JPH10509036A

JPH10509036A - ヒトスタニオカルシン−α

Info

Publication number: JPH10509036A
Application number: JP8516006A
Authority: JP
Inventors: オルセン，ヘンリック; フレイシュマン，ロバート・ディ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1998-09-08
Also published as: AU1289695A; WO1996015147A1; AU687962B2; KR100432260B1; EP0797592A4; KR970707155A; NZ277605A; EP0797592A1

Abstract

(57)【要約】ヒトスタニオカルシン−αポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、およびそのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を開示する。そのようなポリペプチドを、腎疾患、骨疾患、および心疾患をもたらす電解質障害、並びに骨粗鬆症、およびパジェット病の治療に利用する方法もまた開示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト、並びに低カルシウム血症および骨粗鬆症を治療的に処置するためのそれらの使用もまた開示する。疾患、または変異型のスタニオカルシン−α配列に関係のある疾患に対する感受率を検出するための診断物質としてのスタニオカルシン−α配列の使用もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトスタニオカルシン−α 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、ヒトスタニオカルシン−α として推定的に同定されている。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。スタニオカルシン(以前は、テレオカルシンおよびハイポカルシンの両方として知られていた)は、硬骨魚のスタニウス小体、内分泌腺により産生される、抗高カルシウム血性の糖タンパク質ホルモンである。ヒトもまた、スタニオカルシン糖タンパク質を産生する。スタニオカルシン−αは、上皮小体ホルモン(ＰＴＨ)と同様な、報告された生物学的活性を有し、またこれらのタンパク質は両方とも、哺乳動物において二元機能を示す。それらは、魚において、恐らく骨吸収の刺激によるものであろう高カルシウム血活性(Ｅndocrinology １１９：２２４９−２２５５（１９８６）) および低カルシウム血活性を発揮する。該低カルシウム血活性は、恐らく鰓のカルシウム流入の阻害によるものであろう(Ｊ.Ｅxp.Ｂiol.、１４０：１９９−２０８（１９８８）)。さらに、ＰＴＨは、骨代謝に対して二相的作用を有する、すなわち、低用量では骨形成を増加させる一方、高用量では骨吸収を増加させる。従って、そのポリペプチド自体およびアンタゴニストは両方とも、様々な状況の下、骨粗鬆症を治療するために使用することができる。ヒト由来ではないスタニウス小体のタンパク質は、広範囲にわたって研究されている。最近、スタニウス小体のタンパク質が、Ａnguilla australisから精製されてクローン化された。硬骨魚の腎臓は、分泌顆粒、スタニウス小体を含むことが見い出されている。電子顕微鏡は、その顆粒がタンパク質様の性質のものであって、生理学的および生化学的機能が確認されていないホルモンまたは酵素を表し得ることを示す(Ｂutkus,Ａ.ら、Ｍol.Ｃell Ｅndocrinol、５４：１２３− ３３（１９８７）)。鱒のスタニウス小体から得られる糖タンパク質もまた、単離されて精製されており、これは、ハイポカルシン、魚の主要な低カルシウム血性ホルモンであると考えられている。この産物は、幾つかの種(すなわち、欧州鰻、ティラピア(tila pia)金魚、および鯉)のスタニウス小体に比較的多量に存在する。ハイポカルシンは、典型的には、実験的に誘発された血液カルシウム濃度の増加に応じて、スタニウス小体から放出される。超微細構造の観察は、この処置後、スタニウス小体のハイポカルシン産生細胞種がほとんど完全に脱顆粒することを示す。単離された糖タンパク質は、５４kＤaという見掛けの分子量を有する(Ｌafeber Ｆ.Ｐ. ら、Ｇen Ｃomp.Ｅndocrinol、６９：１９−３０（１９８８）)。さらに、最近、テレオカルシンの幾つかの合成ペプチドフラグメントが稚魚の虹鱒(Ｓalmo Ｇairdneri)においてカルシウム吸収を阻害することが示された。鰻および鮭の両方のテレオカルシンのＮ末端ペプチド(アミノ酸１〜２０)は、⁴⁵ Ｃa吸収をカルシウム吸収サイクルの高い時点で有意に阻害する(７５％まで)が、モルを基準としての該ペプチドの有効用量は、完全な分子の有効用量の２０〜２００倍であった。対照的に、鰻テレオカルシンのＣ末端フラグメント(アミノ酸２０２〜２３１)には、カルシウム吸収に対する阻害効果がなかった(Ｍillike n Ｃ.Ｅ.ら、Ｇen.Ｃomp.Ｅndocrinol、７７：４１６−２２（１９９０）)。２つの鮭スタニオカルシンの精製および特性決定、並びにインビトロおよびインビボの両方におけるモデルシステムを用いての、カルシウムに応じてのホルモン分泌調節の実験に関してもまた記載されている。鮭ＣＳ λ gt１０ cＤＮＡライブラリーから得られるコホ(coho)鮭スタニオカルシンメッセンジャーＲＮＡ (mＲＮＡ)の分子クローニングおよびcＤＮＡ配列分析が記載されている。鮭におけるスタニオカルシンmＲＮＡは、長さ約２kＤaであって、２５６個のアミノ酸からなる一次翻訳産物をコードする。最初の３３個の残基は、ホルモンのプレタンパク質領域を含むが、残りの２２３個の残基は、成熟型のホルモンを作り上げる。(Ｗagner Ｇ.Ｆ.ら、Ｍol.Ｃell Ｅndocrinol、９０：７−１５（１９９２）)。本発明のポリペプチドは、ヒトスタニオカルシン−αとして推定的に同定された。この同定は、アミノ酸配列の相同性の結果として成された。本発明の一態様により、ヒトスタニオカルシン−αである新規な推定成熟ポリペプチド、さらにはまた、生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、ヒトスタニオカルシン−αをコードする、単離された核酸分子、さらにはまた、そのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメントを提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法であって、当該タンパク質の発現、およびその後の当該タンパク質の回収を促進する条件下、ヒトスタニオカルシン−αの核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を培養することを含んでなる方法を提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、腎疾患および心疾患をもたらす電解質障害を治療するために利用する方法を提供し、また該ポリペプチドの二相的作用により、該ポリペプチドは、骨粗鬆症、パジェット病および大理石骨病を治療するために使用することができる。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明のまた別の態様により、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストを提供し、これは、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために、例えば、骨粗鬆症および低カルシウム血症の治療において使用することができる。低カルシウム血症は、カルシウムを細胞内液から捕集する、腎不全、上皮小体機能亢進症、重篤な感染、膵不全または熱傷を含め、多くの様々な原因から起こり得る。低カルシウム血症は、テタニー、痙攣、および他の関連障害を起こす。本発明のさらに別の態様により、ヒトスタニオカルシン−α配列へ特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブを提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。第１図は、ヒトスタニオカルシン−αタンパク質のcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関する標準的な３文字略号を使用する。第２図は、Ａnguilla Ａustralisから得られたスタニオカルシン(下の列)およびヒトスタニオカルシン−α(上の列)のアミノ酸比較である。１７０個のアミノ酸重複部分および５５％の総類似性において、同一アミノ酸残基が３５％ある。第３図は、ヒトスタニオカルシン(上の列)およびヒトスタニオカルシン−α( 下の列)のアミノ酸配列比較である。第４図は、細菌発現および精製後のヒトスタニオカルシン−αを示すゲルの写真である。レーン１は、標準分子量マーカーであって、レーン２およびレーン３は、両方ともヒトスタニオカルシン−αタンパク質であるが、レーン３は、より高い濃度のタンパク質を有する。第５図は、ヒトスタニオカルシン−αのバキュロウイルス発現の結果を示すゲルである。本発明の一態様により、第１図の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年７月１５日にＡＴＣＣ寄託番号第７５８３１号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、肺線維芽細胞から得られたcＤＮＡライブラリー中で発見された。それは、構造上、ヒトスタニオカルシンファミリーに関係がある。それは、約２５１個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、このうち、最初の約４０個のアミノ酸残基は推定されるリーダー配列であることから、成熟タンパク質は２１１個のアミノ酸を含んでなる。そのタンパク質は、ヒトスタニオカルシンに対し、アミノ酸範囲全体にわたり、２８％の同一性および６４％の類似性をもって、最も高い程度の相同性を示す。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、第１図に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１図のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。第１図の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場合により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／または３'といったような非コード配列。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。従って、本発明には、第１図に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１図のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１図に示すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペプチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟タンパク質が残る。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、ベクター、例えば、pＱＥ−９またはpＱＥ−６０ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であるのが好ましく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）)。本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的には保有するポリペプチドをコードする。本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するヒトスタニオカルシン−αポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはヒトスタニオカルシン−α遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyc es 、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Ｄrosophila Ｓ２およびＳf９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ− ９(Ｑiagen)、pＢＳ、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、pＢＳＫＳ、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ( Ｐharmacia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン− Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄibner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology（１９８６）)。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual，第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、(１９８９)により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。ヒトスタニオカルシン−αポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。ヒトスタニオカルシン−αの投与は、多くの電解質に基づく疾患の治療的処置に使用することができる。動脈性高血圧症の原因の１つは、Ｎa⁺−Ｋ⁺ポンプの欠陥または阻害による、血管平滑筋細胞の細胞壁を挟んでの異常なＮa⁺輸送であり、もう１つは、幾つかの型のヒト高血圧症に記載されているような、Ｎa⁺の透過性の増加である。最終的な結果は細胞内Ｎa⁺の増加であり、このことは、その細胞を血管収縮剤に対してより感受性の強いものとする。Ｃa⁺⁺がＮa⁺の後に続くことから、交感神経刺激に対する感受性の増加の原因となるのは、細胞内Ｃa⁺ ⁺ の蓄積であって、本質的にはＮa⁺ではないと仮定される。従って、ヒトスタニオカルシン−αは、低カルシウム血性物質として機能し得ることから、この細胞内Ｃa⁺⁺の増加を相殺して、高血圧症を減少させる、または予防するのに役立ち得る。さらに、高カルシウム血症は、心律動異常、昏睡、および心停止に直接関係している。従って、ヒトスタニオカルシン−αは、遊離Ｃa⁺⁺の濃度を低下させることにより、これらの障害の処置に対する治療的価値を有し得る。高血圧症はまた、腎障害にも直接関係がある。従って、正常濃度より高い、または低い電解質は、腎機能不全を引き起こして、他の障害を直接もたらし得る。例として、Ｃa⁺⁺−リンの不均衡は、筋肉および骨の疼痛、骨の脱ミネラル化、並びに脳、眼、心筋、および血管を含め、様々な器官におけるカルシウム沈着を引き起こし得る。従って、本発明のポリペプチドは、Ｃa⁺⁺−リンの不均衡による障害を相殺するために使用することができる。腎不全自体は、血液中に異常に高濃度のホスフェートをもたらすが、これは、ヒトスタニオカルシン−αにより正常な濃度まで減少させることができる。ヒトスタニオカルシン−αはまた、骨代謝に対して二相的作用を有し得る、すなわち、低用量では骨形成を増加させる一方、高用量では骨吸収を増加させるという点で、ある骨疾患の治療にも有用である。従って、低用量のヒトスタニオカルシン−αの投与は、骨粗鬆症を治療するために使用することができ、また高用量の投与は、骨皮質の著しい肥厚化、および骨髄腔の狭窄化または充填を伴う、骨の過剰増殖および硬化である、大理石骨病を治療するために使用することができる。高カルシウム血症の原因はまた、上皮小体機能亢進症、ビタミン過剰症Ｄ、骨を破壊することにより血清Ｃa⁺⁺レベルを上昇させる腫瘍、サルコイド−シス、甲状腺機能亢進症、副腎不全、血清アルブミンの損失、二次性腎疾患、過剰な胃腸カルシウム吸着、および血漿タンパク質濃度の上昇を含め、多くの様々な障害でもあり得る。従って、ヒトスタニオカルシン−αは、高カルシウム血症およびその関連障害を減少させるのに有効である。ヒトスタニオカルシン−αはまた、異常な電解質濃度および体液の不均衡に関係がある他の障害、例えば、片頭痛の治療にも使用することができる。完全な長さのヒトスタニオカルシン−α遺伝子のフラグメントは、完全な長さの遺伝子を単離するために、また該遺伝子に対する高い配列類似性、または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。この種類のプローブは、例えば、２０〜２０００塩基であり得る。好ましくは、しかし、該プローブは、３０〜５０塩基対を有する。該プローブはまた、完全な長さの転写物、並びにゲノムクローン、または調節およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンが含まれる、完全なヒトスタニオカルシン−α遺伝子を含むクローンに対応するcＤＮＡクローンを同定するのに使用することもできる。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のＤＮＡ配列を使用することによって、該遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用して、プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決定する。本発明は、ヒトスタニオカルシン−α受容体の同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られている多数の方法、例えば、リガンドパニング(panning)およびＦＡＣＳソーティングにより同定することができる(Ｃol iganら、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmun.、１（２）、第５章（１９９１）)。好ましくは、発現クローニングを利用し、ここでは、ポリアデニル化ＲＮＡをヒトスタニオカルシン−αに応答する細胞から調製して、このＲＮＡから作られる cＤＮＡライブラリーをプールに分けて、ＣＯＳ細胞またはヒトスタニオカルシン−αタンパク質に応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用する。ガラススライド上で増殖させた、トランスフェクトされた細胞を、標識化ヒトスタニオカルシン−αにさらす。該スタニオカルシン−αは、ヨウ素化または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位の包含を含め、様々な方法により標識化することができる。固定およびインキュベーションに続いて、そのスライドをオートラジオグラフ分析にかける。陽性のプールを同定して、サブプールを調製し、反復サブプーリングおよび再スクリーニング方法を利用して、再びトランスフェクトし、最終的には、推定される受容体をコードする単一クローンを得る。受容体を同定するための他の方法として、標識化ヒトスタニオカルシン−αを細胞膜と光親和性により結合させるか、または受容体分子を発現する調製物を抽出することができる。橋かけ(cross-linked)物質をＰＡＧＥにより分けて、Ｘ線フィルムにさらす。リガンド−受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラグメントに分けて、タンパク質ミクロ配列決定にかけることができる。ミクロ配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、一組の変性オリゴヌクレオチドプローブを設計し、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定される受容体をコードする遺伝子が同定されるであろう。本発明はまた、化合物をスクリーニングして、ヒトスタニオカルシン−αのアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法も提供する。例として、バイオアッセイを行うことができ、ここでは、そのアッセイ成分が、その表面上にヒトスタニオカルシン−α受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物、標識化カルシウム、例えば、⁴⁵Ｃa⁺⁺、およびスクリーニングすべき化合物を含んでなる。その化合物が有効なヒトスタニオカルシン−αアゴニストであるならば、それはヒトスタニオカルシン−α受容体リガンドによく似ているであろうことから、ヒトスタニオカルシン−αの不存在下でも、その細胞または膜による⁴⁵Ｃa⁺⁺吸収がある。その⁴⁵Ｃａ⁺⁺吸収量は、放射性標識を利用することにより測定することができる。アンタゴニストに関してスクリーニングする場合には、ヒトスタニオカルシン−αをバイオアッセイに加えて、その化合物が、ヒトスタニオカルシン −αとその受容体との相互作用を妨げることにより⁴⁵Ｃa⁺⁺吸収を阻害する能力を同じ方法で測定することができる。あるいはまた、ヒトスタニオカルシン−αとその受容体との相互作用に続いて起こる、既知の第二メッセンジャーシステムの応答は、該化合物の存在下または不存在下に測定して比較されるであろう。そのような第二メッセンジャーシステムには、これらに限定されるものではないが、cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解が含まれる。可能性のあるヒトスタニオカルシン−αアンタゴニストには、ヒトスタニオカルシン−αに結合して、その機能を排除する抗体、または幾つかの場合には、オリゴヌクレオチドが含まれる。アンタゴニストにはまた、ヒトスタニオカルシン −α受容体に結合して、その受容体をヒトスタニオカルシン−αから有効にブロックするポリペプチドも含まれる。これらのポリペプチドは、ヒトスタニオカルシン−αと密接に関係しているが、天然の生物学的機能を失ってしまっているタンパク質であり、一例は、変異型のヒトスタニオカルシン−αである。ヒトスタニオカルシン−αアンタゴニストにはまた、アンチセンス構築物も含まれる。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびＤe rvanら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照、そのことによって、転写およびヒトスタニオカルシン−αの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のヒトスタニオカルシン−αポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynucle otides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣＰress、Ｂ oca Ｒaton、ＦＬ（１９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ヒトスタニオカルシン−αタンパク質の産生を阻害することができる。ヒトスタニオカルシン−αアンタゴニストにはまた、ポリペプチドの活性部位に結合して、そのポリペプチドが生物学的機能を与えることができないようにする小さな分子も含まれる。小さな分子の例には、これらに限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含まれる。該アンタゴニストは、高濃度のヒトスタニオカルシン−αによる骨吸収の刺激をブロックするために使用することができ、また従って、骨粗鬆症を治療するために使用することができる。該ヒトスタニオカルシン−αアンタゴニストはまた、カルシウムレベルの増加が望ましい他の障害のうち、低カルシウム血症およびパジェット病を治療するために使用することもできる。該アンタゴニストは、以下に記載するような薬学上許容され得る担体と共に、組成物中で使用することができる。本発明のヒトスタニオカルシン−αポリペプチド、並びにアゴニストおよびアンタゴニスト化合物は、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような医薬組成物は、治療上有効な量の該ポリペプチド、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、該医薬組成物は、他の治療化合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、該医薬組成物は、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。該ヒトスタニオカルシン−αポリペプチド、並びにこれもまたポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストは、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することができる。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作することができる。同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知られているように、細胞をインビボにおいて操作して、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。本発明はまた、疾患、または変異したヒトスタニオカルシン−αの存在に関係のある疾患に対する感受率を検出するための診断アッセイの一部としての、スタニオカルシン−α遺伝子の使用にも関する。そのような疾患、例えば、高血圧症は、ヒトスタニオカルシン−αの発現不足と関係がある。ヒトスタニオカルシン−α遺伝子において変異が起こっている個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓaikiら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９８６）)を利用することにより、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することができる。例として、ヒトスタニオカルシン−αをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、ヒトスタニオカルシン−αの変異を同定して分析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化により検出することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化ヒトスタニオカルシン−αＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化ヒトスタニオカルシン−αアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定することができる。完全に対合している配列は、ＲＮアーゼＡ消化により、または融解温度の相違により、対合していない複式物(duplexes)と区別することができる。ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラジエントゲルを変性することで区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる(例えば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５）)。従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用( 例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）)、およびサザンブロッティングといったような方法により成し遂げることができる。さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、in situ 分析により検出することもできる。本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。配列の３'の翻訳されていない領域のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンをスパン(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、発現配列タグ(ＥＳＴ)が得られるクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２,０００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、４, ０００以上は、恐らく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔech niques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniv ersity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ｋo hlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmm unology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss，Ｉnc.、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒe s.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶa n der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。実施例１ヒトスタニオカルシン−αの細菌発現および精製最初に、ヒトスタニオカルシン−αをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５８３１号を、スタニオカルシン−αコード配列の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列：を有し、Ａfl III制限酵素部位、および推定されるメチオニン開始コドンから始まるスタニオカルシン−αコード配列の２０ヌクレオチドを含む。３'配列：は、Ｂgl II部位に対する相補的配列、続いて、スタニオカルシン−αの２０ヌクレオチドを含む。pＱＥ−６０ベクター(Ｑiagen,Ｉnc．９２５９Ｅton Ａven ue、Ｃhatsworth、ＣＡ、９１３１１)は、抗生物質耐性(Ａmp^r)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードする。pＱＥ−６０をＡfl IIIおよびＢgl IIで消化する。増幅された配列を、Ａfl IIIおよびＢgl IIで消化した後、pＱＥ−６０にライゲートして、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と共に枠内に挿入する。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｓambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress（１９８９）に記載されている手順により、Ｑiagenから入手可能なＥ.coli株Ｍ１５／rep４をトランスフォームする。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、lac Ｉリプレッサーを発現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^r)も与える。トランスフォーマントを、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同定して、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により確認する。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp(１００ug／ml) とＫan(２５ug／ml)の両方を補ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させる（Ｏ／Ｎ）。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の光学密度６００（Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)まで増殖する。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるまで加える。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加させることにより誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離(６０００×ｇで２０分)により収集する。細胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣl中で可溶化する。清澄後、この溶液から、６−ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィーにより、可溶化したスタニオカルシン−αを精製する(Ｈoch uli,Ｅ.ら、Ｇenetic Ｅngineering、Ｐrinciples ＆Ｍethods、１２：８７− ９８（１９９０）)。ＧnＨＣlからのタンパク質の再生は、幾つかのプロトコルにより成し遂げることができる。(Ｊaenicke,Ｒ.およびＲudolph,Ｒ.、Ｐrotein Ｓtructure−ＡＰractical Ａpproach、ＩＲＬＰress、ニューヨーク（１９９０）)。まず最初に、段階透析を利用して、ＧnＨＣＬを除去する。あるいはまた、Ｎi−キレートカラムから単離される精製タンパク質を、減少型リニアＧnＨＣＬグラジエントを通す第２カラムに結合させることができる。そのタンパク質をカラムに結合させる間に再生した後、２５０mＭのイミダゾール、１５０mＭのＮaＣl、２５mＭのトリス−ＨＣl(pＨ７.５)および１０％のグリセロールを含む緩衝液で溶出する。最後に、可溶性タンパク質を、５mＭの重炭酸アンモニウムを含む貯蔵緩衝液に対して透析する。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した(第４図)。実施例２ＣＯＳ細胞における組換えヒトスタニオカルシン−αの発現プラスミド、スタニオカルシン−α ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.coli 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモーターを含む、ベクターpcＤＮＡＩ／Ａmp(Ｉnvitrogen)から得られる。完全なスタニオカルシン−α前駆体およびその３'末端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮＡフラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域にクローン化したことから、組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ. Ｃonnolly、およびＲ.Ｌerner、１９８４、Ｃell３７、７６７)。ＨＡタグを標的タンパク質へ融合させることにより、組換えタンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容易に検出することが可能となる。プラスミド構築方法を以下に記載する：スタニオカルシン−αをコードするＤＮＡ配列を、２つのプライマーを用いてクローン化した、もとの発現配列タグ(ＥＳＴ)でのＰＣＲにより構築した：５'プライマー：は、Ｈind III部位、続いて、開始コドンから始まるスタニオカルシン−αコード配列の２１ヌクレオチドを含む；３'配列：は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、ＨＡタグ、およびスタニオカルシン−αコード配列の最後の２０ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む。従って、ＰＣＲ産物は、Ｈind III部位、スタニオカルシン−αコード配列、続いて、枠内で融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの隣の翻訳終了終止コドン、およびＸbaＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、Ｈind IIIよびＸbaＩ制限酵素で消化して、ライゲートさせた。そのライゲーション混合物をＥ.coli株ＳＵＲＥ(Ｓtra tagene Ｃloning Ｓystems、１１０９９Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒoad、Ｌa Ｊ olla、ＣＡ９２０３７から入手可能である)にトランスフォームし、そのトランスフォームされた培養物をアンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡをトランスフォーマントから単離して、正しいフラグメントの存在に関して制限分析により試験した。組換えスタニオカルシン−αの発現のために、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランスフェクトした(Ｊ．Ｓambrook、Ｅ.Ｆritsch、Ｔ.Ｍaniati s、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaborator y Ｐress、（１９８９）)。スタニオカルシン−αＨＡタンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降法により検出した。(Ｅ.Ｈarlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodi es：ＡＬaboratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８８）)。トランスフェクションから２日後、細胞を³⁵Ｓ−システインで８時間標識化した。次いで、細胞培地を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０ mＭＮaＣl、１％ＮＰ−４０、０.１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭトリス、pＨ７.５))で溶菌した。(Ｗilson,Ｉ.ら、同上３７：７６７（１９８４）)。細胞溶菌液および培養培地の両者を、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降させた。沈降したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。実施例３バキュロウイルス発現システムを用いてのヒトスタニオカルシン−αのクローニングおよび発現完全な長さのスタニオカルシン−αタンパク質をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５８３１号を、遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。その５'プライマーは、配列：を有し、またＢam ＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続いて、真核細胞における翻訳の開始に有効なシグナルに似ている６ヌクレオチド(Ｋozak,Ｍ.、Ｊ.Ｍol. Ｂiol.、１９６、９４７−９５０（１９８７）)、この直ぐ後に、スタニオカルシン−α遺伝子の最初の２１ヌクレオチド(翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を引く)を含む。その３'プライマーは、配列：を有し、また制限エンドヌクレアーゼＡsp ７１８の切断部位、およびスタニオカルシン−α遺伝子の３'配列に対して相補的な２１ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ１０１Ｉnc.、Ｌa Ｊol la、Ｃa.)を使用して、１％アガロースゲルから単離する。次いで、そのフラグメントをエンドヌクレアーゼＢam ＨＩおよびＡsp ７１８で消化した後、１％アガロースゲル上で再び精製する。このフラグメントをＦ２と名付ける。ベクター pＲＧ１(pＶＬ９４１ベクターの修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システムを用いてのスタニオカルシン−αタンパク質の発現に使用する(レビューには、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmith,Ｇ.Ｅ．１９８７、Ａ manua l of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures 、Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.１５５５を参照)。この発現ベクターは、オートグラファ(Ａutographa)カリフォルニアポリヘドロシスウイルス(ＡcＭＮＰＶ)の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて、制限エンドヌクレアーゼＢam ＨＩおよびＡsp ７１８の認識部位を含む。シミアンウイルス(ＳＶ)４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するため、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロモーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトした(cotransfect ed)野生型ウイルスＤＮＡの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイルス配列をポリヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターを、例えば、pＡc３７３、pＶＬ９４１、およびpＡcＩＭ１を、pＲＧ１の代わりに使用することができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.およびＳummers,Ｍ.Ｄ. 、Ｖirology、１７０：３１−３９)。プラスミドを制限酵素Ｂam ＨＩおよびＡsp ７１８で消化した後、当業界で既知の方法により、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット(「Ｇeneclean」ＢＩＯ１０１Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を使用して、ＤＮＡを１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と名付ける。フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートさせる。次いで、Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞をトランスフォームして、スタニオカルシン−α遺伝子を有するプラスミド(pＢac−スタニオカルシン −α)を含む細菌を、酵素Ｂam ＨＩおよびＡsp ７１８を使用して同定する。クローン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。リポフェクション法(Ｆelgnerら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）)を利用して、プラスミド pＢac−スタニオカルシン−α ５μgを市販の線形化バキュロウイルス(「ＢaculoＧold^TMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共に同時トランスフェクトする。ＢaculoＧold^TMウイルスＤＮＡ１μgおよびプラスミド pＢac−スタニオカルシン−α ５μgを、無血清グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc. 、Ｇaithersburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１)に滴加する。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、そのトランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０％ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加える。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養し続ける。４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳmith(上記)により記載されたようにして、プラークアッセイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔechnolo gies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲルを使用するが、このことにより、青色に染色されたプラークを容易に単離することが可能となる。(「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する利用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス学、９−１０頁にも見い出すことができる)。連続希釈の４日後に、ウイルスを細胞に加えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端で採取する。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ管内で再び懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離により除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４℃で保存する。Ｓf９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多重度(ＭＯＩ)２で組換えバキュロウイルスＶ−スタニオカルシン−αを感染させる。６時間後、その培地を除去して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II 培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaither sburg)に替える。４２時間後、５μＣiの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの³⁵Ｓシステイン５μＣi(Ａmersham)を加える。その細胞をさらに１６時間インキュベートした後、それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質を、ＳＤＳ− ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化する(第５図)。第５図において、ゲルは、スタニオカルシン−αがホモダイマーとして存在することを示す。先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＥＤＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ０７Ｋ 14/575 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 16/26 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤＣ１２Ｎ 1/21 ＡＢＹ 5/10 ＡＤＴＣ１２Ｐ 21/02 ＡＢＪＣ１２Ｑ 1/02 ＡＤＦ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３１号に含まれるcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド；よりなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．該ポリヌクレオチドが、第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．該ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３１号のcＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．第１図に示すポリペプチドのコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。９．請求項８に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。１０．ポリペプチドを製造する方法であって、該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項９に記載の宿主細胞から発現させることを含んでなる方法。１１．ポリペプチドを発現させることができる細胞を製造する方法であって、細胞を請求項８に記載のベクターで遺伝的に操作することを含んでなる方法。１２．請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であって、ヒトスタニオカルシン−α活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ。１３．（ｉ）第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにそのフラグメント、アナログおよび誘導体；および（ii）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３１号のcＤＮＡによりコードされるポリペプチド、並びに該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体；よりなる群から選択されるポリペプチド。１４．ポリペプチドが第１図の推定アミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のポリペプチド。１５．請求項１３に記載のポリペプチドに対する抗体。１６．請求項１３に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。１７．請求項１３に記載のポリペプチドに対するアゴニスト。１８．ヒトスタニオカルシン−αを必要とする患者の治療方法であって、治療上有効な量の、請求項１３に記載のポリペプチドを患者に投与することを含んでなる方法。１９．ヒトスタニオカルシン−αを阻害する必要がある患者の治療方法であって、治療上有効な量の、請求項１６に記載のアンタゴニストを患者に投与することを含んでなる方法。２０．該ポリペプチドをコードするＤＮＡを患者に与えて、該ポリペプチドをインビボにおいて発現させることにより、治療上有効な量の該ポリペプチドを投与する、請求項１８に記載の方法。２１．アゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法であって、哺乳動物細胞をその表面上でのスタニオカルシン−α受容体の発現のために調製し；場合により、スタニオカルシン−αの存在下、その哺乳動物細胞、標識化カルシウム、およびスクリーニングすべき化合物を混合し；およびその化合物がカルシウム吸収を刺激するか、または阻害するかどうかを測定する；ことを含んでなる方法。２２．疾患、またはヒトスタニオカルシン−αポリペプチドの発現不足に関係のある疾患に対する感受率を診断する方法であって、宿主から得られた試料より、ヒトスタニオカルシン−αをコードする核酸配列を単離し；およびヒトスタニオカルシン−α核酸配列における変異を測定する；ことを含んでなる方法。