DE69838254T2

DE69838254T2 - Zwei menschliche g-protein-gekoppelte rezeptorproteine: ebv-induzierter gpcr2 (ebi-2) und egd-1-ähnlicher gpcr

Info

Publication number: DE69838254T2
Application number: DE69838254T
Authority: DE
Inventors: Steven M. Brookeville RUBEN; Yi Sunnyvale LI
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-07
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2018-05-08
Also published as: EP1007670A2; WO1998050549A2; US6060272A; JP2002508657A; ES2289780T3; EP1007670B1; US20050123961A1; US20020052043A1; EP1369430A3; CA2289046A1; US20090104619A1; US6887683B1; ATE370233T1; DE69838254D1; WO1998050549A3; EP1369430A2

Description

Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die durch solche Polynucleotide codiert sind, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide sowie die Herstellung von solchen Polynucleotiden und Polypeptiden. Genauer gesagt ist das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ein menschlicher EBV-induzierter G-Protein-gekoppelter Rezeptor (EBI-2), der hierin auch manchmal als „GBR" oder „GPCR" und kollektiv als „GBRs" bezeichnet wird. Die Erfindung betrifft auch die Hemmung der Wirkung solcher Polypeptide.
Mindestens neun Gene sind identifiziert worden, die offensichtlich in Antwort auf eine Epstein-Barr-Virus (EBV) Infektion aktiviert werden. Eines von zwei neuen Genen, das auch in solchen Studien von EBV-Infektionen identifiziert wurde, war ein neues GPCR-ähnliches cDNA-Molekül, das als EBV-induzierter G-Protein-gekoppelter Rezeptor (EBI)-1 bezeichnet wurde.
Außerdem wurde früher ein Endothelium-Differenzierungsgen (EDG) identifiziert, das aus PMA-stimulierten menschlichen Endothelzellen erhalten wurde. Ratten- und Schafhomologe von EDG-1 sind identifiziert worden, die auch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren darstellen.
Es ist gut etabliert, dass viele medizinisch signifikante biologische Prozesse durch Proteine vermittelt werden, die an Signalübertragungswegen teilhaben, die G-Proteine und/oder sekundäre Botenstoffe, z.B.: cAMP, umfassen (Lefkowitz, Nature, 351: 353–354 (1991)). Hierin werden diese Proteine als Proteine bezeichnet, die an Wegen mit G-Proteinen oder PPG-Proteinen teilnehmen. Manche Beispiele dieser Proteine umfassen GPC-Rezeptors wie jene für adrenerge Mittel und Dopamin (Kobilka, B. K., et al., PNAS, 84: 46–50 (1987), Kobilka, B. K., et al., Science, 238: 650–656 (1987); Bunzow, J. R., et al., Nature, 336: 783–787 (1988)), G-Proteine selbst, Effektorproteine, z.B. Phospholipase C, Adenyl-Cyclase, und Phosphodiesterase und Aktuator-Proteine, z.B. Proteinkinase A und Proteinkinase C (Simon, M. I., et al., Science, 252: 802–8 (1991)).
Zum Beispiel ist in einer Form der Signalübertragung der Effekt der Hormonbindung die Aktivierung eines Enzyms, der Adenylat-Cyclase, innerhalb der Zelle. Enzymaktivierung durch Hormone ist von der Anwesenheit der Nucleotide GTP abhängig und GTP beeinflusst auch die Hormonbindung. Ein O-Protein verbindet die Hormonrezeptoren mit der Adenylat-Cyclase. Es wurde gezeigt, dass O-Protein GTP in gebundenes GDP austauscht, wenn es durch Hormonrezeptoren aktiviert wird. Die GTP-tragende Form bindet dann an aktivierte Adenylat-Cyclase. Die durch das G-Protein selbst katalysierte Hydrolyse von GTP zu GDP führt das O-Protein zu seiner grundlegenden Form, der inaktiven Form, zurück. Daher dient das O-Protein einer zweifachen Rolle, als ein Zwischenprodukt, welches das Signal von Rezeptor zum Effektor weitergibt, und als eine Uhr, die die Signaldauer kontrolliert.
Die Membranprotein-Gensuperfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist dahingehend charakterisiert worden, dass sie sieben mutmaßliche Transmembrandomänen aufweist. Von den Domänen wird angenommen, dass sie transmembrane α-Helices aufweisen, die durch extrazelluläre oder cytoplasmatische Schleifen verbunden sind. Ein funktionelles O-Protein ist ein Trimer, das aus einer variablen alpha-Untereinheit besteht, verbunden mit viel enger assoziierten und konstanten beta- und gamma-Untereinheiten. Eine große Auswahl an Liganden (mehr als 20) sind identifiziert worden, die über GPCRs wirken. Im Allgemeinen führt das Binden eines entsprechenden Liganden an einen GPCR zur Aktivierung des Rezeptors. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren umfassen eine große Auswahl an biologisch aktiven Rezeptoren, wie zum Beispiel Hormon-, virale, Wachstumsfaktor- und Neurorezeptoren. Ein solcher aktivierter Rezeptor initiiert den regulatorischen Zyklus des O-Proteins. Dieser Zyklus besteht aus dem GTP-Austausch gegen GDP, Dissoziation der alpha- und beta/gamma-Untereinheiten, Aktivierung des sekundären Botenstoffwegs durch einen Komplex von GTP und der alpha-Untereinheit des O-Proteins und Rückkehr zum Ruhestadium durch GTP-Hydrolyse über die der G-Protein-alpha-Untereinheit eigene GTPase-Aktivität.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind so charakterisiert worden, dass sie diese sieben konservierten hydrophoben Abschnitte von etwa 20 bist 30 Aminosäuren umfassen, die mindestens acht divergente hydrophile Schleifen verbinden. Die G-Proteinfamilie von gekoppelten Rezeptoren umfasst Dopaminrezeptoren, die neuroleptische Arzneistoffe binden, die zur Behandlung von psychotischen und neurologischen Erkrankungen verwendet werden. Andere Beispiele an Mitgliedern dieser Familie umfassen Calcitonin, -adrenerge, Endothelin-, cAMP-, Adenosin-, muskarinische, Acetylcholin-, Serotonin-, Histamin-, Thrombin-, Kinin-, Folikel-stimulierendes Hormon-, Opsin- und Rhodopsin-, Odorans-, Cytomegalievirus-Rezeptoren usw..
Die meisten GPRs weisen konservierte Cysteinreste in jeder der ersten beiden extrazellulären Schleifen auf, die Disulfidbrücken bilden, von welchen angenommen wird, dass sie die funktionelle Proteinstruktur stabilisieren. Die sieben Transmembranregionen werden als TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 und TM7 bezeichnet. TM3 wird auch mit der Signalübertragung in Zusammenhang gebracht.
Phosphorylierung und Lipidierung (Palmitylierung oder Farnesylierung) von Cysteinresten kann die Signaltransduktion von manchen GPRs beeinflussen. Die meisten GPRs enthalten potentielle Phosphorylierungsstellen innerhalb der dritten cytoplasmatischen Schleife und/oder des Carboxylterminus. Bei vielen GPRs wie zum Beispiel dem β-Adenorezeptor vermittelt die Phosphorylierung durch Protein-Kinase A und/oder spezifische Rezeptorkinasen die Rezeptordesensibilisierung.
Von den Ligandenbindungsstellen der GPRs wird angenommen, dass sie einen aus mehreren GPR-Transmembrandomänen gebildeten hydrophilen Sockel umfassen, wobei der Sockel von hydrophoben Resten der GPRs umgeben ist. Von der hydrophilen Seite jeder GPR-Transmembran-Helix wird postuliert, dass sie nach innen zeigt und die polare Ligandenbindungsstelle bildet. TM3 ist mit mehreren GPRs in Zusammenhang gebracht worden, dass sie eine Ligandenbindungsstelle aufweist, wie zum Beispiel eine, die den TM3-Aspartatrest einschließt. Außerdem werden TM5-Serine, ein TM6-Asparagin und TM6- oder TM7-Phenylalanine oder -Tyrosine mit der Ligandenbindung in Zusammenhang gebracht.
GPRs können intrazellulär durch heterotrimere G-Proteine an verschiedene intrazelluläre Enzyme, Ionenkanäle und Transporter gekoppelt sein (siehe Johnson et al., Endoc., Rev., 10: 317–331 (1989)). Unterschiedliche G-Protein-α-Untereinheiten stimulieren vorzugsweise spezielle Effektoren, um verschiedene biologische Funktionen in einer Zelle zu modulieren. Phosphorylierung von cytoplasmatischen Resten an GPRs ist als ein wichtiger Mechanismus der Regulation von G-Protein-Kopplung von manchen GPRs identifiziert worden.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren werden in zahlreichen Stellen innerhalb eines Säugerwirts gefunden, zum Beispiel ist Dopamin ein entscheidender Neurotransmitter im zentralen Nervensystem und ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptorligand.
In Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden neue Polypeptide bereitgestellt, sowie biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente und Derivate davon. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind von menschlichem Ursprung.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, einschließlich mRNAs, DNAs, cDNAs, genomischer DNA sowie auch Antisense-Analoge davon und biologisch aktiver und diagnostisch oder therapeutisch nützlicher Fragmente davon.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Prozess zur Herstellung solcher Polypeptide durch rekombinante Techniken bereitgestellt, welcher Züchten von rekombinanten prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, unter Bedingungen umfasst, welche die Expression dieses Proteins und die anschließende Gewinnung dieses Proteins fördern.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antikörper gegen solche Polypeptide bereitgestellt.
In Übereinstimmung mit einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verwendung von einem oder mehreren der Rezeptoren gemäß der Erfindung zum Durchmustern nach Rezeptorantagonisten und/oder -Agonisten und/oder Rezeptorliganden bereitgestellt.
In Übereinstimmung mit noch einer weiteren Ausführungsform können solche Agonisten verwendet werden, um das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Zuständen zu verwenden, die mit der Unterexpression des Polypeptids der vorliegenden Verbindung in Zusammenhang stehen.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt können solche Antagonisten zur Hemmung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Zuständen verwendet werden, die mit der Überexpression des Polypeptids der vorliegenden Verbindung in Zusammenhang stehen.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren, wie in den Ansprüchen definierten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden nicht natürlich vorkommende, synthetische, isolierte und/rekombinante Polypeptide bereitgestellt, die Fragmente, Konsensus-Fragmente und/oder Sequenzen, die konservative Aminosäuresubstitutionen aufweisen von mindestens einer Transmembrandomäne darstellen, so dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung Liganden binden können, oder die auch quantitativ oder qualitativ die Ligandenbindung an die Polypeptide der vorliegenden Erfindung modulieren können.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren, wie in den Ansprüchen definierten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden synthetische oder rekombinante Polypeptide, konservative Substitutionsderivate davon, Antikörper, anti-idiotypische Antikörper, Zusammensetzungen und Verfahren bereitgestellt, die aufgrund ihrer erwarteten biologischen Eigenschaften, die in diagnostischen, therapeutischen und/oder Forschungsanwendungen verwendet werden können, als mögliche Modulatoren der Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors durch Bindung an Liganden oder Modulieren der Ligandenbindung nützlich sein können.
In Übereinstimmung mit einem anderen, wie in den Ansprüchen definierten Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden synthetische, isolierte oder rekombinante Polypeptide bereitgestellt, die entworfen wurden, um verschiedene GPRs oder Fragmente davon wie Rezeptorarten oder Unterarten zu hemmen oder nachzuahmen.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostischer in vitro-Test zum Nachweis einer Krankheit oder einer Anfälligkeit für eine Krankheit bereitgestellt, die mit einer Mutation in einer Nucleinsäuresequenz in Zusammenhang steht, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten einem Fachmann von den Lehren hierin offensichtlich sein.
Die folgenden Abbildungen sind darstellend für die Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht dafür gedacht den Geltungsbereich der Erfindung, wie er durch die Ansprüche umfasst wird, zu limitieren.
1 zeigt die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) und die entsprechende, davon abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) des EBV-induzierten G-Protein-gekoppleten Rezeptors der vorliegenden Erfindung. Die Polynucleotidsequenz enthält eine 2249 Nucleotid-Sequenz, die einen 342 Aminosäure langen offenen Leserahmen codiert. In 1 wird die Standard 1-Buchstaben-Abkürzung für Aminosäuren verwendet, um die abgeleitete Aminosäuresequenz darzustellen. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines automatisierten 373-DNA-Synthesegeräts (Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt. Es wird vorausgesagt, dass die Sequenzierungsgenauigkeit größer als 97% ist.
2 ist ein Aminosäure-Sequenzvergleich zwischen dem EBV-induzierten (EBI-2) G-Protein-gekoppelten Rezeptor (obere Linie, siehe SEQ ID NO: 2) und dem menschlichen EBI-1-G-Protein-gekoppelten Rezeptor (unter Linie, SEQ ID NO: 17). Die Standard-1-Buchstaben-Abkürzungen werden verwendet, um die Aminosäurereste der geschilderten Aminosäuresequenzen darzustellen. Das EBI-2-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt ungefähr 25% Identität und 49% Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz des EBI-1-Gens über eine Ausdehnung von ungefähr 350 Aminosäuren.
3 zeigt als ein Referenzbeispiel die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 3) und die entsprechende, abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) des EDG-1-ähnlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptors der vorliegenden Erfindung. Die Polynucleotidsequenz enthält eine 1637 Nucleotid-Sequenz, die einen 260 Aminosäuren langen ORF codiert. In 3 wird die Standard-1-Buchstaben-Abkürzung für Aminosäuren verwendet, um die abgeleitete Aminosäuresequenz darzustellen. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines automatisierten 373-DNA-Sequenzierungsgeräts (Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt. Es wird vorausgesagt, dass die Sequenzierungs-Genauigkeit mehr als 97% genau ist.
4 ist ein Aminosäuresequenzvergleich zwischen dem EDG-1-ähnlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (obere Linie, siehe SEQ ID NO: 4) und dem menschlichen EDG-1-Orphan-G-Protein-gekoppeltem Rezeptor (untere Linie, SEQ ID NO: 18). Die Standard-1-Buchstaben-Abkürzungen werden verwendet, um die Aminosäurereste der dargestellten Aminosäuresequenzen zu repräsentieren. Das EDG-1-ähnliche Polypeptid gemäß der Erfindung zeigt ungefähr 54% Identität und 73% Ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz des menschlichen EDG-1-Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptorgens über zwei Regionen von insgesamt ungefähr 120 Aminosäuren.
In Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure (Polynucleotid) bereitgestellt, welche das reife Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) aufweist, oder das reife Polypeptid codiert, das durch die cDNA des Clons codiert ist, der am 28. 4. 1997 als ATCC-Hinterlegungsnummer 209003 hinterlegt wurde.
Ein Polynucleotid, das ein EBI-2-Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann in einer cDNA-Bank aus Nabelvenen-Endothelzellen, neutrophilen Leukocytenzellen und Corpus-colosum-Zellen gefunden werden. Das Polynucleotid dieser Erfindung wurde in einer cDNA-Bank entdeckt, die aus Nabelvenen-Endothelzellen stammt. Wie vorstehend beschrieben, ist es strukturell mit der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie verwandt. Es enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein von 343 Aminosäureresten codiert.
Die vorliegende Anmeldung offenbart darüber hinaus ein Referenzbeispiel einer isolierten Nucleinsäure (Polynucleotid), die das reife Polypeptid, welches die abgeleitete Aminosäuresequenz von 3 (SEQ ID NO: 4) aufweist, oder das reife Polypeptid codiert, welches durch die cDNA des am 28. 4. 1997 als ATCC-Hinterlegungsnummer 209004 hinterlegen Clons codiert wird.
Ein Polynucleotid, das ein EDG-1-ähnliches G-Protein-gekoppeltes Rezeptorpolypeptid codiert, kann in einer cDNA-Bank von aktivierten Neutrophilen, Cyclohexamin behandelten Raji-Zellen, der RSR; 1 l-Knochenmarkszelllinie, aktivierten T-Zellen, Mandeln und DC34-positiven Nabelschnur-Blutzellen gefunden werden. Northern-Blot-Analyse deutet darauf hin, dass das EDG-1-ähnliche Rezeptorgen hauptsächlich in Leukocyten exprimiert wird, aber die Expression kann auch in Plazenta, Milz, Schilddrüse, Lunge und Bauchspeicheldrüsengewebe beobachtet werden. Das Polynucleotid wurde in einer cDNA-Bank entdeckt, die aus aktivierten Neutrophilen stammte. Wie vorstehend beschrieben, ist es strukturell mit der G-Protein-gekoppelten Proteinfamilie verwandt. Es enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein von 261 Aminosäureresten codiert.
Wie vorstehend angemerkt, liegt die Bedeutung, die GPCR-Molekülen wie zum Beispiel jenen der vorliegend beanspruchten Erfindung beigemessen wird, zum großen Teil in der Vielfalt biologischer Funktionen, an welchen sie teilhaben. Zum Beispiel wird angenommen, dass die beta/gamma-Untereinheit nach Freisetzung von der alpha-Untereinheit durch Aktivierung des Arachidonsäure-Signalübertragungswegs über die Aktivierung der Phospholipase A2 auch eine funktionelle Rolle in der Regulation der Signalübertragung spielen kann. Außerdem sind GPCR-Moleküle und ihre assoziierten G-Proteine mit der Kopplung von visuellen Pigmenten an cGMP-Phosphodiesterase, Phosphatidyl-Inosit (PI)-Umsetzung, Adenylat-Cyclase-Signalkanäle und anderen integralen Membranenzymen an Transporterproteine in Zusammenhang gebracht worden. Als eine Folge ist es offensichtlich, dass ein neues GPCR-Molekül sich in einer großen Vielfalt von pharmazeutischen Anwendungen, einschließlich Forschung und Entwicklung, als nützlich herausstellen könnte. Zum Beispiel können zielbasierte Durchmusterungen nach kleinen Molekülen und anderen solch pharmakologisch wertvollen Faktoren auf der Aktivierung eines bestimmten GPCR basiert werden. Es ist auch beobachtet worden, dass kurze Peptide durch Nachahmung des GPCR funktionieren können (bezeichnet als Rezeptormimetika). Darüber hinaus können sich Antikörper, die gegen solche Faktoren erzeugt werden, in etlichen Funktionen als nützliche Arzneimittel erweisen. Mögliche therapeutische und/oder diagnostische Anwendungen eines solchen Faktors kann solch unterschiedliche klinische Präsentationen wie Herzerkrankung, Geisteskrankheit, Krebs, Atherosklerose, Restenose, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und etliche andere umfassen.
Demgemäß können die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung in Form von RNA oder in Form von DNA vorliegen, wobei DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA umfasst. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig vorliegen und, wenn einzelsträngig, kann sie der codierende Strang oder der nicht-codierende (Antisense)-Strang sein. Die codierende Sequenz, welche das reife EBI-2-Polypeptid codiert, kann mit der in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigten codierenden Sequenz oder mit jener des hinterlegten Clons identisch sein oder kann eine unterschiedliche codierende Sequenz darstellen, wobei die codierende Sequenz als ein Ergebnis der Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes das gleiche reife Polypeptid wie die DNA von 1 (SEQ ID NO: 1) oder die hinterlegte DNA codiert.
Die Polynucleotide, die das reife EBI-2-Polypeptid von 1 (SEQ ID NO: 2) oder das reife EBI-2-Polypeptid codieren, das durch die hinterlegte cDNA codiert ist, können umfassen: nur die codierende Sequenz des reifen Polypeptids; die codierende Sequenz des reifen Polypeptids und eine zusätzliche codierende Sequenz wie zum Beispiel einen Leader oder eine sekretorische Sequenz oder eine Proprotein-Sequenz; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid (und wahlweise eine zusätzliche codierende Sequenz) und eine nicht codierende Sequenz wie zum Beispiel Introns oder eine nicht codierende Sequenz 5'- und/oder 3'- von der codierenden Sequenz des reifen Polypeptids.
Der Begriff „Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert" umfasst daher ein Polynucleotid, das nur eine codierende Sequenz für das Polypeptid einschließt, sowie ein Polynucleotid, das zusätzliche codierende und/oder nicht codierende Sequenzen einschließt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Varianten der hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die innerhalb der Einschränkungen der Ansprüche Fragmente, Analoge. und Derivate des Polypeptids, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) aufweist, oder des durch die cDNA des hinterlegten Clons codierte Polypeptids codieren. Die Variante von einem dieser beiden Polynucleotide kann eine natürlich vorkommende allele Variante des Polynucleotids oder eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotids sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher Polynucleotide, codierend das gleiche reife Polypeptid, das in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigt wird, oder das gleiche reife Polypeptid, das durch die cDNA des hinterlegen Clons codiert wird, sowie innerhalb der Einschränkungen der Ansprüche liegende Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten ein Fragment, Derivat oder Analog des Polypeptids von 1 (SEQ ID NO: 2) oder des Polypeptids codieren, das durch die cDNA des hinterlegten Clons codiert wird. Solche Nucleotidvarianten umfassen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten.
Wie hierin vorstehend angedeutet, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz aufweisen, die eine natürlich vorkommende allele Variante der in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigten codierenden Sequenz oder der codierenden Sequenz des hinterlegten Clons ist, wobei diese Variante mindestens 90% identisch ist zu den letzteren Sequenzen. Wie im Fachgebiet bekannt, ist eine allele Variante eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Nucleotide aufweisen kann, welche die Funktion des codierten Polypeptids nicht wesentlich ändert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polynucleotide, wobei die codierende Sequenz für das reife Polypeptid im gleichen Leserahmen mit einer Polynucleotidsequenz fusioniert sein kann, die bei der Expression und Absonderung eines Polypeptids von einer Wirtszelle hilft, zum Beispiel eine Leadersequenz, die als eine sekretorische Sequenz zum Kontrollieren des Transports eines Polypeptids aus der Zelle hilft. Das Polypeptid, welches eine Leadersequenz aufweist, ist ein Präprotein, und wobei die Leadersequenz durch die Wirtszelle von der reifen Form des Polypeptids abgespalten werden kann. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, das ein reifes Protein mit zusätzlichen 5' Aminosäureresten darstellt. Ein reifes Protein, welches eine Prosequenz aufweist, ist ein Proprotein und ist eine inaktive Form des Proteins. Sobald die Prosequenz abgespalten ist, verbleibt ein reifes Protein. Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann daher zum Beispiel ein reifes Protein, oder ein Protein, welches eine Prosequenz aufweist, oder ein Protein codieren, das sowohl eine Prosequenz als auch eine Präsequenz (Leadersequenz) aufweist.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auch eine codierende Sequenz aufweisen, die im Leserahmen mit einer Markersequenz fusioniert ist, welche die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ermöglicht. Die Markersequenz kann im Falle eines bakteriellen Wirts einen Hexa-Histidin-Marker darstellen, der durch einen pQE-9-Vektor geliefert wird, um die Reinigung des reifen Polypeptids, das mit dem Marker fusioniert ist, zu gewährleisten oder, zum Beispiel kann, wenn eine Säugerwirt, zum Beispiel COS-7-Zellen, verwendet wird, die Markersequenz einen Hämagglutinin (HA)-Marker darstellen. Der HA-Marker entspricht einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutinprotein stammt (Wilson, I., et al., Cell, 37: 767 (1984)).
Der Begriff „Gen" bedeutet das DNA-Segment, das an der Herstellung einer Polypeptidkette beteiligt ist; es umfasst Regionen, welche der codierenden Region vorausgehen und folgen (Leader und Trailer), sowie auch intervenierende Sequenzen (Introns) zwischen den einzelnen codierenden Segmenten (Exons).
Fragmente des Volllängengens der vorliegenden Erfindung können als Hybridisierungssonden für eine cDNA oder eine genomische Bank verwendet werden, um die Gesamtlängen-DNA zu isolieren und um andere DNAs zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zu dem Gen oder ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Sonden dieser Art weisen bevorzugt mindestens 10 und vorzugsweise mindestens 15 und noch stärker bevorzugt mindestens 30 Basen auf und können zum Beispiel mindestens 50 oder mehr Basen enthalten. Tatsächlich können Sonden dieses Typs, die mindestens bis zu 150 Basen oder mehr aufweisen, vorzugsweise benützt werden. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen DNA-Clon, der einem Volllängentranskript entspricht, und einen genomischen Clon oder genomische Clone, die das gesamte Gen einschließlich regulatorischer und Promotorregionen, Exons und Intons umfassen, zu identifizieren. Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst Isolieren der codierenden Region des Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine Oligonucleotidsonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide, die eine Sequenz aufweisen, die komplementär oder identisch zu jener des Gens oder zu einem Teil der Gensequenzen der vorliegenden Erfindung ist, können verwendet werden, um eine genomische DNA-Bank zu durchmustern, um zu bestimmen, mit welchen Mitgliedern der Bank die Sonde hybridisiert.
Es ist auch klar, dass solche Sonden vorzugsweise mit einem analytisch nachweisbaren Reagens markiert werden können und werden, um die Identifizierung der Sonde zu erleichtern. Nützliche Reagenzien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Radioaktivität, fluoreszierende Farbstoffe oder Enzyme, die im Stande sind die Bildung eines nachweisbaren Produktes zu katalysieren. Die Sonden sind daher nützlich, um komplementäre DNA-Kopien aus anderen Quellen nachzuweisen oder solche Quellen nach verwandten Sequenzen zu durchmustern.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, wenn mindestens 90% und stärker bevorzugt mindestens 95% Identität zwischen den Sequenzen vorliegt. (Wie vorstehend angezeigt, würde 70% Identität innerhalb einer solchen Definition zum Beispiel ein 70 Basenpaar-Fragment umfassen, das aus einem Polynucleotid von 100 Basenpaaren entnommen wird.) Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen", dass Hybridisierung nur vorkommen wird, wenn mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen vorliegt. Die Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren, codieren Enzyme, die im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität aufweisen wie das reife Polypeptid, das durch die DNA von 1 (SEQ ID NO: 2) codiert wird. Bezug nehmend auf Identität im Fall von Hybridisierung, wie sie im Fachgebiet bekannt ist, bezieht sich eine solche Identität auf die Komplementarität von Polynucleotidsegementen.
Polynucleotide, wie sie hierin offenbart sind, können mindestens 15 Basen, vorzugsweise mindestens 30 Basen und stärker bevorzugt mindestens 50 Basen aufweisen, die an irgendeinen Teil eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung hybridisieren und welche, wie hierin vorstehend beschrieben, dazu eine Identität aufweisen und welche die Aktivität beibehalten können oder nicht. Zum Beispiel können solche Polynucleotide als Sonden für die Polynucleotide von SEQ ID NO: 1 zum Beispiel für die Gewinnung des Polynucleotids oder als eine diagnostische Sonde oder als ein PCR-Primer eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung ist daher auf Polynucleotide gerichtet, die ein Polypeptid codieren, das GPCR-Aktivität aufweist und mindestens 90% Identität und stärker bevorzugt mindestens 95% Identität mit einem Polynucleotid aufweist, welches das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 codiert. Die vorliegende Anmeldung offenbart Fragmente davon, wobei die Fragmente mindestens 15 Basen, vorzugsweise mindestens 30 Basen, stärker bevorzugt mindestens 50 Basen aufweisen, und am stärksten bevorzugt Fragmente, die mindestens bis zu 150 Basen oder mehr aufweisen, wobei die Fragmente mindestens 90% identisch, vorzugsweise mindestens 95% identisch und am stärksten bevorzugt mindestens 97% identisch zu einem Teil eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung sind.
Die Hinterlegung(en), auf die hierin Bezug genommen wird, wird (werden) unter den Bedingungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke des Patentverfahrens beibehalten. Diese Hinterlegungen werden lediglich als eine Annehmlichkeit für die Fachleute bereitgestellt und nicht als ein Zugeständnis, dass unter 35 U.S.C. 112 eine Hinterlegung benötigt wird. Die Sequenz der in dem hinterlegten Material enthaltenen Polynucleotide sowie die Aminosäuresequenz der davon codierten Polypeptide werden hierin durch Referenz eingeschlossen und sie sind im Falle jedes Konflikts mit irgendeiner Beschreibung der Sequenzen hierin maßgebend. Eine Lizenz kann benötigt werden, um das hinterlegte Material zu erzeugen, zu verwenden oder zu verkaufen und es wird hierbei keine solche Lizenz gewährt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptide, welche die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von 1 (SEQ ID NO: 2) aufweisen, sowie Fragmente, Analoge oder Derivate solcher Polypeptide innerhalb der Einschränkungen der Ansprüche.
Die Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analog", wenn sie sich auf das Polypeptid von 1 (SEQ ID NO: 2) oder auf jene beziehen, die durch die hinterlegte cDNA codiert werden, bedeuten ein Polypeptid, das im Wesentlichen entweder die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie ein solches Polypeptid beibehält, d.h. als ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor wirkt, oder die Fähigkeit beibehält, an den Liganden oder den Rezeptor zu binden, auch wenn das Polypeptid nicht als ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor wirkt, wie eine lösliche Form des Rezeptors.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches oder ein synthetisches Polypeptid und vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid sein.
Innerhalb der Beschränkungen der Ansprüche kann das Fragment, Derivat oder Analog des Polypeptids von 1 (SEQ ID NO: 2) oder das durch die hinterlegte cDNA codierte eines sein, (i) in dem ein oder mehrere Aminosäurereste gegen einen konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einem konservierten Aminosäurerest) ausgetauscht sind und ein solcher substituierter Aminosäurerest kann oder kann nicht durch den genetischen Code codiert sein, oder (ii) eines sein, in dem ein oder mehrere Aminosäurereste eine Substituentengruppe umfassen, oder (iii) eines sein, in dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie zum Beispiel einer solchen Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (zum Beispiel Polyethylenglykol), oder (iv) eines sein, in dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, oder (v) eines sein, in dem ein Fragment des Polypeptids löslich ist, d.h. nicht Membran-gebunden ist, jedoch noch immer den Liganden an den membran-gebundenen Rezeptor bindet. Solche Fragmente, Derivate und Analoge werden von den Lehren hierin als im Anwendungsbereich von Fachleuten erachtet.
Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden in einer isolierten Form bereitgestellt und werden vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt.
Der Begriff „isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wird (z.B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorhanden ist, nicht isoliert, aber das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid, das aus manchen oder allen der gleichzeitig vorkommenden Materialien in dem natürlichen System abgetrennt wird, ist isoliert. Solche Polynucleotide könnten Teil eines Vektors darstellen und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide könnten Teil einer Zusammensetzung sein und noch immer so isoliert sein, dass ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil seiner natürlichen Umwelt ist.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (insbesondere das reife Polypeptid) sowie auch Polypeptide, die mindestens 90% Identität zum Polypeptid von SEQ ID NO: 2 aufweisen und noch mehr bevorzugt mindestens 90% Identität zu dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2, und umfassen innerhalb der Beschränkungen der Ansprüche auch Teile solcher Polypeptide mit einem solchen Teil des Polypeptids, der üblicherweise mindestens 30 Aminosäuren und stärker bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren enthält.
Wie im Fachgebiet bekannt, wird „Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden durch Vergleichen der Aminosäuresequenz und der konservierten Aminosäuresubstitutionen eines Polypeptids mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids bestimmt.
Fragmente oder Teile der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zur Erzeugung des entsprechenden Volllängen-Polypeptids durch Peptidsynthese eingesetzt werden; die Fragmente können daher als Zwischenprodukte zum Erzeugen der Volllängen-Polypeptide eingesetzt werden. Fragmente oder Teile der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Volllängen-Polynucleotide der vorliegenden Erfindung zu synthetisieren.
Die vorliegende Anmeldung offenbart auch ein Verfahren zum Identifzieren und/oder Isolieren von Zellen, Geweben oder Klassen von Zellen oder Geweben zum Beispiel durch Verwendung von Sonden der Polynucleotide, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Polypeptid EBI-2 codieren, oder durch Verwendung eines Antikörpers, der für den G-Protein-gekoppelten Rezeptor EBI-2 spezifisch ist. Da die G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Polypeptide gemäß der Erfindung EBI-2 in Venen-Endothelzellen, neutrophilen Leukocytenzellen und Corpus-colosum-Zellen vorkommen, können die vorstehenden Sonden oder Antikörper zum Beispiel benützt werden, um solche Zellen, Gewebe oder Klassen von Zellen oder Geweben zu identifizieren und/oder zu isolieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung enthalten, Wirtszellen, die gentechnisch mit Vektoren der Erfindung erzeugt werden, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken.
Wirtszellen werden mit den Vektoren dieser Erfindung gentechnisch erzeugt (transduziert oder transformiert oder transfiziert), die zum Beispiel ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können. Dieser Vektor kann zum Beispiel in der Form eines Plasmids oder eines viralen Partikels, eines Phagen usw. vorliegen. Die gentechnisch erzeugten Wirtszellen werden in herkömmlichem Nährmedium gezüchtet werden, das wie geeignet zum Aktivieren von Promotoren, Auswählen von Transformanten oder zum Amplifizieren der G-Protein-gekoppelten Rezeptorgene modifiziert ist. Die Kulturbedingungen wie zum Beispiel Temperatur, pH-Wert und ähnliches sind jene, die früher bei der für die Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden und werden für einen Fachmann offensichtlich sein.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Erzeugung der Polypeptide durch rekombinante Techniken angewandt werden. Die Polynucleotide können daher zur Expression eines Polypeptids zum Beispiel in irgendeinen einer Vielfalt an Expressionsvektoren eingeschlossen werden. Solche Vektoren umfassen chomosomale, nicht chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z. B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefeplasmide; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA, viraler DNA wie Vaccinia, Adenovirus, Vogelpockenvirus und dem Pseudorabies-Virus stammen. Jeder andere Vektor kann jedoch verwendet werden, solange er in dem Wirt replizierbar und lebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann in einen Vektor durch eine Vielfalt an Verfahren eingeführt werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in (eine) geeignete Restriktions-Endonucleasenstelle(n) eingeführt. Solche und andere Verfahren werden als innerhalb des Wissens von Fachleuten betrachtet.
Die DNA-Sequenz im Expressionsvektor ist funktionsfähig mit (einer) entsprechenden Expressions-Kontrollsequenzen) (Promotor) verbunden, um die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele solcher Pomotoren können erwähnt werden: LTR oder SV40-Promotor, der E. coli-lac- oder -trp-Promotor, der Lambda-Phagen-P_L-Promotor und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Genexpression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomenbindungsstelle für die Translationsinitiation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zum Amplifizieren der Expression umfassen.
Außerdem enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare Markergene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion der transformierten Wirtszellen bereitzustellen, wie zum Beispiel Dihydrofolatereduktase oder Neomycin-Resistenz für eukaryontische Zellkultur oder wie zum Beispiel Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz in E. coli.
Der Vektor, der die geeignete, wie hierin vorstehend beschriebene DNA-Sequenz sowie einen geeigneten Promotor oder eine geeignete Kontrollsequenz enthält, kann angewandt werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, um dem Wirt zu erlauben, das Protein zu exprimieren.
Als repräsentative Beispiele von geeigneten Wirten können erwähnt werden: bakterielle Zellen wie zum Beispiel E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen, wie zum Beispiel Hefe, Insektenzellen, wie zum Beispiel Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; tierische Zellen wie zum Beispiel CHO, COS oder Bowes-Melanom; Adenoviren, Pflanzenzellen usw. Die Auswahl an geeigneten Wirten wird von den Lehren hierin als innerhalb des Wissens von Fachleuten angesehen.
Genauer gesagt umfasst die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte, die eine oder mehrere der Sequenzen umfassen, wie sie vorstehend ausführlich beschrieben wurden. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie zum Beispiel ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in welchen eine Sequenz der Erfindung in einer Vorwärts- oder Rückwärts-Orientierung inseriert worden ist. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen, einschließlich zum Beispiel einen Promotor, der funktionsfähig mit der Sequenz verbunden ist. Eine große Anzahl an geeigneten Vektoren und Promotoren sind Fachleuten bekannt und sind im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiel bereitgestellt. Bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Quiagen), pbs, pD10, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontisch: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor kann jedoch verwendet werden, solange es/er in dem Wirt replizierbar und lebensfähig ist.
Promotorregionen können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT(Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markern ausgewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind PKK232-8 und PCM7. Insbesondere erwähnte bakterielle Promotoren umfassen lacI, lacZ, T3, Tz, gpt, Lambda-P_R, -P_L und trp. Eukaryontische Promotoren umfassen sehr frühen CMV-, HSV-Thymidin-Kinase, frühen und späten SV40, LTRs aus dem Retrovirus und Maus-Metallothionein-I. Die Auswahl des geeigneten Promotors liegt vollkommen innerhalb des Niveaus eines Fachmannes.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, welche die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle sein, wie zum Beispiel eine Säugerzelle, oder eine niedere eukaryontische Zelle sein, wie zum Beispiel eine Hefezelle oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle sein, wie zum Beispiel eine Bakterienzelle. Die Einführung eines Konstruktes in die Wirtszelle kann durch Calcium-Phosphattransfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation ausgeführt werden (Davis, L., Dibner, M., Battey. I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Die Konstrukte in Wirtszellen können in einer herkömmlichen Weise verwendet werden, um das durch die rekombinante Sequenz codierte Genprodukt zu erzeugen. Alternativ können die Polypeptide der Erfindung durch herkömmliche Peptidsynthesegeräte synthetisch hergestellt werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können auch eingesetzt werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs zu erzeugen, die von DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung stammen. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung bei prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) beschrieben, dessen Offenbarung wird hierbei durch Bezugnahme eingeschlossen.
Transkription der DNA, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert durch höhere Eukaryonten wird durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-agierende Elemente von DNA, üblicherweise etwa von 10 bis 300 Basenpaare lang, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer, auf der späten Seite des Replikationsursprungs, Basenpaare 100 bis 270, einen frühen Promotor-Enhancer des Cytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und die Andenovirus-Enhancer.
Im Allgemeinen werden rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker, welche die Transformation der Wirtszelle erlauben, z.B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-TRP1-Gen, und einen Promotor enthalten, der von einem hoch exprimierten Gen stammt, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen strukturellen Sequenz zu lenken. Solche Promotoren können von Operonen stammen, die glycolytische Enzyme codieren, wie zum Beispiel unter anderen die 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), den α-Faktor, die saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine. Die heterologe strukturelle Sequenz ist in geeigneter Phase mit Tranlationsinitiation- und Terminationsequenzen und vorzugsweise einer Leadersequenz zusammengesetzt, die im Stande ist, die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium zu lenken.
Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, das ein N-terminales Identifikationspeptid einschließt, das gewünschte Eigenschaften verleiht, z.B. Stabilisation oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Nützliche Expressionsvektoren für bakterielle Verwendung werden durch Insertion einer strukturellen DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und Terminationssignalen in funktionsfähiger Leserahmenphase mit einem funktionsfähigen Promotor konstruiert. Der Vektor wird ein oder mehrere phänotypische selektierbare Marker und einen Replikationsursprung umfassen, um die Beibehaltung des Vektors zu sicheren und um, falls wünschenswert, Amplifikation innerhalb des Wirtes bereitzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl andere als eine Wahl eingesetzt werden können.
Als ein repräsentatives, aber nicht limitierendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren zur bakteriellen Verwendung einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, der aus im Handel erhältlichen Plasmiden besteht, umfassend genetische Elemente des gut bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017). Solche im Handel erhältliche Vektoren umfassen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322-„Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und dem Züchten des Wirtsstammes bis zu einer geeigneten Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel (z.B. Veränderung der Temperatur oder chemische Induktion) induziert und die Zellen werden für eine zusätzliche Zeitdauer gezüchtet.
Zellen werden üblicherweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen und der daraus resultierende Rohextrakt wird für weitere Reinigung zurückbehalten.
Mikrobielle Zellen, die zur Expression der Proteine eingesetzt werden, können durch irgendein bequemes Verfahren, einschließlich Einfrier-Auftau-Zyklen, Ultraschall, mechanischem Aufbrechen oder der Verwendung von Zelllysierungsmitteln, aufgebrochen werden; solche Verfahren sind Fachleuten gut bekannt.
Verschiedene Säugerzellen-Kultursysteme können auch eingesetzt werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele von Säugerzellen-Expressionssystemen umfassen die COS-7-Linien von Affennieren-Fibroblasten, beschrieben von Gluzman, Cell, 23: 175 (1981), und andere Zelllinien, die im Stande sind einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, zum Beispiel die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säuger-Expressionsvektoren werden einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und auch irgendwelche notwendigen Ribosomen-Bindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleiß-Donor- und -Akzeptorstellen, transkriptionelle Terminationssequenzen und flankierende, nicht transkribierte 5'-Sequenzen umfassen. DNA-Sequenzen, die aus den SV40-Spleiß- und Polyadenylierungsstellen stammen, können verwendet werden, um die benötigten, nicht transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Die G-Protein-gekoppelten Rezeptorpolypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren einschließlich Ammoniumsulfat oder Ethanolausfällung, saurer Extraktion, Anionen- oder Kationen-Austauschchromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophober Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lecitin-Chromatographie gewonnen und gereinigt werden. Protein-Rückfaltungsschritte können, falls nötig, in der Fertigstellung der Konfiguration des reifen Proteins verwendet werden. Schließlich kann Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) für die endgültigen Reinigungsschritte angewandt werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein natürliches Produkt oder ein Produkt von chemisch-synthetischen Verfahren sein oder durch rekombinante Techniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt erzeugt werden (zum Beispiel durch Bakterien, Hefe, höhere Pflanzen, Insekten und Säugerzellen in Kultur). Abhängig von dem in einem rekombinanten Herstellungsverfahren eingesetzten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert oder nicht glycosyliert sein. Erfindungsgemäße Polypeptide können auch einen anfänglichen Methionin-Aminosäurerest umfassen.
Der G-Protein-gekoppelte Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann in einem Prozess zur Durchmusterung nach Antagonisten und/oder Agonisten für den Rezeptor eingesetzt werden.
Im Allgemeinen umfassen solche Durchmusterungsverfahren das Bereitstellen von geeigneten Zellen, die den Rezeptor auf der Oberfläche davon exprimieren. Insbesondere wird ein Polypeptid eingesetzt, das den Rezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, um Zellen zu transfizieren, um dadurch den G-Protein-gekoppelten Rezeptor zu exprimieren. Eine solche Transfektion kann durch die hierin vorstehend beschriebenen Verfahren erzielt werden.
Ein solches Durchmusterungsverfahren umfasst die Verwendung von Melanophoren, die transfiziert werden, um den G-Protein-gekoppelten Rezeptor der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Eine solche Durchmusterungstechnik wird in PCT WO 92/01810 beschrieben, veröffentlicht am 6. Februar 1992.
Zum Beispiel kann daher ein solcher Test zum Durchmustern nach einem Rezeptorantagonisten durch Inkontaktbringen der melanophoren Zellen, die den G-Protein-gekoppelten Rezeptor exprimieren, sowohl mit dem Rezeptorliganden als auch einer Verbindung, auf die durchmustert werden soll, angewandt werden. Hemmung des durch den Liganden erzeugten Signals deutet darauf hin, dass eine Verbindung ein möglicher Rezeptor-Antagonist ist, d.h. die Aktivierung des Rezeptors inhibiert.
Die Durchmusterung kann zum Bestimmen eines Agonisten durch Inkontaktbringen solcher Zellen mit Verbindungen, die durchmustert werden sollen, und durch Bestimmung, ob eine solche Verbindung ein Signal erzeugt, d.h. den Rezeptor aktiviert, eingesetzt werden.
Andere Durchmusterungstechniken umfassen die Verwendung von Zellen, die den G-Protein-gekoppelten Rezeptor exprimieren (zum Beispiel transfizierte CHO-Zellen), in einem System, das extrazelluläre pH-Wert-Veränderungen, hergerufen durch Rezeptoraktivierung, misst, wie zum Beispiel beschrieben in Science, Bd. 246, Seiten 181–296 (Oktober 1989). Zum Beispiel können mögliche Agonisten oder Antagonisten mit einer Zelle in Kontakt gebracht werden, die den G-Protein gekoppelten Rezeptor exprimiert, und eine sekundäre Botenaktwort, z.B. Signaltransduktion oder pH-Wert-Änderungen, kann gemessen werden, um zu bestimmen, ob der mutmaßliche Agonist oder Antagonist wirksam ist.
Eine andere solche Durchmusterungstechnik umfasst das Einführen von RNA, die den G-Protein-gekoppelten Rezeptor codiert, in Xenopus-Oocyten, um den Rezeptor transient zu exprimieren. Die Rezeptor-Oocyten können dann im Falle der Durchmusterung nach Antagonisten mit dem Rezeptorliganden und einer zu durchmusternden Verbindung in Kontakt gebracht werden, gefolgt vom Nachweis der Hemmung des Calciumsignals.
Eine andere Durchmusterungstechnik umfasst die Expression des G-Protein-gekoppelten Rezeptors, wobei der Rezeptor mit einer Phospholipase C oder D gekoppelt ist. Als repräsentative Beispiele solcher Zellen können Endothelzellen, glatte Muskelzellen, embryonale Nierenzellen usw. erwähnt werden. Die Durchmusterung nach einem Antagonisten oder Agonisten kann, wie hierin vorstehend beschrieben, durch Nachweisen der Aktivierung des Rezeptors oder Hemmung der Aktivierung des Rezeptors aus dem zweiten Signal der Phospholipase erzielt werden.
Ein anderes Verfahren umfasst die Durchmusterung nach Antagonisten durch Bestimmen der Hemmung des Bindens von markierten Liganden an Zellen, die den Rezeptor auf der Oberfläche davon aufweisen. Ein solches Verfahren umfasst Transfektion einer eukaryontischen Zelle mit DNA, die den G-Protein-gekoppelten Rezeptor codiert, sodass die Zelle den Rezeptor auf seiner Oberfläche exprimiert, und Inkontaktbringen der Zelle mit einem möglichen Antagonisten in der Anwesenheit einer markierten Form eines bekannten Liganden. Der Ligand kann markiert sein, z.B. durch Radioaktivität. Die Menge an markiertem Liganden, der an die Rezeptoren gebunden ist, wird zum Beispiel durch Messen der Radioaktivität der Rezeptoren gemessen. Wenn der mutmaßliche Antagonist an den Rezeptor bindet, wie durch eine Reduktion des markierten Liganden, der an die Rezeptoren bindet, bestimmt wird, wird die Bindung des markierten Liganden an den Rezeptor gehemmt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Bestimmen bereit, ob ein Ligand, von dem nicht bekannt ist, dass er im Stande ist an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor zu binden, an einen solchen Rezeptor binden kann, was das Inkontaktbringen einer Säugerzelle, die einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor exprimiert, mit dem Liganden unter Bedingungen, welche die Bindung der Liganden an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor erlauben, den Nachweis des Vorhandenseins eines Liganden, der an den Rezeptor bindet, und dadurch das Bestimmen, ob der Ligand an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor bindet, umfasst. Die hierin vorstehend beschriebenen Systeme zur Bestimmung von Agonisten und/oder Antagonisten können auch zur Bestimmung von Liganden angewandt werden, die an den Rezeptor binden.
Im Allgemeinen können Antagonisten von G-Protein-gekopplete Rezeptoren, die mittels Durchmusterungsverfahren bestimmt werden, für eine Vielzahl an therapeutischen Zwecken eingesetzt werden. Zum Beispiel sind solche Antagonisten zur Behandlung von Bluthochdruck, Angina Pektoris, Mykardialinfarkt, Geschwüren, Asthma, Allergien, Psychosen, Depression, Migräne, Erbrechen, Schlaganfall, Essstörungen, Migräne-Kopfschmerzen, Krebs und gutartiger Prostata-Hypertrophie eingesetzt worden.
Agonisten für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind auch für therapeutische Zwecke nützlich, wie zum Beispiel die Behandlung von Asthma, Parkinson-Krankheit, akutem Herzversagen, Bluthochdruck, Harnretention und Osteoporose.
Beispiele an G-Protein-gekoppelten Antagonisten umfassen einen Antikörper, oder in manchen Fällen ein Oligonucleotid, das an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor bindet, aber keine sekundäre Botenantwort hervorruft, sodass die Aktivität des G-Protein-gekoppelten Rezeptors verhindert wird. Antikörper umfassen anti-idiotypische Antikörper, die einmalige Determinanten erkennen, die im Allgemeinen mit der Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers assoziiert sind. Mögliche Antagonisten umfassen auch Proteine, die eng mit dem Liganden des G-Protein-gekoppelten Rezeptors verwandt sind, d.h. ein Fragment des Liganden, das die biologische Funktion verloren hat und keine Antwort hervorruft, wenn es an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor bindet.
Ein möglicher Antagonist umfasst auch ein Antisense-Konstrukt, das durch die Verwendung von Antisense-Technologie erzeugt wird. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch Dreifachhelixbildung oder Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren, wobei beide Verfahren auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA beruhen. Zum Beispiel wird der codierende 5'-Teil der Polynucleotidsequenz, welche die reifen Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet, um ein etwa 10 bis 40 Basenpaare langes Antisense-RNA-Oligonucleotid zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird entworfen, um mit einer Genregion komplementär zu sein, die an der Transkription beteiligt ist (Dreifachhelix siehe Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), um dadurch die Transkription und die Erzeugung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors zu verhindern. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert mit der mRNA in vivo und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in den G-Protein-gekoppelten Rezeptor (Antisense-Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotid können an Zellen verabreicht werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors zu verhindern.
Ein anderer möglicher Antagonist ist ein kleines Molekül, das an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor bindet und ihn für Liganden unzugänglich macht, sodass normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele solcher kleiner Moleküle umfassen kleine Peptide oder peptidähnliche Moleküle, sind aber nicht darauf beschränkt.
Mögliche Antagonisten umfassen auch eine lösliche Form eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, z.B. ein Rezeptorfragment, die an den Liganden bindet und verhindert, dass der Ligand mit membrangebundenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren interagiert.
Der G-Protein-gekoppelte Rezeptor und Antagonisten oder Agonisten können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger eingesetzt werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Solche Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Rezepturen sollten zur Art der Verabreichung passen.
Die Offenbarung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder einen Kit bereit, umfassend einen oder mehrere Behälter, die mit einem oder mehreren Bestandteilen der Arzneimittel der Erfindung gefüllt sind. Gemeinsam mit (einem) solchen Behälter(n) kann eine Mitteilung in der Form sein, wie sie durch Regierungsbehörden zur Regelung der Herstellung, Verwendung oder des Verkaufs von pharmazeutischen oder biologischen Produkten vorgeschrieben ist, wobei die Mitteilung die Erlaubnis der Behörde für die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf zur Anwendung an Menschen widerspiegelt. Außerdem können die Arzneimittel gemeinsam mit anderen therapeutischen Verbindungen eingesetzt werden.
Die Arzneimittel können in einer zweckmäßigen Weise wie zum Beispiel durch topische, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intranasale oder intradermale Wege verabreicht werden. Die Arzneimittel werden in einer Menge verabreicht, die für das Behandeln und/oder die Prophylaxe der spezifischen Indikation wirkungsvoll ist. Im Allgemeinen werden die Arzneimittel in einer Menge von mindestens etwa 10 g/kg Körpergewicht verabreicht werden und in den meisten Fällen werden sie in einer Menge von nicht mehr als 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. In den meisten Fällen ist die Dosierung von etwa 10 g/kg Körpergewicht bis zu etwa 1 mg/kg Körpergewicht pro Tag, wobei die Verabreichungswege, Symptome usw. in Betracht gezogen werden.
Die G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Polypeptide und Antagonisten oder Agonisten, welche Peptide darstellen, können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durch Expression von solchen Polypeptiden in vivo angewandt werden, was oft als „Gentherapie" bezeichnet wird.
Zellen eines Patienten können daher zum Beispiel mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA) ex vivo erzeugt werden, das ein Polypeptid codiert, die gentechnisch erzeugten Zellen werden dann einem Patienten zur Verfügung gestellt, der mit dem Polypeptid behandelt werden soll. Solche Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel können Zellen durch im Fachgebiet bekannte Verfahren unter Verwendung eines retroviralen Partikels erzeugt werden, das RNA enthält, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
Auf ähnliche Weise können Zellen in vivo zur Expression eines Polypeptids in vivo zum Beispiel mit im Fachgebiet bekannten Verfahren erzeugt werden. Wie im Fachgebiet bekannt, kann eine Erzeugerzelle für die Produktion eines retroviralen Partikels, das die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codierende RNA enthält, einem Patienten zur Erzeugung von Zellen in vivo und zur Expression des Polypeptids in vivo verabreicht werden. Diese und andere Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch ein solches Verfahren sollte für Fachleute von den Lehren der vorliegenden Erfindung offensichtlich sein. Zum Beispiel kann das Expressionsvehikel zur Erzeugung von Zellen ein anderes als ein Retrovirus sein, zum Beispiel ein Adenovirus, das verwendet werden kann, um Zellen nach der Kombination mit einem geeigneten Verabreichungsvehikel in vivo zu erzeugen.
Retroviren, aus welchen die hierin erwähnten retroviralen Plasmidvektoren abgeleitet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Moloney-Leukämie-Virus der Maus, Nieren-Nekrosevirus, Retroviren wie zum Beispiel Rous-Sarcom-Virus, Harvey-Sarcom-Virus, Vogel-Leukosevirus, Gibbonaffen-Leukämievirus, menschliches Immunschwächevirus, Adenovirus, myeloproliferatifes Sarcomvirus und Brustkrebsvirus. In einer Ausführungsform stammt der retrovirlale Plasmidvektor vom Moloney-Leukämievirus der Maus.
Der Vektor umfasst einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren, die eingesetzt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die retrovirale LTR; den SV40-Promotor; und den menschlichen Cytomegalievirus(CMV)-Promotor, der in Miller, et. al., Biotechniques, Bd. 7 Nr. 9, 980–990 (1989) beschrieben wurde, oder irgendeinen anderen Promotor (z.B. zelluläre Promotoren wie zum Beispiel eukaryontische zelluläre Promotoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Histon-, Pol III- und β-Aktin-Promotoren). Andere virale Promotoren, die eingesetzt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Adenoviruspromotoren, Thymidinkinase(TK)-Promotoren und B19-Parvoviruspromotoren. Die Auswahl an geeigneten Promotoren wird aus den hierin enthaltenen Lehren einem Fachmann offensichtlich sein.
Die Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, steht unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren, die eingesetzt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf adenovirale Promotoren wie zum Beispiel den späten adenoviralen Hauptpromotor; oder heterologe Promotoren wie zum Beispiel den Cytomegalievirus(CMV)-Promotor; den Promotor des respiratorischen Syncytialvirus (RSV); induzierbare Promotoren wie zum Beispiel den MMT-Promotor, den Metallothioneinpromotor; Hitzeschockpromotoren: den Albuminpromotor; den ApoAl-Promotor; menschliche Globin-Promotoren; virale Thymidinkinasepromotoren wie zum Beispiel den Herpes simplex-Thymidinkinasepromotor; retrovirale LTRs (einschließlich der hierin beschriebenen, veränderten retroviralen LTRs); den β-Actin-Promotor; und menschliche Wachstumshormon-Promotoren. Der Promotor kann auch der native Promotor sein, der das Gen kontrolliert, welches das Polypeptid codiert.
Der retrovirale Plasmidvektor wird eingesetzt, um Verpackungszelllinien zu tranduzieren, um Erzeuger-Zelllinien zu bilden. Beispiele von Verpackungszellen, die transfiziert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12 T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 und DAN-Zelllinien, wie sie in Miller, Human Gene Therapy, Bd. 1, Seiten 5–14 (1990) beschrieben sind, welches hierin in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Der Vektor kann die Verpackungszellen durch im Fachgebiet bekannte Mittel transduzieren. Solche Mittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und CaPO₄-Ausfällung. In einer Alternative kann der retrovirale Plasmidvektor in ein Liposom eingekapselt sein oder an ein Lipid gekoppelt sein und dann einem Wirt verabreicht werden. Die Erzeugerzelllinie erzeugt infektiöse retrovirale Vektorpartikel, welche die Nucleinsäuresequenz(en) umfassen, die die Polypeptide codiert (codieren). Solche retrovirale Vektorpartikel können dann eingesetzt werden, um eukaryontische Zellen entweder in vitro oder in vivo zu transduzieren. Die transduzierten eukaryontischen Zellen werden die Nucleinsäuresequenz(en) exprimieren, die das Polypeptid codiert (codieren). Eukaryontische Zellen, die transduziert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf embryonale Stammzellen, embryonale Carzinomzellen sowie hämatopoietische Stammzellen, Hepatocyten, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und Bronchialepiethelzellen.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind in Säugerwirten universell und sind für viele biologische Funktionen einschließlich vieler Krankheiten verantwortlich. Demgemäß ist es wünschenswert Verbindungen, die einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor stimulieren, und Verbindungen, die einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor entgegenwirken, zu finden.
Diese Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen bereit, die speziell mit den menschlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an der Oberfläche einer Zelle interagieren und daran binden, was das Inkontaktbringen einer Säugerzelle, umfassend ein isoliertes DNA-Molekül, das den G-Protein-gekoppelten Rezeptor codiert, mit einer Vielzahl von Verbindung, das Bestimmen derjenigen, die an die Säugerzelle binden, und dadurch das Identifizieren von Verbindungen umfasst, die spezifisch mit einem menschlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptor der vorliegenden Erfindung interagieren und daran binden.
Diese Offenbarung stellt ein Verfahren zum Nachweis der Expression des G-Protein-gekoppelten Rezeptors auf der Oberfläche einer Zelle durch Nachweisen der Anwesenheit von mRNA bereit, die einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor codiert, welches das Erhalten der gesamten mRNA aus der Zelle und Inkontaktbringen der auf diese Weise erhaltenen mRNA mit einer Nucleinsäuresonde, die ein Nucleinsäuremolekül von mindestens 15 Nucleotiden umfasst, das im Stande ist, spezifisch mit einer Sequenz zu hybridisieren, die innerhalb der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls vorhanden ist, das einen menschlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptor codiert, unter Hybridisierungsbedingungen, das Nachweisen der Anwesenheit von an die Sonde hybridisierter mRNA und dadurch das Nachweisen der Expression des G-Protein-gekoppelten Rezeptors der Zelle, umfasst.
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung des G-Protein-gekoppelten Rezeptorgens als Teil eines diagnostischen Tests zum Nachweisen von Krankheiten oder der Empfindlichkeit für Krankheiten, die mit der Anwesenheit von mutierten G-Protein-gekoppelten Rezeptorgenen in Zusammenhang stehen. Solche Erkrankungen stehen mit der Zelltransformation in Zusammenhang, wie zum Beispiel Tumore und Krebs.
Personen, die Mutationen im menschlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptorgen tragen, können auf dem DNA-Niveau durch eine Vielzahl an Techniken nachgewiesen werden. Nucleinsäuren zur Diagnose kann von einer Patientenzelle wie zum Beispiel aus dem Blut, Harn, Speichel, einer Gewebebiopsie und dem Autopsiematerial erhalten werden. Die genomische DNA kann direkt zum Nachweis verwendet werden oder kann enzymatisch unter Verwendung von PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163–166 (1986)) vor der Analyse amplifiziert werden. RNA oder cDNA kann auch für den gleichen Zweck verwendet werden. Als ein Beispiel können PCR-Primer verwendet werden, die zu der Nucleinsäure komplementär sind, die das G-Protein-gekoppelte Rezeptorprotein codieren, um G-Protein-gekoppelte Rezeptormutationen zu identifizieren und zu analysieren. Zum Beispiel können durch eine Veränderung in der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich mit dem normalen Genotyp Deletionen und Insertionen nachgewiesen werden. Punktmutationen können durch Hybridisieren der amplifizierten DNA an radioaktiv markierte G-Protein-gekoppelte Rezeptor-RNA oder alternativ an radioaktiv-markierte G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert werden. Perfekt paarende Sequenzen können von nicht-perfekt paarenden Doppelhelices durch Rnase A-Spaltung oder durch Unterschiede in der Schmelztemperatur unterschieden werden.
Genetische Untersuchung basierend auf DNA-Sequenzunterschieden kann durch Nachweis der Änderungen in der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne denaturierende Mittel erzielt werden. Kleine Sequenzdeletionen und -Insertionen können durch Gelelektorphorese mit hoher Auflösung sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente von unterschiedlichen Sequenzen können auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden, in welchen die Mobilitäten von unterschiedlichen DNA-Fragmenten gemäß ihrer spezifischen Schmelz- oder teilweisen Schmelztemperaturen im Gel an unterschiedlichen Positionen verlangsamt werden (siehe z.B. Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)).
Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nuclease-Schutztests wie zum Beispiel Rnase- und S1-Schutz oder das chemische Spaltungsverfahren gezeigt werden (z.B. Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397–4401 (1985)).
Der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz kann daher durch Verfahren wie zum Beispiel Hybridisierung, RNase-Schutz, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen (z.B. Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)) und Southern-Blot-Verfahren von genomischer DNA erzielt werden.
Mutationen können zusätzlich zu der konventionelleren Gel-Elektorphorese und DNA-Sequenzierung auch durch in situ-Analyse nachgewiesen werden.
Die vorliegende Offenbarung betrifft auch einen diagnostischen Test zum Nachweisen von veränderten Mengen an löslichen Formen von Rezeptor-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Geweben. Tests, die verwendet werden, um Mengen an löslichen Rezeptor-Polypeptiden in einer Probe nachzuweisen, die aus einer Wirtszelle stammt, sind Fachleuten gut bekannt und umfassen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western-Blot-Analyse und vorzugsweise einen ELISA-Test.
Ein ELISA-Test umfasst anfänglich das Herstellen eines Antikörpers, der für Antigene der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Polypeptide spezifisch ist, vorzugsweise eines monoclonalen Antikörpers. Außerdem wird ein Reporterantikörper gegen den monoclonalen Antikörper erzeugt. An den Reporterantikörper wird ein nachweisbares Reagens wie zum Beispiel Radioaktivität, Fluoreszenz oder in diesem Beispiel ein Meerrettichperoxidaseenzym angebracht. Nun wird eine Probe von einem Wirt entnommen und auf einem festen Träger inkubiert, z.B. einer Polystyrolschale, welche die Proteine in der Probe bindet. Alle freien Proteinbindungsstellen auf der Schale werden dann durch Inkubation eines nicht-spezifischen Proteins wie zum Beispiel Rinderserumalbumin bedeckt. Als Nächstes wird der monoclonale Antikörper in der Schale inkubiert, während dessen die monoclonalen Antikörper an alle G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine binden, die an die Polystyrolschale gebunden sind. Aller nicht-gebundener monoclonaler Antikörper wird mit Puffer ausgewaschen. Der mit der Meerrettichperoxidase verbundene Reporterantikörper wird nun in die Schale gegeben, was in der Bindung des Reporterantikörpers an die an G-Protein Rezeptorproteine gebundenen monoclonalen Antikörper resultiert. Nicht anhaftender Reporterantikörper wird dann ausgewaschen. Peroxidasesubstrate werden zu der Schale hinzugefügt und die Menge an Farbentwicklung in einer bestimmten Zeitspanne ist eine Messung der Menge an G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen, die in einem bestimmten Volumen einer Patientenprobe enthalten sind, wobei ein Vergleich mit einer Standardkurve erfolgt.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch für die Chromosomenidentifizierung nützlich. Die Sequenz ist spezifisch auf eine bestimmte Stelle auf einem einzelnen menschlichen Chromosom gerichtet und kann damit hybridisieren. Darüber hinaus gibt es gegenwärtig einen Bedarf für die Identifizierung von bestimmten Stellen auf dem Chromosom. Gegenwärtig sind wenige, auf tatsächlichen Sequenzdaten basierende (Wiederholungspolymorphismus), Chromosomen-markierende Reagenzien erhältlich. Die Kartierung von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt in der Korrelierung jener Sequenzen mit Genen, die mit Erkrankungen im Zusammenhang stehen.
Kurz gesagt können Sequenzen durch Erzeugen von PCR-Primern (vorzugsweise 15–25 bp) von der cDNA auf Chromosomen kartiert werden. Computeranalyse der nicht-translatierten 3'-Region wird verwendet, um Primer rasch auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon der genomischen DNA umspannen, was daher den Amplifizierungsprozess komplizieren würde. Diese Primer werden für die PCR-Durchmusterung von somatischen Zellhybriden verwendet, die einzelne menschliche Chromosomen enthalten. Nur jene Hybride, die das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht, werden ein amplifiziertes Fragment ergeben.
PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist ein rasches Verfahren, um eine spezielle DNA einem speziellen Chromosom zuzuweisen. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung kann mit den gleichen Oligonucleotidprimern eine Unterlokalisierung mit Fragmentgruppen von spezifischen Chromosomen oder Pools von großen genomischen Clonen in einer analogen Weise erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die auf ähnliche Weise verwendet werden können, um eine Kartierung zu seinem Chromosom zu erreichen, umfassen in situ-Hybridisierung, Vordurchmusterung mit markierten durchflusssortierten Chromosomen und Vorselektion durch Hybridisierung, um chromosomenspezifische cDNA-Banken zu konstruieren.
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) eines cDNA-Clons an eine Ausbreitung Metaphase-Chromosomen kann auch verwendet werden, um die genaue Chromosomenstelle in einem Schritt bereitzustellen. Diese Technik kann mit cDNA verwendet werden, die so kurz wie 50 oder 60 Basen ist. Für die Zusammenfassung dieser Technik siehe Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Sobald eine Sequenz einmal zu einer genauen Chromosomenstelle kartiert wurde, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit genetischen Kartendaten korreliert werden. Solche Daten werden zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man gefunden (erhältlich online über die John Hopkins University Welch Medical Library). Die Beziehung zwischen Genen und Erkrankungen, die zu der gleichen chromosomalen Region kartiert worden sind, werden dann über Kopplungsanalyse (gemeinsame Vererbung von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
Als Nächstes ist es notwendig, die Unterschiede in der cDNA oder genomischen Sequenz von betroffenen oder nicht betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn eine Mutation in manchen oder allen der betroffenen Personen beobachtet wird, aber nicht in irgendwelchen normalen Personen, dann ist es wahrscheinlich, dass die Mutation der ursächliche Erreger der Krankheit ist.
Mit der gegenwärtigen Auflösung der physikalischen Kartierung und genetischen Kartierungstechniken könnte eine cDNA, die genau zu einer chromosomalen Region lokalisiert wurde, die mit dieser Erkrankung in Zusammenhang steht, eines von zwischen 50 und 500 möglichen ursächlichen Genen darstellen. (Das nimmt eine Kartierungsauflösung von 1 Megabase und einem Gen pro 20 kb an).
Die Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoge davon oder Zellen, die sie exprimieren, können als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper dagegen zu erzeugen. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Chimäre, Einzelketten und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbank. Verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Erzeugung solcher Antikörper und Fragmente verwendet werden.
Antikörper, die gegen die Polypeptide erzeugt werden, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier, oder durch Verabreichung der Polypeptide an ein Tier, vorzugsweise keinen Menschen, erhalten werden. Der auf diese Weise erhaltene Antikörper wird dann die Polypeptide selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment des Polypeptids codiert, für die Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, welche die gesamten nativen Polypeptide binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um die Polypeptide aus Geweben zu isolieren, die dieses Polypeptid exprimieren.
Zur Erzeugung von monoclonalen Antikörpern kann jede Technik verwendet werden, die Antikörper bereitstellt, welche durch fortlaufende Zelllinienkulturen erzeugt werden. Beispiele umfassen die Hybridom-Technik (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256: 495–497), die Triom-Technik, die menschliche B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridom-Technik, um menschliche monoclonale Antikörper zu erzeugen (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77–96).
Für die Erzeugung von Einzelketten-Antikörpern beschriebene Techniken ( US-Patent 4.946.778 ) können adaptiert werden, um Einzelketten-Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu erzeugen. Außerdem können transgene Mäuse verwendet werden, um vermenschlichte Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung wird hierin weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben werden, es ist jedoch klar, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist. Alle Teile oder Mengen beziehen sich, falls nicht anders angegeben, auf das Gewicht.
Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte, oft gebrauchte Verfahren und/oder Begriffe beschrieben werden.
„Plasmide" werden durch ein kleines p, dem Großbuchstaben und/oder Nummern vorausgehen und/oder folgen, beschrieben. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder im Handel erhältlich, auf einer nicht eingeschränkten Basis öffentlich erhältlich oder können aus erhältlichen Plasmiden in Übereinstimmung mit veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Außerdem werden einem Fachmann Plasmide, die zu jenen äquivalent sind, die im Fachgebiet beschrieben werden, offensichtlich sein.
„Spaltung" von DNA bezieht sich auf das katalytische Schneiden von DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur an bestimmten Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen, hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren und anderen Erfordernisse wurden so verwendet, wie es einem Fachmann bekannt sein würde. Für analytische Zwecke wird üblicherweise 1 μg an Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten an Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Zum Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Plasmidkonstruktion werden üblicherweise 5 bis 50 μg an DNA mit 20 bis 250 Einheiten an Enzym in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller vorgeschrieben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C werden normalerweise verwendet, können aber in Übereinstimmung mit dem Anweisungen des Lieferanten variieren. Nach der Spaltung wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterworfen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung eines 8% Polyacrylamidgels durchgeführt, wie von Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) beschrieben.
„Oligonucleotide" bezieht sich entweder auf einzelsträngige Polydesoxynucleotide oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert sein können. Solche synthetischen Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und werden daher ohne. Hinzufügen eines Phosphats durch ein ATP in der Anwesenheit einer Kinase nicht an ein anderes Oligonucleotid ligieren. Ein synthetisches Oligonucleotid wird mit einem Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert worden ist.
„Ligierung" bezieht sich auf den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T., et al., ebenda, S. 146). Wenn nicht anders bereitgestellt, kann die Ligierung unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten an T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg an ungefähr äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erreicht werden.
Wenn nicht anders angegeben, wurde die Transformation wie in den Verfahren von Graham, F. und Van der Eb, A., Virology, 52: 456–457 (1973) durchgeführt.
Beispiel 1
Bakterielle Expression und Reinigung von EBI-2
Die DNA-Sequenz, die EBI-2 codiert, ATCC #209003, wird anfänglich unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'-Sequenzen des prozessierten EBI-2-Proteins (ohne der Signal-Peptidsequenz) und den Vektorsequenzen 3' vom EBI-2-Gen entsprechen. Zusätzliche Nucleotide, die EBI-2 entsprechen, wurden zu den 5' bzw. 3'-Sequenzen hinzugefügt. Der 5'-Oligonucleotidprimer hat die Sequenz 5' CCGAGGATCCATGCAAGCCGTCGACAAT 3' (SEQ ID NO: 5) und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymstelle, gefolgt von 18 Nucleotiden der EBI-2 Codierungssequenz, beginnend an der vermuteten terminalen Aminosäure des prozessierten Proteincodons. Die 3' Sequenz 5' CCGAGGATCCTTACATTGGAGTCTCTTC 3' (SEQ ID NO: 6) enthält komplementäre Sequenzen zur BamHI-Stelle, worauf 18 Nucleotide von EBI-2 folgen. Die Restriktionsenzymstellen entsprechen den Restriktionsenzymstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-60 (Quiagen, Inc., Chatsworth, KA, 91311). pQE-60 codiert Antibiotikaresistenz (Amp^r), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen IPTG-regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomenbindungsstelle (RBS), einen 6-His-Marker und Restriktionsenzymstellen. pQE-60 wurde dann mit BamHI gespalten. Die amplifizierten Sequenzen wurden in pQE-60 ligiert und wurden im Leserahmen mit der Sequenz inseriert, die den Histidin-Marker und die RBS codiert. Das Ligierungsgemisch wurde dann verwendet, um den E. coli-Stamm M15/rep 4 (Quiagen, Inc.) durch das in Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschriebene Verfahren zu transformieren. M15/rep4 enthält vielfache Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch Kanamycin-Resistenz (Kan^r) verleiht. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen identifiziert und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt. Plasmid DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die die gewünschten Konstrukte enthielten, wurden über Nacht in Flüssigkultur in LB-Medium, das sowohl mit Amp (100 μg/ml) als auch Kan (25 μg/ml) ergänzt war, gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 zu inokulieren. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte von 600 (O.D.⁶⁰⁰) von 0,4 bis 0,6 gezüchtet. IPTG („Isopropyl-B-D-thioglalctopyranosid”) wurde dann zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI-Repressors, wodurch der P/O frei gelegt wird, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen wurden für weitere 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wurde in dem chaotrophen Mittel 6 M Guanidin-HCl solubilisiert. Nach der Klärung wurde solubilisiertes hSca-2 aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Nickel-Chelatsäule unter Bedingungen gereinigt, die eine starke Bindung durch Proteine ermöglichen, die den 6-His-Marker enthalten (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177–184 (1984)). hSca-2 (95% rein wurde aus der Säule in 6 M Guanidin-HCl, pH-Wert 5,0, eluiert und zum Zweck der Renaturierung auf 3 M Guanidin-HCl, 100 mM Natriumphosphat, 10 mM Glutathion (reduziert) und 2 mM Glutathion (oxidiert) eingestellt. Nach der Inkubation in dieser Lösung für 12 Stunden wurde das Protein gegen 10 mM Natriumphosphat dialysiert.
Beispiel 2
Clonierung und Expression von EBI-2 unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems
Die DNA-Sequenz, die das Volllängen-EBI-2-Protein, ATCC #209003, codiert, wurde unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5' und 3'-Sequenzen des Gens entsprachen:
Der 5'-Primer hat die Sequenz 5' CCGAGGATCCGCCATCATGCAAGCCGTCGACAAT 3' (SEQ ID NO: 7) und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymstelle (fett gedruckt), gefolgt von 6 Nucleotiden, die einem effizienten Signal für die Translationsinitiation in eukaryontischen Zellen ähneln (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196: 947–950 (1987) und die gleich hinter den ersten 18 Nucleotiden des EBI-2-Gens liegen (das Initiationscodon für die Translation „ATG" ist unterstrichen).
Der 3'-Primer hat die Sequenz 5' CCGAGGATCCTTACATTGGAGTCTCTTC 3' (SEQ ID NO: 8) und enthält die Schnittstelle für die Restriktionsendonuclease BamHI und 18 Nucleotide die komplementär zu der 3'-translatierten Sequenz des extrazellulären Teils von EBI-2 sind. Die amplifizierten Sequenzen wurden aus einem 1%-Agarosegel unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits („Geneclean” BIO 101 Inc. La Jolla, KA) isoliert. Das Fragment wurde dann mit der Endonuclease BamHI gespalten und wieder auf einem 1%-Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wird als F2 bezeichnet.
Der Vektor pA2 (Modifikation des pVL941-Vektors, nachstehend besprochen) wird für die Expression des EBI-2-Proteins unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems verwendet (für eine Zusammenfassung siehe: Summers, M. D. und Smith, G. E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555).
Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des Polyedervirus von Autographs californica (AcMNPV), gefolgt von der Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease BamHI. Die Polyadenylierungsstelle des Affenvirus (SV)40 wird für effiziente Polyadenylierung verwendet. Für eine leichte Auswahl an rekombinantem Virus wird das beta-Galactosidasegen aus E. coli in der gleichen Richtung wie der Polyhedrin-Promotor inseriert, gefolgt vom Polyadenylierungssignal des Polyhedringens. Die Polyhedrinsequenzen werden an beiden Seiten von viralen Sequenzen für die Zell-vermittelte homologe Rekombination von co-transfizierter viraler Wildtyp-DNA flankiert. Viele andere Baculovirusvektoren könnten anstatt von pqA2 verwendet werden, wie zum Beispiel pRG1 und pA2-GP, in welchem Fall die 5'-Primer entsprechend abgeändert werden, und pAc373, pVL941 und pAcIM1 (Luckow, V. A. und Summers, M. D., Virology, 170: 31–39).
Das Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und dann unter Verwendung von Kälberdarm-Phosphatase durch im Fachgebiet bekannte Verfahren dephosphoryliert. Die DNA wurde dann aus einem 1% Agarosegel unter Verwendung des im Handel erhältlichen Kits („Geneclean” BIO Inc., La Jolla. KA) isoliert. Diese Vektor-DNA wird als V2 bezeichnet.
Fragment F2 und das dephosphorylierte Plasmid V2 wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli HB101-Zellen wurden dann transformiert und Bakterien unter Verwendung des Enzyms BamHI identifiziert, die das Plasmid (pBacEBI-2) mit dem EBI-2 Gen enthielten. Die Sequenz des clonierten Fragments wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
5 μg des Plasmids pBacEBI-2 wurden mit 1,0 μg eines im Handel erhältlichen linearisierten Baculovirus („BaculoGold Baculovirus DNA", Pharmigen, San Diego, KA.) unter Verwendung des Lipofektionverfahrens co-transfiziert (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7417 (1987)).
1 μg an BaculoGold-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBacEBI-2 wurden in einer sterilen. Vertiefung einer Mikrotiterplatte gemischt, die 50 μl an serumfreien Grace-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) enthielt. Danach wurden 10 μl Lipofectin und 90 μl Grace-Medium hinzugefügt, gemischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) hinzugefügt, die in einer 35 mm-Gewebekulturplatte mit 1 ml Grace-Medium ohne Serum ausgesät waren. Die Platte wurde hin und her geschaukelt, um die neu hinzugefügte Lösung zu mischen. Die Platte wurde dann für 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wurde die Transfektionslösung aus der Platte entfernt und 1 ml Grace-Insektenmedium, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war, wurde hinzugefügt. Die Platte wurde in einen Inkubator zurückgestellt und die Züchtung bei 27°C für vier Tage fortgesetzt.
Nach vier Tagen wurde der Überstand gesammelt und eine Plaquetest, ähnlich wie bei Summers und Smith beschrieben (vorstehend), wurde durchgeführt. Als eine Modifikation wurde ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) verwendet, das eine einfache Isolierung der blau gefärbten Plaques ermöglicht. (Eine genaue Beschreibung des „Plaquetests" kann auch im Benutzerhandbuch für Insektenzellkultur und Baculovirologie, vertrieben durch Life Technologies Inc., Gaithersburg, Seite 9–10 gefunden werden).
Vier Tage nach der seriellen Verdünnung wurde das Virus zu den Zellen hinzugefügt und blau gefärbte Plaques wurden mit der Spitze einer Eppendorfpipette entnommen. Der Agar, der die rekombinanten Viren enthielt, wurde dann in einem Eppendorfröhrchen resuspendiert, das 200 μl Grace-Medium enthielt. Der Agar wurde durch eine kurze Zentrifugation entfernt und der Überstand, der das rekombinante Baculovirus enthielt, wurde verwendet, um Sf9-Zellen zu infizieren, die in 35 mm-Schalen ausgesät waren. Vier Tage später wurden die Überstände dieser Zellkulturschalen geerntet und dann bei 4°C gelagert.
Sf9-Zellen wurden in Grace-Medium gezüchtet, das mit 10% hitzeinaktiviertem FBS ergänzt war. Die Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovirus V-EBI-2 bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 infiziert. Sechs Stunden später wurde das Medium entfernt und durch SF900 II-Medium ohne Methionin und Cystein (Life Technologies Inc., Gaithersburg) ersetzt. 42 Stunden später wurden 5 μCi and ³⁵S Methionin und 5 μCi ³⁵S-Cystein (Amersham) hinzugefügt. Die Zellen wurden weiter für 16 Stunden inkubiert, bevor sie durch Zentrifugation geerntet wurden, und die markierten Proteine wurden durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht.
Beispiel 3
Expression der rekombinanten EBI-2 in COS-Zellen
Die Expression von Plasmid EBI-2 HA stammt aus dem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen), umfassend: 1) SV40-Replikationsursprung, 2) Ampicillin-Resistenzgen, 3) E. coli-Replikationsursprung, 4) CMV-Promotor, gefolgt von einer Polylinkerregion, einem SV40-Intron und einer Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, das den gesamten EBI-2-Vorläufer und ein HA-Marker, im Leserahmen fusioniert mit seinem 3'-Ende, codiert, wurde in die Polylinkerregion des Vektors cloniert, daher wird die rekombinante Proteinexpression unter dem CMV-Promotor geleitet. Der HA-Marker entspricht, wie vorstehend beschrieben, einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutininprotein stammt (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lerner, 1984, Cell 37: 767, (1984)). Die Fusion des HA-Markers an das Zielprotein ermöglicht den leichten Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
Die Plasmid-Kontstruktionsstrategie wird wie folgt beschrieben:
Die EBI-2 codierende DNA-Sequenz, ATCC #209003, wurde durch PCR unter Verwendung von 2 Primern konstruiert: der 5'-Primer 5' CCGAGGATCCGCCATCATGCAAGCCGTCGACAAT 3' (SEQ ID NO: 9) enthält eine BamHI-Stelle, gefolgt von einer EBI-2-Codierungssequenz, die am Initiationscodon beginnt; die 3'-Sequenz 5' CCGATCTAGATTAATCCCATACGACGTCCCAGACTACGCTCATTGGAGTCTCTTC 3' (SEQ ID NO: 10) enthält komplementäre Sequenzen zur XbaI-Stelle, dem Translations-Stoppcodon, HA-Marker und der EBI-2-Codierungssequenz (ohne des Stoppcodons). Das PCR-Produkt enthält daher eine BamHI-Stelle, eine EBI-2-Codierungssequenz, gefolgt von einem HA-Marker, das im Leserahmen fusioniert ist, einem Translations-Terminationsstoppcodon neben dem HA-Marker und einer XbaI-Stelle. Das PCR-amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor, pcDNAI/Amp, wurden mit dem BamHI- und XbaI-Restriktionsenzym gespalten und ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in den E. coli-Stamm SURF transformiert (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torreg Pines Road, La Jolla, KA 92037), die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten plattiert und resistente Kolonien wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit von richtigen Fragmenten untersucht. Zur Expression des rekombinanten EBI-2 wurden COS-Zellen mit dem Expressionsvektor durch das DEAE-DEXTRAN-Verfahren (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) transfiziert. Die Expression des EBI-2-HA-Proteins wurde durch radioaktive Markierung und das Immunpräzipitationsverfahren (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)) nachgewiesen. Zellen wurden für 8 Stunden mit ³⁵S-Cystein zwei Tage nach der Transfektion markiert. Kulturmedien wurden dann gesammelt und die Zellen wurden mit Detergens lysiert (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH-Wert 7,5) (Wilson, I. et al., ebenda, 37: 767 (1984)). Sowohl Zelllysate als auch Kulturmedien wurden mit HA-spezifischem monoclonalem Antikörper ausgefällt. Die ausgefällten Proteine wurden auf 15% SDS-PAGE-Gelen analysiert.
Beispiel 4
Expression über Gen-Therapie
Fibroblasten werden von einem Individuum durch Hautbiopsie entnommen. Das daraus resultierende Gewebe wird in Gewebekulturmedium gegeben und in kleine Stücke zerteilt. Kleine Brocken des Gewebes werden auf eine nasse Oberfläche einer Gewebekulturflasche gelegt, ungefähr zehn Stücke werden in jede Flasche gelegt. Die Flasche wird dann umgedreht, fest geschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Flasche umgedreht und die Brocken an Gewebe bleiben am Boden der Flasche kleben und frisches Medium (z.B. Ham-F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, Penicillin und Streptomycin) wird hinzugefügt. Das Ganze wird dann bei 37°C für ungefähr eine Woche inkubiert. Zu dieser Zeit wird frisches Medium hinzugefügt und anschließend alle paar Tage gewechselt. Nach weiteren zwei Wochen in der Zellkultur taucht eine Einzelzellschicht von Fibroblasten auf. Die Einzelzellschicht wird mit Trypsin behandelt und in größere Flaschen abgemessen.
pMV-7 (Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219–25 (1988), flankiert durch die langen terminalen Wiederholungen des Moloney-Sarcomvirus der Maus wird mit EcoRI und HindIII gespalten und anschließend mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt. Der lineare Vektor wird auf einem Agarosegel fraktioniert und unter Verwendung von Glasperlen gereinigt.
Die cDNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die den 5' bzw. 3'-Endsequenzen entsprechen. Der 5'-Primer enthält eine EcoRI-Stelle und der 3'-Primer enthält ferner eine HindIII-Stelle. Gleiche Mengen an linearem Rückgrat des Moloney-Sarcomvirus der Maus und der amplifizierten EcoRI- und HindIII-Fragmente werden in der Anwesenheit der T4-DNA-Ligase zusammengefügt. Das daraus resultierende Gemisch wird unter Bedingungen erhalten, die für die Ligierung der zwei Fragmente geeignet sind. Das Ligierungsgemisch wird verwendet, um HB101-Bakterien zu transformieren, die dann zum Zweck der Bestätigung, dass der Vektor das Gen von Interesse richtig inseriert hat, auf Kanamycin enthaltenden Agar plattiert werden.
Die amphotrophen pA317- oder GP+am12-Verpackungszellen werden in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Kälberserum (CS), Penicillin und Streptomycin in Gewebekultur bis zu einer konfluenten Dichte gezüchtet. Der MSV-Vektor, der das Gen enthält, wird dann zu den Medien hinzugefügt und die Verpackungszellen werden mit dem Vektor transduziert. Die Verpackungszellen produzieren nun infektiöse virale Partikel, welche das Gen enthalten (die Verpackungszellen werden nun als Erzeugerzellen bezeichnet).
Frisches Medium wird zu den transduzierten Erzeugerzellen hinzugefügt und anschließend wird das Medium aus einer 10 cm-Platte von konfluenten Erzeugerzellen geerntet. Das verbrauchte Medium, das die infektiösen viralen Partikel enthält, wird durch einen Milipore-Filter gefiltert, um abgelöste Erzeugerzellen zu entfernen, und dieses Medium wird dann verwendet, um Fibroblastenzellen zu infizieren. Medium wird von einer sub-konfluenten Platte an Fibroblasten entfernt und schnell durch das Medium von den Erzeugerzellen ersetzt. Dieses Medium wird entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Wenn der Virustiter hoch ist, werden fast alle Fibroblasten infiziert sein und eine Selektion wird nicht benötigt. Wenn der Titer sehr niedrig ist, dann ist es notwendig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektierbaren Marker wie zum Beispiel neo oder his aufweist.
Die erzeugten Fibroblasten werden dann, entweder alleine oder nachdem sie bis zur Konfluenz auf Cytodex 3-Mikroträger-Perlen gezüchtet wurden, in den Wirt in injiziert.
Beispiel 5
Bakterielle Expression und Reinigung des EDG-1-ähnlichen Polypeptids (Referenzbeispiel)
Die DNA-Sequenz, die das EDG-1-ähnliche Polypeptid codiert, ATCC #209004, wird anfänglich unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern entsprechend den 5'-Sequenzen des prozessierten EDG-1-ähnlichen Polypeptidproteins (ohne der Signalpeptid-Sequenz) und den Vektorsequenzen 3' zum EDG-1-ähnlichen Polypeptidgen amplifiziert. Zusätzliche Nucleotide, die EBI-2 entsprechen, wurden zu den 5'- bzw. 3'-Sequenzen hinzugefügt. Der 5'-Oligonucleotidprimer hat die Sequenz:
5' CCGAGGATCCATGAACGCCACGGGGACC 3' (SEQ ID NO: 11) und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymstelle, gefolgt von 18 Nucleotiden der EDG-1-ähnlichen Polypeptid-Codierungssequenz, die von der mutmaßlichen terminalen Aminosäure des prozessierten Proteincodons startet. Die 3'-Sequenz: 5' CCGAGGATCCTCAGATGCTCCGCACGCT 3' (SEQ ID NO: 12) enthält komplementäre Sequenzen zur BamHI-Stelle, auf die 18 Nucleotide des EDG-1-ähnlichen Polypeptids folgen. Die Restriktionsenzymstellen entsprechen den Restriktionsenzymstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-60 (Quiagen, Inc., Chatsworth, KA, 91311). pQE-60 codiert Antibiotikaresistenz (Amp^r), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen IPTG-regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomenbindungsstelle (RBS), einen 6-His-Marker und Restriktionsenzymstellen. pQE-60 wurde dann mit BamHI gespalten. Die amplifizierten Sequenzen wurden in pQE-60 ligiert und wurden im Leserahmen mit der Sequenz inseriert, die den Histidin-Marker und die RBS codiert. Das Ligierungsgemisch wurde dann verwendet, um den E. coli Stamm M15/rep 4 (Quiagen, Inc.) durch das in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschriebene Verfahren zu transformieren. M15/rep4 enthält mehrere Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch Kanamycin-Resistenz (Kan^r) verleiht.
Transformanten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Ampicillin und Kanamycin resistente Kolonien wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die die gewünschten Konstrukte erzeugen, wurden über Nacht (DIN) in flüssiger Kultur in LB-Medium gezüchtet, das sowohl mit Amp (100 μg/ml) als auch Kan (25 μg/ml) ergänzt war. Die OIN-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur bei einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 zu inokulieren. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte 600 (O.D.⁶⁰⁰) von zwischen 0,4 und 0,6 gezüchtet. IPTG („Isopropy)-β-D-thiogalactopyranosid") wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI-Repressors, wodurch der P/O freigelegt wird, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Zellen wurden weitere 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wurde in dem chaotrophen Mittel 6 M Guanidin-HCl solubilisiert. Nach der Klärung wurde solubilisierter EBI-2 aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Nickel-Chelatsäule unter Bedingungen gereinigt, die eine feste Bindung durch Proteine ermöglichen, die den 6-His-Marker enthalten (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177–184 (1984)). EBI-2 (95% rein) wurde aus der Säule in 6 M Guanidin-HCl, pH-Wert 5,0, eluiert und zum Zweck der Renaturierung auf 3 M Guanidin-HCl, 100 mM Natriumphosphat, 10 mM Gluthathion (reduziert) und 2 mM Glutathion (oxidiert) eingestellt. Nach Inkubation in dieser Lösung für 12 Stunden wurde das Protein gegen 10 mM Natriumphosphat dialysiert.
Beispiel 6
Clonierung und Expression von EDG-1-ähnlichem Polypeptid unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems (Referenzbeispiel)
Die DNA-Sequenz, die das Volllängen-EDG-1-ähnliche Polypeptidprotein, ATCC #209004 codiert, wurde unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern, die den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen, amplifiziert. Der 5'-Primer hat die Sequenz:
5' GCGAGGATCCGCCATCATGAACGCCACGGGGACC 3' (SEQ ID NO: 13) und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymstelle (fett gedruckt), gefolgt von 6 Nucleotiden, die einem effizienten Signal für die Translationsinitiation in eukaryontischen Zellen ähneln (Kozak, M. J. Mol. Biol., 196: 947–950 (1987), das gleich nach den ersten 18 Nucleotiden des EDG-1-ähnlichen Polypeptidgens liegt (das Initiationscodon für die Translation „ATG" ist unterstrichen).
Der 3'-Primer hat die Sequenz: 5' CCGAGGATCCTCAGATGCTCCGCACGCT 3' (SEQ ID NO: 14) und enthält die Spaltungsstelle für die Restriktionsendonuclease BamHI und 18 Nucleotide, die zu der translatierten 3'-Sequenz des extrazellulären Teils des EDG-1-ähnlichen Polypeptids komplementär sind. Die amplifizierten Sequenzen wurden aus einem 1% Agarosegel unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits („Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, KA) isoliert. Das Fragment wurde dann mit der Endonuclease BamHI gespalten und wieder auf einem 1% Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wird als F2 bezeichnet.
Der Vektor pA2 (Modifikation des pVL941-Vektors, nachstehend besprochen) wird für die Expression des EDG-1-ähnlichen Polypeptidproteins unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems verwendet (für eine Zusammenfassung siehe: Summers, M. D. und Smith, G. E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures. Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555). Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des Kernpolyedervirus von Autographs californica (AcMNPV), gefolgt von der Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease BamHI. Die Polyadenylierungsstelle des Affenvirus (SV)40 wird für effiziente Polyadenylierung verwendet. Für eine einfache Selektion von rekombinantem Virus wird das beta-Galactosidasegen aus E. coli in der gleichen Orientierung wie der Polyhedrinpromotor, gefolgt durch das Polyadenylierungssignal des Polyhedringens, inseriert. Die Polyhedrinsequenzen werden an beiden Seiten durch virale Sequenzen für die zellvermittelte homologe Rekombination von co-transfizierter viraler Wildtyp-DNA flankiert. Viele andere Baculovirusvektoren könnten anstelle von pA2 verwendet werden, wie zum Beispiel pRG1 und pA2-GP, wobei der 5'-Primer demgemäß geändert wird, und pAc373, pVL941 und pAcIM1 (Luckow, V. A. und Summers, M. D., Virology, 170: 31–39).
Das Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und dann unter Verwendung von Kälberdarm-Phosphatase durch im Fachgebiet bekannte Verfahren dephosphoryliert. Die DNA wurde dann aus einem 1% Agarosegel unter Verwendung des im Handel erhältlichen Kits („Geneclean” BIO 101 Inc., La Jolla, KA) isoliert. Dieser Vektor wurde als V2 bezeichnet.
Fragment F2 und das dephosphorylierte Plasmid V2 wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli HB 101 wurden dann transformiert und Bakterien unter Verwendung des BamHI-Enzyms identifiziert, die das Plasmid (pBacEDG-1-ähnliches Polypeptid) mit dem EDG-1-ähnlichen Polypeptidgen enthielten. Die Sequenz des clonierten Fragments wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
5 μg des Plasmids pBacEDG-1-ähnliches Polypeptid wurden mit 1,0 μg eines im Handel erhältlichen linearisierten Baculovirus („BaculoGold-Baculovirus-DNA", Pharmigen, San Diego, KA) unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 7413–7417 (1987)) co-transfiziert.
1 μg an BaculoGold-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBacEDG-1-ähnliches Polypeptid wurden in einer sterilen Vertiefung einer Mikrotiterplatte gemischt, die 50 μl an serumfreien Grace-Medium (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) enthielt. Danach wurden 10 μl Lipofectin und 90 μl Grace-Medium hinzugefügt, gemischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) hinzugefügt, damit wurde eine 35 mm-Gewebekulturplatte mit 1 ml Grace-Medium ohne Serum beimpft. Die Platte wurde hin und her geschaukelt, um die neu hinzugefügte Lösung zu mischen. Die Platte wurde dann für 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wurde die Transfektionslösung von der Platte entfernt und 1 ml Grace-Insektenmedium, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war, wurde hinzugefügt. Die Platte wurde in einen Inkubator zurückgestellt und die Züchtung für 4 Tage bei 27°C fortgesetzt.
Nach 4 Tagen wurde der Überstand gesammelt und ein Plaquetest durchgeführt, ähnlich wie er von Summers und Smith (vorstehend) beschrieben wurde. Als eine Modifikation wurde ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) verwendet, das leichte Isolierung der blau gefärbten Plaques ermöglicht. (Eine genaue Beschreibung eines „Plaque-Tests” kann auch im Benutzerhandbuch für Insektenzellkultur und Baculovirologie, vertrieben durch Life Technologies Inc., Gaithersburg, Seiten 9–10, gefunden werden).
Vier Tage nach der seriellen Verdünnung wurde das Virus zu den Zellen hinzugefügt und blau gefärbte Plaques wurden mit der Spitze einer Eppendorfpipette abgenommen. Der die rekombinanten Viren enthaltende Agar wurde dann in einem Eppendorfröhrchen resuspendiert, das 200 μl Grace-Medium enthielt. Der Agar wurde durch kurze Zentrifugation entfernt und der Überstand, der das rekombinante Baculovirus enthielt, wurde verwendet, um Sf9-Zellen zu infizieren, die in die 35 mm-Schalen ausgesät waren. Vier Tage später wurden die Überstände dieser Zellkulturschalen geerntet und bei 4°C gelagert.
Sf9-Zellen wurden in Grace-Medium gezüchtet, das mit 10% hitzeinaktiviertem FBS ergänzt war. Die Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovirus-V-EDG-1-ähnlichem Polypeptid bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 infiziert. Sechs Stunden später wurde das Medium entfernt und durch SF900 II-Medium ohne Methionin und Cystein (Life Technologies Inc., Gaithersburg) ersetzt. 42 Stunden später wurden 5 μCi an ³⁵S-Methionin und 5 μCi ³⁵S-Cystein (Amersham) hinzugefügt. Die Zellen wurden weiter für 16 Stunden inkubiert, bevor sie durch Zentrifugation geerntet wurden, und die markierten Proteine wurden durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht.
Beispiel 7
Expression von rekombinantem EDG-1-ähnlichem Polypeptid in Cos-Zellen (Referenzbeispiel)
Die Expression von Plasmid EDG-1-ähnlichem Polypeptid HA erfolgt von dem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen), enthaltend: 1) SV40-Replikationsursprung, 2) Ampicillinresistenzgen, 3) E. coli-Replikationsursprung, 4) CMV-Promotor, gefolgt von einer Polylinkerregion, einem SV40-Intron und einer Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, welches den gesamten EDG-1-ähnlichen Polypeptid-Vorläufer codiert, und ein HA-Marker, fusioniert im Leserahmen an sein 3'-Ende, wurden in die Polylinkerregion des Vektors cloniert, daher wurde die rekombinante Proteinexpression unter dem CMV-Promotor gesteuert. Der HA-Marker entspricht einem Epitop, das von dem vorstehend beschriebenen Influenza-Hämagglutininprotein stammt (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lerner, 1984 Cell 37: 767, (1984). Die Fusion des HA-Markers mit dem Zielprotein ermöglicht einen leichten Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
Die Plasmidkonstruktionsstrategie wird wie folgt beschrieben:
Die DNA-Sequenz, die das EDG-1-ähnliche Polypeptid, ATCC #209004, codiert, wurde unter Verwendung von zwei Primern durch PCR konstruiert: der 5' Primer 5'CCGAGGATCCGCCATCATGAACGCCACGGGGACC 3' (SEQ ID NO: 15) enthält eine BamHI-Stelle, gefolgt durch die Codierungssequenz des EDG-1-ähnlichen Polypeptids, beginnend vom Initiationscodon; die 3'-Sequenz 5 CCGATCTAGATCAATCCCATACGACGTCCCAGACTACGCTGATGCTCCGCACGCT 3' (SEQ ID NO: 16) enthält komplementäre Sequenzen zu der XbaI-Stelle, dem Translations-Stoppcodon, HA-Marker und der EDG-1-ähnliche Polypeptid-codierende Sequenz (ohne das Stopp-Codon). Daher enthält das PCR-Produkt eine BamHI-Stelle, eine EDG-1-ähnliche Polypeptid-Codierungssequenz, gefolgt von dem im Leserahmen fusionierten HA-Marker, einem Translations-Terminations-Stoppcodon neben dem HA-Marker und einer XbaI-Stelle. Das durch PCR amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor, pcDNAI/Amp, wurden mit BamHI- und XbaI-Restriktionsenzymen gespalten und ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in den E. coli-Stamm SURF (erhältlich vom Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torreg Pines Road, La Jolla, KA 92037) transformiert und die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten ausplattiert und resistente Kolonien wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit des richtigen Fragments überprüft. Zur Expression des rekombinanten EDG-1-ähnlichen Polypeptids wurden COS-Zellen mit dem Expressionsvektor durch das DEAE-DEXTRA-Verfahren transfiziert (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Die Expression des EDG-1-ähnlichen Polypeptid-HA-Proteins wurde durch radioaktive Markierung und ein Immunpräzipitationsverfahren (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)) nachgewiesen. Zellen wurden zwei Tage nach der Transfektion für 8 Stunden mit ³⁵S-Cystein markiert. Kulturmedium wurde dann gesammelt und die Zellen wurden mit Detergens (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH-Wert 7,5) lysiert (Wilson, I. et al., ebenda, 37: 767 (1984)): Sowohl Zelllysat als auch Kulturmedien wurden mit einem HA-spezifischen monoclonalen Antikörper ausgefällt. Ausgefällte Proteine wurden auf 15% SDS-PAGE-Gelen analysiert.
Beispiel 8
Expression über Gentherapie
Fibroblasten wurden aus einem Individuum durch Hautbiopsie erhalten. Das daraus resultierende Gewebe wird in Gewebekulturmedium gelegt und in kleine Stücke zerteilt. Kleine Gewebebrocken werden auf eine nasse Oberfläche einer Gewebekulturflasche gelegt, ungefähr 10 Stücke werden in jede Flasche gelegt. Die Flasche wird dann umgedreht, fest geschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Flasche umgedreht und die Gewebebrocken bleiben am Boden der Flasche kleben und frisches Medium (z.B. Ham-F12-Medium mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin) wird hinzugefügt. Das Ganze wird dann bei 37°C für ungefähr eine Woche inkubiert. Dann wird frisches Medium hinzugefügt und anschließend alle paar Tage gewechselt. Nach weiteren zwei Wochen in Kultur taucht eine Einzelzellschicht aus Fibroblasten auf. Die Einzelzellschicht wird mit Trypsin behandelt und in größere Flaschen abgemessen.
pMV-7 (Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219–25 (1988), flankiert durch die langen terminalen Wiederholungen des Moloney-Sarcomvirus der Maus, wird mit EcoRI und HindIII gespalten und anschließend mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt. Der lineare Vektor wird auf einem Agarosegel fraktioniert und unter Verwendung von Glasperlen gereinigt.
Die cDNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die den 5' bzw. 3'-Endsequenzen entsprechen. Der 5'-Primer enthält eine EcoRI-Stelle und der 3'-Primer enthält ferner eine HindIII-Stelle. Gleiche Mengen an linearem Rückgrat des Moloney-Sarcomvirus der Maus und der amplifizierten EcoRI- und HindIII-Fragmente werden, in der Anwesenheit von T4-DNA-Ligase zusammengefügt. Das daraus resultierende Gemisch wird unter Bedingungen erhalten, die für die Ligierung von zwei Fragmenten geeignet sind. Das Ligierungsgemisch wird verwendet, um HB101-Bakterien zu transformieren, die dann zum Zweck der Bestätigung, dass der Vektor das Gen von Interesse richtig inseriert hat, auf Kanamycin enthaltenden Agar ausplattiert werden.
Die amphotrophen pA317- oder GP+am12-Verpackungszellen werden in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Kälberserum (CS), Penicillin und Streptomycin in Gewebekultur bis zu einer konfluenten Dichte gezüchtet. Der MSV-Vektor, der das Gen enthält, wird dann zu den Medien hinzugefügt und die Verpackungszellen werden mit dem Vektor transduziert. Die Verpackungszellen produzieren nun infektiöse virale Partikel, welche das Gen enthalten (die Verpackungszellen werden nun als Erzeugerzellen bezeichnet).
Frisches Medium wird zu den transduzierten Erzeugerzellen hinzugefügt und anschließend wird das Medium von einer 10 cm-Platte von konfluenten Erzeugerzellen geerntet. Das verbrauchte Medium, das die infektiösen viralen Partikel enthält, wird durch einen Milipore-Filter gefiltert, um abgelöste Erzeugerzellen zu entfernen, und dieses Medium wird dann verwendet, um Fibroblastenzellen zu infizieren. Medium wird von einer sub-konfluenten Platte mit Fibroblasten entfernt und schnell durch das Medium von den Erzeugerzellen ersetzt. Dieses Medium wird entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Wenn der Virustiter hoch ist, werden fast alle Fibroblasten infiziert sein und eine Selektion wird nicht benötigt. Wenn der Titer sehr niedrig ist, dann ist es notwendig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektierbaren Marker wie zum Beispiel neo oder his aufweist.
Die erzeugten Fibroblasten werden dann, entweder alleine oder nachdem sie bis zur Konfluenz auf Cytodex 3-Mikroträger-Perlen gezüchtet wurden, in den Wirt in injiziert. Die Fibroblasten erzeugen nun das Proteinprodukt.
Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind im Lichte der vorstehenden Lehren möglich und daher innerhalb des Geltungsbereiches der beigefügten Ansprüche. Die Erfindung kann anders ausgeübt werden, als spezifisch beschrieben.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz umfasst, die von der in ATCC-Hinterlegungsnr. 209003 enthaltenen cDNA codiert wird; (b) Polynucleotiden, die die codierende Sequenz der in ATCC-Hinterlegungsnr. 209003 enthaltenen cDNA umfassen; (c) Polynucleotiden, die zu mindestens 90% mit einem wie unter einem der Punkte (a) bis (b) definierten Polynucleotid identisch sind und ein Polypeptid codieren, das G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität aufweist; (d) Polynucleotiden, die zu mindestens 95% mit einem wie unter einem der Punkte (a) bis (b) definierten Polynucleotid identisch sind und ein Polypeptid codieren, das G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität aufweist; und (e) Polynucleotiden, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Fragment eines Polypeptids codiert, das von einem Polynucleotid gemäß einem der Punkte (a) bis (d) codiert wird, wobei das Fragment G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität aufweist; oder der komplementäre Strang eines solchen Polynucleotids; mit der Maßgabe, dass das Polynucleotid nicht die folgende Nucleotidsequenz umfasst: gcaagatgga cgcgggattt ttccgcggaa caagtgcaga acaggataat cggttcagca acaaacagaa gaaactactg aagcagctga aattcgcaga atgcctagaa aaaaaggtgg acatgagcaa agtaaatttg gaggttataa agccttggat aacaaaaaga gtaacgggat gtctttgact gcactgctga aaatactctg ttctatgtga aagagagcac tctgtggtta acttccttaa atgcatgcct gg.
Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuren 1 bis 342 der SEQ ID NO: 2 umfasst; (b) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuren 2 bis 342 der SEQ ID NO: 2 umfasst; (c) Polynucleotiden, die zu mindestens 90% mit einem wie unter einem der Punkte (a) bis (b) definierten Polynucleotid identisch sind und ein Polypeptid codieren, das G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität aufweist; (d) Polynucleotiden, die zu mindestens 95% mit einem wie unter einem der Punkte (a) bis (b) definierten Polynucleotid identisch sind und ein Polypeptid codieren, das G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität aufweist; und (e) Polynucleotiden, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Fragment eines Polypeptids codiert, das von einem Polynucleotid gemäß einem der Punkte (a) bis (d) codiert wird, wobei das Fragment G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität aufweist; oder der komplementäre Strang eines solchen Polynucleotids; mit der Maßgabe, dass das Polynucleotid nicht die folgende Nucleotidsequenz umfasst: gcaagatgga cgcgggattt ttccgcggaa caagtgcaga acaggataat cggttcagca acaaacagaa gaaactactg aagcagctga aatttgcaga atgcctagaa aaaaaggtgg acatgagcaa agtaaatttg gaggttataa agccttggat aacaaaaaga gtaacgggat gtctttgact gcactgctga aaatactctg ttctatgtga aagagagcac tctgtggtta acttccttaa atgcatgcct gg.
Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynucleotid DNA ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynucleotid RNA ist.
Verfahren zur Herstellung eines Vektors, umfassend das Insertieren des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einen Vektor.
Vektor, der das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, die das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Vektor nach Anspruch 6 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität aufweisenden Polypeptids, umfassend die Expression des vom Polynucleotid codierten Polypeptids aus der rekombinanten Wirtszelle nach Anspruch 7.
Polypeptid, das von dem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird oder mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 8 erhältlich ist.
Antikörper gegen das Polypeptid nach Anspruch 9.
Antagonist gegen das Polypeptid nach Anspruch 9, umfassend den Antikörper nach Anspruch 10, ein Antisense-Konstrukt, das spezifisch mit dem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert, oder eine lösliche Form des Polypeptids.
In-vitro-Verfahren für die Diagnose einer Krankheit oder einer Prädisposition für eine Krankheit, die mit einer Unterexpression des Polypeptids nach Anspruch 9 in Zusammenhang steht, umfassend das Bestimmen einer Mutation in einer das Polypeptid codierenden Nucleinsäuresequenz.
Arzneimittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Polypeptid nach Anspruch 9, eine DNA, die das Polypeptid oder den Antagonisten nach Anspruch 11 codiert und zu deren Expression fähig ist, sowie gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Antikörper nach Anspruch 10.
Verfahren zum Screenen von Antagonisten des Polypeptids nach Anspruch 9, umfassend: (a) Expression des Polypeptids auf der Oberfläche einer Zelle; (b) Inkontaktbringen der Zelle mit einem Liganden des Polypeptids und einer zu screenenden Verbindung; und (c) Bestimmen, ob das vom Liganden erzeugte Signal durch die Verbindung gehemmt wird.
Verfahren zum Screenen von Agonisten des Polypeptids nach Anspruch 9, umfassend: (a) Expression des Polypeptids auf der Oberfläche einer Zelle; (b) Inkontaktbringen der Zelle mit einem Liganden des Polypeptids und einer zu screenenden Verbindung; und (c) Bestimmen, ob die Verbindung ein Signal erzeugt.
Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand, von dem nicht bekannt ist, ob er fähig ist, das Polypeptid nach Anspruch 9 zu binden, das Polypeptid binden kann, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Säugerzelle, die das Polypeptid exprimiert, mit einem potenziellen Liganden; (b) Nachweis des Vorhandenseins eines Liganden, der an das Polypeptid bindet; und (c) Bestimmen, ob der Ligand an das Polypeptid nach Anspruch 9 bindet.