DE69933688T2 - G-protein-gekoppelter rezeptoren, die holomog zu ebv-induzierter gpcr (ebi-2) sind, verfahren zur identifizierung von ihren entsprechenden liganden - Google Patents

Description

• GEBIET DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft einen neu identifizierten Rezeptor, der der Überfamilie der G-proteingekoppelten Rezeptoren angehört. Die Erfindung betrifft ebenso Polynucleotide, die für den Rezeptor kodieren. Die Erfindung betrifft weiters Verfahren, die die Rezeptor-Polypeptide und -Polynucleotide als Ziel für Diagnose und Behandlung in rezeptorvermittelten Erkrankungen verwenden. Die Erfindung betrifft weiters Wirkstoffscreening-Verfahren, die die Rezeptor-Polypeptide und -Polynucleotide verwenden, um Agonisten und Antagonisten für Diagnose und Behandlung zu identifizieren. Weiters umfasst die Erfindung Agonisten und Antagonisten auf Basis der Rezeptor-Polypeptide und -Polynucleotide. Die Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Herstellung der Rezeptor-Polypeptide und -Polynucleotide.
• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• G-Proteincekoppelte Rezeptoren
• G-Proteingekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine wichtige Klasse an Proteinen dar, die für die Signalübertragung innerhalb einer Zelle verantwortlich sind. GPCRs besitzen drei strukturelle Domänen: eine aminoterminale extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne, die sieben Transmembransegmente, drei extrazelluläre Schleifen und drei intrazelluläre Schleifen enthält, und eine carboxyterminale intrazelluläre Domäne. Nach der Bindung eines Liganden an einen extrazellulären Teil eines GPCR wird ein Signal innerhalb der Zelle übertragen, das zu einer Veränderung einer biologischen oder physiologischen Eigenschaft der Zelle führt. Zusammen mit G-Proteinen und Effektoren (intrazelluläre Enzyme und Kanäle, die von G-Proteinen moduliert werden) sind GPCRs die Komponenten eines modularen Signalsystems, das den Zustand von intrazellulären zweiten Messengern mit extrazellulären Inputs verbindet.
• GPCR-Gene und -Genprodukte sind potentielle Verursacher von Erkrankungen (Spiegel et al., J. Clin. Invest. 92, 1119-1125 (1993); McKusick et al., J. Med. Genet. 30, 1-26 (1993)). Von spezifischen Defekten im Rhodopsin-Gen und im V2-Vasopressin-Rezeptor-Gen ist bekannt, dass sie verschiedene Formen an Retinitis pigmentosa (Nathans et al., Annu. Rev. Genet. 26, 403-424 (1992)) und nephrogenem Diabetes insipidus (Holtzman et al., Hum. Mol. Genet. 2, 1201-1204 (1993)) auslösen. Diese Rezeptoren sind von entscheidender Bedeutung sowohl für das Zentralnervensystem als auch für periphere physiologische Prozesse. Evolutionsanalysen deuten darauf hin, dass der Vorfahre dieser Proteine ursprünglich gemeinsam mit komplexen Körperplänen und Nervensystemen entwickelt wurde.
• Die GPCR-Protein-Überfamilie kann in fünf Familien unterteilt werden: Familie I, Rezeptoren, die durch Rhodopsin und den β2-adrenergischen Rezeptor typisiert sind und im Moment über 200 einzigartige Mitglieder umfassen (Dohlman et al., Annu. Rev. Biochem. 60, 653-688 (1991)); Familie II, die Nebenschilddrüsenhormon-/Calcitonin-/Secretin-Rezeptor-Familie (Juppner et al., Science 254, 1024-1026 (1991); Lin et al., Science 254, 1022-1024 (1991)); Familie III, die metabotrope Glutamatrezeptor-Familie (Nakanishi, Science 258, 597-603 (1992)); Familie IV, die cAMP-Rezeptor-Familie, wichtig für die Chemotaxis und die Entwicklung von D. discoideum (Klein et al., Science 241, 1467-1472 (1988)); und Familie V, die pilzlichen Paarungspheromon-Rezeptoren, wie z.B. STE2 (Kurjan, Annu. Rev. Biochem. 61, 1097-1129 (1992)).
• Es gibt ebenso eine kleine Anzahl an anderen Proteinen, die sieben mutmaßliche hydrophobe Segmente aufweisen und mit GPCRs nicht verwandt zu sein scheinen; es wurde nicht gezeigt, dass sie an G-Proteine koppeln. Drosophila exprimiert ein photorezeptorspezifisches Protein, „Bride-of-Sevenless" (Boss), ein Sieben-Transmembransegment-Protein, das ausgiebig studiert wurde und keine Beweise dafür zeigt, ein GPCR zu sein (Hart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5047-5051 (1991)). Vom Gen „frizzled" (fz) in Drosophila wird ebenso angenommen, es wäre ein Protein mit sieben Transmembransegmenten. Wie von Boss wurde von fz nicht gezeigt, dass es an G-Proteine koppelt (Vinson et al., Nature 338, 263-264 (1989)).
• G-Proteine stellen eine Familie an heterotrimeren Proteinen dar, die aus α-, β- und γ-Untereinheiten bestehen, die Guanin-Nucleotide binden. Diese Proteine sind normalerweise an Zellenoberflächenrezeptoren gebunden, z.B. Rezeptoren, die sieben Transmembransegmente enthalten. Nach der Ligandbindung an den GPCR wird eine Konformationsveränderung an das G-Protein übertragen, die bewirkt, dass die α-Untereinheit ein gebundenes GDP-Molekül gegen ein GTP-Molekül austauscht und eine Dissoziation von den βγ-Untereinheiten hervorruft. Die GTP-gebundene Form der α-Untereinheit fungiert typischerweise als eine effektormodulierende Gruppierung, was zu der Produktion von zweiten Messengern führt, wie z.B. cAMP (z.B. durch Aktivierung von Adenylcyclase), Diacylglycerin oder Inositolphosphaten. Bei Menschen sind mehr als 20 verschiedene Typen an α-Untereinheiten bekannt. Diese Untereinheiten assoziieren mit einem kleineren Pool an β- und γ-Untereinheiten. Beispiele für Säugetier-G-Proteine umfassen Gi, Go, Gq, Gs und Gt. G-Proteine werden ausführlich in Lodish et al., Molecular Cell Biology (Scientific American Books Inc., New York, N.Y. (1995)), beschrieben. GPCRs, G-Proteine und G-proteingebundene Effektor- und zweite-Messenger-Systeme wurden in The G-Protein Linked Receptor Fact Book, Watson et al. (Hrsg), Academic Press (1994), beschrieben.
• GPCRs sind ein wichtiges Ziel für die Wirkung und Entwicklung von Wirkstoffen. Dementsprechend ist die Identifizierung und Charakterisierung zuvor unbekannter GPCRs für das Gebiet der pharmazeutischen Entwicklung wertvoll. Die vorliegende Erfindung bringt Fortschritte für den Stand der Technik, indem sie einen zuvor nicht identifizierten menschlichen GPCR bereitstellt.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Es ist ein Ziel der Erfindung, neue GPCRs zu identifizieren.
• Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, neue GPCR-Polypeptide bereitzustellen, die als Reagenzien oder Ziele in Rezeptorversuchen nützlich sind, die für die Behandlung und Diagnose von GPCR-vermittelten Erkrankungen anwendbar sind.
• Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Polynucleotide bereitzustellen, die den neuen GPCR-Rezeptor-Polypeptiden entsprechen, die als Ziele und Reagenzien in Rezeptorversuchen nützlich sind, die für die Behandlung und Diagnose von GPCR-vermittelten Erkrankungen anwendbar sind und für die Herstellung neuer Rezeptor-Polypeptide mittels Rekombinationsverfahren nützlich sind.
• Ein spezifisches Ziel der Erfindung ist es, Verbindungen zu identifizieren, die als Agonisten und Antagonisten fungieren und die Expression des neuen Rezeptors modulieren.
• Ein weiteres spezifisches Ziel der Erfindung ist es, Verbindungen bereitzustellen, die die Expression des Rezeptors für die Behandlung und Diagnose GPCR-vermittelter Erkrankungen modulieren.
• Die Erfindung basiert daher auf der Identifikation neues neuen GPCR, genannt der 15625-Rezeptor.
• Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifikation eines Agens bereit, das den Spiegel oder die Aktivität eines Polypeptids in einer Zelle moduliert oder das mit einem Polypeptid in einer Zelle wechselwirkt, wobei das Polypeptid aus Folgendem ausgewählt ist:
• (a) aus der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigten Aminosäuresequenz;
• (b) aus der Aminosäuresequenz einer Allelvariante der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigten Aminosäuresequenz;
• (c) aus der Aminosäuresequenz einer Sequenzvariante der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäuresequenz, worin die Sequenzvariante von einem Nucleinsäuremolekül kodiert wird, das an das in Seq.-ID Nr. 2 bzw. 4 dargestellte Nucleinsäuremolekül hybridisiert, und zwar unter stringenten Bedingungen;
• (d) aus einem Fragment der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäuresequenz, worin das Fragment zumindest 10 zusammenhängende Aminosäuren umfasst;
• (e) aus der Aminosäuresequenz des reifen Rezeptorpolypeptids von etwa Aminosäure 6 bis etwa Aminosäure 342, dargestellt in Seq.-ID Nr. 1 oder 3;
• (f) aus der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäuresequenz des Polypeptids, von etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 342; und
• (g) aus der Aminosäuresequenz eines Epitops, das die Region eines beliebigen der Polypeptide aus (a)-(f) trägt; wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (i) das Kontaktieren des Agens mit einer Zelle, die in der Lage ist, das Polypeptid zu exprimieren, sodass der/die Polypetidspiegel oder -aktivität in der Zelle mittels des Agens moduliert werden kann, wobei die Zelle aus dem Gehirn, aus CD34⁺-Zellen, B-Zellen, Skelettmuskel, Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Herz, Granulozyten, Erythroblasten oder Pankreas stammt; und (ii) das Messen des/der Polypeptidspiegels oder -aktivität.
• Die Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart eines Polypeptids in einer Probe bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
• (i) das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper, der spezifisch die Detektion der Gegenwart des Polypeptids in der Probe ermöglicht; und
• (ii) das Detektieren der Gegenwart des Polypeptids, worin das Polypeptid aus Folgendem ausgewählt ist: (a) aus der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigten Aminosäuresequenz; (b) aus der Aminosäuresequenz einer Allelvariante der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigten Aminosäuresequenz; (c) aus der Aminosäuresequenz einer Sequenzvariante der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäuresequenz, worin die Sequenz variante von einem Nucleinsäuremolekül kodiert wird, das an das in Seq.-ID Nr. 2 bzw. 4 dargestellte Nucleinsäuremolekül hybridisiert, und zwar unter stringenten Bedingungen; (d) aus einem Fragment der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäuresequenz, worin das Fragment zumindest 10 zusammenhängende Aminosäuren umfasst; (e) aus der Aminosäuresequenz des reifen Rezeptorpolypeptids von etwa Aminosäure 6 bis etwa Aminosäure 342, dargestellt in Seq.-ID Nr. 1 oder 3; (f) aus der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäuresequenz des Polypeptids, von etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 342; und (g) aus der Aminosäuresequenz eines Epitops, das eine Region eines beliebigen der Polypeptide aus (a)-(f) trägt;
und worin die Probe von einer Zelle stammt, die aus Gehirn-, CD34⁺-, B-, Skelettmuskel-, Lymphknoten-, Milz-, Thymus-, Leber-, Mandel-, Kolon-, Herz-, Granulozyten-, Erythroblasten- und Pankreas-Zellen ausgewählt wurde.
• Die Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Identifikation eines Agens bereit, das den Spiegel oder die Aktivität eines Nucleinsäuremoleküls in einer Zelle moduliert oder das mit einem Nucleinsäuremolekül in einer Zelle wechselwirkt, wobei das Nucleinsäuremolekül eine Nucleinsäuresequenz besitzt, die aus Folgendem ausgewählt ist:
• (a) aus der in Seq.-ID Nr. 2 oder 4 gezeigten Nucleotidsequenz;
• (b) aus einer Nucleotidsequenz, die für die in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigte Aminosequenz kodiert;
• (c) aus einer Nucleotidsequenz, die zu einer beliebigen der Nucleotidsequenzen in (a) oder (b) komplementär ist;
• (d) aus einer Nucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz einer Sequenzvariante der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäurese quenz kodiert, die an die in Seq.-ID Nr. 2 bzw. 4 dargestellte Nucleotidsequenz hybridisiert, und zwar unter stringenten Bedingungen;
• (e) aus einer Nucleotidsequenz, die zu der Nucleotidsequenz in (d) komplementär ist;
• (f) aus einer Nucleotidsequenz, die für ein Fragment der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert, worin das Fragment zumindest 10 zusammenhängende Aminosäuren umfasst; und
• (g) aus einer Nucleotidsequenz, die zu der Nucleotidsequenz in (f) komplementär ist; und das Verfahren Folgendes umfasst: (i) das Kontaktieren des Agens mit einer Zelle, die in der Lage ist, das Nucleinsäuremolekül zu exprimieren, sodass der/die Nucleinsäuremolekülspiegel oder -aktivität in der Zelle mittels des Agens moduliert werden kann, worin die Zelle aus dem Gehirn, aus CD34⁺-Zellen, B-Zellen, Skelettmuskeln, Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Herz, Granulozyten, Erythroblasten oder Pankreas stammen, und; (ii) das Messen des/der Nucleinsäuremolekülspiegels oder -aktivität.
• Die Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
• (i) das Kontaktieren der Probe mit einem Agens, das spezifisch die Detektion der Gegenwart des Nucleinsäuremoleküls in der Probe ermöglicht; und
• (ii) das Detektieren der Gegenwart des Nucleinsäuremoleküls oder Fragments davon, worin das Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz besitzt, die aus Folgendem ausgewählt ist: (a) aus der in Seq.-ID Nr. 2 oder 4 gezeigten Nucleotidsequenz; (b) aus einer Nucleotidsequenz, die für die in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert; (c) aus einer Nucleotidsequenz, die zu einer beliebigen der Nucleotidsequenzen in (a) oder (b) komplementär ist; (d) aus einer Nucleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz einer Sequenzvariante der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert, die an die in Seq.-ID Nr. 2 bzw. 4 dargestellte Nucleotidsequenz hybridisiert, und zwar unter stringenten Bedingungen; (e) aus einer Nucleotidsequenz, die zu der Nucleotidsequenz in (d) komplementär ist; (f) aus einer Nucleotidsequenz, die für ein Fragment der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert, worin das Fragment zumindest 10 zusammenhängende Aminosäuren umfasst; und (g) aus einer Nucleotidsequenz, die zu der Nucleotidsequenz in (f) komplementär ist;
worin die Probe aus einem Gewebe stammt, das aus Gehirn-, CD34⁺-Zellen, B-Zellen, Skelettmuskeln, Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Herz, Granulozyten, Erythroblasten und Pankreas ausgewählt wurde, und worin das Agens ein Oligonucleotid umfasst, das unter stringenten Bedingungen an eine beliebige der Nucleinsäuresequenzen aus (a)-(g) hybridisiert und Schritt (ii) die Bestimmung umfasst, ob das Oligonucleotid an die Nucleinsäuresequenz in der Probe bindet.
• BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• 1 zeigt eine Analyse der 15625-Aminosäuresequenz: αβ-Schleife und Knäuel-Regionen; Hydrophilie; amphipathische Regionen; flexible Regionen; antigener Index und Surface-Wahrscheinlichkeits-Diagramm.
• 2 zeigt ein 15625-Rezeptor-Hydrophobie-Diagramm. Die Aminosäuren entsprechen 1-342 und zeigen die sieben Transmembransegmente.
• AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Rezeptorfunktion/Signalweg
• Das 15625-Rezeptorprotein ist ein GPCR, das an Signalwegen beteiligt ist. Wie hierin verwendet bezeichnet ein „Signalweg" die Modulation (z.B. Stimulierung oder Inhibierung) einer zellulären Funktion/Aktivität nach der Bindung eines Liganden an den GPCR (15625-Protein). Beispiele solcher Funktionen umfassen die Mobilisierung von intrazellulären Molekülen, die an einem Signalübertragungsweg beteiligt sind, z.B. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP₂), Inositol-1,4,5-triphosphat (IP₃) und Adenylatcyclase; Polarisierung der Plasmamembran; Produktion oder Sekretion von Molekülen; Veränderung in der Struktur einer zellulären Komponente; Zellproliferation, z.B. Synthese der DNA; Zellmigration; Zelldifferenzierung und Zellüberleben. Das 15625-Rezeptorprotein wird im gesamten Gehirn exprimiert, hauptsächlich in Gliazellen. Es wird auch in großem Ausmaß in Knochenmark-CD34⁺-Zellen exprimiert, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Megakaryozyten. Es wird ebenso in moderatem Ausmaß in ruhenden B-Lymphozyten exprimiert, wobei der Spiegel absinkt, wenn diese Lymphozyten aktiviert werden, sowie in Skelettmuskeln. Das Gen wird ebenso in Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Herz, Granulozyten und Erythroblasten exprimiert. Es wird ebenso in der Plazenta und dem Pankreas exprimiert. Dementsprechend umfassen Zellen, die an einem 15625-Rezeptorprotein-Signalweg beteiligt sind, jedoch nicht eingeschränkt auf diese, Zellen, die aus diesen Geweben stammen.
• Die durch das Rezeptorprotein vermittelte Reaktion hängt vom Typ der Zelle ab. In einigen Zellen z.B. kann die Bindung eines Liganden an das Rezeptorprotein durch Phosphatidylinositol- oder zyklischen AMP-Metabolismus und -Stoffumsatz eine Aktivität stimulieren, wie z.B. die Freisetzung von Verbindungen, den Schleusenmechanismus eines Kanals, zelluläre Adhäsion, Migration, Differenzierung etc., während in anderen Zellen die Bindung des Liganden zu einem anderen Resultat führt. Unabhängig von der durch das Rezeptorprotein modulierten zellulären Aktivität/Reaktion ist allgemein gültig, dass das Protein ein GPCR ist und mit G-Proteinen wechselwirkt, um ein oder mehrere Sekundärsignale in einer Reihe an intrazellulären Signalübertragungswegen zu produzieren, z.B. durch Phosphatidylinositol- oder zyklischen AMP-Metabolismus und -Stoffumsatz in einer Zelle.
• Wie hierin verwendet bezeichnet „Phosphatidylinositol-Stoffumsatz und -Metabolismus" die in den Stoffumsatz und den Metabolismus von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP₂) involvierten Moleküle sowie die Aktivitäten dieser Moleküle. PIP₂ ist ein Phospholipid, das in der zytosolischen Einzelschicht der Plasmamembran zu finden ist. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor aktiviert in einigen Zellen das Plasmamembran-Enzym Phospholipase C, das wiederum PIP₂ hydrolysieren kann, um 1,2-Diacylglycerin (DAG) und Inositol-1,4,5-triphosphat (IP₃) zu produzieren. Einmal gebildet, kann IP₃ zu der Oberfläche des endoplasmatischen Reticulums diffundieren, wo es einen IP₃-Rezeptor binden kann, z.B. ein Calciumkanalprotein, das eine IP₃-Bindungsstelle enthält. Die IP₃-Bindung kann eine Öffnung des Kanals induzieren, wodurch ermöglicht wird, dass Calciumionen in das Zytoplasma freigesetzt werden. IP₃ kann auch von einer spezifischen Kinase phosphoryliert werden, um Inositol-1,3,4,5-tetraphosphat (IP₄) zu bilden, ein Molekül, das einen Eingang des Calciums in das Zytoplasma aus dem extrazellulären Medium bewirken kann. IP₃ und IP₄ können anschließend sehr schnell zu den inaktiven Produkten Inositol-1,4-biphosphat (IP₂) bzw. Inositol-1,3,4-triphosphat hydrolysiert werden. Diese inaktiven Produkte können von der Zelle wiederverwendet werden, um PIP₂ zu synthetisieren. Der andere zweite Messenger, der durch die Hydrolyse von PIP₂ produziert wird, nämlich 1,2-Diacylglycerin (DAG), verbleibt in der Zellmembran, wo er dazu dienen kann, das Enzym Protein-Kinase C zu aktivieren. Protein-Kinase C ist normalerweise löslich im Zytoplasma der Zelle zu finden, jedoch nach einer Steigerung der intrazellulären Calciumkonzentration kann sich dieses Enzym zu der Plasmamembran bewegen, wo es von DAG aktiviert werden kann. Die Aktivierung von Protein-Kinase C in verschiedenen Zellen führt zu verschiedenen zellulären Reaktionen, wie z.B. der Phosphorylierung von Glykogen-Synthase oder der Phosphorylierung von verschiedenen Transkriptionsfaktoren, z.B. NF-kB. Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck „Phosphatidylinositol-Aktivität" eine Aktivität von PIP₂ oder von einem seiner Metaboliten.
• Ein weiterer Signalweg, an dem der Rezeptor beteiligt sein kann, ist der cAMP-Stoffumsatz-Weg. Wie hierin verwendet bezeichnet „zyklischer AMP-Stoffumsatz und -Metabolismus" die in den Stoffumsatz und den Metabolismus von zyklischem AMP (cAMP) involvierten Moleküle sowie auf die Aktivitäten dieser Moleküle. Zyklisches AMP ist ein zweiter Messenger, der als Reaktion auf eine ligandinduzierte Stimulierung gewisser G-proteingekoppelter Rezeptoren produziert wird. Im cAMP-Signalweg kann die Bindung eines Liganden an einen GPCR zu der Aktivierung des Enzyms Adenylcyclase führen, das die Synthese von cAMP katalysiert. Das neu synthetisierte cAMP kann wiederum eine cAMP-abhängige Protein-Kinase aktivieren. Diese aktivierte Kinase kann ein spannungsgesteuertes Kaliumkanalprotein oder ein assoziiertes Protein phosphorylieren und zu der Unfähigkeit des Kaliumkanals führen, sich während eines Wirkungspotentials zu öffnen. Die Unfähigkeit des Kaliumkanals, sich zu öffnen, führt zu einem Absinken des nach außen gerichteten Kaliumflusses, der normalerweise die Membran eines Neurons erneut polarisiert, was zu einer verlängerten Membran-Depolarisation führt.
• Polypeptide
• Die Erfindung basiert auf der Entdeckung eines neuen G-gekoppelten Proteinrezeptors. Spezifisch wurde eine exprimierte Sequenz-Markierung (EST) basierend auf der Homologie zu G-proteingekoppelten Rezeptorsequenzen ausgewählt. Diese EST wurde verwendet, um, basierend auf Sequenzen, die es enthält, Primer zu kreieren, sowie zur Identifikation einer cDNA aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek. Positive Klone wurden sequenziert, und die überlappenden Fragmente wurden angeordnet. Die Analyse der angeordneten Sequenz ergab, dass das klonierte cDNA-Molekül für einen G-proteingekoppelten Rezeptor kodiert.
• Eine cDNA-Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 4) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3) für einen nicht-menschlichen Primaten (Makaken-Gehirn), die der menschlichen 15625-Rezeptor-Aminosäure- und -Nucleotidsequenz entsprechen, sind in der Erfindung ebenso enthalten.
• Die Erfindung betrifft daher einen neuen GPCR mit der in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten, abgeleiteten Aminosäuresequenz.
• Es wird prognostiziert, dass die Aminosäuren 1-25 die aminoterminale extrazelluläre Domäne darstellen, dass die Aminosäuren 26-302 die Region darstellen, die die Transmembrandomäne umspannt, und dass die Aminosäuren 303-342 die carboxyterminale intrazelluläre Domäne darstellen. Die Transmembrandomäne enthält sieben Transmembransegmente, drei extrazelluläre Schleifen und drei intrazelluläre Schleifen. Die Transmembransegmente sind etwa von Aminosäure 26 bis etwa Aminosäure 47, etwa von Aminosäure 59 bis etwa Aminosäure 79, von etwa Aminosäure 99 bis etwa Aminosäure 120, von etwa Aminosäure 143 bis etwa Aminosäure 162, von etwa Aminosäure 189 bis etwa Aminosäure 212, von etwa Aminosäure 238 bis etwa Aminosäure 255 und von etwa Aminosäure 284 bis etwa Aminosäure 302 zu finden. Innerhalb der Region, die die gesamte Transmembrandomäne umspannt, befinden sich drei intrazelluläre und drei extrazelluläre Schleifen. Die drei intrazellulären Schleifen sind von etwa Aminosäure 48 bis etwa Aminosäure 58, von etwa Aminosäure 121 bis etwa Aminosäure 142 und von etwa Aminosäure 213 bis etwa Aminosäure 237 zu finden. Die drei extrazellulären Schleifen sind von etwa Aminosäure 80 bis etwa Aminosäure 98, von etwa Aminosäure 163 bis etwa Aminosäure 188 und von etwa Aminosäure 256 bis etwa Aminosäure 283 zu finden.
• Die Transmembrandomäne umfasst eine GPCR-Signalübertragungssignatur, DRY, an den Resten 121-123. Die Sequenz umfasst ein Arginin an Rest 122, eine Invariante Aminosäure in GPCRs.
• Ein Vergleich des 15625-Rezeptors gegen die Prosite-Datenbank an Proteinmustern zeigt einen hohen Score-Wert gegenüber der Sieben-Transmembransegment-Rhodopsin-Überfamilie. Der unterstrichene Bereich zeigt eine GPCR-Signatur und spezifisch die Position eines Arginin-Rests, konserviert in GPCRs. Die am häufigsten konservierte Sequenz ist ein Aspartat-Arginin-Tyrosin-(DRY-) Triplett. DRY ist in die Signalübertragung verwickelt. Arginin ist invariant. Aspartat ist in einigen GPCRs konservativ platziert. Im vorliegenden Fall ist das Arginin in der Sequenz DRY zu fin den, was der Position von DRY oder invariantem Arginin in GPCRs der Rhodopsin-Überfamilie an Rezeptoren entspricht.
• Eine Analyse des offenen Leserasters von 15625 zeigt Aminosäuren, die spezifischen funktionellen Stellen entsprechen. Eine N-Glykosylierungsstelle befindet sich etwa an den Aminosäuren 6-9 und 13-16. Eine cAMP- und cGMP-abhängige Protein-Kinase-Phosphorylierungsstelle befindet sich etwa an den Aminosäuren 173-176. Eine Protein-Kinase-C-Phosphorylierungsstelle befindet sich etwa an den Aminosäuren 126-128, 163-165 und 304-306. Eine N-Myristoylierungsstelle befindet sich etwa an den Aminosäuren 39-44 und 333-338. Zusätzlich sind die Aminosäuren, die in Position der GPCR-Signatur entsprechen und das Invariante Arginin enthalten, in der Sequenz-DRY an den Aminosäuren 121-123 zu finden.
• Das „15625-Rezeptor-Polypeptid" oder „15625-Rezeptor-Protein" bezeichnet das Polypeptid in Seq.-ID Nr. 1. Der Begriff „Rezeptor-Protein" oder „Rezeptor-Polypeptid" umfasst jedoch weiters die zahlreichen, hierin beschriebenen Varianten sowie Fragmente, die vom 15625-Polypeptid voller Länge und seinen Varianten abstammen, z.B. Seq.-ID Nr. 3.
• Die vorliegende Erfindung stellt daher ein isoliertes oder gereinigtes 15625-Rezeptor-Polypeptid und Varianten und Fragmente davon bereit.
• Das 15625-Polypeptid ist ein 342-Reste-Protein, das drei Hauptstrukturdomänen aufweist. Die aminoterminale extrazelluläre Domäne wurde als innerhalb der Reste 1 bis etwa 25 in Seq.-ID Nr. 1 identifiziert. Die Transmembrandomäne wurde als innerhalb der Reste von etwa 26 bis etwa 302 in Seq.-ID Nr. 1 identifiziert. Die carboxyterminale intrazelluläre Domäne wurde als innerhalb der Reste von etwa 303 bis etwa 342 in Seq.-ID Nr. 1 identifiziert. Die Transmembrandomäne enthält sieben Segmente, die die Membran umspannen. Die Transmembransegmente sind etwa von Aminosäure 26 bis etwa Aminosäure 47, etwa von Aminosäure 59 bis etwa Aminosäure 79, von etwa Aminosäure 99 bis etwa Aminosäure 120, von etwa Aminosäure 143 bis etwa Aminosäure 162, von etwa Aminosäure 189 bis etwa Aminosäure 212, von etwa Aminosäure 238 bis etwa Aminosäure 255 und von etwa Aminosäure 284 bis etwa Aminosäure 302 zu finden. Innerhalb der Region, die die gesamte Transmembrandomäne umspannt, befinden sich drei intrazelluläre und drei extrazelluläre Schleifen. Die drei intrazellulären Schleifen sind von etwa Aminosäure 48 bis etwa Aminosäure 58, von etwa Aminosäure 121 bis etwa Aminosäure 142 und von etwa Aminosäure 213 bis etwa Aminosäure 237 zu finden. Die drei extrazellulären Schleifen sind von etwa Aminosäure 80 bis etwa Aminosäure 98, von etwa Aminosäure 163 bis etwa Aminosäure 188 und von etwa Aminosäure 256 bis etwa Aminosäure 283 zu finden.
• Die Transmembrandomäne umfasst eine GPCR-Signalübertragungssignatur, DRY, an den Resten 121-123. Die Sequenz umfasst ein Arginin an Rest 122, eine Invariante Aminosäure in GPCRs.
• Basierend auf einer BLAST-Suche wurde gezeigt, dass die höchste Homologie zu der Rhodopsin-Überfamilie an GPCRs bestand.
• Wie hierin verwendet, wird von einem „isolierten" oder „gereinigten" Polypeptid gesprochen, wenn es im Wesentlichen frei von zellulärem Material ist, wenn es von rekombinanten und nicht rekombinanten Zellen isoliert ist, oder frei von chemischen Vorläuferstoffen oder anderen Chemikalien ist, wenn es chemisch synthetisiert ist. Ein Polypeptid kann jedoch an ein anderes Polypeptid gebunden sein, mit dem es normalerweise nicht in einer Zelle assoziiert ist, und trotzdem als „isoliert" oder „gereinigt" angesehen werden.
• Die Rezeptor-Polypeptide können bis zur Homogenität gereinigt werden. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass Präparate, in denen das Polypeptid nicht bis zur Homogenität gereinigt ist, nützlich sind und dass davon ausgegangen wird, dass sie eine isolierte Form des Polypeptids enthalten. Das kritische Merkmal ist, dass das Präparat die gewünschte Funktion des Polypeptids ermöglicht, sogar in Gegenwart beachtlicher Mengen anderer Komponenten. Die Erfindung umfasst daher verschiedene Grade an Reinheit.
• In einer Ausführungsform umfasst der Begriff „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparate des Rezeptor-Polypeptids mit weniger als etwa 30 % (des Trockengewichts) anderer Proteine (d.h. kontaminierende Proteine), weniger als etwa 20 % anderer Proteine, weniger als etwa 10 % anderer Proteine oder weniger als etwa 5 anderer Proteine. Wird das Rezeptor-Polypeptid rekombinant hergestellt, so kann es auch im Wesentlichen frei von Kulturmedium sein, d.h. Kulturmedium stellt weniger als etwa 20 %, weniger als etwa 10 % oder weniger als etwa 5 % des Volumens des Proteinpräparats dar.
• Der Begriff „im Wesentlichen frei von chemischen Vorläuferstoffen oder anderen Chemikalien" umfasst Präparate des Rezeptor-Polypeptids, in denen es von chemischen Vorläuferstoffen oder anderen Chemikalien getrennt ist, die in dessen Synthese involviert sind. In einer Ausführungsform umfasst der Begriff „im Wesentlichen frei von chemischen Vorläuferstoffen oder anderen Chemikalien" Präparate des Polypeptids mit weniger als etwa 30 % (des Trockengewichts) chemischer Vorläuferstoffe oder anderer Chemikalien, weniger als etwa 20 % chemischer Vorläuferstoffe oder anderer Chemikalien, weniger als etwa 10 % chemischer Vorläuferstoffe oder anderer Chemikalien oder weniger als etwa 5 % chemischer Vorläuferstoffe oder anderer Chemikalien.
• In einer Ausführungsform umfasst das Rezeptor-Polypeptid die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz. Die Erfindung umfasst jedoch ebenso Sequenzvarianten. Varianten umfassen ein im Wesentlichen homologes Protein, das vom selben genetischen Locus in einem Organismus kodiert wird, d.h. eine Allelvariante. Der 15625-Rezeptor wurde auf Chromosom 3 kartiert, in der Nähe des AFM-64YG9-Markers. Varianten umfassen ebenso Proteine, die von anderen genetischen Loci in einem Organismus abstammen, jedoch im Wesentlichen eine Homologie zu dem 15625-Rezeptor-Protein aus Seq.-ID Nr. 1 aufweisen. Varianten umfassen ebenso Proteine, die im Wesentlichen homolog zu dem 15625-Rezeptor-Protein sind, jedoch von einem anderen Organismus stammen, d.h. ein Ortholog, wie z.B. in Seq.-ID Nr. 3. Varianten umfassen ebenso Proteine, die im Wesentlichen homolog zu dem 15625-Rezeptor-Protein sind, die mittels chemischer Synthese produziert werden.
• Varianten umfassen ebenso Proteine, die im Wesentlichen homolog zu dem 15625-Rezeptor-Protein sind, die mittels Rekombinationsverfahren produziert werden. Es ist jedoch allgemein bekannt, dass Varianten alle vor der Erfindung offenbarte Aminosäuresequenzen ausschließen.
• Wie hierin verwendet, sind zwei Proteine (oder eine Region der Proteine) im Wesentlichen homolog, wenn die Aminosäuresequenzen zumindest etwa 50-55 %, 55-60 %, typischerweise zumindest etwa 70-75 %, noch typischer zumindest etwa 80-85 % und besonders typisch zumindest etwa 90-95 % oder mehr Homologie aufweisen. Eine im Wesentlichen homologe Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung wird von einer Nucleinsäuresequenz kodiert, die an die Nucleinsäuresequenz der in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Sequenz oder einen Teil davon unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wie dies unten stehend ausführlicher beschrieben wird.
• Um den Prozentsatz der Identität der zwei Aminosäuresequenzen oder der zwei Nucleinsäuresequenzen zu bestimmen, werden die Sequenzen für Zwecke des optimalen Vergleichs angeordnet (z.B. können Lücken in eine oder beide einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz für eine optimale Anordnung eingefügt werden, und nicht homologe Sequenzen können für Vergleichszwecke außer Acht gelassen werden). In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge einer Referenzsequenz, die zu Vergleichszwecken angeordnet wird, zumindest 30 %, vorzugsweise zumindest 40 %, noch bevorzugter zumindest 50 %, noch bevorzugter zumindest 60 % und noch bevorzugter zumindest 70 %, 80 % oder 90 %, der Länge der Referenzsequenz (z.B. wird eine zweite Sequenz mit 342 Aminosäureresten mit den hierin enthaltenen Aminosäuresequenzen angeordnet, so werden zumindest 80, vorzugsweise zumindest 100, noch bevorzugter zumindest 120, noch bevorzugter zumindest 140 und noch bevorzugter zumindest 200, 250, 300 oder 340 Aminosäurereste angeordnet). Die Aminosäurereste oder Nucleotide an korrespondierenden Aminosäurepositionen oder Nucleotidpositionen werden anschließend verglichen. Ist eine Position in der ersten Sequenz vom selben Aminosäurerest oder Nucleotid besetzt wie die korrespondierende Position in der zweiten Sequenz, so sind die Moleküle an dieser Position identisch (wie hierin verwendet, wird Amino säure- oder Nucleinsäure-„Identität" äquivalent zu Aminosäure- oder Nucleinsäure-„Homologie" verwendet). Der Prozentsatz der Identität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die die Sequenzen gemeinsam haben, wobei die Anzahl der Lücken und die Länge jeder Lücke in Betracht gezogen wird, die für eine optimale Anordnung der beiden Sequenzen eingeführt werden müssen.
• Die Erfindung umfasst ebenso Polypeptide mit einem geringeren Grad an Identität, jedoch mit ausreichender Ähnlichkeit, um eine oder mehrere derselben Funktionen durchzuführen, die vom 15625-Polypeptid ausgeführt werden. Die Ähnlichkeit wird mittels konservierter Aminosäuresubstitution ermittelt. Solche Substitutionen sind jene, die eine bestimmte Aminosäure in einem Polypeptid mit einer anderen Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften substituieren. Konservative Substitutionen sind wahrscheinlich phänotypisch stumm. Die Ersetzungen, eines gegen das andere, unter den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile werden typischerweise als konservative Substitutionen angesehen sowie auch der Austausch der Hydroxyl-Reste Ser und Thr, der Austausch der sauren Reste Asp und Glu, die Substitution zwischen den Amid-Resten Asn und Gln, der Austausch der basischen Reste Lys und Arg und die Ersetzungen unter den aromatischen Resten Phe, Tyr. Anleitungen bezüglich der Frage, welche Aminosäureänderungen wahrscheinlich phänotypisch stumm sind, sind in Bowie et al., Science 247, 1306-1310 (1990), zu finden.
• TABELLE 1. Konservative Aminosäuresubstitutionen

  
• Der Vergleich der Sequenzen und die Bestimmung des Prozentsatzes der Identität und der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden (Computational Molecular Biology, A.M. Lesk (Hrsg.), Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, D.W. Smith (Hrsg.), Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, A.M. Griffin und H.G. Griffin (Hrsg.), Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heinje, Academic Press (1987); sowie Sequence Analysis Primer, M. Gribskov und J. Devereux (Hrsg.), M. Stockton Press, New York (1991)). In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Aminosäu resequenzen unter Verwendung des Algorithmus von Needleman und Wunsch bestimmt (J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)), der in das GAP-Programm im GCG-Softwarepacket inkorporiert wurde (erhältlich unter http://www.gcg.com), und zwar unter Verwendung von entweder einer Blossom-62-Matrix oder einer PAM250-Matrix und einer Lückengewichtung von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und einer Längengewichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Nucleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms im GCG-Softwarepacket bestimmt (J. Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12 (I), 387 (1984)) (erhältlich unter http://www.gcg.com), und zwar unter Verwendung einer NWSgapdna.CMP-Matrix und einer Lückengewichtung von 40, 50, 60, 70 oder 80 und einer Längengewichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6. In einer weiteren Ausführungsform wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Aminosäure- oder Nucleotidsequenzen unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller bestimmt (CABIOS 4, 11-17 (1989)), der in das ALIGN-Programm (Version 2.0) inkorporiert wurde, und zwar unter Verwendung einer PAM120-Gewichtungs-Rest-Tabelle, einer sog. „Gap Length Penalty" von 12 und einer „Gap Penalty" von 4.
• Die Nucleinsäure- und Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung können weiters als „Abfrage-Sequenz" verwendet werden, um eine Suche gegen öffentliche Datenbanken durchzuführen, um z.B. andere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Solche Suchoperationen können unter Verwendung der Programme NBLAST und XBLAST (Version 2.0) von Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215, 403-10 (1990)) durchgeführt werden. BLAST-Nucleotid-Suchoperationen können mit dem Programm NBLAST durchgeführt werden, Score = 100, Wortlänge = 12, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die zu den Nucleinsäuremolekülen der Erfindung homolog sind. BLAST-Protein-Suchoperationen können mit dem Programm XBLAST durchgeführt werden, Score = 50, Wortlänge = 3, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu den Proteinen der Erfindung homolog sind. Um für Vergleichszwecke Anordnungen mit Lücken zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie von Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25 (17), 3389-3402 (1997)) beschrieben. Werden die Programme BLAST und Gapped BLAST verwendet, so können die Vorgabe parameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
• Eine Polypeptid-Variante kann sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Inversionen, Fusionen und Trunkierungen oder eine Kombination aus beliebigen dieser Vorgänge unterscheiden.
• Polypeptid-Varianten können voll funktionsfähig sein oder es kann ihnen an Funktion in einer oder mehrer Aktivitäten fehlen. Im vorliegenden Fall können Variationen daher die Funktion von z.B. einer oder mehreren Regionen beeinträchtigen, die mit der Ligandbindung, der Membranassoziierung, der G-Protein-Bindung und der Signalübertragung korrespondieren.
• Voll funktionsfähige Varianten enthalten typischerweise nur konservative Variationen oder Variationen in nicht kritischen Resten oder in nicht kritischen Regionen. Funktionsfähige Varianten können ebenso eine Substitution ähnlicher Aminosäuren enthalten, die zu keiner Veränderung oder einer insignifikanten Veränderung der Funktion führt. Alternativ dazu können solche Substitutionen die Funktion bis zu einem gewissen Ausmaß positiv oder negativ beeinträchtigen.
• Nicht funktionsfähige Varianten enthalten typischerweise eine oder mehrere nicht konservative Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen, -Insertionen, -Inversionen oder -Trunkierung oder eine Substitution, Insertion, Inversion oder Deletion in einem kritischen Rest oder einer kritischen Region.
• Wie angegeben, können Varianten natürlich vorkommend sein oder mittels rekombinanter Mittel oder chemischer Synthese hergestellt werden, um nützliche und neue Charakteristiken für das Rezeptor-Polypeptid bereitzustellen. Dies umfasst das Verhindern der Immunogenität aus pharmazeutischen Formulierungen durch das Verhindern der Protein-Aggregation.
• Nützliche Variationen umfassen weiters die Veränderung der Ligandbindungsmerkmale. Eine Ausführungsform umfasst z.B. eine Variation an der Bindungsstelle, die zu einer Bindung, jedoch nicht zu einer Freisetzung, oder einer langsameren Freisetzung des Liganden führt. Eine weitere nützliche Variation an denselben Stellen kann zu einer größeren Affinität für den Liganden führen. Nützliche Variationen umfassen ebenso Veränderungen, die zu einer Affinität für einen anderen Liganden führen. Eine weitere nützliche Variation umfasst eine, die eine Bindung ermöglicht, jedoch die Aktivierung durch den Liganden verhindert. Eine weitere nützliche Variation umfasst eine Variation in der Transmembran-G-Proteinbindungs-/Signalübertragungs-Domäne, die für eine reduzierte oder erhöhte Bindung durch das geeignete G-Protein oder für eine Bindung durch ein anderes G-Protein sorgt als jenes, mit dem der Rezeptor normalerweise assoziiert ist. Eine weitere nützliche Variation stellt ein Fusionsprotein bereit, in dem eine oder mehrere Domänen oder Subregionen operabel an eine oder mehrere Domänen oder Subregionen eines anderen G-proteingekoppelten Rezeptors fusioniert sind.
• Aminosäuren, die für die Funktion essentiell sind, können durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren identifiziert werden, z.B. ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham et al., Science 244, 1081-1085 (1989)). Das letztere Verfahren führt einzelne Alanin-Mutationen an jedem Rest im Molekül ein. Die resultierenden Mutantenmoleküle werden anschließend auf biologische Aktivität, wie z.B. Rezeptorbindung oder in vitro, oder In-vitro-Proliferationsaktivität getestet. Stellen, die für die Ligand-Rezeptor-Bindung entscheidend sind, können ebenso mittels struktureller Analyse, wie z.B. Kristallisierung, magnetischer Kernresonanz oder Photoaffinitäts-Markierung, bestimmt werden (Smith et al., J. Mol. Biol. 224, 899-904 (1992); de Vos et al., Science 255, 306-312 (1992)).
• Eine substantielle Homologie kann zu der gesamten Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder zu Fragmenten dieser Sequenzen bestehen.
• Die Erfindung stellt daher auch Polypeptidfragmente des 15625-Rezeptor-Proteins bereit. Fragmente können von der in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz abstammen. Die Erfindung umfasst jedoch auch Fragmente der Varianten des 15625-Rezeptor-Proteins, wie es hierin beschrieben wird.
• Die Fragmente, die die Erfindung betreffen, sollen jedoch nicht als jene Fragmente umfassend verstanden werden, die vor der vorliegenden Erfindung offenbart sein könnten.
• Wie hierin verwendet umfasst ein Fragment zumindest 10 zusammenhängende Aminosäuren von Aminosäure 1 bis Aminosäure 280 und von Aminosäure 291 bis Aminosäure 342. Die Fragmente besitzen eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten des Proteins, z.B. die Fähigkeit, an ein G-Protein oder einen Liganden zu binden, sowie Fragmente, die als ein Immunogen verwendet werden können, um Rezeptor-Antikörper herzustellen.
• Biologisch aktive Fragmente (Peptide, die z.B. 10, 12, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) können eine Domäne oder ein Motiv umfassen, z.B. eine extrazelluläre oder intrazelluläre Domäne oder Schleife, ein oder mehr Transmembransegmente oder Teile davon, G-Protein-Bindungsstelle oder GPCR-Signatur, Glykosylierungsstellen, cAMP- und cGMP-abhängige Protein-Kinase und Protein-Kinase-C-Phosphorylierungsstellen sowie Myristoylierungsstellen.
• Mögliche Fragmente umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: 1) lösliche Peptide, die die gesamte aminoterminale extrazelluläre Domäne von etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 25 aus Seq.-ID Nr. 1 umfassen, oder Teile davon; 2) Peptide, die die gesamte cyrboxyterminale intrazelluläre Domäne von etwa Aminosäure 303 bis Aminosäure 342 aus Seq.-ID Nr. 1 umfassen, oder Teile davon; 3) Peptide, die die Region umfassen, die die gesamte Transmembrandomäne umspannt, von etwa Aminosäure 26 bis Aminosäure 302; 4) ein beliebiges der spezifischen Transmembransegmente oder Teile davon; 5) eine beliebige der drei intrazellulären oder drei extrazellulären Schleifen oder Teile davon.
• Fragmente können eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten des Proteins beibehalten, z.B. die Fähigkeit, an ein G-Protein oder einen Liganden zu binden. Fragmente können ebenso als ein Immunogen nützlich sein, um Rezeptor-Antikörper zu erzeugen.
• Biologisch aktive Fragmente können eine Domäne oder ein Motiv umfassen, z.B. eine extrazelluläre oder intrazelluläre Domäne oder Schleife, ein oder mehr Transmembransegmente oder Teile davon, G-Protein-Bindungsstelle oder GPCR-Signatur, Glykosylierung, cAMP- und cGMP-abhängige Protein-Kinase-Phosphorylierungsstellen, Protein-Kinase-C-Phosphorylierungsstellen sowie N-Myristoylierungsstellen. Solche Peptide können z.B. 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sein.
• Mögliche Fragmente umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: 1) lösliche Peptide, die die gesamte aminoterminale extrazelluläre Domäne von etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 25 aus Seq.-ID Nr. 1 umfassen, oder Teile davon; 2) Peptide, die die gesamte carboxyterminale intrazelluläre Domäne von etwa Aminosäure 303 bis Aminosäure 342 aus Seq.-ID Nr. 1 umfassen, oder Teile davon; 3) Peptide, die die Region umfassen, die die gesamte Transmembrandomäne umspannt, von etwa Aminosäure 26 bis etwa Aminosäure 302, oder Teile davon; 4) ein beliebiges der spezifischen Transmembransegmente oder Teile davon, etwa von Aminosäure 26 bis etwa Aminosäure 47, von etwa Aminosäure 59 bis etwa Aminosäure 79, von etwa Aminosäure 99 bis etwa Aminosäure 120, von etwa Aminosäure 143 bis etwa Aminosäure 162, von etwa Aminosäure 189 bis etwa Aminosäure 212, von etwa Aminosäure 238 bis etwa Aminosäure 255 und von etwa Aminosäure 284 bis etwa Aminosäure 302; 5) eine beliebige der drei intrazellulären oder drei extrazellulären Schleifen oder Teile davon, von etwa Aminosäure 48 bis etwa Aminosäure 58, von etwa Aminosäure 121 bis etwa Aminosäure 142, von etwa Aminosäure 213 bis etwa Aminosäure 237, von etwa Aminosäure 80 bis etwa Aminosäure 98, von etwa Aminosäure 163 bis etwa Aminosäure 188 und von etwa Aminosäure 256 bis etwa Aminosäure 283. Fragmente umfassen weiters Kombinationen der oben genannten Fragmente, wie z.B. eine aminoterminale Domäne kombiniert mit einem oder mehr Trans membransegmenten und den begleitenden extra- oder intrazellulären Schleifen oder einem oder mehr Transmembransegmenten und den begleitenden intra- oder extrazellulären Schleifen, plus der carboxyterminalen Domäne. Daher kann jedes beliebige der oben genannten Fragmente kombiniert werden. Andere Fragmente umfassen das reife Protein von etwa Aminosäure 6 bis 342. Weitere Fragmente enthalten die verschiedenen hierin beschriebenen funktionellen Stellen, wie z.B. Glykosylierung, cAMP- und cGMP-abhängige Protein-Kinase-Phosphorylierungsstellen, Protein-Kinase-C-Phosphorylierungsstellen, N-Myristoylierungsstellen und eine Sequenz, die die GPCR-Signatur-Sequenz enthält. Fragmente können sich z.B. in eine oder beide Richtungen von der funktionellen Stelle erstrecken, um 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 oder bis zu 100 Aminosäuren zu umfassen. Weiters können Fragmente Sub-Fragmente der oben genannten spezifischen Domänen umfassen, wobei die Subfragmente die Funktion der Domäne beibehalten, von der sie abstammen.
• Fragmente umfassen ebenso antigene Fragmente und besonders jene, von denen gezeigt wurde, dass sie einen hohen antigenen Index in 1 besitzen.
• Dementsprechend umfassen mögliche Fragmente Fragmente, die eine Ligand-Bindungsstelle definieren, Fragmente, die die Membranassoziierung definieren, Fragmente, die die Wechselwirkung mit G-Proteinen und die Signalübertragung definieren, sowie Fragmente, die Glykosylierungsstellen, cAMP- und cGMP-abhängige Protein-Kinase-Phosphorylierungsstellen, Protein-Kinase-C-Phosphorylierungsstellen und N-Myristoylierungsstellen definieren. Damit ist ein diskretes Fragment gemeint, das die relevante Funktion bereitstellt oder es ermöglicht, die relevante Funktion zu identifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Fragment die Ligand-Bindungsstelle.
• Die Erfindung stellt auch Fragmente mit immunogenen Eigenschaften bereit. Diese enthalten einen epitoptragenden Teil des 15625-Rezeptor-Proteins und Varianten. Diese epitoptragenden Peptide sind nützlich, um Antikörper zu züchten, die spezifisch an ein(e) Rezeptor-Polypeptid oder -Region oder -Fragment binden. Diese Pep tide können zumindest 10, 12, zumindest 14 oder zwischen zumindest etwa 15 bis etwa 30 Aminosäuren enthalten.
• Nicht einschränkende Beispiele antigener Polypeptide, die verwendet werden können, um Antikörper zu generieren, umfassen Peptide, die von der aminoterminalen extrazellulären Domäne oder einer beliebigen der extrazellulären Schleifen stammen. Regionen mit einem hohen Antigenitäts-Index werden in 1 dargestellt. Intrazellulär produzierte Antikörper („Intrakörper") sind darin jedoch ebenso enthalten, diese würden intrazelluläre Rezeptor-Peptid-Regionen erkennen.
• Die Rezeptor-Polypeptide (die Varianten und Fragmente umfassen, die auch bereits vor der vorliegenden Erfindung offenbart worden sein könnten) sind für biologische Tests, die sich auf GPCRs beziehen, nützlich. Solche Tests umfassen eine beliebige der bekannten GPCR-Funktionen oder -Aktivitäten oder -Eigenschaften, die für die Diagnose und Behandlung von GPCR-bezogenen Erkrankungen nützlich sind.
• Der/die epitoptragende(n) Rezeptor und Polypeptide können durch ein beliebiges der herkömmlichen Verfahren produziert werden (R.A. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5131-5135 (1985)). Die gleichzeitige Synthese mehrerer Peptide wird im US-Patent Nr. 4.631.211 beschrieben.
• Fragmente können diskret sein (nicht an andere Aminosäuren oder Polypeptide fusioniert) oder können sich innerhalb eines größeren Polypeptids befinden. Weiters können sich mehrere Fragmente innerhalb eines einzelnen größeren Polypeptids befinden. In einer Ausführungsform kann ein Fragment, das für die Expression in einem Wirt kreiert wurde, heterologe Prä- und Pro-Polypeptid-Regionen besitzen, die an den Amino-Terminus des Rezeptor-Fragments fusioniert sind, sowie eine zusätzliche Region, die an den Carboxyl-Terminus des Fragments fusioniert ist.
• Die Erfindung stellt daher chimäre oder Fusionsproteine bereit. Diese umfassen ein Rezeptor-Protein, das operativ an ein heterologes Protein mit einer Aminosäuresequenz gebunden ist, die zu dem Rezeptor-Protein im Wesentlichen nicht homolog ist.
• „Operativ gebunden" deutet darauf hin, dass das Rezeptor-Protein und das heterologe Protein im Leseraster fusioniert sind. Das heterologe Protein kann an den N-Terminus oder den C-Terminus des Rezeptor-Proteins fusioniert sein.
• In einer Ausführungsform beeinträchtigt das Fusionsprotein die Rezeptor-Funktion per se nicht. Z.B. kann das Fusionsprotein ein GST-Fusionsprotein sein, in dem die Rezeptor-Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Andere Typen an Fusionsproteinen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, enzymatische Fusionsproteine, z.B. β-Galactosidase-Fusionen, Hefe-Zwei-Hybrid-GAL-Fusionen, Poly-His-Fusionen und Ig-Fusionen. Solche Fusionsproteine, insbesondere Poly-His-Fusionen, können die Reinigung von rekombinantem Rezeptor-Protein erleichtern. In gewissen Wirtszellen (z.B. Säugetier-Wirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion eines Proteins durch die Verwendung einer heterologen Signalsequenz erhöht werden. In einer anderen Ausführungsform enthält das Fusionsprotein daher eine heterologe Signalsequenz an ihrem N-Terminus.
• EP-A 0.464.533 offenbart Fusionsproteine, die verschiedene Teile konstanter Immunglobulin-Regionen umfassen. Die Fc ist in der Therapie und der Diagnose nützlich und führt daher zu verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften (EP-A 0.232.262). Bei der Entdeckung von Wirkstoffen wurden z.B. menschliche Proteine zum Zwecke der Erzeugung von Screening-Tests mit hohem Durchsatz zur Identifikation von Antagonisten mit Fc-Abschnitten fusioniert. Bennett et al. (J. Mol. Recog. 8, 52-58 (1995)) und Johanson et al. (J. Biol. Chem. 270 (16), 9459-9471 (1995)). Diese Erfindung umfasst daher auch lösliche Fusionsproteine, die ein Rezeptor-Polypeptid und verschiedene Abschnitte der konstanten Regionen von schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen verschiedener Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) enthalten. Als Immunglobulin bevorzugt wird der konstante Teil der schweren Kette von menschlichem IgG, inbesondere IgG1, worin die Fusion an der Gelenkregion stattfindet. Für einige Verwendungszwecke ist es erwünscht, die Fc zu entfernen, nachdem das Fusionsprotein für den ihm zugedachten Zweck verwendet wurde, z.B. wenn das Fusionsprotein als Antigen für Immunisierungen verwendet werden soll. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil auf einem einfachen Weg mittels einer Spaltungssequenz entfernt werden, die ebenso inkorporiert ist und mit Faktor Xa gespalten werden kann.
• Ein chimäres oder Fusionsprotein kann mittels Standard-DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. DNA-Fragmente, die für die verschiedenen Proteinsequenzen kodieren, werden z.B. gemäß herkömmlicher Verfahren im Leseraster aneinander ligiert. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen mittels herkömmlicher Verfahren synthetisiert werden, die unter anderem automatisierte DNA-Synthesegeräte umfassen. Alternativ dazu kann die PCR-Amplifikation von Gen-Fragmenten unter Verwendung von Ankerprimern durchgeführt werden, die zu komplementären Überhängen zwischen zwei aufeinander folgenden Gen-Fragmenten führen, die anschließend durch Annealing miteinander verbunden werden können und reamplifiziert werden können, um eine chimäre Gen-Sequenz zu erzeugen (siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1992)). Weiters sind viele Expressionsvektoren im Handel erhältlich, die bereits für eine Fusionsgruppierung kodieren (z.B. ein GST-Protein). Eine für ein Rezeptor-Protein kodierende Nucleinsäure kann in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, sodass die Fusionsgruppierung im Leseraster an das Rezeptor-Protein gebunden ist.
• Eine weitere Form des Fusionsproteins ist eine, die die Rezeptorfunktionen direkt beeinflusst. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung ein Rezeptor-Polypeptid, in dem eine oder mehrere der Rezeptor-Domänen (oder Teile davon) durch homologe Domänen (oder Teile davon) aus einem anderen G-proteingekoppelten Rezeptor oder einem anderen Typ eines Rezeptors ersetzt wurde(n). Dementsprechend sind verschiedene Permutationen möglich. Die aminoterminale extrazelluläre Domäne oder Subregion davon (z.B ligandbindend) kann mit der Domäne oder Subregion eines anderen ligandbindenden Rezeptorproteins ersetzt werden. Alternativ dazu kann die gesamte Transmembrandomäne oder ein beliebiges der sieben Segmente oder Schleifen oder Teile davon, z.B. G-Proteinbindung/Signalübertragung, ersetzt werden. Schließlich kann die carboxyterminale intrazelluläre Domäne oder Subregion ersetzt werden. Chimäre Rezeptoren, in denen eine oder mehrere der nativen Domänen oder Subregionen ersetzt wurden, können daher gebildet werden.
• Das isolierte Rezeptor-Protein kann von Zellen gereinigt werden, die es natürlich exprimieren, wie hierin offenbart, wie z.B. aus dem Gehirn und insbesondere aus Gliazellen, CD34⁺-Zellen und Linien, wie etwa HEK 293 und Jurkat, gereinigt von Zellen, die verändert wurden, um es zu exprimieren (rekombinant), oder unter Verwendung bekannter Proteinsyntheseverfahren synthetisiert wurden.
• In einer Ausführungsform wird das Protein mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt. Ein für das Rezeptor-Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül wird z.B. in einen Expressionsvektor kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingeführt, und das Protein wird in der Wirtszelle exprimiert. Das Protein kann dann aus den Zellen mittels eines geeigneten Reinigungsschemas unter Verwendung von Standard-Proteinreinigungsverfahren isoliert werden.
• Polypeptide enthalten oftmals andere Aminosäuren als die 20 Aminosäuren, die im Allgemeinen als die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren bezeichnet werden. Weiters können viele Aminosäuren, unter anderem die terminalen Aminosäuren, durch natürliche Verfahren, wie z.B. Bearbeitung und andere posttranslationale Modifikationen, oder durch chemische Modifikationsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, modifiziert werden. Häufige Modifikationen, die in Polypeptiden natürlich vorkommen, werden in grundlegenden Texten, ausführlichen Monographien und der Forschungsliteratur beschrieben und sind dem Fachmann wohlbekannt.
• Dementsprechend umfassen die Polypeptide auch Derivate oder Analoga, in denen ein substituierter Aminosäurerest keiner ist, für den der genetische Code kodiert, in denen eine Substituenten-Gruppe inkludiert ist, in denen das reife Polypeptid an eine andere Verbindung fusioniert ist, wie z.B. eine Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (z.B. Polyethylenglykol), oder in denen die zusätzlichen Aminosäuren an das reife Polypeptid fusioniert sind, wie z.B. eine Leader- oder Sekreti onssequenz oder eine Sequenz zur Reinigung des reifen Polypeptids oder einer Pro-Proteinsequenz.
• Bekannte Modifikationen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Bindung von Flavin, kovalente Bindung einer Hämgruppierung, kovalente Bindung eines Nucleotids oder eines Nucleotid-Derivats, kovalente Bindung eines Lipids oder eines Lipid-Derivats, kovalente Bindung von Phosphotidylinositol, Vernetzung, Zyklisierung, Disulfidbindungsbildung, Demethylierung, Bildung kovalenter Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, γ-Carboxylierung, Glykosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, lodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Bearbeitung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Addition von Aminosäuren an Proteine, wie z.B. Arginylierung und Ubiquitinierung.
• Solche Modifikationen sind dem Fachmann wohlbekannt und wurden ausführlich in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. In den grundlegendsten Texten werden beispielsweise einige besonders häufige Modifikationen, Glykosylierung, Lipid-Bindung, Sulfatierung, γ-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung, beschrieben, wie z.B. in Proteins-Structure and Molecular Properties, 2. Auflage, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993). Zahlreiche ausführliche Übersichtsartikel sind bezüglich dieses Themas erhältlich, z.B. von F. Wold, Posttranslational Covalent Modification of Proteins, 1-12, B.C. Johnson (Hrsg.), Academic Press, New York (1983); Seifter et al. (Meth. Enzymol. 182, 626-646 (1990)) und Rattan et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 663, 48-62 (1992)).
• Wie ebenso auch wohlbekannt ist, sind Polypeptide nicht immer vollkommen linear. Polypeptide können beispielsweise als Resultat einer Ubiquitinierung verzweigt sein, und sie können ringförmig sein, mit oder ohne Verzweigung, im Allgemeinen als Resultat von Ereignissen nach der Translation, unter anderem Ereignisse der natürlichen Bearbeitung und Ereignisse, die durch menschliche Manipulation ausgelöst werden und die nicht natürlich vorkommen. Ringförmige, verzweigte und verzweigte ringförmige Polypeptide können mittels nicht translationsbezogener natürlicher Vorgänge und mittels synthetischer Verfahren synthetisiert werden.
• Modifikationen können überall in einem Polypeptid auftreten, unter anderem im Peptid-Rückgrat, den Aminosäure-Seitenketten und den Amino- oder Carboxyl-Termini. Eine Blockade der Amino- oder Carboxylgruppe in einem Polypeptid oder von beiden mittels einer kovalenten Modifikation ist bei natürlich vorkommenden und synthetischen Polypeptiden häufig anzutreffen. Der aminoterminale Rest von Polypeptiden, die in E. coli vor der proteolytischen Bearbeitung hergestellt wurden, ist beispielsweise beinahe immer N-Formylmethionin.
• Die Modifikationen können eine Funktion davon sein, wie das Protein hergestellt wird. Bei rekombinanten Polypeptiden z.B. werden die Modifikationen von der posttranslationalen Modifikationsfähigkeit der Wirtszelle und den Modifikationssignalen in der Polypeptid-Aminosäuresequenz bestimmt. Dementsprechend sollte, wenn eine Glykosylierung gewünscht wird, ein Polypeptid in einem glykosylierenden Wirt, im Allgemeinen einer eukaryotischen Zelle, exprimiert werden. Insektenzellen führen oftmals dieselben posttranslationalen Glykosylierungen wie Säugetierzellen durch, und aus diesem Grund wurden Insektenzellen-Expressionssysteme entwickelt, um Säugetierproteine mit nativen Glykosylierungsmustern wirksam zu exprimieren. Ähnliche Überlegungen treffen auf andere Modifikationen zu.
• Dieselbe Art von Modifikation kann im selben oder einem variierenden Grad an verschiedenen Stellen in einem bestimmten Polypeptid vorhanden sein. Weiters kann ein bestimmtes Polypeptid mehr als eine Art der Modifikation enthalten.
• Die oben genannte Offenbarung trifft im Allgemeinen auch auf die in Seq.-ID Nr. 3 dargestellte Polypeptidsequenz zu. Prognostizierte Domänen und funktionelle Stellen sind mittels wohlbekannter und für den Fachmann leicht erhältlicher Computerprogramme leicht identifizierbar (z.B. PROSITE-Analyse).
• Polypeptid-Verwendungen
• Die Rezeptor-Polypeptide sind für die Herstellung von Antikörpern nützlich, die für das/die 15625-Rezeptor-Protein, -Regionen oder -Fragmente spezifisch sind. Regionen mit einem hohen Antigenitäts-Index-Socre werden in 1 dargestellt.
• Die Rezeptor-Polypeptide (die Varianten und Fragmente umfassen, die vor der vorliegenden Erfindung offenbart worden sein könnten) sind für biologische Tests, die sich auf GPCRs beziehen, nützlich. Solche Tests umfassen eine beliebige der bekannten GPCR-Funktionen oder -Aktivitäten oder -Eigenschaften, die für die Diagnose und Behandlung von GPCR-bezogenen Erkrankungen nützlich sind.
• Die Rezeptor-Polypeptide sind ebenso in Wirkstoffscreening-Tests, in zellbasierten oder zellfreien Systemen nützlich. Zellbasierte Systeme können nativ sein, d.h. Zellen, die das Rezeptor-Protein normalerweise exprimieren, als eine Biopsie oder in Zellkultur expandiert. In einer Ausführungsform umfassen zellbasierte Versuche jedoch rekombinante Wirtszellen, die das Rezeptor-Protein exprimieren.
• Die Polypeptide können verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Rezeptoraktivität modulieren. Sowohl das 15625-Protein als auch geeignete Varianten und Fragmente können Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz verwendet werden, um Kandidatenverbindungen auf die Fähigkeit, an den Rezeptor zu binden, zu untersuchen. Diese Verbindungen können weiters gegen einen Funktionsrezeptor gescreent werden, um die Wirkung der Verbindung auf die Aktivität des Rezeptors zu bestimmen. Es können Verbindungen identifiziert werden, die den Rezeptor bis zu einem gewünschten Grad aktivieren (Agonist) oder deaktivieren (Antagonist).
• Die Rezeptor-Polypeptide können verwendet werden, um eine Verbindung auf die Fähigkeit zu screenen, die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor-Protein und einem Zielmolekül, das normalerweise mit dem Rezeptor-Protein wechselwirkt, zu stimulieren oder zu inhibieren. Das Ziel kann ein Ligand oder eine Komponente des Signalwegs sein, mit dem/der das Rezeptor-Protein normalerweise wechselwirkt (z.B. ein G-Protein oder ein anderer wechselwirkender Stoff, der in den cAMP- oder Phosphatidylinositol-Stoffumsatz und/oder die Adenylatcyclase- oder Phospholipase-C-Aktivierung involviert ist). Der Test umfasst die Schritte des Kombinierens des Rezeptor-Proteins mit einer Kandidatenverbindung unter Bedingungen, die es dem Rezeptor-Protein oder -Fragment ermöglichen, mit dem Zielmolekül wechselzuwirken und die Bildung eines Komplexes zwischen dem Protein und dem Ziel zu detektieren oder die biochemische Konsequenz der Wechselwirkung mit dem Rezeptor-Protein und dem Ziel zu detektieren, wie z.B. eine beliebige der assoziierten Wirkungen der Signalübertragung, wie z.B. G-Protein-Phosphorylierung, cAMP- oder Phosphatidylinositol-Stoffumsatz und Adenylatcyclase- oder Phospholipase-C-Aktivierung.
• Kandidatenverbindungen umfassen z.B. 1) Peptide, wie z.B. lösliche Peptide, unter anderem Ig-schwänzige Fusionspeptide und Mitglieder von Zufalls-Peptidbibliotheken (siehe z.B. Lam et al., Nature 354, 82-84 (1991); Houghten et al., Nature 354, 84-86 (1991)) und mittels Chemie hergeleiteten kombinatorischen Molekülbibliotheken, die aus Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfiguration bestehen; 2) Phosphopeptide (z.B. Mitglieder von zufällig ausgewählten und teilweise degenerierten, gerichteten Phosphopeptid-Bibliotheken, siehe z.B. Songyang et al., Cell 72, 767-778 (1993)); 3) Antikörper (z.B. polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimäre und Einzelketten-Antikörper sowie Fab, F(ab')₂, Fab-Expressionsbibliothek-Fragmente und epitopbindende Fragmente von Antikörpern); und 4) kleine organische und anorganische Moleküle (z.B. Moleküle, die aus kombinatorischen und natürlichen Produktbibliotheken erhalten wurden).
• Eine Kandidatenverbindung ist ein löslicher Rezeptor voller Länge oder ein Fragment, der/das um die Ligandbindung konkurriert. Andere Kandidatenverbindungen umfassen Mutantenrezeptoren oder geeignete Fragmente, die Mutationen enthalten, die die Rezeptorfunktion beeinflussen und daher um den Liganden konkurrieren. Dementsprechend umfasst die Erfindung ein Fragment, das um einen Liganden konkurriert, z.B. mit einer höheren Affinität, oder ein Fragment, das einen Liganden bindet, jedoch dessen Freisetzung nicht ermöglicht.
• Die Erfindung stellt andere Endpunkte bereit, um Verbindungen zu identifizieren, die die Rezeptor-Aktivität modulieren (stimulieren oder inhibieren). Die Tests involvieren typischerweise einen Test der Vorkommnisse im Signalübertragungsweg, die die Rezeptor-Aktivität anzeigen. Die Expression von Genen, die als Reaktion auf die vom Rezeptor-Protein abhängige Signalkaskade hinauf- oder hinunterreguliert werden, kann daher getestet werden. In einer Ausführungsform kann die Regulationsregion solcher Gene operabel an einen Marker gebunden sein, der leicht detektierbar ist, wie z.B. Luciferase. Alternativ dazu könnte auch die Phosphorylierung des Rezeptor-Proteins oder eines Rezeptor-Protein-Ziels gemessen werden.
• Jede der biologischen oder biochemischen Funktionen, die vom Rezeptor vermittelt werden, kann als Endpunkttest verwendet werden. Diese umfassen alle der hierin beschriebenen biochemischen oder biochemisch/biologischen Vorkommnisse sowie andere Funktionen, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
• Bindende und/oder aktivierende Verbindungen können ebenso unter Verwendung chimärer Rezeptor-Proteine gescreent werden, in denen die aminoterminale extrazelluläre Domäne oder Teile davon, die gesamte Transmembrandomäne oder Subregionen, wie z.B. ein beliebiges der sieben Transmembransegmente oder eine beliebige der intrazellulären oder extrazellulären Schleifen, und die carboxyterminale intrazelluläre Domäne oder Teile davon durch heterologe Domänen oder Subregionen ersetzt sein können. Es kann z.B. eine G-Protein-bindende Region verwendet werden, die mit einem anderen G-Protein wechselwirkt als jenem, das vom nativen Rezeptor erkannt wird. Dementsprechend ist ein anderes Set an Signalübertragungskomponenten als Endpunkttest für die Aktivierung erhältlich. Alternativ dazu kann/können der/die gesamte(n) Transmembran-Teil oder -Subregionen (wie z.B. Transmembransegmente oder intrazelluläre oder extrazelluläre Schleifen) mit dem/den gesamten Transmembran-Teil oder -Subregionen ersetzt werden, der/die für eine Wirtszelle spezifisch ist/sind, die sich von der Wirtszelle unterscheidet, aus der die aminoterminale extrazelluläre Domäne und/oder die G-Protein-bindende Region stammen. Dies ermöglicht die Durchführung von Tests in anderen als den spezifischen Wirtszellen, von denen der Rezeptor stammt. Alternativ dazu könnte die ami noterminale extrazelluläre Domäne (und/oder andere ligandbindende Regionen) durch eine Domäne ersetzt werden (und/oder eine andere bindende Region), die einen anderen Liganden bindet, wodurch ein Test für Testverbindungen bereitgestellt wird, die mit der heterologen aminoterminalen extrazellulären Domäne (oder Region) wechselwirken, jedoch trotzdem zu einer Signalübertragung führen. Schließlich kann die Aktivierung durch ein Reportergen detektiert werden, das eine leicht detektierbare kodierende Region enthält, die operabel an eine Transkriptions-Regulationssequenz gebunden ist, die Teil des nativen Signalübertragungswegs ist.
• Die Rezeptor-Polypeptide sind ebenso in Wettbewerbs-Bindungstests bei Verfahren nützlich, die kreiert wurden, um Verbindungen zu entdecken, die mit dem Rezeptor wechselwirken. Eine Verbindung wird daher gegenüber einem Rezeptor-Polypeptid unter Bedingungen ausgesetzt, die es der Verbindung ermöglichen, an das Polypeptid zu binden oder auf andere Weise mit diesem wechselzuwirken. Lösliches Rezeptor-Polypeptid wird zu dem Gemisch ebenso hinzugefügt. Falls die Testverbindung mit dem löslichen Rezeptor-Polypeptid wechselwirkt, so verringert es die Menge des gebildeten Komplexes oder die Aktivität aus dem Rezeptor-Ziel. Dieser Typ Test ist besonders in Fällen nützlich, in denen Verbindungen gesucht werden, die mit spezifischen Regionen des Rezeptors wechselwirken. Das lösliche Polypeptid, das mit der Ziel-Rezeptorregion konkurriert, wird daher so kreiert, dass es Peptidsequenzen enthält, die der Region von Interesse entsprechen.
• Um zellfreie Wirkstoffscreening-Tests durchzuführen, ist es wünschenswert, entweder das Rezeptor-Protein oder -Fragment oder dessen Ziel-Molekül zu immobilisieren, um die Trennung von Komplexen von nicht komplexartigen Formen eines oder beider der Proteine zu erleichtern sowie um eine Automatisierung des Tests zu ermöglichen.
• Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrizen können in den Wirkstoffscreening-Tests verwendet werden. In einer Ausführungsform kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die es dem Protein ermöglicht, an eine Matrix gebunden zu werden. So können z.B. Glutathion-S-Transferase/15625- Fusionsproteine auf Glutathion-Sepharose-Perlen (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierten Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die anschließend mit den Zelllysaten (z.B. ³⁵S-markiert) und der Kandidatenverbindung kombiniert werden, wonach das Gemisch unter Bedingungen inkubiert wird, die der Komplexbildung förderlich sind (z.B. unter physiologischen Bedingungen für Salz und pH). Nach der Inkubation werden die Perlen gewaschen, um jegliche ungebundene Markierung zu entfernen, und die Matrix wird immobilisiert, und die Radiomarkierung wird direkt oder im Überstand bestimmt, nachdem die Komplexe dissoziiert sind. Alternativ dazu können die Komplexe von der Matrix dissoziiert werden, mittels SDS-PAGE getrennt werden, und der Spiegel an rezeptorbindendem Protein, der im Perlenteil zu finden ist, kann aus dem Gel mittels Standard-Elektrophoreseverfahren quantifiziert werden. Es können z.B. entweder das Polypeptid oder dessen Ziel-Molekül unter Verwendung einer Konjugation von Biotin und Streptavidin mittels auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannter Verfahren immobilisiert werden. Alternativ dazu können Antikörper, die mit dem Protein reagieren, jedoch die Bindung des Proteins an dessen Ziel-Molekül nicht stören, an die Wells der Platte derivatisiert werden, und das Protein kann in den Wells mittels einer Antikörper-Konjugation gefangen werden. Präparate eines rezeptorbindenden Proteins und einer Kandidatenverbindung werden in den Wells mit Rezeptor-Protein inkubiert, und die Menge an im Well gefangenem Komplex kann quantifiziert werden. Verfahren zur Detektion solcher Komplexe, zusätzlich zu jenen, die oben stehend für die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden, umfassen die Immundetektion von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die mit dem Rezeptorprotein-Zielmolekül reagieren oder die mit dem Rezeptor-Protein reagieren und mit dem Ziel-Molekül konkurrieren, sowie enzymgebundene Tests, die darauf basieren, eine enzymatische Aktivität zu detektieren, die mit dem Ziel-Molekül assoziiert wird.
• Modulatoren der gemäß diesen Wirkstoffscreening-Tests identifizierten Rezeptor-Protein-Aktivität können verwendet werden, um ein Individuum mit einer rezeptorweg-vermittelten Erkrankung zu behandeln, und zwar durch die Behandlung von Zellen, die das 15625-Protein exprimieren, wie z.B. im Gehirn, insbesondere Gliazellen, Knochenmark-CD34⁺-Zellen, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Mega karyozyten, ruhende B-Lymphozyten und Skelettmuskeln. Andere Gewebe umfassen Lymphknoten, Milz, Herz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Granulozyten, Plazenta, Pankreas und Erythroblasten. Diese Behandlungsverfahren umfassen die Schritte der Verabreichung der Proteinaktivitäts-Modulatoren in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie sie hierin beschrieben wird, an ein Individuum, das eine solche Behandlung benötigt.
• Erkrankungen, die die Milz involvieren, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Splenomegalie, unter anderem nicht spezifische akute Splenitis, kongestive Splenomegalie und Milzinfarkte; Neoplasmen, angeborene Anomalien und Ruptur. Erkrankungen, die mit Splenomegalie assoziiert sind, umfassen Infektionen, wie z.B. nicht spezifische Splenitits, Mononucleosis infectiosa, Tuberkulose, Bauchtyphus, Brucellose, Zytomegalie-Virus, Syphilis, Malaria, Histoplasmose, Toxoplasmose, Kala-Azar, Trypanosomiasis, Schistosomiasis, Leishmaniase, Echinokokkose; kongestive Zustände, die mit partieller Hypertonie in Zusammenhang stehen, wie z.B. Zirrhose der Leber, Pfortaderthrombose oder Milzvenenthrombose sowie Herzversagen; lymphohämatogene Erkrankungen, wie z.B. Hodgkin-Krankheit, Non-Hodgkin-Lymphome/Leukämie, multiples Myelom, myeloproliferative Syndrome, hämolytische Anämien und thrombozytopenische Purpura; immunologisch-entzündliche Zustände, wie z.B. rheumatoide Arthritis und systemischer Lupus Erythematodes; Speicherkrankheiten, wie z.B. Gaucher-Krankheit, Niemann-Pick-Krankheit und Mucopolysaccharidosen; sowie andere Erkrankungen, wie z.B. Amyloidose, primäre Neoplasmen und Zysten und sekundäre Neoplasmen.
• Erkrankungen, die den Kolon involvieren, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, angeborene Anomalien, wie z.B. Atresia und Stenose, Meckel-Divertikel, angeborene aganglionäre Megakolon-Hirschsprung-Krankheit, Enterokolitis, wie z.B. Diarrhö und Dysenteria, infektiöse Enterokolitis, unter anderem virale Gastroenteritis, bakterielle Enterokolitis, Necrotisierende Enterokolitis, mit Antibiotika assoziierte Kolitis (Pseudomembranöse Kolitis) und kollagenöse und lymphozytische Kolitis, verschiedene Entzündungserkrankungen des Darms, unter anderem Parasiten und Protozoen, Erworbenes Immunschwäche-Syndrom, Transplantation, durch Wirkstoffe induzierte Darmverletzungen, Bestrahlungsenterokolitis, neutropenische Kolitis (Typhlitis) und Diversionskolitis; idiopathische entzündliche Darmerkrankung, wie z.B. Crohn-Krankheit und Colitis ulcerosa; Tumoren des Kolon, wie z.B. nicht neoplastische Polypen, Adenome, Familien-Syndrome, kolorektale Karzinogenese, kolorektales Karzinom und karzinoide Tumoren.
• Erkrankungen, die die Leber involvieren, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Leberverletzung; Gelbsucht und Cholestase, wie z.B. Bilirubin- und Gallenbildung; Leberversagen und Zirrhose, wie z.B. Zirrhose, portale Hypertonie, unter anderem Aszites, portosystemische Shunts und Splenomegalie; infektiöse Erkrankungen, wie z.B. virale Hepatitis, unter anderem Hepatitis-A-E-Infektion und Infektion durch andere Hepatitis-Viren, klinisch-pathologische Syndrome, wie z.B. Carrier-Zustand, asymptomatische Infektion, akute virale Hepatitis, chronische virale Hepatitis und Hepatitis fulminante; Autoimmun-Hepatitis; Wirkstoff- und Toxin-induzierte Lebererkrankung, wie z.B. alkoholbedingte Lebererkrankung; angeborene Störungen des Metabolismus und pädiatrische Lebererkrankung, wie z.B. Hämochromatose, Wilson-Krankheit, a₁-Antitrypsin-Defizienz und neonatale Hepatitis; intrahepatische Gallentrakterkrankung, wie z.B. sekundäre Gallenzirrhose, primäre Gallenzirrhose, primär sklerosierende Cholangitis und Anomalien des Gallenbaums; Zirkulationsstörungen, wie z.B. gestörter Blutfluss in die Leber, unter anderem eine Beeinträchtigung der Arteria hepatica und Pfortaderobstrukion und -thrombose, gestörter Blutfluss durch die Leber, unter anderem passive Kongestion und zentrilobuläre Nekrose und Hepatis peliosis, Obstruktion des Ausflusses aus der Lebervene, unter anderem Lebervenenthrombose (Budd-Chiari-Syndrom) und Venenverschlusserkrankung, mit einer Schwangerschaft assoziierte Lebererkrankung, wie z.B. Präeklampsie und Eklampsie, akute Fettleber in der Schwangerschaft und intrahepatische Cholestase in der Schwangerschaft, Leberkomplikationen bei Organ- oder Knochenmarkstransplantation, wie z.B. Wirkstofftoxizität nach Knochenmarkstransplantation, Graftversus-Host-Erkrankung und Leberabstoßung sowie nicht immunologische Schädigung von Leberallotransplantaten; Tumoren und tumoröse Leiden, wie z.B. noduläre Hyperplasien, Adenome und maligne Tumoren, unter anderem primäres Karzinom der Leber und Metastasentumoren.
• Erkrankungen, die das Gehirn involvieren, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Erkrankungen, bei denen Neuronen involviert sind, und Erkrankungen, bei denen Glia, wie z.B. Astrozyten, Oligodendrozyten, Ependymzellen und Mikroglia, involviert sind, Hirnödem, erhöhter intrakranieller Druck und Herniation und Hydrocephalus, Missbildungen und Entwicklungskrankheiten, wie z.B. Neuralrohrdefekte, Prosenzephalonanomalien, Anomalien der Fossa posterior und Syringomyelie und Hydromyelie, perinatales Hirntrauma, zerebrovaskuläre Erkrankungen, wie z.B. jene in Zusammenhang mit Hypoxie, Ischämie und Infarkt, unter anderem Hypotonie, Hypoperfusion und Low-Flow-Zustände – globale zerebrale Ischämie und fokale zerebrale Ischämie -, Infarkt aufgrund von Obstruktion der lokalen Blutversorgung, intrakranielle Blutung, unter anderem intrazerebrale (intraparenchymale) Blutung, Subarachnoidalblutung und gerissene Beerenaneurysmen sowie vaskuläre Missbildungen, hypertonische zerebrovaskuläre Erkrankung, unter anderem lakunäre Infarkte, Slit-Blutungen und Hypertensionsenzephalopathie; Infektionen, wie z.B. akute Meningitis, unter anderem akute pyogene (bakterielle) Meningitis und akute aseptische (virale) Meningitis, akute fokale suppurative Infektionen, unter anderem Gehirnabszess, subdurales Empyem und extraduraler Abszess, chronische bakterielle Meningoenzephalitis, unter anderem Tuberkulose und Mycobakteriosen, Neurosyphilis und Neuroborreliose (Lyme-Krankheit), virale Meningoenzephalitis, unter anderem durch Arboviren induzierte virale Enzephalitis, Herpes-Simplex-Virus Typ 1, Herpes-Simplex-Virus Typ 2, Varicella-Zoster-Virus (Herpes Zoster), Zytomegalie-Virus, Poliomyelitis, Tollwut und menschliches Immunschwäche-Virus 1, unter anderem HIV-1-Meningoenzephalitis (subakute Enzephalitis), vakuoläre Myelopathie, mit AIDS assoziierte Myopathie, periphere Neuropathie und AIDS bei Kindern, progressive multifokale Leukoenzephalopathie, subakute sklerosierende Panenzephalitis, fungale Meningoenzephalitis, andere Infektionskrankheiten des Nervensystems, übertragbare spongiforme Enzephalopathien (Prionenkrankheiten), Entmarkungskrankheiten, unter anderem Multiple Sklerose, Varianten der Multiplen Sklerose, akute disseminierte Enzephalomyelitis und akute nekrotisierende hämorrhagische Encephalomyelitis und andere Erkrankungen mit Demyelinisierung; degenerative Erkrankungen, wie z.B. degenerative Erkrankungen, die die Großhirnrinde beeinträchtigen, unter anderem Alzheimer-Krankheit und Pick-Krankheit, degenerative Erkrankungen der Basal ganglien und des Hirnstamms, unter anderem Parkinsonismus, idiopathische Parkinson-Krankheit (Paralysis agitans), progressive supranukleäre Lähmung, kortikobasale Degeneration, Multisystematrophie, unter anderem striatonigrale Degeneration, Shy-Drager-Syndrom und olivopontozerebellare Atrophie und Huntington-Krankheit; spinozerebellare Degenerationen, unter anderem spinozerebellare Ataxien, unter anderem Friedreich-Ataxie und Ataxia teleangiectatica, degenerative Erkrankungen, die Motoneuronen betreffen, unter anderem amyotrophische Lateralsklerose (Erkrankung der Motoneuronen), bulbospinale Muskelatrophie (Kennedy-Syndrom) und spinale Muskelatrophie; angeborene Stoffwechselstörungen, wie z.B. Leukodystrophien, unter anderem Krabbe-Krankheit, metachromatische Leukodystrophie, Adrenoleukodystrophie, Pelizaeus-Merzbacher-Krankheit und Canavan-Krankheit, mitochondriale Enzephalomyopathien, unter anderem Leigh-Krankheit und andere Mitochondrienenzephalomyopathien; toxische und erworbene Stoffwechselerkrankungen, unter anderem Vitaminmängel, wie z.B. Thiaminmangel (Vitamin-B₁-Mangel) und Vitamin-B₁₂-Mangel, neurologische Folgekrankheiten von Stoffwechselstörungen, unter anderem Hypoglykämie, Hyperglykämie und Encephalopathia hepatica, toxische Störungen, unter anderem Kohlenmonoxid, Methanol, Ethanol und Strahlung, unter anderem kombiniertes Methotrexat und durch Strahlung induzierte Verletzungen; Tumoren, wie z.B. Gliome, unter anderem Astrozytome, unter anderem fibrilläres (diffuses) Astrozytom und Glioblastoma multiforme, pilozytische Astrozytome, pleomorphes Xanthoastrozytom und Hirnstammgliom, Oligodendrogliom und Ependymom und verwandte paraventrikuläre Massenläsionen, neuronale Tumoren, kaum differenzierte Neoplasmen, einschließlich Medulloblastom, andere Parenchymtumoren, unter anderem primäres Hirnlymphom, Keimzellentumoren und Pinealparenchymtumoren, Meningiome, metastatische Tumoren, paraneoplastische Syndrome, periphere Nervenscheidentumoren, unter anderem Schwannome, Neurofibrom und bösartiger peripherer Nervenscheidentumor (bösartiges Schwannom), und neurokutane Syndrome (Phakomatosen), unter anderem Neurofibromatose, unter anderem Typ-1-Neurofibromatose (NF1) und Typ-2-Neurofibromatose (NF2), tuberöse Sklerose und Von-Hippel-Lindau-Syndrom.
• Erkrankungen, die T-Zellen involvieren, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, zellvermittelte Hypersensibilität, wie z.B. „Delayed Type Hypersensitivity" (DTH) und T-zellvermittelte Zytotoxizität und Transplantatabstoßung; Autoimmunerkrankungen, wie z.B. systemischer Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, systemische Sklerose, entzündliche Myopathien, gemischte Bindegewebekrankheit und Polyarteritis nodosa und andere Vasculitides; immunologische Defizienz-Syndrome, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, primäre Immundefizienzen, wie z.B. Thymushypoplasie, schwerwiegende kombinierte Immundefizienzerkrankungen und AIDS; Leukopenie; reaktive (entzündliche) Proliferationen der weißen Blutkörperchen, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Leukozytose, akute nicht spezifische Lymphadenitis und chronische nicht spezifische Lymphadenitis; neoplastische Proliferationen der weißen Blutkörperchen, unter anderem, jedoch nicht eigneschränkt auf, lymphoide Neoplasmen, wie z.B. Vorläufer-T-Zellen-Neoplasmen, wie z.B. akute Lymphoblastenleukämie/Lymphom, periphere T-Zellen- und natürliche-Killer-Zellen-Neoplasmen, die periphere T-Zellen-Lymphome umfassen, unspezifizierte T-Zellen-Leukämie/Lymphome bei Erwachsenen, Mycosis fungoides und Sezary-Syndrom und Hodgkin-Krankheit.
• In normalem Knochenmark machen die Myelozytenreihen (polymorphkernige Zellen) etwa 60 % der Zellelemente aus und die Erythrozytenreihen 20-30 %. Lymphozyten, Monozyten, Retikulumzellen, Plasmazellen und Megakaryozyten machen gemeinsam 10-20 % aus. Lymphozyten machen 5-15 % des normalen Knochenmarks bei Erwachsenen aus. Im Knochenmark werden Zelltypen hinzugefügt, sodass die Vorläufer von roten Blutkörperchen (Erythroblasten), Makrophagen (Monoblasten), Plättchen (Megakaryozyten), polymorphkernigen Leukozyten (Myeloblasten) und Lymphozyten (Lymphoblasten) in einem mikroskopischen Feld sichtbar sind. Zusätzlich existieren Stammzellen für die verschiedenen Zelllinien sowie eine Vorläufer-Stammzelle für die geprägten Vorläuferzellen der verschiedenen Linien. Die verschiedenen Arten von Zellen und Stufen jeder Art sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung für gewöhnlich bekannt und z.B. auf Seite 42 (2-8) von Sell et al., Simon und Schuster, Immunology, Imunopathology and Immunity, 5. Auflage (1996), zu finden, wo Lehren über Zelltypen, die im Knochenmark zu finden sind, offenbart werden. Demzufolge ist die Erfindung auf Erkrankungen ausgerichtet, die durch diese Zellen ausgelöst werden. Diese Erkrankungen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Folgende: Erkrankungen, die hämatopoetische Stammzellen umfassen; geprägte lymphoide Vorläuferzellen; lymphoide Zellen, unter anderem B- und T-Zellen; geprägte myeloide Vorläufer, unter anderem Monozyten, Granulozyten und Megakaryozyten; sowie geprägte erythroide Vorläufer. Diese umfassen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt, die Leukämien, unter anderem B-lymphoide Leukämien, T-lymphoide Leukämien, undifferenzierte Leukämien; Erythroleukämie, Megakaryoblastenleukämie, monozytische Leukämien sind mit und ohne Differenzierung aufgenommen; chronische und akute Lymphoblastenleukämie, chronische und akute Lymphozytenleukämie, chronische und akute myelogene Leukämie, Lymphom, myelodysplastisches Syndrom, chronische und akute myeloide Leukämie, myelomonozytäre Leukämie; chronische und akute Myeloblastenleukämie, chronische und akute myelogene Leukämie, chronische und akute Promyelozytenleukämie, chronische und akute myelozytische Leukämie, hämatologische Malignitäten einer Monozyten-Makrophagenlinie, wie z.B. jugendliche chronische myelogene Leukämie; sekundäre AML, hämatologische Vorläufererkrankung; hartnäckige Anämie, aplastische Anämie; reaktive kutane Angioendotheliomatose; fibrosierende Erkrankungen, die eine geänderte Expression in dendritischen Zellen involvieren, Erkrankungen, umfassend systemische Sklerose, E-M-Syndrom, epidemisches toxisches Öl-Syndrom, eosinophile Fasziitis, lokalisierte Formen von Sklerodermie, Keloid und fibrosierende Kolonopathie, angiomatöses malignes Fibrohistiozytom; Karzinom, unter anderem primäres Kopf- und Nacken-Plattenepithelkarzinom; Sarkom, unter anderem Kaposi-Sarkom; Fibroadenom und Phylloidestumoren, unter anderem Mammafibroadenom; Stromatumoren; Phylloidestumoren, unter anderem Histiozytom; Erythroblastose; Neurofibromatose; Erkrankungen des Gefäßendothels; Entmarkung, besonders bei alten Läsionen; Gliose, vasogenes Ödem, Gefäßerkrankung, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit; T-Zellen-Lymphome; B-Zellen-Lymphome.
• Erkrankungen, die das Herz involvieren, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Herzversagen, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Herzhypertrophie, linksseitiges Herzversagen und rechtsseitiges Herzversagen; ischämische Herzerkrankung, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Angina pectoris, Myokardinfarkt, chronische ischämische Herzerkrankung und plötzlicher Herztod; hypertensive Herzerkrankung, unter anderem, jedoch nicht eingeschänkt auf, systemische (linksseitige) hypertensive Herzerkrankung und pulmonale (rechtseitige) hypertensive Herzerkrankung; Herzklappenerkrankung, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Herzklappendegeneration, verursacht durch Kalzifizierung, wie z.B. kalzifizierte Aortenstenose, Kalzifizierung einer angeborenen Bikuspidaortenklappe und Mitralannularkalzifizierung und myxomatöse Degeneration der Mitralklappe (Mitralklappenprolaps), rheumatisches Fieber und rheumatische Herzerkrankung, infektiöse Endokarditis und nichtinfizierte Vegetationen, wie z.B. nicht bakterielle thrombotische Endokarditis und Endokarditis des systemischen Lupus erythematodes (Libman-Sacks-Syndrom), karzinoide Herzerkrankung und Komplikationen der künstlichen Klappen; Myokarderkrankung, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, dilatierte Kardiomyopathie, hypertrophische Kardiomyopathie, restriktive Kardiomyopathie und Myocarditis; Perikarderkrankung, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Perikarderguss und Hämoperikard und Perikarditis, unter anderem akute Perikarditis und geheilte Perikarditis und rheumatische Herzerkrankung; neoplastische Herzerkrankung, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, primäre Herztumoren, wie z.B. Myxom, Lipom, Papillarfibroelastom, Rhabdomyom und Sarkom und Herzwirkungen von nicht kardialen Neoplasmen; angeborene Herzerkrankung, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Links-Rechts-Shunts – späte Zyanose, wie z.B. Vorhofseptumdefekt, Kammerseptumdefekt, Ductus arteriosus apertus und atrioventrikulärer Septumdefekt, Rechts-Links-Shunts-, frühe Zyanose, wie z.B. Fallot-Tetralogie, Transposition großer Arterien, Truncus arteriosus, Trikuspidalatresie und totale Anomalie der Lungenvenenverbindung, obstruktive angeborene Anomalien, wie z.B. Koarktation der Aorta, Lungenstenose und -Atresie und Aortenstenose und -Atresie und Erkrankungen, bei denen eine Herztransplantation erforderlich ist.
• Erkrankungen, die rote Blutkörperchen involvieren, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Anämien, wie z.B. hämolytische Anämien, unter anderem erbliche Sphärozytose, hämolytische Erkrankungen aufgrund von Erythrozytenenzymdefek ten: Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Sichelzellenerkrankung, Thalassämie-Syndrome, paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie, immunhämolytische Anämie und hämolytische Anämie, die aus einem Trauma in roten Blutkörperchen resultiert; sowie Anämien verringerter Erythropoese, unter anderem Megaloblastenanämien, wie z.B. Anämien durch Vitamin-B12-Mangel: perniziöse Anämie und Anämie aufgrund von Folatmangel, Eisenmangelanämie, Anämie bei chronischen Erkrankungen, aplastische Anämie, Erythroblastoaplasie und andere Formen von Markversagen.
• Erkrankungen, die den Thymus involvieren, umfassen Entwicklungsstörungen, wie z.B. DiGeorge-Syndrom mit Thymushypoplasie oder -aplasie; Thymuszysten; Thymushypoplasie, die das Auftreten von lymphoiden Follikeln im Thymus umfasst, wodurch follikuläre Thymushyperplasie entsteht; Thymome, unter anderem, Keimzellentumoren, Lymphome, Hodgkin-Erkrankung und Karzinoide. Thymome können gutartige oder eingekapselte Thymome umfassen sowie bösartige Thymome vom Typ I (invasives Thymom) oder vom Typ II, genannt Thymuskarzinom.
• Erkrankungen, die B-Zellen involvieren, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Vorläufer-B-Zellen-Neoplasmen, wie z.B. Lymphoblastenleukämie/-Lymphom. Periphere B-Zellen-Neoplasmen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, chronische lymphozytische Leukämie/kleines lymphozytisches Lymphom, follikuläres Lymphom, diffuses großes B-Zellen-Lymphom, Burkitt-Lymphom, Plasmazellen-Neoplasmen, multiples Myelom und verwandte Einheiten, lymphoplasmozytisches Lymphom (Waldenstrom-Makroglobulinämie), Mantelzellen-Lymphom, Marginalzonen-Lymphom (MALToma) und Haarzellenleulämie.
• Erkrankungen, die die Skelettmuskeln involvieren, umfassen Tumoren, wie z.B. das Rhabdomyosarkom.
• Erkrankungen, die das Pankreas involvieren, umfassen jene des exokrinen Pankreas, wie z.B. angeborene Anomalien, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, ektopische Pankreas; Pankreatitis, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, akute Pankreatitis; Zysten, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Pseudozysten; Tumoren, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, zystische Tumoren und Karzinome des Pankreas; und Erkrankungen des endokrinen Pankreas, wie z.B. Diabetes Mellitus; Inselzellentumoren, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Insulinome, Gastrinome und andere seltene Inselzellentumoren.
• Erkrankungen, die mit einer reduzierten Plättchenanzahl in Verbindung stehen, Thrombozytopenie, umfassen idiopathische Thrombozytopenie purpura, unter anderem akute idiopathische Thrombozytopenie purpura, wirkstoffinduzierte Thrombozytopenie, HIV-assoziierte Thrombozytopenie und thrombotische Mikroangiopathien: thrombotische Thrombozytopenie purpura und hämolytisch-urämisches Syndrom.
• Erkrankungen, die Vorläufer-T-Zellen-Neoplasmen involvieren, umfassen Vorläufer-T-Lymphoblastenleukämie/-Lymphom. Erkrankungen, die periphere T-Zellen- und natürliche-Killer-Zellen-Neoplasmen involvieren, umfassen chronische lymphozytische T-Zellen-Leukämie, „Large Granular Lymphocytic Leukemia" (LGL-Leukämie), Mycosis fungoides und Sezary-Syndrom, peripheres T-Zellen-Lymphom, unspezifiziertes angioimmunoblastisches T-Zellen-Lymphom, angiozentrisches Lymphom (NK/T-Zellen-Lymphom^4a), intestinales T-Zellen-Lymphom, T-Zellen-Leukämie/Lymphom bei Erwachsenen und anaplastisches Large-Cell-Lymphom.
• Das Gen wird in signifikantem Ausmaß in allen von den Erfindern analysierten Blutzellen-Vorläufern exprimiert. Es wird hochgradig in Knochenmark (CD34⁺), G-CSF-mobilisiertem peripheren Blut (das zirkulierende Vorläufer enthält, die aus Knochenmark stammen) und Nabelschnurblut-Vorläufern exprimiert. Dementsprechend ist die Expression des Gens für die Behandlung von Krankheiten relevant, die mit der Bildung differenzierter und/oder reifer Blutzellen assoziiert sind. In dieser Hinsicht umfassen Erkrankungen, die besonders relevant sind, Anämie, Neutropenie und Thrombozytopenie.
• Die Rezeptor-Polypeptide sind ebenso nützlich, um ein Ziel für die Diagnose einer Krankheit oder Veranlagung zu einer Krankheit bereitzustellen, die durch das Rezep tor-Protein vermittelt wird, wie dies bezüglich der Behandlung oben stehend diskutiert wird, besonders in Gehirn-(insbesondere Gliazellen) und Knochenmark-CD34⁺-Zellen, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Megakaryozyten, und ebenso in Herz, Plazenta, Pankreas, ruhenden B-Lymphozyten, Skelettmuskeln, Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Granulozyten und Erythroblasten. Dementsprechend werden Verfahren zur Detektion der Gegenwart oder des Spiegels des Rezeptor-Proteins in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren einer biologischen Probe mit einer Verbindung, die in der Lage ist, mit dem Rezeptor-Protein wechselzuwirken, sodass die Wechselwirkung detektiert werden kann.
• Ein Agens zur Detektion des Rezeptor-Proteins ist ein Antikörper, der in der Lage ist, selektiv an ein Rezeptor-Protein zu binden. Eine biologische Probe umfasst Gewebe, Zellen und biologische Flüssigkeiten, die aus einem Individuum isoliert wurden, sowie Gewebe, Zellen und Flüssigkeiten, die in einem Individuum vorhanden sind.
• Das Rezeptor-Protein stellt ebenso ein Ziel für die Diagnose einer aktiven Erkrankung oder einer Veranlagung zu einer Erkrankung in einem Patienten mit einer Variante eines Rezeptor-Proteins bereit. Das Rezeptor-Protein kann daher aus einer biologischen Probe isoliert werden, auf die Gegenwart einer genetischen Mutation getestet werden, die zu einem abnormalen Rezeptor-Protein führt. Dies umfasst die Substitution, Deletion, Insertion, Neuanordnung von Aminosäuren (als Resultat von abnormalen Spleiß-Vorkommnissen) sowie die ungeeignete posttranslationale Modifikation. Analytische Verfahren umfassen eine veränderte elektrophoretische Mobilität, einen veränderten tryptischen Peptid-Verdau, eine veränderte Rezeptor-Aktivität in zellbasierten oder zellfreien Tests, eine Veränderung der Ligand- oder Antikörper-Bindungsmuster, einen veränderten isoelektrischen Punkt, direkte Aminosäuresequenzierung und jedes weitere der bekannten Testverfahren, das zur Detektion von Mutationen in einem Protein nützlich ist.
• In-vitro-Verfahren zur Detektion des Rezeptor-Proteins umfassen enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmungen (ELISAs), Western-Blot-Tests, Immunpräzipitatio nen und Immunfluoreszenz. Alternativ dazu kann das Protein in vivo in einem Individuum durch Einführen eines markierten Anti-Rezeptor-Antikörpers in das Individuum detektiert werden. Der Antikörper kann z.B. mit einem radioaktiven Marker markiert werden, dessen Gegenwart und Aufenthaltsort in einem Individuum durch Standard-Bildverfahren detektiert werden kann. Verfahren, die die Allelvariante eines Rezeptor-Proteins detektieren, das in einem Individuum exprimiert wird, sowie Verfahren, die Fragmente eines Rezeptor-Proteins in einer Probe detektieren, sind besonders nützlich.
• Die Rezeptor-Polypeptide sind ebenso in pharmakogenomischen Analysen nützlich. Pharmakogenomische Analysen beschäftigen sich mit klinisch signifikanten erblichen Variationen als Reaktion auf Wirkstoffe aufgrund einer veränderten Wirkstoffdisposition und einer abnormalen Wirkung bei den betroffenen Personen. Siehe z.B. M. Eichelbaum, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-11), 983-985 (1996), und M.W. Linder, Clin. Chem. 43 (2), 254-266 (1997). Die klinischen Ergebnisse dieser Variationen führen zu einer schwerwiegenden Toxizität der therapeutischen Wirkstoffe bei gewissen Individuen oder dem therapeutischen Versagen von Wirkstoffen bei gewissen Individuen als Resultat einer individuellen Variation des Metabolismus. Der Genotyp des Individuums kann daher die Wirkung einer therapeutischen Verbindung auf den Körper oder die Art der Metabolisierung durch den Körper bestimmen. Weiters beeinflusst die Aktivität der wirkstoffmetabolisierenden Enzyme sowohl die Intensität als auch die Dauer der Wirkstoff-Wirkung. Die pharmakogenomische Disposition des Individuums ermöglicht die Selektion wirksamer Verbindungen und wirksamer Dosierungen solcher Verbindungen für eine prophylaktische oder therapeutische Behandlung, basierend auf dem Genotyp des Individuums. Die Entdeckung genetischer Polymorphismen in einigen wirkstoffmetabolisierenden Enzymen erklärte, warum bei einigen Patienten die erwarteten Wirkstoff-Wirkungen nicht auftreten, bei ihnen eine verstärkte Wirkstoff-Wirkung zu beobachten ist oder sie bei Standard-Wirkstoffdosierungen unter schwerwiegender Toxizität leiden. Polymorphismen können im Phänotyp des extensiv metabolisierenden Stoffs und im Phänotyp des schwach metabolisierenden Stoffs exprimiert werden. Dementsprechend kann genetischer Polymorphismus zu Allelproteinvarianten des Rezeptor-Proteins führen, in denen eine oder mehrere der Rezeptor-Funktionen in einer Population sich von jenen in einer anderen Population unterscheidet/unterscheiden. Die Polypeptide ermöglichen es daher einem Ziel, eine genetische Prädisposition sicherzustellen, die die Behandlungsmodalität beeinflussen kann. In einer ligandbasierten Behandlung kann Polymorphismus daher zu aminoterminalen extrazellulären Domänen und/oder anderen ligandbindenden Regionen führen, die mehr oder weniger aktiv in der Ligandbindung und der Rezeptor-Aktivierung sind. Dementsprechend würde die Liganddosierung notwendigerweise modifiziert werden, um die therapeutische Wirkung in einer bestimmten Population, die einen Polymorphismus enthält, zu maximieren. Als Alternative zur Genotypisierung konnten spezifische polymorphe Polypeptide identifiziert werden.
• Die Rezeptor-Polypeptide sind ebenso zur Beobachtung therapeutischer Wirkungen während klinischer Versuche und anderer Behandlungen nützlich. Die therapeutische Wirksamkeit eines Agens, das kreiert wurde, um die Genexpression, Proteinspiegel oder Rezeptor-Aktivität zu erhöhen oder zu verringen, kann unter Verwendung der Rezeptor-Polypeptide als Endpunkt-Ziel während der Behandlungsdauer beobachtet werden.
• Die Rezeptor-Polypeptide sind ebenso zur Behandlung einer rezeptorassoziierten Erkrankung nützlich. Dementsprechend umfassen Behandlungsverfahren die Verwendung von löslichem Rezeptor oder Fragmenten des Rezeptor-Proteins, die um die Ligand-Bindung konkurrieren. Diese Rezeptoren oder Fragmente können eine höhere Affinität gegenüber dem Liganden haben, um eine wirksame Konkurrenz darzustellen.
• Die oben genannte Offenbarung trifft im Allgemeinen auch auf die in Seq.-ID Nr. 3 dargestellte Sequenz zu.
• Antikörper
• Die Erfindung stellt ebenso Antikörper bereit, die selektiv an das 15625-Rezeptor-Protein und dessen Varianten und Fragmente binden. Ein Antikörper wird als selektiv bindend angesehen, sogar wenn er auch an andere Proteine bindet, die im Wesentlichen nicht homolog mit dem Rezeptor-Protein sind. Diese anderen Proteine teilen eine Homologie mit einem Fragment oder einer Domäne des Rezeptor-Proteins. Diese Konservierung in spezifischen Regionen führt zu Antikörpern, die aufgrund der homologen Sequenz an beide Proteine binden. In diesem Fall würde man davon ausgehen, dass die Antikörper-Bindung an das Rezeptor-Protein immer noch selektiv erfolgt.
• Um Antikörper zu erzeugen, wird ein isoliertes Rezeptor-Polypeptid als ein Immunogen verwendet, um Antikörper unter Verwendung von Standardverfahren für polyklonale und monoklonale Antikörper-Präparate herzustellen. Es kann entweder das Protein voller Länge oder das antigene Peptid-Fragment verwendet werden. Regionen mit einem hohen Antigenitätsindex werden in 1 dargestellt.
• Antikörper werden vorzugsweise aus diesen Regionen oder aus diskreten Fragmenten in diesen Regionen hergestellt. Antikörper können jedoch, wie hierin beschrieben, aus einer beliebigen Region des Peptids hergestellt werden. Ein bevorzugtes Fragment produziert einen Antikörper, der die Ligandbindung verringert oder vollständig verhindert. Antikörper können gegen den gesamten Rezeptor oder Teile des Rezeptors entwickelt werden, z.B. die intrazelluläre carboxyterminale Domäne, die aminoterminale extrazelluläre Domäne, die gesamte Transmembrandomäne oder spezifische Segmente, eine beliebige der intra- oder extrazellulären Schleifen oder beliebige Teile der oben genannten Elemente. Antikörper können ebenso gegen spezifische funktionelle Stellen entwickelt werden, wie z.B. die Ligandbindungsstelle, die Stelle der G-Protein-Kopplung oder Stellen, die glykosyliert, phosphoryliert oder myristoyliert sind.
• Ein antigenes Fragment umfasst typischerweise zumindest 10 zusammenhängende Aminosäurereste. Das antigene Peptid kann jedoch zumindest 12, zumindest 14 Aminosäurereste, zumindest 15 Aminosäurereste, zumindest 20 Aminosäurereste oder zumindest 30 Aminosäurereste umfassen. In einer Ausführungsform korrespondieren Fragmente mit Regionen, die sich auf der Oberfläche des Proteins befinden, z.B. hydrophile Regionen. Diese Fragmente sind jedoch nicht als beliebige Fragmente umfassend auszulegen, die vor der Erfindung offenbart sein worden könnten.
• Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Ein intakter Antikörper oder Fragment davon (z.B. Fab oder F(ab')₂) kann verwendet werden.
• Die Detektion kann durch Kopplung (d.h. physisches Binden) des Antikörpers an eine detektierbare Substanz erleichtert werden. Beispiele für detektierbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien, biolumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele geeigneter Enzyme umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele geeigneter prosthetischer Gruppenkomplexe umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele geeigneter fluoreszierender Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel eines lumineszierenden Materials umfasst Luminol; Beispiele biolumineszierender Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Aequorin, und Beispiele geeigneter radioaktiver Materialien umfassen ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S oder ³H.
• Ein geeignetes immunogenes Präparat kann aus nativem, rekombinant exprimiertem Protein oder chemisch synthetisierten Peptiden stammen.
• Antikörper-Verwendungen
• Die Antikörper können verwendet werden, um ein Rezeptor-Protein mittels Standard-Verfahren, wie z.B. Affinitätschromatographie oder Immunpräzipitation, zu isolieren.
• Die Antikörper können die Reinigung des natürlichen Rezeptor-Proteins aus Zellen und rekombinant produziertem Rezeptor-Protein, das in Wirtszellen exprimiert wird, erleichtern.
• Die Antikörper sind nützlich, um die Gegenwart des Rezeptor-Proteins in Zellen oder Geweben zu detektieren, um das Expressionsmuster des Rezeptors unter verschiedenen Geweben in einem Organismus und während der normalen Entwicklung zu bestimmen.
• Die Antikörper können verwendet werden, um das Rezeptor-Protein in situ, in vitro oder in einem Zelllysat oder Überstand zu detektieren, um das Ausmaß und Muster der Expression zu evaluieren.
• Die Antikörper können verwendet werden, um eine abnormale Gewebeverteilung oder eine abnormale Expression während der Entwicklung zu bewerten.
• Die Antikörper-Detektion zirkulierender Fragmente des Rezeptor-Proteins voller Länge kann verwendet werden, um den Rezeptor-Stoffumsatz zu identifizieren.
• Weiters können die Antikörper verwendet werden, um die Rezeptor-Expression in Erkrankungszuständen zu bewerten, wie z.B. in den aktiven Stadien einer Erkrankung oder in einem Individuum mit einer Prädisposition für eine Erkrankung, die mit der Rezeptor-Funktion in Zusammenhang steht. Wird eine Erkrankung durch eine ungeeignete Gewebeverteilung, entwicklungsbedingte Expression oder ein Ausmaß der Expression des Rezeptor-Proteins hervorgerufen, so kann der Antikörper gegen das normale Rezeptor-Protein hergestellt werden. Wird eine Erkrankung durch eine spezifische Mutation im Rezeptor-Protein charakterisiert, so können Antikörper verwendet werden, die für dieses Mutanten-Protein spezifisch sind, um auf die Gegenwart des spezifischen Mutanten-Rezeptor-Proteins zu testen. Intrazellulär hergestellte Antikörper („Intrakörper") sind jedoch ebenso miteingeschlossen, wobei diese intrazelluläre Rezeptor-Peptid-Regionen erkennen würden.
• Die Antikörper können ebenso verwendet werden, um die normale und abnormale subzelluläre Lokalisierung von Zellen in den verschiedenen Geweben in einem Organismus zu bewerten. Antikörper können gegen den gesamten Rezeptor oder gegen Teile des Rezeptors entwickelt werden, z.B. Teile der aminoterminalen extrazellulären Domäne oder extrazelluläre Schleifen.
• Die diagnostischen Verwendungen können nicht nur in genetischen Tests, sondern auch in der Beobachtung einer Behandlungsmodalität angewandt werden. Dementsprechend können dort, wo die Behandlung letztendlich darauf abzielt, den Rezeptor-Expressionsspiegel oder die Gegenwart von abnormalen Rezeptoren und abnormaler Gewebeverteilung oder entwicklungsbedingte Expression zu korrigieren, Antikörper, die gegen den Rezeptor oder relevante Fragmente gerichtet sind, verwendet werden, um die therapeutische Wirksamkeit zu beobachten.
• Zusätzlich sind Antikörper in pharmakogenomischen Analysen nützlich. Antikörper, die gegen polymorphe Rezeptor-Proteine hergestellt werden, können daher verwendet werden, um Individuen zu identifizieren, die modifizierte Behandlungsmodalitäten benötigen.
• Die Antikörper sind ebenso als diagnostische Werkzeuge als immunologischer Marker für abnormale Rezeptor-Proteine nützlich, die mittels elektrophoretischer Mobilität, dem isoelektrischen Punkt, tryptischem Peptid-Verdau und anderen physikalischen Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, analysiert werden.
• Die Antikörper sind ebenso für die Gewebe-Typisierung nützlich. Dort, wo ein spezifisches Rezeptor-Protein mit der Expression in einem spezifischen Gewebe korreliert wurde, können daher Antikörper verwendet werden, die für dieses Rezeptor-Protein spezifisch sind, um einen Gewebetyp zu identifizieren.
• Die Antikörper sind ebenso in der forensischen Identifikation nützlich. Dementsprechend kann in Fällen, in denen ein Individuum mit einem spezifischen genetischen Polymorphismus korreliert wurde, der zu einem spezifischen polymorphen Protein führt, ein Antikörper, der für das polymorphe Protein spezifisch ist, als Hilfe in der Identifikation verwendet werden.
• Die Antikörper sind ebenso nützlich, um die Rezeptor-Funktion zu inhibieren, z.B. für das Blockieren der Ligandbindung.
• Diese Verwendungen können ebenso in einem therapeutischen Kontext angewandt werden, in dem die Behandlung die Inhibierung der Rezeptor-Funktion involviert. Ein Antikörper kann z.B. verwendet werden, um die Ligandbindung zu blockieren. Antikörper können gegen spezifische Fragmente hergestellt werden, die Stellen enthalten, die für die Funktion erforderlich sind, oder gegen einen intakten Rezeptor, der mit einer Zelle assoziiert ist.
• Die Erfindung umfasst ebenso Sets zur Verwendung von Antikörpern, um die Gegenwart eines Rezeptor-Proteins in einer biologischen Probe zu detektieren. Das Set kann Antikörper, wie z.B. einen markierten oder markierfähigen Antikörper und eine Verbindung oder ein Agens zur Detektion des Rezeptor-Proteins in einer biologischen Probe; Mittel zur Bestimmung der Menge eines Rezeptor-Proteins in der Probe; und Mittel zum Vergleichen der Menge des Rezeptor-Proteins in der Probe mit einem Standardwert umfassen. Die Verbindung oder das Agens kann in einem geeigneten Behälter verpackt sein. Das Set kann weiters Anweisungen zur Verwendung des Sets zur Detektion des Rezeptor-Proteins umfassen.
• Die oben genannte Offenbarung trifft im Allgemeinen auch auf die in Seq.-ID Nr. 3 gezeigte Sequenz zu.
• Polynucleotide
• Die spezifisch offenbarte cDNA umfasst die kodierende Region und 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen (Seq.-ID Nr. 2).
• Die menschliche 15625-Rezeptor-cDNA ist etwa 2286 Nucleotide lang und kodiert für ein Protein voller Länge, das etwa 342 Aminosäurereste lang ist. Die Nucleinsäure wird, wie hierin offenbart, exprimiert, wie z.B. in Gehirn-, besonders in Gliazellen, CD34⁺-Zellen und 293- und Jurkat-Zelllinien. Die strukturelle Analyse der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 1 ist in 2 dargestellt, einem Hydropathie-Diagramm. Die Figur zeigt die mutmaßliche Struktur der sieben Transmembransegmente, der aminoterminalen extrazellulären Domäne und der carboxyterminalen intrazellulären Domäne.
• Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Transmembransegment" auf ein strukturelles Aminosäuremotiv, das eine hydrophobe Helix umfasst, die die Plasmamembran umspannt. Die gesamte Transmembrandomäne umspannt etwa den Bereich von Aminosäure 26 bis etwa Aminosäure 302. Sieben Segmente umspannen die Membran, und es gibt drei intrazelluläre und drei extrazelluläre Schleifen in dieser Domäne.
• Die Erfindung stellt isolierte Polynucleotide bereit, die für ein 15625-Rezeptor-Protein kodieren. Der Begriff „15625-Polynucleotid" oder „15625-Nucleinsäure" bezieht sich auf die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Sequenz. Der Begriff „Rezeptor-Polynucleotid" oder „Rezeptor-Nucleinsäure" umfasst weiters Varianten und Fragmente des 15625-Polynucleotids, wie z.B. die in Seq.-ID Nr. 4 gezeigte.
• Eine „isolierte" Rezeptor-Nucleinsäure ist eine, die von anderen Nucleinsäuren, die in der natürlichen Quelle der Rezeptor-Nucleinsäure vorhanden sind, getrennt ist. Vorzugsweise ist eine „isolierte" Nucleinsäure frei von Sequenzen, die die Nucleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, von dem die Nucleinsäure abstammt, natürlich flankieren (d.h. Sequenzen, die sich an den 5'- und den 3'-Enden der Nucleinsäure befinden). Es kann jedoch einige flankierende Nucleotidsequenzen geben, z.B. bis zu etwa 5 KB. Der wichtige Punkt ist, dass die Nucleinsäure aus flankierenden Sequenzen isoliert ist, sodass sie den hierin beschriebenen spezifischen Manipulationen unterzogen werden kann, wie z.B. rekombinanter Expression, Herstellung von Sonden und Primern und anderen Verwendungen, die für die Rezeptor-Nucleinsäuresequenzen spezifisch sind.
• Weiters kann ein „isoliertes" Nucleinsäuremolekül, wie z.B. ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es mittels Rekombinationsverfahren hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Das Nucleinsäuremolekül kann jedoch an andere kodierende oder Regulationssequenzen fusioniert werden und trotzdem als isoliert betrachtet werden.
• Es werden z.B. rekombinante DNA-Moleküle, die in einem Vektor enthalten sind, als isoliert betrachtet. Weitere Beispiele isolierter DNA-Moleküle umfassen rekombinante DNA-Moleküle, die in heterologen Wirtszellen oder gereinigten (partiell oder im Wesentlichen) DNA-Molekülen in Lösung aufbewahrt werden. Isolierte RNA-Moleküle umfassen In-vivo- oder In-vitro-RNA-Transkripte der isolierten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung. Isolierte Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen weiters solche synthetisch hergestellten Moleküle.
• Die Rezeptor-Polynucelotide können für das reife Protein plus zusätzliche amino- oder carboxyterminale Aminosäuren kodieren oder für Aminosäuren, die sich im reifen Polypeptid befinden (wenn die reife Form mehr als eine Polypeptidkette besitzt etwa). Solche Sequenzen u.a. können bei der Verarbeitung eines Proteins von einem Vorläuferstoff zu einer reifen Form eine Rolle spielen, den Transport von Proteinen vereinfachen, die Halbwertszeit von Proteinen verlängern oder verkürzen oder die Manipulation eines Proteins für Tests oder Produktion erleichtern. Da dies im Allgemeinen in situ der Fall ist, können die zusätzlichen Aminosäuren von zellulären Enzymen vom reifen Protein weg verarbeitet werden.
• Die Rezeptor-Polynucleotide umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Sequenz, die für das reife Polypeptid alleine kodiert, die Sequenz, die für das reife Polypeptid und zusätzliche kodierende Sequenzen kodiert, wie z.B. eine Leader- oder Sekretions-Sequenz (z.B. eine Prä-Pro- oder Pro-Protein-Sequenz), die Sequenz, die für das reife Polypeptid mit oder ohne die zusätzlichen kodierenden Sequenzen kodiert, plus zusätzliche nicht-kodierende Sequenzen, z.B. Introns und nicht-kodierende 5'- und 3'-Sequenzen, wie z.B. transkribierte, jedoch nicht translatierte Sequenzen, die eine Rolle in der Transkription, der mRNA-Verarbeitung (inkludierend Spleiß- und Polyadenylierungssignale), der Ribosomen-Bindung und der Stabilität der mRNA eine Rolle spielen. Zusätzlich kann das Polynucleotid an eine Markersequenz fusioniert sein, die z.B. für ein Peptid kodiert, das die Reinigung erleichtert.
• Rezeptor-Polynucleotide können die Form einer RNA aufweisen, wie z.B. mRNA, oder die Form einer DNA, unter anderem cDNA und genomische DNA, die durch Klonieren erhalten wurde oder mittels chemischer Syntheseverfahren oder mittels einer Kombination dieser hergestellt wurde. Die Nucleinsäure, insbesondere DNA, kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Eine einzelsträngige Nucleinsäure kann der kodierende Strang (Sense-Strang) oder der nicht-kodierende Strang (Anti-Sense-Strang) sein.
• Eine Rezeptor-Nucleinsäure umfasst die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Nucleotidsequenz, die der cDNA des menschlichen Gehirns entspricht.
• In einer Ausführungsform umfasst die Rezeptor-Nucleinsäure nur die kodierende Region.
• Die Erfindung stellt weiters verschiedene Rezeptor-Polynucleotide und Fragmente davon bereit, die sich von der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und daher für dasselbe Protein kodieren wie jenes, das von der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Nucleotidsequenz kodiert wird.
• Die Erfindung stellt ebenso Rezeptor-Nucleinsäure-Moleküle bereit, die für die verschiedenen, hierin beschriebenen Polypeptide kodieren. Diese Polynucleotide können natürlich vorkommen, wie z.B. Allelvarianten (selber Locus) (kartiert an Chromosom 3 in der Nähe von AFM164YG9), Homologe (unterschiedlicher Locus) und Or thologe (unterschiedlicher Organismus), wie z.B. die in Seq.-ID Nr. 4 gezeigte Sequenz, oder sie können mittels DNA-Rekombinationsverfahren oder. mittels chemischer Synthese konstruiert werden. Solche nicht natürlich vorkommenden Varianten können mittels Mutagenese-Verfahren, unter anderem jene, die bei Polynucleotiden, Zellen oder Organismen angewandt werden, hergestellt werden. Dementsprechend können die Varianten, wie oben beschrieben, Nucleotid-Substitutionen, -Deletionen, -Inversionen und -Insertionen enthalten.
• Eine Variation kann entweder in den kodierenden oder in den nicht-kodierenden Regionen stattfinden oder in beiden. Die Variationen können sowohl konservative als auch nicht konservative Aminosäure-Substitutionen erzeugen.
• Orthologe, Homologe und Allelvarianten können unter Verwendung von Verfahren identifiziert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Diese Varianten umfassen eine Nucleotidsequenz, die für einen Rezeptor kodiert, der 50 %, zumindest etwa 55 %, typischerweise zumindest etwa 70-75 %, noch typischer zumindest etwa 80-85 % und besonders typisch zumindest etwa 90-95 % oder mehr Homologie gegenüber der in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Nucleotidsequenz oder einem Fragment dieser Sequenz aufweist. Solche Nucleinsäuremoleküle können leicht identifiziert werden, da sie in der Lage sind, unter stringenten Bedingungen an die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Nucleotidsequenz oder ein Fragment der Sequenz zu hybridisieren. Es wird davon ausgegangen, dass eine stringente Hybridisierung keine wesentliche Homologie anzeigt, wo dies auf die allgemeine Homologie zurückzuführen ist, wie z.B. Poly-A-Sequenzen oder Sequenzen, die alle oder die meisten Proteine gemeinsam haben, alle GPCRs oder alle GPCRs der Familie I. Weiters wird davon ausgegangen, dass Varianten keine der Nucleinsäuresequenzen umfassen, die vor der Erfindung offenbart worden sein könnten.
• Wie hierin verwendet, ist mit dem Begriff „hybridisiert unter stringenten Bedingungen" eine Beschreibung der Bedingungen für die Hybridisierung und das Waschen gemeint, unter denen Nucleotidsequenzen, die für einen Rezeptor kodieren und zu zumindest 50 %, 55 % homolog zueinander sind, typischerweise aneinander hybridi siert bleiben. Die Bedingungen können so sein, dass Sequenzen mit zumindest etwa 65 %, zumindest etwa 70 % oder zumindest etwa 75 % oder mehr Homologie zueinander typischerweise aneinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind in Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), zu finden. Ein Beispiel stringenter Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45 °C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 X SSC, 0,1 % SDS bei 50-65 °C. In einer Ausführungsform entspricht ein isoliertes Rezeptor-Nucleinsäure-Molekül, das unter stringenten Bedingungen an die Sequenz aus Seq.-ID Nr. 2 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nucleinsäure-Molekül. Wie hierin verwendet bezieht sich ein „natürlich vorkommendes" Nucleinsäuremolekül auf ein RNA- oder ein DNA-Molekül mit einer Nucleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z.B. für ein natürliches Protein kodiert).
• Weiters stellt die Erfindung Polynucleotide bereit, die ein Fragment der Rezeptor-Polynucleotide voller Länge umfassen. Das Fragment kann einzel- oder doppelsträngig sein und kann DNA oder RNA umfassen. Das Fragment kann entweder von der kodierenden oder der nicht-kodierenden Sequenz stammen.
• Ein Fragment kann eine zusammenhängende Nucleotidsequenz umfassen, die größer als 12 Nucleotide von Nucleotid 1 bis etwa Nucleotid 500 ist, größer als 24 Nucleotide von etwa Nucleotid 476 bis etwa Nucleotid 1096 und größer als 12 Nucleotide von etwa Nucleotid 1147 bis Nucleotid 1715.
• Isolierte Rezeptor-Nucleinsäure-Fragmente hybridisieren unter stringenten Bedingungen an das Nucleinsäure-Molekül, das die Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 2 umfasst. In anderen Ausführungsformen ist die Nucleinsäure zumindest 30, 40, 50, 100, 250 oder 500 Nucleotide lang.
• In einer anderen Ausführungsform kodiert eine isolierte Rezeptor-Nucleinsäure für die gesamte kodierende Region von Aminosäure 1 bis Aminasäure 342. in einer anderen Ausführungsform kodiert die isolierte Rezeptor-Nucleinsäure für eine Sequenz, die dem reifen Protein von etwa Aminosäure 6 bis Aminosäure 342 entspricht. Weitere Fragmente umfassen Nucleotidsequenzen, die für die hierin beschriebenen Aminosäure-Fragmente kodieren. Weitere Fragmente können Subfragmente der hierin beschriebenen spezifischen Domänen oder Stellen umfassen. Nucleinsäure-Fragmente gemäß der vorliegenden Erfindung sollen nicht als jene Fragmente umfassend verstanden werden, die vor der Erfindung offenbart worden sein könnten.
• Rezeptor-Nucleinsäure-Fragmente umfassen weiters Sequenzen, die den hierin beschriebenen Domänen, den ebenso beschriebenen Subregionen und den spezifischen funktionellen Stellen entsprechen. Rezeptor-Nucleinsäure-Fragmente umfassen ebenso Kombinationen der oben beschriebenen Domänen, Segmente, Schleifen und anderen funktionellen Stellen. Daher könnte eine Rezeptor-Nucleinsäure z.B. Sequenzen umfassen, die der aminoterminalen extrazellulären Domäne und einem Transmembran-Fragment entsprechen. Ein durchschnittlicher Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wüsste über die zahlreichen möglichen Permutationen Bescheid.
• Es wird jedoch davon ausgegangen, dass ein Rezeptor-Fragment eine beliebige Nucleinsäure-Sequenz inkludiert, die nicht das gesamte Gen umfasst.
• Rezeptor-Nucleinsäure-Fragmente umfassen Nucleinsäure-Moleküle, die für ein Polypeptid, das die aminoterminale extrazelluläre Domäne, inkludierend die Aminosäurereste von 1 bis etwa 25, umfasst, für ein Polypeptid, das die Region umfasst, die die Transmembranregion umspannt (Aminosäurereste von etwa 26 bis etwa 302), für ein Polypeptid, das die carboxyterminale intrazelluläre Domäne umfasst (Aminosäurereste von etwa 303 bis etwa 342), und für ein Polypeptid kodieren, das für die G-Protein-Rezeptor-Signatur kodiert (121-123 oder umgebende Aminosäurereste von etwa 110 bis etwa 133), Nucleinsäure-Moleküle, die für ein beliebiges der sieben Transmembransegmente kodieren, extrazelluläre oder intrazelluläre Schleifen und Stellen zur Glykosylierung, cAMP- und cGMP-abhängigen Protein-Kinase-Phosphorylierung, Protein-Kinase-C-Phosphorylierung und N-Myristoylierung. Wo der Ort der Domänen mittels Computeranalyse prognostiziert wurde, wäre dem Fachmann bekannt, dass die Aminosäurereste, die diese Domänen darstellen, in Abhängigkeit von den für die Definition der Domänen verwendeten Kriterien variieren können.
• Die Erfindung stellt ebenso Rezeptor-Nucleinsäure-Fragmente bereit, die für epitoptragende Regionen der hierin beschriebenen Rezeptor-Proteine kodieren.
• Die isolierten Rezeptor-Polynucleotid-Sequenzen, und insbesondere -Fragmente, sind als DNA-Sonden und Primer nützlich.
• Die kodierende Region eines Rezeptor-Gens kann z.B. unter Verwendung der bekannten Nucleotidsequenz isoliert werden, um eine Oligonucleotid-Sonde zu synthetisieren. Eine markierte Sonde kann dann verwendet werden, um eine cDNA-Bibliothek, eine genomische DNA-Bibliothek oder mRNA zu screenen, um Nucleinsäure gemäß der kodierenden Region zu isolieren. Weiters können Primer in PCR-Reaktionen verwendet werden, um spezifische Regionen von Rezeptor-Genen zu klonieren.
• Ein(e) Sonde/Primer umfasst typischerweise im Wesentlichen gereinigtes Oligonucleotid. Das Oligonucleotid umfasst typischerweise eine Region an Nucleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen an zumindest etwa 12, typischerweise etwa 25, noch typischer etwa 40, 50 oder 75 aufeinander folgende Nucleotide des Sense- oder Anti-Sense-Strangs aus Seq.-ID Nr. 2 oder andere Rezeptor-Polynucleotide hybridisiert. Eine Sonde umfasst weiters eine Markierung, z.B. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Co-Faktor.
• Die oben genannte Offenbarung trifft im Allgemeinen auch auf die in Seq.-ID Nr. 4 dargestellte Sequenz zu.
• Polynucleotid-Verwendungen
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind für Sonden, Primer und in biologischen Tests nützlich. Werden die Polynucleotide verwendet, um GPCR-Eigenschaften oder Eigenschaften oder Funktionen zu untersuchen, wie z.B. in den hierin beschriebenen Tests, so können die ganze oder weniger als die ganze cDNA nützlich sein. In diesem Fall sind sogar Fragmente, die bereits auch vor der Erfindung bekannt gewesen sein könnten, miteingeschlossen. Daher umfassen z.B. Tests, die spezifisch auf GPCR-Funktionen gerichtet sind, wie z.B. das Untersuchen der Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität, die Verwendung bekannter Fragmente. Weiters können diagnostische Verfahren zur Untersuchung der Rezeptor-Funktion auch mit jedem beliebigen Fragment durchgeführt werden, unter anderem jenen Fragmenten, die vor der Erfindung bereits bekannt gewesen sein könnten. Ähnlich werden bei Verfahren, die die Behandlung einer Rezeptor-Dysfunktion involvieren, alle Fragmente umfasst, unter anderem jene, die unter Umständen auf dem Gebiet der Erfindung bereits bekannt waren.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind als eine Hybridisierungssonde für cDNA und genomische DNA nützlich, um eine cDNA voller Länge und genomische Klone zu isolieren, die für das in Seq.-ID Nr. 1 beschriebene Polypeptid kodieren und, um cDNA- und genomische Klone zu isolieren, die Varianten entsprechen, die dasselbe, in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Polypeptid erzeugen, oder die anderen, hierin beschriebenen Varianten. Varianten können aus demselben Gewebe und Organismus isoliert werden, aus dem das in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Polypeptid isoliert wurde, verschiedenen Gewebe desselben Organismus oder von verschiedenen Organismen. Dieses Verfahren ist für das Isolieren von Genen und cDNA nützlich, die durch die Entwicklung gesteuert werden/wird und daher im selben Gewebe oder in verschiedenen Geweben an unterschiedlichen Punkten in der Entwicklung eines Organismus exprimiert werden können/kann.
• Die Sonde kann einer beliebigen Sequenz entlang der gesamten Länge des für den Rezeptor kodierenden Gens entsprechen. Dementsprechend könnte sie von nicht- kodierenden 5'-Regionen, der kodierenden Region und nicht-kodierenden 3'-Regionen stammen. Wie jedoch bereits erwähnt, sollen Fragmente jedoch nicht als jene verstanden werden, die Fragmente umfassen können, die vor der vorliegenden Erfindung offenbart wurden.
• Die Nucleinsäure-Sonde kann z.B. die cDNA voller Länge aus Seq.-ID Nr. 1 oder ein Fragment davon umfassen, z.B. ein Oligonucleotid mit zumindest 12, 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nucleotiden in der Länge, und ausreichend, um unter stringenten Bedingungen an mRNA oder DNA spezifisch zu hybridisieren.
• Fragmente der hierin beschriebenen Polynucleotide sind ebenso nützlich, um größere Fragmente oder Polynucleotide voller Länge, wie sie hierin beschrieben sind, zu synthetisieren. Ein Fragment kann z.B. an jeden Teil einer mRNA hybridisiert werden, und eine größere oder eine cDNA voller Länge kann hergestellt werden.
• Die Fragmente sind ebenso nützlich, um Antisense-Moleküle der gewünschten Länge und Sequenz zu synthetisieren.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso als Primer für PCR nützlich, um jede beliebige Region eines Rezeptor-Polynucleotids zu amplifizieren.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso nützlich für die Konstruktion von rekombinanten Vektoren. Solche Vektoren umfassen Expressionsvektoren, die einen Teil der oder die gesamten Rezeptor-Polypeptide exprimieren. Vektoren umfassen ebenso Insertionsvektoren, die zur Integration in eine andere Polynucleotidsequenz, wie z.B. in das zelluläre Genom, verwendet werden, um die In-situ-Expression von Rezeptor-Genen und -Gen-Produkten zu verändern. Eine für einen endogenen Rezeptor kodierende Sequenz kann z.B. mittels homologer Rekombination mit der gesamten oder einem Teil der kodierenden Region ersetzt werden, die eine oder mehrere spezifisch eingeführte Mutationen enthält.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso für die Expression von antigenen Teilen der Rezeptor-Proteine nützlich.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso als Sonden zur Bestimmung der chromosomalen Positionen der Rezeptor-Polynucleotide mittels In-situ-Hybridisierungsverfahren nützlich.
• Die Rezeptor-Polynucleotid-Sonden sind ebenso nützlich, um Muster der Gegenwart des Gens, das für die Rezeptor und ihre Varianten kodiert, im Hinblick auf die Gewebsverteilung zu bestimmen, z.B. ob es zu einer Gen-Duplikation gekommen ist und ob die Duplikation in allen oder nur in einem Subset der Gewebe aufgetreten ist. Die Gene können natürlich vorkommende sein, oder sie können exogen in eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus eingeführt worden sein.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso zum Konstruieren von Ribozymen nützlich, die der gesamten oder einem Teil der mRNA entsprechen, die aus Genen produziert wurde, die für die hierin beschriebenen Polynucleotide kodieren.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso für die Konstruktion von Wirtszellen nützlich, die einen Teil der oder die gesamten Rezeptor-Polynucleotide und Polypeptide exprimieren.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso für die Konstruktion transgener Tiere nützlich, die die gesamten oder einen Teil der Rezeptor-Polynucleotide und Polypeptide exprimieren.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso für die Herstellung von Vektoren nützlich, die einen Teil der oder die gesamten Rezeptor-Polypeptide exprimieren.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso als Hybridisierungssonden zur Bestimmung des Ausmaßes der Expression der Rezeptor-Nucleinsäure nützlich. Dementsprechend können die Sonden verwendet werden, um die Gegenwart von Rezeptor- Nucleinsäure in Zellen, Geweben und in Organismen oder deren Spiegel zu detektieren. Die Nucleinsäure, deren Spiegel bestimmt wird, kann eine DNA oder RNA sein. Dementsprechend können die den hierin beschriebenen Polypeptiden entsprechenden Sonden verwendet werden, um die Anzahl der Gen-Kopien in einer/einem bestimmten Zelle, Gewebe oder Organismus zu untersuchen. Dies ist besonders in Fällen relevant, in denen es eine Amplifikation der Rezeptor-Gene gegeben hat.
• Alternativ dazu kann die Sonde im Kontext einer In-situ-Hybridisierung verwendet werden, um die Position von Extra-Kopien der Rezeptor-Gene zu untersuchen, wie z.B. auf extrachromosomalen Elementen oder als in Chromosome integriert, in denen das Rezeptor-Gen normalerweise nicht zu finden ist, z.B. als eine homogen anfärbbare Region.
• Diese Verwendungen sind für die Diagnose von Erkrankungen relevant, die eine Erhöhung oder einen Rückgang der Rezeptor-Expression im Vergleich zu normalen Ergebnissen involvieren.
• In-vitro-Verfahren zur Detektion von mRNA umfassen Northern-Hybridisierungen und In-situ-Hybridisierungen. In-vitro-Verfahren zur Detektion von DNA umfassen Southern-Hybridisierungen und In-situ-Hybridisierungen.
• Sonden können als Teil eines diagnostischen Test-Sets zur Identifikation von Zellen oder Geweben verwendet werden, die ein Rezeptor-Protein exprimieren, z.B. durch Messen eines Spiegels einer rezeptor-kodierenden Nucleinsäure in einer Probe an Zellen eines Individuums, z.B. mRNA oder genomische DNA, oder durch das Bestimmen, ob ein Rezeptor-Gen mutiert wurde.
• Nucleinsäure-Expressionstests sind für das Wirkstoffscreening zur Identifikation von Verbindungen nützlich, die die Expression der Rezeptor-Nucleinsäure modulieren.
• Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung bereit, die verwendet werden kann, um eine Erkrankung zu behandeln, die mit der Nucleinsäu re-Expression des Rezeptor-Gens assoziiert ist. Das Verfahren umfasst typischerweise das Testen der Fähigkeit der Verbindung, die Expression der Rezeptor-Nucleinsäure zu modulieren, und daher das Identifizieren einer Verbindung, die verwendet werden kann, um eine Erkrankung zu behandeln, die durch eine ungewünschte Rezeptor-Nucleinsäure-Expression charakterisiert ist.
• Die Tests können in zellbasierten und zellfreien Systemen durchgeführt werden. Zellbasierte Tests umfassen Zellen, die die Rezeptor-Nucleinsäure natürlich exprimieren, oder rekombinante Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um spezifische Nucleinsäuresequenzen zu exprimieren.
• Alternativ dazu können Kandidatenverbindungen in vivo in Patienten oder in transgenen Tieren getestet werden.
• Der Test für die Rezeptor-Nucleinsäure-Expression kann einen direkten Test der Nucleinsäurespiegel involvieren, wie z.B. mRNA-Spiegel, oder auf kollateralen Verbindungen, die in den Signalweg involviert sind (wie z.B. cAMP- oder Phosphatidylinositol-Stoffumsatz). Weiters kann die Expression von Genen, die als Reaktion auf den Rezeptor-Protein-Signalweg hinauf- oder hinunterreguliert werden, ebenso getestet werden. In dieser Ausführungsform können die Regulationsregionen dieser Gene operabel an ein Reporter-Gen, wie z.B. Luciferase, gebunden werden.
• Daher können Modulatoren der Rezeptor-Gen-Expression in einem Verfahren identifiziert werden, worin eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung kontaktiert wird und die Expression der mRNA bestimmt wird. Das Ausmaß der Expression der Rezeptor-mRNA in Gegenwart der Kandidatenverbindung wird mit dem Ausmaß der Expression der Rezeptor-mRNA in Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen. Die Kandidatenverbindung kann danach basierend auf diesem Vergleich als ein Modulator der Nucleinsäure-Expression identifiziert werden und z.B. verwendet werden, um eine Erkrankung zu behandeln, die durch eine abnormale Nucleinsäure-Expression charakterisiert ist. Ist die Expression der mRNA statistisch signifikant größer in Gegenwart der Kandidatenverbindung als in deren Abwesenheit, so wird die Kandida tenverbindung als ein Stimulator der Nucleinsäure-Expression identifiziert. Ist die Expression der Nucleinsäure statistisch signifikant geringer in Gegenwart der Kandidatenverbindung als in deren Abwesenheit, so wird die Kandidatenverbindung als ein Inhibitor der Nucleinsäure-Expression identifiziert.
• Dementsprechend stellt die Erfindung Behandlungsverfahren mit der Nucleinsäure als Ziel bereit, die eine Verbindung verwenden, die durch Wirkstoffscreenings als ein Gen-Modulator identifiziert wurde, um die Rezeptor-Nucleinsäure-Expression zu modulieren. Die Modulation umfasst sowohl die Hinauf-Regulierung (d.h. die Aktivierung oder Agonisierung) als auch die Hinunter-Regulierung (Unterdrückung oder Antagonisierung) oder die Nucleinsäure-Expression.
• Alternativ dazu kann ein Modulator für die Rezeptor-Nucleinsäure-Expression ein kleines Molekül oder ein Wirkstoff sein, das/der mittels der hierin beschriebenen Screeningtests identifiziert wurde, solange der Wirkstoff oder das kleine Molekül die Rezeptor-Nucleinsäure-Expression inhibiert.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso nützlich, um die Wirksamkeit modulierender Verbindungen auf die Expression oder Aktivität des Rezeptor-Gens in klinischen Versuchen oder in einem Behandlungsregime zu beobachten. Daher kann das Gen-Expressionsmuster als ein Barometer für die andauernde Wirkung einer Behandlung mit der Verbindung dienen, insbesondere mit Verbindungen, gegen die ein Patient eine Resistenz entwickeln kann. Das Gen-Expressionsmuster kann ebenso als ein Marker dienen, der eine physiologische Reaktion der betroffenen Zellen auf die Verbindung anzeigt. Dementsprechend könnte solch eine Beobachtung entweder eine erhöhte Verabreichung der Verbindung ermöglichen oder die Verabreichung von Alternativverbindungen, gegen die der Patient nicht resistent geworden ist. Ähnlich könnte die Verabreichung der Verbindung entsprechend verringert werden, falls das Ausmaß der Nucleinsäure-Expression unter einen gewünschten Wert fällt.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso in diagnostischen Tests für qualitative Veränderungen in Rezeptor-Nucleinsäuren und besonders für qualitative Veränderun gen, die zu Pathologie führen, von Nutzen. Die Polynucleotide können verwendet werden, um Mutationen in Rezeptor-Genen und Gen-Expressions-Produkte, wie z.B. mRNA, zu detekieren. Die Polynucleotide können als Hybridisierungssonden verwendet werden, um natürlich vorkommende genetische Mutationen im Rezeptor-Gen zu detektieren und dadurch zu bestimmen, ob für ein Individuum mit der Mutation das Risiko einer Erkrankung, die durch die Mutation hervorgerufen wird, besteht. Mutationen inkludieren Deletion, Addition oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotids/Nucleotide in dem Gen, chromosomale Neuanordnung, wie z.B. Inversion oder Transposition, die Modifikation genomischer DNA, wie z.B. abnormale Methylierungsmuster, oder Veränderungen in der Anzahl der Gen-Kopien, wie z.B. Amplifikation. Die Detektion einer mutierten Form des Rezeptor-Gens, das mit einer Dysfunktion assoziiert ist, stellt ein diagnostisches Werkzeug für eine aktive Erkrankung oder Anfälligkeit für eine Erkrankung bereit, wenn die Erkrankung das Resultat einer Überexpression, einer Unterexpression oder einer veränderten Expression eines Rezeptor-Proteins ist.
• Individuen, die Mutationen im Rezeptor-Gen in sich tragen, können auf Nucleinsäure-Niveau mittels einer Reihe an Verfahren detektiert werden. Genomische DNA kann direkt analysiert werden oder kann mittels PCR vor der Analyse amplifiziert werden. RNA oder cDNA kann auf dieselbe Art und Weise verwendet werden.
• In gewissen Ausführungsformen involviert die Detektion von Mutationen die Verwendung einer/eines Sonde/Primers in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.683.195 und 4.683.202), wie z.B. Anker-PCR oder RACE-PCR, oder, alternativ dazu, in einer Ligations-Kettenreaktion (LCR) (siehe z.B. Landegran et al., Science 241, 1077-1080 (1988); und Nakazawa et al., PNAS 91, 360-364 (1994)), wobei letztere besonders für die Detektion von Punktmutationen im Gen nützlich ist (siehe Abravaya et al., Nucleic Acids Res. 23, 675-682 (1995)). Dieses Verfahren kann die Schritte des Sammelns einer Probe von Zellen eines Patienten, des Isolierens der Nucleinsäure (z.B. genomische, mRNA oder beide) aus den Zellen der Probe, des Kontaktierens der Nucleinsäureprobe mit einem oder mehreren Primern, die spezifisch an ein Gen hybridisieren, und zwar unter Bedingungen, sodass es zu einer Hybridisierung und Amplifikation des Gens (falls vorhanden) kommt, sowie des Detektierens der Gegenwart oder der Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts oder des Detektierens der Größe des Amplifikationsprodukts und des Vergleichens der Länge mit einer Kontrollprobe umfassen. Deletionen und Insertionen können durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp detektiert werden. Punktmutationen können durch Hybridisieren amplifizierter DNA an normale RNA oder Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert werden.
• Alternativ dazu können Mutationen in einem Rezeptor-Gen direkt identifiziert werden, z.B. durch Veränderungen in Restriktionsenzym-Verdau-Mustern, die mittels Gelelektrophorese bestimmt werden.
• Weiters können sequenzspezifische Ribozyme (US-Patent Nr. 5.498.531) verwendet werden, um durch die Entwicklung oder den Verlust einer Ribozym-Spaltungsstelle einen Score für die Gegenwart spezifischer Mutationen zu erreichen.
• Perfekt gepaarte Sequenzen können von fehlgepaarten Sequenzen durch Nuclease-Spaltungs-Verdau-Tests oder durch Unterschiede in der Schmelztemperatur unterschieden werden.
• Sequenzveränderungen an spezifischen Lokationen können ebenso mittels Nuclease-Schutz-Tests, wie z.B. RNase- und S1-Schutz, oder des chemischen Spaltungsverfahrens untersucht werden.
• Weiters können Sequenzunterschiede zwischen einem Mutanten-Rezeptor-Gen und einem Wildtyp-Gen mittels direkter IDNA-Sequenzierung bestimmt werden. Eine Reihe an automatisierten Sequenzierurugs-Verfahren kann für die Durchführung der diagnostischen Tests verwendet werden (Biotechniques 19, 448 (1995)), unter anderem Sequenzierung mittels Massenspektrometrie (siehe z.B. Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/16101; Cohen et al., Adv. Chromatogr. 36, 127-162 (1996); und Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 38, 147-159 (1993)).
• Andere Verfahren zur Detektion von Mutationen im Gen umfassen Verfahren, in denen ein Schutz vor Spaltungsagenzien verwendet wird, um fehlgepaarte Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Duplexen zu detektieren (Myers et al., Science 230, 1242 (1985); Cotton et al., PNAS 85, 4397 (1988); Saleeba et al., Meth. Enzymol. 217, 286-295 (1992)), die elektrophoretische Mobilität von Mutanten- und Wildtyp-Nucleinsäure wird verglichen (Orita et al., PNAS 86, 2766 (1989); Cotton et al., Mutat. Res. 285, 125-144 (1993); und Hayashi et al., Genet. Annal. Tech. Appl. 9, 73-79 (1992)), und die Bewegung von Mutanten- oder Wildtyp-Fragmenten in Polyacrylamidgelen, die einen Gradienten an Denaturierungsmittel enthalten, wird unter Verwendung von denaturierender Gradienten-Gelelektrophorese getestet (Myers et al., Nature 313, 495 (1985)). Beispiele anderer Verfahren zur Detektion von Punktmutationen umfassen selektive Oligonucleotid-Hybridisierung, selektive Amplifikation und selektive Primer-Extension.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind zum Testen eines Individuums auf einen Genotyp nützlich, der, obwohl er nicht notwendigerweise die Krankheit hervorruft, jedoch trotzdem die Behandlungsmodalität beeinflusst. Daher können die Polynucleotide verwendet werden, um die Beziehung zwischen dem Genotyp eines Individuums und der Reaktion des Individuums auf eine Verbindung, die für die Behandlung verwendet wird (pharmakogenomische Beziehung), zu erforschen. Im vorliegenden Fall könnte z.B. eine Mutation im Rezeptor-Gen, die zu einer veränderten Affinität für den Liganden führt, zu einer exzessiven oder verringerten Wirkstoff-Wirkung mit Standardkonzentrationen des Liganden führen, der den Rezeptor aktiviert. Dementsprechend können die hierin beschriebenen Rezeptor-Polynucleotide verwendet werden, um den Mutationsgehalt des Rezeptor-Gens in einem Individuum zu untersuchen, um eine geeignete Verbindung oder ein geeignetes Dosierungsregime für die Behandlung auszuwählen.
• Daher stellen Polynucleotide, die genetische Variationen zeigen, die die Behandlung beeinflussen, ein diagnostisches Ziel bereit, das verwendet werden kann, um die Behandlung in einem Individuum maßzuschneidern. Dementsprechend ermöglicht die Produktion rekombinanter Zellen und Tiere, die diese Polymorphismen enthalten, ein wirksames klinisches Design von Behandlungsverbindungen und Dosierungsregimes.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind ebenso für die Chromosom-Identifikation nützlich, wenn die Sequenz mit einem individuellen Chromosom und an einem bestimmten Ort auf dem Chromosom identifiziert wird. Zuerst wird die DNA-Sequenz mit dem Chromosom mittels In-situ- oder anderer chromosomspezifischer Hybridisierung gepaart. Sequenzen können ebenso an spezifische Chromosomen korreliert werden, und zwar durch die Herstellung von PCR-Primern, die zum PCR-Screening von somatischen Zellhybriden, die individuelle Chromosome der gewünschten Spezies enthalten, verwendet werden können. Nur Hybride, die das Chromosom enthalten, das das Gen enthält, welches homolog zum Primer ist, ergeben ein amplifiziertes Fragment. Eine Sublokalisierung kann unter Verwendung von chromosomalen Fragmenten erreicht werden. Andere Strategien umfassen ein Pre-Screening mit markierten, durchflusssortierten Chromosomen und eine Präselektion mittels Hybridisierung an chromosomspezifische Bibliotheken. Weitere Kartierungsstrategien umfassen die Insitu-Fluoreszenz-Hybridisierung, was eine Hybridisierung mit Sonden ermöglicht, die kürzer sind als jene, die traditionellerweise verwendet werden. Reagenzien für die Chromosom-Kartierung können individuell verwendet werden, um ein einzelnes Chromosom oder eine einzelne Stelle auf dem Chromosom zu markieren, oder es können Gruppen an Reagenzien verwendet werden, um multiple Stellen und/oder multiple Chromosome zu markieren. Reagenzien, die nicht-kodierenden Regionen der Gene entsprechen, werden tatsächlich für Kartierungszwecke bevorzugt. Kodierende Sequenzen werden mit größerer Wahrscheinlichkeit innerhalb von Genfamilien konserviert, wodurch die Möglichkeit von Quer-Hybridisierungen während des chromosomalen Kartierens erhöht wird.
• Die Rezeptor-Polynucleotide können ebenso verwendet werden, um Individuen aufgrund kleiner biologischer Proben zu identifizieren. Dies kann z.B. unter Verwendung eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) zur Identifikation eines Individuums erreicht werden. Die hierin beschriebenen Polynucleotide sind daher als DNA-Marker für RFLP nützlich (siehe US-Patent Nr. 5.272.057).
• Weiters kann die Rezeptor-Sequenz verwendet werden, um ein Alternativverfahren bereitzustellen, das die tatsächliche DNA-Sequenz ausgewählter Fragmente im Genom eines Individuums bestimmt. Die hierin beschriebenen Rezeptor-Sequenzen können daher verwendet werden, um zwei PCR-Primer aus den 5'- und 3'-Enden der Sequenzen herzustellen. Diese Primer können dann verwendet werden, um DNA aus einem Individuum für weiterführendes Sequenzieren zu amplifizieren.
• Gruppen korrespondierender DNA-Sequenzen von Individuen, die auf diese Art und Weise hergestellt wurden, können einzigartige individuelle Identifikationen bereitstellen, da jedes Individuum ein einzigartiges Set solcher DNA-Sequenzen besitzt. Es wird geschätzt, dass eine Allelvariation bei Menschen mit einer Häufigkeit von etwa einem Mal pro 500 Basen vorkommt. Allelvariationen treten bis zu einem gewissen Ausmaß in den kodierenden Regionen dieser Sequenzen auf und in einem größeren Ausmaß in den nicht-kodierenden Regionen. Die Rezeptor-Sequenzen können verwendet werden, um solche Identifikations-Sequenzen aus Individuen und aus Gewebe zu erhalten. Die Sequenzen stellen einzigartige Fragmente des menschlichen Genoms dar. Jede der hierin beschriebenen Sequenzen kann, bis zu einem gewissen Ausmaß, als ein Standard verwendet werden, mit dem die DNA eines Individuums für Identifikationszwecke verglichen werden kann.
• Wird eine Gruppe an Reagenzien aus den Sequenzen verwendet, um eine einzigartige Identifikations-Datenbank für ein Individuum zu erzeugen, so können dieselben Reagenzien später verwendet werden, um Gewebe von diesem Individuum zu identifizieren. Unter Verwendung der einzigartigen Identifikations-Datenbank kann eine positive Identifikation des Individuums, lebendig oder tot, aufgrund von extrem kleinen Gewebeproben erfolgen.
• Die Rezeptor-Polynucleotide können ebenso in forensischen Identifikationsverfahren verwendet werden. Die PCR-Technologie kann verwendet werden, um DNA-Sequenzen zu amplifizieren, die aus sehr kleinen biologischen Proben entnommen wurden, wie z.B. ein einziges Haarfollikel, Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Speichel, Samen). Die amplifizierte Sequenz kann dann mit einem Standard verglichen werden, der die Identifikation des Ursprungs der Probe ermöglicht.
• Die Rezeptor-Polynucleotide können daher verwendet werden, um Polynucleotid-Reagenzien, z.B. PCR-Primer, die auf spezifische Loci im menschlichen Genom abzielen, bereitzustellen, die die Verlässlichkeit von DNA-basierten forensischen Identifikationen, z.B. durch die Bereitstellung eines anderen „Identifikations-Markers" (d.h. eine andere DNA-Sequenz, die für ein bestimmtes Individuum einzigartig ist), erhöhen. Wie oben beschrieben, kann die tatsächliche Basen-Sequenz-Information für die Identifikation als eine akkurate Alternative zu jenen Mustern verwendet werden, die durch restriktionsenzymgenerierte Fragmente gebildet werden. Sequenzen, die auf die nicht-kodierende Region abzielen, sind besonders nützlich, da in den nicht-kodierenden Regionen größere Polymorphismen auftreten, was eine Differenzierung von Individuen unter Verwendung dieses Verfahrens erleichtert.
• Die Rezeptor-Polynucleotide können weiters verwendet werden, um Polynucleotid-Reagenzien bereitzustellen, z.B. markierte oder markierbare Sonden, die z.B. in einem In-situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden können, um ein spezifisches Gewebe zu identifizieren. Dies ist in Fällen nützlich, in denen ein forensischer Pathologe mit einem Gewebe unbekannter Herkunft konfrontiert ist. Gruppen an Rezeptor-Sonden können verwendet werden, um Gewebe nach der Spezies und/oder nach dem Organtyp zu identifizieren.
• Auf ähnliche Art und Weise können diese Primer und Sonden verwendet werden, um eine Gewebekultur auf Kontaminationen zu screenen (d.h. auf die Gegenwart eines Gemisches verschiedener Typen an Zellen in einer Kultur zu screenen).
• Alternativ dazu können die Rezeptor-Polynucleotide direkt verwendet werden, um die Transkription oder Translation von Rezeptor-Gensequenzen mittels Antisense- oder Ribozym-Konstrukten zu blockieren. Daher können Nucleinsäuren direkt für die Behandlung einer Erkrankung verwendet werden, die durch abnormal hohe oder unerwünschte Rezeptor-Gen-Expression charakterisiert ist.
• Die Rezeptor-Polynucleotide sind daher nützlich als Antisense-Konstrukte, um die Rezeptor-Gen-Expression in Zellen, Geweben und Organismen zu kontrollieren. Ein DNA-Antisense-Polynucleotid wird kreiert, um komplementär zu einer Region des Gens zu sein, das in die Transkription involviert ist, wodurch die Transkription und daher die Produktion des Rezeptor-Proteins verhindert wird. Ein Antisense-RNA- oder -DNA-Polynucleotid würde an die mRNA hybridisieren und daher die Translation der mRNA in das Rezeptor-Protein blockieren.
• Beispiele für Antisense-Molekülen, die nützlich sind, um die Nucleinsäure-Expression zu inhibieren, umfassen Antisense-Moleküle, die komplementär zu einem Fragment der 5'-untranslatierten Region aus Seq.-ID Nr. 2 sind, das auch das Startcodon umfasst, und Antisense-Moleküle, die komplementär zu einem Fragment der 3'-untranslatierten Region aus Seq.-ID Nr. 2 sind.
• Alternativ dazu kann eine Klasse an Antisense-Molekülen verwendet werden, um mRNA zu inaktivieren, um die Expression der Rezeptor-Nucleinsäure zu verringern. Dementsprechend können diese Moleküle eine Erkrankung behandeln, die durch eine abnormale oder unerwünschte Rezeptor-Nucleinsäure-Expression charakterisiert ist. Dieses Verfahren umfasst die Spaltung mittels Ribozymen, die Nucleotidsequenzen enthalten, die komplementär zu einer oder mehreren Regionen in der mRNA sind, die die Fähigkeit der mRNA, translatiert zu werden, abschwächen. Mögliche Regionen umfassen kodierende Regionen und insbesondere kodierende Regionen, die den katalytischen und anderen funktionellen Aktivitäten des Rezeptor-Proteins entsprechen, wie z.B. die Ligandbindung.
• Die Rezeptor-Polynucleotide stellen ebenso Vektoren für die Gen-Therapie bei Patienten bereit, die Zellen aufweisen, die in der Rezeptor-Gen-Expression abnormal sind. Rekombinante Zellen, die die Patientenzellen umfassen, die ex vivo gentechnisch verändert wurden und dem Patienten wieder zugeführt wurden, werden daher in ein Individuum eingeführt, in dem die Zellen das gewünschte Rezeptor-Protein produzieren, um das Individuum zu behandeln.
• Die Erfindung umfasst ebenso Sets zur Detektion der Gegenwart einer Rezeptor-Nucleinsäure in einer biologischen Probe. Das Set kann z.B. Reagenzien umfassen, wie z.B. ein(e) markierte(s) oder ein(e) markierbare(s) Nucleinsäure oder Agens, die/das fähig ist, die Rezeptor-Nucleinsäure in einer biologischen Probe zu detektieren; Mittel zur Bestimmung der Menge der Rezeptor-Nucleinsäure in der Probe; sowie Mittel zum Vergleichen der Menge der Rezeptor-Nucleinsäure in der Probe mit einem Standard. Die Verbindung oder das Agens kann in einem geeigneten Behälter verpackt sein. Das Set kann weiters Anleitungen zur Verwendung des Sets zur Detektion einer Rezeptor-mRNA oder -DNA umfassen.
• Die oben genannte Offenbarung trifft auch auf die in Seq.-ID Nr. 4 dargestellte Sequenz zu.
• Vektoren/Wirtszellen
• Die Erfindung stellt auch Vektoren bereit, die die Rezeptor-Polynucleotide enthalten. Der Begriff „Vektor" bezieht sich auf ein Vehikel, vorzugsweise ein Nucleinsäure-Molekül, dass die Rezeptor-Polynucleotide transportieren kann. Ist der Vektor ein Nucleinsäure-Molekül, so sind die Rezeptor-Polynucleotide kovalent an die Vektor-Nucleinsäure gebunden. Mit diesem Aspekt der Erfindung umfasst der Vektor ein Plasmid, einen einzel- oder doppelsträngigen Phagen, einen einzel- oder doppelsträngigen viralen RNA- oder DNA-Vektor oder ein künstliches Chromosom, wie z.B. ein BAC, PAC, YAC oder MAC.
• Ein Vektor kann in der Wirtszelle als ein extrachromosomales Element beibehalten werden, wo er repliziert und zusätzliche Kopien der Rezeptor-Polynucleotide produziert. Alternativ dazu kann sich der Vektor in das Wirtszellen-Genom integrieren und zusätzliche Kopien der Rezeptor-Polynucleotide produzieren, wenn sich die Wirtszelle repliziert.
• Die Erfindung stellt Vektoren für den Erhalt (Klonierungsvektoren) oder Vektoren für die Expression (Expressionsvektoren) der Rezeptor-Polynucleotide bereit. Die Vekto ren können in prokaryotischen oder in eukaryotischen Zellen oder in beiden (Shuttle-Vektoren) funktionieren.
• Expressionsvektoren umfassen cis-agierende Regulationsregionen, die operabel im Vektor an die Rezeptor-Polynucleotide gebunden sind, sodass die Transkription der Polynucleotide in einer Wirtszelle ermöglicht wird. Die Polynucleotide können in die Wirtszelle mit einem separaten Polynucleotid eingeführt werden, das fähig ist, die Transkription zu beeinflussen. Daher kann das zweite Polynucleotid einen transagierenden Faktor bereitstellen, der mit der cis-Regulations-Kontrollregion wechselwirkt, um die Transkription der Rezeptor-Polynucleotide aus dem Vektor zu ermöglichen. Alternativ dazu kann ein trans-agierender Faktor von der Wirtszelle bereitgestellt werden. Schließlich kann ein trans-agierender Faktor aus dem Vektor selbst produziert werden.
• Es wird jedoch davon ausgegangen, dass in einigen Ausführungsformen die Transkription und/oder Translation der Rezeptor-Polynucleotide in einem zellfreien System erfolgen kann.
• Die Regulationssequenz, an die die hierin beschriebenen Polynucleotide operabel gebunden sein kann, umfasst Promotoren für die Steuerung der mRNA-Transkription. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, den linken Promotor aus Bakteriophagen λ, die lac-, TRP- und TAC-Promotoren aus E. coli, die frühen und späten Promotoren aus SV40, den unmittelbar frühen CMV-Promotor, die frühen und späten Adenovirus-Promotoren und die langen terminalen Wiederholungen eines Retrovirus.
• Zusätzlich zu Kontrollregionen, die die Transkription fördern, können Expressionsvektoren auch Regionen umfassen, die die Transkription modulieren, wie z.B. Repressor-Bindungsstellen und Enhancer. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer, den unmittelbar frühen Enhancer des Zytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer, Adenovirus-Enhancers und Retrovirus-LTR-Enhancer.
• Zusätzlich dazu, dass sie Stellen für die Transkriptionsinitiation und -kontrolle enthalten, können Expressionsvektoren auch Sequenzen, die für die Transkriptionstermination notwendig sind, sowie in der transkribierten Region eine Ribosombindungsstelle für die Translation enthalten. Andere Regulations-Kontrollelemente für die Expression umfassen Initiations- und Terminationscodons sowie Polyadenylierungssignale. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wäre über die zahlreichen Regulationssequenzen informiert, die in Expressionsvektoren nützlich sind. Solche Regulationssequenzen werden z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), beschrieben.
• Es können eine Reihe an Expressionsvektoren verwendet werden, um ein Rezeptor-Polynucleotid zu exprimieren. Solche Vektoren umfassen chromosomale, episomale und von Viren abstammende Vektoren, z.B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, aus Bakteriophagen, aus Hefe-Episomen, aus chromosomalen Elementen von Hefe, unter anderem künstliche Hefe-Chromosomen, aus Viren, wie z.B. aus Baculoviren, Papovaviren, wie z.B. SV40, Vakzinia-Viren, Adenoviren, Pockenviren, Pseudorabies-Viren und Retroviren, abstammen. Vektoren können ebenso aus Kombinationen dieser Quellen stammen, wie z.B. jene, die aus genetischen Elementen von Plasmiden und Bakteriophagen stammen, z.B. Cosmide und Phagemide. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für prokaryotische und eukaryotische Wirte werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), beschrieben.
• Die Regulationssequenz kann eine konstitutive Expression in einer oder mehren Wirtszellen (d.h. gewebespezifisch) bereitstellen, oder sie kann für eine induzierbare Expression in einem oder mehreren Zelltypen sorgen, z.B. durch Temperatur, Nährstoffadditiv oder exogenem Faktor, wie z.B. ein Hormon oder ein anderer Ligand. Eine Reihe an Vektoren, die für die konstitutive und induzierbare Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Wirten sorgen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt.
• Die Rezeptor-Polynucleotide können mittels wohlbekannter Methoden in die Vektor-Nucleinsäure eingeführt werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz, die als letztes exprimiert wird, durch Spalten der DNA-Sequenz und des Expressionsvektors mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen an einen Expressionsvektor gebunden, wonach die Fragmente aneinander ligiert werden. Verfahren für Restriktionsenzym-Verdau und Ligation sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
• Der Vektor, der das geeignete Polynucleotid enthält, kann in eine geeignete Wirtszelle zur Vermehrung oder Expression eingeführt werden, und zwar unter Verwendung wohlbekannter Verfahren. Bakterienzellen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, E. coli, Streptomyces und Salmonella typhimurium. Eukaryotische Zellen umfassen, sind jedoch nicht eigneschränkt auf, Hefe, Insektenzellen, wie z.B. Drosophila, Tierzellen, wie z.B. COS- und CHO-Zellen, und Pflanzenzellen.
• Wie hierin beschrieben, kann es erwünscht sein, das Polypeptid als ein Fusionsprotein zu exprimieren. Dementsprechend stellt die Erfindung Fusionsvektoren bereit, die die Produktion der Rezeptor-Polypeptide ermöglichen. Fusionsvektoren können die Expression eines rekombinanten Proteins erhöhen, die Löslichkeit des rekombinanten Proteins erhöhen und bei der Reinigung des Proteins helfen, indem sie z.B. als ein Ligand für die Affinitätsreinigung fungieren. Eine proteolytische Spaltungsstelle kann an der Verbindungsstelle der Fusionsgruppierung eingeführt werden, sodass das gewünschte Polypeptid schlussendlich von der Fusionsgruppierung getrennt werden kann. Proteolytische Enzyme umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Smith et al., Gene 67, 31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren. Beispiele für geeignete induzierbare Nicht-Fusions-E.-coli-Expressionsvektoren umfassen pTrc (Amann et al., Gene 69, 301-315 (1988)) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 60-89 (1990)).
• Rekombinante Protein-Expression kann in einem Wirtsbakterium maximiert werden, indem ein genetischer Hintergrund bereitgestellt wird, worin die Wirtszelle eine geschwächte Fähigkeit besitzt, das rekombinante Protein proteolytisch zu spalten (S. Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 119-128, Academic Press, San Diego, California (1990)). Alternativ dazu kann die Sequenz des Polynucleotids von Interesse verändert werden, um eine bevorzugte Codon-Verwendung für eine spezifische Wirtszelle, z.B. E. coli, bereitzustellen (Wada et al., Nucleic Acids Res. 20, 2111-2118 (1992)).
• Die Rezeptor-Polynucleotide können ebenso durch Expressionsvektoren exprimiert werden, die in Hefe operativ sind. Beispiele von Vektoren für die Expression in Hefe, z.B. S. cerevisiae, umfassen pYepSecl (Baldari et al., EMBO J. 6, 229-234 (1987)), pMFa (Kurjan et al., Cell 30, 933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54, 113-123 (1987)) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
• Die Rezeptor-Polynucleotide können ebenso in Insektenzellen exprimiert werden, z.B. unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren. Baculovirus-Vektoren, die für die Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (z.B. Sf9-Zellen) erhältlich sind, umfassen die pAc-Serie (Smith et al., Mol. Cell Biol. 3, 2156-2165 (1983)) und die pVL-Serie (Lucklow et al., Virology 170, 31-39 (1989)).
• In gewissen Ausführungsformen der Erfindung werden die hierin beschriebenen Polynucleotide in Säugetierzellen unter Verwendung von Säugetier-Expressionsvektoren exprimiert. Beispiele an Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (B. Seed, Nature 329, 840 (1987)) und pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6, 187-195 (1987)).
• Die hierin aufgelisteten Expressionsvektoren werden lediglich als Beispiel für die wohlbekannten Vektoren genannt, die für den Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung erhältlich sind, die nützlich wären, um die Rezeptor-Polynucleotide zu exprimieren. Der Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wäre sich der Tatsache bewusst, dass es andere für die Erhaltung, Vermehrung oder Expression der hierin beschrie benen Polynucleotide geeignete Vektoren gibt. Diese sind z.B. in J. Sambrook, E.F. Fritsh und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), zu finden.
• Die Erfindung umfasst auch Vektoren, in denen die hierin beschriebenen Nucleinsäure-Sequenzen in den Vektor in reverser Ausrichtung kloniert werden, jedoch operabel an eine Regulationssequenz gebunden sind, die die Transkription von Antisense-RNA ermöglicht. Daher kann ein Antisense-Transkript für alle der oder einen Teil der hierin beschriebenen Polynucleotidsequenzen, unter anderem sowohl kodierende als auch nicht-kodierende Regionen, produziert werden. Die Expression dieser Antisense-RNA hängt von jedem der oben in Verbindung mit der Expression der Sense-RNA beschriebenen Parameter ab (Regulationssequenzen, konstitutive oder induzierbare Expression, gewebespezifische Expression).
• Die Erfindung betrifft ebenso rekombinante Wirtszellen, die die hierin beschriebenen Vektoren enthalten. Wirtszellen umfassen daher prokaryotische Zellen, niedrigere eukaryotische Zellen, z.B. Hefe, andere eukaryotische Zellen, wie z.B. Insektenzellen, und höhere eukaryotische Zellen, wie z.B. Säugetierzellen.
• Die rekombinanten Wirtszellen werden durch Einführen der hierin beschriebenen Vektorkonstrukte in die Zellen durch Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung leicht zugänglich sind, hergestellt. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, kationische lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion, Lipofektion und andere Verfahren, wie z.B. jene, die in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harobr, NY (1989)) zu finden sind.
• Wirtszellen können mehr als einen Vektor enthalten. Unterschiedliche Nucleotid-Sequenzen können daher auf verschiedenen Vektoren derselben Zelle eingeführt werden. Auf ähnliche Art und Weise können die Rezeptor-Polynucelotide entweder alleine oder mit anderen Polynucleotiden eingeführt werden, die nicht mit den Rezeptor-Polynucleotiden verwandt sind, wie z.B. jene, die trans-agierende Faktoren für Expressionsvektoren bereitstellen. Wird mehr als ein Vektor in eine Zelle eingeführt, so können die Vektoren unabhängig voneinander eingeführt werden, zusammen eingeführt werden oder an den Rezeptor-Polynucleotid-Vektor gebunden werden.
• Im Fall von Bakteriophagen- und viralen Vektoren können diese unter Verwendung von Standardverfahren für die Infektion und Transduktion in Zellen als verpackte oder eingekapselte Viren eingeführt werden. Virale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefekt sein. Sollte die virale Replikation defekt sein, so kommt es in Wirtszellen, die jene Funktionen bereitstellen, die die Defekte komplementieren, zu der Replikation.
• Vektoren umfassen im Allgemeinen selektierbare Marker, die die Selektion der Subpopulation an Zellen ermöglichen, die die rekombinanten Vektorkonstrukte enthalten. Der Marker kann im selben Vektor enthalten sein, der die hierin beschriebenen Polynucleotide enthält, oder er kann sich auf einem separaten Vektor befinden. Marker umfassen Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz-Gene für prokaryotische Wirtszellen und Dihydrofolat-Reduktase oder Neomycin-Resistenz für eukaryotische Wirtszellen. Es ist jedoch jeder Marker, der eine Selektion für eine phänotypische Eigenschaft bereitstellt, wirksam.
• Während die reifen Proteine in Bakterien, Hefe, Säugetierzellen und anderen Zellen unter der Steuerung der geeigneten Regulationssequenzen hergestellt werden können, können auch zellfreie Transkriptions- und Translationssysteme verwendet werden, um diese Proteine unter Verwendung von RNA herzustellen, die von den hierin beschriebenen DNA-Konstrukten abstammt.
• Wo die Sekretion des Polypeptids gewünscht wird, werden geeignete Sekretionssignale in den Vektor inkorporiert. Die Signalsequenz kann zu den Rezeptor-Polypeptiden endogen oder zu diesen Polypeptiden heterolog sein.
• Wo das Polypeptid nicht in das Medium sekretiert wird, kann das Protein aus der Wirtszelle mittels Standard-Zerstörungsverfahren isoliert werden, unter anderem durch Gefrieren-Auftauen, Beschallung, mechanische Zerstörung, der Verwendung von Lysieragenzien und dergleichen. Das Polypeptid kann anschließend gewonnen und mittels wohlbekannter Reinigungsverfahren gereinigt werden, unter anderem durch Ammoniumsulfatpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie, Lectinchromatographie oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
• Es ist ebenso bekannt, dass, in Abhängigkeit von der Wirtszelle in rekombinanter Produktion der hierin beschriebenen Polypeptide, die Polypeptide verschiedene Glykosylierungsmuster aufweisen können, in Abhängigkeit von der Zelle, oder unter Umständen nicht glykosyliert sind, wie im Falle einer Produktion in Bakterien. Zusätzlich können die Polypeptide ein anfängliches modifiziertes Methionin enthalten, in einigen Fällen als Resultat eines wirtsvermittelten Verfahrens.
• Die oben genannte Offenbarung trifft auch auf die in Seq.-ID Nr. 3 oder 4 gezeigten Sequenzen zu.
• Verwendungen von Vektoren und Wirtszellen
• Die hierin beschriebenen, die Polypeptide exprimierenden Wirtszellen und insbesondere die rekombinanten Wirstzellen besitzen eine Reihe an Verwendungsmöglichkeiten. In erster Linie sind die Zellen für die Produktion von Rezetor-Proteinen oder -Polypeptiden nützlich, die weiter gereinigt werden können, um gewünschte Mengen an Rezeptor-Protein oder -Fragmenten herzustellen. Wirtszellen, die Expressionsvektoren enthalten, sind daher für die Polypeptid-Produktion nützlich.
• Wirtszellen sind ebenso nützlich, um zellbasierte Tests durchzuführen, die den Rezeptor oder die Rezeptor-Fragmente involvieren. Eine rekombinante Wirtszelle, die einen nativen Rezeptor exprimiert, ist daher nützlich, um auf Verbindungen zu testen, die die Rezeptor-Funktion stimulieren oder inhibieren. Dies umfasst die Ligandbindung, die Gen-Expression auf der Stufe der Transkription oder Translation, die G-Protein-Wechselwirkung sowie Komponenten des Signaltransduktionswegs.
• Wirtszellen sind ebenso zur Identifikation von Rezeptor-Mutanten, in denen diese Funktionen beeinträchtigt sind, nützlich. Falls die Mutanten natürlich vorkommen und eine Pathologie auslösen, so sind Wirtszellen, die die Mutationen enthalten, nützlich, um Verbindungen zu testen, die eine gewünschte Wirkung auf den Mutanten-Rezeptor haben (z.B. stimulierende oder inhibierende Funktion), die durch ihre Wirkung auf den nativen Rezeptor nicht angegeben sein muss.
• Rekombinante Wirtszellen sind ebenso nützlich, um die hierin beschriebenen chimären Polypeptide zu exprimieren, um Verbindungen zu untersuchen, die die Aktivierung mittels einer heterologen aminoterminalen extrazellulären Domäne (oder einer anderen Bindungsregion) aktivieren oder unterdrücken. Alternativ dazu kann eine heterologe Region, die die gesamte Transmembrandomäne (oder Teile davon) umspannt, verwendet werden, um die Wirkung einer gewünschten aminoterminalen extrazellulären Domäne (oder einer anderen Bindungsregion) auf eine beliebige Wirtszelle zu untersuchen. In dieser Ausführungsform wird eine Region, die die gesamte Transmembrandomäne (oder Teile davon) umspannt und mit der spezifischen Wirtszelle kompatibel ist, verwendet, um einen chimären Vektor herzustellen. Alternativ dazu kann eine heterologe carboxyterminale intrazelluläre Domäne (z.B. Signalübertragungs-Domäne) in die Wirtszelle eingeführt werden.
• Weiters können Mutanten-Rezeptoren kreiert werden, in denen eine oder mehrere der verschiedenen Funktionen gentechnisch verändert ist/sind, um erhöht oder verringert zu sein (z.B. Ligandbindung oder G-Protein-Bindung), und dazu verwendet werden, um die Anzahl der Rezeptor-Proteine in einem Individuum zu erhöhen oder diese zu ersetzen. Wirtszellen können daher durch das Ersetzen eines abnormalen Rezeptors oder durch das Bereitstellen eines abnormalen Rezeptors, der ein therapeutisches Resultat erzeugt, einen therapeutischen Vorteil mit sich bringen. In einer Ausführungsform stellen die Zellen Rezeptoren bereit, die in einem abnormalen Ausmaß aktiv sind.
• In einer anderen Auführungsform stellen die Zellen Rezeptoren bereit, die in einem abnormalen Ausmaß inaktiv sind. Diese Rezeptoren können mit endogenen Rezeptoren in dem Individuum konkurrieren.
• In einer anderen Ausführungsform werden Zellen, die Rezeptoren exprimieren, die nicht aktiviert werden können, in ein Individuum eingeführt, um mit endogenen Rezeptoren um einen Liganden zu konkurrieren. Im Fall, in dem z.B. überschüssiger Ligand Teil einer Behandlungsmodalität ist, kann es notwendig sein, diesen Liganden zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Behandlung zu inaktivieren. Das Bereitstellen von Zellen, die um den Liganden konkurrieren, jedoch nicht durch die Rezeptor-Aktivierung beeinträchtigt werden können, wäre vorteilhaft.
• Es können ebenso homolog rekombinante Wirtszellen hergestellt werden, die die Insitu-Veränderung von endogenen Rezeptor-Polynucleotidsequenzen in einem Wirtszellengenom ermöglichen. Diese Technologie wird ausführlicher in WO 93/09222, WO 91/12650 und US-Patent Nr. 5.641.670 beschrieben. Kurz gesagt, wird es spezifischen Polynucleotid-Sequenzen, die den Rezeptor-Polynucleotiden entsprechen, oder Sequenzen, die sich proximal oder distal zu einem Rezeptor-Gen befinden, ermöglicht, sich mittels homologer Rekombination in ein Wirtszellengenom zu integrieren, wo die Expression des Gens beeinflusst werden kann. In einer Ausführungsform werden Regulationssequenzen eingeführt, die die Expression einer endogenen Sequenz entweder erhöhen oder verringern. Dementsprechend kann ein Rezeptor-Protein in einer Zelle produziert werden, die es normalerweise nicht produziert, oder die erhöhte Expression des Rezeptor-Proteins kann dazu führen, dass eine Zelle das Protein in einem bestimmten Ausmaß normal produziert. Alternativ dazu kann das gesamte Gen deletiert werden. Weiters können ebenso spezifische Mutationen in jede gewünschte Region des Gens eingeführt werden, um Mutanten-Rezeptor-Proteine zu produzieren. Solche Mutationen könnten z.B. in die spezifischen funktio nellen Regionen, z.B. die Ligandbindungsstelle oder die G-Protein-Bindungsstelle, eingeführt werden.
• In einer Ausführungsform kann die Wirtszelle eine befruchtete Oozyte oder eine embryonale Stammzelle sein, die verwendet werden kann, um ein transgenes Tier herzustellen, das das veränderte Rezeptor-Gen in sich trägt. Alternativ dazu kann die Wirtszelle eine Stammzelle sein oder ein anderer früher Gewebevorläufer, aus der/dem eine spezifische Untergruppe an Zellen hervorgeht und die/der verwendet werden kann, um transgenes Gewebe in einem Tier herzustellen. Siehe auch Thomas et al., Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z.B. mittels Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen das eingeführte Gen homolog mit dem endogenen Rezeptor-Gen rekombiniert hat, werden ausgewählt (siehe z.B. E. Li et al., Cell 69, 915 (1992)). Die ausgewählten Zellen werden anschließend in eine Blastozyste eines Tieres (z.B. einer Maus) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden (siehe z.B. A. Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, 113-152, E.J. Robertson (Hrsg.), (IRL, Oxford) (1987)). Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes scheinträchtiges weibliches Ammentier implantiert werden, und der Embryo kann ausgetragen werden. Nachkommen, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen in sich tragen, können verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tieres die homolog rekombinierte DNA mittels Keimbahntransmission des Transgens enthalten. Verfahren zur Konstruktion homologer Rekombinationsvektoren und homologer rekombinanter Tiere werden weiters in A. Bradley, Current Opinion in Biotechnology 2, 823-829 (1991), und in den Internationalen PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 90/11354; WO 91/01140; und WO 93/04169 beschrieben.
• Die gentechnisch veränderten Wirtszellen können verwendet werden, um nicht-menschliche transgene Tiere herzustellen. Ein transgenes Tier ist vorzugsweise ein Säugetier, z.B. ein Nagetier, wie etwa eine Ratte oder eine Maus, in dem eine oder mehrere der Zellen des Tiers ein Transgen inkludieren. Ein Transgen besteht aus exogener DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transge nes Tier entwickelt und die im Genom des erwachsenen Tiers in einem oder mehreren Zelltypen oder Geweben des transgenen Tiers verbleibt. Diese Tiere sind für das Studium der Funktion eines Rezeptor-Proteins und für die Identifikation und Evaluation von Modulatoren der Rezeptor-Protein-Aktivität von Nutzen.
• Weitere Beispiele transgener Tiere umfassen nicht-menschliche Primaten, Schafe, Hunde, Kühe, Ziegen, Hühner und Amphibien.
• In einer Ausführungsform ist eine Wirtszelle eine befruchtete Oozyte oder eine embryonale Stammzelle, in die Rezeptor-Polynucleotid-Sequenzen eingeführt wurden.
• Ein transgenes Tier kann durch Einführen von Nucleinsäure in die männlichen Vorkerne einer befruchteten Oozyte, z.B. mittels Mikroinjektion, retroviraler Infektion, hergestellt werden, und es kann der Oozyte ermöglicht werden, sich in einem scheinträchtigen weiblichen Ammentier zu entwickeln. Jede der Rezeptor-Nucleotidsequenzen kann als ein Transgen in das Genom eines nicht-menschlichen Tiers, wie z.B. einer Maus, eingeführt werden.
• Jede der Regulations- oder der anderen Sequenzen, die in Expressionsvektoren nützlich sind, können Teil der transgenen Sequenz sein. Dies umfasst intronische Sequenzen und Polyadenylierungssignale, falls diese noch nicht inkludiert sind. Gewebespezifische Regulationssequenz(en) kann/können operabel an das Transgen gebunden sein, um die Expression des Rezeptor-Proteins zu bestimmten Zellen zu steuern.
• Verfahren zur Herstellung transgener Tiere mittels Embryo-Manipulation und Mikroinjektion, insbesondere Tiere, wie etwa Mäuse, sind auf dem Gebiet der Erfindung zu traditionellen Verfahren geworden und werden z.B. in US-Patent Nr. 4.736.866 und 4.870.009, beide von Leder et al., US-Patent Nr. 4.873.191 von Wagner et al. und in B. Hogan, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1986), beschrieben. Ähnliche Verfahren werden zur Herstellung anderer transgener Tiere verwendet. Ein transgenes Gründertier kann basie rend auf der Gegenwart des Transgens in seinem Genom und/oder der Expression von transgener mRNA in Geweben oder Zellen des Tieres identifiziert werden. Ein transgenes Gründertier kann anschließend verwendet werden, um zusätzliche Tiere zu züchten, die das Transgen in sich tragen. Weiters können transgene Tiere, die ein Transgen in sich tragen, weiter zu anderen transgenen Tieren gezüchtet werden, die andere Transgene in sich tragen. Ein transgenes Tier umfasst ebenso Tiere, in denen das gesamte Tier oder Gewebe in dem Tier unter Verwendung der hierin beschriebenen homolog rekombinanten Wirtszellen hergestellt wurden.
• In einer anderen Ausführungsform können transgene nicht-menschliche Tiere hergestellt werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des Transgens ermöglichen. Ein Beispiel eines solchen Systems ist das cre/loxP-Rekombinase-System von Bakteriophage 1. Für eine Beschreibung des cre/loxP-Rekombinase-Systems siehe z.B. Lakso et al., PNAS 89, 6232-6236 (1992). Ein weiteres Beispiel eines Rekombinase-Systems ist das FLP-Rekombinase-System von S. cerevisiae (O'Gorman et al., Science 251, 1351-1355 (1991)). Wird ein cre/loxP-Rekombinase-System verwendet, um die Expression des Transgens zu regulieren, so sind Tiere erforderlich, die Transgene enthalten, die sowohl für die Cre-Rekombinase als auch für ein selektiertes Protein kodieren. Solche Tiere können durch die Konstruktion von „doppelten" transgenen Tieren bereitgestellt werden, z.B. durch das Kreuzen von zwei transgenen Tieren, von denen eines ein Transgen enthält, das für ein ausgewähltes Protein kodiert, und das andere ein Transgen enthält, das für eine Rekombinase kodiert.
• Klone der hierin beschriebenen, nicht-menschlichen transgenen Tiere können ebenso gemäß der von I. Wilmut et al., Nature 385, 810-813 (1997), und in den Internationalen PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 97/07668 und WO 97/07669 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Kurz gesagt, kann eine Zelle, z.B. eine somatische Zelle, aus dem transgenen Tier isoliert werden und dazu induziert werden, den Wachstumszyklus zu beenden und in die Go-Phase einzutreten. Die ruhende Zelle kann dann, z.B. durch die Verwendung von elektrischen Impulsen, mit einer entkernten Oozyte aus einem Tier derselben Spezies fusioniert werden, aus der die ruhende Zelle isoliert wurde. Die rekonstruierte Oozyte wird anschließend gezüchtet, sodass sie sich zu einer Morula oder Blastozyste entwickelt, und wird anschließend in ein scheinträchtiges weibliches Ammentier transferiert. Die von diesem weiblichen Ammentier zur Welt gebrachte Nachkommenschaft ist ein Klon des Tieres, aus dem die Zelle, z.B. die somatische Zelle, isoliert wurde.
• Transgene Tiere, die rekombinante Zellen enthalten, die die hierin beschriebenen Polypeptide exprimieren, sind nützlich, um die hierin beschriebenen Tests in einem In-vivo-Kontext durchzuführen. Dementsprechend könnten die verschiedenen physiologischen Faktoren, die in vivo vorhanden sind und die die Ligandbindung, Rezeptoraktivierung und Signalübertragung ausführen könnten, aus zellfreien oder zellbasierten In-vitro-Tests nicht klar erkennbar sein. Dementsprechend ist es nützlich, nicht-menschliche transgene Tiere bereitzustellen, um die Rezeptor-Funktion in vivo zu testen, unter anderem die Ligandwechselwirkung, die Wirkung spezifischer Mutanten-Rezeptoren auf die Rezeptor-Funktion und die Ligandwechselwirkung sowie die Wirkung chimärer Rezeptoren. Es ist ebenso möglich, die Wirkung von Null-Mutationen zu testen, d.h. Mutationen, die eine oder mehrere Rezeptor-Funktionen im Wesentlichen oder vollständig eliminieren.
• Die oben genannte Offenbarung trifft ebenso auf die in Seq.-ID Nr. 3 und 4 gezeigten Sequenzen zu.
• Pharmazeutische Zusammensetzungen
• Die Rezeptor-Nucleinsäuremoleküle, Protein (insbesondere Fragmente, wie z.B. die aminoterminale extrazelluläre Domäne), Modulatoren des Proteins und Antikörper (hierin ebenso als „aktive Verbindungen" bezeichnet) können in pharmazeutische Zusammensetzungen inkorporiert werden, die zur Verabreichung an ein Individuum, z.B. einen Menschen, geeignet sind. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise das Nucleinsäuremolekül, Protein, den Modulator oder Antikörper und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
• Wie hierin verwendet, ist soll Begriff „pharmazeutisch annehmbarer Träger" ein beliebiges und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antifungale Agenzien, isotonische und absorptionsverzögernde Agenzien und dergleichen umfassen, die mit der pharmazeutischen Verabreichung kompatibel sind. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Die einzige Ausnahme ist, dass jedes beliebige herkömmliche Medium oder Agens mit der aktiven Verbindung inkompatibel ist, wobei diese Medien in den Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können. Ergänzende aktive Verbindungen können ebenso in die Zusammensetzungen inkorporiert werden. Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung wird so formuliert, dass sie mit ihrem gedachten Verabreichungsweg kompatibel ist. Beispiele für Verabreichungswege umfassen parenterale, z.B. intravenöse, intradermale, subkutane, orale (z.B. Inhalation), transdermale (topische), transmucosale und rektale Verabreichung. Lösungen oder Suspensionen, die für eine parenterale, intradermale oder subkutane Anwendung verwendet werden, können die folgenden Komponenten umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel, wie z.B. Wasser, zur Injektion, Salzlösung, fette Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Agenzien, wie z.B. Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie z.B. Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner, wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, z.B. Acetate, Citrate oder Phosphate, und Agenzien zur Anpassung der Tonizität, wie z.B. Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mit Säuren oder Basen, wie z.B. Salzsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Das parenterale Präparat kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachdosen-Phiolen aus Glass oder Kunststoff eingeschlossen sein.
• Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Injektion geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen (falls wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Puder zur extemporierten Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Für die intravenöse Verabreichung umfassen geeignete Träger physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor ELJ (BASF, Parsippany, NJ) oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). In allen Fällen muss die Zusammenset zung steril sein und sollte bis zu dem Grad, bei dem eine leichte Spritzbarkeit gegeben ist, flüssig sein. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien oder Fungi, geschützt werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das z.B. Wasser, Ethanol, Polyol (z.B. Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen) enthält, sowie geeignete Gemische daraus. Die richtige Fluidität kann z.B. durch die Verwendung eines Überzugs, wie z.B. Lecithin, durch den Erhalt der erforderlichen Partikelgröße im Falle einer Dispersion oder durch die Verwendung von Tensiden beibehalten werden. Die Prävention der Wirkung von Mikkoorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Agenzien, z.B. Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, erreicht werden. In vielen Fällen wird es bevorzugt, isotonische Agenzien, z.B. Zucker, Polyalkohole, wie etwa Mannit, Sorbit, Natriumchlorid, in die Zusammensetzung zu inkludieren. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch das Inkludieren eines Agens in die Zusammensetzung erreicht werden, das die Absorption verzögert, z.B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
• Sterile injizierbare Lösungen können durch das Inkorporieren der aktiven Verbindung (z.B. ein Rezeptor-Protein oder Anti-Rezeptor-Antikörper) in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination von Bestandteilen, wie sie oben aufgezählt wurden, je nach Anforderung, hergestellt werden, gefolgt von einer filtrierten Sterilisation. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch das Inkorporieren der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel hergestellt, das ein basisches Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile aus den oben aufgelisteten enthält. Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen zählen zu den bevorzugten Herstellungsverfahren das Vakuumtrocknen und das Gefriertrocknen, wodurch ein Pulver des aktiven Bestandteils plus eines beliebigen zusätzlichen gewünschten Bestandteils aus einer zuvor steril-filtrierten Lösung davon erhalten wird.
• Orale Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen sein oder zu Tabletten gepresst sein. Zur oralen Verabreichung kann das Agens in enterischen Formen enthalten sein, um den Magen zu überleben, oder weiter beschichtet oder gemischt sein, um in einer bestimmten Region des GI-Trakts mittels bekannter Verfahren freigesetzt zu werden. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung in Exzipienten inkorporiert werden und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können ebenso unter Verwendung eines flüssigen Trägers zur Verwendung als Mundwasser hergestellt werden, worin die Verbindung im flüssigen Träger oral angewandt wird, damit gegurgelt wird und ausgespuckt oder geschluckt wird. Pharmazeutisch kompatible Bindungsagenzien und/oder Adjuvanzien können als Teil der Zusammensetzung inkludiert sein. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können einen beliebigen der folgenden Bestandteile enthalten oder Verbindungen einer ähnlichen Art: ein Bindemittel, wie z.B. mikrokristalline Zellulose, Tragantgummi oder Gelatine; einen Exzipienten, wie z.B. Stärke oder Lactose, ein Aufschlußmittel, wie z.B. Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel, wie z.B. Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel, wie z.B. kolloidales Siliciumdioxid; einen Süßstoff, wie z.B. Saccharose oder Saccharin; oder einen Geschmacksstoff, wie z.B. Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangengeschmack.
• Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in der Form eines Aerosol-Sprays aus unter Druck stehenden Behältern oder Dispensern, die ein geeignetes Treibmittel enthalten, wie z.B. ein Gas, wie z.B. Kohlendioxid, oder aus einem Zerstäuber bereitgestellt.
• Die systemische Verabreichung kann ebenso über transmucosale oder transdermale Mittel erfolgen. Für die transmucosale oder transdermale Verabreichung werden in der Formulierung Eindringmedien verwendet, die der zu durchdringenden Barriere angemessen sind. Solche Eindringmedien sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen z.B. für die transmucosale Verabreichung Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäurederivate. Die transmucosale Verabreichung kann durch die Verwendung von Nasensprays oder Suppositorien erfolgen. Für die transdermale Verabreichung werden die aktiven Verbindungen zu Salben, Pasten, Gelen oder Cremen formuliert, wie dies auf dem Gebiet der Erfindung im Allgemeinen bekannt ist.
• Die Verbindungen können ebenso in Form von Suppositorien hergestellt werden (z.B. mit herkömmlichen Suppositorienbasen, wie etwa Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder Retentionsklistieren zur rektalen Verabreichung.
• In einer Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, die die Verbindung gegen eine schnelle Elimination aus dem Körper schützen, wie z.B. eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, unter anderem Implantate und auf Mikroeinkapselung basierende Zufuhrsysteme. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie z.B. Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind dem Fachmann bekannt. Die Materialien können ebenso im Handel von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals Inc. erhalten werden. Liposomale Suspensionen (unter anderem Liposomen, die auf infizierte Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene abzielen) können ebenso als pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet werden. Diese können gemäß der auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. wie im US-Patent Nr. 4.522.811 beschrieben.
• Es ist besonders vorteilhaft, orale oder parenterale Zusammensetzungen für eine einfache Verabreichung und eine einheitliche Dosierung in Form von Dosiereinheiten zu formulieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich Dosiereinheits-Form auf physisch getrennte Einheiten, die sich als einzelne Dosierungen für das zu behandelnde Individuum eignen; jede Einheit enthält eine zuvor festgelegte Menge der aktiven Verbindung, von der errechnet wurde, dass sie die gewünschte therapeutische Wirkung erzeugt, zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger. Die Beschreibung für Dosiereinheits-Formen der Erfindung werden von den einzigartigen Charakteristika der aktiven Verbindung und der bestimmten, zu erreichenden therapeuti schen Wirkung sowie von den nach dem Stand der Technik der Wissenschaft innewohnenden Einschränkungen auf dem Gebiet der Mischungszubereitung einer solchen aktiven Verbindung zur Behandlung von Individuen festgelegt und hängen von diesen direkt ab.
• Die Nucleinsäure-Moleküle der Erfindung können in Vektoren insertiert werden und als Gentherapievektoren verwendet werden. Gentherapievektoren können einem Individuum z.B. durch intravenöse Injektion, lokale Verabreichung (US-Patent Nr. 5.328.470) oder durch stereotaktische Injektion (siehe z.B. Chen et al., PNAS 91, 3054-3057 (1994)) zugeführt werden. Die pharmazeutische Herstellung des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem annehmbaren Verdünnungsmittel umfassen oder eine Matrix zur langsamen Freisetzung umfassen, in die das Gen-Zufuhrvehikel eingebettet ist. Alternativ dazu kann das pharmazeutische Präparat in Fällen, in denen der vollständige Gen-Zufuhrvektor intakt aus rekombinanten Zellen, z.B. retroviralen Vektoren, hergestellt werden kann, eine oder mehrere Zellen umfassen, die das Gen-Zufuhrsystem herstellen.
• Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusammen mit Anweisungen zur Verabreichung in einem Behälter, einer Packung oder einem Dispenser inkludiert sein.
• Die oben genannte Offenbarung trifft auch auf die in Seq.-ID Nr. 3 und 4 dargestellten Sequenzen zu.
• Sequenzprotokoll

  
• 
• 
• 
• 
• 
• 

Claims (17)

1. Verfahren zur Identifizierung eines Mittels, das das Level oder die Aktivität eines Polypeptids in einer Zelle moduliert, oder das mit einem Polypeptid in einer Zelle in Wechselwirkung tritt, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus: (a) der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz; (b) der Aminosäure-Sequenz einer Allel-Variante der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz; (c) der Aminosäure-Sequenz oder einer Sequenzvariante der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz, wobei die Sequenzvariante durch ein Nucleinsäuremolekül codiert wird, das an das in SEQ ID NO: 2 bzw. 4 dargestellte Nuclsäuremolekül unter strengen Bedingungen hybridisiert; (d) einem Fragment der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz, worin das Fragment mindestens 10 angrenzende Aminosäuren aufweist; (e) der Aminosäure-Sequenz des reifen Rezeptor-Polypeptids von ca. Aminosäure 6 bis ca. Aminosäure 342, dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder 3; (f) der Aminosäure-Sequenz des in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Polypeptids von ca. mindestens Aminosäure 1 bis ca. Aminosäure 342; und (g) der Aminosäure-Sequenz eines Epitops, das eine Region eines der Polypeptide von (a) bis (f) trägt; und das Verfahren umfasst: (i) in Kontakt bringen des Mittels mit einer Zelle, die dazu fähig ist, das Polypeptid so zu exprimieren, dass das Level oder die Aktivität des Polypeptids in dieser Zelle durch das Mittel moduliert werden kann, wobei die Zelle abgeleitet ist aus Gehirn, CD34⁺-Zellen, B-Zellen, Skelettmuskel, Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Herz, Ganulozyten, Erythroblasten oder Pankreas; und (ii) Messen des Levels oder der Aktivität des Polypeptids.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Mittel eine Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und einem Zielmolekül für das Polypeptid moduliert, Stufe (i) unter Bedingungen ausgeführt wird, die es dem Polypeptid ermöglichen, mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung zu treten, und Stufe (ii) die Bestimmung der Bildung eines Komplexes zwischen dem Polypeptid und dem Zielmolekül oder die Bestimmung der Aktivität des Polypeptids als Ergebnis der Wechselwirkung des Polypeptids mit dem Zielmolekül umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Mittel das Level oder die Aktivität des Polypeptids erhöht.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Mittel das Level oder die Aktivität des Polypeptids verringert.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin Stufe (ii) aufweist: (1) Zugeben eines konkurrierenden Polypeptids, das mit dem Mittel in Wechselwirkung treten kann; und (2) Vergleichen des Grades der Wechselwirkung zwischen mit dem Mittel und dem Polypeptid mit dem Grad der Wechselwirkung in Abwesenheit des konkurrierenden Polypeptids.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Gehirnzelle eine Gliazelle ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zelle in vivo und nicht in einem Menschen vorhanden ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Zelle in einem nicht-menschlichen transgenen oder nicht-transgenen Tier vorhanden ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Zelle in vitro vorhanden ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Zelle zerstört wurde.
11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Zelle aus einer Biopsie resultiert oder eine natürlich vorkommende oder rekombinante Zelle in einer Zellkultur ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Mittel ausgewählt ist aus einem Peptid, einem Phosphopeptid, einem Antikörper, einem organischen Molekül und einem anorganischen Molekül.
13. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Polypeptids in einer Probe, wobei das Verfahren aufweist: (i) in Kontakt bringen der Probe mit einem Antikörper, der die spezifische Bestimmung der Gegenwart des Polypeptids in der Probe ermöglicht; und (ii) Bestimmen der Gegenwart des Polypeptids, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus: (a) der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz; (b) der Aminosäure-Sequenz einer Allel-Variante der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz; (c) der Aminosäure-Sequenz oder einer Sequenzvariante der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz, wobei die Sequenzvariante durch ein Nucleinsäuremolekül codiert wird, das an das in SEQ ID NO: 2 bzw. 4 dargestellte Nuclsäuremolekül unter strengen Bedingungen hybridisiert; (d) einem Fragment der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz, worin das Fragment mindestens 10 angrenzende Aminosäuren aufweist; (e) der Aminosäure-Sequenz des reifen Rezeptor-Polypeptids von ca. Aminosäure 6 bis ca. Aminosäure 342, dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder 3; (f) der Aminosäure-Sequenz des in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Polypeptids von ca. mindestens Aminosäure 1 bis ca. Aminosäure 342; und (g) der Aminosäure-Sequenz eines Epitops, das eine Region eines der Polypeptide von (a) bis (f) trägt; und worin die Probe aus einer Zelle abgeleitet ist, die ausgewählt ist aus Gehirn, CD34⁺, B, Skelettmuskel, Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Herz, Granulozyten, Erithroblasten und Pankreaszellen.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Bestimmung in einer Zelle durchgeführt wird, die sich von einem Subjekt ableitet, das eine Erkrankung aufweist, die mit dieser Zelle zu tun hat.
15. Verfahren zur Identifizierung eines Mittels, das das Level oder die Aktivität eines Nucleinsäuremoleküls in einer Zelle moduliert, oder das mit einem Nucleinsäuremolekül in einer Zelle in Wechselwirkung tritt, wobei das Nucleinsäuremolekül eine Nulceinsäure-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus: (a) der in SEQ ID NO: 2 oder 4 dargestellten Nucleotid-Sequenz; (b) einer Nucleotid-Sequenz, die die in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellte Aminosäure-Sequenz codiert; (c) einer zu einer der Nucleotid-Sequenzen in (a) oder (b) komplementären Nucleotid-Sequenz; (d) einer Nucleotid-Sequenz, die eine Aminosäure-Sequenz einer Sequenzvariante der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz codiert, die an die in SEQ ID NO: 2 bzw. 4 dargestellte Nucleotid-Sequenz unter strengen Bedingungen hybridisiert; (e) einer Nucleotid-Sequenz, die zur Nucleotid-Sequenz in (d) komplementär ist; (f) einer Nucleotid-Sequenz, die ein Fragment der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz codiert, wobei das Fragment mindestens 10 angrenzende Aminosäuren aufweist; und (g) einer Nucleotid-Sequenz, die zu der Nucleotid-Sequenz in (f) komplementär ist; und das Verfahren umfasst: (i) in Kontakt bringen des Mittels mit einer Zelle, die dazu fähig ist, das Nucleinsäuremolekül so zu exprimieren, dass das Level oder die Aktivität des Nucleinsäuremoleküls in der Zelle durch das Mittel moduliert werden kann, wobei die Zelle abgeleitet ist aus Gehirn, CD34⁺-Zellen, B-Zellen, Skelettmuskel, Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Herz, Granulozyten, Erythroblasten oder Pankreas, und (ii) Messen des Levels oder der Aktivität des Nucleinsäuremoleküls.
16. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (i) in Kontakt bringen der Probe mit einem Mittel, das eine spezifische Bestimmung der Anwesenheit des Nucleinsäuremoleküls in der Probe ermöglicht, und (ii) Bestimmen der Anwesenheit des Nucleinsäuremoleküls oder Fragments davon, wobei das Nucleinsäuremolekül eine Nucleotid-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus: (a) der in SEQ ID NO: 2 oder 4 dargestellten Nucleotid-Sequenz, (b) einer Nucleotid-Sequenz, die die in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellte Aminosäure-Sequenz codiert; (c) einer Nucleotid-Sequenz, die zu einer der Nucleotid-Sequenzen in (a) oder (b) komplementär ist; (d) einer Nucleotid-Sequenz, die eine Aminosäure-Sequenz einer Sequenzvariante der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz codiert, die an die in SEQ ID NO: 2 bzw. 4 dargestellte Nucleotid-Sequenz unter strengen Bedingungen hybridisiert; (e) einer Nucleotid-Sequenz, die zur Nucleotid-Sequenz in (d) komplementär ist; (f) einer Nucleotid-Sequenz, die ein Fragment der in SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz codiert, wobei das Fragment mindestens 10 angrenzende Aminosäuren aufweist; und (g) einer Nucleotid-Sequenz, die zur Nucleotid-Sequenz in (f) komplementär ist; wobei die Probe abgeleitet ist aus einem Gewebe, ausgewählt aus Gehirn, CD34⁺-Zellen, B-Zellen, Skelettmuskel, Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Mandeln, Kolon, Herz, Granulozyten, Erythroblasten und Pankreas, und wobei das Mittel ein Oligonucleotid aufweist, das an eine der Nucleotidsäure-Sequenzen von (a) bis (g) unter strengen Bedingungen hybridisiert, und Stufe (ii) das Bestimmen umfasst, ob das Oligonucleotid an die Nucleinsäure-Sequenz in der Probe bindet.
17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Nucleinsäure mRNA ist.