JPH11501802A

JPH11501802A - ユビキチン結合酵素７、８および９

Info

Publication number: JPH11501802A
Application number: JP8523484A
Authority: JP
Inventors: ニ，ジャン; ジェンツ，ライナー; アダムス，マーク・ディ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-01-31
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 1999-02-16
Also published as: EP0814661A4; AU1869095A; EP0814661A1; WO1996023410A1

Abstract

(57)【要約】ヒトＵＣＥ７、ＵＣＥ８およびＵＣＥ９ポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組換え技術によるそのようなポリペプチドの製造方法を開示する。悪性細胞の増殖を治療するためにそのようなポリペプチドを利用する方法をも開示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト、およびそれらの、アルツハイマー病、骨格筋萎縮、アフリカ豚コレラウイルス、およびアポプトーシス性細胞死を治療するための治療薬としての使用をも開示する。ＵＣＥ７、８および９核酸配列中の突然変異に関連した疾患を検出し、そのような配列によってコードされるポリペプチド濃度を決定するための診断的アッセイをも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ユビキチン結合酵素７、８および９本発明は、新しく同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびそのようなポリヌクレオチドならびにポリペプチドの製造に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドはユビキチン結合酵素（本明細書では以降「ＵＣＥ７、８および９」と記すことがある）である。本発明はそのようなポリペプチドの作用の変調にも関する。哺乳動物細胞は、蛋白分解の異なる局面に関与する２つの異なる蛋白分解経路を含んでいる。これらの１つはユビキチン依存性であり、異常で短命な蛋白の選択的分解に関与する真核細胞における主要経路である。ユビキチンは、遊離または多様な蛋白と共有結合した、真核細胞中に存在する高度に保存された７６アミノ酸残基の蛋白である。ユビキチンの翻訳後の他の蛋白への結合は、ユビキチン結合酵素によって触媒され、ユビキチンのＣ−末端グリシン残基とアクセプター蛋白中のリジン残基のエプシロン−アミノ基とのイソペプチド結合の形成を伴う。ユビキチン−蛋白結合は選択性が高く、驚くほど多様な細胞機能に必要である。酵母の遺伝的研究により、ユビキチン結合酵素はＤＮＡ修復、突然変異の誘発、胞子形成、逆転位(retrotransposition)の抑制、細胞周期の促進、細胞生存性、熱ショック抵抗性、カドミウムトレランス、およびパーオキシソーム生物発生に必要である。ヒストン、アクチン、細胞表面レセプター、ＭＡＴα２転写リプレッサー、腫瘍サプレッサー蛋白ｐ５３、Ｍｏｓキナーゼ、およびサイクリンを含む、多くのin vivo基質が同定されている。ＵＣＥ７、８および９はヒト細胞における選択的蛋白分解に主要な役割を果たすかも知れない。ユビキチン遺伝子はアポプトーシス性(apoptotic)の死のプログラム中に刺激されることが知られている遺伝子の一つであり、核蛋白のユビキチンは、アポプトーシスにおいて生じる鍵となる出来事であるクロマチンの分裂およびオリゴヌクレオソームの断片化に関与するかも知れない。プログラムされた細胞死の古典的タイプであるアポプトーシスは、種々多様な刺激によって多くの細胞種において誘発することができ、例えば、低線量のγ線はin vitroで中間期のヒト白血球にアポプトーシスを誘導し得る。この種のアポプトーシスの誘導において、活性化遺伝子発現は死のプログラムを満たすために必要である。正常循環ヒトリンパ球におけるγ照射によるアポプトーシスとユビキチン遺伝子発現またはユビキチン化(ubiquitination)との間に関係があることが報告された(Delic，J.らの、Mo l．Cell Biol.，13:4875 (1993))。この報告において、アポプトーシスの開始後１５〜９０分にユビキチン遺伝子の転写が活性化された結果、ユビキチンｍＲＮＡレベルが上昇することが示された。具体的には、すべての照射細胞ではないが、アポプトーシス性細胞において、核蛋白は高度にユビキチン化され、ユビキチン配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害はユビキチン化核蛋白レベルの低下をもたらし、アポプトーシス性死のパターンを示す細胞の割合はかなり減少する。ユビキチン系の混乱は、葉の捻れのような植物におけるプログラムされた壊死性反応、血管組織変化、および壊死性病変をも誘導し得る。ユビキチンは血小板の細胞毒性特性ならびにこれら細胞による酸素代謝物の産生を阻害し得る。さらに、この分子はプロ凝集因子として作用することができ、血小板凝集の欠陥を含む病理において重要性が大きいようである。ユビキチンは、膜翅類毒物過敏症およびアスピリン感受性喘息のような血小板が関与していると思われる免疫学的障害において血小板の細胞毒性機能を阻害することができることから、ユビキチンはこれらの免疫学的障害の調節にも役割を果たす。ユビキチンはアルツハイマー病患者において増加していることも示されている (Taddei，N.らの、Neurosci．Lett.，151:158-61 (1993))。この研究は、アルツハイマー病患者の脳の異なる皮質および皮質下領域中の可溶性ユビキチン量と正常脳中におけるその量との比較に関するものであった。可溶性ユビキチン含量は正常組織より病理組織において有意に高かった。アルツハイマーの変性作用を受けた脳組織から単離されたユビキチンの一次構造を決定し、正常ヒトユビキチンと同じであることがわかった。この報告は、細胞内のユビキチン依存性蛋白分解作用の障害がこの神経変性性疾患の病理に重要な役割を果たすかも知れないことを示唆する。ユビキチン−プロテアソーム系は、ＭＨＣクラスＩ制限抗原の特異的プロセシングとそれに続く提示にも重要な役割を果たす。ｐ１０５ＮＦ−ｋＢ前駆体の、転写活性化因子の活性ｐ５０サブユニットへの成熟は、ユビキチンおよびプロテアソーム依存性の方法でも進行する。さらに、プロテアソームに対するインヒビターはＩｋＢａの分解をブロックし、したがって、腫瘍壊死因子α誘導性のＮＦ−ｋＢの活性化とそれが核内に入るのを抑制する。安定なｖ−Ｊｕｎではなく不安定なｃ−Ｊｕｎは多ユビキチン化され、分解される。発癌性ｖ−Ｊｕｎがユビキチン依存性分解からの免れることは、悪性形質転換への経路を示唆する。別のプロト−オンコ蛋白であるｃ−Ｍｏｓも該ユビキチン系によって分解される。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘導Ｅ６蛋白は、ｐ５３の、ＡＴＰおよびユビキチン依存性結合および分解を刺激し、そのようなメカニズムはＨＰＶ−形質転換子宮頸癌系で観察されたｐ５３レベルが極めて低かったことを説明し、これらオンコ−蛋白の発癌性のメカニズムを提唱するものと思われる。リンパ球ホーミングレセプター、成長ホルモンレセプター、および成長因子レセプター（ＰＤＧＦ、スチール因子）を含む多くの細胞表面レセプターが、ユビキチンによって修飾されることもみいだされた。本発明のポリペプチドは推定上ＵＣＥ７、８および９と同定された。この同定はアミノ酸配列の相同性の結果としてなされた。本発明のある目的は、ＵＣＥ７、８および９である新規成熟ポリペプチド、およびその、生物学的に活性で、診断的または治療的に有用な断片、類似体、および誘導体を提供することである。本発明のポリペプチドはヒト起源である。本発明の別の目的は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含むＵＣＥ７、８および９をコードする単離された核酸分子、およびその診断的または治療的に有用な断片、類似体、および誘導体を提供することである。さらに本発明の別の目的は、ヒトＵＣＥ７、８または９核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を培養することを含む組換え技術によって、そのようなポリペプチドを、該蛋白の発現を促し、次いで該蛋白を回収する条件下で製造する方法を提供することである。さらに本発明の別の目的は、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを治療的目的、例えば、悪性形質転換、免疫学的障害を治療し、望ましくない細胞に細胞死のための目印をつけ、該ポリペプチドと相互作用するアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに利用する方法を提供することである。さらに本発明の別の目的は、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供することである。さらに本発明の別の目的は、そのようなポリペプチドの作用の阻害、例えば、骨格筋萎縮、子宮頸癌、およびある腫瘍、アルツハイマー病、地方病性落葉性天疱瘡、およびアフリカ豚コレラの治療に使用してよいそのようなポリペプチドに対するアンタゴニストを提供することである。さらに本発明の別の目的は、ＵＣＥ７、８および９配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブを提供することである。さらに本発明の別の目的は、そのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学研究、ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの製造に関連した目的でin vitroで利用する方法を提供することである。さらに本発明の別の目的は、ＵＣＥ７、８または９核酸配列の突然変異もしくはそのような配列によってコードされるポリペプチドの過剰発現に関連した疾患または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイ法を提供することである。本発明のこれらおよび別の目的は、本明細書中の記載内容から当業者に明らかであろう。以下の図面は本発明の態様を例示するものであって、特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲を限定するものではない。図１は、ＵＣＥ７ポリペプチドのｃＤＮＡ配列および対応する推定上のアミノ酸配列を示す。アミノ酸の標準的１文字略語を用いている。配列決定は３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems，Inc.）を用いて実施した。配列決定精度は、９７％以上正確であると予測される。図２は、ＵＣＥ８ポリペプチドのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。図３は、ＵＣＥ９ポリペプチドのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。図４は、ＵＣＥ７とDrosophila melanogaster 由来のＵＣＥとのアミノ酸配列の相同性を示す。図５は、ＵＣＥ８とCaenorhabditis elegansＵＣＥ遺伝子産物のアミノ酸配列の相同性を示す。図６は、ＵＣＥ９とSaccharomyces cerevisiae 由来のＵＣＥのアミノ酸配列の相同性を示す。本発明の目的は、図１、２および３（配列番号２、４および６）に記載の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、またはそれぞれＵＣＥ７、８および９をコードするクローン（ＡＴＣＣ寄託番号75877、75876、および75878）のｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供することである。本発明のＵＣＥ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは精巣癌、活性化Ｔ細胞、および軟骨肉腫から得ることができよう。本発明のポリヌクレオチドはRaji細胞（シクロヘキシミド処理）由来ｃＤＮＡライブラリー中にみいだされた。該ポリヌクレオチドはヒトユビキチン結合酵素ファミリーと構造的に関連している。該ポリヌクレオチドは１４７アミノ酸残基の蛋白をコードする転写解読枠を含んでいる。該蛋白はDrosophila melanogastor由来ＵＣＥとの相同性度が最も高く、１４７アミノ酸ストレッチに対して９３％の同一性と９６％の類似性を示す。本発明のＵＣＥ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、破骨細胞腫、精巣癌、および活性化Ｔ細胞から得てよい。本発明のポリヌクレオチドはヒト胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリー中にみいだされた。該ポリヌクレオチドはヒトユビキチン結合酵素ファミリーと構造的に関連している。該ポリヌクレオチドは１５４アミノ酸残基の蛋白をコードする転写解読枠を含む。該蛋白はCaenorha bditis elegans由来ＵＣＥとの相同性度が最も高く、１５４アミノ酸ストレッチに対して５５％の同一性と７８％の類似性を示す。本発明のＵＣＥ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは胚、平滑筋、および大網（greater omentum）から得てよい。本発明のポリヌクレオチドはヒトの大網由来のｃＤＮＡライブラリー中にみいだされた。該ポリヌクレオチドはヒトユビキチン結合酵素ファミリーと構造的に関連している。該ポリヌクレオチドは１９３アミノ酸残基の蛋白をコードする転写解読枠を含む。該蛋白はS．cer evisiae由来ＵＣＥとの相同性度が最も高く、１９３アミノ酸ストレッチに対して６１％の同一性と７２％の類似性を示す。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ形またはＤＮＡ形であってよく、該ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってよく、一本鎖の場合はコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってよい。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１、２および３（配列番号１、３および５）に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と同じであるか、または該遺伝コードの重複性すなわち縮重の結果、図１、２および３のＤＮＡ（配列番号１、３および５）または該寄託されたｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする別のコード配列であってよい。図１、２および３（配列番号２、４および６）の成熟ポリペプチド、または寄託されたｃＤＮＡによってコードされた成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコード配列のみ、成熟ポリペプチドのコード配列（および所望によりさらなるコード配列）、および成熟ポリペプチドのコード配列の非コード配列５’および／または３’またはイントロンのような非コード配列を含んでよい。したがって、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」には、該ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、およびさらなるコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。さらに、本発明は図１、２および３（配列番号２、４および６）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの断片、類似体、および誘導体をコードする上記ポリペプチドの変異体に関する。該ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に生じるアレル変異体または該ポリヌクレオチドの非天然に生じる変異体であってよい。したがって、本発明には、図１、２および３（配列番号２、４および６）に示す同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および図１、２および３（配列番号２、４および６）のポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの断片、誘導体、または類似体をコードするそのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれる。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体が含まれる。既述のごとく、該ポリヌクレオチドは、図１、２および３（配列番号１、３および５）に示すコード配列、または寄託されたクローンのコード配列の天然に生じるアレル変異体であるコード配列を有していてよい。当該分野で知られているように、アレル変異体は、１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有していてよい、それによってコードされるポリペプチドの機能が実質的に変化していないポリヌクレオチド配列の代わりの形である。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を許すマーカー配列と読み取り枠内で融合したコード配列も有していてもよい。マーカー配列は、細菌宿主の場合は該マーカーと融合した成熟ポリペプチドを精製するために提供されるｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンｔａｇであってよいか、または該マーカー配列は哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７細胞を用いる場合はヘマグルチニン（ＨＡ）ｔａｇであってよい。ＨＡｔａｇはインフルエンザヘマグルチニン蛋白由来エピトープに対応する(Wilson,I.らの、Cell，37:767 (1984))。さらに、本発明は、配列間に少なくとも５０％、好ましくは７０％の同一性がある場合に上記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。特に本発明はストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いている用語「ストリンジェント条件」は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％同一性がある場合のみに生じるであろうハイブリダイゼーションを意味する。好ましい態様において上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１、２および３（配列番号１、３および５）で示されるｃＤＮＡまたは寄託されたｃＤＮＡによってコードされた成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードしている。本明細書に示した寄託物は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約によって維持されるであろう。これら寄託物は単に当業者の便宜をはかるために提供されたものであり、寄託物が３５U.S.C.§112によって要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチド配列、およびそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は本明細書の一部を構成し、本明細書中の配列のあらゆる記述とのいかなる矛盾の発生も抑制するものである。寄託された物質を製造、使用、または販売するには承諾が必要であり、本明細書はそのような承諾を与えるものではない。さらに本発明は図１、２および３（配列番号２、４および６）の推定アミノ酸配列を有するか、または寄託されたｃＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列を有するＵＣＥ７、８および９ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの断片、類似体、および誘導体に関する。用語「断片」、「誘導体」、および「類似体」は、図１、２および３（配列番号２、４および６）のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドに言及する場合は、本質的にそのようなポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチドを意味する。したがって、類似体には、プロ蛋白部分の開裂によって活性化し、活性成熟ポリペプチドを生じることができるプロ蛋白が含まれる。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであってよい。図１、２および３（配列番号２、４および６）のポリペプチド、または寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの断片、誘導体、または類似体は、（ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されるもの（そのような置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされたものでもコードされていないものでもよい）、（ii）１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような、別の化合物と融合しているものであってよい。そのような断片、誘導体、および類似体は、本明細書中の記載内容から当業者の技術分野内にあると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは好ましくは単離された形で提供され、好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその最初の環境（例えば、それが天然に生じる場合は天然環境）から取り出されることをいう。例えば、生存動物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系中に共存する物質のいくつかまたはすべてから分離された該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってよく、そして／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってよく、さらに、そのようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないという意味において、単離されていてもよい。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子的に操作されている宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリヌクレオチドの製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってよい本発明のベクターを用いて遺伝子的に操作（形質導入、形質転換、またはトランスフェクション）される。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形であってよい。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化、形質転換体を選択、またはＵＣＥ７、８および９遺伝子を増幅するために適切に改良した通常の栄養培地中で培養することができる。温度やｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択した宿主細胞を用いて以前に使用した条件であり、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によりポリペプチドを製造するのに使用してよい。したがって、例えば、該ポリヌクレオチドはポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれかに含まれてよい。そのようなベクターには、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バクロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡ、およびワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ならびに仮性狂犬病のようなウイルスＤＮＡの結合物由来のベクターが含まれる。しかしながら、宿主中で複製および生存可能である限りあらゆる他のベクターを使用してよい。適切なＤＮＡ配列は種々の方法によってベクター中に挿入されてよい。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野で知られた方法によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような方法および他の方法は当業者の技術分野内にあるものと思われる。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を生じるように適切な発現制御配列（プロモーター）と機能性に連結される。そのようなプロモーターの代表的な例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、E．coli lacまたは trp、ファージλＰ_Lプロモーター、および原核細胞、真核細胞またはそれらのウイルス中で遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。該発現ベクターには翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終止暗号も含まれる。該ベクターは発現を増幅するための適切な配列も含んでいてよい。さらに、好ましくは、発現ベクターは、真核細胞培養のためのネオマイシン耐性またはジヒドロホレート還元酵素ような、またはE.coliにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性のような形質転換宿主細胞を選択するための表現型的特徴を提供するために、１またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。前記の適切なＤＮＡ配列を含むベクターおよび適切なプロモーターまたは制御配列を用いて、適切な宿主を形質転換し、該宿主に該ポリペプチドを発現させてよい。適切な宿主の典型的な例としては、E．coli、Streptomyces、Salmonella typh imuriumのような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、Drosophila S2およびSpodop tera Sf9のような昆虫細胞、CHO、COSまたはBowesメラノーマのような動物細胞、アデノウイルス、植物細胞などが挙げられる。適切な宿主の選択は本明細書の記載から当業者の技術分野内であると思われる。より詳細には、本発明には、先に記載したような１またはそれ以上の配列からなる組換え構築物も含まれる。該構築物には、本発明の配列が正または逆方向に挿入されているプラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターが含まれる。この態様の好ましい局面において、さらに該構築物は、例えば該配列と機能性に連結されたプロモーターを含む制御配列を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、市販されている。以下のベクターが実施例により提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Qiagen）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、phagescript、psiX174、pbluescript、ＳＫ、pbsks、pNH8 A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5 （Pharmacia）。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）pS VK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかしながら、宿主中で複製および生存できる限りにおいて、あらゆる他のプラスミドまたはベクターを使用してよい。ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能なマーカーを有する他のベクターを用いて、あらゆる望ましい遺伝子からプロモーター領域を選択することができる。２つの適切なベクターはpKK232-8およびpC M7である。特に命名された細菌性プロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt 、λP_R、P_L、およびtrpが含まれる。真核性プロモーターには、CMV極初期、HSV チミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来LTRs、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者の技術分野内である。さらなる態様において、本発明は、上記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞や酵母細胞のような下等真核細胞であるか、または宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞であり得る。宿主細胞内への構築物の導入はリン酸カルシウムトランスフェクション法、DEAE-Dextran介在トランスフェクション法、またはエレクトロポーレーションによって行うことができる（Davis，L.、Dibner，M.、およびBattey，I.の、Basic Methods in Mole cular Biology，(1986)）。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し、組換え配列によってコードされた遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、通常のペプチド合成装置によって合成的に製造することができる。成熟蛋白は適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを用いてそのような蛋白を製造することもできる。原核生物および真核生物宿主と共に用いる適切なクローニングおよび発現ベクターはSambrookらの、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、Cold S pring Harbor，N.Y.(1989)に記載されており、この内容は本明細書の一部を構成する。高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増強する、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのｃｉｓ−作用エレメントである。実施例は、複製起点ｂｐ１００〜２７０の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含。一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞を形質転換させる複製起点および選択可能マーカー、例えば、E．coliおよびS．cerevisiae TRP1遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子、および下流の構造配列の転写をもたらす、高度に発現された遺伝子から誘導されるプロモーターを含むであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸ホスファターゼ、または熱ショック蛋白のような糖分解酵素をコードするオペロンから誘導することができる。ヘテロローガスな構造配列は、翻訳、開始、および終止配列を用いて適切な相に組み立てられる。所望により、該ヘテロローガスな配列は、所望の特性、例えば、発現した組換え産物の安定化または簡単な精製をもたらすＮ−末端同定ペプチドを含む融合蛋白をコードすることができる。細菌で使用する有用な発現ベクターは、所望の蛋白をコードする構造ＤＮＡ配列を、機能性プロモーターを有する機能的な解読相中の適切な翻訳開始および終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、ベクターの維持を保証し、所望であれば、宿主内での増幅をもたらす、１またはそれ以上の表現型的選択可能マーカーおよび複製起点を含むであろう。形質転換に適した原核生物宿主には、E．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、およびPs eudomonas、streptomyces、およびStaphylococcus属内の様々な種が含まれるが、他のものも選択の問題として用いてもよい。代表的な非制限的例として、細菌に用いる有用な発現ベクターは、よく知られたクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝的要素を含む市販のプラスミドから誘導された細菌性複製起点および選択可能なマーカーを含むことができる。そのような市販のベクターには、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemica ls,Uppsala，Sweden）およびGEM1（Promega Biotec，Madison，WI，USA）が含まれる。これらpBR322「バックボーン」断片を適切なプロモーターおよび発現させる構造配列と結合させる。適切な宿主株を形質転換し、宿主細胞を適切な細胞密度に増殖させた後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）によって誘導し、細胞をさらにある期間培養する。細胞を通常、遠心によって回収し、物理的または化学的手段により崩壊させ、得られる粗抽出物をさらに精製するために保持する。蛋白を発現させるのに用いた細菌性細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波破砕、機械的崩壊、または細胞溶解剤の使用を含むあらゆる通常の方法によって崩壊させることができ、そのような方法は当業者によく知られている。種々の哺乳動物細胞培養系も組換え蛋白を発現させるのに使用することができる。哺乳動物発現系の例には、サル腎繊維芽細胞のＣＯＳ−７系（Gluzmanの、C ell，23:1751981)に記載）および適合性ベクターを発現することができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターには、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およびあらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終止配列、および５’フランキング非転写配列が含まれよう。SV40スプライスから誘導されるＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位を用いて必要な非転写遺伝要素を得てよい。硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキリアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって組換え細胞培養からＵＣＥ７、８、および９ポリペプチドを回収および精製することができる。成熟蛋白の配置を完成させる際に必要に応じて蛋白リホールディング工程を用いることができる。最終的に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物または化学合成法の産物であるか、または原核生物もしくは真核生物宿主（例えば、培養中の細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞により）から組換え技術により製造されてもよい。組換え体製造方法に用いる宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されても、グリコシル化されなくてもよい。本発明のポリペプチドは最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。本発明によれば、ＵＣＥ７、８および９ポリペプチド、および下記のポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストを、しばしば「遺伝子療法」と呼ばれるin vivoでのそのようなポリペプチドを発現させることにより用いてもよい。したがって、例えば患者由来の細胞をex vivoでポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作し、次いでこの操作された細胞を、該ポリペプチドを用いて治療すべき患者に与えてよい。そのような方法は当該分野でよく知られている。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を用いて、当該分野で知られた方法によって細胞を操作してよい。同様に、例えば当該分野で知られた方法によってin vivoでポリペプチドを発現させるためにin vivoで操作してよい。当該分野で知られているように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するためのプロデューサー細胞を、in vivoで細胞を操作し、in vivoでポリペプチドを発現させるために患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらおよび他の方法は本発明の開示内容から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビークルはレトロウイルス以外、例えば、適切な供給ビークルと結合させた後にin vivoで細胞を操作するのに使用してよいアデノウイルスであってよい。ＵＣＥ７、８および９ポリペプチドが遺伝子療法により細胞内で発現すると、それらを用いてリンパ球ホーミングレセプターに対するシグナルを生じ、次いでリンパ球のトラフィッキング（trafficking）が調節されよう。成長ホルモンレセプターはシグナルリガンドにユビキチンも利用するので、ＵＣＥ７、８および９ポリペプチドを用いて成長レセプターの活性化が調節されよう。プログラムされた細胞死は細胞の一次抗ウイルス防御メカニズムの１つであると思われるので、ＵＣＥ７、８および９ポリペプチドは、これらのウイルスによって誘導されたプログラムされた細胞死の抑制を克服することによって多くのウイルス感染症を克服するのに用いることができよう。ＵＣＥ７、８および９ポリペプチドは、ウイルス感染細胞を細胞死の標的とすることによって、ＡＩＤＳのような免疫抑制関連障害を治療するのに用いることもできよう。ＵＣＥ７、８および９は、血小板の細胞毒性特性および血小板による酸素代謝物の産生を阻害するのに用いることもできよう。これらのポリペプチドは、血小板が関与していると思われる免疫学的障害、例えば、膜翅類毒素過敏症、およびアスピリン感受性喘息を調節するのに用いることもできよう。プロト−オンコ蛋白ｃ−Ｍｏｓおよびｖ−Ｊｕｎはユビキチン依存性に分解されるので、ＵＣＥ７、８および９は悪性形質転換を治療するのに用いることもできよう。さらに本発明の目的は、科学的研究、ＤＮＡの合成、ＤＮＡベクターの製造に関連するin vitroでの目的、およびヒトの疾患を治療するための診断および治療法を提供する目的で、そのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供することである。完全長ＵＣＥ遺伝子を、ｃＤＮＡライブラリーのためのハイブリダイゼーションプローブとして用いて、完全長ＵＣＥ遺伝子を単離し、これら遺伝子と高度の配列類似性または同様の生物活性を有する他の遺伝子を単離してよい。このタイプのプローブは一般には少なくとも２０塩基である。しかしながら、該プローブは大きな塩基数であってもよいが、好ましくは、該プローブは少なくとも３０塩基であり、一般的には５０塩基以下である。該プローブは、完全長転写物に対応するｃＤＮＡクローン、およびゲノムクローンもしくは調節およびプロモーター領域、エクソン、およびイントロンを含む完全ＵＣＥ遺伝子を含むクローンを同定するのに使用してもよい。スクリーニングの例には、既知のＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、ＵＣＥ遺伝子のコード領域を単離することが含まれる。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用いてヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、該プローブとハイブリダイズする該ライブラリーのメンバーを決定することができる。さらに、本発明はＵＣＥ７、８および９酵素の活性を増強（アゴニスト）またはブロック（アンタゴニスト）する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。そのような方法の例には、ユビキチンが正常に蛋白基質に伝達される条件下において、ＵＣＥ７、８または９およびスクリーニングされる物質の存在下で反応体を混合することが含まれる。該反応体には、［Ｉ¹²⁵］ユビキチン、ＡＴＰ、および蛋白基質、例えば、ヒストンが含まれる。正常な条件下でユビキチンは蛋白基質に伝達され、この伝達はＵＣＥ７、８または９酵素によって触媒される。次いで、標識基質、すなわち、標識されたユビキチンが結合した基質の量を測定することにより、スクリーニングされる該化合物がＵＣＥ７、８または９によるこの反応の触媒を増強またはブロックするかを決定することができよう。ヒトＵＣＥ７、８および９は細胞内で産生され、機能するため、あらゆるアンタゴニストは細胞内にあらねばならない。潜在的ＵＣＥ７、８または９アンタゴニストの例には、細胞内で産生される抗体が含まれる。例えば、ＵＣＥ７、８および９と拮抗することが確認された抗体は、ＵＣＥ７、８または９の機能を抑制する一本鎖抗体をコードするＤＮＡを用いて適切な細胞を形質転換するような、当該分野で知られた方法により一本鎖抗体として細胞内で産生できよう。別の潜在的アンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて製造されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を用いることにより、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく方法である、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡによる遺伝子発現を制御することができる。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分を用いて長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドが設計される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを転写に関与する遺伝子の領域と相補性に設計することにより（三重らせん−Leeらの、Nucl．Acids Res.，6:3073(1979) ；Cooneyらの、Science，241:456(1988)；およびDervanらの、Science，251:136 0(1991)参照）、ＵＣＥ７、８および９の転写と翻訳が抑制される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはin vivoでｍＲＮＡとハイブリダイズし、該ｍＲＮＡ分子のＵＣＥ７、８および９ポリペプチドへの翻訳がブロックされる（アンチセンス−Okanoの、J．Neurochem.，56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(19 88)）。上記オリゴヌクレオチドは該アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをin vivo で発現させ、ＵＣＥ７、８および９の産生を抑制することができるように細胞に供給することもできる。さらに別の潜在的アンタゴニストには、基質を認識するが、ユビキチン化を触媒しないためＵＣＥ７、８または９の機能化を妨げるように作用する、ＵＣＥ７、８または９の突然変異形すなわちミューテイン（mutein）が含まれる。潜在的アンタゴニストには、細胞膜を通過し、該ポリペプチドの触媒部位に結合することにより、正常な生物活性が抑制されるように基質が該触媒部位に近づきにくくなるようにする低分子も含まれる。該アンタゴニストは、ＵＣＥ７、８および９がユビキチンの基質への伝達を触媒し、その基質が細胞死を運命づける宿主の疾患を治療するのに用いられよう。１例として、正常組織よりもアルツハイマー病患者由来組織においてユビキチン含量が有意に高いことがわかっているアルツハイマー病が挙げられる。該アンタゴニストは、骨格筋の萎縮はこれらの細胞がユビキチンにより細胞死を運命づけられることによって生じることから、骨格筋萎縮を治療するのに用いることもできよう。該アンタゴニストは、宿主中で増殖し、宿主の制御メカニズムを襲う試みにおいて細胞を殺す結合酵素を産生するアフリカ豚コレラウイルスに感染した患者を治療するのにも用いられよう。したがって、ＵＣＥ７、８および９を阻害することにより、アフリカ豚コレラウイルスの増殖が妨げられる。該アンタゴニストは、ユビキチン結合酵素を用いることにより皮膚を分解させると考えられ、自己免疫障害の一種でもあり、地方病性落葉状天疱瘡と呼ばれている水疱形成性皮膚疾患を治療するのに使用することもできよう。該アンタゴニストは、ある悪性形質転換体、例えば、腫瘍サプレッサー蛋白であるｐ５３のユビキチン依存性分解を誘導する、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）形質転換子宮頸癌を治療するのにも用いられよう。さらに、マウスの上皮腫瘍はユビキチン遺伝子を過剰発現することがわかっている。低分子アゴニストおよびアンタゴニストは、適切な医薬担体と一緒に用いてもよい。そのような組成物は治療的有効量の該アゴニストまたはアンタゴニスト、および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む。そのような担体には、生理食塩液、緩衝生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。該製剤は投与方法に適すべきである。本発明は、本発明の医薬組成物の１またはそれ以上の成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットをも提供する。そのような容器には、ヒトに投与するための製品、使用または販売の該機関による承認を反映している、製薬または生物製剤の製造、使用または販売を規定する政府機関によって規定された形の能書きを添えることができる。さらに、該医薬組成物は他の治療的化合物と一緒に使用してよい。該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内、または皮内経路といった通常の方法で投与してよい。該医薬組成物は特定の適応症を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般には、それらは少なくとも約１０μg/ｋｇ体重の量で投与され、ほとんどの場合、それらは約８ｍｇ／ｋｇ体重／日以下の量で投与されるであろう。ほとんどの場合、用量は投与経路や症状などを考慮して、１日あたり約１０μg/ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明はＵＣＥ遺伝子を診断薬として使用することにも関する。ＵＣＥ７、８または９の突然変異形を検出することにより、これら遺伝子の低発現によって生じる疾患、例えば腫瘍および免疫障害、に対する感受性または疾患を診断することができよう。ヒトＵＣＥ７、８または９遺伝子に突然変異を有する個体は種々の技術によりＤＮＡレベルで検出されよう。診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検材料のような患者の細胞から得られよう。該ゲノムＤＮＡは直接診断に用いるか、または分析前にＰＣＲ（Saikiらの、Nature，324: 163-166(1986)）を用いて酵素的に増幅させてもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じ目的に使用してもよい。例として、ＵＣＥ７、８または９をコードしている核酸に相補性のＰＣＲプライマーを、突然変異を確認および分析するのに用いることができる。例えば、増幅された生成物のサイズ変化を正常遺伝子型と比較することにより欠失および挿入を検出することができる。点突然変異は、増幅したＤＮＡと、放射標識されたＵＣＥ７、８または９ＲＮＡあるいは放射標識ＵＣＥ７、８または９アンチセンスＤＮＡ配列をハイブリダイズさせることにより同定することができる。完全にマッチした配列は、RNase Ａ消化または融解温度の違いによりミスマッチ二本鎖と区別することができる。ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝的検査は、変性剤を含むかまたは含まないゲル中でのＤＮＡ断片の電気泳動による移動度の変化を検出することにより達成されよう。小さな配列の欠失および挿入は、高解像度のゲル電気泳動によって可視化することができる。異なる配列のＤＮＡ断片は、異なるＤＮＡ断片の移動度がそれらの特異的融解または部分融解温度に応じてゲル中で遅れて異なる位置になる、変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別することができよう（例えば、Myersらの、Science，230: 1242(1985)参照）。 RNaseおよびＳ１保護または化学的開裂法のようなヌクレアーゼ保護アッセイにより特定の位置における配列変化も証明されよう(例えば、Cottonらの、PNAS 、USA、85:4397-4401(1985))。したがって、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多形性（RFLP）、およびゲノムＤＮＡのサウザンブロッティングといった方法によって達成できよう。より通常のゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、突然変異はin situ 分析によっても検出可能である。正常コントロール組織試料に比べてＵＣＥ７、８または９蛋白が過剰に発現することにより腫瘍の存在を検出することができるので、本発明は、種々の組織中の該蛋白のレベル変化を検出するための診断アッセイにも関する。宿主由来の試料中のＵＣＥ７、８または９蛋白のレベルを検出するのに用いるアッセイ法は当業者によく知られており、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、および好ましくはELISAアッセイが含まれる。ELISAアッセイにはまずＵＣＥ７、８または９抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を製造することが含まれる。さらに、該モノクローナル抗体に対するレポーター抗体が製造される。該レポーター抗体には、放射活性、蛍光、または本実施例ではホースラディッシュパーオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬を結合させる。宿主から取り出した試料は固体支持体、例えば、試料中の蛋白と結合するポリスチレン皿上でインキュベートされる。次いで、ＢＳＡのような非特異的蛋白とインキュベートすることにより、該皿上のあらゆる遊離蛋白結合部位を被う。次に、モノクローナル抗体がポリスチレン皿に結合したあらゆるＵＣＥ７、８または９蛋白と結合する時間、該モノクローナル抗体を該皿中でインキュベートする。すべての結合していないモノクローナル抗体を緩衝液で洗浄除去する。ホースラディッシュパーオキシダーゼと結合したレポーター抗体を該皿中に入れ、該レポーター抗体を、ＵＣＥ７、８または９蛋白と結合したあらゆるモノクローナル抗体と結合させる。次に、結合していないレポーター抗体を洗浄除去する。次に、パーオキシダーゼ基質を皿に加え、所定の時間で発現した色の量が所定量の患者試料中に存在する蛋白量である（標準曲線との比較）。ＵＣＥ７、８または９蛋白特異的抗体を固体支持体と結合させ、宿主由来の試料を固体支持体上を通過させ、固体支持体と結合した検出される標識の量を該試料中の量と関連づけることができる競合アッセイを用いてよい。本発明の配列は染色体の同定にも有用である。該配列は個々のヒト染色体上の特定位置を特異的な標的とし、ハイブリダイズすることができる。さらに、該染色体上の特定部位を同定することが最近必要とされている。現在、実際の配列データ（反復多形性）に基づく２、３の染色体マーキング試薬が染色体の位置に目印をつけるために利用可能である。本発明による染色体にＤＮＡをマッピングすることは、それらの配列と疾患関連遺伝子を対応させる上で最初の重要なステップである。簡単には、配列はｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは15-25ｂｐ）を製造することにより染色体にマップすることができる。３’非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡ中の１以上のエクソンにまたがって増幅工程を複雑にすることがないプライマーを速やかに選択する。次に、これらプライマーを用いて、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングを行う。該プライマーに対応するヒト遺伝子を含むそれらのハイブリッドのみが増幅された断片を生じるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは特定のＤＮＡを特定の染色体に割り当てる急速法である。本発明を該オリゴヌクレオチドプライマーと共に用いて、類似の方法で大きなゲノムクローンプールまたは特異的染色体由来断片のパネルを用いて副位置測定（sublocalization）を行うことができる。その染色体へのマッピングに同様に用いることができる他のマッピング戦略には、in situハイブリダイゼーション、標識されたフローソート染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択が含まれる。ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、１ステップで正しい染色体位置を得ることができる。この技術は５００または６００塩基ほどの短いｃＤＮＡを用いて行うことができるが、2000bpより大きいクローンは、簡単に検出するための十分なシグナル強度をもって独特な染色体位置に結合する確率が高い。ＦＩＳＨでは、ＥＳＴが誘導されるクローンを用いる必要があり、より長いものがよい。例えば、2000ｂｐがよく、4000がよりよく、よい結果、時間の妥当なパーセンテージを得るにはおそらく4000より大きい必要はない（この技術の総説については、Vermaらの、H uman Chromosomes：a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York (1988)参照）。配列が正確な染色体位置にマッピングされたら、該染色体上の該配列の物理的位置は遺伝子マップデータと関連づけることができる。そのようなデータは、例えばV．McKusickの、Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopkins Universit y Welch Medical Libraryを通してオンラインで利用可能）に記載されている。次に、同じ染色体領域にマッピングされている遺伝子と疾患の相互関係は結合分析によって確認される（物理的に近傍の遺伝子の共同相続(coinheritance)）。次に、罹患した個体と罹患していない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の違いを検討する必要がある。次に、突然変異が罹患した個体のいくらかまたはすべてに認められ、いかなる正常個体にも認められない場合は、該突然変異が該疾患の病因と思われる。物理的マッピングと遺伝子マッピング技術の最新の解析では、該疾患と関連する染色体領域に正確に局在しているｃＤＮＡは５０〜５００個の潜在的原因遺伝子の１つかも知れない。（これは１メガ塩基マッピング解析および１遺伝子／２０ｋｂとみなされる。）ポリペプチド、その断片あるいは他の誘導体、もしくはその類似体、またはそれらを発現する細胞を免疫原に用い、それらに対する抗体を生産することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明には、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体、およびＦａｂ断片、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物も含まれる。当該分野で知られている種々の方法がそのような抗体および断片の製造に用いられよう。本発明の配列に対応するポリペプチドに対する抗体は、該ポリペプチドを動物に直接注射するか、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外に投与することにより得ることができる。次に、そのようにして得られた抗体はそれ自体で該ポリペプチドと結合するであろう。このようにして、該ポリペプチドの断片のみをコードする配列を用いても、全天然ポリペプチドと結合する抗体を産生することができる。次に、そのような抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する組織から該ポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を製造するには、連続細胞系培養によって産生される抗体を提供するあらゆる技術を用いることができる。例としてはハイブリドーマ技術（KohlerとMilstein(1975)の、Nature，256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら(1983)の、Immunology Today 4: 72)、およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら (1985)の、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中、Alan R．Liss，Inc. 、77-96頁）が含まれる。一本鎖抗体を製造するための記載された技術(米国特許第4,946,778号)を適用し、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を製造することができる。また、トランスジェニックマウスを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできよう。本発明はさらに以下の実施例において記載されるであろうが、本発明はそのような実施例によって限定されるものではない。特記しない限り、すべての部分または量は重量である。以下の実施例の理解を促すため、しばしば出てくる特定の方法および／または用語について記載することにする。「プラスミド」は小文字ｐとその前および／または後の大文字および／または数字によって示される。本明細書において出発プラスミドは市販されているか、制限なしに公に利用可能であるか、または公表された方法に従って利用可能なプラスミドから構築することができる。さらに、記載されたものと等価なプラスミドは当該分野で知られており、当業者には明らかであろう。ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡの一定の配列のみに作用する制限酵素でＤＮＡを触媒的に開裂させることをいう。本明細書中で用いている種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補助因子、および他の必要なものは当業者に知られたものを使用した。分析目的で、典型的にはプラスミドまたはＤＮＡ断片１μgを、緩衝溶液約２０μＬ中の酵素約２単位と共に用いる。プラスミド構築物のためのＤＮＡ断片を単離する目的では、典型的にはＤＮＡ５〜５０μgを大容量中の酵素２０〜２５０単位で消化する。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造業者によって明記されている。３７℃約１時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、供給業者の指示に応じて変更してよい。消化した後、Sambrookらの、Molecular Cloning: A laboratory Manual、第２版、 Cold Spring Harbor，N.Y．(1989)の記載に従って、反応物を直接ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、所望の断片を単離する。開裂した断片のサイズ分けは、Goeddel，D.らの、Nucleic Asids Res.，8: 40 57 1980)に記載の８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行われる。「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合成してよい、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖をいう。そのような合成オリゴヌクレオチドは５’ホスフェートを有しているため、キナーゼ存在下でホスフェートにＡＴＰを加えることなしに別のオリゴヌクレオチドと連結されることはないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片と連結されるであろう。「連結」とは、２本の二本鎖核酸断片間にホスホジエステル結合を形成させる工程をいう（Maniatis，T.ら、既述、１４６頁）。特記しない限り、連結は既知の緩衝液、および約等モル量の連結されるＤＮＡ断片０．５μgあたりＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）１０単位を用いる条件を用いて達成されよう。特記しない限り、形質転換は、Graham，F．およびVan der Eb，A.の、Virolog y，52:456-457(1973)に記載の方法に従って行われた。実施例１ＵＣＥ７の細菌における発現および精製ＵＣＥ７をコードするＤＮＡ配列(ATCC # 75877)を最初プロセッシングされたＵＣＥ７蛋白の５’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよびＵＣＥ７遺伝子の３’側のベクター配列を用いて増幅した。ＵＣＥ７に対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ５’および３’末端配列に加えた。配列5’CCC GGATCCGCTTCGAAGAGAATCCACAAT 3'（配列番号７）を有する正方向のオリゴヌクレオチドプライマーは、Bam HI制限酵素部位とそれに続くプロセッシングされた蛋白コドンの推定末端アミノ酸から始まるＵＣＥ７コード配列の２１ヌクレオチドを含む、。逆方向プライマー5’GCGCAAGCTTTTACATCGCATACTTCTGAGTCC 3’（配列番号８）はHind III部位、ＵＣＥ７の２０ヌクレオチド＋終止コドンを含む。制限酵素部位は、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Qiagen，Inc．Chatsworth，C A）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性(Amp^r)、細菌性複製起点(ori)、IPTG−制限可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位（RBS）、6-His tag および単一制限酵素部位をコードしている。次に、p QE-9はBamH1およびHind IIIで消化された。増幅された配列は、pQE-9内に連結され、ヒスチジンtagおよびRBSをコードする配列と共に読み取り枠内に挿入される。次に、連結混合物を用い、Sambrook，J.らの、Molecular Cloning: A Laborat ory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1988)に記載の方法に従ってE. c oli m15/pREP4 株(Qiagen)を形質転換させた。M15/pREP4は、lacIレプレッサーを発現し、カナマイシン耐性(Kan^r)ももたらすプラスミドpREP4の複数のコピーを含む。形質転換体はそれらのＬＢプレート上での増殖能によって確認され、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを分離し、制限分析により確認した。所望の構築物を含むクローンをAmp(100ug/mL)およびKan(25ug/mL)の両方を添加したＬＢ培地の液体培養中で一夜(O/N)増殖させた。O/N培養を用いて大培養に１：１００〜１：２５０の比率で摂取した。細胞を光学密度６００（O.D.⁶⁰⁰）で０．４〜０．６に増殖させた。次に、IPTG(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を最終濃度１ｍＭに加えた。IPTGを、lacIリプレッサーを不活化することにより誘導し、P/Oをクリアーにし、遺伝子発現を増大させる。さらに３〜４時間細胞を増殖させた。次に、遠心して細胞を回収した。細胞ペレットをカオトロピック剤の６ＭグアニジンＨＣｌに可溶化した。浄化した後、6- His tagを含む蛋白による密接な結合を許す条件下で、ニッケル−キレートカラムクロマトグラフィーによりこの溶液から可溶化ＵＣＥ７を精製した(Hochuli， E.らの、J．Chromatography 411: 177-184(1984))。６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ5.0）を用いて該カラムからＵＣＥ７を溶出させ、復元させるために３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元）、および２ｍＭグルタチオン（酸化）に調製した。この溶液中で１２時間インキュベーションした後、該蛋白を１０ｍＭリン酸ナトリウムで透析した。実施例２ＵＣＥ８の細菌における発現および精製ＵＣＥ８をコードするＤＮＡ配列(ATCC # 75876)を最初プロセッシングされたＵＣＥ８蛋白の５’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよびＵＣＥ８遺伝子に対するベクター配列３’を用いて増幅した。ＵＣＥ８に対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ５’および３’末端配列に加えた。配列5' C CCGGATCCGCGGCCAGCAGGAGGCTGATG 3'（配列番号9）を有する正方向のオリゴヌクレオチドプライマーは、Bam HI制限酵素部位とそれに続くプロセッシングされた蛋白コドンの推定末端アミノ酸から始まるＵＣＥ８コード配列の２１ヌクレオチドを含む。逆方向プライマー5' GCGCAAGCTTTTAGTCCACAGGTCG 3'（配列番号10）はHind III部位、ＵＣＥ８コード配列の１５ヌクレオチド＋終止コドンを含む。制限酵素部位は、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Qiagen，Inc．Chatsworth，C A）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性(Amp^r)、細菌性複製起点(ori)、IPTG−制限可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位（RBS）、6-His tag および単一制限酵素部位をコードしている。次に、p QE-9はBamH1およびHind IIIで消化された。増幅された配列は、pQE-9内に連結され、ヒスチジンtagおよびRBSをコードする配列と共に読み取り枠内に挿入される。次に、連結混合物を用い、Sambrook，J.らの、Molecular Cloning: A Laborat ory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1988)に記載の方法に従ってE. c oli m15/pREP4 株(Qiagen)を形質転換させた。M15/pREP4は、lacIレプレッサーを発現し、カナマイシン耐性(Kan^r)ももたらすプラスミドpREP4の複数のコピーを含む。形質転換体はそれらのＬＢプレート上での増殖能によって確認され、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを分離し、制限分析により確認した。所望の構築物を含むクローンをAmp(100ug/mL)およびKan(25ug/mL)の両方を添加したＬＢ培地の液体培養中で一夜(O/N)増殖させた。O/N培養を用いて大培養に１：１００〜１：２５０の比率で摂取した。細胞を光学密度６００(O.D.⁶⁰⁰)で０．４〜０．６に増殖させた。次に、IPTG(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」) を最終濃度１ｍＭに加えた。IPTGを、lacIリプレッサーを不活化することにより誘導し、P/Oを除去し、遺伝子発現を増大させる。さらに３〜４時間細胞を増殖させた。次に、遠心して細胞を回収した。細胞ペレットをカオトロピック剤の６ＭグアニジンＨＣｌに可溶化した。浄化した後、6-His ta gを含む蛋白による密接な結合を許す条件下で、ニッケル−キレートカラムクロマトグラフィーによりこの溶液から可溶化ＵＣＥ８を精製した(Hochuli，E.らの、J．Chromatography 411: 177-184(1984))。６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ5.0）を用いて該カラムからＵＣＥ８を溶出させ、復元させるために３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元）、および２ｍＭグルタチオン（酸化）に調製した。この溶液中で１２時間インキュベーションした後、該蛋白を１０ｍＭリン酸ナトリウムで透析した。実施例３ＵＣＥ９の細菌における発現および精製ＵＣＥ９をコードするＤＮＡ配列（ATCC # 75878）を最初プロセッシングされたＵＣＥ９蛋白の５’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよびＵＣＥ９遺伝子に対するベクター配列３’を用いて増幅する。ＵＣＥ９に対応するさらなるヌクレオチドをそれぞれ５’および３’末端配列に加えた。配列5' GCGCGGATCCACAGTCCAAGCACTAGGGC 3'（配列番号11）を有する正方向のオリゴヌクレオチドプライマーは、Bam HI制限酵素部位をそれに続くプロセッシングされた蛋白コドンの推定末端アミノ酸から始まるＵＣＥ９コード配列の19ヌクレオチドを含む。逆方向のプライマー5' GCGCAAGCTTCTATGTGGCGTACCGCTTGG 3'（配列番号12）はHind III部位と相補性の配列、次いで翻訳終止コドンを含むＵＣＥ９の２０ヌクレオチドを含む。制限酵素部位は、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Qi agen，Inc．，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性(Amp^r)、細菌性複製起点(ori)、IPTG− 制限可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボソーム結合部位（RBS）、6-His tag および制限酵素部位をコードしている。次に、pQE-9はBamH1およびHind III で消化される。増幅された配列は、pQE-9内に連結され、ヒスチジンtagおよびRB Sをコードする配列と共に読み取り枠内に挿入される。次に、連結混合物を用い、Sambrook，J.らの、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spr ing Laboratory Press，(1988)に記載の方法に従ってE．coli m15/pREP4 株(Qia gen)を形質転換させる。M15/pREP4は、lacIレプレッサーを発現し、カナマイシン耐性(Kan^r)ももたらすプラスミドpREP4の複数のコピーを含む。形質転換体はそれらのＬＢプレート上での増殖能によって確認され、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーが選択される。プラスミドＤＮＡを分離し、制限分析により確認する。所望の構築物を含むクローンをAmp(100ug/mL)およびKan(25ug/mL)の両方を添加したＬＢ培地の液体培養中で一夜(O/N)増殖させる。O/N培養を用いて大培養に１：１００〜１：２５０の比率で摂取した。細胞を光学密度６００(O.D.⁶⁰⁰)で０．４〜０．６に増殖させる。次に、IPTG(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」) を最終濃度１ｍＭに加えた。IPTGを、lacIリプレッサーを不活化することにより誘導し、P/Oを除去し、遺伝子発現を増大させる。さらに３〜４時間細胞を増殖させる。次に、遠心して細胞を回収する。細胞ペレットをカオトロピック剤の６ＭグアニジンＨＣｌに可溶化する。浄化した後、6-His tag を含む蛋白による密接な結合を許す条件下で、ニッケル−キレートカラムクロマトグラフィーによりこの溶液から可溶化ＵＣＥ９を精製した（Hochuli，E.らの、J．Chromatography 411: 177-184(1984))。６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ5.0）を用いて該カラムからＵＣＥ９を溶出させ、復元させるために３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元）、および２ｍＭグルタチオン（酸化）に調製した。この溶液中で１２時間インキュベーションした後、該蛋白を１０ｍＭリン酸ナトリウムで透析する。実施例４バクロウイルス発現系を用いるＵＣＥ７の発現およびクローニング完全長ＵＣＥ７蛋白をコードするＤＮＡ配列（ATCC # 75877）は、該遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。正方向プライマーは配列5' GCGCGGATCCACCATGGCTCTGAAGAGAATCC 3'（配列番号 13）を有し、Bam HI制限酵素部位（太字）、次いで、ＵＣＥ７遺伝子の最初の１５ヌクレオチドの直後にある真核細胞において翻訳を開始するのに有効なシグナル（Kozak，M.の、J．Mol．Biol．、196:947-950(1987)）に似た３ヌクレオチド（翻訳の開始コドン「ＡＴＧ」を下線で示す）を含む。逆方向プライマーは配列5' GCGCTCTAGATTACATCGCATACTTCTGAGTCC 3'（配列番号１４）を有し、制限エンドヌクレアーゼXbaIによる開裂部位とＵＣＥ７遺伝子の３’翻訳配列と相補性の２３ヌクレオチドを含む。市販のキット(「Geneclean 」、BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)を用いて、１％アガロースゲルから増幅配列を単離する。次に、該断片をエンドヌクレアーゼBam HIおよびXba Iで消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。この断片をＦ２と呼ぶ。ベクターｐＲＧ１（pVL941ベクターの修飾、後述）、バクロウイルス発現系を用いるＵＣＥ７蛋白の発現に用いる（Summers，M.D.およびSmith，G．E．(198 7)の、A manual of methods for baclovirus vectors and insect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No．1555参照）。この発現ベクターはAutographa californica 核多角体病ウイルス(AcMNPV )、次いで制限エンドヌクレアーゼBam HI およびXba Iの認識部位を含む。効率的にポリアデニル化するためにシミアンウイルス（ＳＶ）４０ポリアデニル化部位を用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリンプロモーター、次いでポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルと同じ方向に挿入する。ポリヘドリン配列は、その両端がコトランスフェクトされた野生型ウイルスＤＮＡの細胞介在ホモローガス組換えのためのウイルス配列の側面に位置する。pAc373、pVL941、およびpAcIM1のような多くのバクロウイルスベクターを、pRG1の代わりに用いることができよう（Luckow，V．A.およびSummers，M．D.の、Virology，170: 31-39)）。該プラスミドを制限酵素Bam HIおよびXbaI で消化し、次いで当該分野で知られた方法により子ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次に、該ＤＮＡを市販キット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と呼ぶ。断片Ｆ２と脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結する。次に、E．coli DH5α細胞を形質転換し、酵素Bsam HIおよびXbaIを用い、ＵＣＥ７遺伝子を含むプラスミド（pBac ＵＣＥ７）を含む細菌を同定する。クローンされた断片の配列は、ＤＮＡ配列決定により確認される。リポフェクション法(Felgnerらの、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84: 7413-7 417(1987))を用い、プラスミドpBac ＵＣＥ７５μgを市販の直線化バクロウイルス（「BaculoGold^TMバクロウイルスＤＮＡ」、Pharmingen，San Diego，CA)1. 0μg とコトランスフェクションさせる。 BaculoGold^TMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミドpBac ＵＣＥ７５μgを、無血清Grace培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）５０μＬを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。次に、リポフェクチン１０μＬ＋Grace培地９０μＬを加え、混合し、室温で１５分間インキュベーションする。次に、トランスフェクション混合物を、無血清Grace培地１ｍＬを含む３５mm組織培養プレート中に接種したＳｆ９昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴加する。プレートを前後に振動させ、新たに加えた溶液を混合する。次に、プレートを２７℃で５時間インキュベーションする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、１０％ウシ胎児血清添加Grace昆虫培地を加える。プレートを孵卵器に戻し、２７℃で４日間培養を続ける。４日後、上清を回収し、SummersおよびSmith(上記)の記載と同様にプラークアッセイを実施する。改良法として、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Ga ithersburg）を含むアガロースゲルを用い、青色に染まったプラークが容易に分離される（「プラークアッセイ」の詳細な説明は、Life Technologies Inc．(Ga ithersburg、9-10頁)配布の、昆虫細胞培養のための使用者指針およびバクロウイルス学中にもみることができる。）連続希釈後４日目に、細胞にウイルスを加え、青色に染まったプラークをエッペンドルフピペットチップで選ぶ。次に、組換えウイルスを含む寒天をGrace培地２００μＬを含むエッペンドルフチューブ中に再懸濁させる。短時間遠心して寒天を除去し、組換えバクロウイルスを含む上清を用いて、３５mm皿中に接種したＳｆ９細胞に感染させる。４日後、これらの培養皿の上清を回収し、次いで４ ℃で保存する。Ｓｆ９細胞を１０％加熱不活化ＦＢＳ添加Grace培地中で増殖させる。この細胞に、感染多重度(MOI)２で組換えバクロウイルスＶ−ＵＣＥ−７を感染させる。６時間後、培地を除去し、メチオニンおよびシステイン不含ＳＦ９００ II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）と交換する。４２時間後、³⁵Ｓ− メチオニン５μCiおよび³⁵Ｓシステイン５μCi（Amersham）を加える。細胞をさらに１６時間インキュベーションした後、遠心して回収し、標識された蛋白をSD S-PAGEおよびオートラジオグラフィにより可視化する。実施例５バクロウイルス発現系を用いるＵＣＥ８の発現およびクローニング完全長ＵＣＥ８蛋白をコードするＤＮＡ配列（ATCC # 75876）は、該遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。正方向プライマーは配列5' GCGCGGATCCACCATGGCGGCCAGCAGGAGGCT 3'（配列番号15）を有し、Bam HI制限酵素部位（太字）、次いで、ＵＣＥ８遺伝子の最初の１７ヌクレオチドの直後にある真核細胞において翻訳を開始するのに有効なシグナル（Kozak，M.の、J．Mol．Biol．、196:947-950(1987)）に似た３ヌクレオチド（翻訳の開始コドン「ＡＴＧ」を下線で示す）を含む。逆方向プライマーは配列5' GCGCTCTAGATTAGTCCACAGGTCG 3'（配列番号１６）を有し、制限エンドヌクレアーゼXbaIによる開裂部位とＵＣＥ８遺伝子の３’翻訳配列と相補性の１５ヌクレオチドを含む。市販のキット(「Geneclean」、BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)を用いて、１％アガロースゲルから増幅配列を単離する。次に、該断片をエンドヌクレアーゼBam HI およびXba Iで消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。この断片をＦ２と呼ぶ。ベクターｐＲＧ１(pVL941ベクターの修飾、後述)は、バクロウイルス発現系を用いるＵＣＥ８蛋白の発現に用いる（Summers，M.D.およびSmith，G．E.(1987) の、A manual of methods for baclovirus vectors and insect cell culture p rocedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No．1555参照）。この発現ベクターはAutographa californica 核多角体病ウイルス(AcMNPV) 、次いで制限エンドヌクレアーゼBam HI、Sma I、Xba I、Bgl II、およびAsp718 の認識部位を含む。効率的にポリアデニル化するためにシミアンウイルス（ＳＶ）４０ポリアデニル化部位を用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、 E. coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリンプロモーター、次いでポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルと同じ方向に挿入する。ポリヘドリン配列は、その両端がコトランスフェクトされた野生型ウイルスＤＮＡの細胞介在ホモローガス組換えのためのウイルス配列の側面に位置する。pAc373、 pVL941、およびpAcTM1のような多くのバクロウイルスベクターを、pRG1の代わりに用いることができよう（Luckow，V．A.およびSummers，M．D.の、Virology，1 70：31-39)）。該プラスミドを制限酵素Bam HIおよびXbaI で消化し、次いで当該分野で知られた方法により子ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次に、該ＤＮＡを市販キット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と呼ぶ。断片Ｆ２と脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結する。次に、E．coli HB101細胞を形質転換し、酵素Bsam HIおよびXbaIを用い、ＵＣＥ８遺伝子を含むプラスミド（pBac ＵＣＥ８）を含む細菌を同定する。クローンされた断片の配列は、ＤＮＡ配列決定により確認される。リポフェクション法(Felgnerらの、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84: 7413-7 417(1987))を用い、プラスミドpBac ＵＣＥ８５μgを市販の直線化バクロウイルス(「BaculoGold^TMバクロウイルスＤＮＡ」、Pharmingen，San Diego，CA)1.0 μgとコトランスフェクションさせる。 BaculoGold^TMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミドpBac ＵＣＥ８５μgを、無血清Grace培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）５０μＬを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。次に、リポフェクチン１０μＬ＋Grace培地９０μＬを加え、混合し、室温で１５分間インキュベーションする。次に、トランスフェクション混合物を、無血清Grace培地１ｍＬを含む３５mm組織培養プレート中に接種したＳｆ９昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴加する。プレートを前後に振動させ、新たに加えた溶液を混合する。次に、プレートを２７℃で５時間インキュベーションする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、１０％ウシ胎児血清添加Grace昆虫培地を加える。プレートを孵卵器に戻し、２７℃で４日間培養を続ける。４日後、上清を回収し、SummersおよびSmith(上記)の記載と同様にプラークアッセイを実施する。改良法として、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Ga ithersburg）を含むアガロースゲルを用い、青色に染まったプラークが容易に分離される（「プラークアッセイ」の詳細な説明は、Life Technologies Inc．（G aithersburg、9-10頁）配布の、昆虫細胞培養のための使用者指針およびバクロウイルス学中にもみることができる。）連続希釈後４日目に、細胞にウイルスを加え、青色に染まったプラークをエッペンドルフピペットチップで選ぶ。次に、組換えウイルスを含む寒天をGrace培地２００μＬを含むエッペンドルフチューブ中に再懸濁させる。短時間遠心して寒天を除去し、組換えバクロウイルスを含む上清を用いて、３５mm皿中に接種したＳｆ９細胞に感染させる。４日後、これらの培養皿の上清を回収し、次いで４ ℃で保存する。Ｓｆ９細胞を１０％加熱不活化ＦＢＳ添加Grace培地中で増殖させる。この細胞に、感染多重度(MOI)２で組換えバクロウイルスＶ−ＵＣＥ８を感染させる。６時間後、培地を除去し、メチオニンおよびシステイン不含ＳＦ９００ II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）と交換する。４２時間後、³⁵Ｓ−メチオニン５μCiおよび³⁵Ｓシステイン５μCi（Amersham）を加える。細胞をさらに１６時間インキュベーションした後、遠心して回収し、標識された蛋白をSDS- PAGEおよびオートラジオグラフィにより可視化する。実施例６バクロウイルス発現系を用いるＵＣＥ７の発現およびクローニング完全長ＵＣＥ９蛋白をコードするＤＮＡ配列（ATCC # 75878）は、該遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。正方向プライマーは配列5' GATCGGATCCACCATGACAGTCCAAGCACTAG 3'（配列番号 17）を有し、Bam HI制限酵素部位（太字）、次いで、ＵＣＥ９遺伝子の最初の１５ヌクレオチドの直後にある真核細胞において翻訳を開始するのに有効なシグナル（Kozak，M.の、J．Mol．Biol．、196:947-950(1987)）に似た３ヌクレオチド（翻訳の開始コドン「ＡＴＧ」を下線で示す）を含む。逆方向プライマーは配列5' GCGCTCTAGACTATGTGGCGTACCGCTTGG 3'（配列番号１８）を有し、制限エンドヌクレアーゼXbaIによる開裂部位とＵＣＥ９遺伝子の３ ’翻訳配列と相補性の２０ヌクレオチドを含む。市販のキット(「Geneclean」、 BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)を用いて、１％アガロースゲルから増幅配列を単離する。次に、該断片をエンドヌクレアーゼBam HIおよびXba Iで消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。この断片をＦ２と呼ぶ。ベクターｐＲＧ１（pVL941ベクターの修飾、後述）は、バクロウイルス発現系を用いるＵＣＥ９蛋白の発現に用いる（Summers，M.D.およびSmith，G．E．(198 7)の、A manual of methods for baclovirus vectors and insect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No．1555参照）。この発現ベクターはAutographa californica 核多角体病ウイルス(AcMNPV )、次いで制限エンドヌクレアーゼBam HI およびXba Iの認識部位を含む。効率的にポリアデニル化するためにシミアンウイルス（ＳＶ）４０ポリアデニル化部位を用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリンプロモーター、次いでポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルと同じ方向に挿入する。ポリヘドリン配列は、その両端がコトランスフェクトされた野生型ウイルスＤＮＡの細胞介在ホモローガス組換えのためのウイルス配列の側面に位置する。pAc373、pVL941、およびpAcIM1のような多くのバクロウイルスベクターを、pRG1の代わりに用いることができよう (Luckow，V．A.およびSummers，M．D.の、Virology，170: 31-39)）。該プラスミドを制限酵素Bam HIおよびXbaI で消化し、次いで当該分野で知られた方法により子ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次に、該ＤＮＡを市販キット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と呼ぶ。断片Ｆ２と脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結する。次に、E．coli DH5α細胞を形質転換し、酵素Bsam HIおよびXbaIを用い、ＵＣＥ９遺伝子を含むプラスミド（pBac ＵＣＥ９）を含む細菌を同定する。クローンされた断片の配列は、ＤＮＡ配列決定により確認される。リポフェクション法(Felgnerらの、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84: 7413-7 417(1987))を用い、プラスミドpBac ＵＣＥ９５μgを市販の直線化バクロウイルス(「BaculoGold^TMバクロウイルスＤＮＡ」、Pharmingen，San Diego，CA)1.0 μg とコトランスフェクションさせる。 BaculoGold^TMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミドpBac ＵＣＥ９５μgを、無血清Grace培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）５０μＬを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。次に、リポフェクチン１０μＬ＋Grace培地９０μＬを加え、混合し、室温で１５分間インキュベーションする。次に、トランスフェクション混合物を、無血清Grace培地１ｍＬを含む３５mm組織培養プレート中に接種したＳｆ９昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴加する。プレートを前後に振動させ、新たに加えた溶液を混合する。次に、プレートを２７℃で５時間インキュベーションする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、１０％ウシ胎児血清添加Grace昆虫培地を加える。プレートを孵卵器に戻し、２７℃で４日間培養を続ける。４日後、上清を回収し、SummersおよびSmith(上記)の記載と同様にプラークアッセイを実施する。改良法として、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Ga ithersburg）を含むアガロースゲルを用い、青色に染まったプラークが容易に分離される（「プラークアッセイ」の詳細な説明は、Life Technologies Inc.（Ga ithersburg、9-10頁）配布の、昆虫細胞培養およびバクロウイルス学のための使用者指針中にもみることができる。）連続希釈後４日目に、細胞にウイルスを加え、青色に染まったプラークをエッペンドルフピペットチップで選ぶ。次に、組換えウイルスを含む寒天をGrace培地２００μＬを含むエッペンドルフチューブ中に再懸濁させる。短時間遠心して寒天を除去し、組換えバクロウイルスを含む上清を用いて、３５mm皿中に接種したＳｆ９細胞に感染させる。４日後、これらの培養皿の上清を回収し、次いで４ ℃で保存する。Ｓｆ９細胞を１０％加熱不活化ＦＢＳ添加Grace培地中で増殖させる。この細胞に、感染多重度(MOI)２で組換えバクロウイルスＶ−ＵＣＥ−9を感染させる。６時間後、培地を除去し、メチオニンおよびシステイン不含ＳＦ９００ II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）と交換する。４２時間後、³⁵Ｓ−メチオニン５μCiおよび³⁵Ｓシステイン５μCi（Amersham）を加える。細胞をさらに１６時間インキュベーションした後、遠心して回収し、標識された蛋白をSDS- PAGEおよびオートラジオグラフィにより可視化する。実施例７ＣＯＳ細胞における組換えＵＣＥ７の発現プラスミドＵＣＥ７ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ＣＭＶプロモーター、次いでポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部位を含むベクターpcDN AI/Amp（Invitrogen）から誘導される。完全なＵＣＥ７遺伝子およびその３’末端に読み取り枠内に融合したHA tagをコードするＤＮＡ断片は該ベクターのポリリンカー領域内にクローンされているため、ＣＭＶプロモーター下で組換え蛋白の発現が生じる。HA tagは、既述のごとくインフルエンザヘマグルチニン蛋白由来のエピトープに対応する(I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A．Cherenson 、M．Connolly、およびR．Lernerの、Cell 37，767(1984))。HA tagの標的蛋白への融合により、HAエピトープを認識する抗体を用いて組換え蛋白を容易に検出することができる。プラスミド構築戦略は以下に述べる。ＵＣＥ７をコードするＤＮＡ配列（ATCC # 75877）は２つのプライマーを用いるＰＣＲによって構築される：５’プライマー5' GCGCGGATCCACCATGGCTCTGAAGA GAATCC 3'(配列番号１９)は、Bam HI部位、次いで開始コドンから始まるＵＣＥ７コード配列の１５ヌクレオチドを有する。逆方向プライマー5' GCGCTCTAGATCA AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACATCGCATACTTCTGAG 3'(配列番号２０)は、XbaI部位、翻訳終止コドン、HA tag、およびＵＣＥ７コード配列の最後の１７ヌクレオチド（終止コドンを含まず）と相補性の配列を含む。したがって、ＰＣＲ産物は Bam HI部位、ＵＣＥ７コード配列、次いで読み取り枠内に融合したHA tag、HA t agの隣の翻訳終了終止コドン、およびXbaI部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片およびベクター、pcDNAI/AmpをBam HIおよびXbaI制限酵素で消化し、連結する。連結混合物をE．coli SURE株(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)中に形質転換し、形質転換培養をアンピシリン培地プレート上に接種し、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、正しい断片の存在を制限分析によって試験する。組換えＵＣＥ７を発現させるため、DEAE-DEXTRAN法により発現ベクターでＣＯＳ細胞をトランスフェクトする(J．Sambrook，E．Frits ch，T．Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Lab oratory Press，(1989))。放射標識および免疫沈降法によりＵＣＥ７−ＨＡ蛋白の発現を検出する(E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Co ld Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。トランスフェクション後２日目に、細胞を³⁵Ｓ−システインで８時間標識する。次に、培養培地を回収し、細胞を界面活性剤で溶解させる(RIPA緩衝液（150mM NaCl、1% NP-40、0.1% SDS、1% NP-40、0.5% DOC、50mM Tris、pH7.5）（Wilson，I.らの、前述、37: 767(1984) )。細胞溶解物および培地の両方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈殿した蛋白を15% SDS-PAGEゲルで分析する。実施例８ＣＯＳ細胞における組換えＵＣＥ８の発現プラスミドＵＣＥ８ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ＣＭＶプロモーター、次いでポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部位を含むベクターpcDN AI/Amp（Invitrogen）から誘導される。完全なＵＣＥ８前駆体およびその３’末端に読み取り枠内に融合したHA tagをコードするＤＮＡ断片は該ベクターのポリリンカー領域内にクローンされているため、ＣＭＶプロモーター下で組換え蛋白の発現が生じる。HA tagは、既述のごとくインフルエンザヘマグルチニン蛋白由来のエピトープに対応する(I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A．Cherenson 、M．Connolly、およびR．Lernerの、Cell 37，767(1984))。HA tagの標的蛋白への融合により、HAエピトープを認識する抗体を用いて組換え蛋白を容易に検出することができる。プラスミド構築戦略は以下に述べる。ＵＣＥ８をコードするＤＮＡ配列（ATCC # 75876）は２つのプライマーを用いるＰＣＲによって構築される：５’プライマー 5' GCGCGGATCCACCATGGCGGCCAGCA GGAGGC 3'(配列番号21)は、Bam HI部位、次いで開始コドンから始まるＵＣＥ８コード配列の１９ヌクレオチド＋Kozak配列に似た３ヌクレオチドを含み、３’ 配列5' GCGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTCCACAGGTCG 3'(配列番号２２)は、XbaI部位、翻訳終止コドン、HA tag、およびＵＣＥ８コード配列の最後の１２ヌクレオチド（終止コドンを含まず）と相補性の配列を含む。したがって、ＰＣＲ産物はBam HI部位、ＵＣＥ−８コード配列、次いで読み取り枠内に融合したHA tag、HA tagの隣の翻訳終了終止コドン、およびXbaI部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片およびベクター、pcDNAI/AmpをBam HIおよびXbaI制限酵素で消化し、連結する。連結混合物をE．coli SURE株(Stratagene Cloning Systems,La Jolla，CA)中に形質転換し、形質転換培養をアンピシリン培地プレート上に接種し、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、正しい断片の存在を制限分析によって試験する。組換えＵＣＥ−８を発現させるため、DEAE-DEXTRAN法により発現ベクターでＣＯＳ細胞をトランスフェクトする(J ．Sambrook，E．Fritsch，T．Maniatisの、Molecular Cloning: A Laboratory M anual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。放射標識および免疫沈降法によりＵＣＥ８−ＨＡ蛋白の発現を検出する(E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。トランスフェクション後２日目に、細胞を³⁵Ｓ−システインで８時間標識する。次に、培養培地を回収し、細胞を界面活性剤で溶解させる（RIPA緩衝液（150mMN aCl、1% NP-40、0.1% SDS、１% NP-40、0.5% DOC、50mM Tris、pH7.5）(Wilson ，I.らの、前述、37: 767(1984))。細胞溶解物および培地の両方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈殿した蛋白を15% SDS-PAGEゲルで分析する。実施例９ＣＯＳ細胞における組換えＵＣＥ９の発現プラスミドＵＣＥ９ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ＣＭＶプロモーター、次いでポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部位を含むベクターpcDN AI/Amp（Invitrogen）から誘導される。完全なＵＣＥ９前駆体およびその３’末端に読み取り枠内に融合したHA tagをコードするＤＮＡ断片は該ベクターのポリリンカー領域内にクローンされているため、ＣＭＶプロモーター下で組換え蛋白の発現が生じる。HA tagは、既述のごとくインフルエンザヘマグルチニン蛋白由来のエピトープに対応する(I．Wilson、H．Niman、R．Πeighten、A．Cherenson 、M．Connolly、およびR．Lernerの、Cell 37，767(1984))。HA tagの標的蛋白への融合により、HAエピトープを認識する抗体を用いて組換え蛋白を容易に検出することができる。プラスミド構築戦略は以下に述べる。ＵＣＥ９をコードするＤＮＡ配列（ATCC # 75878）は２つのプライマーを用いるＰＣＲによって構築される：５’プライマー 5' GATCGGATCCACCATGACAGTCCAAG CACTAG 3'(配列番号23)は、Bam HI部位、次いで開始コドンから始まるＵＣＥ９コード配列の１９ヌクレオチド＋Kozak配列に似た３ヌクレオチドを含み、３’ 配列5' GCGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATGTGGCGTACCGCTTGG 3'（配列番号２４）は、XbaI部位、翻訳終止コドン、HA tag、およびＵＣＥ９コード配列の最後の１７ヌクレオチド（終止コドンを含まず）と相補性の配列を含む。したがって、ＰＣＲ産物はBam HI部位、ＵＣＥ９コード配列、次いで読み取り枠内に融合したHA tag、HA tagの隣の翻訳終了終止コドン、およびXbaI部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片およびベクター、pcDNAI/AmpをBam HIおよびXbaI制限酵素で消化し、連結する。連結混合物をE．coli SURE株(Stratagene Cloning Systems から入手できる，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037)中に形質転換し、形質転換培養をアンピシリン培地プレート上に接種し、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、正しい断片の存在を制限分析によって試験する。組換えＵＣＥ９を発現させるため、DEAE-DEXTRAN法により発現ベクターでＣＯＳ細胞をトランスフェクトする(J．Sambrook，E．Frits ch，T．Maniatisの、Mo1ecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring L aboratory Press，(1989))。放射標識および免疫沈降法によりＵＣＥ９−ＨＡ蛋白の発現を検出する(E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。トランスフェクション後２日目に、細胞を³⁵Ｓ−システインで８時間標識する。次に、培養培地を回収し、細胞を界面活性剤で溶解させる（RIPA緩衝液（150mM NaCl、1% NP-40、0.1% SDS、 1% NP-40、0.5% DOC、50mM Tris、pH7.5）(Wilson，I.らの、前述、37: 767(198 4))。細胞溶解物および培地の両方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させる。沈殿した蛋白を15% SDS-PAGEゲルで分析する。本発明の多くの修飾および変化は上記開示内容に照らして可能であるので、添付された請求の範囲の範囲内であり、特記せずに本発明を実施することができよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＥＤＣ１２Ｎ 1/21 39/395 ＡＡＳＣ１２Ｐ 21/02 Ｌ 48/00 ＡＤＳＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＤＹ // Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＥＤ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ジェンツ，ライナーアメリカ合衆国20904メリーランド州シルバー・スプリング、フェアーランド・パーク・ドライブ 13404番 (72)発明者アダムス，マーク・ディアメリカ合衆国20878メリーランド州ノース・ポトマック、ダフィート・ドライブ 15205番

Claims

【特許請求の範囲】１．(a) 配列番号２で示される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの断片、類似体もしくは誘導体をコードしているポリヌクレオチド、 (b) 配列番号４で示される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの断片、類似体もしくは誘導体をコードしているポリヌクレオチド、 (c) 配列番号６で示される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの断片、類似体もしくは誘導体をコードしているポリヌクレオチド、 (d) ATCC寄託番号75877に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの断片、類似体もしくは誘導体をコードしているポリヌクレオチド、 (e) ATCC寄託番号75876に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの断片、類似体もしくは誘導体をコードしているポリヌクレオチド、 (f) ATCC寄託番号75878に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの断片、類似体もしくは誘導体をコードしているポリヌクレオチドからなる群から選ばれる単離されたポリヌクレオチド。２．ＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．ＲＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．ゲノムＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．配列番号２で示される推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．配列番号４で示される推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．配列番号６で示される推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている請求項２に記載のポリヌクレオチド。８．ATCC寄託番号75877のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドをコードしている請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．ATCC寄託番号75876のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドをコードしている請求項２に記載のポリヌクレオチド。１０．ATCC寄託番号75878のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドをコードしている請求項２に記載のポリヌクレオチド。１１．配列番号１に示すコード配列を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。１２．配列番号３に示すコード配列を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。１３．配列番号５に示すコード配列を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。１４．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。１５．請求項１４に記載のベクターを用いて遺伝子的に操作された宿主細胞。１６．請求項１５に記載の宿主細胞から該ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを発現させることを含むポリペプチドの製造方法。１７．請求項１４に記載のベクターを用いて細胞を形質転換させることを含むポリペプチドを発現させることができる細胞の製造方法。１８．請求項２に記載のＤＮＡとハイブリダイズでき、ＵＣＥ７活性を有するポリペプチドをコードしている単離されたＤＮＡ。１９．請求項２に記載のＤＮＡとハイブリダイズでき、ＵＣＥ８活性を有するポリペプチドをコードしている単離されたＤＮＡ。２０．請求項２に記載のＤＮＡとハイブリダイズでき、ＵＣＥ９活性を有するポリペプチドをコードしている単離されたＤＮＡ。２１．(i) 配列番号２で示される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、およびその断片、類似体ならびに誘導体、 (ii) 配列番号４で示される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、およびその断片、類似体ならびに誘導体、 (iii) 配列番号６で示される推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、およびその断片、類似体ならびに誘導体、 (iv) ATCC寄託番号75877のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドの断片、類似体ならびに誘導体、 (v) ATCC寄託番号75876のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドの断片、類似体ならびに誘導体、 (vi) ATCC寄託番号75878のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドの断片、類似体ならびに誘導体からなる群から選ばれるポリペプチド。２２．ＵＣＥ７であり、配列番号２で示される推定アミノ酸配列を有する請求項２１に記載のポリペプチド。２３．ＵＣＥ８であり、配列番号４で示される推定アミノ酸配列を有する請求項２１に記載のポリペプチド。２４．ＵＣＥ９であり、配列番号６で示される推定アミノ酸配列を有する請求項２１に記載のポリペプチド。２５．請求項２１に記載のポリペプチドに対する抗体。２６．請求項２１に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストとして活性な化合物。２７．請求項２１に記載のポリペプチドの治療的有効量を、ＵＣＥ７を必要とする患者に投与することを含む該患者の治療方法。２８．請求項２１に記載のポリペプチドの治療的有効量を、ＵＣＥ８を必要とする患者に投与することを含む該患者の治療方法。２９．請求項２１に記載のポリペプチドの治療的有効量を、ＵＣＥ９を必要とする患者に投与することを含む該患者の治療方法。３０．請求項２６に記載の化合物の治療的有効量を、ＵＣＥ７を阻害する必要のある患者に投与することを含む該患者の治療方法。３１．請求項２６に記載の化合物の治療的有効量を、ＵＣＥ８を阻害する必要のある患者に投与することを含む該患者の治療方法。３２．請求項２６に記載の化合物の治療的有効量を、ＵＣＥ９を阻害する必要のある患者に投与することを含む該患者の治療方法。３３．該ポリペプチドをコードし、in vivoで該ポリペプチドを発現させるＤＮＡを患者に提供することにより該ポリペプチドの治療的有効量が投与されるものである請求項２７に記載の方法。３４．該ポリペプチドをコードし、in vivoで該ポリペプチドを発現させるＤＮＡを患者に提供することにより該ポリペプチドの治療的有効量が投与されるものである請求項２８に記載の方法。３５．該ポリペプチドをコードし、in vivoで該ポリペプチドを発現させるＤＮＡを患者に提供することにより該ポリペプチドの治療的有効量が投与されるものである請求項２９に記載の方法。３６．スクリーニングされる化合物、ＵＣＥ７、８または９、およびユビキチンおよび基質を含む反応混合物を混合し、該化合物が有効なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確認するために基質がユビキチン化される程度を測定することを含むＵＣＥ７、８または９のアゴニストおよびアンタゴニストとして活性な化合物をスクリーニングする方法。３７．宿主由来の試料からＵＣＥ７、８または９をコードする核酸配列を単離し、ＵＣＥ７、８または９核酸配列中の突然変異を決定することを含むＵＣＥ７、８または９核酸配列中の突然変異に関連する疾患もしくは疾患に対する感受性を診断する方法。３８．宿主由来の試料中における請求項２１に記載のＵＣＥ７、８または９ポリペプチドの存在を分析することを含む診断方法。