DE69936192T2

DE69936192T2 - Menschliches stanniocalcin und seine verwendung zur hemmung der adipogenese

Info

Publication number: DE69936192T2
Application number: DE69936192T
Authority: DE
Inventors: Masaaki Goto; Akihiro Tomoyasu; Kazuki Nishiura Heights 3-1 YANO; Fumie Kobayashi; Nobuaki Nishiura Heights 2-4 NAKAGAWA; Hisataka Yasuda; Kyoji Yamaguchi; Masahiko Kinosaki; Shin-Ichi Mochizuki; Tadashi Nakakarumai; Tomonori Morinaga; Eisuke Daiyaparesu Jichiidai 5-Banka TSUDA; Kanji Higashio
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-04-10
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2019-04-10
Also published as: WO1999053056A1; DE69936192D1; EP1070758A1; CA2325390A1; US7252973B1; EP1070758B1; AU3167999A; ATE363534T1; ES2288016T3; EP1070758A4

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Adipogeneseinhibitionsfaktor (ADIF), der ein neuartiges Protein mit Aktivität zur Unterdrückung einer Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten hat, sowie Verfahren für seine Herstellung.
Das erfindungsgemäße Protein ist als pharmazeutische Zusammensetzung zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von Fettleibigkeit oder als ein Antigen für die Erstellung immunologischer Diagnosen von Nutzen.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Fettleibigkeit ist ein Risikofaktor für Krankheiten wie Diabetes mellitus, Hypertonie und Herzkrankheiten, die eine Gesundheitsbedrohung für Menschen in fortschrittlichen Ländern darstellen. Fettleibigkeit steht für physische Bedingungen mit einer anormalen Ansammlung von Fettgewebe. Fettgewebe ist ein spezielles Organ, in dem überschüssige In-vivo-Energie als Fett oder Triglycerid gespeichert wird und das aus Fibroblasten, einschließlich Adipozyten und ihrer Vorläufer, Makrophagen, blutgefäßumgebenden Zellen, Blutzellen und dergleichen, aufgebaut ist.
Es heißt, Adipozyten machen 1/3 bis 2/3 der in Fettgewebe vorliegenden Zellen aus und sammeln Fette oder Triglyceride darin an. Adipozyten differenzieren und reifen im Laufe eines Prozesses, der bei mesenchymalen multipotenten Stammzellen beginnt und bei dem es zur Entwicklung in Lipoblasten, die zu einem Grundstock für Adipozyten geworden sind, Vorläuferadipozyten ohne Lipidtröpfchen, aber mit Adipozyten-Anfangsmarkern, unreife Adipozyten, die Lipidtröpfchen enthalten, und schließlich in reife Adipozyten kommt, die eine große Menge an akkumulierten Fetten enthalten. Adipozyten von Erwachsenen, die an leichter Fettleibigkeit leiden, wachsen infolge einer Zunahme der akkumulierten Triglyceridmenge hypertroph. Die Adipozytenzahl nimmt mit dem Grad an offensichtlicher Fettleibigkeit zu. Durch eine Verringerung der Adipozytenzahl durch Kontrollieren der Differenzierung und Maturation oder Unterdrückung der Hypertrophie reifer Adipozyten wird der Fortschritt der Fettleibigkeit folglich voraussichtlich gestoppt, indem die Zunahme der akkumulierten Fettmenge unterdrückt wird, und die Fettleibigkeit behandelt. Es hat sich gezeigt, dass eine Kontrolle der In-vivo-Adipozytendifferenzierung je nach einer Reihe von äußeren Umständen wie Nahrungsaufnahme, Bewegung und so weiter positiv oder negativ abläuft. Im Hinblick auf Cytokine, die die Differenzierung von Adipozyten von Adipozytenvorläufern kontrollieren, wurde über den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α; Torti F. M. et al., Science, Bd. 229, S. 867 (1985)), den Transforming Growth Factor-β (Ignotz R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82, S. 8530 (1985)), den Präadipozytenfaktor-1 (Pref-1: Smas C.M. et al., Cell, Bd. 73, S. 725 (1993)) und dergleichen berichtet. Darüber hinaus wurde über Leptin, ein Translationsprodukt eines ob-Gens, das kürzlich kloniert wurde, berichtet, das möglicherweise die Aufnahmemenge und das Gewicht von Fettgewebe über das Zentralnervensystem verringert (Levin N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 93, S. 1726, 1996).
Ferner erlangen das intrazerebrale Peptid-Neuropeptid Y, das einen starken Appetitstimulationseffekt aufweist, und sein Rezeptor als Materialien für die Entwicklung eines Pharmazeutikums zur Unterdrückung von Fettleibigkeit Aufmerksamkeit (Sainsburg A. et al, Diabetologia, Bd. 39, S. 353, 1996). Diese Cytokine werden aufgrund ihrer Adipozytenhemmwirkung auf eine Akkumulation von Fett wohl zu einem Therapeutikum für Fettleibigkeit. Klinische Tests im Hinblick auf ein Mittel zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen Fettleibigkeit werden an einigen dieser Cytokine wie Leptin durchgeführt.
Derzeit ist im Handel ein Mittel zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen Fettleibigkeit in den USA unter der Bezeichnung Redux^TM (American Home Products Co.) erhältlich. Andere Wirkstoffe wie Meridia (Kunol Col) und Xenical (Roche Co.) werden eine Zulassung als Mittel zur Behandlung von Fettleibigkeit oder als Fettabsorptionsinhibitor in den USA erhalten. Die Behandlungsmethoden mit diesen Pharmazeutika sind im Hinblick auf die Effekte und therapeutischen Ergebnisse jedoch nicht unbedingt zufrieden stellend. Die Entwicklung eines neuen verfügbaren Mittels, das für diese Pharmazeutika einen stärkeren Heileffekt und weniger Nebenwirkungen verwendbar aufweist, sind wünschenswert.
Die WO 96/15147 und Chang et al, Molecular and Cellular, Bd. 141, S. 95-99, 1998, betreffen die Identifizierung der Polypeptide Stanniocalcin-α und Stanniocalcin-2, die ähnliche Aminosäuresequenzen wie die von den Autoren der vorliegenden Erfindung untersuchten Proteine haben.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Infolge umfangreicher Untersuchungen zur Entdeckung einer neuartigen Verbindung mit einem Antiadipositaseffekt oder einem Adipositaskontrolleffekt haben die Autoren der vorliegenden Erfindung ein Protein gefunden, das eine Adipogeneseinhibitionsaktivität, d.h. eine Aktivität zur Unterdrückung einer Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten, in einer Kulturbrühe aus humanen fötalen Lungenfibroblasten IMR-90 (hinterlegt bei ATCC, Hinterlegungsnummer CCL186) aufweist. Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben ferner ein Verfahren zum Akkumulieren dieses Proteins in einer hohen Konzentration durch Kultivieren der Zellen unter Verwendung von Aluminiumoxidkeramikstücken als Zellmatrix und zum effizienten Reinigen des Proteins gefunden. Ferner haben die Autoren der vorliegenden Erfindung auch ein effizientes Verfahren zum Isolieren des Proteins von der oben genannten Kulturbrühe durch aufeinander folgendes Wiederholen von Adsorption und Elution mit einer Ionenaustauschsäule, Affinitätssäule und Umkehrphasensäule entwickelt.
Im Speziellen ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Adipogeneseinhibitionsfaktor (ADIF), der ein neuartiges Protein mit einer Aktivität zur Unterdrückung einer Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Proteins von einer Kulturbrühe bereitzustellen, die durch Kultivieren humaner Fibroblasten erhalten wird.
Die vorliegende Anmeldung stellt eine cDNA, die das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins unter Verwendung der cDNA bereit.
Wie oben beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung einen Adipogeneseinhibitionsfaktor (nachfolgend gelegentlich „ADIF" genannt), der ein neuartiges Protein mit einer Aktivität zur Unterdrückung einer Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Proteins.
Das erfindungsgemäße Protein ist ein isoliertes Protein gemäß Anspruch 1.
Das Verfahren zum Erzeugen des erfindungsgemäßen Proteins beinhaltet das Kultivieren von humanen fötalen Lungenfibroblasten auf Aluminiumoxidkeramikstücken und Reinigen der Kulturbrühe durch Chromatographie unter Verwendung einer Ionenaustauschsäule, Heparinaffinitätssäule und Umkehrphasensäule.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Elutionsprofil von ADIF-Rohprotein (Superose-12-Fraktion im Beispiel 3, vii); Probe 7) von der Heparin-5PW-Säule.
2 zeigt das Elutionsprofil von ADIF-Rohprotein (Heparin-5PW-Fraktion im Beispiel 3, viii); Probe 8) von der Polycat-A-Säule.
3 zeigt das Elutionsprofil von ADIF-Protein (Polycat-A-Fraktionen in Beispiel 3, ix) von einer Umkehrphasensäule.
4 zeigt eine ADIF-Aktivität der Peak-5-Fraktion, eluiert von einer Umkehrphasensäule.
5 zeigt die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese des schließlich gereinigten ADIF-Proteins unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen.
(Erläuterung der Symbole)

Bahn 1: Molekülmassenmarker (SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen)
Bahn 2: ADIF (SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen)
Bahn 3: Molekülmassenmarker (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen)
Bahn 4: ADIF (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen)

6 zeigt die SDS-PAGE nach der Behandlung des schließlich gereinigten Produkts mit N-Glycanase.
(Erläuterung der Symbole)

Bahn 1: Molekülmassenmarker
Bahn 2: Unbehandelter ADIF
Bahn 3: ADIF, das mit N-Glycanase behandelt wurde, um Zuckerketten des N-Bindetyps zu entfernen

7 zeigt die ADIF-Aktivität aus Beispiel 16.
BESTE ART DER UMSETZUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein ADIF-Protein mit einer Aktivität zur Unterdrückung einer Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten, die von humanen Fibroblasten stammen, mit einer relativen Molekülmasse gemäß SDS-PAGE von etwa 45 kD unter nicht reduzierenden Bedingungen, etwa 28 kD und/oder 23 kD unter reduzierenden Bedingungen, und mit Affinität zu Heparin. Das erfindungsgemäße Protein ADIF hat eine scheinbare relative Molekülmasse von etwa 18 kD gemäß SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, wenn Zuckerketten des N-Bindetyps durch eine N-Glycanase-Behandlung entfernt werden. Das erfindungsgemäße Protein ADIF unterdrückt den Prozess der Differenzierung und/oder Maturation von Lipoblasten, Vorläufern von Adipozyten oder unreifen Aidpozyten, in reife Adipozyten, die eine große Menge an akkumulierten Fetten enthalten. Das erfindungsgemäße Protein ADIF unterscheidet sich deutlich von bekannten Adipogeneseinhibitionsfaktoren hinsichtlich der relativen Molekülmasse oder der N-terminalen Aminosäuresequenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Proteins ADIF, das das Kultivieren von humanen fötalen Lungenfibroblasten auf Aluminiumoxidkeramikstücken, das Auftragen der Kulturbrühe auf eine Heparinsäule, Eluieren adsorbierter Fraktionen, Laden der Fraktionen auf eine Kationenaustauschsäule und Eluieren der adsorbierten Fraktionen und Weiterbehandeln der Fraktionen mit einer Anionenaustauschsäule, Gelfiltrationssäule und Umkehrphasensäule beinhaltet, wodurch das Protein ADIF gereinigt und aufgefangen wird.
In der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Säulenbehandlung nicht nur eine Behandlung, um eine Kulturbrühe durch eine Heparinsepharosesäule oder dergleichen fließen zu lassen, sondern auch eine Behandlung, die den gleichen Effekt wie die Säulenbehandlung hervorruft, wie Mischen und Verrühren der Kulturbrühe mit Heparinsepharose oder dergleichen durch ein diskontinuierliches Verfahren (in der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „Säulenbehandlung" in diesem Sinne verwendet).
In der vorliegenden Erfindung kann das Protein auch effizient durch Kultivieren der humanen fötalen Lungenfibroblasten unter Verwendung von Aluminiumoxidkeramikstücken als Zelladhäsionsträger produziert werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine cDNA, die das Protein ADIF kodiert, das Protein ADIF, das durch Gentechnik unter Verwendung der cDNA erzeugt wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Proteins ADIF.
Das erfindungsgemäße Protein ADIF kann effizient von einer Kulturbrühe aus humanen fötalen Lungenfibroblasten isoliert und gereinigt werden. Die als Produktionszellen verwendeten humanen Fibroblasten unterliegen zwar keinen speziellen Beschränkungen, aber humane embryonale Lungenfibroblaten IMR-90 (hinterlegt bei ATCC, Hinterlegungsnummer CCL186) werden besonders bevorzugt. Die humanen fötalen Lungenfibroblasten lässt man an Aluminiumoxidkeramikstücken anhaften und kultiviert sie dann eine Woche bis zehn Tage lang statisch in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), dem neonatales Rinderserum zugegeben wird, in einem T-Kolben oder einer Rollerflasche. Das erfindungsgemäße Protein ADIF wird von dieser Kulturbrühe isoliert und gereinigt. Als Isolations- und Reinigungsverfahren können verschiedene Reinigungsprozesse unter Verwendung der physikalischen oder chemischen Charakteristiken des Zielproteins ADIF gemäß konventionellen Verfahren durchgeführt werden, die zum Reinigen von Proteinen von biologischen Proben angewendet werden. Als Konzentrationsverfahren können konventionelle Verfahren wie Ultrafiltration, Gefriertrocknung, Aussalzung und dergleichen angewendet werden. Als Reinigungsmittel können verschiedene Reinigungsvorgänge, die üblicherweise zur Reinigung von Proteinen angewendet werden, wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Hydrophobchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, präparative Elektrophorese und dergleichen entweder eigenständig oder in Kombination angewendet werden. Ein Tensid kann zugegeben werden, wenn das erfindungsgemäße Protein aus der Kulturbrühe gereinigt wird. Das verwendete Tensid unterliegt zwar in diesem Fall keinen speziellen Beschränkungen, aber es werden bevorzugt 0,1 % CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat), 0,01 % Polysorbat 80 oder 0,01 % Polysorbat 20 verwendet. Die Isolation und Reinigung des erfindungsgemäßen Proteins ADIF durch Bearbeiten der Kulturbrühe in der Reihefolge von Heparinsäule, SP-Kationenaustauschsäule, Q-Anionenaustauschsäule, Gelfiltrationssäule, Heparinsäule, schwachen Kationenaustauschsäule und Umkehrphasensäule wird besonders bevorzugt. Das erfindungsgemäße Protein ADIF kann anhand der folgenden biologischen und physikochemischen Charakteristiken spezifiziert werden:

(a) Aktivität: unterdrückt eine Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten,
(b) relative Molekülmasse (gemäß SDS-PAGE): hat eine relative Molekülmasse von etwa 45 kD unter nicht reduzierenden Bedingungen und etwa 28 kD und/oder 23 kD unter reduzierenden Bedingungen,
(c) Affinität: hat Affinität zu Heparin,
(d) enthält Zucker,
(e) N-terminale Aminosäuresequenz:

(Xaa steht für eine nicht identifizierte Aminosäure)

Das erfindungsgemäße ADIF-Protein kann auch durch ein Gentechnikverfahren produziert werden. Im Speziellen wird eine cDNA, die dieses Protein kodiert, auf der Basis der Informationen der Aminosäuresequenz von natürlichem ADIF, das mit dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wird, kloniert, und durch ein Gentechnikverfahren wird diese cDNA veranlasst, ein genrekombinantes ADIF zu exprimieren. Spezieller wird die N-terminale Aminosäuresequenz des durch die vorliegende Erfindung erzeugten natürlichen ADIF analysiert und es wird ein Gemisch aus Oligonucleotiden hergestellt, die diese Sequenz kodieren können. Als nächstes werden ADIF cDNA-Fragmente mit dem PCR-Verfahren (vorzugsweise dem RT-PCR-Verfahren) unter Verwendung des Oligonucleotidgemischs als Primer gewonnen. Die Volllängen-cDNA von ADIF kann durch Klonieren der cDNA-Bibliothek erhalten werden, die von IMR-90-Zellen hergestellt wird, indem die cDNA-Fragmente als Sonde verwendet werden (Sequenztabelle, Sequenz-ID-Nr. 12).
Ein genrekombinantes ADIF-Protein kann erhalten werden durch Einfügen der resultierenden Volllängen-cDNA in einen Expressionsvektor, um ein ADIF-Expressionsplasmid zu erzeugen, Einfügen des Plasmids in verschiedene Mikroorganismen oder Tierzellen und Bewirken einer Expression des ADIF. Das so erhaltene genrekombinante ADIF hat die gleichen physikochemischen Charakteristiken wie das oben beschriebene natürliche ADIF und seine N-terminale Aminosäuresequenz ist wie folgt (dieselbe Sequenz ist in der Sequenztabelle, Sequenz-ID-Nr. 3 dargestellt).
N-terminale Aminosäuresequenz (von cDNA erwartet):
Die biologische Aktivität von ADIF kann durch Einschätzen der Unterdrückungswirkung einer durch Dexamethason induzierten Adipogenese, mit einer Verzögerung der Triglyceridakkumulation, unter Verwendung einer Maus-Präadipozytenzellen als Target mit dem Verfahren von Kodama H. et al. (Journal of Cellular Physiology, Bd. 112, S. 83 (1982)) bestimmt werden.
Der Adipogeneseinhibitionsfaktor (ADIF), der das erfindungsgemäße Protein ist, ist als eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Fettleibigkeit oder als ein Antigen für die Erstellung immunologischer Diagnosen von Nutzen. ADIF kann unbedenklich an Menschen und Tiere verabreicht werden. ADIF kann als ein Präparat hergestellt und entweder oral oder parenteral verabreicht werden. Zu Beispielen für die pharmazeutische Zusammensetzung gehören Zusammensetzungen für Injektionen, Tropfinfusionen, Suppositorien, nasale Mittel, sublinguale Mittel, perkutane Absorptionsmittel und dergleichen. Diese Zusammensetzungen werden mit bekannten pharmazeutischen Herstellungsverfahren unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Vehikeln, Stabilisatoren, Färbemitteln, Tensiden und/oder anderen Zusatzstoffen formuliert und zu Zielpräparaten verarbeitet. Bei der Herstellung von Zusammensetzungen für Injektionen kann eine pharmakologisch wirksame Menge des Adipogeneseinhibitionsfaktors der vorliegenden Erfindung mit pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln oder Aktivierungsmitteln wie Aminosäuren, Saccharide, Cellulosederivate und andere organische/anorganische Verbindungen vermischt werden. Bei der Herstellung einer Zusammensetzung für Injektionen aus dem erfindungsgemäßen Adipogeneseinhibitionsfaktor und solchen Vehikeln oder Aktivierungsmitteln können ferner bei Bedarf ein Mittel zum Einstellen des pH-Wertes, ein Puffermittel, Stabilisator, Solubilisierungsmittel und dergleichen mit einem konventionellen Verfahren zugegeben werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlicher anhand von Beispielen beschrieben. Es ist jedoch zu verstehen, dass die Beispiele lediglich Illustrationszwecken dienen und die Erfindung nicht beschränken.
1. Beispiel
(Herstellung einer Kulturbrühe aus humanen Fibroblasten IMR-90)
Humane fötale Lungenfibroblasten IMR-90 (hinterlegt bei ATCC, Hinterlegungsnummer CCL186) wurden auf 80 g Aluminiumoxidkeramikstücken (Aluminiumoxid: 99,5 %, hergestellt von Toshiba Ceramic Corp.) kultiviert und in Rollerflaschen (490 cm², 110 × 171 mm, hergestellt von Coming Co.) kultiviert. Die Kultivierung fand unter Verwendung von 40 Rollerflaschen mit jeweils 500 ml DMEM, das mit 5 % neonatalem Rinderserum und 10 mM HEPES (Gibco BRL) angereichert war, bei 37°C in Anwesenheit von 5 % CO₂ über einen Zeitraum von 7 bis 10 Tagen ohne Drehen der Flaschen statt. Nach dem Kultivieren wurde die Kulturbrühe geerntet und frisches Medium wurde zugegeben, um einen Kultivierungszyklus abzuschließen. In jedem Kultivierungszyklus wurden 20 l IMR-90-Kulturbrühe gewonnen. Die Kulturbrühe wurde Probe 1 genannt.
2. Beispiel
(Messung der Aktivität zur Unterdrückung der Adipozytenbildung)
Die Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins ADIF wurde mit dem Verfahren von Kodama H. et al. gemessen (Journal of Cellular Physiology, Bd. 112, S. 83, (1982)). Im Speziellen wurde die Unterdrückungsaktivität durch Einschätzen der durch Dexamethason induzierten Adipogenese anhand der Triglyceridakkumulation unter Verwendung einer Maus-Präadipozytenzelle MC373-G2PA6 (RIKEN GENE BANK, RCB1127) als Target bestimmt. Im Speziellen wurden 50 μl einer Probe, die mit α-MEM (Gibco BRL) verdünnt war, das 10 % fötales Rinderserum enthielt, in eine 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben. Maus-Präadipozyten-MC373-G2/PA6-Zellen wurden in α-MEM suspendiert, das 2 × 10^-7 M Dexamethason und 10 % fötales Rinderserum enthielt, in die Mikrotiterplatte auf eine Zellkonzentration von 3 × 10³/50 μl/Well inokuliert und eine Woche lang unter Bedingungen mit 5 % CO₂, 37°C und 100 % Feuchtigkeit inkubiert. Nach sieben Tagen wurde das Medium durch Aspiration entfernt und die Zellen wurden getrocknet, um die Menge an in den Adipozyten akkumuliertem Triglycerid mit einem Triglycerid-Testkit (Triglyceride G-Test Wako, hergestellt von Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) zu messen. Der OD-Rückgang bei 510 nm wurde als ADIF-Aktivität genommen.
3. Beispiel
(Reinigung von ADIF)
i) Reinigung auf einer Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule
Etwa 60 l einer IMR-90-Kulturbrühe (Probe 1) wurden mit einem 0,22-μm-Filter (Hydrophilic Milldisk, 2000 cm², hergestellt von Millipore Co.) filtriert und in drei Teile unterteilt. Die jeweiligen Teile (20 l) wurden auf eine Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (5 × 4,1 cm, Gelvolumen 80 ml) aufgetragen, die mit einem 10 mM Tris-HCl-Puffer mit 0,3 M NaCl (pH 7,5) äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) (nachfolgend „Tris-HCl" genannt) mit einer Fließgeschwindigkeit von 500 ml/h wurde die Probe mit Tris-HCl, das 2 M NaCl (pH 7,5) enthielt, eluiert, um 1,5 l einer Heparin-Sepharose-CL-6B-adsorbierten Fraktion zu erhalten, die Probe 2 genannt wurde.
ii) Reinigung auf einer HiLoad-SP/HP-Säule
Die Heparin-Sepharose-adsorbierte Fraktion (Probe 2) wurde gegen 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) dialysiert, mit CHAPS auf eine Endkonzentration von 0,1 % angereichert, über Nacht bei 4°C inkubiert und in sechs Teile unterteilt. Die jeweiligen Teile wurden dann auf eine Kationenaustauschsäule (HiLoad-SP/HP, 2,6 × 10 cm, Amasham-Pharmacia Biotech Co.) aufgetragen, die mit 50 mM Tris-HCl, das 0,1 % CHAPS (pH 7,5) enthielt, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), das 0,1 % CHAPS enthielt, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradient von 0 bis 0,5 M NaCl über einen Zeitraum von 120 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 6 ml/min eluiert und es wurden 12-ml-Fraktionen aufgefangen. Mit 30 μl jeder Fraktion wurde die ADIF-Aktivität mit dem im 2. Beispiel beschriebenen Verfahren gemessen. ADIF-aktive Fraktionen (936 ml), die bei NaCl-Konzentrationen von etwa 0,15 bis 0,25 M eluierten, wurden gewonnen und Probe 3 genannt.
iii) Reinigung auf einer HiLoad-Q/HP-Säule
Die resultierende Probe 3 wurde mit 1900 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) mit 0,1 % CHAPS verdünnt und in sechs Teile unterteilt. Die jeweiligen Teile wurden auf eine Kationenaustauschsäule (HiLoad-Q/HP, 2,6 × 10 cm, Amasham-Pharmacia Biotech Co.) aufgetragen, die mit 50 mM Tris-HCl, das 0,1 % CHAPS (pH 7,5) enthielt, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), das 0,1 % CHAPS enthielt, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradient von 0 bis 0,5 M NaCl über einen Zeitraum von 120 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 6 ml/min eluiert und es wurden 12-ml-Fraktionen aufgefangen. Mit 30 μl jeder Fraktion wurde die ADIF-Aktivität gemäß dem im 2. Beispiel beschriebenen Verfahren gemessen. Es wurde eine Fraktion (936 ml), die bei NaCl-Konzentrationen von etwa 0,1 bis 0,18 M eluierte, mit ADIF-Aktivität gefunden, die Probe 4 genannt wurde.
iv) Reinigung auf einer iLoad-SP/HP-Säule
Die resultierende Probe 4 wurde mit 1900 ml 50 mM Bis-Tris-HCl (pH 6,0), das 0,1 % CHAPS enthielt, verdünnt und in drei Teile unterteilt. Die jeweiligen Teile wurden auf eine Kationenaustauschsäule (HiLoad-SP/HP, 2,6 × 10 cm, Amasham-Pharmacia Biotech Co.) aufgetragen, die mit 50 mM Bis-Tris-HCl, das 0,1 % CHAPs (pH 6,0) enthielt, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Bis-Tris-HCl (pH 6,0), das 0,1 % CHAPS enthielt, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradient von 0,1 bis 0,6 M NaCl über einen Zeitraum von 100 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 6 ml/min eluiert und 12-ml-Fraktionen wurden aufgefangen. Mit 30 μl jeder Fraktion wurde die ADIF-Aktivität mit dem im 2. Beispiel beschriebenen Verfahren gemessen. Eine Fraktion (360 ml), die bei NaCl-Konzentrationen von etwa 0,3 bis 0,45 M eluierte, wies ADIF-Aktivität auf und wurde Probe 5 genannt.
v) Reinigung auf einer Resource-S-Säule
Die resultierende Probe 5 wurde mit 1080 ml 50 mM Bis-Tris-HCl (pH 6,0), das 0,1 % CHAPS enthielt, verdünnt und in drei Teile unterteilt. Die jeweiligen Teile wurden auf eine Kationenaustauschsäule (Resource S, 0,5 × 5 cm, Amasham-Pharmacia Biotech Co.), die mit 50 mM Bis-Tris-HCl, das 0,1 % CHAPS (pH 6,0) enthielt, äquilibriert worden war, in drei Portionen aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Bis-Tris-HCl (pH 6,0), das 0,1 % CHAPS enthielt, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradient von 0 bis 0,6 M NaCl über einen Zeitraum von 40 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert und es wurden 1-ml-Fraktionen aufgefangen. Mit 10 μl jeder Fraktion wurde die ADIF-Aktivität mit dem im 2. Beispiel beschriebenen Verfahren gemessen. Eine Fraktion (30 ml), die bei NaCl-Konzentrationen von etwa 0,2 bis 0,3 M eluierte, wies ADIF-Aktivität auf und wurde Probe 6 genannt.
vi) Reinigung auf einer Superose-12-Säule
Die resultierende Probe 6 wurde mit einem Zentrifugenkonzentrator (Centricon 10, Millipore Co.) auf etwa 600 μl konzentriert und in drei Teile unterteilt. Die jeweiligen Teile wurde auf eine Gelfiltrationssäule (Superose 12, 1,0 × 60 cm, Amasham-Pharmacia Biotech Co.) aufgetragen, die mit 50 mM Tris-HCl, das 0,1 % CHAPS und 0,5 M NaCl (pH 7,5) enthielt, äquilibriert worden war. Die Proteine wurden mit 50 mM Tris-HCl, das 0,1 % CHAPS und 0,5 M NaCl (pH 7,5) enthielt, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min behandelt und es wurden 0,5-ml-Fraktionen aufgefangen. Mit 10 μl jeder Fraktion wurde die ADIF-Aktivität mit dem im 2. Beispiel beschriebenen Verfahren gemessen. Eine Fraktion (9 ml), die sich zwischen etwa 25 und 30 Minuten entwickelte, wies ADIF-Aktivität auf und wurde Probe 7 genannt.
vii) Reinigung auf einer Heparin-5PW-Säule
Die resultierende Probe 7 wurde mit 41 ml 50 mM Bis-Tris-HCl (pH 6,0), das 0,1 % CHAPS enthielt, verdünnt und auf eine Heparin-Affinitätssäule (Heparin 5PW, 0,5 × 5 cm, Tosoh Corporation) aufgetragen, die mit 50 mM Bis-Tris-HCl, das 0,1 % CHAPS (pH 6,0) enthielt, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Bis Tris-HCl (pH 6,0), das 0,1 % CHAPS enthielt, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradient von 0,2 bis 0,8 M NaCl über einen Zeitraum von 120 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert und es wurden 1-ml-Fraktionen aufgefangen. Mit 10 μl von jeder Fraktion wurde die ADIF-Aktivität gemäß dem im 2. Beispiel beschriebenen Verfahren gemessen. Eine Fraktion (16 ml), die bei NaCl-Konzentrationen von etwa 0,2 bis 0,3 M eluierte, wies ADIF-Aktivität auf und wurde Probe 8 genannt.
viii) Reinigung auf einer Polycat-A-Säule
Die resultierende Probe 8 wurde mit einem Zentrifugenkonzentrator (Centricon 10, hergestellt von Millipore Co.) auf etwa 300 μl konzentriert, mit 600 μl 50 mM Bis Tris-HCl, das 0,1 % CHAPS (pH 6,0) enthielt, verdünnt und auf eine äquilibrierte schwache Kationenaustauschsäule (Polycat A, 0,46 × 20 cm, Poly LC Co.) aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Bis-Tris-HCl (pH 6,0), das 0,1 % CHAPS enthielt, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradient von 0 bis 0,4 M NaCl über einen Zeitraum von 50 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert und es wurden 1-ml-Fraktionen aufgefangen (2). Mit 10 μl jeder Fraktion wurde die ADIF-Aktivität mit dem im 2. Beispiel beschriebenen Verfahren gemessen. Eine Fraktion der Fraktionsnummern 37 bis 46, die bei NaCl-Konzentrationen von etwa 0,3 bis 0,4 M NaCl eluierte, hatte ADIF-Aktivität.
ix) Reinigung auf einer Umkehrphasensäule
Ein ml der resultierenden Polycat-A-Fraktion Nr. 43 wurde mit 10 μl 20 %iger TFA (Trifluoressigsäure) angesäuert und auf eine Umkehrphasensäule (C4, 2,1 × 250 mm, VYDAC Co.) aufgetragen, die mit 30 % Acetonitril, das 0,1 % TFA enthielt, äquilibriert worden war. Das adsorbierte Protein wurde mit einem linearen Gradient von 30 bis 55 % Acetonitril über einen Zeitraum von 50 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min eluiert, jeder Protein-Peak wurde aufgefangen (3). Die ADIF-Aktivität wurde mit dem im 2. Beispiel beschriebenen Verfahren mit 35 μl jeder Peakfraktion gemessen. Peak 5 weist eine konzentrationsabhängige ADIF-Aktivität auf.
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
4. Beispiel
(Bestimmung der relativen Molekülmasse des ADIF-Proteins)
Einhundert μl der Fraktion bei Peak 5 mit ADIF-Aktivität wurden einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen unterzogen. Im Speziellen wurden 50 μl der Peak-5-Fraktion unter Vakuum konzentriert und in 1,5 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8), das 1 mM EDTA, 2,5 % SDS und 0,01 % Bromphenolblau enthielt, gelöst und über Nacht bei 37°C unter reduzierenden Bedingungen (in Anwesenheit von 5 % 2-Mercaptoethanol) oder über Nacht bei 37° unter nicht reduzierenden Bedingungen inkubiert, und jeweils 1 μl der Probe wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektroporese analysiert. Die Elektrophorese fand mit einem Gradientengel mit 10-15 % Acrylamid (Amasham Pharmacia Biotech Co.) und der Elektrophoresevorrichtung Phast System (Amasham Pharmacia Biotech Co.) statt.
Phosphorylase b (94 kDa), Rinderserumalbumin (67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Kohlensäureanhydrase (30 kDa), Trypsininhibitor (20,1 kDa) und α-Lactalbumin (14,4 kDa) wurden als Molekülmassenmarker verwendet. Nach der Elektrophorese fand eine Silberfärbung mit dem Phast Gel Silver Stain Kit (Amasham Pharmacia Biotech Co.) statt. Die relative Molkülmasse des Peak-5-Proteins wurde wie folgt bestimmt. Im Speziellen wurde die zurückgelegte Strecke vom oberen Ende des Trenngels gemessen, als die jeweiligen Molekülmassenmarker der Elektrophorese unterworfen wurden. Es wurde eine standardmäßige gerade Linie durch graphisches Darstellen der zurückgelegten Strecke von jedem Marker gegenüber der relativen Molekülmasse (in Logarithmus) erzeugt. Die relative Molekülmasse des Peak-5-Proteins wurde dadurch bestimmt, dass die gemessene zurückgelegte Strecke des Proteins mit der standardmäßigen geraden Linie in Bezug gebracht wurde. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Wie anhand der Ergebnisse erkennbar ist, wurde lediglich eine 45-kDa-Proteinbande unter nicht reduzierenden Bedingungen nachgewiesen und Proteinbanden mit etwa 28 kDa und 23 kDa wurden unter reduzierenden Bedingungen nachgewiesen.
5. Beispiel
(Entfernung von Zuckerketten des N-Bindetyps von ADIF und Bestimmung der relativen Molekülmasse)
Eine Probe, die etwa 0,2 μg ADIF enthielt, das mit einer Umkehrphasensäule gemäß dem Verfahren aus dem 3. Beispiel, ix) gereinigt worden war, wurde unter Vakuum konzentriert. Ein μl 0,5 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,6), 1 μl 0,5 M 2-Mercaptoethanol, 1 μl Wasser und 1 μl 250 U/ml N-Glycanaselösung (Genzyme Co.) wurden zur Probe gegeben. Das Gemisch wurde gründlich verrührt und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 2 μl von 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 2 mM EDTA, 5 % SDS, 0,02 % Bromphenolblau und 5 % 2-Mercaptoethanol enthielt, wurde das Gemisch gründlich verrührt und 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Ein μl der resultierenden Probe wurde einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß dem Verfahren aus dem 4. Beispiel unterzogen, gefolgt von einer Silberfärbung. Als Kontrolle wurden 0,2 μg unbehandeltes ADIF, das mit dem in 3. Beispiel, ix) beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, der gleichen Elektrophorese und Silberfärbung unterzogen. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Als Ergebnis betrug die scheinbare relative Molekülmasse des ADIF-Proteins, das keine Zuckerketten des N-Bindetyps enthielt, gemessen anhand SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, etwa 18 kD. Da die anhand SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen gemessene scheinbare relative Molekülmasse des unbehandelten ADIF-Proteins etwa 23 kDa und/oder 28 kD betrug, wurde belegt, dass das ADIF ein Glykoprotein war, das Zuckerketten des N-Bindetyps im Molekül enthielt. Die Differenz zwischen der scheinbaren relativen Molekülmasse von 23 kD und 28 kD des unbehandelten ADIF-Proteins, die anhand SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen gemessen wurde, ist wohl in der Bindungszahl von Zuckerketten des N-Bindetyps begründet.
6. Beispiel
(Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz)
Die Probe der Polycat-A-Fraktionen Nr. 37-46, die in Beispiel 3, viii erhalten wurde, wurde mit einem Zentrifugenkonzentrator (Centricon 10, Millipore Co.) auf etwa 500 μl konzentriert, mit 10 μl 20 %iger TFA angesäuert und auf eine Umkehrphasensäule (C4, 2,1 × 250 mm, VYDAC Co.) aufgetragen, die mit 30 % Acetonitril, das 0,1 % TFA enthielt, äquilibriert worden war. Das adsorbierte Protein wurde mit einem linearen Gradient von 30 bis 55 % Acetonitril über einen Zeitraum von 50 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min eluiert und die Peak 5 entsprechende Proteinfraktion wurde aufgefangen. Der resultierende Peak 5 wurde unter Vakuum mit einem Zentrifugenkonzentrator konzentriert. Die konzentrierte Fraktion wurde in 0,5 μl von 10 mM Tris-HCl (pH 8), das 1 mM EDTA, 2,5 % SDS und 0,01 % Bromphenolblau enthielt, gelöst und unter reduzierenden Bedingungen (in Anwesenheit von 5 % 2-Mercaptoethanol) über Nacht bei 37°C inkubiert und 4 μl der Fraktion wurden auf SDS-Polyacrylamidgel zur Elektrophorese aufgetragen. Die Elektrophorese fand mit einem Gradientengel von 10-15 % Acrylamid (Amasham Pharmacia Biotech Co.) in der Elektrophoresevorrichtung Phast System (Amasham Pharmacia Biotech Co.) statt. Im Anschluss an die Elektrophorese wurde das Protein auf eine PVDF-Membran (ProBlot, Perkin Elmer Co.) bei 20 V und 25 mA unter Verwendung der Blotvorrichtung Phast Transfer (Amasham Pharmacia Biotech Co.) übertragen. Nach dem Transfer wurde das Protein mit einer Lösung aus 2 % Coomassie-Blau/40 % Methanol/10 % Essigsäure gefärbt und mit einer 60 %igen Methanollösung entfärbt, um überschüssige Farbe zu entfernen. Banden von etwa 23 kDa und 28 kDa wurden herausgeschnitten und einer N-terminalen Aminosäuresequenzanalyse mit einem Proteinsequenzer (Procise, Typ 492, hergestellt von Perkin Elmer Co.) unterzogen. Die Ergebnisse sind in der Sequenztabelle, Sequenz-ID-Nr. 1, aufgeführt.
Jede Fraktion der Polycat-A-Fraktionen 37 bis 46, die in der gleichen Weise wie oben beschrieben von etwa 80 l IMR-90-Kulturmedium erhalten wurden, wurde mit 10 μl 20 %iger TEA angesäuert und auf eine Umkehrphasensäule (C4, 2,1 × 250 mm, VYDAC Co.), die mit 30 % Acetonitril, das 0,1 % TFA enthielt, äquilibriert worden war, zehnmal aufgetragen. Das adsorbierte Protein wurde mit einem linearen Gradient von 30 bis 55 % Acetonitril über einen Zeitraum von 55 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min eluiert und die Peak 5 entsprechende Proteinfraktion wurde aufgefangen. Das resultierende Peak-5-Protein wurde unter reduzierenden Bedingungen pyridylethyliert und einer N-terminalen Aminosäuresequenzanalyse mit einem Proteinsequenzer (Procise, Typ 492, hergestellt von Perkin Elmer Co.) unterzogen. Als Ergebnis konnte eine Aminosäuresequenz zwischen dem N-Terminus und der 40. Aminosäure ermittelt werden. Die Ergebnisse sind in der Sequenztabelle, Sequenz-ID-Nr. 2, aufgeführt.
7. Beispiel
(Klonierung von ADIF cDNA-Fragmenten)
i) Isolation von poly(A) + RNA von IMR-90-Zellen
Etwa 10 μg poly(A) + RNA wurden von 1 × 10⁸ IMR-90-Zellen mit dem Fast Truck mRNA Isolationskit (hergestellt von Invitro Gene Co.) gemäß dem Handbuch des Kits isoliert.
ii) Herstellung eines Mischprimers
Die beiden folgenden Mischprimer wurden auf der Basis der im 6. Beispiel erhaltenen und in der Sequenztabelle, Sequenz-ID-Nr. 2 beschriebenen N-terminalen Aminosäuresequenz synthetisiert. Im Speziellen können alle Oligonucleotide (Mischprimer, TAE/F) die Aminosäuresequenz vom 13. Rest (Thr) zum 19. Rest (Cys) vom N-Terminus kodieren wurde synthetisiert. Darüber hinaus können alle Komplementäroligonucleotide (Mischprimer, CFE/R) die Aminosäuresequenz vom 29. Rest (Gly) zum 35. Rest (Glu) vom N-Terminus kodieren wurde synthetisiert. Die verwendeten Basensequenzen der Mischprimer sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
iii) Amplifikation von ADIF cDNA-Fragmenten durch PCR

Eine einzelsträngige cDNA wurde mit dem Superscript II cDNA Synthesekit (Gibco BRL Co.) und 1 μg poly(A) + RNA aus Beispiel 7, i) gemäß dem Protokoll von Gibco BRL Co. erzeugt. Das ADIF kodierende DNA-Fragment wurde durch PCR unter Verwendung der im Beispiel 8, ii) beschriebenen cDNA, Matrize und Primer erhalten. Die Reaktionslösung hatte die folgende Zusammensetzung:

10X Ex Taq Puffer (Takara Shuzo Co., Ltd.)	10 μl
2,5 mM dNTP	8 μl
cDNA-Lösung	2,5 μl
Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.)	1 μl
Destilliertes Wasser	73,5 μl
20 μM Primer TAE/F	2,5 μl
20 μM Primer CFE/R	2,5 μl

Die obigen Lösungen wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen vermischt und eine PCR fand unter den folgenden Bedingungen statt. Nach einer 3-minütigen Vorbehandlung bei 95°C wurde eine Dreistufenreaktion bestehend aus Schritten bei 95°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für eine Sekunde 40 Mal wiederholt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch fünf Minuten lang bei 72°C inkubiert. Ein Teil des Reaktionsgemischs wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert und ein etwa 68 bp cDNA-Fragment, das von der N-terminalen Aminosäuresequenz erwartet wurde, wurde angesäuert.
8. Beispiel
(Klonierung des durch PCR amplifizierten ADIF cDNA-Fragments und Bestimmung seiner DNA-Sequenz)
Das in Beispiel 7, iii erhaltene cDNA-Fragment wurde in einen pT7 Vektor (Novagen Co.) mit einem DNA-Ligationskit Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingefügt und Escherichia coli XL2Blue (Stratagene Co.) wurde mit der Ligationsreaktion transformiert. Die resultierenden Transformanten wurden amplifiziert und das ADIF cDNA (etwa 68 bp) enthaltende Plasmid wurde mit einem konventionellen Verfahren gereinigt. Dieses Plasmid wurde pBSADIF genannt. Die Sequenz von ADIF cDNA in diesem Plasmid wurde mit einem DNA-Sequenzierungskit (Perkin Elmer) bestimmt. Die Aminosäuresequenz von 23 Aminosäuren, die von dieser Sequenz vorhergesagt wurde, war in der N-terminalen Aminosäuresequenz (Sequenztabelle, Sequenz-ID-Nr. 2) von ADIF zu finden, die zum Konstruieren der Mischprimer verwendet wurde. Anhand der obigen Ergebnisse wurde bestätigt, dass die klonierte 68-bp-cDNA ein ADIF cDNA-Fragment war.
9. Beispiel
(Herstellung einer DNA-Sonde)
Das ADIF cDNA-Fragment wurde durch PCR unter den Bedingungen aus Beispiel 6, iii amplifiziert, wobei das im 8. Beispiel hergestellte Plasmid mit eingefügtem 68 bp ADIF cDNA-Fragment als Matrize verwendet wurde. Das ADIF cDNA-Fragment mit etwa 68 bp wurde einer präparativen Agarosegelelektrophorese unterzogen und mit einem QIAEXIIDNA Isolationskit (Qiagen Co.) gereinigt. Diese DNA wurde unter Verwendung eines Megaprime-DNA-Markierungskits (Amasham Pharmacia Biotech Co.) mit [α32P]dCTP-Plasmid markiert und als Sonde zum Screenen der vollen Längen der ADIF cDNA verwendet.
10. Beispiel
(Herstellung der cDNA-Bibliothek)
cDNA wurde mit 2,5 μg poly(a) + RNA aus Beispiel 7, i), Oligo-(dT)-Primer und dem Greatlength-cDNA-Synthesekit (hergestellt von Clonetech Co.) gemäß dem Protokoll von Clonetech Co. synthetisiert. Eco RI-SaI I-Not I-Adapter wurde mit der cDNA ligiert und cDNA wurde durch Größenfraktionierung getrennt. Die gereinigte cDNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in 10 μl einer TE-Pufferlösung aufgelöst. Die resultierende cDNA mit Adapter (0,1 μl) wurde durch T4DNA-Ligase in einen λZAP-Express-Vektor (Stratagene Co.) eingefügt, der zuvor mit Eco RI verdaut worden war. Die resultierende rekombinante Phagen-DNA mit der cDNA wurde unter Verwendung von Gigapack Gold II (Stratagene Co.) in vitro verpackt und es wurde eine rekombinante λZAP-Express-Phagenbibliothek erzeugt.
11. Beispiel
(Screening von rekombinantem Phage)
Der im 10. Beispiel erhaltene rekombinante Phage wurde 15 Minuten lang bei 37°C mit Escherichia coli XL1-Blue MRF (Stratagene Co.) infiziert. Die infizierten Escherichia coli-Zellen wurden in ein NZY-Medium bei 50°C gegeben, das 0,7 % Agar enthielt, und auf NZY-Agarplatten plattiert. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht wurde Hybond N (Amarsham Pharmacia Biotech Co.) an der Oberfläche der pesthaltigen Platte etwa 30 Minuten lang angebracht. Der Filter wurde in Alkalilösung denaturiert, neutralisiert und mit einem konventionellen Verfahren in 2 × SSC gewaschen. Die Phagen-DNA wurde auf dem Filter durch UV-Quervernetzung (Stratagene Co.) immobilisiert. Der Filter wurde in einem Schnellhybridisierungspuffer, der 100 μg/ml Lachssperma-DNA (Amasham Co.) enthielt, 1 Stunde lang bei 65°C inkubiert und dann über Nacht in dem gleichen Puffer, der 2 × 10⁵ cpm/ml der im 9. Beispiel hergestellten denaturierten DNA-Sonde enthielt, inkubiert. Nach der Reaktion wurde der Filter zweimal mit 2 × SSC, zweimal mit 0,1 × SSC und zweimal mit einer 0,1 % SDS-Lösung jeweils 10 Minuten lang bei 65°C gewaschen. Der gewaschene Filter wurde an einem Röntgenfilm angebracht und über Nacht bei -80°C stehen gelassen. Positive Klone wurden durch Entwickeln des Röntgenfilms selektiert. Einige der gewonnenen positiven Klone wurden noch einmal durch Screenen gereinigt. Von diesen Klonen wurden diejenigen, die etwa 2,0 kb DNA-Insert enthielten, in den folgenden Experimenten verwendet. Der gereinigte Phage und Helfer-Phage ExAssisi (Stratagene Co.) wurden mit Escherichia coli XL1-Blue MRF' (Stratagene Co.) unter Verwendung eines λZAP-Express-Klonierungskits (Stratagene Co.) gemäß dem Protokoll von Stratagene Co. infiziert. Es wurde eine Kulturbrühe aus infizierten XLI-Blue MRF' hergestellt. Die Brühe mit den exzidierten Phagemids wurde mit Escherichia coli XLOLR (Stratagene Co.) infiziert und der über dem Plasmid mit pBKADIF, das aus pBKCMV (Stratagene Co.) besteht, schwebende Transformant mit dem oben genannten 2,0 kb Insert wurde durch die Aufnahme von kanamycinresistenten Kolonien gewonnen. Der Transformant wurde am 11. August 1998 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industrie mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6459 unter der Bezeichnung XLOLR/pBKADIF hinterlegt. Das Transformantenmaterial mit diesem Plasmid wurde amplifiziert und das Plasmid wurde gemäß dem Standardprotokoll gereinigt.
12. Beispiel
(Bestimmung der Nucleotidsequenz von ADIF cDNA, die die volle Kodierungsregion kodiert)
Die Nucleotidsequenz von ADIF cDNA aus dem 11. Beispiel wurde mit einem DNA-Sequenzierungskit (Perkin Elmer Co.) bestimmt. Die verwendeten Primer waren T3, T7 Primer (Stratagene Co.) und synthetische Primer, die gemäß der ADIF cDNA-Sequenz konstruiert wurden, deren Sequenzen in der Sequenztabelle, Sequenz-ID-Nr. 4-11 dargestellt sind. Die auf diese Weise ermittelte Nucleotidsequenz von ADIF cDNA und die anhand der cDNA-Sequenz vorhergesagte entsprechende Aminosäuresequenz sind jeweils in der Sequenz Nr. 12 und Nr. 13 der Sequenztabelle dargestellt.
13. Beispiel
(Produktion von rekombinantem ADIF von 293/EBNA-Zellen)
i) Konstruktion des Plasmids zum Exprimieren von ADIF
Das im 10. Beispiel erhaltene Plasmid pBKADIF wurde mit dem Restriktionsenzym SalI verdaut. Das ADIF cDNA-Insert wurde herausgeschnitten, durch Agarosegelelektrophorese separiert und mit einem QIAEXIIDNA-Isolationskit (Qiagen Co.) gereinigt. Die gereinigte ADIF cDNA wurde mit einem Ligationskit Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit dem Expressionsplasmid pCEP4 (Inviro Gene Co.) ligiert, das zuvor mit dem Restriktionsenzym Xho I verdaut worden war, und mit alkalischer Phosphatase behandelt. E. coli DH5α (Gibco BRL Co.) wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert. Man ließ die resultierenden Transformanten wachsen und das Plasmid pCEPADIF mit der ADIF cDNA wurde mit dem QIAGEN Plasmid-Midi-Kit (Qiagen Co.) gereinigt. Das ADIF-Expressionsplasmid pCEPADIF wurde mit Ethanol präzipitiert und das Präzipitat wurde für den Gebrauch in den folgenden Experimenten in sterilisiertem destilliertem Wasser aufgelöst.
ii) Vorübergehende Expression von ADIF cDNA und Analyse der biologischen Aktivität von rekombinantem ADIF

Rekombinantes ADIF wurde unter Verwendung des im Beispiel 13, i hergestellten ADIF-Expressionsplasmids pCEPADIF mit dem folgenden Verfahren produziert und seine biologische Aktivität wurde gemessen. 2 × 10⁵ 293/EBNA-Zellen (Invitro Gene Co.) wurden in IMDM (Gibco BRL Co.) suspendiert, das 10 % fötales Rinderserum (Gibco BRL Co.) enthielt, und in jedes Well einer 24-Well-Platte inokuliert. Am nächsten Tag wurden pCEPADIF und das zuvor mit IMDM verdünnte Transfektionsreagens FuGENE^TM6 (Roche Diagnostic Co.) vermischt und das Gemisch wurde zu den Zellen in den jeweiligen Wells gemäß den dem FuGENE^TM6 beiliegenden Herstelleranweisungen gegeben. 0,5 mg pCEPADIF und 1 μl FuGENE^TM6 wurden für jede Transfektion verwendet. Nach 72 Stunden wurde das konditionierte Medium geerntet und zur Bestimmung der ADIF-Aktivität verwendet. Die ADIF-Aktitivät wurde mit dem folgenden Verfahren bestimmt. Im Speziellen wurde die durch Dexamethason induzierte Bildung von Adipozyten anhand der Triglyceridakkumulation unter Verwendung von Maus-Präadipozyten MC3T3-G2/PA6 als Targetzellen gemessen, um die Unterdrückungsaktivität zu bestimmen. Spezieller wurden 50 μl der mit α-MEM (Gibco BRL), das 10 % fötales Rinderserum enthielt, verdünnten Probe in eine 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und Maus-Präadipozyten-MC3T3-G2/PA6-Zellen (3 × 10³), suspendiert in 50 μl α-MEM mit 2 × 10^-7 Dexamethason und 10 % fötalem Rinderserum, wurden in die Mikrotiterplatte inokuliert und eine Woche lang unter Bedingungen mit 5 % CO₂ bei 37°C und 100 % Feuchtigkeit inkubiert. Nach sieben Tagen wurde das Medium durch Aspiration entfernt und die Zellen wurden an der Luft getrocknet, um die in den Adipozyten akkumulierte Triglyceridmenge mit einem Triglycerid-Testkit (Triglyceride G-Test Wako, Code Nr. 274-69802, hergestellt von Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) zu messen. Der OD-Rückgang bei 510 nm wurde als ADIF-Aktivität genommen. Als Ergebnis (siehe Tabelle 2) wurde bestätigt, dass die Kulturbrühe aus 293/EBNA-Zellen, die mit ADIF-Gen transfiziert waren, die gleiche Aktivität wie natürliches ADIF aufwies, das zuvor von der IMR-90-Kulturbrühe erhalten wurde. Tabelle 2

Verdünnungsrate	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64
mit ADIF-Gen transfiziert	0,141	0,130	0,109	0,089	0,067
mit Vektor transfiziert	-0,009	0,009	-0,007	0,005	0,015
unbehandelt	0,001	0,009	-0,018	0,013	0,016
(Rückgang von OD bei 510 nm, Δ 510 nm)

14. Beispiel
(Bestimmung der ADIF-Aktivität mittels 3T3/LI-Zellen)

Die ADIF-Aktivität wurde durch Einschätzen der Unterdrückungswirkung der durch Dexamethason und 1-Methyl-3-isobutyl-xanthin induzierten Adipogenese anhand der Triglyceridakkumulation unter Verwendung von Maus-Vorläufer-Präadipozyten-3T3-LI-Zellen (hinterlegt bei ATCC, Hinterlegungsnummer CL173) als Targetzellen beurteilt. Im Speziellen wurden 50 μl der mit α-MEM (Gibco BRL), das 10 % fötales Rinderserum enthielt, verdünnten Probe in eine 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben und Maus-Präadipozyten-3T3-LI-Zellmaterial (5 × 10³) wurde in 50 μl von α-MEM-Medium suspendiert, das 4 × 10^-7 Dexamethason, 2 × 10^-5 M 1-Methyl-3-isobutyl-xanthin und 10 % fötales Rinderserum enthielt, in die Mikrotiterplatte inokuliert und 1 Woche lang unter Bedingungen mit 5 % CO₂ bei 37°C und 100 % Feuchtigkeit inkubiert. Nach sieben Tagen wurde das Medium durch Aspiration entfernt und die Zellen wurden an der Luft getrocknet, um die Menge des in den Adipozyten akkumulierten Triglycerids unter Verwendung eines Triglycerid-Testkits (Triglyceride G-Test Wako, Code Nr. 274-69802, hergestellt von Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) zu messen. Der Rückgang von OD bei 510 nm wurde als ADIF-Aktivität genommen. Als Ergebnis (siehe Tabelle 3) wurde bestätigt, dass die Kulturbrühe aus 293/EBNA-Zellen, die mit ADIF-Gen transfiziert waren, ebenfalls ADIF-Aktivität aufwies, wenn die 3T3-LI-Zellen als Targetzellen verwendet wurden. Tabelle 3

Verdünnungsrate	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64
mit ADIF-Gen transfiziert	0,106	0,103	0,079	0,065	0,053
mit Vektor transfiziert	-0,042	-0,021	0,013	0,011	0,010
unbehandelt	0,045	-0,034	0,002	-0,030	-0,004
(Rückgang von OD bei 510 nm, Δ 510 nm)

15. Beispiel
Herstellung von ADIF-FLAG (+ Xho I)
(I) Zugabe der Restriktionsenzym-XhoI-Erkennzungssequenz und FLAG-Kodierungssequenz
Eine Sequenz, die das Restriktionsenzym XhoI erkennt, und eine Sequenz, die FLAG kodiert, wurden unmittelbar hinter der Sequenz hinzugefügt, die das 265. Arg kodiert, dem C-Terminus der ADIF-Aminosäuresequenz, die in der Sequenz-ID-Nr. 13 beschrieben ist. Zehn Aminosäuren, Leu, Glu, Asp, Tyr, Lys, Asp, Asp, Asp, Asp und Lys, wurden durch diese Sequenz hinter dem 265. Arg hinzugefügt. Die Mutagenese fand mit dem PCR-Verfahren statt. Die Sequenzen der für die Mutagenese verwendeten Primer sind in Tabelle 4 und Sequenz-ID-Nr. 14-19 dargestellt.
Tabelle 4

ADFY1Hd 5'-GGGGGAAGCTTGCGGCGAAGGAGGAAGAGG-3'
ADFL2R 5'-GGCTCGAGGGCATGGGCGTTTGGGTGG-3'
ADFL3R 5'-GGCTCGAGTGCTTCCCCGTGGTGGGCC-3'
ADFL4R 5'-GGCTCGAGGGTGCAGAAGCTCAAGATG-3'
ADFL5R 5'-GGCTCGAGCCCACAGGTCAGCAGCAAG-3'
ADFL6R 5'-GGGGGCTCGAGGTTCTCCTGGGCAGCCGCGCACAG-3'

Eine PCR fand unter den folgenden Bedingungen statt.
Nach einer Reaktion bei 95°C für 3 Minuten, 55°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten wurde eine Dreistufenreaktion, die aus Reaktionen bei 96°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für drei Minuten bestand, 25 Mal wiederholt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch fünf Minuten lang bei 72°C inkubiert. Die Zusammensetzung der PCR-Reaktionslösung ist nachfolgend dargestellt.

Die PCR-Reaktionslösung für die Mutagenese:

Ex Taq Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)	0,5 μl
10 × Ex Taq Puffer (Takara Shuzo Co., Ltd.)	10 μl
2,5 mM dNTP-Lösung	8 μl
Matrizenplasmidvektor (pCEPADIF 40 ng/μl)	1 μl
0,1 M Primer (ADFY1 Hd)	1 μl
0,1 M Primer (ADFLSXR)	1 μl
Sterilisiertes destilliertes Wasser	78,5 μl

Die durch PCR erhaltene DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese separiert und mit 20 μl sterilisiertem destilliertem Wasser unter Verwendung des QIAEXII Gelextraktionskits (Qiagen Co.) extrahiert. Zehn μl einer Lösung, die die extrahierte DNA enthielt, wurden mit dem Restriktionsenzym Hind III (Takara Shuzo Co., Ltd.) und SalI (Takara Shuzo Co., Ltd.) zum Verdauen der DNA behandelt. Die DNA-Lösung wurde einer Elektrophorese mit 1,5 Agarosegel unterzogen und das Target-DNA-Fragment wurde mit 20 μl sterilisiertem destilliertem unter Verwendung des QIAEXII Gelextraktionskits (DNA-Lösung 1) extrahiert.
(II) Konstruktion des ADIF-FLAG (+ Xho I) Expressionsvektors
pCEP4 wurde mit dem Restriktionsenzym Hind III und Xho I (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut und einer Elektrophorese mit 1,0 % Agarosegel unterzogen. Ein DNA-Fragment mit etwa 10 kbp wurde mit dem QIAEXII Gelextraktionskit extrahiert (DNA-Lösung 2).
Vier μl der DNA Ligationskit-Ver.2I-Lösung (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu 3 μl DNA-Lösung 1 und 1 μl DNA-Lösung 2 gegeben, und das Gemisch wurde einer Ligationsreaktion unterzogen, während gleichzeitig 30 Minuten lang 16°C aufrechterhalten wurden. Escherichia coli DH5α wurde mit der resultierenden Reaktionslösung transformiert. Die DNA-Struktur des transformierten Escherichia coli, das ampicillinresistent war, wurde analysiert, um die Transformanten zu selektieren, die das Targetplasmid enthielten. Die Analyse der DNA-Struktur erfolgte durch Messen der Länge des Fragments, das durch einen Restriktionsenzymverdau erhalten wurde, und Bestimmen der DNA-Sequenz. Der erhaltene Expressionsvektor wurde pCEP4 ADIF-FLAG (+ Xho I) genannt.
(III) Herstellung eines mutierten Expressionsvektors
Escherichia coli mit pCEP4-ADIF-FLAG (+Xho I) wurde in 25 ml LB-Medium (1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefe-Extrakte, 1 % NaCl) wachsen gelassen und mit dem QIAGEN Plasmid-Midi-Kit (Qiagen Co.) gereinigt. Der Expressionsvektor wurde mit Ethanol präzipitiert und das Präzipitat wurde für den Gebrauch im folgenden Experiment in 50 μl sterilisiertem destilliertem Wasser aufgelöst.
16. Beispiel
(Herstellung einer C-terminalen Deletionsmutante)
(I) Mutagenese der C-terminalen Deletionsmutante
Es wurden Mutanten mit der gleichen Aminosäuresequenz wie die Sequenz-ID-Nr. 13, jedoch mit Sequenzdeletionen vom 236. Arg bis zum 265. Arg, vom 206. Gly bis zum 265. Arg, vom 176. Ser bis zum 265. Arg, vom 146. Glu bis zum 265. Arg oder vom 116. Thr bis zum 265. Arg, hergestellt. Die Mutanten mit Sequenzdeletionen vom 236. Arg bis zum 265. Arg, vom 206. Gly bis zum 265. Arg, vom 176. Ser bis zum 265. Arg, vom 146. Glu bis zum 265. Arg und vom 116. Thr bis zum 265. Arg wurden jeweils ADIF-R1, ADIF-R2, ADIF-R3, ADIF-R4 und ADIF-R5 genannt.
Eine Mutagenese zur Herstellung der Mutanten wurde mit dem PCR-Verfahren durchgeführt. Die für die Mutagenese verwendeten Primer sind in der Tabelle dargestellt und die Sequenzen der Primer sind in den Sequenz-ID-Nr. dargestellt. Eine PCR fand unter den folgenden Bedingungen statt. Nach einer Reaktion bei 97°C für 3 Minuten, 55°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten wurde eine Dreistufenreaktion, die aus Reaktionen bei 96°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72° für 3 Minuten bestand, 25 Mal wiederholt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch fünf Minuten lang bei 72°C inkubiert. Die Zusammensetzung der PCR-Reaktionslösung ist nachfolgend dargestellt.

Die PCR-Reaktionslösung für die C-terminale Deletionsmutagenese:

Ex Taq Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)	0,5 μl
10 × Ex Taq Puffer (Takara Shuzo Co., Ltd.)	10 μl
2,5 mM dNTP-Lösung	8 μl
Matrizenplasmidvektor (pCEPADIF 40 ng/μl)	1 μl
0,1 M Primer (ADFY1 Hd)	1 μl
0,1 M Mutageneseprimer	1 μl
Sterilisiertes destilliertes Wasser	78,5 μl

Die durch das PCR-Verfahren erhaltene DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese separiert und mit 20 μl sterilisiertem destilliertem Wasser unter Verwendung des QIAEXII Gelextraktionskits extrahiert. Zehn μl einer Lösung, die die extrahierte DNA enthielt, wurden mit dem Restriktionsenzym Hind III und Sal I zum Verdauen der DNA behandelt. Die DNA-Lösung wurde einer Elektrophorese mit 1,5 % Agarosegel unterzogen und das Target-DNA-Fragment wurde mit 20 μl sterilisiertem destilliertem Wasser unter Verwendung des QIAEXII Gelextraktionskits (DNA-Lösung 3) extrahiert.
(II) Konstruktion eines mutierten Expressionsvektors
pCEP4-ADIF-FLAG (+ Xho I) wurde mit dem Restriktionsenzym Hind III und Xho I verdaut und einer Elektrophorese mit 1,0 % Agarosegel unterzogen. Ein DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 10 kbp wurde mit dem QIAEXII Gelextraktionskit (DNA-Lösung 4) extrahiert.
Vier μl DNA-Ligationskit-Ver.2I-Lösung wurden zu 3 μl DNA-Lösung 3 und 1 μl DNA-Lösung 4 gegeben und das Gemisch wurde einer Ligationsreaktion unterzogen, während gleichzeitig 30 Minuten lang 16°C aufrechterhalten wurden. Escherichia coli DH5α wurde mit der resultierenden Reaktionslösung transformiert. Die DNA-Struktur des transformierten Escherichia coli, das ampicillinresistent war, wurde analysiert, um den Transformanten zu selektieren, der das Targetplasmid enthielt. Die Analyse der DNA-Struktur erfolgte durch Messen der Länge des durch den Restriktionsenzymverdau erhaltenen Fragments und Bestimmen der DNA-Sequenz. Die Expressionsvektoren für ADIF-R1, ADIF-R2, ADIF-R3, ADIF-R4 und ADIF-R5 wurden jeweils pCEP4-ADIF-R1, pCEP4-ADIF-R2, pCEP4-ADIF-R3, pCEP4-ADIF-R4 und pCEP4-ADIF-R5 genannt.
(III) Herstellung eines mutierten Expressionsvektors
Escherichia coli mit dem mutierten Expressionsvektor wurde in 25 ml LB-Medium wachsen gelassen und mit dem QIAGEN Plasmid-Mid-Kit gereinigt. Jeder Expressionsvektor wurde mit Ethanol präzipitiert und das Präzipitat wurde für den Gebrauch im folgenden Experiment in 50 μl sterilisiertem destilliertem Wasser aufgelöst.
17. Beispiel
(Vorübergehende Expression von ADIF-FLAG (+ Xho I) und mutierter cDNA)
2 × 10⁶ 293-EBNA-Zellen wurden in 20 ml IMDM mit 10 % fötalem Rinderserum suspendiert, in einem 75-cm²-Kulturkolben verteilt und 24 Stunden lang in CO₂ bei 37°C kultiviert. Einhundert ml FuGENE6 (Roche Diagonostic) wurden zu 3,5 ml serumfreiem IMDM-Medium gegeben. Man ließ das Gemisch 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen und gab es dann tropfenweise in eine Lösung, die 35 μg ADIF-FLAG (+ Xho I) enthielt. Man ließ das resultierende Gemisch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Dieses Gemisch wurde tropfenweise zu den Zellen in den fünf 75-cm²-Kolben (jeweils 700 μl) gegeben, wodurch der Expressionsvektor in die Zellen transfiziert wurde. Das gleiche Verfahren wurde an den anderen mutierten Expressionsvektoren angewendet. Die in die Zellen transfizierten Expressionsvektoren wurden in einem CO₂-Inkubator bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert. Nach dem Kultivieren wurden 20 ml frisches serumfreies IMDM zugegeben und die Zellen wurden in einem CO₂-Inkubator 48 Stunden lang bei 37°C kultiviert. Die Brühe aus den Kulturkolben wurde aufgefangen, 20 ml frisches serumfreies IMDM wurden in die Kulturkolben gegeben und die Zellen wurden in einem CO₂-Inkubator 48 Stunden lang bei 37°C weiter kultiviert. Die Kulturbrühe wurde aufgefangen und mit der zuvor aufgefangenen Kulturbrühe kombiniert, um insgesamt 200 ml Kulturbrühe zu erhalten.
18. Beispiel
(Reinigung von ADIF-FLAG(+ Xho I) und Mutanten)
ADIF-FLAG(+ Xho I) und Mutanten wurden von 200 ml der von vorübergehend exprimierten Zellen erhaltenen Kulturbrühe gereinigt. Bei der Reinigung wurden ADIF-FLAG(+ Xho I) und Mutanten spezifisch an einem Gelträger, der einen Anti-FLAG-Antikörper (M2, Sigma Co.) als Ligand enthielt, adsorbiert und davon eluiert.
Ein ml des in TBS/T (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,01 % Tween 80 (Sigma Co.) suspendierten Gels wurde in 8 Zentrifugenröhrchen (Volumen: 50 ml) gefüllt. Fünfundzwanzig ml der aufgefangenen Kulturbrühe wurden in jedes Röhrchen gegeben und das Gemisch wurde 24 Stunden lang vorsichtig bei 4°C rotiert, um zu bewirken, dass ADIF-FLAG(+ Xho I) und Mutanten am Antikörper adsorbierten. Durch Zentrifugation präzipitierte Gele wurden in einem Zentrifugenröhrchen (Volumen: 15 ml) aufgefangen. Das Gel wurde durch Suspendieren in 10 ml TBS/T und Zentrifugieren der Suspension gewaschen. Nach dem dreimaligen Waschen wurde das Gel in 5 ml eines Elutionspuffers (0,1 M Glycin-HCl (pH 2,8), 150 mM NaCl, 0,01 % Tween 80) suspendiert und zentrifugiert, um die eluierte Lösung aufzufangen. Dieses Verfahren wurde wiederholt, um insgesamt 10 ml der eluierten Lösung zu erhalten. Die eluierte Lösung wurde unter Zugabe von 100 μl von 3 M Tris neutralisiert. Die eluierte Lösung wurde durch einen Natriumphosphatpuffer (10 mM Natriumphosphat (pH 7,0) 0,3 M NaCl) unter Verwendung von Centriplus 10 (Millipore Co.) ersetzt und die Proteinkonzentration wurde mit dem gleichen Puffer auf 32 μg/ml gebracht.
19. Beispiel
(Analyse mit SDS-PAGE)
Gereinigter ADIF-FLAG (+ Xho I) und Mutanten wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Die Elektrophorese fand unter reduzierenden Bedingungen mit dem Phast System (Amasham Pharmacia Biotechn Co.) statt. Der gereinigte ADIF-FLAG (+ Xho I) und Mutanten, jeweils 60 ng, wurden einem 10-15 %igen Gradientengel (Amasham Pharmacia Biotech Co.) zur Elektrophorese ausgesetzt.
Als Ergebnis stimmte die relative Molekülmasse von ADIF-FLAG (+ XhoI) und Mutanten fast mit der anhand der Nucleotidsequenzen vorhergesagten überein. Die Reinheit lag bei mehr als 90
20. Beispiel
(Messung der Aktivität)
3T3-L1-Zellen, die in DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum (DMEM-FSC) mit einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/ml suspendiert waren, wurden in eine 96-Well-Platte in einer Menge von 100 μl/Well inokuliert und in einem CO₂-Inkubator 96 Stunden lang bei 37°C kultiviert. Zum Differenzieren konfluenter Zellen in Adipozyten wurde das Medium in der 96-Well-Platte durch DMEM-FCS mit 5 × 10^-4 M 1-Methyl-3-isobutyl-xanthin und 1 × 10^-6 M Dexamethason ersetzt und die Zellen wurden 48 Stunden lang bei 37°C in einem CO₂-Inkubator kultiviert. DMEM-FCS wurde zum Kulturmedium gegeben, um die Konzentrationen von ADIF-FLAG (+ Xho I) oder der Mutanten von 200 ng/ml auf 6,4 μg/ml zu bringen. Nach einer Kultivierung von 48 Stunden wurde das Medium entfernt und 100 μl DMEM-FCS mit ADIF-FLAG (+ Xho I) oder den Mutanten in der gleichen Konzentration wie oben wurden zu jedem Well gegeben. Die Kultivierung wurde fünf Tage lang bei 37°C in einem CO₂-Inkubator fortgesetzt und die Zellen wurden in Adipozyten differenziert. Nach der Kultivierung wurde die Adipogeneseinhibitionsaktivität (ADIF-Aktivität) der Zellen in der 96-Well-Platte, die nach dem Entfernen der Kulturbrühe gründlich getrocknet wurde, mit dem Triglyceride-G Test Wako (Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) untersucht. Der Rückgang der bei einer Probe gefundenen Absorbanz im Vergleich zur Absorbanz bei 510 nm in dem Well ohne Mutanten wurde als die AIDF-Aktivität der Probe genommen.
Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Die Aktivitätsmessung wurde für jede Probe zweimal durchgeführt, wobei der Mittelwert der beiden Messungen dargestellt ist. Die Mutanten ADIF-R1, ADIF-R2 und ADIF-R3 wiesen fast die gleiche spezifische Aktivität wie ADIF-FLAG (+ Xho I) auf. Die spezifische Aktivität von ADIF-R4 lag bei weniger als 1/30 von der des ADIF-FLAG (+ Xho I). ADIF-R5 wies selbst bei einer Konzentration von 6,4 μg/ml keine ADIF-Aktivität auf.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Es werden ein Adipogeneseinhibitionsfaktor (ADIF), der ein neuartiges Protein mit einer Aktivität zur Unterdrückung einer Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten ist, ein Verfahren zur Herstellung des Proteins durch Kultivieren humaner Fibroblasten und Reinigen von der Kulturbrühe unter Anwendung von Ionenaustauschsäulen-, Affinitätssäulen- und Umkehrphasensäulenchromatographie sowie ein Verfahren zum effizienten Herstellen des Proteins durch Kultivieren der humanen Fibroblasten unter Verwendung von Aluminiumoxidkeramikstücken als Zelladhäsionsträger vorgesehen. Außerdem werden eine cDNA, die das Protein kodiert, und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins unter Verwendung der cDNA bereitgestellt. Das erfindungsgemäße Protein ist als eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Fettleibigkeit oder als ein Antigen zur Erstellung immunologischer Diagnosen von Nutzen.
BEMERKUNGEN ZU HINTERLEGTEN MIKROORGANISMEN
Name und Adresse der Organisation, bei der die Mikroorganismen hinterlegt wurden:

Name: National Institute of Bioscience and Human-Technology, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industries
Adresse: 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan (Postcode: 305-8566).
Hinterlegungsdatum: 11. August 1998 Von der Hinterlegungsstelle zugeteilte
Hinterlegungsnummer: FERM BP-6459

Claims

Isoliertes Protein von humanen fötalen Lungenfibroblasten, das von einer Kulturbrühe aus humanen fötalen Lungenfibroblasten durch Chromatographie mit Ionenaustauschsäulen, Heparinaffinitätssäulen und Umkehrphasensäulen gereinigt ist, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Eigenschaften aufweist: a) eine Aktivität zur Unterdrückung einer Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten b) eine relative Molekulmasse gemäßSDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von etwa 45 kD unter nicht reduzierenden Bedingungen und etwa 28 kD und/oder 23 kD unter reduzierenden Bedingungen, c) eine Affinität zu Heparin in Übereinstimmung mit einem spezifischen Konzentrationsbereich von NaCl, d) N-verknüpfte Zuckerketten enthält, die entfernt werden, um ein Protein mit einer relativen Molekülmasse von etwa 18 kD gemäßSDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen zu bilden, und e) aus der in SEQ ID Nr. 13 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, das das Kultivieren von humanen fötalen Lungenfibroblasten auf Aluminiumoxidkeramikstücken und das Reinigen des Proteins aus der Kulturbrühe durch Chromatogrpahie unter Verwendung von Ionenaustauschsäulen, Heparinaffinitätssäulen und Umkehrphasensäulen beinhaltet.
Rekombinantes Polypeptid, das die Aminosäurereste 1 bis 175 der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 13 umfasst; eine Aktivität zur Unterdrückung einer Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten hat; und mit der in SEQ ID Nr. 12 dargestellten Nucleotidsequenz anhand einer gentechnischen Methode produziert wird.
Polypeptid nach Anspruch 3, das die Aminosäurereste 1-175; 1-205; 1-235 oder 1-265 der in der SEQ ID Nr. 13 dargestellten Aminosäuresequenz hat.
Polypeptid nach Anspruch 3, das in Säugetierzellen als Wirtszellen durch eine gentechnische Methode produziert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Unterdrückung einer Differenzierung und/oder Maturation von Adipozyten, die das Protein aus Anspruch 1 oder das rekombinante Polypeptid aus den Ansprüchen 3, 4 oder 5 umfasst.
Verwendung des Proteins aus Anspruch 1 oder des rekominanten Polypeptids aus den Ansprüchen 3, 4 oder 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung gegen und/oder Behandlung von Fettleibigkeit.