【発明の詳細な説明】
ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ
本発明は、新たに同定したポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドに
よりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関
する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、コリンアセチルトランスフェラ
ーゼであり、本明細書においてこの後、時々「hChAT」という。本発明はまた、
このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヒト脳から単離された（Mc
Geer P.L.ら、Life Sci.,34:2319-2338(1984))。コリンアセチルトランスフェラ
ーゼは、コリン作動性ニューロンで特異的に発現する。コリンアセチルトランス
フェラーゼは、神経伝達物質であるアセチルコリンを生じる反応を触媒する酵素
である。コリンアセチルトランスフェラーゼの発現は、ニューロンおよび特定の
非ニューロン組織（例えば、胎盤（Schuberth,J.,Biochim.Biophys.Acta,122:47
O-481(1966)ならびに精子（Ibanez,C.F.およびPersson,H.,Eur.J.Neurosci.,3:1
309-1315(1991)）の両方において見出されたが、この酵素の発現は主に特定のニ
ューロンに限定されている。
げっ歯動物遺伝子が転写開始部位の上流に「TATAA」ボックス保存配列を有す
るが、このようなエレメントがヒト遺伝子には見出されないという点で、ヒトコ
リンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の５’フランキング領域は、げっ歯動物
遺伝子とは異なる。げっ歯動物遺伝子はまた、少なくとも３つのプロモーターを
含有し、そしてそのプロモーターのうちの１つであるＭ型のみに対応する配列が
、ヒト遺伝子に見出されるという点で異なる(Hersh,L.B.ら、J.Neurochem.,61:3
06-314(1993))。
運動作用の制御は、中枢神経系の最も重要な機能の１つを構成する。脳の多く
の領域はこの過程に関与し、この過程は、運動制御における「最終共通経路」で
ある脊髄の運動ニューロンに最終的に統合される。これらのニューロンは前角に
存在し、コリン作動性の表現型を示し、それ故、コリンアセチルトランスフェラ
ーゼを発現する。コリンアセチルトランスフェラーゼは、コリン作動系の特異的
なマーカーである。
本発明の１つの局面によれば、hChaTである新規の成熟ポリペプチド、ならび
に生化学的に活性であり、かつ診断または治療に有用な、そのフラグメント、ア
ナログ、および誘導体が提供される。
本発明の別の局面によれば、hChaTをコードする単離された核酸分子（mRNA、D
NA，cDNA、ゲノムDNAを含む）ならびに生化学的に活性であり、かつ診断または
治療に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術に
より産生する方法が提供される。この方法は、該タンパク質の発現および、引き
続くこのタンパク質の回収を促進する条件下で、hChaT核酸配列を含む組換え原
核宿主細胞および/または真核宿主細胞を培養することを包含する。
本発明のなおさらなる局面によれば、治療目的（例えば、筋萎縮性側索硬化症
（ALS）、アルツハイマー病、家族性自律神経失調症（disautonomia）、ハンチ
ントン舞踏病、精神遅滞、記憶喪失、重症筋無力症、およびコリン作動系に関与
するか、またはその経路および身体の神経に作用することが知られている他の疾
患の処置）のために、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。
本発明の別の局面によれば、hChaT配列と特異的にハイブリダイズするに十分
な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。
本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が
提供される。
本発明の別の局面によれば、hChaT核酸配列およびそのような核酸配列によっ
てコードされるタンパク質中の変異に関連する疾患（例えば、アルツハイマー病
）または疾患に対する感受性を診断する方法が提供される。
本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドに対するアンタゴニ
ストが提供される。このアンタゴニストは、例えば、パーキンソン病および種々
の薬剤による偶発的な過剰投与ならびに毒素による汚染の処置において、このよ
うなポリペプチドの作用を阻害するために用いられ得る。
本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明
らかであるはずである。
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により規定
される本発明の範囲を限定することを意図しない。
図１は、hChatのcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。示したhCh
atポリペプチドは、推定上の成熟ポリペプチドである。アミノ酸の標準１文字略
語が使われている。
本発明の局面によれば、図１の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドを
コードするか、または1994年８月９日にATCC受託番号第75856号として寄託され
たクローンのcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離され
た核酸配列（ポリヌクレオチド）が提供される。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、胎児の肝臓および胎
児の肺から得られ得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの胎児の肺由来のcD
NAライブラリーから発見された。これは、677アミノ酸残基のタンパク質をコー
ドするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、ブタコリンア
セチルトランスフェラーゼに最も高い相同性を示し、145アミノ酸長にわたり43
％の同一性および64％の類似性を示す。
本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態であり得る。DNAは
、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。DNAは二本鎖または一本鎖であり
得る。そして、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であ
り得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列と
同一であり得るか、または寄託したクローンのコード配列と同一であり得る。あ
るいは、コード配列が、遺伝コードの重複（redundancy）または縮重（degenera
cy）の結果として、図１のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコ
ードする異なるコード配列であり得る。
図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成
熟ポリペプチドのコード配列および付加的なコード配列（例えば、リーダー配列
または分泌配列あるいはプロプロテイン配列）;成熟ポリペプチドのコード配列
（および必要に応じて付加的なコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イ
ントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’の非コ
ード配列）を包含し得る。
従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および
/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託し
たクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログ
、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関す
る。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝
子変異体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であり得る。
従って、本発明は、図１に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したク
ローンのcDNAによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。これ
らの変異体は、図１のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコード
されるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。こ
のようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿
入変異体を包含する。
本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列
または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体である
コード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体は、１
以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列
の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的には変化さ
せない。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする
マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列
は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する
pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例
えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合
、赤血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ赤血球凝集素
タンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell、37:767(1984)）
。
本発明はさらに、配列間に少なくとも50％、そして好ましくは70％の同一性が
存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに
関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェント
な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いら
れる用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも95％、そして好ま
しくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが
生じることをいう。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のcDNAまたは寄託したcDNAに
よりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的
活性を保持するポリペプチドをコードする。
本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続きの目的のための微
生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。これら
の寄託物は、単に便宜のために当業者に提供されるものであり、そして米国特許
法第112条の下で寄託が必要とされることを容認するものではない。寄託物に含
まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中
の配列のいかなる記載とのいかなる矛盾の場合も制御している。寄託物を製造、
使用、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施
許諾は本明細書によって与えられるわけではない。
本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有する、または寄託したcDNAによ
りコードされるアミノ酸配列を有するhChatポリペプチド、ならびにこのような
ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。
用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１のポリペプ
チド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合は、この
ようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持する
ポリペプチドを意味する。従ってアナログは、プロタンパク質部分の切断により
活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包含する。
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または
合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
図１のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドの
、フラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で１以上のアミノ酸残
基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され
、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされる
アミノ酸残基であってもよいし、または遺伝コードによりコードされるアミノ酸
残基でなくてもよい、フラグメント、誘導体、またはアナログ、あるいは(ii)そ
の中で１以上のアミノ酸残基が置換基を含有するフラグメント、誘導体、または
アナログ、あるいは(iii)その中で成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期
を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に
融合されているフラグメント、誘導体、またはアナログであり得る。このような
フラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範
囲内にあると考えられる。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態
で提供され、そして好ましくは均質に精製される。
用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合
は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動
物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが
、天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチ
ドはベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてさらにこのようなベクターま
たは組成物がその天然の環境の一部ではないため単離され得る。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポリペ
プチドを生成することに関する。
宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは
発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換または
トランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、
ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化
し、形質転換体を選択し、またはhChat遺伝子を増幅するために適切に改変され
た従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発
現のために選択された宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者に
は明らかである。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するため
に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す
るための種々の発現ベクターのいずれか１つ内に含まれ得る。このようなベクタ
ーは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含し、例えば、SV40の誘導体
；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラ
スミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスDNAである。し
かし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、いかなる他のベク
ターも使用され得る。
適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配
列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数また
は複数）に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲
内であると考えられる。
発現ベクター中のDNA配列は、mRNAの合成を指示する適切な発現制御配列（１
つまたは複数）（プロモーター）に作動可能に連結される。このようなプロモー
ターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター
、E.coli. lacまたはtrp、λファージPLプロモーター、および原核細胞または真
核細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である
他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位
および転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはまた、発現を増幅するため
の適切な配列を含み得る。
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため
の表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま
たはネオマイシン耐性、またはE ．coliにおけるテトラサイクリン耐性またはア
ンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。
本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また
は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質
を発現させるために用いられ得る。
適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E ．coli
、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）
；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2およびSf9）；動物細胞（例えば、CHO、COS
またはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、
本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む
組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターま
たはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向
または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物
はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含
する）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であ
り、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQ
E70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript
SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3
、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pX
T1、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主に
おいて複製可能で、そして存続可能である限り、いかなる他のプラスミドまたは
ベクターも使用され得る。
プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子
から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびPCM7である。特に
よく知られた細菌性プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、お
よびtrpを含む。真核性プロモーターは、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ
、
初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオ
ネインＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業
者のレベルの範囲内にある。
さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。
宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例え
ば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）
であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレー
ションにより達成され得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey，I.、Basic Method
s in Molecular Biology、(1986))。
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生成する
ために、従来の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来
のペプチド合成機により合成的に生成され得る。
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ
ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク
質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る
。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現
ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版、
Cold Spring Harbor、N.Y.、（1989）（この開示は、本明細書中に参考として援
用されている）に記載されている。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ
ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーはDNAのシ
ス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに
作用してその転写を増大する。例としては、複製起点bp100〜270の後期側のSV40
エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起
点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包
含する。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能と
する選択マーカー（例えば、E ．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS ．cerevi
siae
のTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来
するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、解糖酵素（例えば、
3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱
ショックタンパク質など）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は
、翻訳開始配列および翻訳終止配列と共に適切な相内で組立てられる。必要に応
じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または
簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコード
し得る。
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み
とり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナ
ルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、
１以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、およ
び所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換の
ための適切な原核宿主は、E ．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimuri um
、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の種々
の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。
代表的であるが、限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、
周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝エレメントを含む市販
のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。この
ような市販のベクターは、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、Upps
ala、Sweden）およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI、USA)を包含する。こ
れらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配
列と組み合わされる。
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選
択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）
により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段に
より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音
波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ
り破砕され得、このような方法は、当業者に周知である。
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い
られ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載されて
いるサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の
細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含する。哺乳
動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およ
びさらに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスド
ナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終止配列、および５’フラン
キング非転写配列を含有する。SV40のスプライス部位およびポリアデニル化部位
に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝因子を提供するために使用され得る。
hChatポリペプチドは、以下に挙げる方法により組換え細胞培養物から回収さ
れ、そして精製され得る。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈澱、
酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンク
ロマトグラフィーが包含される。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（re
folding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最
終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得
る。
本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物
であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細菌、酵
母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞により）から組換え技術により生成
され得る。組換え生成手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化され得ない。本発明のポリ
ペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。
本発明のhChatポリペプチドは、コリンへのアシル基の転移を触媒し、アセチ
ルコリンを生成する。神経伝達物質であるアセチルコリンの欠損は、変性神経系
疾患の羅病のような、認識および/または神経学的欠損、ならびに/あるいは気分
または精神障害を導く。
従って、本発明のhChatポリペプチドは、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマ
ー病、老人性痴呆症、多発脳梗塞性痴呆症、家族性自律神経失調症、ハンチント
ン舞踏病、精神遅滞、記憶喪失、および重症筋無力症を処置するために使用され
得る。
hChatポリペプチドはまた、コリン作動性系に関連するか、またはその経路お
よび身体の神経に作用することが知られている障害を処置するために使用され得
る。このような障害の例には、腸およびGI障害、脊髄障害（運動障害、節制障害
、および感覚障害を含む）、脳幹障害（睡眠障害、血圧障害、呼吸障害、および
平衡障害を含む）、視床下部障害（体温障害、呼吸障害、および内分泌機能障害
を含む）、および大脳辺縁系障害（精神分裂、記憶障害、および痴呆を含む）が
挙げられる。
全長のhChat遺伝子のフラグメントは、全長遺伝子を単離するため、およびこ
の遺伝子に対する高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子
を単離するために、cDNAライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとし
て使用され得る。このタイプのプローブは、例えば、20塩基と2000塩基との間で
あり得る。しかし、好ましくは、このプローブは、30塩基対と50塩基対との間を
有する。プローブはまた、全長転写物に対応するcDNAクローンならびにゲノムク
ローンまたは調節領域およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを
含む完全hChaT遺伝子を含むクローンを同定するために使用され得る。スクリー
ニングの例は、既知のDNA配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成す
ることにより、hChaT遺伝子のコード領域を単離することを包含する。本発明の
遺伝子配列に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、ヒトcDNA
、ゲノムcDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングするために使用され
、このプローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするかが決定さ
れる。
本発明のなおさらなる局面によれば、科学研究、DNAの合成およびDNAベクター
の製造に関するインビトロでの目的のために、このようなポリペプチド、または
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供さ
れる。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒト疾患に対
する処置および診断の発見のための研究試薬および研究材料として使用され得る
。
本発明は、hChatに対するレセプターを同定する方法を提供する。このレセプ
ターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンドパニ
ングおよびFACS分取(Coliganら、Current Protocols in Immun.,1(2),第５章，(
1991))によって同定され得る。好ましくは、発現クローニングが使用され、ここ
では、ポリアデニル化RNAがhChatに応答する細胞から調製され、そしてこのRNA
から作製されるcDNAライブラリーが、プールに分けられ、そしてhChatに応答し
ないCOS細胞または他の細胞をトランスフェクトするために使用される。ガラス
スライド上で増殖するトランスフェクト細胞は、標識されたhChatに曝される。h
Chatは、部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位のヨウ素化または封入を含む
種々の方法により標識され得る。固定化およびインキュベーションに続いて、ス
ライドは、オートラジオグラフ分析にかけられる。ポジティブプールが同定され
、そしてサブプールが、繰り返しのサブプーリング(sub-pooling)および再スク
リーニングプロセスを使用して、調製および再トランスフェクトされ、最終的に
推定上のレセプターをコードする単一のクローンが産生される。
レセプター同定の代わりのアプローチとして、標識されたhChatは、細胞膜ま
たはレセプター分子を発現する抽出調製物と光親和力で結合され得る。架橋した
物質は、SDS-PAGEによって分離され、そしてＸ線フィルムに曝される。hChatレ
セプターを含む標識複合体は、切り出され得、そしてペプチドフラグメント中に
分離され、そしてタンパク質微小配列決定にかけられる。推定のレセプターをコ
ードする遺伝子を同定するためのcDNAライブラリーをスクリーニングするために
、微小配列決定から得られたアミノ酸配列を使用して、一連の縮重オリゴヌクレ
オチドプローブを設計した。
本発明はまた、コリンアセチルトランスフェラーゼによるアセチルコリンの合
成に特異的に相互作用し、かつそれを増強またはブロックする化合物を同定する
ためのスクリーニング法を提供する。このような方法の例は、hChatがコリンへ
のアシル基の転移を正常に触媒し、アセチルコリンを生成するような適切な条件
下で、アセチルCoA、コリン、hChat、および潜在的なアゴニストまたはアンタゴ
ニストをインキュベートすることを包含する。結果は、１分あたり、かつ１mgの
タンパク質あたりに形成されたアセチルコリンのpmolとして測定され得る。アセ
チルコリンの増加生産または減少生産が、効果的なアゴニストまたはアンタゴニ
ストの発見を余儀なくするように、コントロール反応は、アゴニストまたはアン
タゴニストの非存在下で行われ得た。
潜在的なhChatアンタゴニストは、抗体であるか、またはある場合では、hChat
に結合し、そしてアセチルCoAとのその相互作用をブロックするオリゴヌクレオ
チドである。潜在的なアンタゴニストはまた、hChatと密接に関連するが、アセ
チルコリンの合成が妨げられるような生物学的機能を付与しないタンパク質（例
えば、hChatフラグメント）であり得る。
潜在的なhChaTアンタゴニストはまた、アンチセンス技術を使用して調製され
たアンチセンス構築物を含む。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアン
チセンスDNAもしくはRNAを介して遺伝子発現を制御するために用いられ得る。こ
れらの方法の両方は、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合することに基づい
ている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
の５’コード部分は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチ
ドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺
伝子領域に対して相補的であるように設計され（三重らせん-Leeら、Nucl．Acid
s Res.，6:3073(1979); Cooneyら、Science，241:456(1988);およびDervanら、S
cience，251: 1360(1991)を参照のこと）、それにより、hChatの転写および生成
を妨害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAとハイブ
リダイズし、そしてmRNA分子のhChatポリペプチドへの翻訳をブロックする（ア
ンチセンス-Okano、J．Neurochem.，56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as
Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)
）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それによりアンチセ
ンスRNAまたはDNAがインビボで発現されてhChatの生成を阻害し得る。
潜在的なアンタゴニストは、hChatポリペプチドの触媒部位に結合し、そして
それを占有し、アセチルコリンの合成が妨害されるように触媒部位へのアセチル
CoAの接近を不可能にする低分子を含む。低分子の例としては、低分子ペプチド
またはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。
アンタゴニストは、ドーパミンの欠損のために相対的に過剰なアセチルコリン
を産生するパーキンソン病を処置するために使用され得る。同様に、種々の薬剤
による偶発的な過剰投与および毒素による汚染はまた、コリン作動性系の相対的
に過剰な活性を生じ得、そして本発明のアンタゴニストを使用して処置され得る
。
アンタゴニストは、例えば、本明細書中下記のような薬学的に受容可能なキャ
リアーを有する組成物中で使用され得る。
hChatポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、適切な薬
学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量の
ポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このよ
うなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、
グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これら
に限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分で満たされた１以上の容
器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器に関して、薬剤
または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定さ
れた形式の製品表示をし得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使用
、または販売における機関による認可を表す。さらに、薬学的組成物は、他の治
療化合物と併用して用いられ得る。
これらの薬学的組成物は、静脈内、大脳内、腹膜内、筋肉内、皮下、鼻腔内、
または皮内経路によるような簡便な様式で投与される。薬学的組成物は、特異症
状の処置および／または予防に効果的な量で投与される。一般に、薬学的組成物
は少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日
に約８mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日あた
り約10μg/kg体重から約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される
。
hChatポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストは
また、本発明に従って、このようなポリペプチドのインビボでの発現により用い
られ得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。
従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞
はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該
分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを
含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作
され得る。
同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分
野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発
明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた
めの産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプ
チドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者
には明らかであるはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、
レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適
切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され
得る。
本発明はまた、変異hChaTの存在に関する疾患または疾患に対する感受性を検
出するための診断アッセイの一部分としてのhChaT遺伝子の使用に関する。この
ような疾患は、アセチルコリン欠損（例えば、神経学的障害）に関する。hChaT
遺伝子に変異を有する個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出され得る。
診断用の核酸は、患者の細胞（例えば、血液、組織生検、および解剖材料）から
得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、または分析の前
に、PCR(Saikiら、Nature,324:163-166(1986))を使用して酵素的に増幅され得る
。RNAまたはcDNAはまた、同じ目的のために使用され得る。例えば、hChaTをコー
ドする核酸に相補的なPCRプライマーは、hChaT変異を同定および分析するために
使用され得る。例えば、欠失および挿入が、正常な遺伝子型と比較した増幅産物
のサイズの変化により検出され得る。点変異は、増幅DNAを放射性標識hChaT RNA
あるいは放射性標識hChaTアンチセンスDNA配列にハイブリダイズさせることによ
り同定され得る。完全にマッチした配列は、RNase A消化によるか、または融解
温度の差異によりミスマッチ二重鎖と区別され得る。
DNA配列差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を有するか、または有しないゲル
中でのDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成され得
る。小配列の欠失および挿入は、高分離能ゲル電気泳動により可視化され得る。
異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルで区別され得、こ
こで、異なるDNAフラグメントの移動度は、その特異的な融解温度または部分的
な融解温度に従って、異なる位置にゲル中で遅延される（例えば、Myersら、Sci
ence,230:1242(1985)を参照のこと）。
特異的な位置の配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNase
およびS1保護または化学的切断法）により示され得る(例えば、Cottonら、PNAS,
USA,85:4397-4401(1985)を参照のこと)。
従って、特異的なDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化
学的切断、直接的なDNA配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多
型（RFLP））およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法によって達
成され得る。
より慣例的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、インサ
イチュ分析により検出され得る。
本発明はまた、種々の組織におけるhChatタンパク質の変化したレベルを検出
するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常なコントロール組織サンプル
と比較したこのタンパク質の過剰発現は、神経学的な疾患の存在または神経学的
な疾患に対する感受性を検出し得るからである。宿主に由来するサンプル中のhC
hatタンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者には周
知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロ
ット分析、ELISAアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイを含む。ELISAアッ
セイ(Coliganら、Current Protocols in Immunology,1(2),第６章、(1991))は、
最初にhChat抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製するこ
とを包含する。さらに、レポーター抗体がそのモノクローナル抗体に対して調製
される。このレポーター抗体に対して、検出可能な試薬、例えば、放射能、蛍光
、または本発明の実施例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を結合さ
せる。サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質と結合す
る
固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次
いで、ディッシュ上の任意のフリーのタンパク質結合部位は、BSAのような非特
異的タンパク質を用いてインキュベートすることにより覆われる。次に、モノク
ローナル抗体は、ディッシュ中でインキュベートされる。この間に、モノクロー
ナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合された任意のhChatタンパク質と結
合する。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液で洗い出される。西洋ワサ
ビペルオキシダーゼに結合したレポーター抗体はここで、ディッシュ中に置かれ
、hChatに結合した任意のモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合を生じ
る。次いで、非付着レポーター抗体が洗い出される。次いで、ペルオキシダーゼ
基質が、ディッシュに加えられ、そして所定の時間内の発色量は、標準曲線と比
較した場合、患者サンプルの所定の容量中に存在するhChatタンパク質量の測定
値である。
競合アッセイが、使用され得る。ここで、hChatに特異的な抗体は、固体支持
体に付着し、そして標識hChatおよび宿主由来のサンプルは、固体支持体上を通
過され、そして例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出さ
れた標識の量は、サンプル中のhChat量と相関し得る。
「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに類似する。「サンドイッチ」
アッセイでは、hChatは固体支持体上を通過させられ、そして固体支持体に付着
した抗体と結合する。次いで、第２の抗体をhChatに結合させる。次いで、標識
されており、かつ第２の抗体に特異的な第３の抗体は、固体支持体上を通過させ
られ、そして第２の抗体に結合し、次いで、量が定量され得る。
本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。この配列は、個々のヒ
ト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズ
し得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染
色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標
識試薬はほとんどない。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、これらの
配列と疾患に関連する遺伝子との相関づけにおいて重要な第１工程である。
簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を
調製することにより染色体にマップされ得る。３’非翻訳領域のコンピューター
解析が、ゲノムDNA内で１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセ
スを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これ
らのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスク
リーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリ
ッドのみが増幅フラグメントを生じる。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当て
るための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に
使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きな
ゲノムクローンのプールを用いて部分的位置決め(sublocalization)が達成され
得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、イ
ンサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで分取した
（flow-sorted）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNA
ライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含す
る。
cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ
ン(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技
術は、500または600塩基ほどの短いcDNAを用いて使用され得るが、しかし2,000b
pより大きなクローンは、簡単な検出のために十分なシグナル強度をともなって
独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。FISHはESTが得られたクローン
の使用を必要とし、クローンは大きいほどよい。例えば、2,000bpが良好であり
、4,000bpがより良好であり、そして4,000より大きなものは、良好な結果を妥当
な時間の割合で得るためにはおそらく必要ではない。この技術の総説としては、
Vermaら、Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press
、New York(1988)を参照のこと。
一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な
位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．M
cKusick、Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Med
ical Libraryからオンラインで入手可能である)に見出される。次いで、同一の
染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣
接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
次いで、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定す
る必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個
体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。
物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患
に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的
原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そ
して20kbあたり１遺伝子と仮定する。）
このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナ
ログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるため
の免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およ
びヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を
包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメント
の生成のために使用され得る。
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ
リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ
得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた
抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ
メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体
を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド
を発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。
モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗
体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ko
hlerおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、および
ヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、198
5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁
）が挙げられる。
単鎖抗体を生成するために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本
発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得
る。さらに、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性ポリペプチド産物
に対するヒト化抗体を発現するために使用され得る。
本発明を以下の実施例に関してさらに記載する；しかし、本発明はこのような
実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明記し
ない限り重量基準である。
以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および
／または用語を記載する。
「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または
数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、商業的に入手可能である
か、制限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手
可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプ
ラスミドと等価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らか
である。
DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列にのみ作用する制限酵素でそのDNAを触
媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市
販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者
に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまた
はDNAフラグメントを、約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する
。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的に
は５〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定
の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37
℃での約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の
説明書に従って変化し得る。消化後、反応物は直接ポリアクリルアミドゲル上で
電気泳動されて目的のフラグメントが単離される。
切断されたフラグメントの大きさによる分離は、Goeddel，D.ら、Nucleic Aci
d Res.，8:4057(1980)に記載の８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相
補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ
れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキ
ナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連
結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに
連結される。
「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形
成するプロセスをいう（Maniatis，T.ら、前出、146頁）。他に提供しない限り
、連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位
のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を用いて
達成され得る。
他に記載しない限り、形質転換は、Graham，F.およびVan der Eb，A.、Virolo
gy、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。
実施例１ hChat の細菌発現および精製
hChatをコードするDNA配列（ATCC受託番号第75856号）を、プロセスされたhCh
atタンパク質の５'配列（シグナルペプチド配列を除く）およびhChat遺伝子に対
して３'のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最
初に増幅する。hChatに対応するさらなるヌクレオチドを、５'および３'配列そ
れぞれに添加した。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５' CGCGAGATCCA
CCATGAAGGCTTCCAGCCGCTTC ３'を有し、Bam HI制限酵素部位（下線）、続いてプ
ロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開始する21ヌクレオチド
のhChatコード配列を含む。３'配列、５' CGCGTCTAGAAGGGTACAGATGGTGGCC ３'は
、Xba I部位（下線）に相補的な配列を含み、hChatDNAインサートの３’に位置
する18ヌクレオチドのhChat非コード配列が続く。制限酵素部位は、細菌発現ベ
クターpQE-9（Qiagen，Inc．9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）の制
限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性（Ampr）、細菌の複製起点（ori
）、IPTG調節可能プロモーター／オペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（R
BS）、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9をBam HIお
よびXb
a Iで消化する。増殖配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSを
コードする配列にインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、Qiag
enから入手可能なE ．coli m15/REP4株をSambrook，J.ら、Molecular Cloning: A
Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順によ
り形質転換する。M15/rep4は、プラスミドpREP4の多数のコピーを含み、lacIリ
プレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（Kanr）も与える。形質転換体は
LBプレート上で増殖するそれらの能力により同定され、そしてアンピシリン／カ
ナマイシン耐性コロニーが選択される。プラスミドDNAを単離して、制限分析に
より確認する。所望の構築物を含むクローンを、Amp（100μg/ml）とKan（25μg
/ml）との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させる。O/
N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大規模な培養物に接種する。細胞を、600の
光学密度（O.D.600）が0.4と0.6との間になるまで増殖させる。次いで、IPTG（
「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にす
る。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化することにより、遺伝子発現を増大させ
るためのP/Oの解放（clear）を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖する。次
いで、細胞を遠心分離により採集する。細胞ペレットをカオトロピック剤である
６MグアニジンHClで可溶化させる。明澄化後、可溶化されたhChatを、6-Hisタグ
を含むタンパク質により堅く結合させる条件下でニッケルキレートカラムでのク
ロマトグラフィーによりこの溶液から精製する（Hochuli，E.ら、J．Chromatogr
aphy 411:177-184(1984)）。hChatを、６MグアニジンHCl pH 5.0でカラムから溶
出し、そして再生の目的のために、３MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム
、10mMグルタチオン（還元型）、および２mMグルタチオン（酸化型）に調整する
。この溶液で12時間インキュベーションした後、タンパク質を10mMリン酸ナトリ
ウムに対して透析した。
実施例２ バキュロウィルス発現系を用いるhChatのクローニングおよび発現
全長のhChatタンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第75856号）を、
遺伝子の５'および３'配列に相補的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用い
て増幅する。
５'プライマーは、配列５' CGCGGGATCCACCATGAAGGCTTCCAGCCGCTTC ３'を有し
、BamHI制限酵素部位（太字）、続いて３非特異的ヌクレオチドおよび真核細胞
における翻訳の開始に効率的なシグナル（J．Mol．Biol．1987，196，947-950，
Kozak，M.）に類似するhChatをコードする21ヌクレオチドを含む。
３'プライマーは、配列５' CGCGGGTACCAGGTACAGATGGTGGCC ３'を有し、制限エ
ンドヌクレアーゼAsp718の切断部位（太字）、続いてhChatのコード領域に相補
的な16ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Geneclean」 BIO 1
01 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離する。次いで
、フラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718で消化し、次いで上述
のように再度精製する。このフラグメントを、F2と称する。
ベクターpA35(pVL941ベクターの改変体、下記)をバキュロウィルス発現系を用
いるhChatタンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers，M.D.およ
びSmith，G.E．1987，A manual of methods for baculovirus vectors and inse
ct cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bull
etin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californica
核多角体病ウィルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて制限
エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718の認識部位を含む。シミアンウィルス（S
V）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換
えウィルスを容易に選択するために、E．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子
を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロモー
ターと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト野生型ウィ
ルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウィルス配列により両端で隣接させる
。多くの他のバキュロウィルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。例え
ば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1である（Luckow，V.A.およびSummers，M.D.
、Virology，170:31-39）。
プラスミドを制限酵素BamHIおよびAsp718で消化し、次いで当該分野で公知の
手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、DNAを実
施例１に記載のように１％アガロースゲルより単離する。このベクターDNAをV2
と称する。
フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連
結する。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIおよびAsp7
18を用いて、hChat遺伝子を有するプラスミド（pBac hChat）を含む細菌を同定
する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。
５μgのプラスミドpBac hChatを、リポフェクション法（Felgnerら Proc．Na
tl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化し
たバキュロウイルス（「BaculoGoldTM baculovirus DNA」，Pharmingen，San Di
ego，CA.）とともにコトランスフェクトする。
1μgのBaculoGoldTMウィルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac hChatを、50μ
lの血清非含有グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を
含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10μlリポ
フェクチンと90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間イ
ンキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含有グ
レース培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATC
CCRL 1711）に滴下する。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために
、前後に振とうした。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートする。５
時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児
血清を補充した１mlのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベータ
ーに戻し、そして27℃で４日間培養を続ける。
４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（上述）による記載と同様
にプラークアッセイを行う。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単
離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を有
するアガロースゲルを用いる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Li
fe Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養法およびバキ
ュロウィルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。
ウィルスの連続希釈物を細胞に加えた４日後、青く染色されたプラークをエッ
ペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウィルスを含む寒天を、20
0μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁する。寒天を、短い
遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウィルスを含む上清を、35mm皿で
播種されたSf9細胞に感染させるために用いる。４日後、これらの培養皿の上清
を回収し、次いで４℃で保存する。
Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したグレース培地中で培養する。細胞を、
感染多重度（MOI）２で組換えバキュロウィルスＶ-hChatで感染させる。６時間
後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培
地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換える。42時間後、５μCi
の35Ｓ-メチオニンおよび５μCiの35Ｓシステイン（Amersham）を添加する。細
胞を、さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そ
してSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質を可視
化する。
実施例３ COS 細胞における組換えhChatの発現
プラスミド、hChat HAの発現を、ベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen）により誘
導する。ベクターpcDNAI/Ampは：１）SV40複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝
子、３）E．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イントロンそしてポリ
アデニル化部位が続くCMVプロモーター、を含有する。完全なhChat前駆体、およ
びその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメント
を、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。それゆえ、組換えタンパク
質発現はCMVプロモーター下で支配される。HAタグは、以前に記載されたような
インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（I．Wilso
n、H．Niman、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、198
4，Cell 37，767）。本発明者らの標的タンパク質に対するHAタグ融合物は、HA
エピトープを認識する抗体を用いて組換えタンパク質の容易な検出を可能にする
。
プラスミド構築戦略を以下に記述する：
hChatをコードするDNA配列（ATCC受託番号第75856号）を、２つのプライマー
を用いて、クローン化された元来のESTに対するPCRにより構築する：５'プライ
マー５' CGCGGGATCCACCATGAAGGCTTCCAGCCGCTTC ３'は、BamHI部位（太字）、続
いて開始コドンから開始するhChatコード配列の21ヌクレオチドの配列を含む；
３'配列５' CGCGTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCCTCTGCACTCAGCCCC ３
'は、XbaI部位に相補的な配列（太字）、翻訳停止コドン、HAタグ、およびhChat
コード配列の最後の18ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を
含む。それゆえ、PCR産物は、BamHI部位、インフレーム融合HAタグが続くhChat
コード配列、HAタグに隣接する翻訳終止停止コドン、およびXbaI部位を含む。PC
R増幅DNAフラグメントおよびベクター（pcDNAI/Amp）を、BamHIおよびXbaI制限
酵素により消化し、そして連結する。連結混合物を、E．coli SURE株（Stratage
ne Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037よ
り入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種
し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体より単離し、
そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試験する。組換えhChatタンパク
質の発現のために、COS細胞をDEAE-DEXTRAN法により発現ベクターでトランスフ
ェクトする（J．Sambrook、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Cloning: A L
aboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)）。hChat HAタンパ
ク質の発現を、放射標識および免疫沈降法により検出する。（E．Harlow，D．La
ne，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press
,(1988)）。細胞を、トランスフェクションの２日後、35S-システインで８時間
標識する。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤(RIPA緩衝液(150m
M NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))
で溶解する。（Wilson，I.ら、同上37:767(1984)）。細胞溶解物および培養培地
の両方を、HA特異的モノクローナル抗体により沈降させる。沈降したタンパク質
を15％ SDS-PAGEゲル上で分析する。
実施例４ ヒト組織におけるhChatの発現パターン
ノザンブロット分析をヒト組織におけるhChatの発現レベルを調査するために
行う。総細胞RNAサンプルをRNAzolTMBシステム(Biotecx Laboratories,Inc.6023
South loop East,Houston,TX77033)を用いて単離する。指定された各ヒト組織か
ら単離した約10μgの総RNAを１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィ
ルターにブロットする（Sambrook、FritschおよびManiatis、Molecular Cloning
、Cold Spring Harbor Press、(1989)）。標識反応を、50ng DNAフラグメントを
用いてStratagene PrimeItキットに従って行う。標識DNAを、Select-G-50カラム
を用いて精製する。（5Prime-3Prime、Inc.5603 Arapahoe Road、Boulder、CO 8
0303）。次いでフィルターを、0.5M NaPO4(pH7.4)および７％SDSにおいて1,000,
000 cpm/mlで放射活性標識した全長hChat遺伝子とともに、65℃で一晩ハイブリ
ダイズする。0.5×SSC、0.1％SDSを用いて、室温で２回および60℃で２回洗浄し
た後、次いで、フィルターを増感スクリーンとともに−70℃に一晩曝す。hChat
のメッセンジャーRNAは、肝臓、骨格筋、膵臓において多量に存在し、そして心
臓、腎臓、および胎盤においては幾分少ない程度で存在する（図２）。
本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、した
がって、添付の請求の範囲の範囲内で、本発明は詳細に記載されている以外にも
実施され得る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08
5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
9/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
15/02 Ａ６１Ｋ 37/52 ＡＡＭ
Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＡＢ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ｂ
//(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｎ 9/10
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 9/10
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 ヒ， ウェイ ウ.
アメリカ合衆国 メリーランド 21045,
コロンビア，フリー ストーン コート
6225
(72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20882,
レイトンズビル，ローリング ヒル ロ
ード 22400
(72)発明者 ゴーケイン， ジーンナイン ディー.
アメリカ合衆国 メリーランド 20902,
シルバー スプリング， ハーモン ロ
ード 2715