（０．１５ＭのＫＣｌを含む）中に再懸濁させ、そして２Ｌの同一緩衝液に対する透析を３回緩衝液を交換して実施して（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄を除去した。最終核抽出物を３０，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により清澄化させ、そしてアリコートに分けた上で液体窒素中で凍結させた。典型的には１Ｋｇの肝臓から約５ｇの核抽出物蛋白質が取得された。Ｂ．ｓｓＤＮＡアガロースカラムおよびポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）アガロースカラムの第一周期全カラムクロマトグラフィー操作は４℃下で実施した。約５ｇの未処理核抽出物（０．３５ＭＫＣｌに塩濃度を調節した後）を、０．３５ＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化させてある８５ｍｌ（２．６×１６ｃｍ）のｓｓＤＮＡアガロースカラムに通した（流速２０ｍｌ／時間）。この酵素はｓｓＤＮＡには結合せず、かつ素通り分画に見いだされた。このｓｓＤＮＡカラムは、この操作を行わなければｄｓＲＮＡカラムにも結合するであろう所定のｓｓＤＮＡ結合性蛋白質を除去するのに役立った。この素通り分画含有性活性を、０．３５ＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａで予め平衡化させてある５０ｍｌ（２．６×１０ｃｍ）のポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）ｄｓＲＮＡアガロースカラムに直ちにかけた。このポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）カラムを、０．５ＭのＫＣｌを含む１００ｍｌの緩衝液Ａ、次いで１．０ＭのＫＣｌを含む１００ｍｌの緩衝液Ａを用い、２０ｍｌ／時間の流速で連続的に洗浄した。ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）に結合した酵素は、用いた条件下では非常に強力に二重らせんを形成し、このことにより他のｄｓＲＮＡ結合性蛋白質を高塩緩衝液（最高１．０ＭのＫＣｌ）でそのカラムから洗い流すことが可能となる。酵素はその緩衝液の塩濃度を上昇させることにより溶出させた。活性は、０．３ＭのＫＣｌおよび０．２％のＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（ＮＰ−４０）を含む１００ｍｌの緩衝液Ａを用いて１０ｍｌ／時間の流速で溶出された。稀釈酵素の損失を防ぐ目的で、後続の精製段階全てにおいて緩衝液にＮＰ４０（０．１〜０．２％）を添加した。各１０ｍｌの分画を回収し、そして実施例２の塩基改変活性についてのアッセイを実施して活性分画を同定した。３．０ＭのＫＣｌ分画は、銀染色を施したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定したところ、９３および８８ｋＤの見かけ上の分子量を有する２つの主要ポリペプチドを含んでいた。Ｃ．ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）アガロースカラムの第二周期微量混入物質から更にその酵素を精製するために、３．０ＭのＫＣｌ分画を、ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）カラム上での第二精製周期を通す再クロマトグラフにかけた。ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）アガロースカラムの第一周期からの活性分画をプールし、０．２％のＮＰ４０を含む緩衝液Ａで０．３５ＭのＫＣｌにまで希釈し、そして５０ｍｌのポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）アガロースカラムの第二周期に通した。このカラムは、第一ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）カラムについての要領で（ただし例外は全緩衝液が０．２％のＮＰ４０を含んでいることである）洗浄および溶出を行った。２回の周期のｄｓＲＮＡ親和性カラムクロマトグラフィーにより精製された活性分画を、その後にＤＥＡＥＣＬ−６Ｂイオン交換カラムクロマトグラフィーにより濃縮した。Ｄ．ＤＥＡＥＣＬ−６Ｂイオン交換カラム第二ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）アガロースカラムからの活性分画をプールし、そして、０．０５ＭのＫＣｌおよび０．２％のＮＰ４０を含む２Ｌの緩衝液Ｂ［０．０２ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１．０ｍＭのＤＴＴ、１７％のグリセロール、および０．２５ｍＭのＰＭＳＦ］に対して同一緩衝液を２回交換することによる透析を８時間行った。透析分画を、０．０５ＭのＫＣｌおよび０．２％のＮＰ４０を含む緩衝液Ｂで予め平衡化させてある１．０ｍｌ（１．０×１．３ｃｍ）のＤＥＡＥＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に、４ｍｌ／時間の流速で通した。そのカラムを０．０５ＭのＫＣｌおよび０．２％のＮＰ４０を含む４ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後に、活性を、３．０ＭのＫＣｌおよび０．２％のＮＰ４０を含む１０ｍｌの緩衝液Ａで溶出させた。活性分画は、実施例２％の塩基改変アッセイにより同定した。９３ｋＤおよび８８ｋＤのポリペプチドを含む最終精製分画は、ＤＲＡＤＡ活性については初期肝臓ホモジネートより約２２，０００倍濃縮されたと推定され（収率は０．１６％）、かつそれをＳＥＳ−ＰＡＧＥ（７％ゲル）により分画化し、そして銀染色により可視化させた。用いた分子量標準はα２−マクログロブリン（１０８ｋＤ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤ）、ホスホリラーゼＢ（９４ｋＤ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤ）、ピルビン酸キナーゼ（５８ｋＤ）、フマラーゼ（４８．５ｋＤ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（３６．５ｋＤ）、および炭酸アンヒドラーゼ（３０ｋＤ）であった。このゲルにより、９３、８８、および８３ｋＤの見かけ上の分子量を有する３つの主要ペプチドが明らかにされた。これら３つの蛋白質は２次元等電点電気泳動用ゲル上では同一の動向を呈し、そして更にトリプシンでの消化後にほぼ同一のペプチド開裂パターンを生じた。実施例２−ＤＲＡＤＡアッセイおよび塩基改変アッセイＡ．ＤＲＡＤＡアッセイＤＲＡＤＡはインビトロでアッセイした［Ｂａｓｓｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ、４８：６０７−６１３（１９８７）；Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：７７０−７７７（１９８８）］。他に具体的な記載がなされていないない限り、この反応は１００μの反応物中で実施し、その反応物は１０ｆモルのα−［³²Ｐ］ＡＴＰ−ラベル化ｃ−ｍｙｃｄｓＲＮＡもしくはヒトα−グロビンｄｓＲＮＡ［Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．、（先に引用されている）；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａｅｔａｌ．、ＥＭＢＯＪ．、１０：３５２３−３５３２（１９９１）］、０．０５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、および２０％のグリセロール、ならびに様々な量のウシ肝臓核抽出物蛋白質もしくは２０ｎｇの精製化ＤＲＡＤＡ蛋白質を含んでいた。３７℃下、１時間のインキュベーション後、この反応産物の除蛋白質を行い、そしてその後に以前に記載された要領でエタノールを用いて沈殿させた［Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．、（先に引用されている）；Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６：２６４７−２６５１（１９８９）］。抽出されたＲＮＡを以下に記載される塩基改変アッセイを用いて分析した。Ｂ．塩基改変アッセイＤＲＡＤＡ活性についてはその後に、以下に記載されるインビトロ塩基改変アッセイにおいて固定用量の各分画につきイノシンに転化されたアデノシンの量の決定を行った。ＤＲＡＤＡ反応の後にそのＲＮＡ試料（これは１０μｇの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のｔＲＮＡを共に含む）をヌクレアーゼＰ₁で５’モノヌクレオチドに消化した。これらの消化物を一次元薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析した。用いた溶媒系は０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）／硫酸アンモニウム／１−プロパノール、１００：６０：２（ｖ／ｗ／ｖ）であり、これはＳｉｌｖｅｒＫｌａｎｇｅｔａｌ．、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、５９：５８−１０９（１９７９）に記載されている。ＴＬＣプレート上のアデノシンおよびイノシンのスポットの放射活性は、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により定量した。実施例３−ウシクローンの取得９３および８８ｋＤの蛋白質のＮＨ₂−末端をコードするウシｃＤＮＡクローンを、ｃＤＮＡの複数のオリゴヌクレオチド−プライマーを用いるＰＣＲ増幅の方法（ＬｅｅａｎｄＣａｓｋｅｙ）ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ中、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．、Ｅｄｓ．、（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ１９９０）、ｐｐ．４７−５３）により取得した。Ａ．リバーストランスクリプターゼでのポリメラーゼ連鎖反応簡潔に記載すると、ＮＨ₂−末端ペプチド配列についてのコドンを表すオリゴヌクレオチドの縮重セットを合成した。９３ｋＤの蛋白質についてはセンスプライマーは配列番号２７：５’ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＮＧＧＮＡＡＡ／ＧＧＴＮＧＡ３’であり、かつアンチセンスプライマーは配列番号２９：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＮＧＣＴ／ＣＴＣＣＴＴ／ＣＴＧＧＴ／ＣＴＴＮＡであり、これらは各々配列番号２８のアミノ酸残基：ＰＧＫＶＥおよび配列番号３０のアミノ酸残基：ＡＥＱＫＬに相当していた。８８ｋＤの蛋白質については、センスプライマーは配列番号３１：５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡ／ＧＡＣＮＧＧＮＴＡＣ／ＴＧＴＮＧＡ３’であり、かつアンチセンスプライマーは配列番号３３：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＧ／ＡＴＣＧ／ＡＴＣＮＧＧＧ／Ｔ／ＡＡＴＧ／ＡＴＣＧ／ＡＴＣ３’であり、これらは各々配列番号３２の残基：ＫＴＧＹＶＤおよび配列番号３４の残基：ＤＤＰＩＤＤに相当していた。センスプライマーについてのＥｃｏＲＩおよびアンチセンスプライマーについてのＢａｍＨＩ用の制限部位が５’末端に含まれており、かつ先の配列中下線で示されている。それに加え、センスおよびアンチセンスプライマーによりフランクされる残基を表す内部プローブを合成した。９３ｋＤの蛋白質用の内部プローブの配列は、配列番号３５：５’Ｃ／ＴＴＴＧ／ＣＡＣＧ／ＣＡＣＧ／Ｔ／ＡＧＧＣＴＣＣＴＧ３’であり、そして８８ｋＤの蛋白質用の内部プローブの配列は、配列番号３６：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴ／ＣＴＧＮＣＣＡ／ＧＴＴＣ／ＴＴＣＴ／ＧＴＴ３’であった。それらのセンスおよびアンチセンスプライマーについての全ての可能な縮重コドンが含まれていた。内部プローブに関しては、ウシゲノム中において好まれるコドンのみが含まれていた。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、培養化ウシ内皮細胞株、ＢＦＡ−１ＣＢＰＴ［Ｊ．Ｇｒｉｎｓｐａｎｅｔａｌ．、Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．、１１４、３２８−３３８（１９８３）］から調製される総ＲＮＡおよびＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＲＮＡＰＣＲキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭの各ｄＡ／Ｇ／Ｃ／ＴＴＰ、１単位のＲＮａｓｅインヒビター、４００ｎｇのアンチセンスプラィマー、２．５単位／μｌのリバーストランスクリプターゼ、および１μｇの総ＲＮＡを含む２０μＬの反応物中、４２℃下で１時間実施した。この反応は、その試験管を９９℃で５分間インキュベートすることにより停止させた。Ｂ．組換えライブラリーのスクリーニングＰＣＲは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、４μＭの各センスおよびアンチセンスプライマー、２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１００μＬの反応物中で実施した。増幅は、３５周期分の９５℃下３０秒、４８℃下１分間、７０℃下１分間を用いるサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ）中で実施した。増幅化産物の一部分を、６×ＳＳＣ、０．１％のピロリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、０．１％のデンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、および１００μｇの一本鎖ＤＮＡ中での４２℃ 下のサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーションにより、［ガンマー−³² Ｐ］ＡＴＰでラベル化した内部プローブを用いて分析した［実施例６を参照されたい］。内部プローブにハイブリダイズする７５ｂｐのｃＤＮＡをアガロースゲルから精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋プラスミドに連結させた。選択されたサブクローンについては、センスおよびアンチセンスプライマーを用いて配列決定を行った。このｃＤＮＡクローンのネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）欠損突然変異体のセットをエキソヌクレアーゼＩＩＩおよびヤエナリ（ｍｕｎｇｂｅａｎ）のヌクレアーゼを用いて作製した［Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９３）］。これらの欠損クローンについての配列決定は、セクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）もしくはＴａｑＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔのいずれかにより実施し、そしてそれらの配列を３７３ＡＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ系（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により分析した。サブクローンの重複配列を、ｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のｔｈｅＦｒａｇｍｅｎｔＡｓｓｅｍｂｌｙプログラムという配列分析用ソフトウエアーパッケージ（Ｖｅｒｓｉｏｎ７．０）［Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．、（先に引用されている）］により整列および連結させた。後続実験用に２つのｃＤＮＡクローンを選択し、そしてそれらをＢＵＣ１およびＢＵＣ２と命名したが、それらは各々ウシＤＲＡＤＡの９３ｋＤおよび８８ｋＤの蛋白質をＮＨ₂−末端をコードしていた。ウシ９３ｋＤおよび８８ｋＤ蛋白質の両方のＮＨ₂−末端のアミノ酸配列はアシル化による遮断を受けておらず、これらの配列をマイクロ配列決定法により決定した。実施例４−ヒトＤＲＡＤＡｃＤＮＡの取得ＬａｍｂｄａＺａｐ（商標）ＩＩベクター中の組換えｃＤＮＡライブラリーを、ヒト血液から単離されたヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（この細胞は高レベルのＤＲＡＤＡ活性を含むことが知られている）から作製した。このライブラリーをＭａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．、（先に引用されている）の方法により、特異的プローブとしてＢＵＣ２クローンを用いてスクリーニングした。精製された陽性ラムダーファージを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の指導書に記載されるインビボ切り出し方法によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに転化させた。得られるｃＤＮＡプラスミドＨＵＣ１は約４ｋｂの挿入ＤＮＡを含んでおり、これはサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロット分析によるとＢＵＣ１とＢＵＣ２との両方にハイブリダイズした。その後にＨＵＣ１の挿入断片を用いてもともとのｃＤＮＡライブラクーをスクリーニングしたが、このライブラリーからは追加的ｃＤＮＡクローンであるＨＵＣ２、３、および４が取得された。これら４つのｃＤＮＡクローンの配列を決定し、そして図１Ａおよび１Ｂに説明されるようにこれらは重複することが見いだされた。ｃＤＮＡおよびヒトＤＲＡＤＡ蛋白質の構造をこれらのクローンから演繹した。複数の重複性ｃＤＮＡクローンを整列させるための制限部位マッピングの後に、６６７１塩基対（ｂｐ）のヌクレオチド配列［配列番号１］がヒトＤＲＡＤＡについて決定された。６６７１塩基対のヒトＤＲＡＤＡポリヌクレオチド配列は、短い５’非翻訳領域（１５４塩基対）および長い３’非翻訳領域（２８３９ｂｐ）を含み、その３ ’非翻訳領域には９９塩基対のポリアデニル化領域が含まれている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１０４３９号）。このｃＤＮＡはＤＲＡＤＡｍＲＮＡの５’末端および／またはキャップ部位を含むことがある。図２Ａに示されるように、ＤＲＡＤＡは単一のＯＲＦ（細い白四角）を含んでおり、そのＯＲＦは１３６ｋＤという算出分子量を有する１２２６アミノ酸からなる蛋白質［配列番号２］をコードしている。提案されている開始コドンは哺乳類の翻訳開始コンセンサス配列と一致しており［Ｍ．Ｋｏｚａｋ、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１０８：２２９ −２４１（１９８１）］、そしてその前にはインフレームストップコドンが存在する。このＯＲＦの演繹されるアミノ酸配列が図１Ａ〜１Ｊ［配列番号２］に示される。このＯＲＦはｐ９３およびｐ８８ｋＤ蛋白質の両方のＮＨ₂−末端配列を含んでおり、これらの蛋白質は両方共切断形態をとっているように思われ、各々全長１３６ｋＤａのＤＲＡＤＡ蛋白質のＮＨ₂−末端の内の４０３および４３９アミノ酸残基を欠失している（図２Ａ〜２Ｃの細い白四角、および図１Ａ〜１Ｊの矢印を参照されたい）。仮想的二部構造性核局在化シグナルが図２ＡではＮＵＣおよび黒四角として示されており、そして図１Ａ〜１Ｚでは四角で囲まれている。３つのｄｓＲＮＡ結合性モチーフ（ＤＲＢＭ）反復構造は、図１および２においては各々下線もしくは毛羽塗り四角により示されている。実施例５−ヒトＤＲＡＤＡの発現単離されたｃＤＮＡクローンが実際にＤＲＡＤＡをコードすることの確証は、この蛋白質をスポドプテラフルギペデラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｄｅｒａ）（Ｓｆ９）細胞内で組換えバキュロウイルス蛋白質として発現させることにより取得した。全長ＤＲＡＤＡ蛋白質（ｐＶＬＤＲＡＤＡ１４０）もしくはＣ−末端の３４６アミノ酸を欠損する突然変異体（ｐＶＬＤＲＡＤＡΔ）をコードする２つの組換え構築物を作製した。ｐＶＬＤＲＡＤＡ１４０については、ＨＵＣ１のＸｂａＩ〜ＫｐｎＩ断片（５ ’末端；３．７ｋｂ）およびＨＵＣ２のＫｐｎＩ〜ＸｂａＩ断片（３’末端；１ｋｂ）を商品として入手可能なバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内のＸｂａＩ部位内に連結した。得られる組換え発現ベクターｐＶＬＤＲＡＤＡ１４０は、内因性の翻訳開始および停止コドン、ならびに全長ＤＲＡＤＡ［配列番号１］の内の１５５ｂｐの５’非翻訳配列および７２４ｂｐの３’非翻訳配列を含んでいた。図４Ａを参照されたい。ｐＶＬＤＲＡＤＡ１４０Δについては、新規の停止コドンをｄｓＲＮＡ結合性モチーフ（ＤＲＢＭ）の下流に位置するＸｍａＩＩＩの突出性末端を充填することにより残基８８０に作製した。この操作により、もともとの配列（配列番号３７）：ＫＩＬＡＡＩＩＭＫＫＤＳＥが、残基８６７〜８７９に新規に作製されたＣ−末端配列（配列番号３８）：ＰＱＤＳＧＨＨＨＹＥＫＲＬで置換された。図４Ｂを参照されたい。Ｓｆ９昆虫細胞を既述の組換えバキュロウイルスで感染させた。細胞を通常の手法により培養した。蛋白質産生は、５０μＣｉ［³⁵Ｓ］メチオニンで１時間スポドプテラフルギペデラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｄｅｒａ）（Ｓｆ９）細胞をラベル化することにより評定した［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙｅｔａｌ．、ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９２）］。このラベル化蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光間接像映法により分析した。１４０ｋＤの独特なバンドが、全コーディング配列を含む組換えウイルス（ＤＲＡＤＡ１４０）で感染させた細胞内に検出され、このことにより全長蛋白質がこの組換えウイルスから発現されたことが示された。約１１０ｋＤのバンドがＤＲＡＤＡΔ で感染させた細胞内に検出された。ＤＲＡＤＡ活性は、４×１０⁷細胞から作製された未精製抽出物中、改変化塩基の検出用のアッセイ［Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．、（１９９０）（先に引用されている）において先に記載されている］中で分析したが、このアッセイによってはＤＲＡＤＡ１４０およびＤＲＡＤＡデルタについてのイノシン５’−一リン酸（ｐＩ）およびアデノシン５’−一リン酸（ｐＡ）が、２０μｇの蛋白質を用い、３７℃下、２時間で説明される。実施例２を参照されたい。対照として、Ｓｆ９細胞ならびにＨｅＬａ細胞から作製された未精製抽出物を増加量（１、１０、２０、および４０μｇ）の蛋白質を用いてアッセイした。ＤＲＡＤＡ１４０を発現する細胞の抽出物のみが高レベルでのアデノシンのイノシンへの転化活性を示した（これは既に比較的高レベルのＤＲＡＤＡ活性を含むことが示されているＨｅＬａ核抽出物のものの５倍高い値である［Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．、（１９９０）（先に引用されている））］。それとは対照的に、ＤＲＡＤＡΔを発現する細胞ならびに非感染化Ｓｆ９細胞は、あったとしても非常に少量の検出基準程度の改変化活性を示した。これらの結果により、クローン化ｃＤＮＡは機能的ＤＲＡＤＡ酵素を実際にコードすることが確証される。不飽和の直線領域において検査された別のアッセイ（２０μｇの蛋白質、３７ ℃下、３０分間で過剰量の基質ｄｓＲＮＡを用いる）により、ＤＲＡＤＡ１４０で４１時間感染させたＳｆ９細胞はＨｅＬａ細胞と比較すると約５倍高いＤＲＡＤＡ活性を含むことが示された。興味深いことに、ＤＲＡＤＡのＮＨ₂−末端切断形態であるｐ９３およびｐ８８は、完全なＤＲＡＤＡＯＲＦを保持する組換えウイルスで感染させたＳｆ９細胞中には検出されなかった（図２Ａ）。従って、これらのＤＲＡＤＡのＮ−末端切断形態は蛋白質精製中に蛋白質分解により産生されるように思われる。実施例６−ＤＲＡＤＡ遺伝子のサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロット分析ＤＲＡＤＡ遺伝子を、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロット分析により様々な種において検出した。簡潔に記載すると、２０μｇの染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩもしくはＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩのいずれかで消化させ、アガロースゲル（０．９％）上で分画化し、そしてゲネスクリーンプラス（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎｐｌｕｓ）膜に転移させた。この膜を³²Ｐ−ラベル化プローブ（ＨＵＣ１の１．２ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片；１０¹⁶ｃｐｍ／ｍＬ）と、２×ＳＳＣ、１×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、４０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、および０．０５ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で１８時間ハイブリダイズさせた。その後にこの膜を２×ＳＳＣで室温で２０分間洗浄し（この溶液を一回交換した）、次いで２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳで３７ ℃で３０分間洗浄した。この膜を−７０℃に６８時間さらした。ＤＮＡはＨｅＬａ（ヒト）、ＢＦＡ−１ＣＢＰＴ（ウシ）、ＭＯＰＣ１１（マウス）、ＸＴＣ−２（キセノプスラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ；両生類）、およびＳｆ９（昆虫）細胞から取得した。２本の最近取得された重複性ヒトゲノムクローンを制限部位マッピングについて分析した。これらの結果により、薄いバンドも含む全ＤＮＡバンドは単一のＤＲＡＤＡ遺伝子より生じることが示唆される。サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ブロット分析により、ＤＲＡＤＡ遺伝子は哺乳類細胞中で良好に保存されることが示された。ヒト、マウス、およびウシの細胞から調製されるゲノムＤＮＡはヒトｃＤＮＡプローブと強力にハイブリダイズした。しかしながら、このプローブは両生類もしくは昆虫ゲノム中の配列は検出しなかった。ＤＲＡＤＡの酵素活性がこれら２つの種において既に報告されているため、保存される酵素性ドメインを含むと予測されるＣ−末端領域をコードするＤＮＡ分画を初めとする追加的ｃＤＮＡプローブを検査した。全プローブは陰性の結果を示した。従って、所定の短い領域が触媒反応に関与する可能性があるということを例外として、ＤＲＡＤＡ配列は進化中には良好な状態では保存されてはいなかったということが推定される。実施例７−ヒト組織のノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）ブロット分析ＤＲＡＤＡをコードする転写物の発現を、様々なヒト組織からのｍＲＮＡに対するノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーションにより調査した。２μｇのポリＡ⁺ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を含むノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）ブロットを、製造業者の説明事項に従ってヒトｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。簡潔に記載すると、このブロットを５×ＳＳＰＥ、１０×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、５０％ホルムアミド、２％ＳＤＳ、および０．１ｍｇ／ｍｌの変性化サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で４時間予備ハイブリダイズさせ、その後に変性化プローブを含む新鮮な溶液中、４２℃下、１８時間のハイブリダイゼーションを行った。このブロットを２×ＳＳＣおよび０．０５％のＳＤＳで（この溶液を数回交換して）室温で３０分間洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳで（この溶液を一回交換して）５０℃で１時間洗浄した。このブロットをグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）ｃＤＮＡ対照プローブに再ハイブリダイズさせた。得られるノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）分析ブロットは、心臓、脳、臍帯、肺、肝臓、筋肉、腎臓、および脾臓をはじめとする検査を施した全組織中、ＤＲＡＤＡ転写物の場所に位置していた。ＤＲＡＤＡｍＲＮＡのサイズ（７ｋｂ）により、この重複性ｃＤＮＡ（６，６７１ヌクレオチド）はほぼ完全なＤＲＡＤＡｍＲＮＡを含むことが示される。様々な組織から作製された未精製抽出物の改変化塩基アッセイにより以前に示されたように、ＤＲＡＤＡ遺伝子は汎存的に発現されるように思われる。脳組織は高レベルのＤＲＡＤＡ転写物を含み、このことはグルタミン酸−ゲート化イオンチャネル転写物のＲＮＡ修正において提案されている関連性と一致する［Ｓｏｍｍｅｒｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ、６７：１１−１９（１９９１）；Ｈｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ、７５：１３６１−１３７０（１９９３）］。実施例８−ＤＲＡＤＡの構造特徴予想される一次構造のコンピューター介在調査により、ＤＲＡＤＡの機能的特性を映し出す数々の特徴が明らかにされた。図５は、ＤＲＡＤＡと他のｄｓＲＮＡ結合性蛋白質との間の類似性を説明する。様々なＤＲＢＭとデアミナーゼの間のアラインメントは、ＰＩＬＥＵＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、およびＧＡＰプログラムにより実施した。様々な蛋白質配列モチーフの同定は、ＧＣＧ配列分析パッケージ、バージョン７．０のＭＯＴＩＦＳプログラムにより実施した［Ｊ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１２：３８７−３９５（１９８４）］。Ａ．ＤＲＡＤＡとｄｓＲＮＡの相互作用ＤＲＡＤＡ蛋白質の中央領域は、ｄｓＲＮＡ結合性モチーフ（ＤＲＢＭ；図１Ａ〜１Ｊを参照されたい）の３つの反復構造を含む。ＤＲＡＤＡ中のｄｓＲＮＡ結合性モチーフの存在（アミノ酸５００−７００）は最初に、ＤＲＡＤＡアミノ酸配列のコンピューター分析中に出現する３つの内部反復構造として認識された。これらのモチーフの存在により、二重らせんＲＮＡについてのＤＲＡＤＡの選択性が説明され、かつＤＲＢＭ含有性蛋白質の増加中のファミリーの一員としてＤＲＡＤＡが同定される。このモチーフは、ｄｓＲＮＡに結合し、かつ発育、ＨＩＶとの相互作用、およびｄｓＲＮＡの開裂の調節のような多様な一連の機能を実施することが予測される多数の蛋白質中の数々の異なる群により認識された。例えば、中でもＡ．Ｇａｔｉｇｎｏｌｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１３：２１９３（１９９３）；およびＤ．Ｓｔ．Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８９：１０９７９（１９９２）を参照されたい。例えば、ＤＲＡＤＡの５７５ｂｐのｄｓＲＮＡへの解離定数（Ｋｄ）は０．２３ｎＭであり、これは非常に高い親和性を有することが知られている他のＲＮＡ結合性蛋白質に匹敵し、それらは例えば、ＨＩＶのＴＡＲへのＴＡＴの結合（Ｋｄ＝０．１４ｎＭ）およびＲＲＥへのｒｅｖの結合（Ｋｄ＝０．３ｎＭ）である。各モチーフは独立にｄｓＲＮＡに結合することが可能であり、このことによりＤＲＡＤＡはｄｓＲＮＡと３箇所での接触を行うことが可能となり、そして協同様式でｄｓＲＮＡについての親和性を増加する可能性が考えられる。結合調査および基質必要性調査により示されるように複数のＤＲＡＤＡが長いｄｓＲＮＡに結合しているように思われることを特筆すべきであろう［Ｎｉｓｈｉｋｕｒａｅｔａｌ．、（１９９１）（先に引用されている）］。これらの蛋白質は多様な一連の機能を保持しており、それらは例えば、調節および初期発生（Ｓｔａｕｆｅｎ）［Ｓｔ．Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．、（先に引用されている）］、ならびにヒト免疫不全性ウイルスＲＮＡ（ＴＡＲ−結合性蛋白質）との相互作用［Ｇａｔｉｇｎｏｌｅｔａｌ．、（先に引用されている）］である。配列番号２のアミノ酸２００−２５０の位置に追加的内部反復構造が存在することを銘記されたい。これはＤＲＢＭには無関係であり、そしてヒトＤＲＢＭに独特であるように思われ、それはこの反復構造がウシＤＲＡＤＡ配列中には存在しなかったためである。ＤＲＢＭ−１の上流の丁度６２残基目にＲＮＰコアーコンセンサス配列の部分的保存構造が存在する（ＧＹＶＤＦ、配列番号２の残基４４５−４４９）。多くのｓｓＲＮＡ結合性蛋白質（例えば、ヌクレオリン）およびポリ（Ａ）−結合性蛋白質中に見いだされるＲＮＰコンセンサス［Ｓ．Ｒ．Ｈａｙｎｅｓ、ＮｅｗＢｉｏｌ．、４：４２１−４２９（１９９２）］は、おおまかに保存される配列の９０残基の領域からできており、その保存配列内には８残基（ＲＮＰ−１）および５残基（ＲＮＰ−２）の高度に保存されたコア配列が存在する。ＤＲＡＤＡ内に見いだされる短いＲＮＰ−２−様領域は、Ａ−Ｕ塩基対を不安定化させ、かつアデノシンデアミナーゼ以前に局所的ｓｓＲＮＡ領域を作製することに関わっているかもしれない。ＤＲＢＭに加え、ＭＯＴＩＦＳプログラム（ＧＣＧ）によるＤＲＡＤＡ配列のコンピューター分析により、二部構造性核局在化シグナルの存在が示されており、そのシグナルは２つの塩基性残基、およびその後に１０のフランク残基および配列番号２の残基１６９〜１８５の塩基性クラスターを含む。このことは、哺乳類細胞および組織の生化学的に精製された核分画中のＤＲＡＤＡ活性の所見と一致する。ＤＲＡＤＡ配列は多数の潜在的リン酸化部位を含んでおり、このことによりＤＲＡＤＡ活性がリン酸化による調節を受けることがあることが暗示される。それに加え、この酵素はもともとは「ｄｓＲＮＡアンワインダーゼ」と称されていたが、ＤＲＡＤＡ配列の調査によっては、既知のヘリカーゼ（ＤＥＡＥもしくはＤＥＡＨ蛋白質）に対するいずれかの有意な相同性は示されておらず、このことによりＤＲＡＤＡはいずれかの古典的なヘリカーゼ活性は有してはいないという生化学的分析からの以前の結果が立証される。生化学的に精製された９３および８８ｋＤの蛋白質（これは全長蛋白質のＮ− 末端部位を欠失している）がＤＲＡＤＡ活性を示すため、この触媒メカニズムに直接関連するアミノ酸残基はＣ−末端領域に存在することが予測され、それはＤＲＢＭの３つの反復構造の下流に存在する可能性が最も高い。Ｃ−末端切断を生じた突然変異体（ＤＲＡＤＡΔ）はＤＲＡＤＡ活性を示さないことを銘記されたい。ＤＲＡＤＡのこの基質結合性ドメインの突然変異誘発分析が既に行われている。このモチーフの３つの反復構造を含んでなる基質結合性ドメインの内の第一もしくは第三ＤＲＢＭの欠失により酵素活性が消失する一方で第二モチーフは重要でないように思われる。これらの結果により、これら３つのＤＲＢＭモチーフはＤＲＡＤＡ活性における役割においては等価ではないことが示される。Ｂ．ＤＲＡＤＡの触媒メカニズムおよび脱アミノ化に必要な残基の保存特異的配列状況内に整列されかつ一定間隔を保つ一連の進化的に保存されるアミノ酸残基がアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）において既に報告されており、そしてアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）デアミナーゼが既に報告されており［Ｚ．Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０：２２７３（１９９１）］、かつシチジンデアミナーゼおよびデオキシシチジレート（ｄＣＭＰ）についても報告がなされている。ＤＲＡＤＡのＣ−末端領域はトリペプチド配列ＨＡＥおよびＰＣＧを含み、これらは配列番号３９：ＲＥＰＲを初めとする数々のシチジンおよびｄＣＭＰデアミナーゼにおいて保存されている［Ｂ．Ｔｅｎｇｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：１８１６（１９９３）］。（データベースの調査により、ＤＲＡＤＡのＣ−末端領域、特にトリペプチドＨＡＥおよびＰＣＧ配列付近に対するかなりの程度の配列保存を有する未知の機能の線虫遺伝子（Ｔ２０Ｈ４．４）［Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３６８：３２−３８（１９９４）］が示されている。この線虫遺伝子はＤＲＡＤＡの脊椎動物版の原型をコードしているかもしれない。）ＲＥＰＲは、アポリポ蛋白質ＢｍＲＮＡのＲＮＡ修正の原因となる特異的シチジンデアミナーゼ活性を含む多重構成成分性酵素のサブユニットであると考えられている。これらのトリペプチドはヒスチジン、グルタミン酸、およびシステインを含み、これらは亜鉛原子の配位およびＤＲＡＤＡの触媒中心の形成に関与するようである。ＤＲＡＤＡの触媒ドメインの突然変異誘発分析を実施した。仮想的亜鉛配位性残基、Ｈｉｓ⁹¹⁰、Ｃｙｓ⁹⁶⁶、およびＣｙｓ¹⁰³⁶の突然変異誘発によりＤＲＡＤＡ活性が消失した。この酵素のプロトン輸送機能を働かせることが予測されているＧｌｕ⁹¹²残基は必要不可欠であることが確認された。このデータは、ＤＲＡＤＡの加水分解的脱アミノ化メカニズムがシチジンデアミナーゼのものに類似するという結果を支持する。このデータはまた、例えば過剰なＤＲＡＤＡ活性が疾患を生じるという状況下において、その活性を消失させるように改変することができるＤＲＡＤＡの部位も示している。本発明の所定の態様が特別に記載されてきたが、当業者には多くの改変事項および変異物を作製することができることが明らかであろう。従って本発明は、示された特別な態様の内のいずれかによって制限されるとして見なされるのではなく、むしろ本発明の範囲は以下に記載される請求の範囲によってのみ特定されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＮ 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 9356−4Ｈ 16/18 16/18 9282−4ＢＣ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 9282−4Ｂ 1/21 1/21 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 5/10 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/08 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/573 ＡＣ１２Ｑ 1/68 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/573 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/54 ＡＡＭ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．天然の状態では結合している他の細胞性物質から単離されたヒト二本鎖リボ核酸アデノシンデアミナーゼ酵素（ＤＲＡＤＡ）蛋白質配列であって、配列番号２のアミノ酸配列、ＤＲＡＤＡ−様生物学的活性を有するその断片およびアナログを含む配列。２．天然の状態では結合している他の細胞性物質から単離され、かつヒト二本鎖リボ核酸アデノシンデアミナーゼ酵素（ＤＲＡＤＡ）蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列。３．配列番号１およびその断片を含む、請求の範囲２に記載のポリヌクレオチド配列。４．検出用ラベルと結合させてある、請求の範囲２のもしくは請求の範囲３のポリヌクレオチド配列。５．発現制御配列に操作的に連結される、請求の範囲２もしくは請求の範囲３のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。６．請求の範囲５の発現ベクターで形質転換させた宿主細胞。７．ヒト二本鎖リボ核酸アデノシンデアミナーゼ酵素（ＤＲＡＤＡ）蛋白質もしくは免疫原としてのＤＲＡＤＡ−様生物学的活性を有するその断片の使用により作製されたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体。８．請求の範囲２、請求の範囲３のポリヌクレオチド配列もしくはその相補鎖のオリゴヌクレオチド断片を含むＤＮＡプローブ。９．更に検出用ラベルを含む、請求の範囲８のプローブ。１０．選択された二本鎖リボ核酸アデノシンデアミナーゼ酵素（ＤＲＡＤＡ）ＤＮＡ配列に特異的に結合する化合物を同定する、前記ＤＲＡＤＡＤＮＡ配列を検査化合物に接触させてその検査化合物のそのＤＮＡ配列への結合を可能にさせる段階；およびそのＤＮＡ配列に結合する検査化合物の量を決定する段階を含む方法。１１．前記ＤＮＡ配列が、ＤＲＡＤＡ二本鎖ＲＮＡ結合性モチーフ（ＤＲＢＭ）配列およびＤＲＡＤＡ触媒ドメインからなる群より選択される、請求の範囲１０に記載の方法。１２．前記ＤＲＡＤＡＤＮＡ配列が固形支持体上に固定化される、請求の範囲１０に記載の方法。１３．前記ＤＲＡＤＡ配列の正常標的をも前記ＤＮＡ配列および前記検査化合物と共にインキュベートして、前記標的と前記ＤＮＡ配列との間の結合を可能にさせ；前記ＤＮＡ配列に結合する標的蛋白質の量を決定し、その検査化合物によるＤＲＡＤＡ配列への標的の結合の阻害がそのＤＲＡＤＡＤＮＡ配列への検査化合物の結合を表す、請求の範囲１０に記載の方法。１４．二本鎖リボ核酸アデノシンデアミナーゼ酵素（ＤＲＡＤＡ）発現の欠損もしくは欠乏を特徴とする障害を診断する、患者からの組織試料を、ＤＲＡＤＡに対するポリクローナル抗体、ＤＲＡＤＡに対するモノクローナル抗体、ＤＲＡＤＡをコードするＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列、ＤＲＡＤＡの蛋白質配列もしくはその断片からなる群より選択される診断用試薬、もしくは検出用ラベルと結合させた前記試薬と接触させ、そして前記組織中のＤＲＡＤＡの量を前記組織中での前記試薬とＤＲＡＤＡとの間の結合により測定することを含む方法。１５．二本鎖リボ核酸アデノシンデアミナーゼ酵素（ＤＲＡＤＡ）の活性を亢進もしくは阻害することが可能であり、ＤＲＡＤＡ蛋白質、ＤＲＡＤＡＤＮＡ配列、もしくは抗−ＤＲＡＤＡ抗体を用いて一群の化合物をスクリーニングすることにより産生される化合物。１６．配列番号３のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列、および配列番号５のアミノ酸配列からなる群より選択される、請求の範囲１のヒト二本鎖リボ核酸アデノシンデアミナーゼ酵素蛋白質配列の断片。１７．ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を作製する際の、請求の範囲１に記載のヒトＤＲＡＤＡ蛋白質配列の使用。１８．神経変性性症状の治療のための医療剤を調製する際の、請求の範囲１の蛋白質配列、請求の範囲２のポリヌクレオチド配列、もしくは請求の範囲７の抗体の使用。