ES2289780T3 - Dos receptores acoplados a proteina g humanos: gpcr 2 inducido por ebv (ebi-2) y gpcr de tipo edg-1. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por: (a) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por el cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 209003; (b) polinucleótidos que comprenden la secuencia de codificación del cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 209003; (c) polinucleótidos que son al menos 90% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de los (a) y (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad de receptor acoplado a proteína G; (d) polinucleótidos que son al menos 95% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de los (a) y (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad de receptor acoplado a proteína G; y (e) polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican un fragmento de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los (a) a (d), en los que dicho fragmento tiene actividad de receptor acoplado a proteína G; o la cadena complementaria de tal polinucleótido, con la condición de que dicho polinucleótido no comprenda la siguiente secuencia de nucleótidos:

Description

Dos receptores acoplados a proteína G humanos: GPCR 2 inducido por EBV (EBI-2) y GPCR de tipo EDG-1.

Esta invención se refiere a polinucleótidos identificados recientemente, a polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, al uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como a la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. Más particularmente, el polipéptido de la presente invención es un receptor acoplado a proteína G inducido por EBV humano (EBI-2), al que también se hace referencia a veces aquí como "GBR" o "GPCR" y colectivamente como "GBRs". La invención se refiere también a inhibir la acción de tales polipéptidos.

Se han identificado al menos nueve genes que se activan aparentemente en respuesta a una infección por Virus de Epstein-Barr (EBV). Uno de dos nuevos genes identificados también en tales estudios de infecciones por EBV era una nueva molécula de cADN de tipo GPCR denominada receptor acoplado a proteína G inducido por EBV (EBI)-1.

Adicionalmente, se ha identificado previamente un gen de diferenciación de endotelio (EDG) que se obtuvo de células endoteliales humanas simuladas con PMA. Se han identificado homólogos de rata y oveja de EDG-1, que también son receptores acoplados a proteína G.

Está bien establecido que muchos procesos biológicos significativos médicamente son mediados por proteínas que participan en trayectorias de transducción de señal que implican proteínas G y/o segundos mensajeros, por ejemplo, cAMP (Lefkowitz, Nature, 351:353-354 (1991)). Se hace referencia aquí a estas proteínas como proteínas que participan en trayectorias con proteínas G o proteínas PPG. Algunos ejemplos de estas proteínas incluyen los receptores de GPC, tales como los de agentes adrenérgicos y dopamina (Kobilka, B.K. et al., PNAS, 84:46-50 (1987); Kobilka, B.K. et al., Science, 238:650-656 (1987); Bunzow, J.R. et al., Nature, 336:783-787 (1988)), las propias proteínas G, proteínas efectoras, por ejemplo, fosfolipasa C, adenil ciclasa y fosfodiesterasa, y proteínas impulsoras, por ejemplo, proteína quinasa A y proteína quinasa C (Simon, M.I. et al., Science, 252:802-8 (1991)).

Por ejemplo, en una forma de transducción de señal, el efecto de unión de hormonas es activación de una enzima, adenilato ciclasa, dentro de la célula. La activación de enzimas por hormonas depende de la presencia del nucleótido GTP, y GTP influye también en la unión de hormonas. Una proteína G conecta los receptores de hormonas con adenilato ciclasa. Se ha mostrado que la proteína G intercambia GTP por GDP unido cuando se activa por receptores de hormonas. La forma que lleva GTP se une después a una adenilato ciclasa activada. La hidrólisis de GTP a GDP, catalizada por la propia proteína G, devuelve la proteína G a su forma básica inactiva. Así, la proteína G sirve para un doble papel, como compuesto intermedio que retransmite la señal de receptor a efector, y como reloj que controla la duración de la señal.

La superfamilia de genes de proteínas de membrana de receptores acoplados a proteína G se ha caracterizado por tener siete dominios transmembrana putativos. Se cree que los dominios representan hélices \alpha transmembrana conectadas por lazos extracelulares o citoplásmicos. Una proteína G funcional es un trímero que consiste en una subunidad alfa variable acoplada a subunidades beta y gamma asociadas mucho más estrechamente y constantes. Se ha identificado un amplio intervalo de ligandos (más de veinte) que funcionan a través de GPCRs. En general, la unión de un ligando apropiado a un GPCR conduce a la activación del receptor. Los receptores acoplados a proteína G incluyen un amplio intervalo de receptores activos biológicamente, tales como receptores hormonas, víricos, factores de crecimiento y neurorreceptores. Tal receptor activado inicia el ciclo regulador de la proteína G. Este ciclo consiste en intercambio de GTP por GDP, disociación de las subunidades alfa y beta/gamma, activación de la segunda trayectoria de mensajero por un complejo de GTP y la subunidad alfa de la proteína G y vuelta al estado de reposo por hidrólisis de GTP mediante la actividad de GTP-asa innata de la subunidad alfa de proteína G.

Se han caracterizado receptores acoplados a proteína G por incluir estas siete extensiones hidrófobas conservadas de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, que conectan al menos ocho lazos hidrófilos divergentes. La familia de proteína G de receptores acoplados incluye receptores de dopamina que se unen a fármacos neurolépticos usados para tratar trastornos psicóticos y neurológicos. Otros ejemplos de miembros de esta familia incluyen receptores de calcitonina, adrenérgicos, endotelina, cAMP, adenosina, muscarínicos, acetilcolina, serotonina, histamina, trombina, quinina, hormona estimulante de folículos, opsinas y rodopsinas, de olores, citomegalovirus, etc.

Muchos GPRs tienen residuos de cisteína conservados simples en cada uno de los dos primeros lazos extracelulares que forman enlaces disulfuro que se cree que estabilizan la estructura de proteína funcional. Las 7 regiones transmembrana se denominan TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 y TM7. TM3 también está implicada en transducción de señal.

La fosforilación y lipidación (palmitilación o farnesilación) de residuos de cisteína puede influir en la transducción de señal de algunos GPRs. Muchos GPRs contienen lugares de fosforilación potenciales dentro del tercer lazo citoplásmico y/o el término carboxi. Para varios GPRs, tales como el \beta-adrenorreceptor, la fosforilación por proteína quinasa A y/o quinasas de receptor específicas, media en la desensibilización del receptor.

Se cree que los lugares de unión de ligando de GPRs comprenden un receptáculo hidrófilo formado por varios dominios transmembrana de GPR, cuyo receptáculo está rodeado por residuos hidrófobos de los GPRs. El lado hidrófilo de cada hélice transmembrana de GPR está postulado para mirar hacia dentro y formar el lugar de unión de ligando polar. Se ha implicado a TM3 en varios GPRs por tener un lugar de unión de ligando, tal como incluyendo el residuo de aspartato de TM3. Adicionalmente, las serinas de TM5, una asparagina de TM6 y fenilalaninas o tirosinas de TM6 o TM7 también están implicadas en unión a ligando.

Los GPRs pueden acoplarse intracelularmente por proteínas G heterotrímeras a diversas enzimas intracelulares, canales de iones y transportadores (véase Johnson et al., Endoc., Rev., 10:317-331 (1989)). Diferentes subunidades \alpha de proteína G estimulan preferentemente efectores particulares para modular diversas funciones biológicas en una célula. La fosforilación de residuos citoplásmicos de GPRs se ha identificado como un mecanismo importante para la regulación del acoplamiento de proteína G de algunos GPRs.

Se encuentran receptores acoplados a proteína G en numerosos lugares dentro de un hospedante mamífero, por ejemplo, la dopamina es un neurotransmisor crítico en el sistema nervioso central y es un ligando de receptor acoplado a proteína G.

Según un aspecto de la presente invención, se proporcionan nuevos polipéptidos así como fragmentos y derivados de ellos útiles activos biológicamente y diagnósticamente o terapéuticamente. Los polipéptidos de la presente invención son de origen humano.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aislados, incluyendo mARNs, ADNs, cADNs y ADN genómico, así como análogos antisentido de ellas y fragmentos útiles activos biológicamente y diagnósticamente o terapéuticamente de ellas.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir tales polipéptidos por técnicas recombinantes que comprende cultivas células hospedantes procariotas y/o eucariotas recombinantes, que contienen una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención, en condiciones que promueven la expresión de dicha proteína, y recuperar a continuación dicha proteína.

Según otro aspecto adicional aún de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra tales polipéptidos.

Según otra realización, se proporciona un procedimiento para usar uno o más de los receptores según la invención para examinar antagonistas y/o agonistas del receptor y/o ligandos del receptor.

Según otra realización todavía, tales agonistas pueden usarse para activar el polipéptido de la presente invención para el tratamiento de estados relacionados con la infraexpresión del polipéptido de la presente invención.

Según otro aspecto, tales antagonistas pueden usarse para inhibir el polipéptido de la presente invención para tratar estados asociados con la sobreexpresión del polipéptido de la presente invención.

Según otro aspecto aún de la presente invención como se define en las reivindicaciones, se proporcionan polipéptidos sintéticos de origen no natural, aislados y/o recombinantes que son fragmentos, fragmentos de consenso y/o secuencias que tienen sustituciones de aminoácidos conservadoras, de al menos un dominio transmembrana, de tal modo que los polipéptidos de la presente invención pueden unirse a ligandos, o que pueden modular también, cuantitativa o cualitativamente, unión a ligando del polipéptido de la presente invención.

Según otro aspecto todavía de la presente invención como se define en las reivindicaciones, se proporcionan polipéptidos sintéticos o recombinantes, derivados de ellos de sustitución conservadora, anticuerpos, anticuerpos anti-idiotipo, composiciones y métodos que pueden ser útiles como moduladores potenciales de la función de receptor acoplado a proteína G, uniéndose a ligandos o modulando la unión de ligandos, debido a sus propiedades biológicas esperadas, que pueden usarse en aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas y/o de investigación.

Según otro objeto de la presente invención como se define en las reivindicaciones, se proporcionan polipéptidos sintéticos, aislados o recombinantes, que se diseñan para inhibir o imitar diversos GPRs o fragmentos de ellos, como tipos y subtipos de receptores.

Según otro objeto todavía de la presente invención, se proporciona un ensayo de diagnóstico in vitro para detectar una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad relacionada con una mutación de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención.

Éstos y otros aspectos de la presente invención deben ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.

Los dibujos siguientes son ilustrativos de realizaciones de la invención y no ha de entenderse que limiten el alcance de la invención como se abarca por las reivindicaciones.

La Figura 1 muestra la secuencia de cADN (SEQ ID NO: 1) y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 2) del receptor acoplado a proteína G inducido por EBV de la presente invención. La secuencia de polinucleótido contiene una secuencia de 2.249 nucleótidos que codifica un marco de lectura abierto (ORF) de 342 aminoácidos. En la Figura 1, se usa la abreviatura estándar de una letra para aminoácidos, para ilustrar la secuencia de aminoácidos deducida. La determinación de secuencia se realizó usando un determinador de secuencia de ADN automatizado 373 (Applied Biosystems, Inc.). Se predice que la precisión de la determinación de secuencia es mayor del 97% de precisión.

La Figura 2 es una comparación de secuencias de aminoácidos entre el receptor acoplado a proteína G inducido por EBV (EBI-2) (línea superior, véase SEQ ID NO: 2) y el receptor acoplado a proteína G EBI-1 humano (línea inferior, SEQ ID NO: 17). Se usan las abreviaturas estándares de una letra para representar los residuos de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos ilustradas. El polipéptido de EBI-2 según la invención muestra una identidad de aproximadamente el 25% y una similitud del 49% con la secuencia de aminoácidos del gen de EBV-1 sobre una extensión de aproximadamente 350 aminoácidos.

La Figura 3 muestra, como un ejemplo de referencia, la secuencia de cADN (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente (SEQ ID NO: 4) del receptor acoplado a proteína G de tipo EDG-1 de la presente invención. La secuencia de polinucleótido contiene una secuencia de 1.637 nucleótidos que codifica un ORF de 260 aminoácidos. En la Figura 3, se usa la abreviatura estándar de una letra para aminoácidos, para ilustrar la secuencia de aminoácidos deducida. La determinación de secuencia se realizó usando un determinador de secuencia de ADN automatizado 373 (Applied Biosystems, Inc.). Se predice que la precisión de la determinación de secuencia es mayor del 97% de precisión.

La Figura 4 es una comparación de secuencias de aminoácidos entre el receptor acoplado a proteína G de tipo EDG-1 (línea superior, véase SEQ ID NO: 4) y el receptor acoplado a proteína G huérfano EDG-1 (línea inferior, SEQ ID NO: 18). Se usan las abreviaturas estándares de una letra para representar los residuos de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos ilustradas. El polipéptido de tipo EDG-1 según la invención muestra una identidad de aproximadamente el 54% y una similitud del 73% con la secuencia de aminoácidos del gen de receptor acoplado a proteína G huérfano EDG-1 humano sobre dos regiones que totalizan aproximadamente 120 aminoácidos.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado (polinucleótido) que codifica el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el polipéptido maduro codificado por el cADN del clon depositado como Depósito ATCC Nº 209003 el 28/4/97.

Puede encontrarse un polinucleótido que codifica un polipéptido de EBI-2 de la presente invención en una genoteca de cADN de células endoteliales de la vena umbilical, células de leucocitos neutrófilos y células de corpus colosum. El polinucleótido de esta invención se descubrió en una genoteca de cADN derivada de células endoteliales de la vena umbilical. Como se ha descrito antes, está relacionado estructuralmente con la familia de receptor acoplado a proteína G. Contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 343 residuos de aminoácidos.

La presente solicitud describe además como ejemplo de referencia un ácido nucleico aislado (polinucleótido) que codifica el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 3 (SEQ ID NO: 4) o el polipéptido maduro codificado por el cADN del clon depositado como Depósito ATCC Nº 209004 el 28/4/97.

Puede encontrarse un polinucleótido que codifica un polipéptido de receptor acoplado a proteína G de tipo EDG-1 en una genoteca de cADN de neutrófilos activados, células Raji tratadas con ciclohexamina, el linaje celular de médula ósea RSR;11, células T activadas, amígdalas y células sanguíneas de cordón umbilical positivas en CD34. Los análisis de manchas de Northern indican que el gen de receptor de tipo EDG-1 se expresa principalmente en leucocitos, pero puede observarse también expresión en tejido de placenta, bazo, timo, pulmón y páncreas. El polinucleótido se descubrió en una genoteca de cADN derivado de neutrófilos activados. Como se ha descrito antes, está relacionado estructuralmente con la familia de receptor acoplado a proteína G. Contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 261 residuos de aminoácidos.

Como se ha indicado antes, gran cantidad de la importancia atribuida a moléculas de GPCR tales como las de la invención reivindicada actualmente radica en la diversidad de funciones biológicas en las que participan. Por ejemplo, se piensa que, por liberación de la subunidad alfa, la subunidad beta/gamma puede jugar también un papel funcional en la regulación de transducción de señal activando la trayectoria de transducción de señal de ácido araquidónico mediante la activación de fosfolipasa A_{2}. Además, las moléculas de GPCR y sus proteínas G asociadas se han implicado en el acoplamiento de pigmentos visuales a fosfodiesterasa de cGMP, movimiento de fosfatidil inositol (PI), canales de señales de adenilil ciclasa y otras enzimas de membrana integrales para proteínas transportadoras. Como resultado, se evidente que nuevas moléculas de GPCR pueden probarse útiles en una amplia variedad de aplicaciones farmacéuticas incluyendo investigación y desarrollo. Por ejemplo, exámenes basados en objetivos para pequeñas moléculas y otros factores valiosos farmacológicamente tales pueden basarse en la activación de un GPCR dado. Se ha observado también que péptidos cortos pueden funcionar imitando al GPCR (denominados receptomiméticos). Además, anticuerpos monoclonales producidos contra tales factores pueden probarse útiles como agentes terapéuticos en un cierto número de capacidades. Las aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico potenciales para tal factor pueden incluir diversas presentaciones clínicas tales como enfermedad del corazón, enfermedad mental, cáncer, aterosclerosis, restenosis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y un cierto número de otras.

Por consiguiente, los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, cuyo ADN incluye cADN, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble cadena o de cadena sencilla, y, si es de cadena sencilla, puede ser la cadena de codificación o la cadena no codificante (antisentido). La secuencia de codificación que codifica el polipéptido EBI-2 maduro puede ser idéntica a la secuencia de codificación mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o la del clon depositado o puede ser una secuencia de codificación diferente, cuya secuencia de codificación, como resultado del exceso o degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido maduro que el ADN de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o el cADN depositado.

Los polinucleótidos que codifican el polipéptido EBI-2 maduro de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el polipéptido EBI-2 maduro codificado por el cADN depositado pueden incluir: sólo la secuencia de codificación para el polipéptido maduro; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y una secuencia de codificación adicional tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia de proproteína; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro (y opcionalmente una secuencia de codificación adicional) y una secuencia no codificante, tal como intrones o secuencia no codificante 5' y/o 3' de la secuencia de codificación para el polipéptido maduro.

Así, la expresión "polinucleótdo que codifica un polipéptido" abarca un polinucleótido que que incluye sólo secuencia de codificación para el polipéptido así como un polinucleótido que incluye secuencia de codificación y/o no codificante adicional.

La presente invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos antes que codifican fragmentos, análogos y derivados dentro de los límites de las reivindicaciones del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el polipéptido codificado por el cADN del clon depositado. La variante de alguno de estos dos polinucleótidos puede ser una variante alélica de origen natural del polinucleótido o una variante de origen no natural del polinucleótido.

Así, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro mostrado en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el mismo polipéptido maduro codificado por el cADN del clon depositado así como variantes dentro de los límites de las reivindicaciones de tales polinucleótidos, cuyas variantes codifican un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el polipéptido codificado por el cADN del clon depositado. Tales variantes de nucleótidos incluyen variantes de supresión, variantes de sustitución y adición o variantes de inserción.

Como se ha indicado antes, el polinucleótido puede tener una secuencia de codificación que sea una variante alélica de origen natural de la secuencia de codificación mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o de la secuencia de codificación del clon depositado, siendo dicha variante al menos 30% idéntica a las últimas secuencias. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótido que puede tener una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado.

La presente invención incluye también polinucleótidos, en los que la secuencia de codificación para el polipéptido maduro puede estar fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia de polinucleótido que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido desde una célula hospedante, por ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder dividida por la célula hospedante para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos pueden codificar también una proproteína que es la proteína madura más residuos de aminoácidos 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se divide la prosecuencia, queda una proteína madura aciva. Así, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína madura, o una proteína que tiene una prosecuencia o una proteína que tiene una prosecuencia y una presecuencia (secuencia líder).

Los polinucleótidos de la presente invención pueden tener también la secuencia de codificación fusionada enmarcada a una secuencia marcadora que permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexa-histidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar purificación del polipéptido maduro fusionado a la marcadora en el caso de un hospedante bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) cuando se usa un hospedante mamífero, por ejemplo, células COS-7. La etiqueta de HA corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe (Wilson, I. et al., Cell, 37:767 (1984)).

El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena de polipéptido; incluye regiones precedentes y siguientes a la región de codificación (líder y remolque) así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones).

Pueden usarse fragmentos del gen de longitud completa de la presente invención como sondas de hibridación para un cADN o una genoteca genómica para aislar el ADN de longitud completa y para aislar otros ADNs que tienen una alta similitud de secuencias con el gen o actividad biológica similar. Las sondas de este tipo tienen preferiblemente al menos 10, preferiblemente al menos 15, y aún más preferiblemente al menos 30 bases, y pueden contener, por ejemplo, al menos 50 o más bases. De hecho, pueden utilizarse preferiblemente sondas de este tipo que tienen al menos hasta 150 bases o más. La sonda puede usarse también para identificar un clon de ADN correspondiente a un transcripto de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen completo, incluyendo regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de un examen comprende aislar la región de codificación del gen usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Se usan oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria o idéntica a la secuencia del gen o porción del gen de la presente invención para examinar una genoteca de ADN genómico, a fin de determinar con qué miembros de la genoteca se hibrida la
sonda.

Se aprecia también que tales sondas pueden, y preferiblemente se marcan, con un reactivo detectable analíticamente para facilitar la identificación de la sonda. Los reactivos útiles incluyen, aunque sin limitarse a ellos, radioactividad, colorantes fluorescentes o enzimas capaces de catalizar la formación de un producto detectable. Las sondas son así útiles para aislar copias complementarias de ADN de otras fuentes o para examinar tales fuentes para secuencias relacionadas.

La presente invención se refiere además a polinucleótidos que se hibridan con las secuencias descritas antes si hay al menos 90%, y más preferiblemente al menos 95%, de identidad entre las secuencias. (Como se ha indicado antes, una identidad del 70% incluiría dentro de tal definición un fragmento de 70 pb tomado de un polinucleótido de 100 pb, por ejemplo). La presente invención se refiere particularmente a polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas con los polinucleótidos descritos anteriormente. Según se usa aquí, la expresión "condiciones rigurosas" significa que la hibridación tendrá lugar sólo si hay al menos 95%, y preferiblemente al menos 97%, de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan con los polinucleótidos descritos anteriormente codifican enzimas que retienen sustancialmente la misma función biológica o actividad que el polipéptido maduro codificado por el ADN de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2). Con referencia a identidad en el caso de hibridación, como se conoce en la técnica, tal identidad se refiere a complementariedad de segmentos de polinucleótidos.

El polinucleótido como se describe aquí puede tener al menos 15 bases, preferiblemente al menos 30 bases, y más preferiblemente al menos 50 bases que se hibridan con cualquier parte de un polinucleótido de la presente invención y que tiene una identidad con él, como se ha descrito antes, y que puede o no retener actividad. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden emplearse como sondas para los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1, por ejemplo, para recuperación del polinucleótido o como una sonda de diagnóstico o como un cebador de PCR.

Así, la presente invención se dirige a polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad de GPCR y al menos 90% de identidad y más preferiblemente al menos 95% de identidad con un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2. La presente solicitud describe fragmentos del mismo, cuyos fragmentos tienen al menos 15 bases, preferiblemente al menos 30 bases, más preferiblemente al menos 50 bases y aún más preferiblemente fragmentos que tienen hasta al menos 150 bases o más, cuyos fragmentos son al menos 90% idénticos, preferiblemente al menos 95% idénticos y aún más preferiblemente al menos 97% idénticos a cualquier porción de un polinucleótido de la presente invención.

El(los) depósitos a lo que se hace referencia aquí se mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento internacional de los depósitos de microorganismos con fines de procedimiento de patentes. Estos depósitos se proporcionan simplemente por conveniencia a los expertos en la técnica y no son una entrada que se requiere a un depósito bajo 35 U.S.C. 112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por ellos, se incorporan aquí como referencia y son predominantes en caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias presente. Puede requerirse una autorización para hacer, usar o vender los materiales depositados, y no se garantiza aquí tal autorización.

La presente invención se refiere además a polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), así como fragmentos, análogos y derivados de tales polipéptidos dentro de los límites de las reivindicaciones.

Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se hace referencia al polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el codificado por el cADN depositado, significa un polipéptido que o bien conserva sustancialmente la misma función o actividad biológica de tal polipéptido, es decir, funciona como un receptor acoplado a proteína G, o bien conserva la capacidad para unirse al ligando o al receptor incluso aunque el polipéptido no funcione como un receptor acoplado a proteína G como forma soluble del receptor.

El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferiblemente un polipéptido recombinante.

Dentro de los límites de las reivindicaciones, el fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el codificado por el cADN depositado puede ser: (i) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácidos conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácidos conservado) y tal residuo de aminoácidos puede ser o no uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro, o (v) uno en el que un fragmento del polipéptido es soluble, es decir, no unido a membrana, aunque une todavía ligandos al receptor unido a la membrana. Tales fragmentos, derivados y análogos se cree que están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en forma aislada, y se purifican preferiblemente hasta homogeneidad.

El término "aislado" significa que el material se separa de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y estar aún aislados en tal vector o composición si no es parte de su entorno natural.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido de SEQ ID NO: 2 (en particular el polipéptido maduro) así como polipéptidos que tienen al menos una identidad del 90% con el polipéptido de SEQ ID NO: 2 y aún más preferiblemente una identidad de al menos el 90% con el polipéptido de SEQ ID NO: 2 y, dentro de los límites de las reivindicaciones, incluyen también porciones de tales polipéptidos, conteniendo generalmente tal porción del polipéptido al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.

Como se sabe en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.

Los fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis de péptidos; por tanto, los fragmentos pueden emplearse como compuestos intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

La presente solicitud describe también un método para identificar y/o aislar células, tejidos o clases de células o tejidos, utilizando sondas de los polinucleótidos que codifican polipéptido de receptor acoplado a proteína G EBI-2 o utilizando un anticuerpo específico para el receptor acoplado a proteína G EBI-2, por ejemplo. Puesto que los polipéptidos de receptor acoplado a proteína G EBI-2 según la invención tienen lugar en células endoteliales venosas, células de leucocitos neutrófilos y células de corpus colosum, las sondas o anticuerpos anteriores, por ejemplo, pueden utilizarse para identificar y/o aislar tales células, tejidos o clases de células o tejidos.

La presente invención se refiere también a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, células hospedantes que se proyectan genéticamente con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.

Las células hospedantes se proyectan genéticamente (se transducen o transforman o transfectan) con los vectores de esta invención, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula vírica, un fago, etc. Las células hospedantes proyectadas pueden cultivarse en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o multiplicar los genes de receptor acoplado a proteína G. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula hospedante seleccionada para expresión, y serán evidentes para un técnico de experiencia ordinaria.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. Así, por ejemplo, el polinucleótido puede incluirse en uno cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN vírico tal como vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabias. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector en tanto en cuanto sea replicable y viable en el hospedante.

La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un(unos) lugar(es) de endonucleasa de restricción apropiada por procedimientos conocidos en la técnica. Se cree que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la técnica.

La secuencia de ADN en el vector de expresión se enlaza operativamente a una(s) secuencia(s) de control de expresión apropiada(s) (promotor) para dirigir la síntesis de mARN. Como ejemplos representativos de tales promotores, pueden mencionarse: promotor de LTR o SV40, el lac o trp de E. coli, el promotor de fago lambda P_{L} y otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión contiene también un lugar de unión de ribosoma para iniciar la traducción y un terminador de transcripción. El vector puede incluir también secuencias apropiadas para multiplicar expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes de marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para selección de células hospedantes transformadas tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se ha descrito anteriormente, así como un promotor o secuencia de control apropiados, pueden emplearse para transformar un hospedante apropiado a fin de permitir al hospedante expresar la proteína.

Como ejemplos representativos de hospedantes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células de hongos, tales como levadura; células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células de plantas, etc. Se cree que la selección de un hospedante apropiado está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.

Más particularmente, la presente invención incluye también construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias como se ha descrito antes ampliamente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un vector plásmido o vírico, en el que se ha insertado una secuencia de la invención, en orientación de avance o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, enlazado operativamente a la secuencia. Se conoce por los expertos en la técnica un gran número de vectores y promotores adecuados, y están disponibles comercialmente. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). No obstante, puede usarse cualquier otro plásmido o vector en tanto en cuanto sea replicable y viable en el hospedante.

Pueden seleccionarse regiones de promotor de cualquier gen deseado usando vectores de CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son PKK232-8 y PCM7. Los promotores bacterianos nombrados particulares incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp. Los promotores eucariotas incluyen CMV inmediato temprano, HSV timidina quinasa, SV temprano y tardío, LTRs de retrovirus y metalotienina-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está bien dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a células hospedantes que contienen las construcciones descritas antes. La célula hospedante puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedante puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedante puede efectuarse por transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, L., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).

Las construcciones en células hospedantes pueden usarse de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden producirse sintéticamente por sintetizadores de péptidos convencionales.

Pueden expresarse proteínas maduras en células de mamíferos, células de levadura, bacterias u otras bajo el control de promotores apropiados. Pueden emplearse también sistemas de traducción exentos de células para producir tales proteínas usando ARNs derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados de uso con hospedantes procariotas y eucariotas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), cuya descripción se incorpora aquí como referencia.

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores aumenta insertando una secuencia de aumentador en el vector. Los aumentadores son elementos de ADN que actúan cis, usualmente de alrededor de 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el aumentador de SV40 en el lado tardío de 100 a 270 pb del origen de replicación, un aumentador de promotor temprano de citomegalovirus, el aumentador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y aumentadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedante, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo. Tales promotores pueden derivarse de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre otros. La secuencia estructural heteróloga se monta en fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de la traducción y, preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de proteína traducida en el espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación N-terminal que imparta características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada de producto recombinante expresado.

Se construyen vectores de expresión útiles para uso bacteriano insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de iniciación y terminación de la traducción adecuadas en fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si es deseable, proporcionar multiplicación dentro del hospedante. Los hospedantes procariotas adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Strptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otras como materia de elección.

Como ejemplo representativo pero no limitativo, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del muy conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones de "cadena principal" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar.

Tras la transformación de una cepa hospedante adecuada y el crecimiento de la cepa hospedante hasta una densidad de células apropiada, se induce el promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y se cultivan las células durante un período adicional.

Las células se cosechan típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y se retiene el extracto crudo resultante para purificación adicional.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica o el uso de agentes de lisado de células, tales métodos son muy conocidos por los expertos en la técnica.

Pueden emplearse también diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen los linajes COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritos por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otros linajes celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, los linajes celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y un aumentador, y también cualesquiera lugares de unión de ribosomas necesarios, lugar de poliadenilación, donante de empalme y lugares aceptores, secuencias de terminación de transcripción y secuencias no transcritas flanqueantes 5'. Las secuencias de ADN derivadas del empalme de SV40 y lugares de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

Los polipéptidos de receptor acoplado a proteína G pueden recuperarse y purificarse de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Pueden usarse etapas de repliegue de proteína, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) para etapas de purificación finales.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado naturalmente, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producirse por técnicas recombinantes a partir de un hospedante procariota o eucariota (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y mamíferos en cultivo). Dependiendo del hospedante empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Los polipéptidos de la invención pueden incluir también un residuo de aminoácido metionina inicial.

El receptor acoplado a proteína G de la presente invención puede emplearse en un procedimiento para examinar antagonistas y/o agonistas del receptor.

En general, tales procedimientos de examen implican proporcionar células apropiadas que expresan el receptor sobre su superficie. En particular, se emplea un polinucleótido que codifica el receptor de la presente invención para transfectar células para expresar por ello el receptor acoplado a proteína G. Tal transfección puede conseguirse por procedimientos como se ha descrito anteriormente.

Un procedimiento de examen tal implica el uso de melanóforos que se transfectan para expresar el receptor acoplado a proteína G de la presente invención. Tal técnica de examen se describe en el documento PCT WO 92/01810 publicado el 6 de Febrero de 1992.

Así, por ejemplo, tal ensayo puede emplearse para examinar un antagonista de receptor poniendo en contacto las células de melanóforo que codifican el receptor acoplado a proteína G con el ligando de receptor y un compuesto a examinar. La inhibición de la señal generada por el ligando indica que un compuesto es antagonista potencial del receptor, es decir, inhibe la activación del receptor.

El examen puede emplearse para determinar un agonista poniendo en contacto tales células con compuestos a examinar y determinando si tal compuesto genera una señal, es decir, activa el receptor.

Otras técnicas de examen incluyen el uso de células que expresan el receptor acoplado a proteína G (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema que mide los cambios del pH extracelular causados por activación del receptor, por ejemplo, como se describe en Science, volumen 246, páginas 181-296 (Octubre de 1989). Por ejemplo, pueden ponerse en contacto agonistas o antagonistas potenciales con una célula que expresa el receptor acoplado a proteína G y puede medirse una segunda respuesta de mensajero, por ejemplo, transducción de señal o cambios de pH, para determinar si el agonista o antagonista potencial es eficaz.

Otra técnica de examen así implica introducir ARN que codifica el receptor acoplado a proteína G en oocitos xenopus para expresar transitoriamente el receptor. Los oocitos del receptor pueden ponerse después en contacto en el caso de examen de antagonista con el ligando del receptor y un compuesto a examinar, seguido por detección de inhibición de una señal de calcio.

Otra técnica de examen implica expresar el receptor acoplado a proteína G en la que el receptor está enlazado a una fosfolipasa C o D. Como ejemplos representativos de tales células, pueden mencionarse células endoteliales, células de músculos lisos, células de riñón embrionarias, etc. El examen de un antagonista o agonista puede conseguirse como se ha descrito antes detectando la activación del receptor o la inhibición de la activación del receptor a partir de la segunda señal de fosfolipasa.

Otro método implica examinar antagonistas determinando la inhibición de unión de ligando marcado a células que tienen el receptor en su superficie. Tal método implica transfectar una célula eucariota con ADN que codifica el receptor acoplado a proteína G de tal modo que la célula exprese el receptor en su superficie, y poner en contacto la célula con un antagonista potencial en presencia de una forma marcada de un ligando conocido. El ligando puede estar marcado, por ejemplo, mediante radioactividad. Se mide la cantidad de ligando marcado unido a los receptores, por ejemplo, midiendo la radioactividad de los receptores. Si el antagonista potencial se une al receptor como se determina por una reducción de ligando marcado que se une a los receptores, se inhibe la unión de ligando marcado al receptor.

La presente invención proporciona también un método para determinar si un ligando del que no se sabe que sea capaz de unirse a un receptor acoplado a proteína G puede unirse a tal receptor, que comprende poner en contacto una célula de mamífero que expresa receptor acoplado a proteína G con el ligando en condiciones que permitan la unión de ligandos al receptor acoplado a proteína G, detectar la presencia de un ligando que se una al receptor y determinar por ello si el ligando se une al receptor acoplado a proteína G. Los sistemas descritos anteriormente para determinar agonistas y/o antagonistas pueden emplearse para determinar ligandos que se unen al receptor.

En general, los antagonistas para receptores acoplados a proteína G que se determinan por procedimientos de examen pueden emplearse para una variedad de propósitos terapéuticos. Por ejemplo, tales antagonistas se han empleado para tratamiento de hipertensión, angina de pecho, infarto de miocardio, úlceras, asma, alergias, psicosis, depresión, jaqueca, vómitos, apoplejía, trastornos de alimentación, dolores de cabeza por jaqueca, cáncer e hipertrofia prostática benigna.

Los agonistas para receptores acoplados a proteína G también son útiles para fines terapéuticos, tales como el tratamiento de asma, enfermedad de Parkinson, fallo cardíaco agudo, hipotensión, retención urinaria y osteoporosis.

Los ejemplos de antagonistas de receptor acoplado a proteína G incluyen un anticuerpo o, en algunos casos, un oligonucleótido, que se une al receptor acoplado a proteína G pero no obtiene una segunda respuesta de mensajero de tal modo que se impide la actividad del receptor acoplado a proteína G. Los anticuerpos incluyen anticuerpos anti-idiotípicos que reconocen determinantes únicos asociados generalmente con el lugar de unión a antígeno de un anticuerpo. Los antagonistas potenciales incluyen también proteínas que están estrechamente relacionadas con el ligando del receptor acoplado a proteína G, es decir, un fragmento del ligando, que ha perdido función biológica y, cuando se une al receptor acoplado a proteína G, no obtiene respuesta.

Un antagonista potencial incluye también una construcción antisentido preparada mediante el uso de tecnología antisentido. Puede usarse tecnología antisentido para controlar expresión génica mediante formación de triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos de cuyos métodos se basan en unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica los polipéptidos maduros de la presente invención, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para ser complementario con una región del gen implicado en transcripción (triple hélice- véase Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991)), impidiendo por ello la transcripción y la producción de receptor acoplado a proteína G. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida con el mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mARN en el receptor acoplado a proteína G (antisentido- Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Los oligonucleótidos descritos antes también pueden entregarse a células de tal modo que el ARN o ADN antisentido pueda expresarse in vivo para inhibir la producción de receptor acoplado a proteína G.

Otro antagonista potencial es una pequeña molécula que se une al receptor acoplado a proteína G, haciéndole inaccesible a ligandos, de tal modo que se impide la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, aunque sin limitarse a ellos, moléculas de péptidos o de tipo péptido pequeñas.

Los antagonistas potenciales incluyen también una forma soluble de un receptor acoplado a proteína G, por ejemplo, un fragmento del receptor, que se une al ligando e impide al ligando interactuar con receptores acoplados a proteína G unidos a membrana.

El receptor acoplado a proteína G y antagonistas o agonistas pueden emplearse en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Tales composiciones comprenden una cantidad eficaz terapéuticamente del polipéptido, y un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente. Tal vehículo incluye, aunque sin limitarse a ellos, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de ellos. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

La descripción proporciona también un paquete o juego farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Puede asociarse con tal(es) recipiente(s) un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, cuyo aviso refleje la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana. Además, las composiciones farmacéuticas pueden emplearse conjuntamente con otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de manera conveniente tal como mediante vías tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que sea eficaz para tratamiento y/o profilaxis de la indicación específica. En general, las composiciones farmacéuticas se administrarán en una cantidad de al menos aproximadamente 10 g/kg de peso corporal y en muchos casos se administrarán en una cantidad no superior a aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día. En muchos casos, la dosificación es de alrededor de 10 g/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal diariamente, teniendo en cuenta las vías de administración, síntomas, etc.

Los polipéptidos de receptor acoplado a proteína G y los antagonistas o agonistas que sean polipéptidos pueden emplearse según la presente invención por expresión de tales polipéptidos in vivo, a lo que se hace referencia a menudo como "terapia génica".

Así, por ejemplo, pueden proyectarse células de un paciente con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un polipéptido ex vivo, proporcionándose las células proyectadas a un paciente a tratar con el polipéptido. Tales métodos son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden proyectarse células por procedimientos conocidos en la técnica mediante el uso de una partícula retrovírica que contenga ARN que codifica un polipéptido de la presente invención.

De modo similar, pueden proyectarse células in vivo para expresión de un polipéptido in vivo mediante, por ejemplo, procedimientos conocidos en la técnica. Como se sabe en la técnica, puede administrarse a un paciente una célula productora para producir una partícula retrovírica que contenga ARN que codifique el polipéptido de la presente invención, para proyectar células in vivo y expresar el polipéptido in vivo. Éstos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención mediante tal método deben ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para proyectar células puede ser distinto de un retrovirus, por ejemplo, un adenovirus que puede usarse para proyectar células in vivo tras combinación con un vehículo de entrega adecuado.

Los retrovirus de los que pueden derivarse los vectores plásmidos retrovíricos mencionados anteriormente incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el virus de leucemia de ratón de Moloney, el virus de necrosis de bazo, retrovirus tales como virus de sarcoma de Rous, virus de sarcoma de Harvey, virus de leucosis aviar, virus de leucemia de mono gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus de sarcoma mieloproliferativo y virus de tumor de mama. En una realización, el vector plásmido retrovírico se deriva de virus de leucemia de ratón de Moloney.

El vector incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el LTR retrovírico, el promotor de SV40, y el promotor de citomegalovirus (CMV) humano descrito en Miller et al., Biotechniques, Vol. 7, Nº 9, 980-990 (1989) o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucariotas incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, los promotores de histona, pol III y \beta-actina). Otros promotores víricos que pueden emplearse incluyen, aunque sin limitarse a ellos, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK) y promotores de parvovurus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas aquí.

La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, aunque sin limitarse a ellos, promotores adenovíricos, tales como el promotor tardío principal adenovírico, o promotores heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de metalotienina; promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor de ApoAI; promotores de globina humana; promotores de timidina quinasa vírica, tales como el promotor de timidina quinasa de Herpes Simplex; LTRs retrovíricos (incluyendo los LTRs retrovíricos modificados descritos anteriormente); el promotor de \beta-actina; y promotores de hormona del crecimiento humano. El promotor también puede ser el promotor nativo que controla el gen que codifica el polipéptido.

El vector plásmido retrovírico se emplea para transducir linajes celulares de empaquetado para formar linajes celulares productores. Los ejemplos de células de empaquetado que pueden transfectarse incluyen, aunque sin limitarse a ellas, PE501, PA317, \Psi-2, \Psi-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, \PsiCRE, \PsiCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 y linajes celulares de ADN como se describe en Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, págs. 5-14 (1990), que se incorpora aquí como referencia en su integridad. El vector puede transducir las células de empaquetado mediante cualquier medio conocido en la técnica. Tales medios incluyen, aunque sin limitarse a ellos, electroporación, el uso de liposomas y precipitación con CaPO_{4}. En una alternativa, el vector plásmido retrovírico puede encapsularse en un liposoma, o acoplarse a un lípido, y administrarse después a un hospedante.

El linaje celular productor genera partículas de vector retrovírico infecciosas que incluyen la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. Tales partículas de vector retrovírico pueden emplearse después para transducir células eucariotas, in vitro o in vivo. Las células eucariotas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Las células eucariotas que pueden transducirse incluyen, aunque sin limitarse a ellas, células estaminales embriónicas, células de carcinoma embriónico, así como células estaminales hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales.

Los receptores acoplados a proteína G son ubicuos en el hospedante mamífero y son responsables de muchas funciones biológicas, incluyendo muchas patologías. Por consiguiente, es deseable encontrar compuestos que estimulen un receptor acoplado a proteína G y compuestos que antagonicen con un receptor acoplado a proteína G.

Esta invención proporciona además un método para identificar compuestos que interactúan específicamente con, y se unen a, los receptores acoplados a proteína G en la superficie de una célula, que comprende poner en contacto una célula de mamífero que comprende una molécula de ADN aislado que codifica el receptor acoplado a proteína G con una pluralidad de compuestos, determinar aquellos que se unen a la célula de mamífero, e identificar por ello compuestos que interactúan específicamente con, y se unen a, un receptor acoplado a proteína G humano de la presente invención.

Esta descripción proporciona un método para detectar expresión del receptor acoplado a proteína G en la superficie de una célula detectando la presencia de mARN que codifica un receptor acoplado a proteína G, que comprende obtener mARN total de la célula y poner en contacto el mARN obtenido así con una sonda de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos capaz de hibridarse específicamente con una secuencia incluida dentro de la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor acoplado a proteína G humano en condiciones de hibridación, detectar la presencia de mARN hibridado con la sonda y detectar por ello la expresión por la célula del receptor acoplado a proteína G.

Esta invención también está relacionada con el uso del gen de receptor acoplado a proteína G como parte de un ensayo de diagnóstico para detectar enfermedades o susceptibilidad a enfermedades relacionadas con la presencia de genes de receptor acoplado a proteína G mutados. Se hace referencia a tales enfermedades como transformación de células, tales como tumores y cánceres.

Pueden detectarse individuos que llevan mutaciones en el gen de receptor acoplado a proteína G humano en el nivel de ADN por una variedad de técnicas. Pueden obtenerse ácidos nucleicos para diagnosis de células de un paciente, tal como de sangre, orina, saliva, biopsia de tejidos y material de autopsia. El ADN genómico puede usarse directamente para detección o puede multiplicarse enzimáticamente usando PCR (Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1980)) antes de análisis. Puede usarse también con el mismo fin ARN o cADN. Como ejemplo, pueden usarse cebadores de PCR complementarios del ácido nucleico que codifica la proteína de receptor acoplado a proteína G para identificar y analizar mutaciones de receptor acoplado a proteína G. Por ejemplo, pueden detectarse supresiones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto multiplicado en comparación con el genotipo normal. Pueden identificarse mutaciones puntuales hibridando ADN multiplicado con ARN de receptor acoplado a proteína G radiomarcado o, alternativamente, secuencias de ADN antisentido de receptor acoplado a proteína G radiomarcado. Pueden distinguirse secuencias emparejadas perfectamente de dúplex mal emparejados por digestión con RNasa A o por diferencias de temperaturas de fusión.

Puede conseguirse el ensayo genético basado en diferencias de secuencias de ADN por detección de la alteración de movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Pueden visualizarse pequeñas supresiones e inserciones de secuencia por electroforesis en gel de alta resolución. Pueden distinguirse fragmentos de ADN de secuencias diferentes en geles de gradiente de formamida desnaturalizantes, en los que se retardan en el gel las movilidades de diferentes fragmentos de ADN en diferentes posiciones según sus temperaturas de fusión o fusión parcial específicas (véase, por ejemplo, Myers et al., Science, 230:1242 (1985)).

Pueden revelarse también cambios de secuencia en localizaciones específicas por ensayos de protección con nucleasa, tales como protección con RNasa y S1 o el método de división química (por ejemplo, Cotton et al., PNAS, USA, 85:4397-4401 (1985)).

Así, puede conseguirse la detección de una secuencia de ADN específica por métodos tales como hibridación, protección con RNasa, división química, determinación de secuencia de ADN directa o el uso de enzimas de restricción (por ejemplo, polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLP)) y manchas de Southern de ADN genómico.

Además de electroforesis en gel y determinación de secuencia de ADN más convencionales, pueden detectarse también mutaciones por análisis in situ.

La presente descripción se refiere también a un ensayo de diagnóstico para detectar niveles alterados de formas solubles de los polipéptidos de receptor de la presente invención en diversos tejidos. Los ensayos usados para detectar niveles de los polipéptidos de receptor soluble en una muestra derivada de un hospedante son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de manchas de Western y preferiblemente como ensayo ELISA.

Un ensayo ELISA comprende inicialmente preparar un anticuerpo específico para antígenos de los polipéptidos de receptor acoplado a proteína G, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además, se prepara un anticuerpo informador contra el anticuerpo monoclonal. Se incorpora al anticuerpo informador un reactivo detectable tal como radioactividad, fluorescencia o, en este ejemplo, una enzima peroxidasa de rábano picante. Se separa ahora una muestra de un hospedante y se incuba en un soporte sólido, por ejemplo, una placa de poliestireno, que se une a las proteínas de la muestra. Se cubren después cualesquiera lugares de unión de proteína libres en la placa incubando con una proteína no específica, tal como albúmina de suero de bovino. A continuación, se incuba el anticuerpo monoclonal en la placa, durante cuyo tiempo los anticuerpos monoclonales se incorporan a cualesquiera proteínas de receptor acoplado a proteína G incorporadas a la placa de poliestireno. Todo anticuerpo monoclonal no unido se separa por lavado con tampón. El anticuerpo informador enlazado a peroxidasa de rábano picante se pone ahora en la placa, produciendo la unión del anticuerpo informador a cualquier anticuerpo monoclonal unido a proteínas de receptor de proteína G. Se separa después por lavado el anticuerpo informador no incorporado. Se añaden después a la placa sustratos de peroxidasa, y la magnitud de color revelado en un período de tiempo dado es una medición de la cantidad de proteínas de receptor acoplado a proteína G presentes en un volumen dado de muestra de paciente cuando se compara frente a una curva estándar.

Las secuencias de la presente invención también son valiosas para identificación de cromosomas. Se fija el objetivo de la secuencia específicamente a, y puede hibridarse con, una localización particular en un cromosoma humano individual. Además, hay una necesidad actual de identificar lugares particulares en el cromosoma. Hay pocos reactivos de marcado de cromosomas basados en datos de secuencias reales (polimorfismos repetidos) para marcar localización cromosómica. La representación de ADNs en cromosomas según la presente invención es una primera etapa importante para correlacionar esas secuencias con genes asociados con enfermedad.

Brevemente, pueden representarse secuencias en cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) a partir del cADN. Se usa el análisis por ordenador de la región no traducida 3' para seleccionar rápidamente cebadores que no se extienden más de un exón en el ADN genómico, complicando así el proceso de multiplicación. Estos cebadores se usan después para examen de PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo aquellos híbridos que contienen el gen humano correspondiente al cebador producirán un fragmento multiplicado.

La representación de PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos cebadores de oligonucleótidos, puede conseguirse la sublocalización con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o agrupamientos de clones genómicos grandes de manera análoga. Otras estrategias de representación que pueden usarse de modo similar para representar en su cromosoma incluyen hibridación in situ, preexamen con cromosomas clasificados por flujo marcados y preselección por hibridación para construir genotecas de cADN específicas para cromosomas.

Puede usarse la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) de un clon de cADN a una extensión cromosómica metafásica para proporcionar una localización cromosómica precisa en una etapa. Esta técnica puede usarse con cADN tan corto como de 50 o 60 bases. Para tener un análisis de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).

Una vez que se ha representado una secuencia en una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con datos de la representación genética. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de la Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre genes y enfermedades que se ha representado en la misma región cromosómica se identifica después mediante análisis de enlaces (co-herencia de genes adyacentes físicamente).

A continuación, es necesario determinar las diferencias en el cADN o secuencia genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en ningún individuo normal, es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad.

Con la resolución actual de las técnicas de representación física y representación genética, un cADN localizado con precisión en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno entre 50 y 500 agentes causantes potenciales. (Esto supone una resolución de representación de 1 megabase y un gen por 20 kb).

Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de ellos, o células que los expresan, pueden usarse como inmunógeno para producir anticuerpos para ellos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención incluye también anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como fragmentos de Fab, o el producto de una genoteca de expresión de Fab. Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipéptidos correspondientes a una secuencia de la presente invención por inyección directa de los polipéptidos a un animal, o administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo obtenido así se unirá después a los propios polipéptidos. De esta manera, puede usarse incluso una secuencia que codifica sólo un fragmento de los polipéptidos para generar anticuerpos que se unan a los polipéptidos nativos totales. Tales anticuerpos pueden usarse después para aislar el polipéptido de tejido que expresa ese polipéptido.

Para preparar anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de linajes celulares continuos. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96).

Pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de los EE.UU. 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla para productos de polipéptidos inmunógenos de esta invención. También pueden usarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para productos de polipéptidos inmunógenos de esta invención.

La presente invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, ha de entenderse que la presente invención no está limitada a tales ejemplos. Todas las partes o cantidades, salvo especificación en contrario, son en peso.

Con el fin de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos, se describirán ciertos métodos y/o términos que aparecen frecuentemente.

"Plásmidos" se designan por una p minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida aquí están disponibles comercialmente, disponbles públicamente en base restringida, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles según procedimientos publicados. Además, se conocen en la técnica plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para el técnico experto ordinariamente.

"Digestión" de ADN se refiere a división catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de restricción usadas aquí están disponibles comercialmente y se usaron sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos como sería conocido por el técnico experto ordinariamente. Con fines analíticos, se usa típicamente 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Con el fin de aislar fragmentos de ADN para construcción de plásmidos, se digieren típicamente de 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Se especifican por el fabricante tampones y cantidades de sustrato apropiados para enzimas de restricción particulares. Se usan ordinariamente tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar según las instrucciones del suministrador. Después de digerir, la reacción se somete a electroforesis directamente en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación por tamaños de los fragmentos divididos se realiza usando un gel de poliacrilamida del 8 por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980).

"Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido de cadena sencilla o dos cadenas de polidesoxinucleótido complementarias que pueden sintetizarse químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5' y no se ligarán así a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no se ha desfosforilado.

"Ligación" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácidos nucleicos de cadena doble (Maniatis, T. et al., Id. pág. 146). Salvo que se proporcione otra cosa, la ligación puede conseguirse usando tampones y condiciones conocidos con 10 unidades a ligasa de ADN T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ligar.

Salvo indicación en contrario, la transformación se realizó como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).

Ejemplo 1 Expresión bacteriana y purificación de EBI-2

La secuencia de ADN que codifica EBI-2, ATCC 209003, se multiplica inicialmente usando cebadores de oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5' de la proteína de EBI-2 tratada (menos la secuencia de péptido señal) y las secuencias de vector 3' para el gen de EBI-2. Los nucleótidos adicionales correspondientes a EBI-2 se añadieron a las secuencias 5' y 3' respectivamente. El cebador de oligonucleótido 5' tiene la secuencia 5' CCGAG
GATCCATGCAAGCCGTCGACAAT 3' (SEQ ID NO: 5), contiene un lugar de enzima de restricción BamHI seguido por 18 nucleótidos de la secuencia de codificación de EBI-2 partiendo del aminoácido terminal supuesto del codón de la proteína tratada. La secuencia 3' 5' CCGAGGATCCTTACATTGGAGTCTCTTC 3' (SEQ ID NO: 6) contiene secuencias complementarias del lugar de BamHI y es seguida por 18 nucleótidos de EBI-2. Los lugares de enzimas de restricción corresponden a los lugares de enzimas de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-60. (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, 91311). El pQE-60 codifica resistencia a antibióticos (Amp'), un origen bacteriano de replicación (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un lugar de unión a ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y lugares de enzimas de restricción. El pQE-60 se digirió después con BamhI. Las secuencias multiplicadas se ligaron en pQE-60 y se insertaron enmarcadas con la secuencia que codifica la etiqueta de histidina y el RBS. La mezcla de ligación se usó después para transformar cepa de E. coli M15/rep 4 (Qiagen, Inc.) por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989). La M15/rep4 contiene copias múltiples del plásmido pREP4, que expresa el represor de lacI y confiere también resistencia a canamicina (Kan'). Se identificaron transformantes por su capacidad para crecer en placas de LB y se seleccionaron colonias resistentes a ampicilina/canamicina. El ADN plásmido se aisló y confirmó por análisis de restricción. Se desarrollaron durante la noche (O/N) clones que contenían las construcciones deseadas en cultivo líquido en medio LB suplementado con Amp (100 \mug/ml) y Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usó para inocular un cultivo grande en una relación de 1:100 a 1:250. Las células se desarrollaron hasta una densidad óptica 600 (O.D.^{600}) entre 0,4 y 0,6. Se añadió después IPTG ("isopropil-B-D-tiogalacto piranósido") hasta una concentración final de 1 mM. El IPTG induce inactivando el represor de lacI, despejando el P/O que conduce a expresión génica aumentada. Las células se desarrollaron de 3 a 4 horas más. Se cosecharon después las células por centrifugación. El glóbulo de células se solubilizó en el agente caotrópico guanidina HCl 6 molar. Tras clarificar, se purificó de esta solución hSca-2 solubilizado por cromatografía en una columna de niquel-quelato en condiciones que permiten una unión estrecha por proteínas que contienen la etiqueta de 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). El hSca-2 (95% de pureza) se eluyó de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5,0 y, con el propósito de renaturalización se ajustó en guanidina HCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutationa 10 mmolar (reducida) y glutationa 2 mmolar (oxidada). Tras incubación en esta solución durante 12 horas, se dializó la proteína a fosfato sódico 10 mmolar.

Ejemplo 2 Clonación y expresión de EBI-2 usando el sistema de expresión de baculovirus

La secuencia de ADN que codifica la proteína de EBI-2 de longitud completa, ATCC 209003, se multiplicó usando cebadores de oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen.

El cebador 5' tiene la secuencia 5' CCGAGGATCCGCCATCATGCAAGCCGTCGACAAT 3' (SEQ ID NO: 7) y contiene un lugar de enzima de restricción BamHI (en negrilla) seguido por 6 necleótidos que parecen una señal eficaz para la iniciación de la traducción en células eucariotas (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950 (1987) que está inmediatamente detrás de los primeros 18 nucleótidos del gen de EBI-2 (el codón de iniciación para la traducción "ATG" está subrayado).

El cebador 3' tiene la secuencia 5' CCGAGGATCCTTACATTGGAGTCTCTTC 3' (SEQ ID NO: 8) y contiene el lugar de división para la endonucleasa de restricción BamHI y 18 nucleótidos complementarios de la secuencia traducida 3' de la parte extracelular de EBI-2. Las secuencias multiplicadas se aislaron en un gel de agarosa del 1% usando un juego disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento se digirió después con las endonucleasas BamHI y se purificó de nuevo en un gel de agarosa del 1%. Este fragmento se denominó F2.

El vector pA2 (modificación del vector pVL941, discutido después) se usa para la expresión de la proteína de EBI-2 usando el sistema de expresión de baculovirus (para tener un análisis véase: Summers, M.D. y Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus and insect cell culture procedures, Texas Agriculural Experimental Station Bulletin No. 1555). Este vector de expresión contiene el promotor de polihedrina fuerte del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido por los lugares de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHI. Se usa el lugar de poliadenilación del virus de los simios (SV) 40 para una poliadenilación eficaz. Para una selección fácil de virus recombinante, se inserta el gen de beta-galactosidasa de E. coli en la misma orientación que el promotor de polihedrina seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Las secuencias de polihedrina están flanqueadas a ambos lados por secuencias víricas para la recombinación homóloga mediada por células de ADN vírico de tipo natural co-transfectado. Podrían usarse muchos otros vectores de baculovirus en lugar de pA2, tales como pRG1 y pA2-GP, en cuyo caso se cambia en consecuencia el cebador 5', y pAc373, pVL941 y pAcIM1 (Luckow, V.A. y Summers, M.D., Virology, 170:31-39).

El plásmido se digirió con la enzima de restricción BamHI y se desfosforiló después usando fosfatasa intestinal de becerro por procedimientos conocidos en la técnica. Se aisló después el ADN en un gel de agarosa del 1% usando el juego disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Este ADN vector se denominó V2.

El fragmento F2 y el plásmido desfosforilado V2 se ligaron con ligasa de ADN T4. Se transformaron después células de E. coli HB101 y se identificaron bacterias que contenían el plásmido (pBacEBI-2) con el gen de EBI-2 usando la enzima BamHI. La secuencia del fragmento clonado se confirmó por determinación de secuencia de ADN.

Se co-transfectaron 5 \mug del plásmido pBacEBI-2 con 1,0 \mug de un baculovirus linealizado disponible comercialmente ("BaculoGold baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA) usando el método de lipofección (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)).

Se mezclaron 1 \mug de ADN de virus BaculoGold y 5 \mug del plásmido pBacEBI-2 en un pocillo estéril de una placa de microtitulación que contenía 50 \mul de medio de Grace exento de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Se añadieron después 10 \mul de lipofectina más 90 \mul de medio de Grace, se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió después gota a gota la mezcla de transfección a las células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. Se sacudió la placa de acá para allá para mezclar la solución recién añadida. Se incubó después la placa durante 5 horas a 27ºC. Después de 5 horas, la solución de transfección se retiró de la placa y se añadió 1 ml de medio de insectos de Grace suplementado con 10% de suero de becerro fetal. Se devolvió la placa a un incubador y se continuó el cultivo a 27ºC durante cuatro días.

Después de cuatro días, se recogió el sobrenadante y se realizó un ensayo en placa similar a como se describe por Summers y Smith (supra). Como modificación, se usó un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Tecjnologes Inc., Gaithersburg) que permite un aislamiento fácil de las placas coloreadas de azul. (Puede encontrarse también una descripción detallada de un "ensayo en placa" en la guía del usuario para cultivo de células de insectos y baculovirología distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).

Cuatro días después de la dilución en serie, se añadió el virus a las células y las placas coloreadas de azul se picaron con la punta de una pipeta Eppendorf. El agar que contenía los virus recombinantes se resuspendió después en un tubo Eppendorf que contenía 200 \mul de medio de Grace. El agar se separó mediante una centrifugación breve y se usó el sobrenadante que contenía el baculovirus recombinante para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días más tarde, se cosecharon los sobrenadantes de estas placas de cultivo y se guardaron después a 4ºC.

Se desarrollaron células Sf9 en medio de Grace suplementado con 10% de FBS inactivado por calor. Se infectaron las células con el baculovirus recombinante V-EBI-2 con una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas más tardes se retiró el medio y se sustituyó con medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). Se añadieron 42 horas más tarde 5 \muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de ^{35}S cisteína (Amersham). Las células se incubaron adicionalmente durante 16 horas antes de cosecharse por centrifugación y las proteínas marcadas se visualizaron por SDS-PAGE y autorradiografía.

Ejemplo 3 Expresión de EBI-2 recombinante en células COS

La expresión de plásmido EBI-2 HA se deriva de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) origen de replicación de SV40, 2) gen de resistencia a ampicilina, 3) origen de replicación de E. coli, 4) promotor de CMV seguido por una región de polienlazador, un intrón de SV40 y lugar de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica el precursor de EBI-2 completo y una etiqueta HA fusionada enmarcada a su extremo 3' se clonó en la región de polienlazador del vector, por tanto, la expresión de proteína recombinante se dirige bajo el promotor de CMV. La etiqueta HA corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe como se ha descrito previamente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly y R. Lemer, 1984, Cell 37:767 (1984)). La infusión de la etiqueta HA en la proteína objetivo permite una detección fácil de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce al epítope de HA.

La estrategia de construcción del plásmido se describe como sigue:

La secuencia de ADN que codifica EBI-2, ATCC 209003, se construyó por PCR usando dos cebadores: el cebador 5' 5' CCGAGGATCCGCCATCATGCAAGCCGTCGACAAT 3' (SEQ ID NO: 9) contiene un lugar de BamHI seguido por la secuencia de codificación de EBI-2 partiendo del codón de iniciación; la secuencia 3' 5' CCGATCTA
GATTAATCCCATACGACGTCCCAGACTACGCTCATTGGAGTCTCTTC 3' (SEQ ID NO: 10) contiene secuencias complementarias del lugar de XbaI, codón de detención de traducción, etiqueta HA y secuencia de codificación de EBI-2 (no incluyendo el codón de detención). Por tanto, el producto de PCR contiene un lugar de BamHI, una secuencia de codificación de EBI-2 seguida por la etiqueta HA fusionada enmarcada, un codón de detención de terminación de la traducción inmediatamente después de la etiqueta HA y un lugar de XbaI. El fragmento de ADN multiplicado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digirieron con enzima de restricción BamHI y XbaI y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en cepa SURE de E. coli (disponible de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se puso en placas con medio de ampicilina y se seleccionaron colonias resistentes. Se aisló ADN plásmido de transformantes y se examinó por análisis de restricción la presencia del fragmento correcto. Para expresión del EBI-2 recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRAN (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína de EBI-2 HA se detectó por el método de radiomarcado e inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)). Se marcaron células durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Se recogió después el medio de cultivo y las células se lisaron con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 1% de NP-40, 0,5% de DOC, Tris 50 mM, pH 7,5 (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)).Se precipitaron el lisado de células y el medio de cultivo con un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizaron en geles del 15% de SDS-PAGE.

Ejemplo 4 Expresión vía terapia génica

Se obtienen fibroblastos de un sujeto por biopsia de piel. El tejido resultante se pone en medio de cultivo de tejidos y se separa en pequeños trozos. Se ponen pedazos pequeños del tejido en una superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejidos, poniéndose en cada matraz aproximadamente diez trozos. Se vuelve el matraz al revés, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, se invierte el matraz y los trozos de tejido permanecen fijados al fondo del matraz y se añade medio reciente (por ejemplo, medio de Ham F12, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina). Se incuba después esto a 37ºC durante aproximadamente una semana. En este momento, se añade medio reciente y se cambia a continuación cada varios días. Después de dos semanas más en cultivo, emerge una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsiniza y se cambia de escala a matraces mayores.

Se digiere con EcoRI y HindIII pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25 (1988)) flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus de sarcoma de ratón de Moloney, y se trata a continuación con fosfatasa intestinal de becerro. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica, usando perlas de vidrio.

El cADN que codifica un polipéptido de la presente invención se multiplica usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias extremas 5' y 3' respectivamente. El cebador 5' que contiene un lugar de EcoRI y el cebador 3' incluye además un lugar de HindIII. Se añaden juntas cantidades iguales de la cadena principal lineal del virus del sarcoma de ratón de Moloney y el fragmento de EcoRI y HindIII multiplicado, en presencia de ligasa de ADN T4. La mezcla resultante se mantiene en condiciones apropiadas para ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se usa para transformar bacterias HB101, que se ponen después en placa en canamicina que contiene agar con el fin de confirmar que el vector tenía el gen de interés insertado apropiadamente.

El pA317 anfotrópico o células de empaquetado GP+am12 se desarrollan en cultivo de tejidos hasta densidad confluente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de becerro (CS), penicilina y estreptomicina. Se añade después al medio el vector MSV que contiene el gen y se transducen las células de empaquetado con el vector. Las células de empaquetado producen ahora partículas víricas infecciosas que contienen el gen (se hace referencia ahora a las células de empaquetado como células productoras).

Se añade medio reciente a las células productoras transducidas y, a continuación, se cosecha el medio desde una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado, que contiene las partículas víricas infecciosas, se filtra a través de un filtro de miliporos para separar células productoras sueltas y se usa después este medio para infectar células de fibroblastos. Se retira el medio de una placa de fibroblastos sub-confluente y se sustituye rápidamente con el medio de las células productoras. Este medio se separa y se sustituye con medio reciente. Si el título del virus es alto, se infectarán virtualmente todos los fibroblastos y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, es necesario usar un vector retrovírico que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his.

Los fibroblastos proyectados se inyectan después en el hospedante, solos o después de haberse desarrollado hasta confluencia en perlas de microvehículo de citodex 3. Los fibroblastos producen ahora el producto proteínico.

Ejemplo 5 Expresión bacteriana y purificación de polipéptido de tipo EDG-1 (Ejemplo de referencia)

La secuencia de ADN que codifica polipéptido de tipo EDG-1, ATCC 209004, se multiplica inicialmente usando cebadores de oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5' de la proteína de polipéptido de tipo EDG-1 elaborada (menos la secuencia de péptido señal) y las secuencias del vector 3' para el gen de polipéptido de tipo EDG-1. Se añadieron nucleótidos adicionales correspondientes a EBI-2 a las secuencias 5' y 3' respectivamente. El cebador de oligonucleótido 5' tiene la secuencia 5' CCGAGGATCCATGAACGCCACGGGGACC 3' (SEQ ID NO: 11), contiene un lugar de enzima de restricción BanHI seguido por 18 nucleótidos del polipéptido de tipo EDG-1 que codifican una secuencia que parte del aminoácido terminal supuesto del codón de proteína elaborado. La secuencia 3' 5' CCGAGGATCCTCAGATGCTCCGCACGCT 3' (SEQ ID NO: 12) contiene secuencias complementarias del lugar de BamHI y es seguida por 18 nucleótidos de polipéptido de tipo EDG-1. Los lugares de enzimas de restricción corresponden a los lugares de enzimas de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-60 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA; 91311). El pQE-60 codifica resistencia a antibiótico (Amp'), un origen bacteriano de replicación (ori), un operador promotor (P/O) regulable por IPTG, un lugar de unión de ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y lugares de enzimas de restricción. Se digirió después el pQE-60 con BamHI. Las secuencias multiplicadas se ligaron en pQE-60 y se insertaron enmarcadas con la secuencia que codifica la etiqueta de histidina y el RBS. Se usó después la mezcla de ligación para transformar cepa M15/rep 4 de E. coli (Qiagen, Inc.) por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989). La M15/rep4 contiene copias múltiples del plásmido pREP4, que expresa el represor de lacI y confiere también resistencia a canamicina (Kan'). Se identifican transformantes por su capacidad para crecer en placas LB y se seleccionaron colonias resistentes a ampicilina/canamicina. Se aisló ADN plásmido y se confirmó por análisis de restricción. Se desarrollaron durante la noche (O/N) clones que contenían las construcciones deseadas en cultivo líquido en medio LB suplementado con Amp (100 \mug/ml) y Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un gran cultivo en una relación de 1:100 a 1:250. Las células se desarrollaron hasta una densidad óptica 600 (O.D.^{600}) entre 0,4 y 0,6. Se añadió después IPTG ("isopropil-B-D-tiogalacto piranósido") hasta una concentración final de 1 mM. El IPTG induce inactivando el represor de lacI, despejando el P/O que conduce a expresión génica aumentada. Las células se desarrollaron de 3 a 4 horas más. Se cosecharon después las células por centrifugación. El glóbulo de células se solubilizó en el agente caotrópico guanidina HCl 6 molar. Tras clarificar, se purificó de esta solución EBI-2 solubilizado por cromatografía en una columna de niquel-quelato en condiciones que permiten una unión estrecha por proteínas que contienen la etiqueta de 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). El EBI-2 (95% de pureza) se eluyó de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5,0 y, con el propósito de renaturalización se ajustó en guanidina HCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutationa 10 mmolar (reducida) y glutationa 2 mmolar (oxidada). Tras incubación en esta solución durante 12 horas, se dializó la proteína a fosfato sódico 10 mmolar.

Ejemplo 6 Clonación y expresión de polipéptido de tipo EDG-1 usando el sistema de expresión de baculovirus (Ejemplo de referencia)

La secuencia de ADN que codifica la proteína de polipéptido de tipo EDG-1 de longitud completa, ATCC 209004, se multiplicó usando cebadores de oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen:

El cabador 5' tiene la secuencia 5' GCGAGGATCCGCCATCATGAACGCCACGGGGACC 3' (SEQ ID NO: 13) y contiene un lugar de enzima de restricción BamHI (en negrilla) seguido por 6 necleótidos que parecen una señal eficaz para la iniciación de la traducción en células eucariotas (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950 (1987) que está inmediatamente detrás de los primeros 18 nucleótidos del gen de polipéptido de tipo EDG-1 (el codón de iniciación para la traducción "ATG" está subrayado).

El cebador 3' tiene la secuencia 5' CCGAGGATCCTCAGATGCTCCGCACGCT 3' (SEQ ID NO: 14) y contiene el lugar de división para la endonucleasa de restricción BamHI y 18 nucleótidos complementarios de la secuencia traducida 3' de la parte extracelular de polipéptido de tipo EDG-1. Las secuencias multiplicadas se aislaron en un gel de agarosa del 1% usando un juego disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento se digirió después con las endonucleasas BamHI y se purificó de nuevo en un gel de agarosa del 1%. Este fragmento se denominó F2.

El vector pA2 (modificación del vector pVL941, discutido después) se usa para la expresión de la proteína de polipéptido de tipo EDG-1 usando el sistema de expresión de baculovirus (para tener un análisis véase: Summers, M.D. y Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus and insect cell culture procedures, Texas Agriculural Experimental Station Bulletin No. 1555). Este vector de expresión contiene el promotor de polihedrina fuerte del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido por los lugares de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHI. Se usa el lugar de poliadenilación del virus de los simios (SV) 40 para una poliadenilación eficaz. Para una selección fácil de virus recombinante, se inserta el gen de beta-galactosidasa de E. coli en la misma orientación que el promotor de polihedrina seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Las secuencias de polihedrina están flanqueadas a ambos lados por secuencias víricas para la recombinación homóloga mediada por células de ADN vírico de tipo natural co-transfectado. Podrían usarse muchos otros vectores de baculovirus en lugar de pA2, tales como pRG1 y pA2-GP, en cuyo caso se cambia en consecuencia el cebador 5', y pAc373, pVL941 y pAcIM1 (Luckow, V.A. y Summers, M.D., Virology, 170:31-39).

El plásmido se digirió con la enzima de restricción BamHI y se desfosforiló después usando fosfatasa intestinal de becerro por procedimientos conocidos en la técnica. Se aisló después el ADN en un gel de agarosa del 1% usando el juego disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Este ADN vector se denomina V2.

El fragmento F2 y el plásmido desfosforilado V2 se ligaron con ligasa de ADN T4. Se transformaron después células de E. coli HB101 y se identificaron bacterias que contenían el plásmido (pBacpolipéptido de tipo EDG-1) con el gen de polipéptido de tipo EDG-1 usando la enzima BamHI. La secuencia del fragmento clonado se confirmó por determinación de secuencia de ADN.

Se co-transfectaron 5 \mug del plásmido pBacpolipéptido de tipo EDG-1 con 1,0 \mug de un baculovirus linealizado disponible comercialmente ("BaculoGold baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA) usando el método de lipofección (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)).

Se mezclaron 1 \mug de ADN de virus BaculoGold y 5 \mug del plásmido pBacpolipéptido de tipo EDG-1 en un pocillo estéril de una placa de microtitulación que contenía 50 \mul de medio de Grace exento de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Se añadieron después 10 \mul de lipofectina más 90 \mul de medio de Grace, se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió después gota a gota la mezcla de transfección a las células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. Se sacudió la placa de acá para allá para mezclar la solución recién añadida. Se incubó después la placa durante 5 horas a 27ºC. Después de 5 horas, la solución de transfección se retiró de la placa y se añadió 1 ml de medio de insectos de Grace suplementado con 10% de suero de becerro fetal. Se devolvió la placa a un incubador y se continuó el cultivo a 27ºC durante cuatro días.

Después de cuatro días, se recogió el sobrenadante y se realizó un ensayo en placa similar a como se describe por Summers y Smith (supra). Como modificación, se usó un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Tecjnologes Inc., Gaithersburg) que permite un aislamiento fácil de las placas coloreadas de azul. (Puede encontrarse también una descripción detallada de un "ensayo en placa" en la guía del usuario para cultivo de células de insectos y baculovirología distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).

Cuatro días después de la dilución en serie, se añadió el virus a las células y las placas coloreadas de azul se picaron con la punta de una pipeta Eppendorf. El agar que contenía los virus recombinantes se resuspendió después en un tubo Eppendorf que contenía 200 \mul de medio de Grace. El agar se separó por una centrifugación breve y se usó el sobrenadante que contenía los baculovirus recombinantes para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días más tarde, se cosecharon los sobrenadantes de estas placas de cultivo y se guardaron después a 4ºC.

Se desarrollaron células Sf9 en medio de Grace suplementado con 10% de FBS inactivado por calor. Se infectaron las células con el baculovirus recombinante V-polipéptido de tipo EDG-1 con una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas más tarde se retiró el medio y se sustituyó con medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). Se añadieron 42 horas más tarde 5 \muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de ^{35}S cisteína (Amersham). Las células se incubaron adicionalmente durante 16 horas antes de cosecharse por centrifugación y las proteínas marcadas se visualizaron por SDS-PAGE y autorradiografía.

Ejemplo 7 Expresión de polipéptido de tipo EDG-1 recombinante en células COS (Ejemplo de referencia)

La expresión de plásmido polipéptido de tipo EDG-1 HA se deriva de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) origen de replicación de SV40, 2) gen de resistencia a ampicilina, 3) origen de replicación de E. coli, 4) promotor de CMV seguido por una región de polienlazador, un intrón de SV40 y lugar de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica el precursor de polipéptido de tipo EDG-1 completo y una etiqueta HA fusionada enmarcada a su extremo 3' se clonó en la región de polienlazador del vector, por tanto, la expresión de proteína recombinante se dirige bajo el promotor de CMV. La etiqueta HA corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe como se ha descrito previamente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly y R. Lemer, 1984, Cell 37:767 (1984)). La infusión de la etiqueta HA en la proteína objetivo permite una detección fácil de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce al epítope de HA.

La estrategia de construcción del plásmido se describe como sigue:

La secuencia de ADN que codifica polipéptido de tipo EDG-1, ATCC 209004, se construyó por PCR usando dos cebadores: el cebador 5' 5' CCGAGGATCCGCCATCATGAAGCCACGGGGACC 3' (SEQ ID NO: 15) contiene un lugar de BamHI seguido por la secuencia de codificación de polipéptido de tipo EDG-1 partiendo del codón de iniciación; la secuencia 3' 5' CCGATCTAGATCAATCCCATACGACGACGTCCCAGACTACGCTGATGTCCGCACGCT 3' (SEQ ID NO: 16) contiene secuencias complementarias del lugar de XbaI, codón de detención de traducción, etiqueta HA y secuencia de codificación de polipéptido de tipo EDG-1 (no incluyendo el codón de detención). Por tanto, el producto de PCR contiene un lugar de BamHI, una secuencia de codificación de polipéptido de tipo EDG-1 seguida por la etiqueta HA fusionada enmarcada, un codón de detención de terminación de la traducción después de la etiqueta HA y un lugar de XbaI. El fragmento de ADN multiplicado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digirieron con enzima de restricción BamHI y XbaI y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en cepa SURE de E. coli (disponible de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se puso en placas con medio de ampicilina y se seleccionaron colonias resistentes. Se aisló ADN plásmido de transformantes y se examinó por análisis de restricción la presencia del fragmento correcto. Para expresión del polipéptido de tipo EDG-1 recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRAN (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína de polipéptido de tipo EDG-1 HA se detectó por el método de radiomarcado e inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)). Se marcaron células durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Se recogió después el medio de cultivo y las células se lisaron con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 1% de NP-40, 0,5% de DOC, Tris 50 mM, pH 7,5 (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)).Se precipitaron el lisado de células y el medio de cultivo con un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizaron en geles del 15% de SDS-PAGE.

Ejemplo 8 Expresión vía terapia génica

Se obtienen fibroblastos de un sujeto por biopsia de piel. El tejido resultante se pone en medio de cultivo de tejidos y se separa en pequeños trozos. Se ponen pedazos pequeños del tejido en una superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejidos, poniéndose en cada matraz aproximadamente diez trozos. Se vuelve el matraz al revés, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, se invierte el matraz y los trozos de tejido permanecen fijados al fondo del matraz y se añade medio reciente (por ejemplo, medio de Ham F12, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina). Se incuba después esto a 37ºC durante aproximadamente una semana. En este momento, se añade medio reciente y se cambia a continuación cada varios días. Después de dos semanas más en cultivo, emerge una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsiniza y se cambia de escala a matraces mayores.

Se digiere con EcoRI y HindIII pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25 (1988)) flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus de sarcoma de ratón de Moloney, y se trata a continuación con fosfatasa intestinal de becerro. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica, usando perlas de vidrio.

El cADN que codifica un polipéptido de la presente invención se multiplica usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias extremas 5' y 3' respectivamente. El cebador 5' que contiene un lugar de EcoRI y el cebador 3' incluye además un lugar de HindIII. Se añaden juntas cantidades iguales de la cadena principal lineal del virus del sarcoma de ratón de Moloney y el fragmento de EcoRI y HindIII multiplicado, en presencia de ligasa de ADN T4. La mezcla resultante se mantiene en condiciones apropiadas para ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se usa para transformar bacterias HB101, que se ponen después en placa en canamicina que contiene agar con el fin de confirmar que el vector tenía el gen de interés insertado apropiadamente.

El pA317 anfotrópico o células de empaquetado GP+am12 se desarrollan en cultivo de tejidos hasta densidad confluente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de becerro (CS), penicilina y estreptomicina. Se añade después al medio el vector MSV que contiene el gen y se transducen las células de empaquetado con el vector. Las células de empaquetado producen ahora partículas víricas infecciosas que contienen el gen (se hace referencia ahora a las células de empaquetado como células productoras).

Se añade medio reciente a las células productoras transducidas y, a continuación, se cosecha el medio desde una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado, que contiene las partículas víricas infecciosas, se filtra a través de un filtro de miliporos para separar células productoras sueltas y se usa después este medio para infectar células de fibroblastos. Se retira el medio de una placa de fibroblastos sub-confluente y se sustituye rápidamente con el medio de las células productoras. Este medio se separa y se sustituye con medio reciente. Si el título del virus es alto, se infectarán virtualmente todos los fibroblastos y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, es necesario usar un vector retrovírico que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his.

Los fibroblastos proyectados se inyectan después en el hospedante, solos o después de haberse desarrollado hasta confluencia en perlas de microvehículo de citodex 3. Los fibroblastos producen ahora el producto proteínico.

Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores y, por tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede practicarse de otro modo que como se ha descrito particularmente.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: HUMAN GENOME SCIENCES, INC., ET AL.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Receptor acoplado a proteína G

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: HUMAN GENOME SCIENCES, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 9410 KEY WEST AVENUE

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: ROCKVIKLLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MARYLAND

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE:UU:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 20850

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: DISDQUETE DE 3,5''

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PS/2

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/09048

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de Mayo de 1998

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/852.824

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de Mayo de 1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: A. ANDERS, BROOKES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.373

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: PF351PCT.LIC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 301-309-8504

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 301-309-8439

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2249 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

100

1

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 342 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1737 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 276 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC ATGCAAGCCG TCGACAAT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC TTACATTGGA GTCTCTTC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC GCCATCATGC AAGCCGTCGA CAAT

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC TTACATTGGA GTCTCTTC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC GCCATCATGC AAGCCGTCGA CAAT

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGATCTAGA TTAATCCCAT ACGACGTCCC AGACTACGCT CATTGGAGTC TCTTC

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC ATGAACGCCA CGGGGACC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC TCAGATGCTC CGCACGCT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGAGGATCC GCCATCATGA ACGCCACGGG GACC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC TCAGATGCTC CGCACGCT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC GCCATCATGA ACGCCACGGG GACC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGATCTAGA TCAATCCCAT ACGACGTCCC AGACTACGCT GATGCTCCGC ACGCT

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 348 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 381 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

Claims (17)

1. Un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por:

(a) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por el cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 209003;

(b) polinucleótidos que comprenden la secuencia de codificación del cADN contenido en el Depósito ATCC Nº 209003;

(c) polinucleótidos que son al menos 90% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de los (a) y (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad de receptor acoplado a proteína G;

(d) polinucleótidos que son al menos 95% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de los (a) y (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad de receptor acoplado a proteína G; y

(e) polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican un fragmento de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los (a) a (d), en los que dicho fragmento tiene actividad de receptor acoplado a proteína G;

o la cadena complementaria de tal polinucleótido,

con la condición de que dicho polinucleótido no comprenda la siguiente secuencia de nucleótidos:

14

2. Un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por:

(a) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 342 de SEQ ID NO: 2;

(b) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende los aminoácidos 2 a 342 de SEQ ID NO: 2;

(c) polinucleótidos que son al menos 90% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de los (a) a (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad de receptor acoplado a proteína G;

(d) polinucleótidos que son al menos 95% idénticos a un polinucleótido como se define en uno cualquiera de los (a) a (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad de receptor acoplado a proteína G; y

(e) polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los (a) a (d), en los que dicho fragmento tiene actividad de receptor acoplado a proteína G;

o la cadena complementaria de tal polinucleótido,

con la condición de que dicho polinucleótido no comprenda la siguiente secuencia de nucleótidos:

15

3. El polinucleótido de las reivindicaciones 1ª o 2ª, que es ADN.

4. El polinucleótido de las reivindicaciones 1ª o 2ª, que es ARN.

5. Un método para fabricar un vector que comprende insertar el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª en un vector.

6. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª.

7. Una célula hospedante recombinante que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª o el vector de la reivindicación 6ª.

8. Un método para producir un polipéptido que tiene actividad de receptor acoplado a proteína G, que comprende expresar desde la célula hospedante recombinante de la reivindicación 7ª el polipéptido codificado por dicho polinucleótido.

9. Un polipéptido codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª u obtenible por el método de la reivindicación 8ª.

10. Un anticuerpo contra el polipéptido de la reivindicación 9ª.

11. Un antagonista contra el polipéptido de la reivindicación 9ª, que comprende el anticuerpo de la reivindicación 10ª, una construcción antisentido que se hibrida específicamente con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª o una forma soluble de dicho polipéptido.

12. Un procedimiento in vitro para diagnosticar una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad relacionada con una infraexpresión del polipéptido de la reivindicación 9ª, que comprende: determinar una mutación en una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido.

13. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, el polipéptido de la reivindicación 9ª, un ADN que codifica y es capaz de expresar dicho polipéptido o el antagonista de la reivindicación 11ª, y opcionalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente.

14. Una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª o el anticuerpo de la reivindicación 10ª.

15. Un procedimiento para examinar antagonistas para el polipéptido de la reivindicación 9ª, que comprende:

(a) expresar dicho polipéptido en la superficie de una célula;

(b) poner en contacto la célula con un ligando de dicho polipéptido y un compuesto a examinar; y

(c) determinar si la señal generada por el ligando es inhibida por dicho compuesto.

16. Un procedimiento para examinar agonistas para el polipéptido de la reivindicación 9ª, que comprende:

(a) expresar dicho polipéptido en la superficie de una célula;

(b) poner en contacto la célula con un ligando de dicho polipéptido y un compuesto a examinar; y

(c) determinar si el compuesto genera una señal.

17. Un procedimiento para determinar si un ligando del que no se sabe que sea capaz de unirse al polipéptido de la reivindicación 9ª puede unirse a dicho polipéptido que comprende:

(a) poner en contacto una célula de mamífero que expresa dicho polipéptido con un ligando potencial;

(b) detectar la presencia de un ligando que se une a dicho polipéptido; y

(c) determinar si el ligando se une al polipéptido de la reivindicación 9ª.