JP2002330795A - ヒトアミン輸送体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトアミン輸送体ポリペプチドと該ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）及び組換え技術によ
る該ポリペプチドの生産法を開示する。 【解決手段】 該ポリペプチドに対する作用薬及び拮抗
薬を検出する方法と、本発明ヒトアミン輸送体の過小発
現及び過剰発現に関係する疾患を治療するための作用薬
及び拮抗薬の使用をも提供する。また、上記ポリペプチ
ドをコードする核酸配列中の突然変異を検出する方法並
びに上記ポリペプチドの可溶型のレベルの変化を検出す
る方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、新たに同定されたポリヌクレオ
チド、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、
該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用並びに該ポ
リヌクレオチド及びポリペプチドの生産に関する。より
具体的に述べると、本発明のポリペプチドはヒトアミン
輸送体である。さらに本発明は、上記ポリペプチドの作
用を阻害することに関する。

【０００２】知覚神経機能と運動神経機能は神経伝達に
よって行われる。神経伝達とは、シナプス前ニューロン
と呼ばれる1つのニューロンからシナプス後ニューロン
と呼ばれるもう1つのニューロンへ向かってシナプス間
隙を横切る、神経インパルスの伝導である。シナプス間
隙を横切る神経インパルスの伝達には、神経伝達物質の
分泌が伴う。神経伝達物質はシナプス前ニューロンにお
いて小胞に封入されて、シナプス間隙に放出され、シナ
プス後ニューロンにあるそのレセプターを見つける。神
経インパルスの伝達は、常態では、一時的である。

【０００３】シナプス伝達の不可欠な特性は、神経伝達
物質放出に続く迅速な作用の終了である。カテコールア
ミン、セロトニン及びある種のアミノ酸（例えばγ-ア
ミノ酪酸（GABA）、グルタミン酸、グリシンなど）を含
む多くの神経伝達物質の場合、シナプス作用の迅速な終
了は、シナプス前末端及び周辺の神経膠細胞への神経伝
達物質の取り込みによって達成される。この迅速な神経
伝達物質の再蓄積は、シナプス前末端による再取り込み
の結果である。

【０００４】シナプス前末端では、再取り込みのための
種々の分子構造が、コリンや生物起源のアミン（ドーパ
ミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン及
びヒスタミンなどの低分子量神経伝達物質）といった神
経伝達物質に対して高い親和性を持つ。これらの分子装
置は輸送体（トランスポーター）と呼ばれる。これらの
輸送体は、神経伝達物質をシナプス間隙からシナプス前
ニューロンの細胞膜を逆に横切ってシナプス前末端の細
胞質内へ動かすことによって、これらの物質の機能を終
了させる。神経伝達物質取り込みの阻害又は刺激は、内
因性神経伝達物質の作用を調節する手段となる。

【０００５】輸送体による神経伝達物質の再取り込み
は、ナトリウム依存性でありうる。例えばGABA輸送体
は、最近記述されたナトリウム依存性神経伝達物質輸送
体遺伝子ファミリーの一要素である。これらの輸送体
は、細胞外部分、膜貫通部分及び細胞内部分を持つ膜貫
通型レセプター錯体である。ナトリウム依存性神経伝達
物質輸送体タンパク質の全ファミリーの膜貫通ドメイン
には、かなりの相同性が存在し、同一のアミノ酸を持つ
区間がかなりあるが、これらのドメインにつながってい
る細胞内ループと細胞外ループに認められる相同性はは
るかに少ない。特に細胞外ループは、各輸送体に独特で
あるように思われる。この領域は基質特異性及び/又は
阻害因子特異性に寄与するのだろう。

【０００６】本発明の新規アミン輸送体を同定し、タイ
プの異なる輸送体間の構造と機能の相違を解明すること
は、行動と疾患の細胞及び分子的基礎を理解する上で重
要である。

【０００７】本発明のポリペプチドは、アミン輸送体で
あろうと同定された。この同定は、ラットのアミン輸送
体に対するアミノ酸配列相同性の結果としてなされた。
本発明の一側面によれば、ヒトアミン輸送体である新規
成熟ポリペプチドと、生物学的に活性かつ診断的又は治
療的に有用なその断片、類縁体及び誘導体が提供され
る。

【０００８】本発明のもう1つの側面によれば、ヒトア
ミン輸送体をコードする核酸分子（mRNA、DNA、cDNA、
ゲノムDNAを含む）と、生物学的に活性かつ診断又は治
療に有用なその断片及び誘導体が提供される。

【０００９】本発明のさらなる側面によれば、組換え技
術によって上記ポリペプチドを生産する方法であって、
ヒトアミン輸送体核酸配列を含有する組換え原核及び/
又は真核宿主細胞を、該タンパク質の発現を促進する条
件下に培養し、次いで該タンパク質を回収することから
なる方法が提供される。

【００１０】本発明のさらなる側面によれば、上記ポリ
ペプチドに対するリガンド、アゴニスト（作用薬）及び
アンタゴニスト（拮抗薬）のスクリーニングに、上記ポ
リペプチド若しくは上記ポリペプチドををコードするポ
リヌクレオチドを使用する方法が提供される。

【００１１】本発明のさらなる側面によれば、アミン輸
送体の過少発現又はそのリガンドの過剰発現に関係する
疾患の治療として、神経伝達リガンドのアミン輸送体取
り込みを刺激するために上記アゴニストを使用する方法
が提供される。

【００１２】本発明のさらなる側面によれば、アミン輸
送体の過剰発現又はそのリガンドの過少発現に関係する
疾患の治療として、神経伝達リガンドのアミン輸送体取
り込みを阻害するために上記アンタゴニストを使用する
方法も提供される。

【００１３】本発明のさらなる側面によれば、上記ポリ
ペプチドに対する抗体が提供される。

【００１４】本発明のさらなる側面によれば、ヒトアミ
ン輸送体配列に特異的にハイブリッド形成するに足る長
さを持つ核酸分子を含む核酸プローブも提供される。

【００１５】本発明のさらなる側面によれば、アミン輸
送体ポリペプチドの過少発現及び過剰発現並びに上記ポ
リペプチドをコードする核酸配列中の突然変異に関係す
る疾患を検出するための診断的検定法が提供される。

【００１６】本発明のさらなる側面によれば、科学的研
究、DNAの合成及びDNAベクターの製造に関係する試験管
内用途に、上記ポリペプチド又は上記ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供され
る。当業者にとっては、本発明のこれらの側面と他の側
面は、本明細書の教示から明白なはずである。

【００１７】以下の図面は本発明の実施態様を例示する
ものであって、請求の範囲が包含する本発明の範囲を制
限するものではない。図１〜５は、本発明のヒトアミン
輸送体のcDNA配列と、対応する推定アミノ酸配列とを表
す。アミノ酸には標準的な一文字略号を使用している。
配列決定は373自動DNA配列決定装置（Applied Biosyste
ms, Inc.）を用いて行なった。配列決定の正確さは、97
%以上正確であると予測される。図６〜７は、本発明の
アミン輸送体とラットのアミン輸送体（Genbank公開デ
ーターベースから検索）とのアミノ酸ホモロジー整合図
である。

【００１８】本発明のアミン輸送体は、哺乳類細胞中に
存在するアミン神経伝達物質の1つ又はいくつかの再取
り込みを引き起こしうる。そのようなアミンの例として
は、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、セ
ロトニン及びヒスタミン、その他のアミノ酸伝達物質
（GABA、グリシン及びグルタミン酸を含む）が挙げられ
る。

【００１９】本発明の一側面によれば、図１〜５の推定
アミノ酸配列（配列番号2）を持つ成熟ポリペプチド若
しくは1994年12月16日にATCC寄託番号75980として寄託
されたクローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペ
プチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチ
ド）が提供される。

【００２０】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、種々のヒト組織から得ることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒト副腎腫瘍に由来する
cDNAライブラリー中に発見された。これは、構造的にア
ミン輸送体ファミリーに関係している。このポリヌクレ
オチドは、470アミノ酸残基からなる部分をコードする
読み取り枠を含有する。このタンパク質はラットアミン
輸送体に対して最も高い相同性を持ち、468アミノ酸の
範囲にわたって80%の同一性と86%の類似性を持つ。

【００２１】本発明のポリヌクレオチドはRNA型であっ
てもよいし、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAを含むDNA型
であってもよい。DNAは二本鎖であってよいし、一本鎖
であってもよく、一本鎖の場合はコーディング鎖でもよ
いし、非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。成
熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図１
〜５に示すコーディング配列（配列番号2）又は上記寄
託クローンのコーディング配列と同一であってもよい
し、その遺伝コードの重複性又は縮重性の結果として図
１〜５のDNA（配列番号2）又は上記寄託cDNAと同じ成熟
ポリペプチドをコードする、異なるコーディング配列で
あってもよい。

【００２２】図１〜５の成熟ポリペプチド配列（配列番
号2）をコードするポリヌクレオチド又は上記寄託cDNA
によってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドは、その成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列のみを含んでもよいし、その成熟ポリペプチドの
コーディング配列（追加のコーディング配列を伴っても
よい）と非コーディング配列（イントロンや成熟ポリペ
プチドに関するコーディング配列の5'及び/又は3'側に
ある非コーディング配列など）とを含んでもよい。

【００２３】したがって、「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」という用語は、そのポリペプチドの
コーディング配列のみを含むポリヌクレオチドと、さら
に追加のコーディング配列及び/又は非コーディング配
列をも含むポリヌクレオチドとを包含する。

【００２４】さらに本発明は、図１〜５の推定アミノ酸
配列（配列番号2）を持つポリペプチド若しくは上記寄
託クローンのcDNAによってコードされるポリペプチドの
断片、類縁体及び誘導体をコードする、上述のポリヌク
レオチドの変種に関する。このポリペプチドの変種は、
上記ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変種
であってもよいし、上記ポリヌクレオチドの天然には存
在しない変種であってもよい。

【００２５】したがって本発明は、図１〜５に示す成熟
ポリペプチド（配列番号2）又は上記寄託クローンのcDN
Aによってコードされる成熟ポリペプチドと同じ成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに図１
〜５のポリペプチド(配列番号2)若しくは上記寄託クロ
ーンのcDNAによってコードされるポリペプチドの断片、
誘導体又は類縁体をコードする上記ポリヌクレオチドの
変種を包含する。そのようなヌクレオチド変種として
は、欠失変種、置換変種及び付加又は挿入変種が挙げら
れる。

【００２６】上述のように、本発明のポリヌクレオチド
は、図１〜５に示すコーディング配列（配列番号1）若
しくは上記寄託クローンのコーディング配列の天然に存
在する対立遺伝子変種であるコーディング配列を持って
もよい。当該技術分野で知られているように、対立遺伝
子変種は、コードされるポリペプチドの機能を実質的に
変えない1以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を
持ちうる代替型のポリヌクレオチド配列である。

【００２７】本発明のポリヌクレオチドは、本発明ポリ
ペプチドの精製に利用されるマーカー配列にインフレー
ム（in frame）融合したコーディング配列を持ってもよ
い。細菌宿主の場合は、pQE-9ベクターによって供給さ
れるヘキサヒスチジン標識をマーカー配列として、その
マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製に備えるこ
とができ、また、COS-7細胞のような哺乳類宿主を使用
する場合は、例えば血球凝集素（HA）標識をマーカー配
列とすることができる。HA標識は、インフルエンザ血球
凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（Wi
lson, I.ら, Cell, 37:767（1984））。

【００２８】さらに本発明は、配列間に少なくとも50
%、好ましくは少なくとも70%の同一性がある場合に上述
の配列にハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドに関
する。特に本発明は、厳密な条件下で上述のポリヌクレ
オチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関す
る。本明細書で使用する「厳密な条件」という用語は、
配列間に少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%の同
一性がある場合にのみ、ハイブリッド形成が起こること
を意味する。好ましい態様として、上述のポリヌクレオ
チドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、図１
〜５のcDNA（配列番号1）又は上記寄託cDNAによってコ
ードされる成熟ポリペプチドと実質上同じ生物学的機能
又は活性を保持するポリペプチドをコードする。

【００２９】本明細書で言及する寄託物は、特許手続上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に
基づいて維持される。これらの寄託物は当業者の利便の
ために提供されるに過ぎず、これが35U.S.C§112で求め
られる寄託であると認めるわけではない。寄託物に含ま
れるポリヌクレオチドの配列とそれによってコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本明細書
の一部を構成し、万一、本明細書に記載する配列の説明
と矛盾する場合は、これが支配的となる。上記寄託物を
作成、使用又は販売するには承諾が必要であり、本明細
書はそのような承諾を与えるものではない。

【００３０】さらに本発明は、図１〜５の推定アミノ酸
配列（配列番号2）を持つヒトアミン輸送体ポリペプチ
ド又は上記寄託cDNAによってコードされるアミノ酸配列
を持つヒトアミン輸送体ポリペプチド、及びそのような
ポリペプチドの断片、類縁体及び誘導体に関する。

【００３１】図１〜５のポリペプチド（配列番号2）又
は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドに関
して「断片」、「誘導体」及び「類縁体」という場合、これ
らの用語は、そのようなポリペプチドと実質上同じ生物
学的機能又は活性を保持するポリペプチドを意味する。
したがって類縁体には、プロタンパク質部分の切断によ
って活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成しうる
プロタンパク質が含まれる。

【００３２】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチド及び合成ポリペプチドのいず
れであってもよく、組換えポリペプチドが好ましい。

【００３３】図１〜５のポリペプチド（配列番号2）又
は上記寄託cDNAによってコードされるポリペプチドの断
片、誘導体又は類縁体は、（i）1以上のアミノ酸残基が
保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的ア
ミノ酸残基）で置換されているもの（その置換アミノ酸
残基は遺伝コードによってコードされるものであっても
よいし、そうでなくてもよい）であってもよいし、（i
i）1以上のアミノ酸残基が置換基を含有するものであっ
てもよく、或いは（iii）成熟ポリペプチドがもう1つの
化合物（例えばそのポリペプチドの半減期を増大させる
ための化合物（ポリエチレングリコールなど））に融合
しているものであってもよい。そのような断片、誘導体
及び類縁体は、本明細書の教示から、当業者の範囲に含
まれると考えられる。

【００３４】本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチ
ドは、単離型で提供されることが好ましく、また、均一
に精製されることが好ましい。

【００３５】「単離（された）」という用語は、その物
質がその当初の環境（例えばそれが天然物ならばその自
然環境）から取り出されていることを意味する。例え
ば、生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチド又
はポリペプチドは「単離された」とは言えないが、その
天然系中に共在する物質の一部又は全部から分離された
そのポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離され
た」と言える。そのようなポリヌクレオチドがベクター
の一部であったり、かつ/または、そのようなポリヌク
レオチド又はポリペプチドが組成物の一部であっても、
そのようなベクター又は組成物がその自然環境の一部で
ないという点で、「単離された」と言える。

【００３６】本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含
むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主
細胞、及び組換え技術による本発明ポリペプチドの生産
にも関係する。

【００３７】宿主細胞は、本発明のベクター（例えばク
ローニングベクターであってもよいし、発現ベクターで
あってもよい）によって遺伝子操作（形質導入又は形質
転換若しくはトランスフェクション）される。ベクター
は、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの
形態をとりうる。操作された宿主細胞は、プロモーター
を活性化し、形質転換体を選択し、若しくはヒトアミン
運搬体遺伝子を増幅するために適宜改良した従来の栄養
培地で培養することができる。温度やpHなどといった培
養条件は、発現用に選択したその宿主細胞に過去に用い
られた条件であり、当業者には明らかであろう。

【００３８】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によってポリペプチドを生産するために使用できる。し
たがって、例えばそのポリヌクレオチドを、ポリペプチ
ド発現用の種々の発現ベクターのいずれかに組込むこと
ができる。そのようなベクターとしては、染色体DNA配
列、非染色体DNA配列及び合成DNA配列、例えばSV40の誘
導体、細菌性プラスミド、ファージDNA、バクロウイル
ス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組み
合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例えばワク
シニア、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、偽性
狂犬病ウイルス）などが挙げられる。ただし、その他の
ベクターであっても、それがその宿主内で複製可能かつ
生存可能であるかぎり、使用できる。

【００３９】適当なDNA配列は、種々の手法によってベ
クターに挿入できる。一般的には、当該技術分野で知ら
れる手法で、適当な制限部位にDNA配列を挿入する。そ
のような手法その他は、当業者の範囲に含まれると考え
られる。発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令
する適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に
連結される。そのようなプロモーターの代表例として
は、LTR又はSV40プロモーター、大腸菌lac又はtrp、フ
ァージλP_Ｌプロモーター、及び原核細胞、真核細胞若
しくはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御するこ
とが知られているその他のプロモーターを挙げることが
できる。発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結合
部位と転写終結区（ターミネーター）をも含有する。ま
たベクターは、発現の増幅に適した配列を含んでもよ
い。

【００４０】さらに発現ベクターは、形質転換された宿
主細胞の選択に利用できる表現型特徴を与えるための1
以上の選択可能マーカー遺伝子（例えば真核細胞培養用
のネオマイシン耐性やジヒドロ葉酸レダクターゼ、大腸
菌におけるテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性な
ど）を含有することが好ましい。

【００４１】上述の適当なDNA配列と適当なプロモータ
ー又は制御配列とを含有するベクターを、適当な宿主の
形質転換に使用することによって、その宿主にそのタン
パク質を発現させることができる。

【００４２】適当な宿主の代表例としては、大腸菌、ス
トレプトミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞、酵母
などの真菌細胞、キイロショウジョウバエS2及びSpodop
teraSf9などの昆虫細胞、CHO、HEK、COS又はボーズ黒色
腫などの動物細胞、アデノウイルス、植物細胞などを挙
げることができる。適当な宿主の選択は、本明細書の教
示から、当業者の範囲に含まれると考えられる。

【００４３】より具体的に述べると、本発明は、上に広
く記述した配列の1以上を含む組換え構築物をも包含す
る。これらの構築物は、本発明の配列が正方向又は逆方
向に挿入されているベクター（プラスミドやウイルスベ
クターなど）を含む。この態様の好ましい側面では、上
記構築物がさらに、上記配列に作動可能に連結した調節
配列（例えばプロモーターを含む）をも含有する。好適
なベクターとプロモーターは当業者に多数知られてお
り、市販されている。次に挙げるベクターはその例であ
る。細菌用：pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBS、pD
10、phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pN
H8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、ptrc99
a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaci
a）。真核細胞用：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG
（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmaci
a）。ただし、他のプラスミド又はベクターであって
も、それがその宿主内で複製可能かつ生存可能である限
り、使用できる。

【００４４】プロモーター領域は、CAT（クロラムフェ
ニコールトランスフェラーゼ）ベクターや、選択可能マ
ーカーを持つ他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝
子から選択することができる。適当なベクターはPKK232
-8とPCM7である。特に有名な細菌プロモーターとして
は、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_Ｒ、P_Ｌ及びtrpが挙
げられる。真核プロモーターとしては、CMV即時型初
期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロ
ウイルスのLTR、マウスメタロチオネイン-Iが挙げられ
る。適当なベクターとプロモーターの選択は、当該技術
分野の通常の技術水準に十分含まれる。

【００４５】さらなる態様として、本発明は、上述の構
築物を含有する宿主細胞に関する。本発明の宿主細胞
は、哺乳類細胞のような高等真核細胞であってもよい
し、酵母細胞のような下等真核細胞であってもよく、ま
た、細菌細胞のような原核細胞であってもよい。宿主細
胞への上記構築物の導入は、リン酸カルシウムトランス
フェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェク
ション、又はエレクトロポレーションによって達成する
ことができる（Davis, L., Dibner, M. Battey, I., Ba
sic Methods in Molecular Biology（1986））。

【００４６】宿主細胞中の構築物を従来のように使用す
ることによって、その組換え配列によってコードされる
遺伝子産物を生産することができる。別法として、本発
明のポリペプチドを従来のペプチド合成装置で合成する
こともできる。

【００４７】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下に、哺乳類細胞、酵母、細菌その他の細胞中で発
現させることができる。本発明のDNA構築物に由来するR
NAを用いて上記タンパク質を生産するには、無細胞翻訳
系も使用できる。原核宿主及び真核宿主での使用に適し
たクローニングベクターと発現ベクターは、Sambrook
ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第2版,
ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989））
に記述されており、その開示は参考文献として本明細書
の一部を構成する。

【００４８】本発明のポリペプチドをコードするDNAの
高等真核生物による転写は、そのベクターにエンハンサ
ー配列を挿入することによって増大する。エンハンサー
はDNAのシス作用性要素であり、通常10〜300bpで、プロ
モーターに作用してその転写を増大させる。複製起点の
後期側100〜270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガ
ロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイル
スエンハンサーなどがその例である。

【００４９】一般的に、組換え発現ベクターは、複製起
点、その宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能マー
カー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やサッカ
ロミセス・セレビシェTRP1遺伝子）及び下流構造配列の
転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む
だろう。そのようなプロモーターは、なかんずく、3-ホ
スホグリセリン酸キナーゼ（PGK）のような解糖系酵
素、α-因子、酸性ホスファターゼ又は熱ショックタン
パク質をコードするオペロンから得ることができる。異
種構造配列は、翻訳開始配列及び終止配列に対して適当
な位相で、組み立てられる。任意に、異種配列が、発現
した組換え産物の安定化や簡便な精製などといった所望
の特徴を付与するN-末端同定ペプチド（identification
peptide）をコードしてもよい。

【００５０】細菌の使用に有用な発現ベクターは、所望
のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻
訳開始シグナル及び翻訳終止シグナルと共に、機能的プ
ロモーターに対して作動可能な解読位相（reading phas
e）に挿入することによって、構築される。ベクター
は、そのベクターの維持を保証し、かつ、所望であれ
ば、その宿主内での増幅を提供するために、1以上の表
現型選択可能マーカーと複製起点とを含むだろう。形質
転換に好適な原核宿主としては、大腸菌、枯草菌、ネズ
ミチフス菌並びにシュードモナス属、ストレプトミセス
属及びスタフィロコッカス属に属する様々な種が挙げら
れる。ただし、他の宿主も選択肢として使用できる。

【００５１】細菌の使用に有用な発現ベクターの典型例
は、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC37017）
の遺伝要素を含む市販のプラスミドに由来する選択可能
マーカーと細菌性複製起点とを含むことができる（ただ
しこれに限られない）。そのような市販ベクターとして
は、例えばpKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals,スウ
ェーデン国ウプサラ）及びGEM1（Promega Biotec.,米国
ウィスコンシン州マディソン）が挙げられる。これらの
pBR322「骨格」部分を、適当なプロモーター及び発現さ
せようとする構造配列と組み合わせる。

【００５２】適当な宿主株を形質転換し、その宿主株を
適当な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモータ
ーを適当な手段（例えば温度変化や化学誘導）によって
誘導し、細胞をさらに培養する。

【００５３】典型的には、細胞を遠心分離によって収集
し、物理的又は化学的手段によって破壊し、得られた粗
抽出物をさらなる精製のために確保する。

【００５４】タンパク質の発現に使用する微生物細胞
は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊又は
細胞溶解剤の使用などといった任意の便利な方法で破壊
でき、そのような方法は当業者にはよく知られている。

【００５５】組換えタンパク質の発現には、種々の哺乳
類細胞培養系も使用できる。哺乳類発現系の例として
は、Gluzman, Cell, 23:175（1981）に記載のサル腎繊
維芽細胞のCOS-7系や、適合するベクターを発現させる
ことのできる他の細胞系（例えばC127、3T3、CHO、HE
K、HeLa及びBHK細胞系）が挙げられる。哺乳類発現ベク
ターは、複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサ
ーを含み、さらに必要なリボソーム結合部位、ポリアデ
ニル化部位、スプライス供与部位とスプライス受容部
位、転写終止配列及び5'隣接非転写配列をも含むだろ
う。必要な非転写遺伝要素を提供するには、SV40のスプ
ライス部位とポリアデニル化部位に由来するDNA配列を
使用できる。

【００５６】ヒトアミン輸送体ポリペプチドは、硫酸ア
ンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は
陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパ
タイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフ
ィーを含む方法によって、組換え細胞培養から回収、精
製できる。必要とあれば、成熟タンパク質の配置の完成
に、タンパク質再生段階を使用できる。最後に、最終的
な精製段階として、高性能液体クロマトグラフィー(HPL
C)を使用できる。

【００５７】本発明のポリペプチドは、天然の精製産物
であってもよいし、化学合成法の生成物であってもよ
く、また組換え技術によって原核宿主又は真核宿主（例
えば培養された細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆
虫細胞及び哺乳類細胞など）から生産されるものであっ
てもよい。組換え生産法に使用する宿主によって、本発
明のポリペプチドはグリコシル化されることもあるし、
グリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチ
ドは、開始メチオニンアミノ酸残基を含んでもよい。

【００５８】完全長ヒトアミン輸送体遺伝子の断片をcD
NAライブラリー用のハイブリッド形成プローブとして用
いることにより、その完全長遺伝子そのものや、その遺
伝子に対する高い配列類似性又は類似の生物学的活性を
持つ他の遺伝子を単離することができる。このタイプの
プローブは一般的には少なくとも20個の塩基からなる。
しかしプローブは少なくとも30個の塩基からなることが
好ましく、50塩基以上であってもよいが、一般的には50
塩基を超えないことが好ましい。またこのプローブは、
完全長転写物に相当するcDNAクローンや、ゲノムクロー
ン若しくは調節領域、プロモーター領域、エクソン及び
イントロンを含む完全なヒトアミン輸送体遺伝子を含有
するクローンを同定するためにも使用できる。スクリー
ニングの一例では、オリゴヌクレオチドプローブの合成
に既知のDNA配列を用いることによって、ヒトアミン輸
送体遺伝子のコーディング領域を単離する。本発明遺伝
子の配列に相補的な配列を持つ標識オリゴヌクレオチド
を用いて、ヒトのcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラ
リーをスクリーニングし、そのプローブがハイブリッド
形成するライブラリーの構成要素を決定する。

【００５９】本発明は、本発明のヒトアミン輸送体によ
って輸送されるアミン神経伝達物質を決定する方法を提
供する。これらの神経伝達物質を同定する検定法の一例
では、T7 RNAポリメラーゼをコードする組換えワクシニ
アウイルスVTF-7株に哺乳類細胞を感染させた後、ベク
ター（例えばpBSSKII（−））を使用して、リポソーム
媒介トランスフェクション法で、アミン輸送体遺伝子に
感染させる。等量のベクターのみを用いて、対照トラン
スフェクションをも行なう。検定は、トランスフェクシ
ョンの8時間後に、改良クレブス-リンゲル-HEPES緩衝液
中で行なう。次に、細胞を［^３H］神経伝達物質（例え
ばGABA、ドーパミン、セロトニンなど）と共に培養す
る。細胞を氷上に置くことによって取り込みを停止させ
る。細胞を1%SDS中で可溶化し、蓄積した放射活性の量
を液体シンチレーション計数で決定する。各検定につい
てpBSSKIIによる対照トランスフェクションを用いてバ
ックグラウンドを測定し、特定のアミン神経伝達物質に
ついて決定したシグナルからその値を差し引くことによ
って、有意な量が取り込まれていたら、その特定の神経
伝達物質が本発明のヒトアミン輸送体によって取り込ま
れることが確定される。

【００６０】本発明は、アミン輸送体をコードするmRNA
の存在を検出することによる、細胞表面におけるアミン
輸送体の発現を検出する方法をも提供する。この方法で
は、当該技術分野周知の方法で細胞から全mRNAを得て、
そのmRNAを、少なくとも15ヌクレオチドからなり、か
つ、ヒトアミン輸送体をコードする核酸分子の配列内に
含まれる配列と特異的にハイブリッド形成することので
きる核酸プローブと、ハイブリッド形成条件下に接触さ
せ、そのプローブにハイブリッド形成したmRNAの存在を
検出し、それによってその細胞によるアミン輸送体の発
現を検出する。mRNA分子などの標的核酸分子に対するプ
ローブのハイブリッド形成には、当該技術分野周知の技
術を使用する。しかし、本発明の一態様では、溶解した
細胞から沈殿によって核酸を抽出し、mRNA分子のポリA
テイルを結合するカラムを用いて、その抽出物からmRNA
を単離する。次に、ニトロセルロース膜上で、そのmRNA
を、放射活性で標識したプローブに暴露する。この際、
プローブは相補的なmRNA配列にハイブリッド形成するこ
とによって、その相補的mRNA配列を標識する。結合はオ
ートラジオグラフィーかシンチレーション計数によって
検出できる。しかし、これらの段階を行なう他の方法も
当業者には良く知られている。

【００６１】別法として、ヒトアミン輸送体に対する抗
体を、その輸送体にその抗体が結合し、かつ、細胞表面
におけるその輸送体の存在を検出することのできる条件
下に、使用することもできる。このような方法は、ある
与えられた細胞がアミン輸送体の発現に欠陥を持つか否
かを決定するために使用できる。検出法としては、抗体
に結合した蛍光マーカーが挙げられる。

【００６２】本発明は、ヒトアミン輸送体に特異的に結
合しうることが知られていない化合物が、ヒトアミン輸
送体に特異的に結合できるか否かを決定する方法であっ
て、哺乳類細胞での発現に適合させたプラスミド（この
プラスミドは細胞表面にアミン輸送体を発現させるDNA
をも含有する）を含む哺乳類細胞を、アミン輸送体に結
合することがわかっているリガンドの結合が可能な条件
下に、上記化合物と接触させ、その哺乳類アミン輸送体
に結合した化合物の存在を検出することからなり、結合
した化合物が存在すれば、その化合物がヒトアミン輸送
体に特異的に結合できることが示されるという方法をも
提供する。

【００６３】本発明は、細胞表面のヒトアミン輸送体と
特異的に相互作用し、それに結合する薬物を同定するた
めの薬物スクリーニング法であって、細胞表面にヒトア
ミン輸送体を発現させる哺乳類細胞を多数の薬物と接触
させ、その細胞に結合する薬物を検出することによっ
て、ヒトアミン輸送体と特異的に相互作用し、それに結
合する薬物を同定する方法をも提供する。

【００６４】本発明はさらに、競争検定法を使用して、
本発明のヒトアミン輸送体に対するアゴニスト化合物又
はアンタゴニスト化合物を同定する方法をも提供する。
アンタゴニストを同定するための上記検定法の一例で
は、ヒトアミン輸送体をその表面に発現させるニューロ
ン細胞を、候補化合物の存在下に、既知の神経伝達物質
と接触させて、輸送された神経伝達物質の量を決定す
る。その候補化合物の不在下に対照をも作成し、その細
胞によって輸送されたアミン神経伝達物質の量を対照細
胞と比較すれば、その候補化合物がトランスフェクショ
ンされた哺乳類細胞による標識アミン神経伝達物質の輸
送を刺激又は阻害するかどうかがわかる。

【００６５】ヒトアミン輸送体アンタゴニストの例とし
ては、ヒトアミン輸送体に対する抗体、例えば細胞表面
に存在するヒトアミン輸送体のエピトープに対するモノ
クローナル抗体が挙げられる。これらの抗体は、ヒトア
ミン輸送体の存在を検出したり、若しくはヒトにおける
その輸送体の機能を阻害するのに有用である。

【００６６】もう1つのアンタゴニスト候補は、アンチ
センス技術を用いて作成されるアンチセンス構築物であ
る。アンチセンス技術は、アンチセンスDNA又はRNA若し
くは三重らせん形成による遺伝子発現の制御に使用で
き、これらの方法は共に、DNA又はRNAに対するポリヌク
レオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コーディ
ング部分を用いて、約10〜40塩基対長のアンチセンスRN
Aオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチ
ドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるよう
に設計されることによって（三重らせん−Leeら, Nucl.
Acids. Res., 6:3073（1979）；Cooneyら, Science, 2
41:456（1988）；Dervanら, Science, 251:1360（199
1）を参照）、ヒトアミン輸送体の転写と生産を妨害す
る。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは生体内でmRN
Aにハイブリッド形成し、そのmRNA分子のヒトアミン輸
送体ポリペプチドへの翻訳を遮断する（アンチセンス−
Okano, J. Neurochem., 56:560（1991）；Oligodeoxynu
cleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressi
on, CRC Press,フロリダ州ボカラトン（1988）を参
照）。上述のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNA
又はDNAが生体内で発現してヒトアミン輸送体の生産を
阻害しうるように、細胞に送達することもできる。

【００６７】神経伝達物質に結合し、それがヒトアミン
輸送体と相互作用するのを妨害する可溶型のヒトアミン
輸送体（例えばその輸送体の断片）も、アンタゴニスト
候補である。

【００６８】さらに、ヒトアミン輸送体の細胞外部分に
結合し、それを占拠することによって、ヒトアミン輸送
体を神経伝達物質に近づけなくし、輸送体を阻害する小
分子も、アンタゴニスト候補である。そのような小分子
の例としては、小ペプチド又は小さいペプチド様分子が
挙げられるが、これらに限られるわけではない。

【００６９】本発明はさらに、過剰のアミン輸送体活性
に関係する病的状態を処置する方法であって、上述のア
ンタゴニストを医薬的に許容できる担体と共に、アミン
輸送体に対する天然に存在する基質の結合を遮断するの
に有効な量で、対象に投与することによって、その病的
状態を緩和することからなる方法を提供する。病的状態
の例としては、癲癇、精神分裂病、うつ病、認識障害、
不安及び偏頭痛が挙げられる。

【００７０】本発明は、アミン輸送体活性の過少発現に
関係する病的状態を処置する方法であって、上述のアゴ
ニストを医薬的に許容できる担体と共に、アミン輸送体
に対する天然に存在する基質の結合を増進するのに有効
な量で、対象に投与することによって、その病的状態を
緩和することからなる方法を提供する。パーキンソン病
やアルツハイマー病が、その病的状態の例である。

【００７１】可溶型のヒトアミン輸送体とアゴニスト及
びアンタゴニストは、適当な医薬担体と組み合わせて使
用できる。そのような組成物は、治療有効量の輸送体、
アゴニスト又はアンタゴニストと、医薬的に許容できる
担体又は賦形剤とを含有する。そのような担体として
は、塩水、緩衝塩水、デキストロース、水、グリセロー
ル、エタノール及びそれらの組み合わせが挙げられる
が、これらに限られるわけではない。製剤は投与法に適
合すべきである。

【００７２】本発明は、本発明医薬組成物の1以上の成
分で満たされた1以上の容器を含む医薬パック又はキッ
トをも提供する。そのような容器には、医薬品又は生物
学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によ
って規定された形で、ヒト投与に関する製造、使用又は
販売の該機関による認可を反映する情報を付すことがで
きる。さらに、本発明医薬組成物を他の治療用化合物と
共に使用してもよい。

【００７３】上記医薬組成物は、経口経路、局所経路、
静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻孔
内経路又は皮内経路など、都合の良い方法で投与でき
る。上記医薬組成物は、特定の適応症の処置及び／又は
予防に有効な量で投与される。一般的には、少なくとも
約10(g/kg-体重の量で投与され、ほとんど場合は、約8m
g/kg-体重/日を超えない量で投与されるだろう。ほとん
どの場合、日用量は、投与経路、症状などを考慮して、
約10(g/kg〜約1mg/kg-体重である。

【００７４】ヒトアミン輸送体と、ポリペプチドである
アゴニスト及びアンタゴニストを、本発明に従って使用
する場合、それを生体内における上記ポリペプチドの発
現によってすることもできる。これはしばしば「遺伝子
療法」と呼ばれる。

【００７５】したがって例えば、患者から得た細胞を、
生体外で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（DNA又はRNA）で操作し、そのポリペプチドで処置しよ
うとする患者に、操作したその細胞を与えることができ
る。例えば、本発明のポリペプチドをコードするRNAを
含有するレトロウイルス粒子を使用して、当該技術分野
で知られる手法で、細胞を操作することができる。

【００７６】さらに、生体内でポリペプチドを発現させ
るために、例えば当該技術分野で知られる手法によっ
て、生体内で細胞を操作することもできる。当該技術分
野では知られているように、生体内で細胞を操作し、生
体内で本発明のポリペプチドを発現させるために、本発
明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウ
イルス粒子を生産する生産細胞を、患者に投与すること
ができる。本発明のポリペプチドを投与するためのこれ
ら方法とその他の方法は、本発明の教示から、当業者に
は明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための
発現ベクターはレトロウイルス以外であってもよく、例
えばアデノウイルスは、適当な送達ベクターと組み合わ
せれば、生体内で細胞を操作するために使用できる。

【００７７】本発明は、ヒトアミン輸送体遺伝子におけ
る突然変異の存在に関係する疾患若しくはその疾患に対
する罹病性を検出するための診断的検定法の一部として
の、ヒトアミン輸送体遺伝子の使用にも関係する。その
ような疾患は、ヒトアミン輸送体の過少発現に関係す
る。

【００７８】ヒトアミン輸送体遺伝子に突然変異を持つ
個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出できる。
診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検及び検死体
などといった患者の細胞から得ることができる。ゲノム
DNAは、検出に直接使用してもよいし、分析に先立っ
て、PCRを用いて酵素的に増幅してもよい（Saikiら, Na
utre, 324:163-166（1986））。RNAやcDNAも同じ目的に
使用できる。例えば、ヒトアミン輸送体突然変異の同定
と分析に、ヒトアミン輸送体タンパク質をコードする核
酸に相補的なPCRプライマーを使用することができる。
例えば、欠失や挿入は、増幅産物のサイズが正常な遺伝
子型とは異なることによって検出できる。点変異は、放
射線で標識したヒトアミン輸送体RNA配列若しくは放射
線で標識したヒトアミン輸送体アンチセンスDNA配列
に、増幅したDNAをハイブリッド形成させることによっ
て同定できる。完全に一致した配列は、RNaseA消化若し
くは融解温度の相違によって、ミスマッチを持つ二本鎖
分子と識別できる。

【００７９】DNA配列の相違に基づく遺伝子試験は、変
性剤を含む（若しくは含まない）ゲルにおけるDNA断片
の電位泳動移動度の変化を検出することによって、達成
できる。小さい配列の欠失と挿入は、高分解能ゲル電気
泳動によって可視化できる。配列が異なるDNA断片は、
変性ホルムアミド勾配ゲルで識別できる。この場合、異
なるDNA断片の移動度は、それぞれの融解温度又は部分
的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する
（例えばMyersら, Science, 230:1242（1985）を参
照）。

【００８０】特定の位置における配列の変化は、化学切
断法や、RNase及びS1保護などのヌクレアーゼ保護検定
法でも明らかにできる（例えばCottonら, PNAS, USA, 8
5:4397-4401（1985）を参照）。

【００８１】したがって、特定のDNA配列の検出は、ハ
イブリッド形成、RNase保護、化学切断、直接DNA配列決
定などの方法、若しくは制限酵素の使用（例えば制限断
片長多形（Restriction Fragment Length Polymorphism
s；RFLP））及びゲノムDNAのサザンブロッティングによ
って達成できる。

【００８２】より従来的なゲル電気泳動とDNA配列決定
に加えて、インシチュー分析でも突然変異を検出するこ
とができる。

【００８３】本発明の配列は、染色体同定にも有効であ
る。本発明の配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置
に特異的に誘導され、それにハイブリッド形成できる。
また、染色体上の特定の部位を同定することは、現在必
要とされていることでもある。現在のところ、染色体位
置の標識に利用できる、実際の配列データ（反復多形
（repeat polymorphisms））に基づく染色体標識試薬は
ほとんどない。本発明による染色体に対するDNAのマッ
ピングは、それらの配列を疾患に関係する遺伝子と相関
させる重要な第1段階である。

【００８４】簡単に述べると、配列は、そのcDNAからPC
Rプライマー（15〜25bpが好ましい）を調製することに
よって、染色体に対してマッピングできる。ゲノムDNA
中の2エクソン以上にまたがることによって増幅過程を
複雑にすることのないプライマーをすばやく選択するに
は、3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いる。次
に、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドの
PCRスクリーニングに、これらのプライマーを用いる。
そのプライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブ
リッドのみが、増幅断片を生成するだろう。

【００８５】体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、
特定のDNAを特定の染色体に割り当てる迅速な方法であ
る。同じオリゴヌクレオチドプライマーで本発明を用い
ると、同様の方法で、特定の染色体に由来する断片のパ
ネル若しくは大きいゲノムクローンのプールで、サブマ
ッピング（sublocalization）を達成できる。染色体へ
のマッピングに同様に使用できる他のマッピング法とし
ては、インシチューハイブリッド形成、染色体特異的cD
NAライブラリーを構築するためのハイブリッド形成によ
る予備選択及び標識フロー選別（labeled flow-sorte
d）染色体による予備スクリーニングが挙げられる。

【００８６】中期染色体に対するcDNAクローンの蛍光イ
ンシチューハイブリッド形成（FISH）を用いると、1段
階で正確な染色体位置を得ることができる。この技術は
500又は600塩基程度のcDNAでも使用できるが、2000bp以
上のクローンを用いると、簡単な検出に十分なシグナル
強度でユニークな染色体位置に結合する可能性が高くな
る。FISHは、発現配列標識（expression sequence ta
g）の供給源としたクローンの使用を必要とし、長いほ
ど良い。例えば、良好な結果を得るには2000bpが良く、
4000bpがさらに良いが、合理的な時間％で良い結果を得
るのに4000以上はおそらく必要ないだろう。この技術の
総説としては、Vermaら, Human Chromosomes: a Manual
of Basic Techniques, Pergamon Press,ニューヨーク
（1988）を参照のこと。

【００８７】配列を正確な染色体位置にマッピングした
ら、その配列の染色体上の物理的位置を遺伝子マップデ
ータと相関させることができる。そのようなデータは、
例えばV. McKusick, Mendelian Inheritance in Man
（ジョーンズホプキンス大学ウェルチ医学図書館からオ
ンラインで入手できる）に認められる。次に、同じ染色
体領域にマッピングされた疾患と遺伝子の関係を連鎖分
析（linkage analysis）（物理的に隣接する遺伝子の同
時遺伝）によって同定する。

【００８８】次に、患者と非患者の間で、そのcDNA又は
ゲノム配列の相違を決定する必要がある。ある突然変異
がその患者の一部又は全部に観測され、正常な個体には
観測されない場合、その突然変異はその疾患の原因因子
であるかもしれない。

【００８９】物理的マッピング技術と遺伝子マッピング
技術の現在の解像度では、その疾患に関係する染色体領
域に正確にその位置が特定されるcDNAは、50〜500個の
潜在的原因因子のうちの一つであろう（1メガ塩基マッ
ピング解像度と20kbにつき1遺伝子と仮定）。

【００９０】ポリペプチド、その断片その他の誘導体、
その類縁体、若しくはそれらを発現させる細胞は、それ
らに対する抗体を生産するための免疫原として使用でき
る。これらの抗体は、例えばポリクローナル抗体やモノ
クローナル抗体でありうる。本発明は、キメラ抗体、一
本鎖抗体、擬人化抗体及びFab断片又はFab発現ライブラ
リーの産物をも包含する。このような抗体及び断片の生
産法は、当該技術分野で種々知られている。

【００９１】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生じる抗体は、動物（好ましくはヒト以外の動物）
にそのポリペプチドを直接注射するか、投与することに
よって得ることができる。そのようにして得た抗体は、
そのポリペプチド自体に結合するだろう。この方法で、
そのペプチドの断片のみをコードする配列を使用して、
その全天然ポリペプチドを結合する抗体を生成させるこ
ともできる。そのような抗体は、そのポリペプチドを発
現させる組織からそのポリペプチドを単離するために使
用できる。

【００９２】モノクローナル抗体の製造には、連続的継
代細胞系培養によって生産される抗体を与える任意の技
術を使用できる。その例としては、ハイブリドーマ技術
（Kohler及びMilstein, 1975, Nature, 256:495-49
7）、トリオーマ（trioma）技術、ヒトB細胞ハイブリド
ーマ技術（Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72）
及びヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBVハイ
ブリドーマ技術（Coleら, 1985, Monoclonal Antibodie
s and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77-96
頁）が挙げられる。

【００９３】一本鎖抗体の生産について記述した技術
（米国特許4946778）は、本発明の免疫原性ポリペプチ
ド産物に対する一本鎖抗体の生産に適合させることがで
きる。また、形質転換マウスを用いて、本発明の免疫原
性ポリペプチド産物に対する擬人化抗体を発現させるこ
ともできる。

【００９４】以下の実施例を参照して、本発明をさらに
説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定され
ないと理解すべきである。特に指定しない限り、割合や
量はすべて重量に基づく。

【００９５】以下の実施例の理解を容易にするため、頻
繁に使用する方法及び/又は用語をいくつか説明してお
く。「プラスミド」は、小文字pとその前後の大文字及
び/又は数字で呼ぶ。本明細書における出発プラスミド
は市販されているか、公に無制限に入手できるか、若し
くは入手できるプラスミドから公表された方法に従って
構築できる。さらに、本明細書に記述するプラスミドと
等価なプラスミドが当該技術分野で知られており、それ
らは当業者には明らかだろう。

【００９６】DNAの「消化」とは、そのDNA中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素によるDNAの触媒的切断を意
味する。本明細書で使用する種々の制限酵素は市販され
ており、それらの反応条件、補因子その他の必要条件
は、当業者に知られているであろうものを使用した。分
析には、通常、1(gのプラスミド又はDNA断片を約2単位
の酵素と共に約20(lの緩衝溶液中で使用する。プラスミ
ド構築用のDNA断片を単離する場合は、通常、より大き
い体積中で、5〜50(gのDNAを20〜250単位の酵素で消化
した。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質の量は、製
造者によって指定される。通常は37℃で約1時間のイン
キュベーション時間を使用するが、これは供給者の指示
に従って変えることができる。消化後、その反応液をポ
リアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望の断片
を単離する。

【００９７】切断した断片のサイズ分離は、Goeddel,
D.ら, Nucleic Acids Res., 8:4057（1980）に記載の8%
ポリアクリルアミドゲルを用いて行なう。

【００９８】「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合
成できる一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は2本の相
補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのよう
な合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸基を持たないの
で、キナーゼの存在下にATPでリン酸基を付加しない
と、もう1つのオリゴヌクレオチドには連結しないだろ
う。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていな
い断片に連結するだろう。

【００９９】「連結」とは、2本の二本鎖核酸断片間の
リン酸ジエステル結合の形成過程をいう（Maniatis, T.
ら,同上,146頁）。特に規定しない限り、連結は、既知
の緩衝液と条件を用いて、連結すべきほぼ等モル量のDN
A断片0.5(gにつき10単位のT4DNAリガーゼ（「リガー
ゼ」）で、達成することができる。特に明言しない限
り、形質転換はGraham, F.及びVan der Eb, A., Virolo
gy,52:456-457（1973）の方法で行なった。

【実施例】

【０１００】実施例1：ヒトアミン輸送体の細菌発現と
精製 ヒトアミン輸送体をコードするDNA配列（ATCC番号7598
0）を、まず、プロセシングされたアミン輸送体核酸配
列（シグナルペプチド配列を欠く）の5'及び3'末端配列
に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
増幅する。アミン輸送体遺伝子に対応する追加のヌクレ
オチドを、その5'配列と3'配列のそれぞれに付加する。
5'オリゴヌクレオチドプライマーは、5'GACTAAAGCTTAAT
GCTCCGGCCCATTCTG3'（配列番号3）という配列を持ち、H
indIII制限酵素部位と、それに続く、プロセシングされ
たタンパク質の推定末端アミノ酸から始まるヒトアミン
輸送体コーディング配列の18ヌクレオチドとを含有す
る。3'配列（5'GAACTTCTAGACGGTCAGCCATGGTGACTGG3'；
配列番号4）は、XbaI部位に相補的な配列と、それに続
くヒトアミン輸送体の20ヌクレオチドを含有する。これ
らの制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Quiage
n, Inc.,カリフォルニア州チャッツワース）上の制限酵
素部位に対応する。pQE-9は抗生物質耐性（Amp^ｒ）、細
菌性複製起点（ori）、IPTGで制御できるプロモーター
オペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-
His標識及び及び制限酵素部位をコードする。pQE-9をHi
ndIIIとXbaIで消化する。増幅した配列をpQE-9中に連結
し、ヒスチジン標識及びRBSと枠を合わせて挿入する。
次に、その連結混合物を用いて、Sambrook, J.ら, Mole
cularCloning: A Laboratory Manual, Cold Harbor Lab
oratory Press（1989）に記載の手法で、大腸菌M15/rep
4株（Qiagen, Inc.）を形質転換する。M15/rep4は、lac
I抑制因子を発現し、かつ、カナマイシン耐性（Kan^ｒ）
を付与するプラスミドpREP4の複数コピーを含有する。L
Bプレート上で成長するそれらの能力によって形質転換
体を同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニー
を選択する。プラスミドDNAを単離し、制限分析によっ
てそれを確認する。所望の構築物を含有するクローン
を、Amp（100(g/ml）とKan（25(g/ml）の両方を補足し
たLB液体培地で、終夜（O/N）培養する。そのO/N培養物
を、1:100〜1:250の比率で、大きい培養に接種する。光
学密度600（O.D.^６００）が0.4〜0.6になるまで細胞を
生育する。次に、IPTG（「イソプロピル-(-D-チオガラ
クトピラノシド」）を最終濃度1mMで加える。IPTGは、l
acI抑制因子を不活化することによって、P/Oをきれいに
し、遺伝子発現の増大を誘導する。細胞をさらに3〜4時
間生育する。次に、遠心分離によって細胞を収集する。
細胞ペレットをカオトロピック剤6M塩酸グアニジン中で
可溶化する。清浄化の後、この溶液から、6-His標識を
含有するタンパク質による強固な結合が可能な条件下
に、ニッケル-キレートカラムでのクロマトグラフィー
によって、可溶化したヒトアミン輸送体を精製する（Ho
chuli, E.ら,J. Chromatography 411:177-184（198
4））。ヒトアミン輸送体タンパク質を6M塩酸グアニジ
ンpH5.0でカラムから溶出させ、再生のために、3M塩酸
グアニジン、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオ
ン（還元型）及び2mMグルタチオン（酸化型）に調節す
る。この溶液を12時間インキュベートした後、タンパク
質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析する。

【０１０１】実施例2：バクロウイルス発現系によるヒ
トアミン輸送体のクローニングと発現 完全長ヒトアミン輸送体タンパク質をコードするDNA配
列（ATCC番号75980）を、その遺伝子の5'及び3'配列に
対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増
幅する。

【０１０２】5'プライマーは5'CG GGATCC CTCCATGGCTCC
GGCCCATTCTG3'（配列番号5）という配列を持ち、BamHI
制限酵素部位（太字部分）、真核細胞における翻訳開始
の効率のよいシグナルに似た4ヌクレオチド（Kozak,
M., J. Mol. Biol., 196:947-950（1987））、ヒトアミ
ン輸送体遺伝子の最初の18ヌクレオチド（翻訳開始コド
ン「ATG」に下線を引いてある）を、この順番に含有す
る。

【０１０３】3'プライマーは5'CGGGATCCCGCTCAGCCATGGT
GACTGGT3'（配列番号6）という配列を持ち、制限エンド
ヌクレアーゼBamHIの切断部位と、ヒトアミン輸送体遺
伝子の3'非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドとを含有
する。増幅された配列を、市販のキット（「Geneclea
n」, BIO 101 Inc.,カリフォルニア州ラジョラ）を用い
て、1%アガロースゲルから単離する。次に、その断片を
エンドヌクレアーゼBamHIで消化した後、1%アガロース
ゲルで再び精製する。この断片をF2と命名する。

【０１０４】ベクターpRG1（pVL941ベクターを改良した
もの、後述）を、バクロウイルス発現系（総説としては
Summers, M.D.及びSmith, G.E., 1987, A manual of me
thods for baculovirus vectors and insect cell cult
ure procedures, Texas Agricultureal Experimental S
tation Bulletin No. 1555を参照のこと）によるヒトア
ミン輸送体タンパク質の発現に用いる。この発現ベクタ
ーは、Autographa californica核多角体病ウイルス（Ac
MNPV）の強力なポリヘドリン（polyhedrin）プロモータ
ーと、それに続く制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識
部位とを含有する。効率のよいポリアデニル化のため
に、シミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位を
使用する。組換えウイルスを簡単に選択するため、大腸
菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が、ポリヘドリン
遺伝子のポリアデニル化シグナルに先行するポリヘドリ
ンプロモーターと同じ方向に挿入される。ポリヘドリン
配列の両端には、同時にトランスフェクションされる野
生型ウイルスDNAの細胞媒介相同組換え用のウイルス配
列が隣接する。pRG1の代わりに、pAc373、pVL941及びpA
cIM1（Luckow, V.A.及びSummers, M.D., Virology, 17
0:31-39）などといった他の多くのバクロウイルスベク
ターも使用できる。

【０１０５】このプラスミドを制限酵素BamHIで消化し
た後、ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該技術分野で
知られる手法で脱リン酸化する。次に、市販のキット
（「Geneclean」BIO 101 Inc.,カリフォルニア州ラジョ
ラ）を用いて、そのDNAを1%アガロースゲルから単離す
る。このベクターをV2と命名する。

【０１０６】断片F2と脱リン酸化プラスミドV2をT4 DNA
リガーゼで連結する。次に、大腸菌HB101細胞を形質転
換し、ヒトアミン輸送体遺伝子を持つプラスミド（pBac
-ヒトアミン輸送体）を含有する細菌を、酵素BamHIを用
いて同定する。クローン化された断片の配列をDNA配列
決定によって確認する。

【０１０７】リポフェクション法（Felgnerら, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417（1987））を用い
て、5(gのプラスミドpBac-ヒトアミン輸送体を、市販の
直鎖化したバクロウイルス（「BaculoGold^ＴＭ baculov
irus DNA」, Pharmingen,カリフォルニア州サンディエ
ゴ）1.0(gと同時にトランスフェクションする。

【０１０８】1(gのBaculoGold^ＴＭウイルスDNAと5(gの
プラスミドpBac-ヒトアミン輸送体を、血清非含有グレ
ース培地（Life Technologies Inc.,メリーランド州ガ
イサースブルク）50(lの入ったマイクロタイタープレー
トの滅菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン
10(gとグレース培地90(lを加え、混合し、室温で15分間
インキュベートする。次に、35mm組織培養プレートに血
清を含まないグレース培地1mlと共に接種したSf9昆虫細
胞（ATCC CRL1711）に、上記トランスフェクション混合
物を滴下する。プレートを前後にゆすって、新たに加え
た溶液を混合する。次に、そのプレートを27℃で5時間
培養する。5時間後、トランスフェクション溶液をプレ
ートから取り除き、10%ウシ胎児血清を補足したグレー
ス昆虫培地1mlを加える。そのプレートを培養器に戻
し、培養を27℃で4日間続ける。

【０１０９】4日後、上清を集め、Summers及びSmith
（上記）の記述と同様に、プラーク検定を行なう。改良
点として、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.,ガ
イサースブルク）を含むアガロースゲルを使用する。こ
れは、青く染色したプラークの単離を容易にする。「プ
ラーク検定」に関する詳細な説明は、Life Technologie
s Inc.（ガイサースブルク）が発行している昆虫細胞培
養とバクロウイルス学に関するユーザーズガイドの9-10
頁にも認められる。

【０１１０】連続希釈の4日後、ウイルスを細胞に加
え、青く染色したプラークをエッペンドルフピペットの
先端で拾う。次に、組換えウイルスを含有する寒天を、
グレース培地200(lの入ったエッペンドルフチューブ中
に再懸濁する。短い遠心分離によって寒天を除去し、組
換えバクロウイルスを含有する上清を用いて、35mm皿に
接種したSf9細胞を感染させる。4日後、これらの培養皿
の上清を収集し、4℃で保存する。

【０１１１】Sf9細胞を、10%熱不活化FBSを補足したグ
レース培地で生育する。細胞を組換えバクロウイルスV-
ヒトアミン輸送体に感染多重度（MOI）2で感染させる。
6時間後、培地を除去し、メチオニンとシステインを欠
くSF900II培地（Life Technologies Inc.,ガイサースブ
ルク）に置換した。45時間後、5(Ciの^３５S-メチオニン
と5(Ciの^３５S-システイン（Amersham）を加える。細胞
をさらに16時間培養した後、遠心分離によって収集し、
標識されたタンパク質をSDS-PAGEとオートラジオグラフ
ィーで可視化する。

【０１１２】実施例3：COS細胞における組換えヒトアミ
ン輸送体の発現 プラスミド、ヒトアミン輸送体HAの発現は、1）SV40複
製起点、2）アンピシリン耐性遺伝子、3）大腸菌複製起
点、4）CMVプロモーターとそれに続くポリリンカー領
域、SV40イントロン及びポリアデニル化部位を含有する
ベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen）から得る。全ヒトア
ミン輸送体前駆体と、その3'末端にインフレーム（in f
rame）融合したHA標識とをコードするDNA断片を、ベク
ターのポリリンカー領域にクローニングする。したがっ
て、その組換えタンパク質の発現はCMVプロモーターに
制御される。HA標識は、既に記述されたインフルエンザ
血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する
（I. Wilsonら, Cell, 37:767（1984））。標的タンパ
ク質にHA標識を注入（infusion）することにより、HAエ
ピトープを認識する抗体で組換えタンパク質を容易に検
出できるようになる。

【０１１３】プラスミド構築法は次の通りである。ヒト
アミン輸送体をコードするDNA配列（ATCC番号75980）
を、次の2つのプライマーを用いるPCRで構築する。5'プ
ライマー（5'GTCCAAGCTTGCCACCATGCTGCGGCCCATTCTG3'；
配列番号7）は、HindIII部位と、それに続く、開始コド
ンから始まるヒトアミン輸送体コーディング配列の18ヌ
クレオチドとを含有する。3'配列（5'CTAGCTCGAGTCAGCC
ATGGTGACTGGTAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCA3'；配列
番号8）は、XhoI部位に相補的な配列、翻訳停止コド
ン、HA標識及びヒトアミン輸送体コーディング配列の最
後の18ヌクレオチド（停止コドンを除く）を含有する。
したがって、PCR産物は、HindIII部位、ヒトアミン輸送
体コーディング領域、それに続く、インフレーム融合し
たHA標識、HA標識に続く翻訳終結停止コドン及びHindII
I部位を含有する。そのPCR増幅DNA断片とベクターpcDNA
I/AmpをHindIII及びXhoI制限酵素で消化し、連結する。
その連結混合物で大腸菌SURE株（Stratagene Cloning S
ystems,カリフォルニア州ラジョラ）を形質転換し、そ
の形質転換培養をアンピシリン培地プレートで培養し
て、耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転
換体から単離し、制限分析によって正しい断片の存在を
調べる。この組換えアミン輸送体を発現させるため、DE
AE-デキストラン法（J. Sambrook, E. Fritsch, T. Man
iatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Col
d Spring Laboratory Press（1989））によって、COS細
胞を上記発現ベクターでトランスフェクションする。ヒ
トアミン輸送体HAタンパク質の発現は、放射線標識と免
疫沈降法（E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press
（1988））によって検出する。トランスフェクションの
2日後に、細胞を^３５S-システインで8時間標識する。次
に、培養培地を集め、細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液
（150mM NaCl, 1%NP-40, 0.1%SDS, 1%NP-40, 0.5%DOC,
50mM Tris, pH7.5）で溶解する（Wilson, I.ら,同上, 3
7:767（1984））。細胞溶解液と培養培地の両方をHA特
異的モノクローナル抗体で沈殿させる。沈殿したタンパ
ク質を15%SDS-PAGEゲルで分析する。

【０１１４】実施例4：ヒト組織におけるヒトアミン輸
送体の発現パターン ヒト組織におけるヒトアミン輸送体の発現レベルを調べ
るために、ノーザンブロット分析を行なう。全細胞RNA
試料をRNAzol^ＴＭ Bシステム（Biotecx Laboratories,
Inc.,テキサス州ヒューストン）で単離する。各ヒト組
織から単離した約10(gの全RNAを1%アガロースゲルで分
離し、ナイロンフィルターにブロットする（Sambrook,
Fritsch及びManiatis, Molecular Cloning, Cold Sprin
g Harbor Press（1989））。標識反応は、50ngのDNA断
片を用いて、Stratagene Prime-Itキットに従って行な
う。標識されたDNAをSelect-G-50カラム（5 Prime-3 Pr
ime, Inc.,コロラド州ボールダー）で精製する。次に、
フィルターを、0.5M NaPO_４, pH7.4及び7%SDS中、65℃
で終夜、放射活性標識した完全長ヒトアミン輸送体遺伝
子1,000,000cpm/mlと、ハイブリッド形成させる。0.5XS
SC、0.1%SDSを用いて室温で2回、60℃で2回洗浄した
後、増幅スクリーンを用いて、フィルターを−70℃で終
夜、露出する。

【０１１５】上の教示を考慮すれば、本発明には数多く
の改良や変更を加えることができるので、詳しく説明し
た態様以外にも、添付の請求項の範囲内で本発明を実施
することができる。

【０１１６】

【配列表】 (１) 一般的情報： (ｉ) 出願人：リ等 (ii) 発明の名称：ヒトアミン輸送体 (iii) 配列の数：８ (iv) 連絡先： (Ａ) 宛名：カレーラ，バーン，ベイン，ギルフイラン，セッチ， スチュワート・アンド・オルステイン (Ｂ) 通り：ベッカー・ファーム・ロード６番 (Ｃ) 市：ローズランド (Ｄ) 州：ニュー・ジャージー (Ｅ) 国：アメリカ合衆国 (Ｆ) ＺＩＰ：０７０６８ (ｖ) コンピューター解読書式： (Ａ) 媒体型：３．５インチ ディスケット (Ｂ) コンピューター：ＩＢＭ ＰＳ／２ (Ｃ) オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウエア：ワード・パーフェクト５．１ (vi) 本出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日：同日 (Ｃ) 分類： (vii) 優先権主張出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日：１９９７年２月６日 (viii) 弁理士／代理人 情報： (Ａ) 氏名：フェラーロ，グレゴリー・ディー (Ｂ) 登録番号：３６，１３４ (Ｃ) 参照／整理番号：３２５８００−２６７ (ix) 電話連絡先情報： (Ａ) 電話番号：２０１−９９４−１７００ (Ｂ) ファックス番号：２０１−９９４−１７４４ (２) 配列番号１の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２８８５塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号１： TCCTGCGTTA TCCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTNC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA 60 CCGCTCNCCN CAGCCGAACG ACCGAGCGCA GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA GCGGAAGAGC 120 GCCCAATACG CAAACCGCCT CTCCCCGCGC GTTGGCCGAT TCATTAATGC AGCTGGCACG 180 ACAGGTTTCC CGACTGGAAA GCGGGCAGTG AGCGCAACGC AATTAATGTG AGTTAGCTCA 240 CTCATTAGGC ACCCCAGGCT TTACACTTTA TGCTTCCGGC TCGTATGTTG TGTGGAATTG 300 TGAGCGGATA ACAATTTCAC ACAGGAAACA GCTATGACCA TGATTACGCC AAGCTCGAAA 360 TTAACCCTCA CTAAAGGGAA CAAAAGCTGG AGCTCCACCG CGGTGGCGNC CGCTCTAGAA 420 CTAGTGGATC CCCCGGNCTG CAGGGGCACA CACACGCACA CATACACAGA ATCCTCAGAT 480 AACAGGAGGC AATAAATCCA ACAGCACATC CACGTTCAGA GAACAGTGTC CCTGCTGTCT 540 TGCTAACAGC TGCCAATACC TCACTGAGTG CCTCACACCA ACATGGGCTC CAAGTGAGTT 600 TCATTCGTCT GGGCAGACTC CCTCCCCTCT TCCATAAAGG CTGCAGGAGA CCTGTAGCTG 660 TCACAGGACC TTCCCTAAGA GCCCGCAGGG GGAAGACTGC CCCAGTCCGG CCATCACCAT 720 GCTCCGGCCC ATTCTGGATG CTCCCCAGCG GTTGCTGAAG GAGGGGAGAG CGTCCCGGCA 780 GCTGGTGCTG GTGGTGGTAT TCGTCGCTTT GCTCCTGGAC AACATGCTGT TTACTGTGGT 840 GGTGCCAATT GTGCCCACCT TCCTATATGA CATGGAGTTC AAAGAAGTCA TCTCTTCTCT 900 GCACCTCGGG CATGCCGGAA GTTCCCCACA TGCCCTCGCC TCTCCTGCCT TTTCCACCAT 960 CTTCTCCTTC TTCAACAACA ACACCGTGGC TGTTGAAGAA AGCGTACCTA GTGGAATAGC 1020 ATGGATGAAT GACACTGCCA GCACCATCCC ACCTCCAGCC ACTGAAGCCA TCTCAGCTCA 1080 TAAAAACAAC TGCTTGCAAG GCACAGGTTT CTTGGAGGAA GAGACTACCC GGGTCGGGGT 1140 TCTGTTTGCT TCAAAGGCTG TGATGCAACT TCTGGTCAAC CCATTCGTGG GCCCTCTCAC 1200 CAACAGGATT GGATATCATA TCCCCATGTT TGCTGGCTTT GTTATCATGT TTCTCTCCAC 1260 AGTTATGTTT GCTTTTTCTG GGACCTATAC TCTACTCTTT GTGGCCCGAA CCCTTCAAGG 1320 CATTGGATCT TCATTTTCAT CTGTTGCAGG TCTTGGAATG CTGGCCAGTG TCTACACTGA 1380 TGACCATGAG AGAGGACGAG CCATGGGAAC TGCTCTGGGG GGCCTGGCCT TGGGGTTGCT 1440 GGTGGGAGCT CCCTTTGGAA GTGTAATGTA CGAGTTTGTT GGGAAGTCTG CACCCTTCCT 1500 CATCCTGGCC TTCCTGGCAC TACTGGATGG AGCACTCCAG CTTTGCATCC TACAGCCTTC 1560 CAAAGTCTCT CCTGAGAGTG CCAAGGGGAC TCCCCTCTTT ATGCTTCTCA AAGACCCTTA 1620 CATCCTGGTG GCTGCAGGGT CCAGCTGCTT TGCCAACATG GGGGTGGCCA TCCTGGAGCC 1680 CACACTGCCC ATCTGGATGA TGCAGACCAT GTGCTCCCCC AAGTGGCAGC TGGGTCTAGC 1740 TTTCTTGCCT GCCAGTGTGT CCTACCTCAT TGGCACCAAC CTCTTTGGTG TGTTGGCCAA 1800 CAAGATGGGT CGGTGGCTGT GTTCCCTAAT CGGGATGCTG GTAGTAGGTA CCAGCTTGCT 1860 CTGTGTTCCT CTGGCTCACA AAAATTTTGG TCTCATTGGC CCCAATGCAG GGCTTGGCCT 1920 TNCCATAGGC ATGGTGGAAT CTTCTATGAT GCCCATCATG GGGCACCTGG TGGATCCACG 1980 CCACACCTCG GTGTATGGGA GTGTCCACGC CATCGCTGAT GTGGCTTTTT GCATGGGCTT 2040 TGCTATAGGC TATTCTGAGT CAGGACTGCC CCATGGAGAC CCGGATGTAT CAACCCAGAA 2100 ACCTCTTCCC TGGACCAGTC ACCATGGCTG ACCCACGGCT CAGTGGCCTC AAAACCTCTG 2160 CCTGGGATCT TCTTCCTCCC CTCCCATGGA CACTGTCCCT CATACTCTTC TCACCTGTGT 2220 AACTTGTAGC TCTTCMTCTA TGCCTTGGTG CCGCAGTGGC CCATCTTTTA TGGGAAGACA 2280 GAGTGATGCA CCYYCCCGCT GCTGTGAGGT TGATTAAACT TGAGCTGTGA CGGGGTTCTG 2340 CAAGGGGTGA CTCATTGYAT AGAGGTGGTA GTGAGTAATG TGCCCCTGAA ACCAGTGGGG 2400 TGACTGACAA GCCTGTTTAA TCTGTTGCCT GATTTTCTCT GGCATAGCCC CAACAGATCG 2460 GAAGAGTGTT ACCCTCTTTW CCCTCAACGT GTTCTTTCCC GGGTTTTCCC CAGCCGAGTT 2520 GAGAAAATGT TCTCAGCATT GTCTTGCTGC CAAATGCCAG CKTGAAGAGT TWGGTATGKT 2580 TTTTCTNCCA TTTATTTTAT TTATTWACTA AAGTGAATGA TTTTACTGTG GYTAAATCTA 2640 GAGCTGCTAA AAGGGCTTTA CCCTCAGTGA AAAGTGTCTT CTATTTNCAT WATCTTTCAG 2700 AAACWGGAGC CCATTTCTCT TCTGGTGGAG TTATNGACAT CCTCCTGACC NCCCCTGTGT 2760 NTNCCTACCT NTACTGAACC TCTTAGACTC TNAGAAATAA AAGTAGAAGA AAGACAGAAA 2820 AATTAACTGA TTAGACCCAA GATTTCATGG GAAGAAGTTA AAAGAAACTG CCTTGGAAAT 2880 CCCTC 2885 (２) 配列番号２の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４７０アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｃ) 鎖の数： (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列：配列番号２： Met Leu Arg Pro Ile Leu Asp Ala Pro Gln Arg Leu Leu Lys Glu 5 10 15 Gly Arg Ala Ser Arg Gln Leu Val Leu Val Val Val Phe Val Ala 20 25 30 Leu Leu Leu Asp Asn Met Leu Phe Thr Val Val Val Pro Ile Val 35 40 45 Pro Thr Phe Leu Tyr Asp Met Glu Phe Lys Glu Val Ile Ser Ser 50 55 60 Leu His Leu Gly His Ala Gly Ser Ser Pro His Ala Leu Ala Ser 65 70 75 Pro Ala Phe Ser Thr Ile Phe Ser Phe Phe Asn Asn Asn Thr Val 80 85 90 Ala Val Glu Glu Ser Val Pro Ser Gly Ile Ala Trp Met Asn Asp 95 100 105 Thr Ala Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Thr Glu Ala Ile Ser Ala 110 115 120 His Lys Asn Asn Cys Leu Gln Gly Thr Gly Phe Leu Glu Glu Glu 125 130 135 Thr Thr Arg Val Gly Val Leu Phe Ala Ser Lys Ala Val Met Gln 140 145 150 Leu Leu Val Asn Pro Phe Val Gly Pro Leu Thr Asn Arg Ile Gly 155 160 165 Tyr His Ile Pro Met Phe Ala Gly Phe Val Ile Met Phe Leu Ser 170 175 180 Thr Val Met Phe Ala Phe Ser Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Phe Val 185 190 195 Ala Arg Thr Leu Gln Gly Ile Gly Ser Ser Phe Ser Ser Val Ala 200 205 210 Gly Leu Gly Met Leu Ala Ser Val Tyr Thr Asp Asp His Glu Arg 215 220 225 Gly Arg Ala Met Gly Thr Ala Leu Gly Gly Leu Ala Leu Gly Leu 230 235 240 Leu Val Gly Ala Pro Phe Gly Ser Val Met Tyr Glu Phe Val Gly 245 250 255 Lys Ser Ala Pro Phe Leu Ile Leu Ala Phe Leu Ala Leu Leu Asp 260 265 270 Gly Ala Leu Gln Leu Cys Ile Leu Gln Pro Ser Lys Val Ser Pro 275 280 285 Glu Ser Ala Lys Gly Thr Pro Leu Phe Met Leu Leu Lys Asp Pro 290 295 300 Tyr Ile Leu Val Ala Ala Gly Ser Ile Cys Phe Ala Asn Met Gly 305 310 315 Val Ala Ile Leu Glu Pro Thr Leu Pro Ile Trp Met Met Gln Thr 320 325 330 Met Cys Ser Pro Lys Trp Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Pro Ala 335 340 345 Ser Val Ser Tyr Leu Ile Gly Thr Asn Leu Phe Gly Val Leu Ala 350 355 360 Asn Lys Met Gly Arg Trp Leu Cys Ser Leu Ile Gly Met Leu Val 365 370 375 Val Gly Thr Ser Leu Leu Cys Val Pro Leu Ala His Lys Asn Phe 380 385 390 Gly Leu Ile Gly Pro Asn Ala Gly Leu Gly Leu Xaa Ile Gly Met 395 400 405 Val Glu Ser Ser Met Met Pro Ile Met Gly His Leu Val Asp Pro 410 415 420 Arg His Thr Ser Val Tyr Gly Ser Val His Ala Ile Ala Asp Val 425 430 435 Ala Phe Cys Met Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Ser Glu Ser Gly Leu 440 445 450 Pro His Gly Asp Pro Asp Val Ser Thr Gln Lys Pro Leu Pro Trp 455 460 465 Thr Ser His His Gly 470 (２) 配列番号３の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３０塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号３： GACTAAAGCT TAATGCTCCG GCCCATTCTG 30 (２) 配列番号４の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号４： GAACTTCTAG ACGGTCAGCC ATGGTGACTG G 31 (２) 配列番号５の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号５： CGGGATCCCT CCATGGCTCC GGCCCATTCT G 31 (２) 配列番号６の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号６： CGGGATCCCG CTCAGCCATG GTGACTGGT 29 (２) 配列番号７の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３４塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号７： GTCCAAGCTT GCCACCATGC TGCGGCCCAT TCTG 34 (２) 配列番号８の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：５８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号８： CTAGCTCGAG TCAGCCATGG TGACTGGTAG CGTAGTCTGG GACGTCGTAT GGGTAGCA 58

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のヒトアミン輸送体のcDNA配列と、対
応する推定アミノ酸配列とを表す。アミノ酸には標準的
な一文字略号を使用している。配列決定は373自動DNA配
列決定装置（Applied Biosystems, Inc.）を用いて行な
った。配列決定の正確さは、97%以上正確であると予測
される。

【図２】 本発明のヒトアミン輸送体のcDNA配列と、対
応する推定アミノ酸配列とを表す。アミノ酸には標準的
な一文字略号を使用している。配列決定は373自動DNA配
列決定装置（Applied Biosystems, Inc.）を用いて行な
った。配列決定の正確さは、97%以上正確であると予測
される。

【図３】 本発明のヒトアミン輸送体のcDNA配列と、対
応する推定アミノ酸配列とを表す。アミノ酸には標準的
な一文字略号を使用している。配列決定は373自動DNA配
列決定装置（Applied Biosystems, Inc.）を用いて行な
った。配列決定の正確さは、97%以上正確であると予測
される。

【図４】 本発明のヒトアミン輸送体のcDNA配列と、対
応する推定アミノ酸配列とを表す。アミノ酸には標準的
な一文字略号を使用している。配列決定は373自動DNA配
列決定装置（Applied Biosystems, Inc.）を用いて行な
った。配列決定の正確さは、97%以上正確であると予測
される。

【図５】 本発明のヒトアミン輸送体のcDNA配列と、対
応する推定アミノ酸配列とを表す。アミノ酸には標準的
な一文字略号を使用している。配列決定は373自動DNA配
列決定装置（Applied Biosystems, Inc.）を用いて行な
った。配列決定の正確さは、97%以上正確であると予測
される。

【図６】 本発明のアミン輸送体とラットのアミン輸送
体（Genbank公開データーベースから検索）とのアミノ
酸ホモロジー整合図である。

【図７】 本発明のアミン輸送体とラットのアミン輸送
体（Genbank公開データーベースから検索）とのアミノ
酸ホモロジー整合図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年３月２８日（２００２．３．２
８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１１６】

【配列表】 (１) 一般的情報： (ｉ) 出願人：リ等 (ii) 発明の名称：ヒトアミン輸送体 (iii) 配列の数：９ (iv) 連絡先： (Ａ) 宛名：カレーラ，バーン，ベイン，ギルフイラン，セッチ， スチュワート・アンド・オルステイン (Ｂ) 通り：ベッカー・ファーム・ロード６番 (Ｃ) 市：ローズランド (Ｄ) 州：ニュー・ジャージー (Ｅ) 国：アメリカ合衆国 (Ｆ) ＺＩＰ：０７０６８ (ｖ) コンピューター解読書式： (Ａ) 媒体型：３．５インチ ディスケット (Ｂ) コンピューター：ＩＢＭ ＰＳ／２ (Ｃ) オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ (Ｄ) ソフトウエア：ワード・パーフェクト５．１ (vi) 本出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日：同日 (Ｃ) 分類： (vii) 優先権主張出願のデータ： (Ａ) 出願番号： (Ｂ) 出願日：１９９７年２月６日 (viii) 弁理士／代理人 情報： (Ａ) 氏名：フェラーロ，グレゴリー・ディー (Ｂ) 登録番号：３６，１３４ (Ｃ) 参照／整理番号：３２５８００−２６７ (ix) 電話連絡先情報： (Ａ) 電話番号：２０１−９９４−１７００ (Ｂ) ファックス番号：２０１−９９４−１７４４ (２) 配列番号１の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２８８５塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：cＤＮＡ (xi) 配列：配列番号１： TCCTGCGTTA TCCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTNC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA 60 CCGCTCNCCN CAGCCGAACG ACCGAGCGCA GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA GCGGAAGAGC 120 GCCCAATACG CAAACCGCCT CTCCCCGCGC GTTGGCCGAT TCATTAATGC AGCTGGCACG 180 ACAGGTTTCC CGACTGGAAA GCGGGCAGTG AGCGCAACGC AATTAATGTG AGTTAGCTCA 240 CTCATTAGGC ACCCCAGGCT TTACACTTTA TGCTTCCGGC TCGTATGTTG TGTGGAATTG 300 TGAGCGGATA ACAATTTCAC ACAGGAAACA GCTATGACCA TGATTACGCC AAGCTCGAAA 360 TTAACCCTCA CTAAAGGGAA CAAAAGCTGG AGCTCCACCG CGGTGGCGNC CGCTCTAGAA 420 CTAGTGGATC CCCCGGNCTG CAGGGGCACA CACACGCACA CATACACAGA ATCCTCAGAT 480 AACAGGAGGC AATAAATCCA ACAGCACATC CACGTTCAGA GAACAGTGTC CCTGCTGTCT 540 TGCTAACAGC TGCCAATACC TCACTGAGTG CCTCACACCA ACATGGGCTC CAAGTGAGTT 600 TCATTCGTCT GGGCAGACTC CCTCCCCTCT TCCATAAAGG CTGCAGGAGA CCTGTAGCTG 660 TCACAGGACC TTCCCTAAGA GCCCGCAGGG GGAAGACTGC CCCAGTCCGG CCATCACCAT 720 GCTCCGGCCC ATTCTGGATG CTCCCCAGCG GTTGCTGAAG GAGGGGAGAG CGTCCCGGCA 780 GCTGGTGCTG GTGGTGGTAT TCGTCGCTTT GCTCCTGGAC AACATGCTGT TTACTGTGGT 840 GGTGCCAATT GTGCCCACCT TCCTATATGA CATGGAGTTC AAAGAAGTCA TCTCTTCTCT 900 GCACCTCGGG CATGCCGGAA GTTCCCCACA TGCCCTCGCC TCTCCTGCCT TTTCCACCAT 960 CTTCTCCTTC TTCAACAACA ACACCGTGGC TGTTGAAGAA AGCGTACCTA GTGGAATAGC 1020 ATGGATGAAT GACACTGCCA GCACCATCCC ACCTCCAGCC ACTGAAGCCA TCTCAGCTCA 1080 TAAAAACAAC TGCTTGCAAG GCACAGGTTT CTTGGAGGAA GAGACTACCC GGGTCGGGGT 1140 TCTGTTTGCT TCAAAGGCTG TGATGCAACT TCTGGTCAAC CCATTCGTGG GCCCTCTCAC 1200 CAACAGGATT GGATATCATA TCCCCATGTT TGCTGGCTTT GTTATCATGT TTCTCTCCAC 1260 AGTTATGTTT GCTTTTTCTG GGACCTATAC TCTACTCTTT GTGGCCCGAA CCCTTCAAGG 1320 CATTGGATCT TCATTTTCAT CTGTTGCAGG TCTTGGAATG CTGGCCAGTG TCTACACTGA 1380 TGACCATGAG AGAGGACGAG CCATGGGAAC TGCTCTGGGG GGCCTGGCCT TGGGGTTGCT 1440 GGTGGGAGCT CCCTTTGGAA GTGTAATGTA CGAGTTTGTT GGGAAGTCTG CACCCTTCCT 1500 CATCCTGGCC TTCCTGGCAC TACTGGATGG AGCACTCCAG CTTTGCATCC TACAGCCTTC 1560 CAAAGTCTCT CCTGAGAGTG CCAAGGGGAC TCCCCTCTTT ATGCTTCTCA AAGACCCTTA 1620 CATCCTGGTG GCTGCAGGGT CCAGCTGCTT TGCCAACATG GGGGTGGCCA TCCTGGAGCC 1680 CACACTGCCC ATCTGGATGA TGCAGACCAT GTGCTCCCCC AAGTGGCAGC TGGGTCTAGC 1740 TTTCTTGCCT GCCAGTGTGT CCTACCTCAT TGGCACCAAC CTCTTTGGTG TGTTGGCCAA 1800 CAAGATGGGT CGGTGGCTGT GTTCCCTAAT CGGGATGCTG GTAGTAGGTA CCAGCTTGCT 1860 CTGTGTTCCT CTGGCTCACA AAAATTTTGG TCTCATTGGC CCCAATGCAG GGCTTGGCCT 1920 TNCCATAGGC ATGGTGGAAT CTTCTATGAT GCCCATCATG GGGCACCTGG TGGATCCACG 1980 CCACACCTCG GTGTATGGGA GTGTCCACGC CATCGCTGAT GTGGCTTTTT GCATGGGCTT 2040 TGCTATAGGC TATTCTGAGT CAGGACTGCC CCATGGAGAC CCGGATGTAT CAACCCAGAA 2100 ACCTCTTCCC TGGACCAGTC ACCATGGCTG ACCCACGGCT CAGTGGCCTC AAAACCTCTG 2160 CCTGGGATCT TCTTCCTCCC CTCCCATGGA CACTGTCCCT CATACTCTTC TCACCTGTGT 2220 AACTTGTAGC TCTTCMTCTA TGCCTTGGTG CCGCAGTGGC CCATCTTTTA TGGGAAGACA 2280 GAGTGATGCA CCYYCCCGCT GCTGTGAGGT TGATTAAACT TGAGCTGTGA CGGGGTTCTG 2340 CAAGGGGTGA CTCATTGYAT AGAGGTGGTA GTGAGTAATG TGCCCCTGAA ACCAGTGGGG 2400 TGACTGACAA GCCTGTTTAA TCTGTTGCCT GATTTTCTCT GGCATAGCCC CAACAGATCG 2460 GAAGAGTGTT ACCCTCTTTW CCCTCAACGT GTTCTTTCCC GGGTTTTCCC CAGCCGAGTT 2520 GAGAAAATGT TCTCAGCATT GTCTTGCTGC CAAATGCCAG CKTGAAGAGT TWGGTATGKT 2580 TTTTCTNCCA TTTATTTTAT TTATTWACTA AAGTGAATGA TTTTACTGTG GYTAAATCTA 2640 GAGCTGCTAA AAGGGCTTTA CCCTCAGTGA AAAGTGTCTT CTATTTNCAT WATCTTTCAG 2700 AAACWGGAGC CCATTTCTCT TCTGGTGGAG TTATNGACAT CCTCCTGACC NCCCCTGTGT 2760 NTNCCTACCT NTACTGAACC TCTTAGACTC TNAGAAATAA AAGTAGAAGA AAGACAGAAA 2820 AATTAACTGA TTAGACCCAA GATTTCATGG GAAGAAGTTA AAAGAAACTG CCTTGGAAAT 2880 CCCTC 2885 (２) 配列番号２の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４７０アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｃ) 鎖の数： (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列：配列番号２： Met Leu Arg Pro Ile Leu Asp Ala Pro Gln Arg Leu Leu Lys Glu 5 10 15 Gly Arg Ala Ser Arg Gln Leu Val Leu Val Val Val Phe Val Ala 20 25 30 Leu Leu Leu Asp Asn Met Leu Phe Thr Val Val Val Pro Ile Val 35 40 45 Pro Thr Phe Leu Tyr Asp Met Glu Phe Lys Glu Val Ile Ser Ser 50 55 60 Leu His Leu Gly His Ala Gly Ser Ser Pro His Ala Leu Ala Ser 65 70 75 Pro Ala Phe Ser Thr Ile Phe Ser Phe Phe Asn Asn Asn Thr Val 80 85 90 Ala Val Glu Glu Ser Val Pro Ser Gly Ile Ala Trp Met Asn Asp 95 100 105 Thr Ala Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Thr Glu Ala Ile Ser Ala 110 115 120 His Lys Asn Asn Cys Leu Gln Gly Thr Gly Phe Leu Glu Glu Glu 125 130 135 Thr Thr Arg Val Gly Val Leu Phe Ala Ser Lys Ala Val Met Gln 140 145 150 Leu Leu Val Asn Pro Phe Val Gly Pro Leu Thr Asn Arg Ile Gly 155 160 165 Tyr His Ile Pro Met Phe Ala Gly Phe Val Ile Met Phe Leu Ser 170 175 180 Thr Val Met Phe Ala Phe Ser Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Phe Val 185 190 195 Ala Arg Thr Leu Gln Gly Ile Gly Ser Ser Phe Ser Ser Val Ala 200 205 210 Gly Leu Gly Met Leu Ala Ser Val Tyr Thr Asp Asp His Glu Arg 215 220 225 Gly Arg Ala Met Gly Thr Ala Leu Gly Gly Leu Ala Leu Gly Leu 230 235 240 Leu Val Gly Ala Pro Phe Gly Ser Val Met Tyr Glu Phe Val Gly 245 250 255 Lys Ser Ala Pro Phe Leu Ile Leu Ala Phe Leu Ala Leu Leu Asp 260 265 270 Gly Ala Leu Gln Leu Cys Ile Leu Gln Pro Ser Lys Val Ser Pro 275 280 285 Glu Ser Ala Lys Gly Thr Pro Leu Phe Met Leu Leu Lys Asp Pro 290 295 300 Tyr Ile Leu Val Ala Ala Gly Ser Ile Cys Phe Ala Asn Met Gly 305 310 315 Val Ala Ile Leu Glu Pro Thr Leu Pro Ile Trp Met Met Gln Thr 320 325 330 Met Cys Ser Pro Lys Trp Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Pro Ala 335 340 345 Ser Val Ser Tyr Leu Ile Gly Thr Asn Leu Phe Gly Val Leu Ala 350 355 360 Asn Lys Met Gly Arg Trp Leu Cys Ser Leu Ile Gly Met Leu Val 365 370 375 Val Gly Thr Ser Leu Leu Cys Val Pro Leu Ala His Lys Asn Phe 380 385 390 Gly Leu Ile Gly Pro Asn Ala Gly Leu Gly Leu Xaa Ile Gly Met 395 400 405 Val Glu Ser Ser Met Met Pro Ile Met Gly His Leu Val Asp Pro 410 415 420 Arg His Thr Ser Val Tyr Gly Ser Val His Ala Ile Ala Asp Val 425 430 435 Ala Phe Cys Met Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Ser Glu Ser Gly Leu 440 445 450 Pro His Gly Asp Pro Asp Val Ser Thr Gln Lys Pro Leu Pro Trp 455 460 465 Thr Ser His His Gly 470 (２) 配列番号３の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３０塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号３： GACTAAAGCT TAATGCTCCG GCCCATTCTG 30 (２) 配列番号４の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号４： GAACTTCTAG ACGGTCAGCC ATGGTGACTG G 31 (２) 配列番号５の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号５： CGGGATCCCT CCATGGCTCC GGCCCATTCT G 31 (２) 配列番号６の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号６： CGGGATCCCG CTCAGCCATG GTGACTGGT 29 (２) 配列番号７の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３４塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号７： GTCCAAGCTT GCCACCATGC TGCGGCCCAT TCTG 34 (２) 配列番号８の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：５８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：オリゴヌクレオチド (xi) 配列：配列番号８： CTAGCTCGAG TCAGCCATGG TGACTGGTAG CGTAGTCTGG GACGTCGTAT GGGTAGCA 58 (２) 配列番号９の情報： (i) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４６５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｃ) 鎖の数： (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：蛋白質 (xi) 配列：配列番号９： Met Leu Gln Val Val Leu Gly Ala Pro Gln Arg Leu Leu Lys Glu Gly 1 5 10 15 Arg Gln Ser Arg Lys Leu Val Leu Val Val Val Phe Val Ala Leu Leu 20 25 30 Leu Asp Asn Met Leu Leu Thr Val Val Val Pro Ile Val Pro Thr Phe 35 40 45 Leu Tyr Ala Thr Glu Phe Lys Asp Ser Asn Ser Ser Leu His Arg Gly 50 55 60 Pro Ser Val Ser Ser Gln Gln Ala Leu Thr Ser Pro Ala Phe Ser Thr 65 70 75 80 Ile Phe Ser Phe Phe Asp Asn Thr Thr Thr Thr Val Glu Glu His Val 85 90 95 Pro Phe Arg Val Thr Trp Thr Asn Gly Thr Ile Pro Pro Pro Val Thr 100 105 110 Glu Ala Ser Ser Val Pro Lys Asn Asn Cys Leu Gln Gly Ile Glu Phe 115 120 125 Leu Glu Glu Glu Asn Val Arg Ile Gly Ile Leu Phe Ala Ser Lys Ala 130 135 140 Leu Met Gln Leu Leu Val Asn Pro Phe Val Gly Pro Leu Thr Asn Arg 145 150 155 160 Ile Gly Tyr His Ile Pro Met Phe Val Gly Phe Met Ile Met Phe Leu 165 170 175 Ser Thr Leu Met Phe Ala Phe Ser Gly Thr Tyr Ala Leu Leu Phe Val 180 185 190 Ala Arg Thr Leu Gln Gly Ile Gly Ser Ser Phe Ser Ser Val Ala Gly 195 200 205 Leu Gly Met Leu Ala Ser Val Tyr Thr Asp Asn Tyr Glu Arg Gly Arg 210 215 220 Ala Met Gly Ile Ala Leu Gly Gly Leu Ala Leu Gly Leu Leu Val Gly 225 230 235 240 Ala Pro Phe Gly Ser Val Met Tyr Glu Phe Val Gly Lys Ser Ser Pro 245 250 255 Phe Leu Ile Leu Ala Phe Leu Ala Leu Leu Asp Gly Ala Leu Gln Leu 260 265 270 Cys Ile Leu Trp Pro Ser Lys Val Ser Pro Glu Ser Ala Met Gly Thr 275 280 285 Ser Leu Leu Thr Leu Leu Lys Asp Pro Tyr Ile Leu Val Ala Ala Gly 290 295 300 Ser Ile Cys Leu Ala Asn Met Gly Val Ala Ile Leu Glu Pro Thr Leu 305 310 315 320 Pro Ile Trp Met Met Gln Thr Met Cys Ser Pro Glu Trp Gln Leu Gly 325 330 335 Leu Ala Phe Leu Pro Ala Ser Val Ala Tyr Leu Ile Gly Thr Asn Leu 340 345 350 Phe Gly Val Leu Ala Asn Lys Met Gly Arg Trp Leu Cys Ser Leu Val 355 360 365 Gly Met Val Ala Val Gly Ile Ser Leu Leu Cys Val Pro Leu Ala His 370 375 380 Asn Ile Phe Gly Leu Ile Gly Pro Asn Ala Gly Leu Gly Phe Ala Ile 385 390 395 400 Gly Met Val Asp Ser Ser Leu Met Pro Ile Met Gly Tyr Leu Val Asp 405 410 415 Leu Arg His Thr Ser Val Tyr Gly Ser Val Tyr Ala Ile Ala Asp Val 420 425 430 Ala Phe Cys Val Gly Phe Ala Ile Gly Pro Ser Thr Gly Gly Val Ile 435 440 445 Val Gln Val Ile Gly Phe Pro Trp Leu Met Val Ile Ile Gly Thr Ile 450 455 460 Asn 465

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/08 25/06 25/16 25/08 25/18 25/16 25/22 25/18 25/24 25/22 25/28 25/24 43/00 １１１ 25/28 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 イ・リ アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ハワード・ランディング・ ドライブ16125番 (72)発明者 リアン・カオ 香港ケネディ・ロード、モンマス・テラ ス、サンクレスト・タワー18ビー番 (72)発明者 クレイグ・エイ・ローゼン アメリカ合衆国20882メリーランド州レイ トンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 DA03 DA06 EA02 GA11 GA18 HA03 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA62 DC50 NA14 ZA012 ZA062 ZA122 ZA152 ZA162 ZA182 ZC022 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 NA14 ZA01 ZA06 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZC02

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 本明細書に記載したいずれかの発明。