-
Diese
Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide,
die von solchen Polynucleotiden codiert werden, den Gebrauch solcher
Polynucleotide und Polypeptide wie auch die Herstellung solcher
Polynucleotide und Polypeptide. Die Polypeptide der vorliegenden
Erfindung sind insbesondere menschliche Beta-9 Chemokine, manchmal
im Folgenden als „Ckβ-9" bezeichnet. Die
Erfindung betrifft außerdem
die Hemmung der Aktivität
solcher Polypeptide.
-
Chemokine,
die auch als interkrine Cytokine bezeichnet werden, sind eine Unterfamilie
der strukturell und funktionell verwandten Cytokine. Diese Moleküle haben
eine Größe von 8–10 kD.
Im Allgemeinen weisen Chemokine eine Homologie von 20% bis 75% auf
der Aminosäureebene
auf, und werden durch vier konservative Cysteinreste charakterisiert,
die zwei Disulfidbrücken
bilden. Basierend auf der Einteilung der ersten beiden Cysteinreste
werden Chemokine in zwei Unterfamilien, alpha und beta, unterteilt.
In der alpha-Unterfamilie sind die ersten beiden Cysteine durch
eine Aminosäure
getrennt und werden deshalb als „C-X-C"-Unterfamilie bezeichnet. In der beta-Unterfamilie
liegen die zwei Cysteine in benachbarter Position und werden deshalb
als „C-C"-Unterfamilie bezeichnet.
Bisher wurden mindestens acht verschiedene Mitglieder dieser Familie
in Menschen identifiziert.
-
Die
interkrinen Cytokine weisen eine breite Vielfalt an Funktionen auf.
Ein Hauptmerkmal ist ihre Fähigkeit,
chemotaktische Migration von verschiedenen Zelltypen auszulösen, einschließlich der
Monocyten, der neutrophilen Granulocyten, der T-Lymphocyten, der
Basophilen und der Fibroblasten. Viele Chemokine haben eine entzündungsfördernde
Aktivität
und sind an zahlreichen Schritten während einer Entzündungsreaktion beteiligt.
Diese Aktivitäten
beinhalten die Stimulierung der Histamin-Freisetzung, die Freisetzung
lysosomaler Enzyme und Leukotriene, das Ansteigen der Adhärenz von
Ziel-Immunzellen an Endothelzellen, die erhöhte Bindung von Komplementproteinen,
die induzierte Expression von Granulocyten- Adhäsions-Molekülen und Komplement-Rezeptoren
und den plötzlichen
starken O2-Verbrauch ("respiratory burst"). Zusätzlich zu ihrer Beteiligung
bei Entzündungen
wurde gezeigt, dass bestimmte Chemokine andere Aktivitäten aufweisen.
Das Macrophagen-Enzündungsprotein
1 (MIP-1), zum Beispiel, ist in der Lage, die Proliferation von
hämatopoetischen
Stammzellen zu unterdrücken,
der Plättchen-Faktor-4 (PF-4) ist
ein starker Hemmstoff des Wachstums von Endothelzellen, Interleukin-3
(II-8) fördert
die Proliferation von Keratinocyten, und GRO ist ein autokriner Wachstumsfaktor
für Melanomzellen.
-
Angesichts
der verschiedenen biologischen Aktivitäten, ist es nicht überraschend,
dass Chemokine in eine Vielzahl von physiologischen und Krankheitszuständen verwickelt
sind, einschließlich
dem Lymphocytenverkehr, der Wundheilung, der häematopoetischen Regulation
und von immunologischen Störungen
wie Allergien, Asthma und Arthritis.
-
Die
Mitglieder des „C-C"-Zweiges üben ihre
Effekte auf die folgenden Zellen aus: Eosinophile, die Parasiten
zerstören,
um parasitische Infektionen abzuschwächen, und die chronische Entzündungen
der Atemwege des Atmungssystems auslösen; Macrophagen, die die Tumorbildung
in Vertebraten unterdrücken,
und Basophile, die Histamine freisetzen, die eine Rolle bei allergischen
Entzündungen
spielen. Dennoch üben
die Mitglieder eines Zweiges Effekte auf Zellen aus, die normalerweise
auf den anderen Zweig der Chemokine reagieren, so dass den Mitgliedern
der Zweige deshalb keine genaue Rolle zugewiesen werden kann.
-
Während die
Mitglieder des C-C-Zweiges überwiegend
auf einkernige Zellen und die Mitglieder des C-X-C-Zweiges überwiegend
auf neutrophile Granulocyten wirken, kann einem Chemokin eine gesonderte chemoattraktive
Eigenschaft basierend auf diesem Leitfaden nicht zugeordnet werden.
Einige Chemokine der einen Familie zeigen die Eigenschaften der
anderen.
-
Das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung wurde aufgrund der Homologie
in der Aminosäuresequenz mutmaßlich als
Ckβ-9 identifiziert.
-
In Übereinstimmung
mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden sowohl neue Polypeptide als
auch biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche
Fragmente, die C-C-Chemokin-Aktivität haben, bereitgestellt. Das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist menschlicher Herkunft.
-
In Übereinstimmung
mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte
Nucleinsäuremoleküle, die
das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codieren, bereitgestellt,
einschließlich
mRNAs, DNAs, cDNAs, genomischer DNAs wie auch biologisch aktive
und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente davon.
-
In Übereinstimmung
mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein
Verfahren zur Herstellung solcher Polypeptide mittels rekombinanter
Techniken bereitgestellt, umfassend die Züchtung von rekombinanten prokaryontischen
und/oder eukaryontischen Wirtszellen, die eine Nucleinsäuresequenz beinhalten,
die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, unter Bedingungen,
die die Expression des Proteins fördern, und die nachfolgende
Gewinnung des Proteins.
-
In Übereinstimmung
mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein
Verfahren zum Gebrauch solcher Polypeptide oder Nucleinsäuren, die
diese Polypeptide codieren, für
therapeutische Zwecke bereitgestellt, wie zum Beispiel, um feste
Tumore, chronische Infektionen, Autoimmunkrankheiten, Psoriasis,
Asthma, und Allergien zu behandeln, die Blutbildung zu regulieren
und die Wundheilung zu fördern.
-
In Übereinstimmung
mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden
Antikörper gegen
solche Polypeptide bereitgestellt.
-
In Übereinstimmung
mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden
Antagonisten zu solchen Polypeptiden bereitgestellt, die benutzt
werden können,
um die Aktivität
solcher Polypeptide, zum Beispiel bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten,
chronisch entzündlichen
Krankheiten, Histamin vermittelten allergischen Reaktionen, Asthma,
Arthritis, dem Prostaglandinunabhängigen Fieber, Knochenmarksdefekten,
Silikose, Sarcoidose, dem hypereosinophilen Syndrom und der Lungenentzündung, zu
hemmen.
-
In Übereinstimmung
mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden
auch Nucleinsäuresonden,
die Nucleinsäuremoleküle mit einer
ausreichenden Länge
beinhalten, um spezifisch mit einer Nucleinsäuresequenz der vorliegenden
Erfindung zu hybridisieren, bereitgestellt.
-
In Übereinstimmung
mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden
diagnostische Tests bereitgestellt, um Krankheiten nachzuweisen,
die mit der Expression von Polypeptiden und Mutationen in den Nucleinsäuresequenzen,
die solche Polypeptide codieren, in Zusammenhang stehen.
-
In Übereinstimmung
mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein
Verfahren bereitgestellt, um solche Polypeptide oder Polynucleotide,
die diese Polypeptide codieren, für in-vitro Zwecke zu benutzen,
die die wissenschaftliche Forschung, die Synthese von DNA und die
Herstellung von DNA-Vektoren
betreffen.
-
Diese
und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten den Fachleuten
aus den hier dargebotenen Lehren bekannt sein.
-
Die
folgenden Abbildungen erklären
die Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung und beabsichtigen nicht, den Umfang der
Erfindung, wie er in den Ansprüchen
umfasst ist, zu begrenzen.
-
1 zeigt
die cDNA-Sequenz und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz
von Ckβ-9. Die
23 Aminosäuren
am Anfang bilden die Leitsequenz, so dass das mutmaßliche reife
Polypeptid 111 Aminosäuren
beinhaltet. Es wird die Standard-Ein-Buchstaben-Abkürzung für Aminosäuren benutzt.
-
2 zeigt
die Aminosäure-Sequenz-Homologie
zwischen Ckβ-9
und dem reifen Peptid des Eotaxins (unten).
-
In Übereinstimmung
mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuren (Polynucleotide)
bereitgestellt, die die reifen Polypeptide, die die abgeleiteten
Aminosäure-Sequenzen
von 1 (SEQ ID Nr. 2) aufweisen, oder das reife Polypeptid
codieren, das von den cDNA-Clonen, die als ATCC-Hinterlegung Nr.
75803 am 7. Juni, 1994 hinterlegt wurden, codiert wird.
-
Das
Polynucleotid, das Ckβ-9
codiert, wurde in einer cDNA-Genbank entdeckt, die aus einem menschlichen
Lymphknoten der Brust abgeleitet wurde. Ckβ-9 ist strukturell mit der Chemokin-Familie
verwandt. Es besitzt einen offenen Leserahmen, der ein Protein mit
134 Aminosäureresten
codiert, von denen ungefähr
die ersten 23 Aminosäurereste
die mutmaßliche
Leadersequenz sind, so dass das reife Protein 111 Aminosäuren umfasst.
Das Protein zeigt den höchsten
Grad der Homologie zu Eotaxin mit 32% Identität und 69% Ähnlichkeit über eine Ausdehnung von 75
Aminosäureresten.
Es ist auch wichtig, dass die vier räumlich konservativen Cysteinreste
der Chemokine in den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung gefunden
werden.
-
Die
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können in Form von RNA oder in
Form von DNA, wobei DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA
beinhaltet, vorkommen. Die DNA kann als Doppelstrang oder als Einzelstrang
vorliegen, und wenn sie als Einzelstrang vorliegt, kann es sich
um den Codierungsstrang oder den Nicht-Codierungsstrang (Antisense)
handeln. Die Codierungs-Sequenz, die das reife Polypeptid codiert,
kann mit der Codierungs-Sequenz,
die in 1 (SEQ ID Nr. 1) gezeigt wird, oder mit der der
hinterlegten Clone identisch sein, oder es kann sich um eine unterschiedliche
Codierungs-Sequenz
handeln, die als ein Ergebnis der Redundanz oder der Degeneration
des genetischen Codes das gleiche reife Polypeptid wie die DNA in 1 (SEQ
ID Nr. 1) oder die hinterlegte cDNA codiert.
-
Es
werden die Polynucleotide, die die reifen Polypeptide der 1 (SEQ
ID Nr. 2) oder die reifen Polypeptide codieren, die von der hinterlegten
cDNA codiert werden, eingeschlossen: nur die Codierungs-Sequenz
für das
reife Polypeptid; die Codierungs-Sequenz für das reife Polypeptid und
weitere Codierungs-Sequenzen, wie die Leader- oder die sekretorische
Sequenz oder eine Proprotein-Sequenz; die Codierungs-Sequenz für das reife
Polypeptid (und wahlweise eine weitere Codierungs-Sequenz) und eine
Nicht-Codierungs-Sequenz wie Introns oder eine Nicht-Codierungs-Sequenz
5' und/oder 3' der Codierungs-Sequenz
der reifen Polypeptide.
-
So
umfasst der Ausdruck „Polynucleotide
codierend ein Polypeptid" ein
Polynucleotid, das nur die Codierungs-Sequenz des Polypeptides beinhaltet,
wie auch ein Polynucleotid, das eine weitere Codierungs- und/oder
eine Nicht-Codierungs-Sequenz
einschließt.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Varianten der vorstehend
beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente der Polypeptide, die
die hergeleitete Aminosäuresequenz
der 1 (SEQ ID Nr. 2) besitzen, oder des Polypeptids
codieren, das von der cDNA der hinterlegten Clone codiert wird.
Die Variante der Polynucleotide kann eine natürlich auftretende Allel-Variante
der Polynucleotide oder eine nicht-natürlich auftretende Variante
der Polynucleotide sein.
-
Deshalb
umfasst die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die die gleichen,
reifen Polypeptide, wie sie in 1 (SEQ ID
Nr. 2) dargestellt sind, oder die gleichen reifen Polypeptide codieren,
die von der cDNA der hinterlegten Clone codiert werden, wie auch
Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten Fragmente
der Polypeptide der 1 (SEQ ID Nr. 2) oder der Polypeptide
codieren, die von der cDNA der hinterlegten Clone codiert werden.
Solche Nucleotid-Varianten beinhalten Deletions-, Substitutions-,
Additions- oder Insertions-Varianten. Wie vorstehend angezeigt,
können
die Polynucleotide eine Codierungs-Sequenz besitzen, die eine natürlich auftretende
Allelvariante der Codierungs-Sequenz, wie sie 1 (SEQ
ID Nr. 2) gezeigt wird, oder der Codierungs-Sequenz der hinterlegten
Clone ist. Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, ist eine allelische
Variante eine wechselnde Form einer Polynucleotid-Sequenz, die eine
Substitution, Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotiden
aufweisen kann, die die Funktion des codierten Polypeptides nicht
wesentlich ändern.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Polynucleotide, deren Codierungs-Sequenz
der reifen Polypeptide im gleichen Leserahmen mit einer Polynucleotid-Sequenz
verknüpft
sein kann, die bei der Expression und Sekretion von Polypeptiden
aus einer Wirtszelle hilft zum Beispiel eine Leadersequenz, die
als eine sekretorische Sequenz der Kontrolle des Transportes von
Polypeptiden aus der Zelle dient. Das Polypeptid, das eine Leadersequenz
hat, ist ein Präprotein
und die Leadersequenz kann von der Wirtszelle abgespalten werden,
um die reife Form des Polypeptids zu bilden. Die Polynucleotide
können
auch ein Proprotein, das aus dem reifen Protein plus zusätzlichen
5'-Aminosäureresten
besteht, codieren. Ein reifes Protein, das eine Prosequenz hat,
ist ein Proprotein und ist eine inaktive Form des Proteins. Sobald
die Prosequenz abgespalten wird, bleibt ein aktives, reifes Protein übrig.
-
Deshalb
können
zum Beispiel die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung das reife
Protein oder ein Protein, das eine Prosequenz hat, oder ein Protein,
das beides, eine Prosequenz und eine Präsequenz (Leadersequenz) hat,
codieren.
-
Die
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können die Codierungs-Sequenz
auch im Rahmen mit einer Markersequenz verknüpft haben, was die Reinigung
der Polypeptide der vorliegenden Erfindung ermöglicht. Die Marker-Sequenz
kann im Fall eines bakteriellen Wirtes ein Hexa-Histidin-Anhang
sein, der durch einen pQE-9-Vektor
bereitgestellt wird, um für
die Reinigung der reifen Polypeptide, die mit dem Marker verbunden
sind, zu sorgen, oder die Marker-Sequenz kann ein Hämagglutinin
(HA)-Anhang sein, wenn ein Säuger-Wirt,
z.B. COS-7-Zellen, benutzt wird. Der HA- Anhang stimmt mit einem Epitop, das
aus dem Influenza-Hämagglutinin-Protein
stammt, überein
(Wilson, I., et al., Cell, 37: 767 (1984)).
-
Der
Begriff „Gen" meint das Segment
der DNA, das an der Herstellung einer Polypeptidkette beteiligt ist;
er umfasst Regionen, die der Codierungs-Region (Leader- und Trailer-)
vorangehen und folgen, wie auch intervenierende Sequenzen (Introns)
zwischen einzelnen codierenden Segmenten (Exons).
-
Die
Fragmente mit der ganzen Länge
des Gens der vorliegenden Erfindung können als eine Hybridisierungssonde
für eine
cDNA-Genbank benutzt werden, um eine cDNA mit vollständiger Länge zu isolieren und
um anderen cDNAs, die eine hohe Ähnlichkeit
in der Sequenz zu dem Gen oder eine ähnliche biologische Aktivität haben,
zu isolieren. Sonden dieses Typs haben vorzugsweise wenigstens 30
Basen und können,
zum Beispiel, 50 oder mehr Basen enthalten. Die Sonde kann auch
benutzt werden, um einen cDNA-Clon zu identifizieren, der mit einem
Transkript der ganzen Länge
und einem genomischen Clon oder Clonen übereinstimmt, die das vollständige Gen,
einschließlich
der regulatorischen und Promotorregionen, Exons und Introns beinhalten.
Ein Beispiel einer Durchsuchung umfasst die Isolation der Codierungs-Region
des Gens, indem eine bekannte DNA-Sequenz benutzt wird, um eine
Oligonucleotidsonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide,
die eine übereinstimmende
Sequenz zu der des Gens der vorliegenden Erfindung haben, werden
benutzt, um eine menschliche cDNA-, genomische DNA- oder mRNA-Genbank zu durchmustern,
um zu bestimmen, mit welchen Mitgliedern der Genbank die Sonde hybridisiert.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Polynucleotide, die mit
den vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, wenn wenigstens
90% und stärker
bevorzugt wenigstens 95% Identität
zwischen den Sequenzen bestehen. Die vorliegende Erfindung betrifft
besonders Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit
den vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie
bisher benutzt, bedeutet der Ausdruck „stringente Bedingungen", dass die Hybridisierung
nur stattfindet, wenn wenigstens 95% und vorzugsweise wenigstens
97% Identität
zwischen den Sequenzen bestehen. Die Polynucleotide, die mit den
vorstehend beschriebenen Polynucleotiden in einer bevorzugten Ausführungsform
hybridisieren, codieren Polypeptide, die im Wesentlichen die gleiche
biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid
beinhalten, das von den cDNAs der 1 (SEQ ID
Nr. 1) oder der (den) hinterlegten cDNA(s) codiert wird.
-
Alternativ
dazu kann das Polynucleotid wenigstens 20 Basen haben, vorzugsweise
30 Basen und stärker
bevorzugt wenigstens 50 Basen, die mit einem Polynucleotid der vorliegenden
Erfindung hybridisieren, und es weist eine Identität dazu auf,
wie vorstehend beschrieben wurde, und behält die Aktivität bei oder
auch nicht. Solche Polynucleotide können zum Beispiel als Sonden
für das
Polynucleotid der SEQ ID Nr. 1 eingesetzt werden, zum Beispiel zur
Gewinnung des Polynucleotides, oder als diagnostische Sonde oder
als PCR-Primer.
-
So
betrifft die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die wenigstens
90% und stärker
bevorzugt wenigstens 95% Identität
mit einem Polynucleotid aufweisen, das das Polypeptid der SEQ ID
Nr. 2 codiert, wie auch Fragmente, wobei die Fragmente wenigstens
30 Basen und vorzugsweise wenigstens 50 Basen besitzen, und Polypeptide,
die von solchen Polynucleotiden codiert werden.
-
Die
nachstehend bezeichnete(n) Hinterlegung(en) wird unter den Bedingungen
des Budapester Vertrages über
die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Microorganismen
zum Zweck von Patentverfahren erhalten. Diese Hinterlegungen werden
lediglich als Annehmlichkeit für
Fachleute bereitgestellt und sind kein Zugeständnis, dass eine Hinterlegung
unter 35 U.S.C. §112
erforderlich ist. Die Sequenz der Polynucleotide, die in den hinterlegten
Materialien enthalten sind, wie auch die Aminosäuresequenz der Polypeptide,
die davon codiert wird, sind im Falle eines jeden Konfliktes mit
einer Beschreibung der Sequenzen hierin maßgeblich. Eine Lizenz kann
erforderlich sein, um die hinterlegten Materialien herzustellen,
zu benutzen oder zu verkaufen und es wird hiermit keine solche Lizenz
gewährt.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Chemokin-Polypeptide, die
die hergeleitete Aminosäuresequenz
der 1 (SEQ ID Nr. 2) haben oder die die Aminosäuresequenz
besitzen, die von der hinterlegten cDNA codiert wird, wie auch Fragmente,
Analoge und Derivate dieser Polypeptide.
-
Die
Begriffe „Fragmente", „Derivate", und „Analoge" bedeuten, wenn sie
sich auf die Polypeptide der 1 (SEQ ID
Nr. 2) beziehen oder von der hinterlegten cDNA codiert werden, Polypeptide,
die die gleiche wesentliche biologische Funktion oder Aktivität wie solche
Polypeptide bewahren. Deshalb beinhaltet ein Analog ein Proprotein,
das durch Abspaltung des Proproteinanteils aktiviert werden kann,
um ein aktives reifes Polypeptid zu erhalten.
-
Die
Chemokin-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können rekombinante
Polypeptide, natürliche Polypeptide
oder synthetische Polypeptide, vorzugsweise aber rekombinante Polypeptide
sein.
-
Das
Fragment, das Derivat oder das Analog der Polypeptide der 1 (SEQ
ID Nr. 2) oder das, das von der hinterlegten cDNA codiert wird,
kann (i) eines sein, in dem ein oder mehrere Aminosäurereste
mit einem konservativen oder nicht-konservativen Aminosäurerest
(vorzugsweise einem konservativen Aminosäurerest) substituiert sind
und ein solcher substituierter Aminosäurerest kann oder kann nicht
vom genetischen Code codiert werden, oder (ii) eines sein, in dem
ein oder mehrere Aminosäurereste
eine Substituentengruppe beinhalten, oder (iii) eines sein, in dem
das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung verknüpft ist,
wie einer Verbindung, die die Halbwertszeit des Polypeptides erhöht (zum
Beispiel Polyethylenglykol), oder (iv) eines sein, in dem die zusätzlichen
Aminosäuren
mit einem reifen Polypeptid verbunden sind, wie einer Leader- oder
sekretorischen Sequenz oder einer Sequenz, die zur Reinigung des
reifen Polypeptides oder der Proproteinsequenz gebraucht wird. Solche
Fragmente, Derivate und Analoge werden als im Kenntnisstand der
Fachleute aufgrund der hier beschriebenen Lehren eingeschlossen
betrachtet.
-
Die
Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden
vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und sind vorzugsweise
bis zur Homogenität
gereinigt.
-
Der
Begriff „isoliert" bedeutet, dass das
Material aus seiner ursprünglichen
Umgebung entfernt wird (zum Beispiel die natürliche Umgebung, wenn es natürlich vorkommt).
Ein natürlich
vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden
Tier vorkommt, ist zum Beispiel nicht isoliert, aber das gleiche Polynucleotid
oder Polypeptid, das von einigen oder allen coexistierenden Substanzen
im natürlichen
System abgetrennt ist, ist isoliert. Solche Polynucleotide können Teil
eines Vektors sein und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide
können
Teil einer Zusammensetzung sein und dennoch isoliert sein, weil
ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung kein Teil seiner
natürlichen
Umwelt ist.
-
Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung beinhalten das Polypeptid
mit der SEQ ID Nr. 2 (im Besonderen das reife Polypeptid) wie auch
Polypeptide; die wenigstens 70% Ähnlichkeit
(vorzugsweise wenigstens 70% Identität) mit dem Polypeptid der SEQ
ID Nr. 2 haben und stärker
bevorzugt wenigstens 90% Ähnlichkeit
(stärker
bevorzugt wenigstens 90% Identität)
mit dem Polypeptid mit der SEQ ID Nr. 2 haben und noch stärker bevorzugt
wenigstens 95% Ähnlichkeit
(noch stärker
bevorzugt wenigstens 95% Identität)
mit dem Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 haben, und auch Teile solcher
Polypeptide mit einem solchen Anteil der Polypeptide, der im Allgemeinen
wenigstens 30 Aminosäuren
und stärker
bevorzugt wenigstens 50 Aminosäuren
beinhaltet.
-
Wie
im Fachgebiet bekannt ist, wird die „Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden bestimmt,
indem man die Aminosäuresequenz
und die konservativen Aminosäuresubstituenten
eines Polypeptides mit der Sequenz eines zweiten Polypeptides vergleicht.
-
Fragmente
oder Teile der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zur
Herstellung von entsprechenden Polypeptiden von vollständiger Länge mit
Hilfe der Peptidsynthese verwendet werden; dazu können die
Fragmente als Zwischenglieder zur Produktion von Polypeptiden von
vollständiger
Länge gebraucht
werden. Fragmente oder Teile der Polynucleotide der vorliegenden
Erfindung können
benutzt werden, um die Polynucleotide von vollständiger Länge der vorliegenden Erfindung
herzustellen.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die die Polynucleotide
der vorliegenden Erfindung beinhalten, sowie Wirtszellen, die gentechnisch
mit Vektoren der Erfindung verändert
wurden, und die Produktion von Polypeptiden der Erfindung mit rekombinanten
Techniken.
-
Wirtszellen
sind gentechnisch mit den Vektoren dieser Erfindung verändert (transduziert
oder transformiert oder transfiziert), die zum Beispiel ein Clonierungsvektor
oder ein Expressionsvektor sein können. Der Vektor kann zum Beispiel
in Form eines Plasmides, eines viralen Teilchens, eines Phagen etc.
vorliegen. Die gentechnisch veränderte
Wirtszelle kann in konventionellen Nährmedien kultiviert werden,
die in geeignetem Maß für die Aktivierung
von Promotoren, der Selektion von Transformanten oder der Amplifizierung
der Ckβ-9Gene verändert wurden.
Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und andere sind solche,
die schon vorher bei den Wirtszellen, die für die Expression selektiert
wurden, benutzt wurden und werden dem normalen Fachmann offensichtlich
sein.
-
Die
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Produktion von Polypeptiden
mit rekombinanten Techniken eingesetzt werden. Deshalb können die
Polynucleotide zum Beispiel in einer Vielfalt von Expressions-Vektoren
zur Expression eines Polypeptides eingesetzt werden. Solche Vektoren
beinhalten chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen,
zum Beispiel Derivate von SV40, bakterielle Plasmide, Phagen-DNA,
Baculovirus, Hefeplasmide, Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden
und Phagen-DNA stammen, virale DNA wie Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus
und Pseudorabies. Jedoch kann auch irgendein anderer Vektor benutzt
werden, so lange er im Wirt replizierbar und lebensfähig ist.
-
Die
geeignete DNA-Sequenz kann in den Vektor mit einer Vielzahl an Methoden
inseriert werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz in eine geeignete
Restriktionsendonuclease-Stelle(n) mit Verfahren, die im Fachgebiet
bekannt sind, inseriert. Solche und andere Verfahren werden als
im Kenntnisstand von Fachleuten eingeschlossen betrachtet.
-
Die
DNA-Sequenz im Expressions-Vektor ist funktionell mit (einer) geeigneten
Expressions-Kontroll-Sequenz(en) (Promotor) verbunden, um die mRNA-Synthese
zu lenken. Als bezeichnende Beispiele für solche Promotoren werden
hier genannt: LTR oder SV40-Promotor, E. coli-lac oder -trp, der
Phage lambda PL-Promotor und andere Promotoren,
die dafür
bekannt sind, die Expression von Genen in prokaryontischen oder
eukaryontischen Zellen oder deren Viren zu kontrollieren. Der Expressions-Vektor
beinhaltet auch eine Ribosomen-Bindungsstelle für den Translations-Beginn und
einen Transkriptions-Terminator. Der Vektor kann auch geeignete
Sequenzen zur Steigerung der Expression beinhalten.
-
Weiterhin
beinhalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere
selektierbare Markergene, um ein phänotypisches Merkmal für die Selektion
der transformierten Wirtszellen bereitzustellen, wie die Dihydrofolat-Reduktase
oder die Neomycin-Resistenz für
eukaryontische Zellkulturen oder die Tetracyclin- oder die Ampicillin-Resistenz
in E. coli.
-
Der
Vektor, der eine geeignete DNA-Sequenz, wie vorstehend beschrieben,
wie auch einen geeigneten Promotor oder eine geeignete Kontrollsequenz
enthält,
kann dazu eingesetzt werden, einen geeigneten Wirt zu transformieren,
damit der Wirt das Protein exprimieren kann.
-
Als
bezeichnende Beispiele für
geeignete Wirte werden genannt: Bakterienzellen wie E. coli, Streptomyces,
Salmonella typhimurium, Pilz-Zellen wie Hefe, Insektenzellen wie
Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, Tier-Zellen wie CHO, COS oder
Bowes-Melanom; Adenoviren;
Pflanzenzellen etc. Die Selektion eines geeigneten Wirtes wird als
im Kenntnisstand von Fachleuten aufgrund der Lehren hierin eingeschlossen
betrachtet.
-
Die
vorliegende Erfindung beinhaltet im Besonderen auch recombinante
Konstrukte, die eine oder mehrere der vorstehend ausführlich beschriebenen
Sequenzen enthalten. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie ein
Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung
in Vorwärts-
oder rückwärtiger Orientierung
inseriert wurde. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführung umfasst
das Konstrukt weiterhin regulatorische Sequenzen wie zum Beispiel
einen Promotor, der funktionell mit der Sequenz verbunden ist. Große Zahlen
geeigneter Vektoren sind dem Fachmann bekannt und käuflich zu
erwerben. Die folgenden Vektoren werden als Beispiele bereitgestellt:
Bakterien: pQE70, pQE60, pQE-9 (Quiagen), pBS, pD10, Phagescript,
psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene),
ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryonten:
pWLNEO, pSV2CAT, pOG-44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG,
pSVL (Pharmacia). Jedoch kann jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor
benutzt werden, solange er replizierbar und lebensfähig im Wirt
ist.
-
Promotor-Regionen
können
aus jedem gewünschten
Gen mit CAT(Chloramphenicol Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren
mit selektierbaren Markern selektiert werden. Zwei geeignete Vektoren sind
pKK232-8 und pCM7. Speziell benannte bakterielle Promotoren beinhalten
lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL und trp. Eukaryontische Promotoren beinhalten
den sehr frühen
CMV-Promotor, HSV-Thymidinkinase-Promotor,
frühen
und späten
SV40-Promotor, LTRs aus Retroviren und Maus-Metallothionein-I-Promotor. Die
Selektion des geeigneten Vektors und Promotors ist im Kenntnisstand
des Fachmanns.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen
Konstrukte enthalten. Die Wirtszellen können eine höhere eukaryontische Zelle wie
eine Säugerzelle
sein oder eine niedere eukaryontische Zelle wie eine Hefezelle oder
die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie eine Bakterienzelle
sein. Die Einführung
des Konstruktes in die Wirtszelle kann durch eine Calciumphosphat-Transfektion,
eine DEAE-Dextran vermittelte Transfektion oder Elektroporation
ausgeführt
werden (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular
Biology, (1986)).
-
Die
Konstrukte in den Wirtszellen können
in der üblichen
Weise benutzt werden, um das Genprodukt, das von der rekombinanten
Sequenz codiert wird, herzustellen. Alternativ dazu können die
Polypeptide der Erfindung synthetisch mit den üblichen Peptidsynthesegeräten hergestellt
werden.
-
Reife
Proteine können
in Säugerzellen,
Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter
Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translations-Systeme können genauso
benutzt werden, um solche Proteine herzustellen, indem man RNAs,
die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet
werden, benutzt. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren
zum Gebrauch in prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden
von Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite
Ausgabe, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) beschrieben.
-
Die
Transkription der DNA in höheren
Eukaryonten, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert,
wird durch Einbringen einer Enhancer-Sequenz in den Vektor erhöht. Enhancer
sind cis-agierende Elemente der DNA, normalerweise mit etwa 10 bis
300 bp, die auf einen Promotor wirken, um dessen Transkription zu
erhöhen.
Beispiele beinhalten den SV 40-Enhancer auf der späten Seite
des Replikationsursprungs bei bp 100 bis 270, einen Cytomegalievirus-Enhancer
für den
frühen
Promotor, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs
und den Adenovirus-Enhancer.
-
Die
rekombinanten Expressions-Vektoren schließen generell die Replikationsursprünge und
selektierbaren Marker, die eine Transformation der Wirtszelle erlauben,
mit ein, zum Beispiel, das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und
das S. cerevisiae-TRP1-Gen, und einen Promotor, der aus einem stark
exprimierten Gen kommt, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen strukturellen
Sequenz zu steuern. Solche Promotoren können aus Operons, die glycolytische
Enzyme wie die 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), den α-Faktor, die
saure Phosphatase oder Hitzschock-Proteine und andere codieren,
hergeleitet werden. Die heterologe strukturelle Sequenz ist in einer
geeigneten Phase mit den Translationsinitiations- und den Terminationssequenzen
zusammengesetzt, und vorzugsweise mit einer Leader-Sequenz, die
fähig ist,
die Sekretion der translatierten Proteine in den periplasmatischen
Raum oder das extrazelluläre
Medium zu steuern. Die heterologe Sequenz kann wahlweise ein Fusions-Protein
codieren, das ein N-terminales
Identifikations-Peptid codiert, das gewünschte Eigenschaften wie zum
Beispiel die Stabilisierung oder die einfache Reinigung der exprimierten
rekombinanten Produkte ermöglicht.
-
Gebräuchliche
Expressions-Vektoren zum Einsatz in Bakterien werden durch Einfügen einer
strukturellen DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen
mit geeigneten Translationsinitiations- und Terminationssignalen
in einer funktionellen Lesephase mit einem funktionellen Promotor
konstruiert. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotypisch
selektierbare Marker und einen Replikationsursprung, um den Erhalt
des Vektors sicherzustellen und, wenn gewünscht, die Amplifikation im
Wirt zu ermöglichen.
Für die Transformation
geeignete prokaryontische Wirte beinhalten E. coli, Bacillus subtilis,
Salmonella typhimurium und verschiedene Arten der Gattungen Pseudomonas,
Streptomyces und Staphylococcus, obwohl andere wahlweise auch eingesetzt
werden können.
-
Als
ein repräsentatives,
aber nicht begrenzendes Beispiel können geeignete Expressions-Vektoren zum
Gebrauch in Bakterien einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen
Replikationsursprung umfassen, die von käuflich zu erwerbenden Plasmiden,
die genetische Elemente des gut bekannten Clonierungs-Vektors pBR322
(ATCC 37017) enthalten, stammen. Solche käuflich zu erwerbende Vektoren
beinhalten zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,
Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wi, USA). Diese pBR322-"Rückgrat"-Abschnitte werden
mit einem geeigneten Promotor und der strukturellen Sequenz, die
exprimiert werden soll, kombiniert.
-
Nach
Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und Züchten des
Wirtsstammes bis zu einer geeigneten Zell-Dichte wird der ausgewählte Promotor
mit geeigneten Mitteln (zum Beispiel einem Temperatur-Wechsel oder
chemischer Induktion) induziert und die Zellen werden für eine zusätzliche
Zeitspanne kultiviert.
-
Die
Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, mit
physikalischen oder chemischen Mitteln zerstört und der erhaltene rohe Extrakt
wird zur weiteren Aufreinigung zurückbehalten.
-
Mikrobielle
Zellen, die zur Expression von Proteinen genutzt werden, können mit
jeder passenden Methode, einschließlich dem Gefrieren-Auftau-Wechsel,
Ultraschall, der mechanischen Zerstörung oder dem Einsatz von Agenzien,
die Zellen lysieren, zerstört
werden. Diese Methoden sind dem Fachmann wohl bekannt.
-
Verschiedene
Kultur-Systeme von Säugerzellen
können
auch zur Expression rekombinanter Proteine genutzt werden. Beispiele
von Säugerexpressions-Systemen
beinhalten die COS-7-Linien der Affennieren-Fibroblasten, die von
Gluzman, Cell, 23: 175 (1981) beschrieben wurden, und andere Zellinien,
die in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, zum
Beispiel die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zellinien. Säugerexpressions-Vektoren
umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und
Enhancer und auch jede nötige
Ribosomen-Bindungs-Stelle,
Polyadenylierungs-Stellen, Spleißdonor- und Akzeptorstellen,
transkriptionale Terminations-Sequenzen und flankierende nicht-transkribierte
5'-Sequenzen. Die DNA-Sequenzen,
die von den Spleiß-
und Polyadenylierungsstellen von SV40 stammen, können benutzt werden, um die
benötigten
nicht-transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
-
Die
Ckβ-9 Polypeptide
können
aus den rekombinanten Zellkulturen mit Methoden wie der Ammoniumsulfat-
oder der Ethanol-Fällung,
der sauren Extraktion, der Anionen- oder Kationenaustauschchromatografie, der
Phosphocellulosechromatografie, der hydrophoben Interaktions-Chromatografie,
der Affinitätschromatografie,
der Hydroxylapatitchromatografie und der Lektinchromatografie erhalten
und gereinigt werden. Schritte zur Neufaltung der Proteine können, falls
nötig,
benutzt werden, um die Konfiguration des reifen Proteins zu vervollständigen.
Zum Schluss kann die Hochleistungsflüssigkeits-Chromatografie (HPLC) benutzt werden, um
die letzten Reinigungsschritte auszuführen.
-
Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein natürlich gereinigtes
Produkt oder ein Produkt aus chemischen synthetischen Verfahren
sein oder mit rekombinanten Techniken aus prokaryontischen oder eukaryontischen
Wirten (zum Beispiel von Bakterien-, Hefe-, höheren Pflanzen-, Insekten-
und Säugerzellen in
Kultur) produziert werden. Abhängig
von dem Wirt, der in dem rekombinanten Herstellungsverfahren benutzt wird,
können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert oder nicht
glycosyliert sein. Die Polypeptide der Erfindung können auch
einen Methionin-Aminosäurerest
am Anfang besitzen.
-
Die
Ckβ-9-Polypeptide
können
benutzt werden, um die Kolonienbildung der Knochenmarksstammzellen
als zusätzliche
schützende
Behandlung während
einer Krebs-Chemotherapie und für
Leukämie
zu hemmen.
-
Die
Chemokin-Polypeptide können
auch benutzt werden, um die Vermehrung von epidermalen Keratinocyten
zu hemmen, um Psoriasis zu behandeln, die durch eine übermäßige Kerationocytenvermehrung
charakterisiert ist.
-
Die
Chemokin-Polypeptide können
auch benutzt werden, um feste Tumore zu behandeln, indem die Invasion
und Aktivierung von Wirts-Verteidgungszellen, zum Beispiel cytotoxischen
T-Zellen und Macrophagen, stimuliert werden. Sie können auch
benutzt werden, um die Wirtsabwehr gegen resistente chronische Infektionen,
zum Beispiel Mycobakterien-Infektionen, über die Anziehungskraft und
Aktivierung von microbiziden Leukocyten zu fördern.
-
Die
Chemokin Polypeptide können
auch benutzt werden, um Autoimmunkrankheiten und lymphocytische
Leukämien
zu behandeln, indem die Vermehrung von T-Zellen durch die Biosynthese
von IL2- gehemmt wird.
-
Ckβ-9 kann auch
zur Wundheilung eingesetzt werden, sowohl durch die Ingangsetzung
der Fremdkörperbereinigung
als auch die Rekrutierung von entzündungsförderndem Bindegewebe und auch über seine Kontrolle
einer übermäßigen TGFβ vermittelten
Fibrose. In der gleichen Art und Weise kann Ckβ-9 auch genutzt werden, um andere
fibrotische Fehlfunktionen wie Leberzirrhose, Osteoarthritis und
Lungenfibrose zu behandeln.
-
Die
Chemokin-Polypeptide erhöhen
auch die Präsenz
von Eosinophilen, die eine bestimmte Funktion bei der Abtötung von
Parasitenlarven haben, die in Gewebe einwandern, wie bei Schistosomiasis,
Trichinose und Ascariasis.
-
Sie
können
auch dazu benutzt werden, die Blutbildung zu regulieren, indem die
Aktivierung und die Differenzierung der verschiedenen blutbildenden
Progenitor- Zellen,
zum Beispiel die Freisetzung reifer Leukocyten aus dem Knochenmark
nach einer Chemotherapie, reguliert wird.
-
Die
Polynucleotide und Polypeptide, die von solchen Polynucleotiden
codiert werden, können
auch für in
vitro-Zwecke, die die wissenschaftliche Forschung, die Synthese
von DNA und die Herstellung von DNA-Vektoren betreffen, und für die Herstellung
von Therapeutika und Diagnostika zur Behandlung von menschlichen
Krankheiten eingesetzt werden.
-
Die
Fragmente der Ckβ-9-Gene
vollständiger
Länge können als
eine Hybridisierungssonde für
eine cDNA-Genbank zur Isolation des Gens vollständiger Länge und zur Isolation anderer
Gene, die eine hohe Ähnlichkeit
mit der Sequenz des Gens oder eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen,
benutzt werden. Sonden dieses Typs können zum Beispiel zwischen
20 und 2000 Basenpaare aufweisen. Vorzugsweise jedoch haben die
Sonden zwischen 30 und 50 Basenpaare. Die Sonde kann auch benutzt
werden, um cDNA-Clone, die einem Transkript vollständiger Länge entsprechen,
und einen genomischen Clon oder genomische Clone, die die vollständigen Gene
einschließlich
der regulatorischen und Promotor-Regionen, Exons und Introns beinhalten,
zu identifizieren. Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst die
Isolation der Codierungsregion des Gens, indem die bekannte DNA-Sequenz
zur Synthese einer Oligonnucleotidsonde verwendet wird. Markierte
Oligonucleotide, die eine übereinstimmende
Sequenz mit den Genen der vorliegenden Erfindung haben, werden benutzt,
um eine menschliche cDNA-, genomische DNA- oder mRNA-Genbank zu
durchmustern, um zu bestimmen, welche Mitglieder der Genbank mit
der Sonde hybridisieren.
-
Diese
Erfindung betrifft auch den Gebrauch des CKβ-9-Gens als Teil eines diagnostischen
Tests zur Bestimmung von Krankheiten oder der Anfälligkeit
für Krankheiten,
die auf der Gegenwart von Mutationen in der Ckβ-9-Nucleinsäuresequenz zurückzuführen sind.
Solche Krankheiten stehen mit der Unter-Expression der Chemokin-Polypeptide,
zum Beispiel bei Tumoren und Krebs in Zusammenhang.
-
Individuen,
die Mutationen im Ckβ-9-Gen
tragen, können
auf DNA-Ebene mit einer Vielzahl von Techniken bestimmt werden.
Nucleinsäuren
zur Diagnose können
von Patientenzellen, zum Beispiel aus Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie
und Autopsiematerial erhalten werden. Die genomische DNA kann direkt
zum Nachweis genutzt werden oder kann vor der Analyse enzymatisch,
indem die PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163–166 (1986)) genutzt wird,
vermehrt werden. RNA oder cDNA können
auch für
denselben Zweck benutzt werden. Zum Beispiel können PCR-Primer, die mit der Nucleinsäure, die
das Ckβ-9-Gen
codiert, übereinstimmt,
genutzt werden, um Ckβ-9-Mutationen
zu identifizieren und zu analysieren. Zum Beispiel können Deletionen
und Insertionen über
die Änderung
der Größe des amplifizierten
Produktes im Vergleich zu dem normalen Genotyp bestimmt werden.
Punktmutationen können über eine
Hybridisierung der vermehrten DNA mit einer radioaktiv markierten
Ckβ-9-RNA
oder alternativ dazu, mit radioaktiv markierten CKβ-9-antisense-DNA-Sequenzen
identifiziert werden. Perfekt passende Sequenzen können von
fehlerhaften Duplexmolekülen über einen
Verdau mit RNAse A oder den Änderungen
in der Schmelztemperatur unterschieden werden.
-
Genetisches
Testen, das auf Unterschieden in der DNA-Sequenz beruht, kann über die
Bestimmung der Änderung
der elektrophoryetischen Beweglichkeit der DNA-Fragmente in Gelen mit oder ohne denaturierende
Agenzien durchgeführt
werden. Kleine Deletionen und Insertionen in der Sequenz können mittels
Gelelektrophorese mit hoher Auflösung
sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente mit verschiedenen Sequenzen können mit
denaturierenden Formamid-Gradienten-Gelen unterschieden werden,
in denen sich die verschiedenen DNA-Fragmente in dem Gel an verschiedenen
Positionen in Übereinstimmung
mit ihren spezifischen Schmelztemperaturen oder Partial-Schmelztemperaturen,
langsamer fortbewegen werden (vgl. zum Beispiel Myers et al., Science,
230: 1242 (1985)).
-
Änderungen
in der Sequenz an spezifischen Stellen können mit den Nuclease-Protektions-Tests
wie RNAse und S1-Protektion oder der chemischen Spaltungsmethode
aufgedeckt werden (zum Beispiel, Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397–4401 (1985)).
-
Deshalb
kann die Bestimmung einer spezifischen DNA-Sequenz mit Methoden
wie Hybridisierung, RNAse-Protektion, chemischer Spaltung, direkter
DNA-Sequenzierung
oder dem Gebrauch von Restriktionsenzymen (zum Beispiel Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus
(RFLP)) und Southern-Blott-Verfahren
der genomischen DNA erreicht werden.
-
Zusätzlich zu
den üblicheren
Methoden der Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch mit der
in situ-Analyse bestimmt werden.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Test zur
Bestimmung von geänderten Mengen
von Ckβ-9-Proteinen
in verschiedenen Geweben, da eine Über-Expression der Proteine
verglichen mit einer normalen Kontroll-Gewebeprobe die Gegenwart
einer Krankheit oder Anfälligkeit
für eine
Krankheit, zum Beispiel einem Tumor, zeigen kann. Tests, die benutzt
werden, um Ckβ-9-Protein-Mengen
in einer Probe von einem Wirt zu bestimmen, sind dem Fachmann wohl
bekannt und beinhalten Radioimmunotests, kompetitive Bindungstests,
die Western-Blot-Analyse, ELISA-Tests und den „Sandwich"-Tests. Ein ELISA-Test (Coligan, et
al., Current Protocols in Immunology, 1 (2), Kapitel 6, (1991))
umfasst zuerst die Herstellung eines Antikörpers, der zu dem Ckβ-9-Antigen
spezifisch ist, vorzugsweise eines monoclonalen Antikörpers. Zusätzlich dazu
kann ein Reporter-Antikpörper
gegen den monoclonalen Antikörper
hergestellt werden. An den Reporter-Antikörper wird ein detektierbares
Reagenz wie Radioaktivität,
Fluoreszenz oder in diesem Beispiel ein Meerrettich-Peroxidase-Enzym
angehängt.
Dem Wirt wird eine Probe entnommen und auf einer festen Unterlage,
zum Beispiel einer Polystyrolschale, die die Proteine aus der Probe
bindet, inkubiert. Alle freien Proteinbindungsstellen auf der Schale
werden dann durch Inkubation mit einem nicht-spezifischen Protein
wie Rinderserumalbumin abgedeckt. Als nächstes wird der monoclonale
Antikörper
in der Schale inkubiert; in dieser Zeit binden die monoclonalen
Antikörper
an jedes Ckβ-9-Protein, das an der
Polystyrolschale haftet. Alle ungebundenen monoclonalen Antikörper werden
mit Puffer ausgewaschen. Der Reporter-Antikörper, der mit der Meerrettich-Peroxidase
verbunden ist, wird nun in die Schale gegeben und bindet an jeden
monoclonalen Antikörper,
der mit dem Ckβ-9
verbunden ist. Ungebundene Reporter-Antikörper werden dann ausgewaschen. Dann
werden Peroxidase-Substrate
in die Schale gegeben und die Menge an gebildeter Farbe in einer
vorgegebenen Zeit ist eine Maß für die Menge
an Ckβ-9-Protein,
die in einem vorgegebenen Volumen einer Patientenprobe vorhanden
ist, wenn sie mit einer Standard-Kurve verglichen wird.
-
Ein
Konkurrenz-Test kann benutzt werden, in dem die Antikörper, die
zu Ckβ-9
spezifisch sind, an einen festen Träger angeheftet werden und markiertes
Ckβ-9 und
die Probe, die von einem Wirt stammt, über den feste Träger gegeben
werden, und der Gehalt an Markierung, der zum Beispiel mit der Flüssigkeitsscintillationschromatografie
bestimmt wird, kann mit der Menge an Ckβ-9 in der Probe korreliert werden.
-
Ein „Sandwich"-Test ist so ähnlich wie
ein ELISA-Test. In einem „Sandwich"-Test wird Ckβ-9 über einen festen
Träger
geschickt und bindet an Antikörper,
die an dem festen Träger
angelagert sind. Ein zweiter Antikörper wird dann an das Ckβ-9 gebunden.
Ein dritter Antikörper,
der markiert und spezifisch zu dem zweiten Antikörper ist, wird dann über den
festen Träger
gegeben und bindet an den zweiten Antikörper und der Gehalt kann dann
quantifiziert werden.
-
Diese
Erfindung stellt eine Methode zur Identifikation des Rezeptors von
Ckβ-9-Polypeptiden bereit. Das
Gen, das den Rezeptor codiert, kann mit zahlreichen Methoden, die
dem Fachmann bekannt sind, identifiziert werden, zum Beispiel dem
Liganden-Panning und der FACS-Sortierung (Coligan, et al., Current
Protocols in Immun. 1 (2), Kapitel 5 (1991)). Vorzugsweise wird
das Expressions-Clonieren ausgeführt,
wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle, auf die Polypeptide reagiert,
hergestellt wird und eine cDNA-Genbank, die aus dieser RNA aufgebaut
ist, in Pools unterteilt und benutzt wird, um COS-Zellen oder andere
Zellen, die nicht auf die Polypeptide reagieren, zu transfizieren.
Transfizierte Zellen, die auf Objektträgern aus Glas gezüchtet werden,
werden den markierten Polypeptiden ausgesetzt. Die Polypeptide können mit
einer Vielzahl von Mitteln, einschließlich der Iodierung oder dem
Einbringen einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase,
markiert werden. Nach der Fixierung und der Inkubation werden die
Objektträger
einer autoradiographischen Analyse unterworfen. Positive Poole werden
identifiziert und Subpoole werden hergestellt und erneut transfiziert,
indem sich wiederholende Subpooling- und erneute Durchmusterungsverfahren
mit letztendlicher Ernte eines Einzel-Clons, der den möglichen
Rezeptor codiert, durchlaufen werden.
-
Als
ein alternativer Ansatz zur Identifikation eines Rezeptors können die
markierten Polypeptide an die Zellmembran oder an Extrakt-Präparationen,
die das Rezeptormolekül
exprimieren, über
Photoaffinität,
gebunden werden. Quervernetztes gebundenes Material wird mittels
PAGE-Analyse aufgelöst
und einem Röntgenfilm
ausgesetzt. Der markierte Komplex, der den Rezeptor für die Polypeptide
enthält,
kann herausgeschnitten werden und in Peptid-Fragmente aufgetrennt
werden und einer Protein-Mikro-Sequenzierung unterworfen werden.
Die Aminosäuresequenz,
die von der Mikro-Sequenzierung erhalten wird, kann benutzt werden,
um einen Satz von degenerierten Oligonucleotidsonden herzustellen,
mit denen eine cDNA-Genbank
durchsucht wird, um die Gene, die die vermeintlichen Rezeptoren
codieren, zu identifizieren.
-
Diese
Erfindung stellt auch eine Methode zum Durchmustern von Komponenten
bereit, um Agonisten und Antagonisten der Ckβ-9-Polypeptide der vorliegenden
Erfindung zu identifizieren. Ein Agonist ist eine Komponente, die
eine ähnliche
biologische Funktion wie die Polypeptide hat, während ein Antagonist solche Funktionen
blockiert. Chemotaxis kann untersucht werden, indem die Zellen,
die durch jedes der Polypeptide der vorliegenden Erfindung chemisch
angezogen werden oben auf den Filter, mit Poren von genügend großem Durchmesser,
um die Zellen einzulassen (etwa 5 μm), platziert werden. Lösungen mit
möglichen
Agonisten werden auf den Boden der Kammer mit einem geeigneten Kontroll-Medium
in dem oberen Kompartiment gegeben und so wird ein Konzentrationsgradient
der Agonisten gemessen, indem die Zellen, die in oder durch die
poröse
Membran im Laufe der Zeit wandern, gezählt werden.
-
Wenn
Antagonisten untersucht werden, werden die Polypeptide der vorliegenden
Erfindung in die untere Kammer gegeben und der mögliche Antagonist wird hinzugegeben,
um zu bestimmen, ob die Chemotaxis der Zellen verhindert wird.
-
Alternativ
dazu kann eine Säugerzell-
oder Membranpräparation,
die die Rezeptoren der Polypeptide exprimiert, mit einem zum Beispiel
mit Radioaktivität
markierten Ckβ-9-Polypeptid in Gegenwart
der Verbindung inkubiert werden. Die Fähigkeit der Verbindung, diese
Interaktion zu blockieren, kann dann gemessen werden. Wenn auf diese
Weise Agonisten untersucht werden, fehlen die Chemokine und die
Fähigkeit
des Agonisten seinerseits, mit dem Rezeptor zu interagieren, kann
gemessen werden.
-
Beispiele
möglicher
Ckβ-9 Antagonisten
beinhalten Antikörper.
Ein anderes Beispiel eines möglichen Antagonisten
ist eine negativ dominante Mutante der Polypeptide. Negativ dominante
Mutanten sind Polypeptide, die an den Rezeptor des Wild-Typ-Polypeptids binden,
die aber keine biologische Aktivität besitzen.
-
Antisense-Konstrukte,
die mittels Antisense-Technologien hergestellt werden, sind auch
mögliche
Antagonisten. Antisense-Technologien können benutzt werden, um die
Genexpression über
die Triple-Helix-Bildung oder Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren,
beides Methoden, die darauf basieren, dass ein Polynucleotid an
DNA oder RNA bindet. Zum Beispiel können 5'-Codierungsabschnitte der Polynucleotid-Sequenz, die das
reife Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, genutzt werden,
um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren
Länge herzustellen.
Ein DNA-Oligonucleotid wird hergestellt, um zu einer Region auf
dem Gen komplementär
zu sein, das an der Transkription beteiligt ist (Triple-Helix, vgl.
Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science,
241: 456 (1988) und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)); dabei
werden die Transkription und die Produktion der Chemokin-Polypeptide
verhindert. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid
hybridisiert mit der mRNA in vivo und blockiert die Translation
der mRNA-Moleküle
zu Polypeptiden (Antisense-Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991);
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,
CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide
können
auch an Zellen verabreicht werden, so dass die Antisense-RNA oder
DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von Ckβ-9 zu hemmen.
-
Die
Antagonisten können
genutzt werden, um die Chemotaxis und die Aktivierung von Makrophagen und
deren Vorläufern
und von neutrophilen Granulocyten, Basophilen, B-Lymphocyten und
einigen T-Zell-Untergruppen, zum Beispiel aktivierte und cytotoxische
CD-8-T-Zellen und natürliche
Killerzellen, in Autoimmun- und chronisch entzündlichen und infektiösen Krankheiten
zu hemmen. Beispiele für
Autoimmunkrankheiten beinhalten rheumatoide Arthritis, multiple
Sklerose und Insulin-abhängigen
Diabetes. Einige infektiöse
Krankheiten beinhalten Silikose, Sarcoidose, idiopathische Lungenfibrose,
wobei die Rekrutierung und Aktivierung von einkernigen Phagocyten
verhindert wird, das idiopathische hyper-eosinophile Syndrom wobei
die Produktion und Migration von Eosinophilen verhindert werden,
und endotoxischen Schock wobei die Migration von Makrophagen und
deren Produktion von Chemokin-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung
verhindert werden.
-
Die
Antagonisten können
auch benutzt werden, um Artherosklerose zu behandeln, indem die
Monocyten-Infiltration in die Arterienwand verhindert wird.
-
Die
Antagonisten können
auch benutzt werden, um Histamin vermittelte allergische Reaktionen
und immunologische Störungen
zu behandeln; die allergische Reaktionen vom Spättyp, die chronische Urtikaria und
die atopische Dermatitis beinhalten, wobei die Chemokin induzierten
Mastzellen und die Degranulation der Basophilen und die Freisetzung
von Histaminen verhindert werden. Die IgE vermittelten allergischen
Reaktionen wie allergisches Asthma, Rhinitis und Ekzeme können auch
behandelt werden.
-
Die
Antagonisten können
auch eingesetzt werden, um chronische und akute Entzündungen
zu behandeln, indem die Anziehung der Monocyten zu einem Wundbereich
verhindert wird. Sie können
auch benutzt werden, um die normalen Macrophagen-Populationen der
Lunge zu regulieren, da die akuten und chronischen entzündlichen
Lungenkrankheiten mit Sequestrierung von einkernigen Phagocyten
in der Lunge verbunden sind.
-
Die
Antagonisten können
auch dazu benutzt werden, rheumatoide Arthritis zu behandeln, indem
die Anziehung von Monocyten zu der Synovialflüssigkeit in den Gelenken der
Patienten verhindert wird. Das Einfließen und die Aktivierung der
Monocyten spielen in der Pathogenese sowohl der degenerativen als
auch der entzündlichen
Arthropathien eine signifikante Rolle.
-
Die
Antagonisten können
benutzt werden, um in die schädlichen
Kaskaden, die hauptsächlich
dem IL-1 und dem TNF zugeschrieben werden, einzugreifen, was die
Biosynthese anderer Entzündungs-Cytokine hemmt.
Auf diese Weise können
Antagonisten eingesetzt werden, um Entzündungen zu verhindern. Die
Antagonisten können
auch dazu eingesetzt werden, das Prostaglandin-unabhängige Fieber,
das von Chemokinen induziert wird, zu hemmen.
-
Die
Antagonisten können
auch dazu eingesetzt werden, Fälle
von Knochenmarksstörungen
zu behandeln, zum Beispiel die aplastische Anämie und das myelodysplastische
Syndrom.
-
Die
Antagonisten können
auch dazu benutzt werden, Asthma und Allergien zu behandeln, indem
die Akkumulation von Eosinophilen in der Lunge verhindert wird.
Die Antagonisten können
auch dazu eingesetzt werden, die Basalmembran-Fibrose zu behandeln,
die ein hervorstechendes Merkmal der asthmatischen Lunge ist.
-
Die
Antagonisten können
auch in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch geeigneten
Träger,
zum Beispiel wie nachfolgend beschrieben, eingesetzt werden.
-
Die
Ckβ-9-Polypeptide
und Agonisten und Antagonisten können
in Kombination mit geeigneten pharmazeutischen Trägern eingesetzt
werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch effektive
Menge der Polypeptide und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder Excipient. Solch ein Träger
beinhaltet, ist aber nicht darauf beschränkt, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose,
Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung
sollte der Art der Anwendung angepasst sein.
-
Die
Erfindung stellt auch eine Arzneimittelpackung oder einen Kit bereit,
die der einen oder mehrere Behälter
umfasst, die mit einem oder mehreren der Inhaltsstoffe der Arzneimittel
der Erfindung gefüllt
sind. Einhergehend mit (einem) solchen Behälter(n) kann eine Mitteilung
in der Form sein, wie sie von der Regierungsbehörde, die die Herstellung, den
Gebrauch oder den Verkauf von pharmazeutischen oder biologischen
Produkten regelt, vorgeschrieben ist; eine solche Mitteilung spiegelt
die Genehmigung für
die Herstellung, den Gebrauch oder den Verkauf zur Verabreichung
an den Menschen durch die Behörde
wider. Außerdem
können die
Polypeptide und die Agonisten und die Antagonisten in Verbindung
mit anderen therapeutischen Verbindungen benutzt werden.
-
Die
Arzneimittel können
in einer geeigneten Form wie dem topischen, intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, intratumorösen, subcutanen,
intranasalen oder intradermalem Wege verabreicht werden. Die Arzneimittel
werden in Mengen, die für
die Behandlung und/oder für
die Prophylaxe der spezifischen Indikationen effektiv sind, eingesetzt.
Im Allgemeinen werden die Polypeptide in Mengen von wenigstens etwa
10 μg/kg
Körpergewicht
eingesetzt und in den meisten Fällen
werden sie in Mengen nicht über
etwa 8 mg/kg Körpergewicht
pro Tag eingesetzt. In den meisten Fällen liegt die Dosierung bei
etwa 10 μg/kg
bis zu etwa 1 mg/kg Körpergewicht
täglich
unter Berücksichtigung
der Wege der Verabreichung, Symptome etc.
-
Die
Ckβ-9-Polypeptide
und Agonisten oder Antagonisten, die Polypeptide sind, können in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung zur Expression solcher Polypeptide
in vivo, was häufig
als „Gentherapie" bezeichnet wird,
eingesetzt werden.
-
Deshalb
werden zum Beispiel Zellen eines Patienten mit einem Polynucleotid
(DNA oder RNA), das ein Polypeptid codiert, ex vivo verändert; die
manipulierten Zellen werden dann einem Patienten, der mit dem Polypeptid
behandelt werden soll, verabreicht. Solche Methoden sind im Fachgebiet
wohl bekannt. Es werden zum Beispiel Zellen mit den im Fachgebiet
bekannten Verfahren verändert,
wobei retrovirale Partikel benutzt werden, die RNA enthalten, die
ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
-
In ähnlicher
Weise können
Zellen mit zum Beispiel Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind,
in vivo für
die Expression eines Polypeptides verändert werden. Wie im Fachgebiet
bekannt, kann eine Produktionszelle zur Herstellung von einem retroviralen
Partikel, der RNA enthält,
die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einem Patienten
zur Manipulation von Zellen in vivo und Expression des Polypeptids
in vivo verabreicht werden. Diese und andere Methoden zur Verabreichung
eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit solchen Methoden
sollten dem Fachmann von der Lehre der vorliegenden Erfindung offenbar
sein. Ein Expressions-Vehikel zur Veränderung von Zellen kann zum
Beispiel etwas anderes als ein Retrovirus sein, zum Beispiel ein
Adenovirus, das benutzt werden kann, um Zellen in vivo nach der
Kombination mit einem geeigneten Abgabevehikel zu manipulieren.
-
Die
Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch wertvoll zur Identifikation
von Chromosomen. Die Sequenz ist spezifisch gegen eine bestimmte
Stelle auf einem individuellen menschlichen Chromosom ausgerichtet
und kann mit dieser hybridisieren. Weiterhin gibt es ein aktuelles
Bedürfnis,
bestimmte Stellen eines Chromosoms zu identifizieren. Es sind zur
Zeit nur wenige Reagenzien, die Chromosomen markieren und auf der
Basis von aktuellen Sequenzdaten (Wiederholungspolymorhismus) zur
Markierung von chromosomalen Stellen eingesetzt werden, verfügbar. Die
Kartierung von DNAs auf Chromosomen in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt, solche Sequenzen mit
Genen, die mit einer Krankheit zusammenhängen, in Beziehung zu setzen.
-
Kürzlich wurden
Sequenzen auf Chromosomen kartiert, indem PCR-Primer (vorzugsweise
15–25
bp) aus cDNA hergestellt wurden. Die Computer gestützte Analyse
der nicht translatierten 3'-Region
wird benutzt, um Primer schnell zu selektieren, die sich über nicht
mehr als ein Exon in der genomischen DNA erstrecken, was so den
Amplifikations-Prozeß verkomplizieren
würde.
Diese Primer werden dann benutzt, um mit der PCR somatische Zellhybride
zu durchmustern, die individuelle menschliche Chromosomen beinhalten.
Nur solche Hybride, die die menschlichen Gene, die mit dem Primer übereinstimmen,
beinhalten, ergeben ein amplifiziertes Fragment.
-
Die
PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist ein schnelles Verfahren,
um bestimmte DNA einem bestimmten Chromosom zuzuweisen. Wenn die
vorliegende Erfindung mit den gleichen Oligonucleotid-Primern benutzt
wird, kann eine Sublokalisierung in einer analogen Art und Weise
mit Fragmentgruppen von spezifischen Chromosomen oder Pools großer genomischer
Clone erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die in ähnlicher
Weise benutzt werden können,
um Chromosomen zu kartieren, beinhalten die in situ-Hybridisierung,
eine vorherige Durchmusterung mit markierten durchflußsortierten
Chromosomen und eine Vorselektion über die Hybridisierung, um
Chromsomen-spezifische cDNA-Genbanken
zu konstruieren.
-
Um
eine genaue chromosomale Lokalisierung in einem Schritt bereit zu
stellen, kann die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) von
cDNA-Clonen an einer Metaphase-Chromosomenausbreitung
benutzt werden. Diese Technik kann mit cDNA, die so kurz wie 50
bis 60 bp ist, durchgeführt
werden. Für
einen Überblick über diese
Technik, vgl. Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic
Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
-
Ist
eine Sequenz einmal auf einem genauen chromosomalen Locus kartiert,
kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit
den Daten der genetischen Karte korreliert werden. Solche Daten
sind, zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man
(online verfügbar
von Johns Hopkins University Welch Medical Library) erhältlich.
Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die auf derselben chromosomalen
Region kartiert werden, werden dann mit der Kopplungsanalyse (gemeinsame
Vererbung von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
-
Als
nächstes
ist es nötig,
die Unterschiede in der cDNA oder der genomischen Sequenz zwischen
betroffenen und nicht-betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn
eine Mutation in einigen oder allen betroffenen Individuen, aber
nicht in einem normalen Individuum beobachtet wird, dann ist die
Mutation wahrscheinlich das verursachende Agens der Krankheit.
-
Mit
der gegenwärtigen
Auflösung
von physikalischer Kartierung und genetischen Kartierungstechniken
kann eine cDNA, die in einer chromosomalen Region genau lokalisiert
wurde und mit der Krankheit assoziiert ist, eines von 50 bis 500
möglichen
ursächlichen
Genen sein. (Dies setzt eine Auflösung von 1 Megabase Kartierung
und einem Gen pro 20 kb voraus).
-
Die
Polypeptide, ihre Fragmente und andere Derivate oder Analoge davon
oder Zellen, die diese exprimieren, können als Immunogene eingesetzt
werden, um Antikörper
dagegen zu produzieren. Diese Antikörper können, zum Beispiel, polyclonale
oder monoclonale Antikörper
sein. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch chimäre, Einzelstrang-
und humanisierte Antikörper
wie auch Fab-Fragmente oder die Produkte einer Fab-Expressions-Genbank.
Es können
verschiedene Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, zur Produktion
von solchen Antikörpern
und Fragmenten eingesetzt werden.
-
Antikörper, die
gegen ein Polypeptid, das mit einer Sequenz der vorliegenden Erfindung übereinstimmt,
hergestellt werden, können
erhalten werden, indem das Polypeptid direkt in ein Tier injiziert
wird oder indem das Polypeptid einem Tier, vorzugsweise einem nicht-menschlichen,
verabreicht wird. Die so erhaltenen Antikörper binden dann ihrerseits
die Polypeptide. In dieser Art kann auch eine Sequenz, die nur ein
Fragment der Polypeptide codiert, benutzt werden, Antikörper herzustellen,
die das ganze native Polypeptid binden. Solche Antikörper können dann
dazu benutzt werden, Polypeptide aus dem Gewebe zu isolieren, das
diese Polypeptide exprimiert.
-
Zur
Herstellung von monoclonale Antikörpern kann jede Technik verwendet
werden, die Antikörper
zur Verfügung
stellt, die von einer kontinuierlichen Zellinienkultur hergestellt
werden. Beispiele beinhalten die Hybridom-Technik (Köhler und
Milstein, 1975, Nature, 256: 495–497), die Triom-Technik, die
menschliche B-Zellen-Hybridom-Technik
(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridom-Technik, um menschliche
monoclonale Antikörper
herzustellen (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,
Alan R. Liss, Inc., Seite: 77–96).
-
Techniken,
die zur Produktion von Einzelketten-Antikörpern (US-Patent 4,946,778)
beschrieben werden, können
angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen immunogene Polypeptid-Produkte
dieser Erfindung herzustellen. Es können auch transgene Mäuse benutzt
werden, um humanisierte Antikörper
gegen die immunogenen Polypeptid-Produkte dieser Erfindung zu exprimieren.
-
Die
vorliegende Erfindung wird weiterhin mit Bezug auf die folgenden
Beispiele beschrieben. Dennoch soll verstanden werden, dass die
vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele begrenzt ist. Alle
Teile und Mengen sind, sofern es nicht anderweitig beschrieben wird,
auf das Gewicht bezogen.
-
Um
das Verständnis
der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte häufiger erscheinende Methoden
und/oder Begriffe erläutert.
-
„Plasmide" werden mit dem Kleinbuchstaben
p bezeichnet, dem Großbuchstaben
und/oder Zahlen voranstehen und/oder folgen. Die Start-Plasmide
hierin sind auch käuflich
zu erwerben und öffentlich
auf freier Basis zugänglich
oder können
aus zugänglichen
Plasmiden im Einklang mit publizierten Verfahren konstruiert werden.
Außerdem
sind ähnliche
Plasmide wie die beschriebenen im Fachgebiet bekannt und dem Fachmann offenbar.
-
Der „Verdau" von DNA bezieht
sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym,
das nur an einer bestimmten Sequenz in der DNA agiert. Die verschiedenen
Restriktionsenzyme, die hier benutzt werden, sind käuflich zu
erwerben und ihre Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und andere Anforderungen
werden so benutzt, wie es dem Fachmann bekannt ist. Zu analytischen
Zwecken werden typischerweise 1 μg
des Plasmids oder des DNA-Fragmentes mit etwa 2 Einheiten Enzym
in etwa 20 μl
Pufferlösung
angesetzt. Für
den Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Plasmid-Konstruktion
werden typischerweise 5 bis 50 μg
DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete
Puffer und Substratmengen für
besondere Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Es
werden gewöhnlich Inkubationszeiten
von etwa 1 h bei 37°C
benutzt, aber sie können
auch in Übereinstimmung
mit den Anweisungen des Lieferanten variieren. Nach dem Verdau wird
der Reaktionsansatz direkt einer Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel
unterzogen, um die gewünschten
Fragmente zu isolieren.
-
Eine
Auftrennung der gespalteten Fragmente nach Größe wird ausgeführt, indem
ein 8 prozentiges Polyacrylamidgel, wie es von Goeddel, D. et al.,
Nucleic Acid Res., 8: 4057 (1980) beschrieben wurde, benutzt wird.
-
„Oligonucleotide" bezieht sich sowohl
auf Einzelstrang-Polydesoxynucleotide als auch auf zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die
chemisch synthetisiert werden können.
Solche synthetisch hergestellten Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und werden
sich deswegen nicht mit anderen Oligonucleotiden verbinden, ohne
dass ein Phosphat von einem ATP in der Gegenwart einer Kinase angehängt wird.
Ein synthetisches Oligonucleotid wird sich mit einem Fragment verbinden,
das nicht dephosphoryliert ist.
-
„Ligierung" bezieht sich auf
den Prozess, bei dem Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäure-Fragmenten
gebildet werden (Maniatis, T., et al., Id. S. 146). Soweit nicht
anderweitig vorgesehen, wird die Ligierung durchgeführt, indem
die bekannten Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten der T4-DNA-Ligase
(„Ligase") auf 0,5 μg, von etwa äquimolaren
Mengen der DNA-Fragmente, die verbunden werden sollen, genutzt werden.
-
Soweit
es nicht anderweitig ausgeführt
wird, wird die Transformation wie in der Methode von Graham, F.
und Van der Eb, A., Virology, 52: 456–457 (1973) beschrieben, ausgeführt.
-
Beispiel 1
-
Bakterielle Expression
und Reinigung von Ckβ-9
-
Die
DNA-Sequenz, die Ckβ-9,
ATCC # 75803 codiert, wird zuerst amplifiziert, indem PCR-Oligonucleotid-Primer,
die den 5'- und
3'-Endsequenzen
der prozessierten Ckβ-9-Gene
entsprechen (minus der mutmaßlichen
Signal-Peptid-Sequenz), benutzt werden. Weitere Nucleotide, die
Ckβ-9 entsprechen,
werden an die 5'- bzw.
den 3'-Endsequenzen angefügt. Der
5'-Oligonucleotidprimer
hat die Sequenz 5'CCCGCATGCGTGATGGAGGGGCTCAG3' (SEQ ID Nr. 3) und
beinhaltet eine SphI-Restriktionsschnittstelle (fett gedruckt),
auf die 17 Nucleotide der Ckβ-9
Codierungssequenz (unterstrichen) folgen und die am zweiten Nucleotid
der Sequenz, die das reife Protein codiert, startet.
-
Das
ATG-Codon ist in die SphI-Stelle eingeschlossen. In dem nächsten Codon,
das dem ATG folgt, stammt die erste Base von der SphI-Stelle und
die verbleibenden zwei Basen stimmen mit der zweiten und dritten
Base des ersten Codons (Rest S24) des mutmaßlichen
reifen Proteins überein.
Als eine Konsequenz wird die erste Base in diesem Codon von A zu
C, verglichen mit der Originalsequenz, geändert, was in einer S zu R-Substitution
in dem rekombinanten Protein führt.
Die 3'-Sequenz 5'AAAGGATCCTGGCCCTTTAGGGGTCTGTGA3' (SEQ ID Nr. 4) beinhaltet
komplementäre
Sequenzen zur BamHI-Stelle (fett gedruckt), auf die 21 Nucleotide Gen-spezifischer
Sequenzen folgen, die dem Terminationscodon vorangehen. Die Restriktionsenzym-Stelle
stimmt mit der Restriktionsenzymstelle auf dem bakteriellen Expressions-Vektor
pQE-70 (Quiagen, Inc. Chatsworth, CA) überein. pQE-70 codiert eine
antibiotische Resistenz (Amp.), einen bakteriellen Replikationsursprung
(ori), einen IPTG-regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomen-Bindungsstelle
(RBS), einen 6-His-Marker und Restriktionsenzymstellen. pQE-70 wird
dann mit SphI und BamHI verdaut. Die amplifizierten Sequenzen werden
in pQE-9 ligiert und im Rahmen mit der Sequenz, die den Histidinmarker
und die RBS codiert, eingefügt.
Das Ligierungsgemisch wird dann benutzt, um den E. coli-Stamm M15/rep4
(Quiagen, Inc.) mit der Methode, die von Sambrook, J. et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989),
beschrieben wird, zu transformieren. M15/rep4 beinhaltet zahlreiche
Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und
auch eine Kanamycin-Resistenz (Kanr) trägt. Transformanten
werden durch ihre Fähigkeit,
auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert und Ampicillin/Kanamycin-resistente
Kolonien werden selektiert. Die Plasmid-DNA wird isoliert und mit
der Restriktionsanalyse bestätigt.
Clone, die die gewünschten
Konstrukte enthalten, werden über
Nacht (O/N) in einer flüssigen
Kultur in LB-Medium,
dem sowohl Amp (100 μg/ml)
als auch Kan (25 μg/ml)
hinzugegeben werden, angezogen. Die O/N-Kultur wird benutzt, um
eine große
Kultur in einem Verhältnis
1:100 bis 1:250 anzuimpfen. Die Zellen werden bis zu einer optischen
Dichte von 600 (O. D.600) von 0,4 bis 0,6
angezogen. IPTG („Isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranosid") wird dann bis zu
einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt. IPTG induziert, indem es
den lacI-Repressor inaktiviert, wodurch der P/O freigelegt wird,
was zur Erhöhung
der Genexpression führt.
Die Zellen werden weitere 3 bis 4 Stunden angezogen. Die Zellen
werden dann mittels Zentrifugation geerntet. Das Pellet der Zellen
wird in einem chaotropen Mittel gelöst: 6 molar Guanidin-HCl pH
5,0. Nach der Klärung
wird solubilisiertes Ckβ-9
aus dieser Lösung
mittels Chromatografie auf einer Nickel-Chelat-Säule unter Bedingungen gereinigt,
die eine feste Bindung durch Proteine, die den 6-His-Marker beinhalten,
erlauben (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177–184 (1984)).
Ckβ-9 (> 98% rein) wird von
der Säule
mit 6 M Guanidin-HCl eluiert. Die Protein-Renaturierung aus GnHCl
kann mit verschiedenen Verfahren ausgeführt werden (Jaenicke, R., und
Rudolph, R., Protein Structure- A Practical Approach, IRL Press,
New York (1990)). Anfangs wird eine schrittweise Dialyse benutzt,
um das GnHCl heraus zu lösen. Alternativ
dazu kann das gereinigte Protein aus der Ni-Chelat Säule an eine
zweite Säule
gebunden werden, über
die ein absteigender linearer GnHCl-Gradient läuft. Dem Protein wird erlaubt,
zu renaturieren, während es
an die Säule
gebunden ist, und es wird anschließend mit einem Puffer, der
250 mM Imidazol, 150 mM NACl, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 10% Glycerin
enthält,
eluiert. Am Schluss wird das gelöste
Protein gegen den Aufbewahrungs-Puffer dialysiert, der 5 mM Ammoniumbicarbonat
enthält.
-
Beispiel 2
-
Expression von rekombinantem
Ckβ-9 in
COS-Zellen
-
Die
Expression des Plasmides Ckβ-9
HA ist abgeleitet von dem Vektor pcDNAl/Amp (Invitrogen), der enthält: 1) einen
SV 40-Replikationsursprung, 2) ein Ampicillin-Resistenzgen, 3) einen E. coli-Replikationsursprung,
4) einen CMV-Promotor, dem eine Polylinker-Region, ein SV40-Intron
und eine Polyadenylationsstelle folgen. Ein DNA-Fragment, das den
vollständigen
Ckβ-9-Vorläufer und
einen HA-Marker codiert, der mit seinem 3'-Ende im Rahmen fusioniert ist, wird
in die Polylinker-Region des Vektors cloniert, deshalb wird die
Expression des rekombinanten Proteins von dem CMV-Promotor gesteuert.
Der HA-Marker stimmt mit einen Epitop überein, das aus dem Influenza-Hämaglutinin-Protein
stammt, wie kürzlich
beschrieben wurde (I. Wilson, N. Niman, R. Heighten, A Cherenson,
M. Connolly, und R. Lerner, 1984, Cell 37, 767)). Das Einbringen
des HA-Markers in das Zielprotein erlaubt eine einfache Bestimmung
des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
-
Die
Plasmid-Konstruktions-Strategie wird wie folgt beschrieben:
Die
DNA-Sequenz, die das Ckβ-9,
ATTC# 75803, codiert, wird konstruiert, indem zwei PCR-Primer benutzt werden:
der 5'-Primer 5'AAAGGATCCAGACATGGCTCAGTCACT3' (SEQ ID Nr. 5) beinhaltet
eine BamHI-Stelle,
die von 18 Nucleotiden der Ckβ-9-Codierungssequenz
gefolgt wird, die vom Initiationscodon startet: die 3'-Sequenz 5'CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATGGCCCTTTAGGG
GTCTG3' (SEQ ID
Nr. 6) beinhaltet komplementäre
Sequenzen zu einer XbaI-Stelle, einem Translations-Stopp-Codon, einem
HA-Marker und den letzten 18 Nucleotide der CKβ-9-Codierungssequenz (das Stopp-Codon
nicht eingeschlossen). Deshalb beinhaltet das PCR-Produkt eine BamH1-Stelle,
eine CKβ-9-Codierungssequenz,
die von einem HA-Marker, der im Rahmen fusioniert ist, gefolgt wird,
ein Translations-Terminations-Stopp-Codon neben
dem HA-Marker und eine XbaI-Stelle. Das PCR amplifizierte DNA-Fragment
und der Vektor, pcDNAl/AMP, werden mit BamHI und XbaI-Restriktionsenzymen
verdaut und ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in den E. coli-Stamm
SURE (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) transformiert und
die transformierte Kultur wird auf Platten, die ein Ampicillin-Medium
enthalten, ausplattiert und resistente Kolonien werden selektiert.
Die Plasmid-DNA wird aus den Transformanten isoliert und mit der
Restriktionsanalyse auf die Präsenz des
korrekten Fragmentes untersucht. Für die Expression des rekombinanten
Ckβ-9 werden
COS-Zellen mit dem Expressions-Vektor mittels der DEAE-DEXTRAN-Methode transfiziert
(J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989)). Die Expression des Ckβ-9 HA-Proteins
wird über
die Radiomarkierungs- und Immunpräzipitationsmethode bestimmt
(E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1988)). Die Zellen werden für acht Stunden
mit 35S-Cystein zwei Tage nach der Transfektion
markiert. Das Kultur-Medium wird dann gewonnen und die Zellen werden
mit einem Detergenz (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS,
1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5) (Wilson, I. et al., Id.
37: 767 (1984)) lysiert. Beides, Zellysat und Kulturmedium, wird
mit einem NA-spezifischen monoclonalen Antikörper ausgefällt. Die ausgefällten Proteine werden
mittels SDS-PAGE
analysiert.
-
Beispiel 3
-
Expression mittels Gentherapie
-
Fibroblasten
werden von einem Individuum mittels Hautbiopsie erhalten. Das erhaltene
Gewebe wird in ein Gewebe-Kultur-Medium gebracht und in kleine Teile
aufgeteilt. Kleine Stücke
des Gewebes werden auf die feuchte Oberfläche eines Gewebe-Kultur-Kolbens
gelegt; es werden ungefähr
zehn Stücke
in jeden Kolben gelegt. Der Kolben wird mit dem Oberteil nach unten
gedreht, gut verschlossen und über
Nacht bei Raumtemperatur belassen. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur
wird der Kolben umgedreht und die Gewebestücke bleiben am Boden des Kolbens angehaftet
und frisches Medium (zum Beispiel Ham-F12-Medium mit 10% FBS, Penicillin
und Streptomycin) wird hinzu gegeben. Dies wird dann bei 37°C für ungefähr eine
Woche inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird frisches Medium hinzugegeben
und anschließend
alle paar Tage gewechselt. Nach weiteren zwei Wochen in Kultur taucht
eine einzellige Schicht von Fibroblasten auf. Die einzellige Schicht wird
trypsinisiert und in größere Kolben überführt.
-
pMV-7
(Kirschmeier, P. T:, et al., DNA, 7: 219–25 (1988) ist umgeben von
den langen terminalen Wiederholungen des murinen Moloney-Sarcoma-Virus
und wird mit EcoRI und HindIII verdaut und anschließend mit
intestinaler Phosphatase vom Kalb behandelt. Der lineare Vektor
wird auf einem Agarosegel fraktioniert und gereinigt, wobei Glasperlen
benutzt werden.
-
Die
cDNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird
vermehrt, indem PCR-Primer benutzt werden, die den 5'- bzw. 3'-Endsequenzen entsprechen.
Der 5'-Primer enthält eine
EcoRI-Stelle und der 3'-Primer
beinhaltet weiterhin eine HindIII-Stelle. Gleiche Mengen des linearen
Rückgrates
des murinen Moloney-Sarcoma-Virus
und das amplifizierte EcoRI- und HindIII-Fragment werden in Gegenwart
einer T4-DNA-Ligase zusammen gegeben. Die erhaltene Mischung wird
unter den Bedingungen, die für
eine Ligierung der zwei Fragmente geeignet sind, gehalten. Die Ligierungsmischung
wird benutzt, um die Bakterien HB101 zu transformieren, die dann
auf Agar, der Kanamycin enthält,
ausplattiert werden, um festzustellen, dass der Vektor das Gen von
Interesse richtig inseriert hat.
-
Die
amphotropen pA317- oder GP+am12-Verpackungszellen werden in Gewebekultur
bis zu einer konfluenten Dichte in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit
10% Kälberserum
(CS), Penicillin und Streptomycin angezogen. Der MSV-Vektor, der
das Gen enthält,
wird anschließend
zu dem Medium gegeben und die Verpackungszellen werden mit dem Vektor
transduziert. Die Verpackungszellen stellen jetzt infektiöse virale
Partikel, die das Gen enthalten, her (die Verpackungszellen werden
im Folgenden als Produktionszellen bezeichnet). Es wird frisches
Medium zu den transduzierten Produktionszellen gegeben und anschließend wird
das Medium von einer 10 cm-Platte mit konfluenten Produktionszellen
geerntet. Das verbrauchte Medium, das die infektiösen viralen
Partikel enthält,
wird durch einen Millipore-Filter filtriert, um abgelöste Produktionszellen
zu entfernen und diese Medien werden dann benutzt, um die Fibroblastenzellen
zu infizieren. Das Medium wird aus der Platte mit unkonfluenten
Fibroblasten entfernt und schnell mit dem Medium von den Produktionszellen
ersetzt. Dieses Medium wird entfernt und gegen frisches Medium ausgetauscht. Wenn
der Titer des Virus hoch ist, werden praktisch alle Fibroblasten
infiziert und es ist keine Selektion nötig. Ist der Titer sehr niedrig,
dann ist es nötig,
einen retroviralen Vektor zu benutzen, der einen selektierbaren
Marker wie neo oder his enthält.
Die manipulierten Fibroblasten werden dann in den Wirt injiziert,
entweder allein oder nachdem sie bis zur Konfluenz auf Cytodex 3-Microträgerperlen
angezogen wurden. Die Fibroblasten produzieren jetzt das Protein-Produkt.
-
-
-
-