JPH11506309A

JPH11506309A - ヒトアミン輸送体

Info

Publication number: JPH11506309A
Application number: JP8526210A
Authority: JP
Inventors: リ，イ; カオ，リアン; ローゼン，クレイグ・エイ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-03-01
Filing date: 1995-03-01
Publication date: 1999-06-08
Also published as: EP0815220A1; AU2271995A; WO1996027009A1; EP0815220A4

Abstract

(57)【要約】ヒトアミン輸送体ポリペプチドと該ポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）及び組換え技術による該ポリペプチドの生産法を開示する。該ポリペプチドに対する作用薬及び拮抗薬を検出する方法と、本発明ヒトアミン輸送体の過小発現及び過剰発現に関係する疾患を治療するための作用薬及び拮抗薬の使用をも提供する。また、上記ポリペプチドをコードする核酸配列中の突然変異を検出する方法並びに上記ポリペプチドの可溶型のレベルの変化を検出する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトアミン輸送体本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用並びに該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの生産に関する。より具体的に述べると、本発明のポリペプチドはヒトアミン輸送体である。さらに本発明は、上記ポリペプチドの作用を阻害することに関する。知覚神経機能と運動神経機能は神経伝達によって行われる。神経伝達とは、シナプス前ニューロンと呼ばれる1つのニューロンからシナプス後ニューロンと呼ばれるもう1つのニューロンへ向かってシナプス間隙を横切る、神経インパルスの伝導である。シナプス間隙を横切る神経インパルスの伝達には、神経伝達物質の分泌が伴う。神経伝達物質はシナプス前ニューロンにおいて小胞に封入されて、シナプス間隙に放出され、シナプス後ニューロンにあるそのレセプターを見つける。神経インパルスの伝達は、常態では、一時的である。シナプス伝達の不可欠な特性は、神経伝達物質放出に続く迅速な作用の終了である。カテコールアミン、セロトニン及びある種のアミノ酸（例えばγ-アミノ酪酸（GABA）、グルタミン酸、グリシンなど）を含む多くの神経伝達物質の場合、シナプス作用の迅速な終了は、シナプス前末端及び周辺の神経膠細胞への神経伝達物質の取り込みによって達成される。この迅速な神経伝達物質の再蓄積は、シナプス前末端による再取り込みの結果である。シナプス前末端では、再取り込みのための種々の分子構造が、コリンや生物起源のアミン（ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン及びヒスタミンなどの低分子量神経伝達物質）といった神経伝達物質に対して高い親和性を持つ。これらの分子装置は輸送体（トランスポーター）と呼ばれる。これらの輸送体は、神経伝達物質をシナプス間隙からシナプス前ニューロンの細胞膜を逆に横切ってシナプス前末端の細胞質内へ動かすことによって、これらの物質の機能を終了させる。神経伝達物質取り込みの阻害又は刺激は、内因性神経伝達物質の作用を調節する手段となる。輸送体による神経伝達物質の再取り込みは、ナトリウム依存性でありうる。例えばGABA輸送体は、最近記述されたナトリウム依存性神経伝達物質輸送体遺伝子ファミリーの一要素である。これらの輸送体は、細胞外部分、膜貫通部分及び細胞内部分を持つ膜貫通型レセプター錯体である。ナトリウム依存性神経伝達物質輸送体タンパク質の全ファミリーの膜貫通ドメインには、かなりの相同性が存在し、同一のアミノ酸を持つ区間がかなりあるが、これらのドメインにつながっている細胞内ループと細胞外ループに認められる相同性ははるかに少ない。特に細胞外ループは、各輸送体に独特であるように思われる。この領域は基質特異性及び/又は阻害因子特異性に寄与するのだろう。本発明の新規アミン輸送体を同定し、タイプの異なる輸送体間の構造と機能の相違を解明することは、行動と疾患の細胞及び分子的基礎を理解する上で重要である。本発明のポリペプチドは、アミン輸送体であろうと同定された。この同定は、ラットのアミン輸送体に対するアミノ酸配列相同性の結果としてなされた。本発明の一側面によれば、ヒトアミン輸送体である新規成熟ポリペプチドと、生物学的に活性かつ診断的又は治療的に有用なその断片、類縁体及び誘導体が提供される。本発明のもう1つの側面によれば、ヒトアミン輸送体をコードする核酸分子（m RNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む）と、生物学的に活性かつ診断又は治療に有用なその断片及び誘導体が提供される。本発明のさらなる側面によれば、組換え技術によって上記ポリペプチドを生産する方法であって、ヒトアミン輸送体核酸配列を含有する組換え原核及び/又は真核宿主細胞を、該タンパク質の発現を促進する条件下に培養し、次いで該タンパク質を回収することからなる方法が提供される。本発明のさらなる側面によれば、上記ポリペプチドに対するリガンド、アゴニスト（作用薬）及びアンタゴニスト（拮抗薬）のスクリーニングに、上記ポリペプチド若しくは上記ポリペプチドををコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。本発明のさらなる側面によれば、アミン輸送体の過少発現又はそのリガンドの過剰発現に関係する疾患の治療として、神経伝達リガンドのアミン輸送体取り込みを刺激するために上記アゴニストを使用する方法が提供される。本発明のさらなる側面によれば、アミン輸送体の過剰発現又はそのリガンドの過少発現に関係する疾患の治療として、神経伝達リガンドのアミン輸送体取り込みを阻害するために上記アンタゴニストを使用する方法も提供される。本発明のさらなる側面によれば、上記ポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のさらなる側面によれば、ヒトアミン輸送体配列に特異的にハイブリッド形成するに足る長さを持つ核酸分子を含む核酸プローブも提供される。本発明のさらなる側面によれば、アミン輸送体ポリペプチドの過少発現及び過剰発現並びに上記ポリペプチドをコードする核酸配列中の突然変異に関係する疾患を検出するための診断的検定法が提供される。本発明のさらなる側面によれば、科学的研究、DNAの合成及びDNAベクターの製造に関係する試験管内用途に、上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。当業者にとっては、本発明のこれらの側面と他の側面は、本明細書の教示から明白なはずである。以下の図面は本発明の実施態様を例示するものであって、請求の範囲が包含する本発明の範囲を制限するものではない。図1は、本発明のヒトアミン輸送体のcDNA配列と、対応する推定アミノ酸配列とを表す。アミノ酸には標準的な一文字略号を使用している。配列決定は373自動DNA配列決定装置（Applied Biosystems，Inc.）を用いて行なった。配列決定の正確さは、97%以上正確であると予測される。図2は、本発明のアミン輸送体とラットのアミン輸送体（Genbank公開データーベースから検索）とのアミノ酸ホモロジー整合図である。本発明のアミン輸送体は、哺乳類細胞中に存在するアミン神経伝達物質の1つ又はいくつかの再取り込みを引き起こしうる。そのようなアミンの例としては、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン及びヒスタミン、その他のアミノ酸伝達物質（GABA、グリシン及びグルタミン酸を含む）が挙げられる。本発明の一側面によれば、図1の推定アミノ酸配列（配列番号2）を持つ成熟ポリペプチド若しくは1994年12月16日にATCC寄託番号75980として寄託されたクローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、種々のヒト組織から得ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト副腎腫瘍に由来するcDNA ライブラリー中に発見された。これは、構造的にアミン輸送体ファミリーに関係している。このポリヌクレオチドは、470アミノ酸残基からなる部分をコードする読み取り枠を含有する。このタンパク質はラットアミン輸送体に対して最も高い相同性を持ち、468アミノ酸の範囲にわたって80%の同一性と86%の類似性を持つ。本発明のポリヌクレオチドはRNA型であってもよいし、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAを含むDNA型であってもよい。DNAは二本鎖であってよいし、一本鎖であってもよく、一本鎖の場合はコーディング鎖でもよいし、非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図1 に示すコーディング配列（配列番号2）又は上記寄託クローンのコーディング配列と同一であってもよいし、その遺伝コードの重複性又は縮重性の結果として図 1のDNA（配列番号2）又は上記寄託cDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異なるコーディング配列であってもよい。図1の成熟ポリペプチド配列（配列番号2）をコードするポリヌクレオチド又は上記寄託cDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、その成熟ポリペプチドのコーディング配列のみを含んでもよいし、その成熟ポリペプチドのコーディング配列（追加のコーディング配列を伴ってもよい）と非コーディング配列（イントロンや成熟ポリペプチドに関するコーディング配列の5'及び/又は3'側にある非コーディング配列など）とを含んでもよい。したがって、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、そのポリペプチドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドと、さらに追加のコーディング配列及び/又は非コーディング配列をも含むポリヌクレオチドとを包含する。さらに本発明は、図1の推定アミノ酸配列（配列番号2）を持つポリペプチド若しくは上記寄託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの断片、類縁体及び誘導体をコードする、上述のポリヌクレオチドの変種に関する。このポリペプチドの変種は、上記ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変種であってもよいし、上記ポリヌクレオチドの天然には存在しない変種であってもよい。したがって本発明は、図1に示す成熟ポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託クローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに図1のポリペプチド（配列番号2）若しくは上記寄託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの断片、誘導体又は類縁体をコードする上記ポリヌクレオチドの変種を包含する。そのようなヌクレオチド変種としては、欠失変種、置換変種及び付加又は挿入変種が挙げられる。上述のように、本発明のポリヌクレオチドは、図1に示すコーディング配列（配列番号1）若しくは上記寄託クローンのコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変種であるコーディング配列を持ってもよい。当該技術分野で知られているように、対立遺伝子変種は、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変えない1以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を持ちうる代替型のポリヌクレオチド配列である。本発明のポリヌクレオチドは、本発明ポリペプチドの精製に利用されるマーカー配列にインフレーム（in frame）融合したコーディング配列を持ってもよい。細菌宿主の場合は、pQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジン標識をマーカー配列として、そのマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製に備えることができ、また、COS-7細胞のような哺乳類宿主を使用する場合は、例えば血球凝集素（HA）標識をマーカー配列とすることができる。HA標識は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（Wilson，I.ら，Ce ll，37:767（1984））。さらに本発明は、配列間に少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%の同一性がある場合に上述の配列にハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、厳密な条件下で上述のポリヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する「厳密な条件」という用語は、配列間に少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%の同一性がある場合にのみ、ハイブリッド形成が起こることを意味する。好ましい態様として、上述のポリヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、図1のcDNA（配列番号1 ）又は上記寄託cDNAによってコードされる成熟ポリペプチドと実質上同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書で言及する寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて維持される。これらの寄託物は当業者の利便のために提供されるに過ぎず、これが35U.S.§C112で求められる寄託であると認めるわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列とそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書の一部を構成し、万一、本明細書に記載する配列の説明と矛盾する場合は、これが支配的となる。上記寄託物を作成、使用又は販売するには承諾が必要であり、本明細書はそのような承諾を与えるものではない。さらに本発明は、図1の推定アミノ酸配列（配列番号2）を持つヒトアミン輸送体ポリペプチド又は上記寄託cDNAによってコードされるアミノ酸配列を持つヒトアミン輸送体ポリペプチド、及びそのようなポリペプチドの断片、類縁体及び誘導体に関する。図1のポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドに関して「断片」、「誘導体」及び「類縁体」という場合、これらの用語は、そのようなポリペプチドと実質上同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドを意味する。したがって類縁体には、プロタンパク質部分の切断によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成しうるプロタンパク質が含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド及び合成ポリペプチドのいずれであってもよく、組換えポリペプチドが好ましい。図1のポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドの断片、誘導体又は類縁体は、（i）1以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されているもの（その置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであってもよいし、そうでなくてもよい）であってもよいし、（ii）1以上のアミノ酸残基が置換基を含有するものであってもよく、或いは（iii）成熟ポリペプチドがもう1つの化合物（例えばそのポリペプチドの半減期を増大させるための化合物（ポリエチレングリコールなど））に融合しているものであってもよい。そのような断片、誘導体及び類縁体は、本明細書の教示から、当業者の範囲に含まれると考えられる。本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、単離型で提供されることが好ましく、また、均一に精製されることが好ましい。「単離（された）」という用語は、その物質がその当初の環境（例えばそれが天然物ならばその自然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」とは言えないが、その天然系中に共在する物質の一部又は全部から分離されたそのポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」と言える。そのようなポリヌクレオチドがベクターの一部であったり、かつ/または、そのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドが組成物の一部であっても、そのようなベクター又は組成物がその自然環境の一部でないという点で、「単離された」と言える。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び組換え技術による本発明ポリペプチドの生産にも関係する。宿主細胞は、本発明のベクター（例えばクローニングベクターであってもよいし、発現ベクターであってもよい）によって遺伝子操作（形質導入又は形質転換若しくはトランスフェクション）される。ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態をとりうる。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、若しくはヒトアミン運搬体遺伝子を増幅するために適宜改良した従来の栄養培地で培養することができる。温度やpHなどといった培養条件は、発現用に選択したその宿主細胞に過去に用いられた条件であり、当業者には明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを生産するために使用できる。したがって、例えばそのポリヌクレオチドを、ポリペプチド発現用の種々の発現ベクターのいずれかに組込むことができる。そのようなベクターとしては、染色体DNA配列、非染色体DNA配列及び合成DNA配列、例えばSV40の誘導体、細菌性プラスミド、ファージDNA、バクロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、偽性狂犬病ウイルス）などが挙げられる。ただし、その他のベクターであっても、それがその宿主内で複製可能かつ生存可能であるかぎり、使用できる。適当なDNA配列は、種々の手法によってベクターに挿入できる。一般的には、当該技術分野で知られる手法で、適当な制限部位にDNA配列を挿入する。そのような手法その他は、当業者の範囲に含まれると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令する適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結される。そのようなプロモーターの代表例としては、LTR又はSV40プロモーター、大腸菌lac又はtrp、ファージλP_Lプロモーター、及び原核細胞、真核細胞若しくはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御することが知られているその他のプロモーターを挙げることができる。発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結合部位と転写終結区（ターミネーター）をも含有する。またベクターは、発現の増幅に適した配列を含んでもよい。さらに発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択に利用できる表現型特徴を与えるための1以上の選択可能マーカー遺伝子（例えば真核細胞培養用のネオマイシン耐性やジヒドロ葉酸レダクターゼ、大腸菌におけるテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性など）を含有することが好ましい。上述の適当なDNA配列と適当なプロモーター又は制御配列とを含有するベクターを、適当な宿主の形質転換に使用することによって、その宿主にそのタンパク質を発現させることができる。適当な宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、キイロショウジョウバエS2及びSpodoptera Sf9などの昆虫細胞、CHO、HEK、COS又はボーズ黒色腫などの動物細胞、アデノウイルス、植物細胞などを挙げることができる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から、当業者の範囲に含まれると考えられる。より具体的に述べると、本発明は、上に広く記述した配列の1以上を含む組換え構築物をも包含する。これらの構築物は、本発明の配列が正方向又は逆方向に挿入されているベクター（プラスミドやウイルスベクターなど）を含む。この態様の好ましい側面では、上記構築物がさらに、上記配列に作動可能に連結した調節配列（例えばプロモーターを含む）をも含有する。好適なベクターとプロモーターは当業者に多数知られており、市販されている。次に挙げるベクターはその例である。細菌用：pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBS、pD10、phagescript 、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratage ne）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）。真核細胞用：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、 pSVL（Pharmacia）。ただし、他のプラスミド又はベクターであっても、それがその宿主内で複製可能かつ生存可能である限り、使用できる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターや、選択可能マーカーを持つ他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択することができる。適当なベクターはPKK232-8とPCM7である。特に有名な細菌プロモーターとしては、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L及びtrpが挙げられる。真核プロモーターとしては、CMV即時型初期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルスのLTR、マウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適当なベクターとプロモーターの選択は、当該技術分野の通常の技術水準に十分含まれる。さらなる態様として、本発明は、上述の構築物を含有する宿主細胞に関する。本発明の宿主細胞は、哺乳類細胞のような高等真核細胞であってもよいし、酵母細胞のような下等真核細胞であってもよく、また、細菌細胞のような原核細胞であってもよい。宿主細胞への上記構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、又はエレクトロポレーションによって達成することができる（Davis，L.，Dibner，M．Battey，I. ，Basic Methods in Molecular Biology（1986））。宿主細胞中の構築物を従来のように使用することによって、その組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生産することができる。別法として、本発明のポリペプチドを従来のペプチド合成装置で合成することもできる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下に、哺乳類細胞、酵母、細菌その他の細胞中で発現させることができる。本発明のDNA構築物に由来するRNAを用いて上記タンパク質を生産するには、無細胞翻訳系も使用できる。原核宿主及び真核宿主での使用に適したクローニングベクターと発現ベクターは、Sambrook ら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第2版，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989））に記述されており、その開示は参考文献として本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、そのベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハンサーはDN Aのシス作用性要素であり、通常10〜300bpで、プロモーターに作用してその転写を増大させる。複製起点の後期側100〜270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーなどがその例である。一般的に、組換え発現ベクターは、複製起点、その宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能マーカー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やサッカロミセス・セレビシェTRP1遺伝子）及び下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含むだろう。そのようなプロモーターは、なかんずく、3- ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）のような解糖系酵素、α-因子、酸性ホスファターゼ又は熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。異種構造配列は、翻訳開始配列及び終止配列に対して適当な位相で、組み立てられる。任意に、異種配列が、発現した組換え産物の安定化や簡便な精製などといった所望の特徴を付与するN-末端同定ペプチド（identification peptide）をコードしてもよい。細菌の使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始シグナル及び翻訳終止シグナルと共に、機能的プロモーターに対して作動可能な解読位相（reading phase）に挿入することによって、構築される。ベクターは、そのベクターの維持を保証し、かつ、所望であれば、その宿主内での増幅を提供するために、1以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むだろう。形質転換に好適な原核宿主としては、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌並びにシュードモナス属、ストレプトミセス属及びスタフィロコッカス属に属する様々な種が挙げられる。ただし、他の宿主も選択肢として使用できる。細菌の使用に有用な発現ベクターの典型例は、周知のクローニングベクターpB R322（ATCC37017）の遺伝要素を含む市販のプラスミドに由来する選択可能マーカーと細菌性複製起点とを含むことができる（ただしこれに限られない）。そのような市販ベクターとしては、例えばpKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals,スウェーデン国ウプサラ）及びGEM1（Promega Biotec.,米国ウィスコンシン州マディソン）が挙げられる。これらのpBR322「骨格」部分を、適当なプロモーター及び発現させようとする構造配列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換し、その宿主株を適当な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモーターを適当な手段（例えば温度変化や化学誘導）によって誘導し、細胞をさらに培養する。典型的には、細胞を遠心分離によって収集し、物理的又は化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために確保する。タンパク質の発現に使用する微生物細胞は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用などといった任意の便利な方法で破壊でき、そのような方法は当業者にはよく知られている。組換えタンパク質の発現には、種々の哺乳類細胞培養系も使用できる。哺乳類発現系の例としては、Gluzman，Cell，23:175（1981）に記載のサル腎繊維芽細胞のCOS-7系や、適合するベクターを発現させることのできる他の細胞系（例えばC127、3T3、CHO、HEK、HeLa及びBHK細胞系）が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサーを含み、さらに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位とスプライス受容部位、転写終止配列及び5'隣接非転写配列をも含むだろう。必要な非転写遺伝要素を提供するには、SV40のスプライス部位とポリアデニル化部位に由来するDNA 配列を使用できる。ヒトアミン輸送体ポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって、組換え細胞培養から回収、精製できる。必要とあれば、成熟タンパク質の配置の完成に、タンパク質再生段階を使用できる。最後に、最終的な精製段階として、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用できる。本発明のポリペプチドは、天然の精製産物であってもよいし、化学合成法の生成物であってもよく、また組換え技術によって原核宿主又は真核宿主（例えば培養された細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞など）から生産されるものであってもよい。組換え生産法に使用する宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化されることもあるし、グリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチドは、開始メチオニンアミノ酸残基を含んでもよい。完全長ヒトアミン輸送体遺伝子の断片をcDNAライブラリー用のハイブリッド形成プローブとして用いることにより、その完全長遺伝子そのものや、その遺伝子に対する高い配列類似性又は類似の生物学的活性を持つ他の遺伝子を単離することができる。このタイプのプローブは一般的には少なくとも20個の塩基からなる。しかしプローブは少なくとも30個の塩基からなることが好ましく、50塩基以上であってもよいが、一般的には50塩基を超えないことが好ましい。またこのプローブは、完全長転写物に相当するcDNAクローンや、ゲノムクローン若しくは調節領域、プロモーター領域、エクソン及びイントロンを含む完全なヒトアミン輸送体遺伝子を含有するクローンを同定するためにも使用できる。スクリーニングの一例では、オリゴヌクレオチドプローブの合成に既知のDNA配列を用いることによって、ヒトアミン輸送体遺伝子のコーディング領域を単離する。本発明遺伝子の配列に相補的な配列を持つ標識オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトのcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、そのプローブがハイブリッド形成するライブラリーの構成要素を決定する。本発明は、本発明のヒトアミン輸送体によって輸送されるアミン神経伝達物質を決定する方法を提供する。これらの神経伝達物質を同定する検定法の一例では、T7 RNAポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルスVTF-7株に哺乳類細胞を感染させた後、ベクター（例えばpBSSKII（−））を使用して、リポソーム媒介トランスフェクション法で、アミン輸送体遺伝子に感染させる。等量のベクターのみを用いて、対照トランスフェクションをも行なう。検定は、トランスフェクションの8時間後に、改良クレブス-リンゲル-HEPES緩衝液中で行なう。次に、細胞を［³H］神経伝達物質（例えばGABA、ドーパミン、セロトニンなど）と共に培養する。細胞を氷上に置くことによって取り込みを停止させる。細胞を1% SDS中で可溶化し、蓄積した放射活性の量を液体シンチレーション計数で決定する。各検定についてpBSSKIIによる対照トランスフェクションを用いてバックグラウンドを測定し、特定のアミン神経伝達物質について決定したシグナルからその値を差し引くことによって、有意な量が取り込まれていたら、その特定の神経伝達物質が本発明のヒトアミン輸送体によって取り込まれることが確定される。本発明は、アミン輸送体をコードするmRNAの存在を検出することによる、細胞表面におけるアミン輸送体の発現を検出する方法をも提供する。この方法では、当該技術分野周知の方法で細胞から全mRNAを得て、そのmRNAを、少なくとも15ヌクレオチドからなり、かつ、ヒトアミン輸送体をコードする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリッド形成することのできる核酸プローブと、ハイブリッド形成条件下に接触させ、そのプローブにハイブリッド形成したmRNAの存在を検出し、それによってその細胞によるアミン輸送体の発現を検出する。mR NA分子などの標的核酸分子に対するプローブのハイブリッド形成には、当該技術分野周知の技術を使用する。しかし、本発明の一態様では、溶解した細胞から沈殿によって核酸を抽出し、mRNA分子のポリAテイルを結合するカラムを用いて、その抽出物からmRNAを単離する。次に、ニトロセルロース膜上で、そのmRNAを、放射活性で標識したプローブに暴露する。この際、プローブは相補的なmRNA配列にハイブリッド形成することによって、その相補的mRNA配列を標識する。結合はオートラジオグラフィーかシンチレーション計数によって検出できる。しかし、これらの段階を行なう他の方法も当業者には良く知られている。別法として、ヒトアミン輸送体に対する抗体を、その輸送体にその抗体が結合し、かつ、細胞表面におけるその輸送体の存在を検出することのできる条件下に、使用することもできる。このような方法は、ある与えられた細胞がアミン輸送体の発現に欠陥を持つか否かを決定するために使用できる。検出法としては、抗体に結合した蛍光マーカーが挙げられる。本発明は、ヒトアミン輸送体に特異的に結合しうることが知られていない化合物が、ヒトアミン輸送体に特異的に結合できるか否かを決定する方法であって、哺乳類細胞での発現に適合させたプラスミド（このプラスミドは細胞表面にアミン輸送体を発現させるDNAをも含有する）を含む哺乳類細胞を、アミン輸送体に結合することがわかっているリガンドの結合が可能な条件下に、上記化合物と接触させ、その哺乳類アミン輸送体に結合した化合物の存在を検出することからなり、結合した化合物が存在すれば、その化合物がヒトアミン輸送体に特異的に結合できることが示されるという方法をも提供する。本発明は、細胞表面のヒトアミン輸送体と特異的に相互作用し、それに結合する薬物を同定するための薬物スクリーニング法であって、細胞表面にヒトアミン輸送体を発現させる哺乳類細胞を多数の薬物と接触させ、その細胞に結合する薬物を検出することによって、ヒトアミン輸送体と特異的に相互作用し、それに結合する薬物を同定する方法をも提供する。本発明はさらに、競争検定法を使用して、本発明のヒトアミン輸送体に対するアゴニスト化合物又はアンタゴニスト化合物を同定する方法をも提供する。アンタゴニストを同定するための上記検定法の一例では、ヒトアミン輸送体をその表面に発現させるニューロン細胞を、候補化合物の存在下に、既知の神経伝達物質と接触させて、輸送された神経伝達物質の量を決定する。その候補化合物の不在下に対照をも作成し、その細胞によって輸送されたアミン神経伝達物質の量を対照細胞と比較すれば、その候補化合物がトランスフェクションされた哺乳類細胞による標識アミン神経伝達物質の輸送を刺激又は阻害するかどうかがわかる。ヒトアミン輸送体アンタゴニストの例としては、ヒトアミン輸送体に対する抗体、例えば細胞表面に存在するヒトアミン輸送体のエピトープに対するモノクローナル抗体が挙げられる。これらの抗体は、ヒトアミン輸送体の存在を検出したり、若しくはヒトにおけるその輸送体の機能を阻害するのに有用である。もう1つのアンタゴニスト候補は、アンチセンス技術を用いて作成されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、アンチセンスDNA又はRNA若しくは三重らせん形成による遺伝子発現の制御に使用でき、これらの方法は共に、DNA 又はRNAに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コーディング部分を用いて、約 10〜40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるように設計されることによって（三重らせん−Leeら，Nucl．Acids．Res.，6:3073（1979）；Cooney ら，Science，241:456（1988）；Dervanら，Science，251:1360（1991）を参照）、ヒトアミン輸送体の転写と生産を妨害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは生体内でmRNAにハイブリッド形成し、そのmRNA分子のヒトアミン輸送体ポリペプチドへの翻訳を遮断する（アンチセンス−Okano，J．Neurochem.，56:5 60（1991）;Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Express ion，CRC Press，フロリダ州ボカラトン（1988）を参照）。上述のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNA又はDNAが生体内で発現してヒトアミン輸送体の生産を阻害しうるように、細胞に送達することもできる。神経伝達物質に結合し、それがヒトアミン輸送体と相互作用するのを妨害する可溶型のヒトアミン輸送体（例えばその輸送体の断片）も、アンタゴニスト候補である。さらに、ヒトアミン輸送体の細胞外部分に結合し、それを占拠することによって、ヒトアミン輸送体を神経伝達物質に近づけなくし、輸送体を阻害する小分子も、アンタゴニスト候補である。そのような小分子の例としては、小ペプチド又は小さいペプチド様分子が挙げられるが、これらに限られるわけではない。本発明はさらに、過剰のアミン輸送体活性に関係する病的状態を処置する方法であって、上述のアンタゴニストを医薬的に許容できる担体と共に、アミン輸送体に対する天然に存在する基質の結合を遮断するのに有効な量で、対象に投与することによって、その病的状態を緩和することからなる方法を提供する。病的状態の例としては、癲癇、精神分裂病、うつ病、認識障害、不安及び偏頭痛が挙げられる。本発明は、アミン輸送体活性の過少発現に関係する病的状態を処置する方法であって、上述のアゴニストを医薬的に許容できる担体と共に、アミン輸送体に対する天然に存在する基質の結合を増進するのに有効な量で、対象に投与することによって、その病的状態を緩和することからなる方法を提供する。パーキンソン病やアルツハイマー病が、その病的状態の例である。可溶型のヒトアミン輸送体とアゴニスト及びアンタゴニストは、適当な医薬担体と組み合わせて使用できる。そのような組成物は、治療有効量の輸送体、アゴニスト又はアンタゴニストと、医薬的に許容できる担体又は賦形剤とを含有する。そのような担体としては、塩水、緩衝塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限られるわけではない。製剤は投与法に適合すべきである。本発明は、本発明医薬組成物の1以上の成分で満たされた1以上の容器を含む医薬パック又はキットをも提供する。そのような容器には、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形で、ヒト投与に関する製造、使用又は販売の該機関による認可を反映する情報を付すことができる。さらに、本発明医薬組成物を他の治療用化合物と共に使用してもよい。上記医薬組成物は、経口経路、局所経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻孔内経路又は皮内経路など、都合の良い方法で投与できる。上記医薬組成物は、特定の適応症の処置及び／又は予防に有効な量で投与される。一般的には、少なくとも約10(g/kg-体重の量で投与され、ほとんど場合は、約8m g/kg-体重/日を超えない量で投与されるだろう。ほとんどの場合、日用量は、投与経路、症状などを考慮して、約10(g/kg〜約1mg/kg-体重である。ヒトアミン輸送体と、ポリペプチドであるアゴニスト及びアンタゴニストを、本発明に従って使用する場合、それを生体内における上記ポリペプチドの発現によってすることもできる。これはしばしば「遺伝子療法」と呼ばれる。したがって例えば、患者から得た細胞を、生体外で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNA又はRNA）で操作し、そのポリペプチドで処置しようとする患者に、操作したその細胞を与えることができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を使用して、当該技術分野で知られる手法で、細胞を操作することができる。さらに、生体内でポリペプチドを発現させるために、例えば当該技術分野で知られる手法によって、生体内で細胞を操作することもできる。当該技術分野では知られているように、生体内で細胞を操作し、生体内で本発明のポリペプチドを発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を生産する生産細胞を、患者に投与することができる。本発明のポリペプチドを投与するためのこれら方法とその他の方法は、本発明の教示から、当業者には明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発現ベクターはレトロウイルス以外であってもよく、例えばアデノウイルスは、適当な送達ベクターと組み合わせれば、生体内で細胞を操作するために使用できる。本発明は、ヒトアミン輸送体遺伝子における突然変異の存在に関係する疾患若しくはその疾患に対する罹病性を検出するための診断的検定法の一部としての、ヒトアミン輸送体遺伝子の使用にも関係する。そのような疾患は、ヒトアミン輸送体の過少発現に関係する。ヒトアミン輸送体遺伝子に突然変異を持つ個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出できる。診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検及び検死体などといった患者の細胞から得ることができる。ゲノムDNAは、検出に直接使用してもよいし、分析に先立って、PCRを用いて酵素的に増幅してもよい（Saikiら，Na utre，324:163-166（1986））。RNAやcDNAも同じ目的に使用できる。例えば、ヒトアミン輸送体突然変異の同定と分析に、ヒトアミン輸送体タンパク質をコードする核酸に相補的なPCRプライマーを使用することができる。例えば、欠失や挿入は、増幅産物のサイズが正常な遺伝子型とは異なることによって検出できる。点変異は、放射線で標識したヒトアミン輸送体RNA配列若しくは放射線で標識したヒトアミン輸送体アンチセンスDNA配列に、増幅したDNAをハイブリッド形成させることによって同定できる。完全に一致した配列は、RNaseA消化若しくは融解温度の相違によって、ミスマッチを持つ二本鎖分子と識別できる。 DNA配列の相違に基づく遺伝子試験は、変性剤を含む（若しくは含まない）ゲルにおけるDNA断片の電位泳動移動度の変化を検出することによって、達成できる。小さい配列の欠失と挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって可視化できる。配列が異なるDNA断片は、変性ホルムアミド勾配ゲルで識別できる。この場合、異なるDNA断片の移動度は、それぞれの融解温度又は部分的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えばMyersら，Science，230:1242（1985）を参照）。特定の位置における配列の変化は、化学切断法や、RNase及びS1保護などのヌクレアーゼ保護検定法でも明らかにできる（例えばCottonら，PNAS，USA，85:43 97-4401（1985）を参照）。したがって、特定のDNA配列の検出は、ハイブリッド形成、RNase保護、化学切断、直接DNA配列決定などの方法、若しくは制限酵素の使用（例えば制限断片長多形（Restriction Fragment Length Polymorphisms；RFLP））及びゲノムDNAのサザンブロッティングによって達成できる。より従来的なゲル電気泳動とDNA配列決定に加えて、インシチュー分析でも突然変異を検出することができる。本発明の配列は、染色体同定にも有効である。本発明の配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に誘導され、それにハイブリッド形成できる。また、染色体上の特定の部位を同定することは、現在必要とされていることでもある。現在のところ、染色体位置の標識に利用できる、実際の配列データ（反復多形（repeat polymorphisms））に基づく染色体標識試薬はほとんどない。本発明による染色体に対するDNAのマッピングは、それらの配列を疾患に関係する遺伝子と相関させる重要な第1段階である。簡単に述べると、配列は、そのcDNAからPCRプライマー（15〜25bpが好ましい）を調製することによって、染色体に対してマッピングできる。ゲノムDNA中の2 エクソン以上にまたがることによって増幅過程を複雑にすることのないプライマーをすばやく選択するには、3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いる。次に、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに、これらのプライマーを用いる。そのプライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが、増幅断片を生成するだろう。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当てる迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用いると、同様の方法で、特定の染色体に由来する断片のパネル若しくは大きいゲノムクローンのプールで、サブマッピング（sublocalization）を達成できる。染色体へのマッピングに同様に使用できる他のマッピング法としては、インシチューハイブリッド形成、染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリッド形成による予備選択及び標識フロー選別（labeled flow-sorted）染色体による予備スクリーニングが挙げられる。中期染色体に対するcDNAクローンの蛍光インシチューハイブリッド形成（FISH ）を用いると、1段階で正確な染色体位置を得ることができる。この技術は500又は600塩基程度のcDNAでも使用できるが、2000bp以上のクローンを用いると、簡単な検出に十分なシグナル強度でユニークな染色体位置に結合する可能性が高くなる。FISHは、発現配列標識（expression sequence tag)の供給源としたクローンの使用を必要とし、長いほど良い。例えば、良好な結果を得るには2000bpが良く、4000bpがさらに良いが、合理的な時間％で良い結果を得るのに4000以上はおそらく必要ないだろう。この技術の総説としては、Vermaら，Human Chromosomes： a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press,ニューヨーク（1988）を参照のこと。配列を正確な染色体位置にマッピングしたら、その配列の染色体上の物理的位置を遺伝子マップデータと相関させることができる。そのようなデータは、例えばV．McKusick，Mendelian Inheritance in Man（ジョーンズホプキンス大学ウェルチ医学図書館からオンラインで入手できる）に認められる。次に、同じ染色体領域にマッピングされた疾患と遺伝子の関係を連鎖分析（linkage analysis）（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定する。次に、患者と非患者の間で、そのcDNA又はゲノム配列の相違を決定する必要がある。ある突然変異がその患者の一部又は全部に観測され、正常な個体には観測されない場合、その突然変異はその疾患の原因因子であるかもしれない。物理的マッピング技術と遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、その疾患に関係する染色体領域に正確にその位置が特定されるcDNAは、50〜500個の潜在的原因因子のうちの一つであろう（1メガ塩基マッピング解像度と20kbにつき1遺伝子と仮定）。ポリペプチド、その断片その他の誘導体、その類縁体、若しくはそれらを発現させる細胞は、それらに対する抗体を生産するための免疫原として使用できる。これらの抗体は、例えばポリクローナル抗体やモノクローナル抗体でありうる。本発明は、キメラ抗体、一本鎖抗体、擬人化抗体及びFab断片又はFab発現ライブラリーの産物をも包含する。このような抗体及び断片の生産法は、当該技術分野で種々知られている。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生じる抗体は、動物（好ましくはヒト以外の動物）にそのポリペプチドを直接注射するか、投与することによって得ることができる。そのようにして得た抗体は、そのポリペプチド自体に結合するだろう。この方法で、そのペプチドの断片のみをコードする配列を使用して、その全天然ポリペプチドを結合する抗体を生成させることもできる。そのような抗体は、そのポリペプチドを発現させる組織からそのポリペプチドを単離するために使用できる。モノクローナル抗体の製造には、連続的継代細胞系培養によって生産される抗体を与える任意の技術を使用できる。その例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hler及びMilstein，1975，Nature，256:495-497）、トリオーマ（trioma）技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら，1983，Immunology Today 4:72）及びヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら，1 985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，77-96 頁）が挙げられる。一本鎖抗体の生産について記述した技術（米国特許4946778）は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体の生産に適合させることができる。また、形質転換マウスを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する擬人化抗体を発現させることもできる。以下の実施例を参照して、本発明をさらに説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されないと理解すべきである。特に指定しない限り、割合や量はすべて重量に基づく。以下の実施例の理解を容易にするため、頻繁に使用する方法及び/又は用語をいくつか説明しておく。「プラスミド」は、小文字pとその前後の大文字及び/又は数字で呼ぶ。本明細書における出発プラスミドは市販されているか、公に無制限に入手できるか、若しくは入手できるプラスミドから公表された方法に従って構築できる。さらに、本明細書に記述するプラスミドと等価なプラスミドが当該技術分野で知られており、それらは当業者には明らかだろう。 DNAの「消化」とは、そのDNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素によるDN Aの触媒的切断を意味する。本明細書で使用する種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子その他の必要条件は、当業者に知られているであろうものを使用した。分析には、通常、1(gのプラスミド又はDNA断片を約2単位の酵素と共に約20(1の緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築用のDNA断片を単離する場合は、通常、より大きい体積中で、5〜50(gのDNAを20〜250単位の酵素で消化した。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質の量は、製造者によって指定される。通常は37℃で約1時間のインキュベーション時間を使用するが、これは供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応液をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望の断片を単離する。切断した断片のサイズ分離は、Goeddel，D.ら，Nucleic Acids Res.，8:4057 （1980）に記載の8%ポリアクリルアミドゲルを用いて行なう。「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合成できる一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は2本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのような合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸基を持たないので、キナーゼの存在下にATPでリン酸基を付加しないと、もう1つのオリゴヌクレオチドには連結しないだろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片に連結するだろう。「連結」とは、2本の二本鎖核酸断片間のリン酸ジエステル結合の形成過程をいう（Maniatis，T.ら,同上,146頁）。特に規定しない限り、連結は、既知の緩衝液と条件を用いて、連結すべきほぼ等モル量のDNA断片0.5(gにつき10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）で、達成することができる。特に明言しない限り、形質転換はGraham，F.及びVan der Eb，A.，Virology， 52:456-457（1973）の方法で行なった。実施例1：ヒトアミン輸送体の細菌発現と精製ヒトアミン輸送体をコードするDNA配列（ATCC番号75980）を、まず、プロセシングされたアミン輸送体核酸配列（シグナルペプチド配列を欠く）の5'及び3'末端配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。アミン輸送体遺伝子に対応する追加のヌクレオチドを、その5'配列と3'配列のそれぞれに付加する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、5'GACTAAAGCTTAATGCTCCGGCCC ATTCTG3'（配列番号3）という配列を持ち、HindIII制限酵素部位と、それに続く、プロセシングされたタンパク質の推定末端アミノ酸から始まるヒトアミン輸送体コーディング配列の18ヌクレオチドとを含有する。3'配列（5'GAACTTCTAGACGG TCAGCCATGGTGACTGG3'；配列番号4）は、XbaI部位に相補的な配列と、それに続くヒトアミン輸送体の20ヌクレオチドを含有する。これらの制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Quiagen，Inc.,カリフォルニア州チャッツワース）上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は抗生物質耐性（Amp^r）、細菌性複製起点（ori）、IPTGで制御できるプロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（R BS）、6-His標識及び及び制限酵素部位をコードする。pQE-9をHindIIIとXbaIで消化する。増幅した配列をpQE-9中に連結し、ヒスチジン標識及びRBSと枠を合わせて挿入する。次に、その連結混合物を用いて、Sambrook，J.ら，Molecular Cl oning: A Laboratory Manual，Cold Harbor Laboratory Press（1989）に記載の手法で、大腸菌M15/rep4株（Qiagen，Inc.）を形質転換する。M15/rep4は、lacI 抑制因子を発現し、かつ、カナマイシン耐性（Kan^r）を付与するプラスミドpREP 4の複数コピーを含有する。LBプレート上で成長するそれらの能力によって形質転換体を同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、制限分析によってそれを確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Amp（100(g/ml)とKan（25(g/ml) の両方を補足したLB液体培地で、終夜（O/N）培養する。そのO/N培養物を、1:100〜1:250の比率で、大きい培養に接種する。光学密度600（O.D.⁶⁰⁰）が0.4〜0.6になるまで細胞を生育する。次に、IPTG（「イソプロピル-(-D-チオガラクトピラノシド」）を最終濃度1mMで加える。IPTGは、lacI抑制因子を不活化することによって、P/Oをきれいにし、遺伝子発現の増大を誘導する。細胞をさらに3〜4時間生育する。次に、遠心分離によって細胞を収集する。細胞ペレットをカオトロピック剤6M塩酸グアニジン中で可溶化する。清浄化の後、この溶液から、6-His標識を含有するタンパク質による強固な結合が可能な条件下に、ニッケル-キレートカラムでのクロマトグラフィーによって、可溶化したヒトアミン輸送体を精製する（Hochuli，E.ら，J．Chro mato graphy 411:177-184（1984））。ヒトアミン輸送体タンパク質を6M塩酸グアニジンpH5.0でカラムから溶出させ、再生のために、3M塩酸グアニジン、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）及び2mMグルタチオン（酸化型）に調節する。この溶液を12時間インキュベートした後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析する。実施例2：バクロウイルス発現系によるヒトアミン輸送体のクローニングと発現完全長ヒトアミン輸送体タンパク質をコードするDNA配列（ATCC番号75980）を、その遺伝子の5'及び3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。 5'プライマーは5'CG GGATCC CTCCATGGCTCCGGCCCATTCTG3'（配列番号5）という配列を持ち、BamHI制限酵素部位（太字部分）、真核細胞における翻訳開始の効率のよいシグナルに似た4ヌクレオチド（Kozak，M.，J．Mol．Biol.，196:947-9 50（1987））、ヒトアミン輸送体遺伝子の最初の18ヌクレオチド（翻訳開始コドン「ATG」に下線を引いてある）を、この順番に含有する。 3'プライマーは5'CGGGATCCCGCTCAGCCATGGTGACTGGT3'（配列番号6）という配列を持ち、制限エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位と、ヒトアミン輸送体遺伝子の3'非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドとを含有する。増幅された配列を、市販のキット（「Geneclean」，BIO 101 Inc.,カリフォルニア州ラジョラ）を用いて、1%アガロースゲルから単離する。次に、その断片をエンドヌクレアーゼBamH Iで消化した後、1%アガロースゲルで再び精製する。この断片をF2と命名する。ベクターpRG1（pVL941ベクターを改良したもの、後述）を、バクロウイルス発現系（総説としてはSummers，M.D.及びSmith，G.E.，1987，A manual of method s for baculovirus vectors and insect cell culture procedures，Texas Agri cultureal Experimental Station Bulletin No．1555を参照のこと）によるヒトアミン輸送体タンパク質の発現に用いる。この発現ベクターは、Autographa cal ifornica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターと、それに続く制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識部位とを含有する。効率のよいポリアデニル化のために、シミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位を使用する。組換えウイルスを簡単に選択するため、大腸菌由来のβ −ガラクトシダーゼ遺伝子が、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルに先行するポリヘドリンプロモーターと同じ方向に挿入される。ポリヘドリン配列の両端には、同時にトランスフェクションされる野生型ウイルスDNAの細胞媒介相同組換え用のウイルス配列が隣接する。pRG1の代わりに、pAc373、pVL941及び pAcIM1（Luckow，V.A.及びSummers，M.D.，Virology，170:31-39）などといった他の多くのバクロウイルスベクターも使用できる。このプラスミドを制限酵素BamHIで消化した後、ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該技術分野で知られる手法で脱リン酸化する。次に、市販のキット（「Ge necleanl」BIO 101 Inc.,カリフォルニア州ラジョラ）を用いて、そのDNAを1%アガロースゲルから単離する。このベクターをV2と命名する。断片F2と脱リン酸化プラスミドV2をT4 DNAリガーゼで連結する。次に、大腸菌 HB101細胞を形質転換し、ヒトアミン輸送体遺伝子を持つプラスミド（pBac-ヒトアミン輸送体）を含有する細菌を、酵素BamHIを用いて同定する。クローン化された断片の配列をDNA配列決定によって確認する。リポフェクション法（Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:7413-741 7（1987））を用いて、5(gのプラスミドpBac-ヒトアミン輸送体を、市販の直鎖化したバクロウイルス（「BaculoGold^TM baculovirus DNA」，Pharmingen,カリフォルニア州サンディエゴ）1.0(gと同時にトランスフェクションする。 1(gのBaculoGold^TMウイルスDNAと5(gのプラスミドpBac-ヒトアミン輸送体を、血清非含有グレース培地（Life Technologies Inc.,メリーランド州ガイサースブルク）50(lの入ったマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン10(gとグレース培地90(lを加え、混合し、室温で15分間インキュベートする。次に、35mm組織培養プレートに血清を含まないグレース培地 1mlと共に接種したSf9昆虫細胞（ATCC CRL1711）に、上記トランスフェクション混合物を滴下する。プレートを前後にゆすって、新たに加えた溶液を混合する。次に、そのプレートを27℃で5時間培養する。5時間後、トランスフェクション溶液をプレートから取り除き、10%ウシ胎児血清を補足したグレース昆虫培地1mlを加える。そのプレートを培養器に戻し、培養を27℃で4日間続ける。 4日後、上清を集め、Summers及びSmith（上記）の記述と同様に、プラーク検定を行なう。改良点として、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.,ガイサースブルク）を含むアガロースゲルを使用する。これは、青く染色したプラークの単離を容易にする。「プラーク検定」に関する詳細な説明は、Life Technologie s Inc.（ガイサースブルク）が発行している昆虫細胞培養とバクロウイルス学に関するユーザーズガイドの9-10頁にも認められる。連続希釈の4日後、ウイルスを細胞に加え、青く染色したプラークをエッペンドルフピペットの先端で拾う。次に、組換えウイルスを含有する寒天を、グレース培地200(lの入ったエッペンドルフチューブ中に再懸濁する。短い遠心分離によって寒天を除去し、組換えバクロウイルスを含有する上清を用いて、35mm皿に接種したSf9細胞を感染させる。4日後、これらの培養皿の上清を収集し、4℃で保存する。 Sf9細胞を、10%熱不活化FBSを補足したグレース培地で生育する。細胞を組換えバクロウイルスV-ヒトアミン輸送体に感染多重度（MOI）2で感染させる。6時間後、培地を除去し、メチオニンとシステインを欠くSF900II培地（Life Techno logies Inc.,ガイサースブルク）に置換した。45時間後、5(Ciの³⁵S-メチオニンと5(Ciの³⁵S-システイン（Amersham）を加える。細胞をさらに16時間培養した後、遠心分離によって収集し、標識されたタンパク質をSDS-PAGEとオートラジオグラフィーで可視化する。実施例3：COS細胞における組換えヒトアミン輸送体の発現プラスミド、ヒトアミン輸送体HAの発現は、1）SV40複製起点、2）アンピシリン耐性遺伝子、3）大腸菌複製起点、4）CMVプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、SV40イントロン及びポリアデニル化部位を含有するベクターpcDNAI/A mp（Invitrogen）から得る。全ヒトアミン輸送体前駆体と、その3'末端にインフレーム（in frame）融合したHA標識とをコードするDNA断片を、ベクターのポリリンカー領域にクローニングする。したがって、その組換えタンパク質の発現は CMVプロモーターに制御される。HA標識は、既に記述されたインフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する（I．Wilsonら，Cell，37:76 7（1984））。標的タンパク質にHA標識を注入（infusion）することにより、HA エピトープを認識する抗体で組換えタンパク質を容易に検出できるようになる。プラスミド構築法は次の通りである。ヒトアミン輸送体をコードするDNA配列（ATCC番号75980）を、次の2つのプライマーを用いるPCRで構築する。5'プライマー（5'GTCCAAGCTTGCCACCATGCTGCGGCC CATTCTG3'；配列番号7）は、HindIII部位と、それに続く、開始コドンから始まるヒトアミン輸送体コーディング配列の18ヌクレオチドとを含有する。3'配列（ 5'CTAGCTCGAGTCAGCCATGGTGACTGGTAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCA3'；配列番号 8)は、XhoI部位に相補的な配列、翻訳停止コドン、HA標識及びヒトアミン輸送体コーディング配列の最後の18ヌクレオチド（停止コドンを除く）を含有する。したがって、PCR産物は、HindIII部位、ヒトアミン輸送体コーディング領域、それに続く、インフレーム融合したHA標識、HA標識に続く翻訳終結停止コドン及びHi ndIII部位を含有する。そのPCR増幅DNA断片とベクターpcDNAI/AmpをHindIII及び XhoI制限酵素で消化し、連結する。その連結混合物で大腸菌SURE株（Stratagene Cloning Systems,カリフォルニア州ラジョラ）を形質転換し、その形質転換培養をアンピシリン培地プレートで培養して、耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、制限分析によって正しい断片の存在を調べる。この組換えアミン輸送体を発現させるため、DEAE-デキストラン法（J．Sambrook ，E．Fritsch，T．Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press（1989））によって、COS細胞を上記発現ベクターでトランスフェクションする。ヒトアミン輸送体HAタンパク質の発現は、放射線標識と免疫沈降法（E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1988））によって検出する。トランスフェクションの2日後に、細胞を³⁵S-システインで8時間標識する。次に、培養培地を集め、細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液（150mM NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，1%NP-40 ，0.5%DOC，50mM Tris，pH7.5）で溶解する（Wilson，I.ら,同上，37:767（1984 ））。細胞溶解液と培養培地の両方をHA特異的モノクローナル抗体で沈殿させる。沈殿したタンパク質を15%SDS-PAGEゲルで分析する。実施例4：ヒト組織におけるヒトアミン輸送体の発現パターンヒト組織におけるヒトアミン輸送体の発現レベルを調べるために、ノーザンブロット分析を行なう。全細胞RNA試料をRNAzol^TM Bシステム（Biotecx Laborator ies，Inc.,テキサス州ヒューストン）で単離する。各ヒト組織から単離した約10 (gの全RNAを1%アガロースゲルで分離し、ナイロンフィルターにブロットする（S ambrook，Fritsch及びManiatis，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Pres s（1989））。標識反応は、50ngのDNA断片を用いて、Stratagene Prime-Itキットに従って行なう。標識されたDNAをSelect-G-50カラム（5 Prime-3 Prime，Inc .,コロラド州ボールダー）で精製する。次に、フィルターを、0.5M NaPO₄，pH7. 4及び7%SDS中、65℃で終夜、放射活性標識した完全長ヒトアミン輸送体遺伝子1, 000,000cpm/mlと、ハイブリッド形成させる。0.5×SSC、0.1%SDSを用いて室温で 2回、60℃で2回洗浄した後、増幅スクリーンを用いて、フィルターを−70℃で終夜、露出する。上の教示を考慮すれば、本発明には数多くの改良や変更を加えることができるので、詳しく説明した態様以外にも、添付の請求項の範囲内で本発明を実施することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ｚ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＫ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ローゼン，クレイグ・エイアメリカ合衆国20882メリーランド州レイトンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）配列番号2の推定アミノ酸配列を持つポリペプチド、該ポリペプチドの断片、類縁体又は誘導体をコードするポリヌクレオチド、及び（b）ATCC寄託番号75980に含まれるcDNAによってコードされるアミノ酸配列を持つポリペプチド、該ポリペプチドの断片、類縁体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される単離されたポリヌクレオチド。２．DNAである請求項1のポリヌクレオチド。３．RNAである請求項1のポリヌクレオチド。４．ゲノムDNAである請求項1のポリヌクレオチド。５．配列番号2の推定アミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする請求項2のポリヌクレオチド６．ATCC寄託番号75980のcDNAによってコードされるポリペプチドをコードする請求項2のポリヌクレオチド。７．配列番号1に記載のコーディング配列を持つ請求項1のポリヌクレオチド。８．ATCC寄託番号75980として寄託されたコーディング配列を持つ請求項2のポリヌクレオチド。９．請求項2のDNAを含有するベクター。 10．請求項9のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。 11．請求項10の宿主細胞から該DNAによってコードされるポリペプチドを発現させることからなるポリペプチドの生産法。 12．請求項9のベクターで細胞を遺伝子操作することからなる、ポリペプチドを発現させうる細胞の生産法。 13．請求項2のDNAにハイブリッド形成することができ、かつ、ヒトアミン輸送体活性を持つポリペプチドをコードする単離されたDNA。 14．（a）配列番号2の推定アミノ酸配列を持つポリペプチド、その断片、類縁体又は誘導体、及び（b）ATCC寄託番号75980のcDNAによってコードされるポリペプチド、該ポリペプチドの断片、類縁体又は誘導体からなる群より選択されるポリペプチド。 15．ポリペプチドが配列番号2の推定アミノ酸配列を持つ請求項14のポリペプチド。 16．請求項14のポリペプチドに対する抗体。 17．請求項14のポリペプチドに対するアゴニストとして有効な化合物。 18．請求項14のポリペプチドに対するアンタゴニストとして有効な化合物。 19．ヒトアミン輸送体活性を必要とする患者の治療法であって、請求項17の化合物の治療有効量をその患者に投与することからなる方法。 20．ヒトアミン輸送体活性を必要とする患者の治療法であって、請求項14のポリペプチドの治療有効量をその患者に投与することからなり、該ポリペプチドをコードするDNAをその患者に与えて、該ポリペプチドを生体内で発現させることによって、該ポリペプチドの治療有効量を投与する方法。 21．ヒトアミン輸送体活性を阻害する必要のある患者の治療法であって、請求項18の化合物の治療有効量をその患者に投与することからなる方法。 22．その受容体のリガンドを結合する請求項14のポリペプチドの可溶性断片。 23．請求項14のポリペプチドに対するアンタゴニスト又はアゴニストとして有効な化合物を同定する方法であって、ある細胞の表面にそのポリペプチドを発現させ、その細胞を、そのポリペプチドによって輸送されることがわかっているリガンド及びスクリーニングすべき化合物と接触させ、そのポリペプチドによって輸送されるリガンドの程度を測定し、そのスクリーニングすべき化合物がアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを同定することからなる方法。 24．ヒトアミン輸送体に結合できるとわかっていないリガンドが、それに結合できるかどうかを決定する方法であって、ヒトアミン輸送体を発現させる哺乳類細胞を潜在的リガンドと接触させ、その輸送体に結合するリガンドの存在を検出し、そのリガンドがその輸送体に結合するかどうかを決定することからなる方法。 25．宿主から得た試料中の請求項14のポリペプチドをコードする核酸配列における突然変異を検出することからなる、ヒトアミン輸送体の過少発現に関係する疾患又はその疾患に対する罹病性を診断する方法。 26．宿主から得た試料中の請求項22のポリペプチドの存在を分析することからなる診断法。