DE60129228T2

DE60129228T2 - Humane 7-transmembranproteine und dafür codierende polynukleotide

Info

Publication number: DE60129228T2
Application number: DE60129228T
Authority: DE
Inventors: D. Wade Spring WALKE; John Pearland SCOVILLE; Gregory Portage DONOHO; C. Alexander The Woodlands TURNER; Glenn c/o BCM Technologies Houston FRIEDRICH; Alejandro The Woodlands ABUIN; Brian The Woodlands ZAMBROWICZ; Arthur T. The Woodlands Sands
Original assignee: Lexicon Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Lexicon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: CA2403633A1; DE60129228D1; AU4956901A; WO2001072842A2; AU2001249569B2; EP1311544A2; ATE366261T1; WO2001072842A3; US20020045740A1; US20050064466A1; EP1311544B1; JP2004507216A

Description

Die vorliegende Anmeldung beansprucht den Rechtsvorteil der am 28. März 2000 eingereichten vorläufigen US-Anmeldung 60/192,978 .
1. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und Charakterisierung von neuen menschlichen Polynucleotiden, die membranassoziierte Proteine und Rezeptoren codieren. Die Erfindung umfasst die beschriebenen Polynucleotide, Expressionssysteme von Wirtszellen, die codierten Proteine, Fusionsproteine, Polypeptide und Peptide sowie gentechnisch veränderte Tiere, denen die beschriebenen Polynucleotide fehlen oder welche die beschriebenen Polynucleotide oder Antagonisten und Agonisten der Proteine und anderer Verbindungen überexprimieren, welche die Expression oder Aktivität der von den beschriebenen Polynucleotiden codierten Proteine modulieren, die für die Diagnose, das Medikamentenscreening, die Überwachung klinischer Versuche und/oder die Behandlung von Krankheiten und Beschwerden eingesetzt werden können.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Membranrezeptor-Proteine können als integrale Komponenten von Zellmechanismen zum Erkennen ihrer Umgebung und zur Aufrechterhaltung der Zellhomöostase und -funktion dienen. Dementsprechend spielen Membranrezeptor-Proteine oft in Stoffwechselwegen der Signaltransduktion eine Rolle, welche die Physiologie der Zelle, die chemische Kommunikation und die Genexpression kontrollieren. Eine besonders relevante Klasse von Membranrezeptoren sind solche, die typischerweise durch das Vorkommen von 7 konservierten Transmembran-Domänen gekennzeichnet sind, welche über nicht-konservierte hydrophile Schleifen miteinander verbunden sind. Solche "7TM-Rezeptoren" enthalten eine als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GCPRs) bekannte Rezeptor-Superfamilie. GPCRs spielen typischerweise in Stoffwechselwegen der Signaltransduktion eine Rolle, bei denen G-Proteine und PPG-Proteine beteiligt sind. Als solche umfasst die GPCR-Familie viele Rezeptoren, von denen bekannt ist, dass sie als Medikamenten-Zielorte für therapeutische Wirkstoffe dienen.
In Valve et al., (1999) "Two polymorphisms in the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma gene are associated with severe overweight among obese women" J. Clin. Endocrinol. 84(1): 3708-3712 werden zwei Polymorphismen im PPARγ-Gen beschrieben, welche mit einem erhöhten Gewicht bei finnischen Frauen in Zusammenhang stehen.
In der WO 00/06592 werden die Sequenzen von Nucleinsäuren offenbart, die einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor codieren, der an der sensorischen Transduktion beteiligt ist.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und Charakterisierung von Nucleotiden, welche neue GPCRs und die entsprechenden neuen GPCR-(NGPCR)-Aminosäuresequenzen codieren. Die hier zum ersten Mal beschriebenen NGPCRs sind Transmembranproteine, welche die Zellmembran überspannen und nach der Bindung eines Liganden an der Signal-Transduktion beteiligt sind. Die beschriebenen NGPCRs weisen in der 7TM-Rezeptorfamilie gefundene strukturelle Eigenheiten auf. Die Expression der beschriebenen NGPCRs lässt sich in menschlichen Hoden- und Nierenzellen nachweisen. Die hier beschriebenen neuen menschlichen GPCR-Sequenzen codieren Proteine mit einer Länge von 841, 763, 366 und 234 Aminosäuren (siehe jeweils die SEQ ID NOs 2, 4, 6 und 8). Die beschriebenen NGPCRs verfügen über eine charakteristische Leader-Sequenz und enthalten mehrfache für die 7TM-Proteine charakteristische Transmembran-Regionen (von etwa 20-30 Aminosäuren) sowie einige vorhergesagte cytoplasmatische Domänen.
Zusätzlich ins Auge gefasst sind "Knockout"-ES-Zellen, die unter Einsatz konventioneller Verfahren (siehe z.B. die am 20. Februar 1998 eingereichte PCT-Anmeldung PCT/US98/03243 ) bearbeitet worden sind. Dementsprechend umfasst ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung KO-Zellen und -Tiere mit gentechnisch erzeugten Mutationen in den die hier beschriebenen NGPCRs codierenden Polynucleotiden.
Die Erfindung umfasst die im Sequenzprotokoll wiedergegebenen Nucleotide, solche Nucleotide exprimierende Wirtszellen und die Expressionsprodukte solcher Nucleotide sowie: (a) Nucleotide, welche Säugetier-Homologe der beschriebenen NGPCRs codieren, einschließlich der speziell beschriebenen menschlichen NGPCRs und der menschlichen NGPCR-Genprodukte; (b) Nucleotide, welche einen oder mehrere Abschnitte der NGPCRs codieren, welche den funktionellen Domänen entsprechen, sowie die durch derartige Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte, einschließlich, aber nicht ausschließlich, der neuen Regionen der beschriebenen extrazellulären Domäne(n) (ECD), eine oder mehrere der hier zum ersten Mal beschriebenen Transmembran-Domäne(n) (TM) sowie die cytoplasmatische(n) Domäne(n) (CD); (c) isolierte Nucleotide, welche erzeugte oder natürlich vorkommende Mutanten der beschriebenen NGPCRs codieren, in denen alle oder ein Teil von zumindest einer der Domänen deletiert oder verändert sind, sowie die durch solche Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte, einschließlich, aber nicht ausschließlich, löslicher Rezeptoren, in welchen alle oder ein Teil der TM deletiert sind, sowie nicht-funktionelle Rezeptoren, in welchen die gesamte CD oder ein Teil davon deletiert ist: (d) Nucleotide, die Fusionsproteine codieren, welche die codierende Region aus einem NGPCR oder eine von deren an ein anderes Peptid oder Polypeptid fusionierten Domänen enthalten (z.B. eine extrazelluläre Domäne).
Die Erfindung umfasst auch Agonisten und Antagonisten der beschriebenen NGPCRs, einschließlich kleiner Moleküle, großer Moleküle, mutanter NGPCRs oder Abschnitte derselben, welche mit nativem NGCPR, Peptiden und Antikörpern konkurrieren sowie Nucleotidsequenzen, die eingesetzt werden können, um die Expression der beschriebenen NGPCRs zu hemmen (z.B. Antisense- und Ribozymmoleküle sowie Ersatz-Konstrukte für Gene oder regulatorische Sequenzen) oder um die Expression der beschriebenen NGPCR- Polynucleotide zu unterstützen (z.B. Expressions-Konstrukte, welche die beschriebenen Polynucleotide unter die Kontrolle eines starken Promotorsystems stellen) sowie transgene Tiere, welche ein NGPCR-Transgen exprimieren oder "Knock-outs" (die bedingt sein können), welche kein funktionelles NGPCR exprimieren. KO-Mäuse lassen sich auf verschiedene Weise produzieren, von denen eine den Einsatz von Stammzelllinien von Mäuseembryonen ("ES-Zellen") betrifft, welche in einem murinen Homologen von zumindest einem der beschriebenen NGPCRs gene-trag-Mutationen enthält. Wenn die in SEQ ID NOs: 1-9 beschriebenen Unique-NGPCR-Sequenzen "ausgeknockt" werden, liefern sie sowohl ein Verfahren zur Identifizierung der Expression des Phänotyps des besonderen Gens als auch ein Verfahren, das zuvor unbekannten Genen eine Funktion zuordnet. Darüber hinaus sind die in SEQ ID NOs: 1-9 beschriebenen Unique-NGPCR-Sequenzen für die Identifizierung der codierenden Sequenz und das Mapping eines Unique-Gens auf einem besonderen Chromosom von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner auch Verfahren zur Verwendung der beschriebenen NGPCR-Gene und/oder NGPCR-Genprodukte zur Identifizierung von Verbindungen, welche modulieren, d.h. als Agonisten oder Antagonisten der NGPCR-Genexpression und/oder der NGPCR-Genaktivität wirken. Solche Verbindungen lassen sich als therapeutische Mittel für die Behandlung verschiedener mit biologischen Beschwerden oder Unausgewogenheiten einhergehender Symptome einsetzen.
Die Erfindung stellt die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls und von Polypeptiden der Erfindung in einem Verfahren zur Diagnose einer Gewichtsstörung, einem Verfahren zum Wirkstoffscreening zur Verwendung bei der Behandlung einer Gewichtsstörung oder einem Verfahren zur Überwachung eines klinischen Versuchs einer Behandlung einer Gewichtsstörung zur Verfügung unter der Bedingung, dass Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und Diagnostizierverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden, nicht beansprucht sind.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung gemäß der Erfindung oder eines Epitop bindenden Fragments oder Derivats des Antikörpers, z.B., eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers, eines einsträngigen Antikörpers, eines Gab Fragments, eines F(ab')₂, eines mittels einer Fab Expressionsbibliothek oder eines antiidiotypischen (Anti Id) Antikörpers hergestellten Fragments, in einem Verfahren zur Diagnose einer Gewichtsstörung, einem Verfahren zum Wirkstoffscrenning zur Verwendung bei der Behandlung einer Gewichtsstörung oder in einem Verfahren zur Überwachung eines klinischen Versuchs einer Behandlung einer Gewichtsstörung zur Verfügung, mit der Einschränkung, dass Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und Diagnostizierverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden, nicht beansprucht sind.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder eines Epitop-bindenden Fragments oder Derivats des Antikörpers, beispielsweise eines polyklonalen oder eines monoklonalen Antikörpers, eines einsträngigen Antikörpers, eines Fab-Fragments, eines F(ab')₂, eines mittels einer Fab Expressionsbibliothek hergestellten Fragments oder eines antiidiotypischen (Anti-Id) Antikörpers, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Gewichtsstörung zur Verfügung.
Für die Verwendung als Medikament zur Behandlung einer Gewichtsstörung stellt die Erfindung auch ein Antisense-Nukleinsäuremolekül, welches die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids inhibiert, sowie für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Gewichtsstörung die Verwendung eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, welches die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids inhibiert, zur Verfügung.
4. BESCHREIBUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS UND DER FIGUREN
Das Sequenzprotokoll gibt die Sequenz von 4 NGPCR-ORFs, die von diesen codierten Aminosäuresequenzen sowie ein ORF mit den umgebenden 5'- und 3'-Regionen (SEQ ID NO: 9) wieder.
5. GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die hier zum ersten Mal beschriebenen menschlichen NGPCRs stellen neue Rezeptorproteine dar, die in menschlichen Zellen exprimiert werden. Die beschriebenen NGPCR-Sequenzen wurden erhalten, indem Sequenzen aus humanen gene-trapped-Zellen und aus cDNA-Klonen eingesetzt wurden, welche aus cDNA-Bibliotheken von menschlichen Nieren und Hoden isoliert wurden (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD, Clontech, Palo Alto, CA). Die beschriebenen NGPCRs sind Transmembran-Proteine, die zu der 7TM-Rezeptorfamilie gehören. Wie bei anderen GPCRs wird eine Signal-Transduktion ausgelöst, wenn sich ein Ligand an den Rezeptor bindet. Ein Eingriff bei der Bindung des natürlichen Liganden oder eine Neutralisation oder Entfernung des Liganden oder ein Eingriff bei seiner Bindung an einen NGPCR bewirkt eine NGPCR-vermittelte Signal-Transduktion. Wegen ihrer biologischen Bedeutung sind 7TM- und insbesondere GPCR-Proteine einer intensiven wissenschaftlich/kommerziellen Untersuchung unterzogen worden (für Anwendungen, Einsatz, und Assays mit den beschriebenen NGPCRs, siehe z.B. die am 19. März 1997 eingereichte US-Anmeldung 08/820,521 und die am 17. April 1997 eingereichte Anmeldung 08/833,226 ). Die hier beschriebenen NGPCRs weisen mit den Geschmacks- und Pheromon-Rezeptoren, den Calcium-Rezeptoren und den Peptidhormon-Rezeptoren von Säugetieren eine signifikante Homologie auf.
Die beschriebenen NGPCRs teilen auch eine Ähnlichkeit mit metabotropen Aminosäure- oder Glutamat-Rezeptoren. Metabotrope Glutamat-Rezeptoren sind mit einer Neurodegeneration, epileptischen Anfällen, Schizophrenie und anderen Nerven- oder Verhaltensstörungen in Zusammenhang gebracht worden. Als solches ist diese Unterklasse von Rezeptoren Gegenstand bedeutender Untersuchungen gewesen, wie dies in den US-Patenten 5,869,609 , 5,912,122 , 5,981,195 und 6,001,581 und der US-Anmeldung 60/085,973 zum Ausdruck kommt, in welchen verwandte Zusammensetzungen und Assays und deren Verwendung beschrieben werden.
Die Erfindung umfasst sowohl die Verwendung der beschriebenen NGPCR-Nucleotide, NGPCR-Proteiene und -Peptide als auch Antikörper, vorzugsweise humanisierte monoklonale Antikörper, oder Bindungs-Fragmente, Domänen oder Fusionsproteine derselben an die NGPCRs (welche z.B. als NGPCR-Agonisten oder -Antagonisten wirken können), Antagonisten, welche die Rezeptor-Aktivität oder -Expression hemmen, oder Agonisten, welche bei der Diagnose oder Behandlung einer Erkrankung die Rezeptor-Aktivität aktivieren oder dessen Expression erhöhen.
Die in den unten stehenden Unterabschnitten beschriebene Erfindung umfasst insbesondere NGPCR-Polypeptide oder -Peptide, welche funktionellen Domänen des NGPCR (z.B. der ECD, der TM, oder der CD), mutierten, eingekürzten oder deletierten NGPCRs (z.B. NGPCRs, denen eine oder mehrere funktionelle Domänen oder Abschnitte derselben fehlen, wie z.B. ΔECD, ΔTM und/oder ΔCD), NGPCR-Fusionsproteinen (z.B. einem NGPCR oder einer funktionellen Domäne eines NGPCR, wie z.B. dem an ein nicht verwandtes Protein oder Peptid wie z.B. einer konstanten Immunglobulin-Region, d.h. IgFc, fusioniertem ECD, solche Produkte codierenden Nucleotidsequenzen und einem Wirtszell-Expressionssystem, das solche NGPCR-Produkte produzieren kann, entsprechen.
Die Erfindung umfasst auch Antikörper und antiidiotypische Antikörper (einschließlich der Fab-Fragmente), Antagonisten und Agonisten des NGPCR sowie Verbindungen oder Nucleotidkonstrukte, welche die Expression eines NGPCR-Gens hemmen (Inhibitoren des Transkriptionsfaktors, Antisense- und Ribozymmoleküle oder Konstrukte für den Ersatz von Genen oder regulatorischen Sequenzen) oder die Expression eines NGPCR begünstigen (z.B. Expressionskonstrukte, in denen die NGPCR-codierenden Sequenzen funktionsfähig mit Kontrollelementen der Expression wie z.B. Promotoren, Promotor/Enhancern usw. assoziiert sind). Die Erfindung betrifft auch gentechnisch veränderte Wirtszellen und Tiere, um die menschlichen NGPCRs (oder Mutanten derselben) zu exprimieren oder um die Expression der endogenen NGPCR-Gene des Tieres zu hemmen oder "auszuknocken".
Die NGPCR-Proteine oder NGPCR-Peptide, NGPCR-Fusionsproteine, NGPCR-Nucleotidsequenzen, Antikörper, Antagonisten und Agonisten können für den Nachweis mutierter NGPCRs oder ungeeignet exprimierter NGPCRs für die Diagnose einer Krankheit von Nutzen sein. Die NGPCR-Proteine oder -Peptide, NGPCR-Fusionsproteine, NGPCR-Nucleotidsequenzen, Expressionssysteme von Wirtszellen, Antikörper, Antagonisten, Agonisten und gentechnisch manipulierte Zellen und Tiere können zum Auffinden von Arzneimitteln (oder dem mit hohem Durchsatz erfolgenden Screening von kombinatorischen Bibliotheken) zum Einsatz kommen, die bei der Behandlung von symptomatischen oder phänotypischen Anzeichen einer Störung der normalen NGPCR-Funktion im Körper wirksam sind. Die Verwendung von behandelten Wirtszellen und/oder Tieren kann insofern einen Vorteil bieten, als solche Systeme nicht nur die Identifizierung von Verbindungen erlauben, die sich an eine ECD eines NGPCR binden, sondern auch Verbindungen identifizieren können, welche das von einem aktivierten NGPCR transduzierte Signal beeinflussen können.
Schließlich lassen sich die NGPCR-Proteinprodukte (besonders lösliche Derivate wie Peptide, die der NGPCR-ECD entsprechen, oder eingekürzte Polypeptide ohne eine oder mehrere TM-Domänen) und die Fusionsprotein-Produkte (besonders NGPCR-Ig-Fusionsproteine, d.h. Fusionen eines NGPCR oder einer NGPCR-Domäne, z.B. ECD, ΔTM, an ein IgFc), die Antikörper und antiidiotypischen Antikörper (einschließlich der Fab-Fragmente), die Antagonisten und Agonisten (einschließlich der Verbindungen, welche die Signal-Transduktion modulieren, die in einem NGPCR-vermittelten Stoffwechselweg der Signal-Transduktion auf downstream gelegene Ziele einwirken können) für die Therapie solcher Erkrankungen einsetzen. Beispielsweise würde die Verabreichung einer wirksamen Menge von löslicher NGPCR-ECD, ΔTM oder einem ECD-IgFc-Fusionsprotein oder einem antiidiotypischen Antikörper (oder dessen Fab), der die NGPCR-ECD nachahmt, den endogenen NGPCR-Liganden "wegwischen" oder "neutralisieren" und die Bindung und Aktivierung des Rezeptors verhindern oder vermindern.
Nucleotid-Konstrukte, die derartige NGPCR-Produkte codieren, können dazu verwendet werden, Wirtszellen gentechnisch zu manipulieren, damit sie solche Produkte in vivo exprimieren; diese gentechnisch manipulierten Zellen wirken im Körper als "Bioreaktoren", indem sie einen kontinuierlichen Strom von NGPCR, eines NGPCR-Peptids, einer löslichen ECD oder ΔTM oder eines NGPCR-Fusionsproteins, welche einen NGPCR-Liganden "wegwischen" oder "neutralisieren" würden, an den Körper abgeben. Nucleotid-Konstrukte, welche funktionelle NGPCRs, mutierte NGPCRs sowie Antisense- und Ribozymmoleküle codieren, lassen sich auch in Versuchen einer "Gentherapie" für die Modulation der NGPCR-Expression verwenden. Somit umfasst die Erfindung auch pharmazeutische Formulierungen.
Verschiedene Aspekte der Erfindung werden genauer weiter unten in den Unterabschnitten beschrieben.
5.1 DIE NGPCR-POLYNUCLEOTIDE
Die cDNA-Sequenzen und die entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenzen der beschriebenen menschlichen NGPCRs werden im Sequenzprotokoll wiedergegeben. Während der Sequenzierung der beschriebenen NGPCRs wurden einige Polymorphismen identifiziert, nämlich: ein C- oder T-Austausch an der z.B. vom Nucleotid 320 der SEQ ID NO: 1 wiedergegebenen Position, was zu einem entsprechenden an Aminosäureposition 107 von z.B. der SEQ ID NO: 2 vorkommenden S (bevorzugt) oder F führt; ein A- oder G-Austausch an der z.B. vom Nucleotid 1114 der SEQ ID NO: 1 wiedergegebenen Position, was zu einem entsprechenden an Aminosäureposition 372 von z.B. der SEQ ID NO: 2 vorkommenden A (bevorzugt) oder T führt, sowie ein stiller C- oder T-Austausch an der z.B. vom Nucleotid 2526 der SEQ ID NO: 1 wiedergegebenen Position. Die Regionen der SEQ ID NOs 3-8, welche den oben angegebenen Regionen entsprechen, können ebenfalls, sofern sie geeignet sind, die beschriebenen Polymorphismen zeigen.
Die NGPCRs der vorliegenden Erfindung umfassen: (a) die im Sequenzprotokoll wiedergegebenen DNA-Sequenzen des Menschen und zusätzlich jede Nucleotidsequenz, welche ein angrenzendes und funktionelles offenes Leseraster (ORF) für einen NGPCR codiert, das an eine Komplementärsequenz einer im Sequenzprotokoll wiedergegebenen DNA-Sequenz unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert, z.B. eine Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C (Ausubel, F.M., et al., Hrg., 1989, Current Protocols in Molecular Bioliogy, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New York auf S. 2.10.3). und ein funktionell äquivalentes Genprodukt codiert. Zusätzlich ist jede Nucleotidsequenz ins Auge gefasst, die an die Komplementärsequenz von DNA-Sequenzen hybridisiert, welche eine im Sequenzprotokoll unter moderat stringenten Bedingungen angegebene Aminosäuresequenz codieren und exprimieren, z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel et al., 1989, supra) und immer noch ein funktionell äquivalentes NGPCR-Genprodukt codiert. Funktionelle Äquivalente eines NGPCR umfassen in anderen Spezies natürlich vorkommende NGPCRs und NGPCR-Mutanten, unabhängig davon, ob sie natürlich vorkommen oder gentechnisch manipuliert wurden Die Erfindung umfasst auch degenerierte Varianten der beschriebenen Sequenzen.
Zusätzlich ins Auge gefasst sind Polynucleotide, welche NGPCR-ORFs oder deren funktionelle Äquivalente codieren, die von Polynucleotidsequenzen codiert werden, welche zu etwa 99, 95, 90 oder etwa 85% ähnlich oder identisch mit entsprechenden Regionen der im Sequenzprotokoll beschriebenen Polynucleotidsequenzen sind (gemessen mit der BLAST-Sequenzvergleichs-Analyse unter Verwendung von z.B. dem GCG-Sequenzanalyse-Softwarepaket mit Hilfe von Default-Paramertern).
Die Erfindung umfasst auch Nucleinsäuremoleküle, vorzugsweise DNA-Moleküle, welche an die beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen hybridisieren und daher deren Komplementärsequenzen darstellen. Derartige Hybridisierungsbedingungen können, wie oben beschrieben, hoch stringent oder weniger hoch stringent sein. In Fällen, wo die Nucleinsäuremoleküle Deoxyoligonucleotide ("DNA-Oligos") sind, sind solche Moleküle im Allgemeinen etwa 16 bis etwa 100 Basen oder etwa 20 bis etwa 80 oder etwa 34 bis 45 lang oder jede Variation oder Kombination der angegeben Größen, welche eine angrenzende Region einer zum ersten Mal im Sequenzprotokoll offenbarten Sequenz umfassen. Derartige Oligonucleotide können zusammen mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) zum Durchsuchen von Bibliotheken, zur Isolierung von Klonen und zur Herstellung von Klonierungs- und Sequenzierungs-Matrizen usw. verwendet werden.
Alternativ lassen sich derartige NGPCR-Oligonucleotide als Hybridisierungssonden zum Durchsuchen von Bibliotheken und zur Bewertung von Genexpressionsmustern (insbesondere unter Einsatz eines Mikroarrays oder "Chip"-Formats mit hohem Durchsatz) verwenden. Darüber hinaus kann eine Reihe der beschriebenen NGPCR-Oligonucleotidsequenzen oder deren Komplementärsequenzen dazu benutzt werden, die ganzen oder einen Abschnitt der beschriebenen NGPCR-Sequenzen darzustellen. Eine zuerst in mindestens einem Abschnitt von einer oder mehreren der Sequenzen der SEQ ID NOs: 1-9 offenbartes Oligonucleotid oder Polynucleotid kann zusammen mit einer (einem) festen Trägermatrix/Substrat (Harze, Kügelchen, Membranen, Kunststoffe, Polymere, metallische oder metallisierte Substrate, kristalline oder polykristalline Substrate usw.) als Hybridisierungssonde eingesetzt werden. Von besonderer Bedeutung sind räumlich ansteuerbare Arrays (d.h. Gen-Chips, Mikotiterplatten usw.) von Oligonucleotiden und Polynucleotiden oder die entsprechenden Oligopeptide und Polypeptide, wobei mindestens ein auf dem räumlich ansteuerbaren Array vorkommendes Biopolymer eine zuerst in mindestens einer der Sequenzen der SEQ ID NOs: 1-9 wiedergegebene Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenz oder eine von denen codierte Aminosäuresequenz umfasst. Verfahren zum Anheften von Biopolymeren an oder zur Synthese von Biopolymeren auf festen Trägermatrizes und die Durchführung von Bindungsstudien darauf werden u.a. in den US-Patenten 5,700,637 , 5,556,752 , 5,744,305 , 4,631,211 , 5,445,934 , 5,252,743 , 4,713,326 , 5,424,186 und 4,689,405 beschrieben, deren Offenbarungen hiermit in ihrer Gesamtheit als Referenz eingeführt werden.
Ansteuerbare Arrays mit den zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-9 wiedergegebenen Sequenzen können zur Identifizierung und Charakterisierung der zeitlichen und gewebsspezifischen Expression eines Gens benutzt werden. Diese ansteuerbaren Arrays enthalten Oligonucleotidsequenzen von ausreichender Länge, um die geforderte Spezifität zu erbringen, die aber immer noch innerhalb der von der Produktionstechnik auferlegten Grenzen liegt. Die Länge dieser Sonden liegt im Bereich von ca. 8 bis ca. 2000 Nucleotiden. Vorzugsweise bestehen die Sonden aus 60 Nucleotiden und mehr bevorzugt aus 25 Nucleotiden von den zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-9 beschriebenen Sequenzen.
Beispielsweise kann eine Reihe der beschriebenen Oligonucleotidsequenzen oder deren Komplementärsequenzen im Chip-Format benutzt werden, um alle oder einen Teil der beschriebenen Sequenzen darzustellen. Die Oligonucleotide, typischerweise mit einer Länge von ca. 16 bis ca. 40 Nucleotiden (oder jeder ganzen Zahl zwischen dem angegebenen Bereich), können sich teilweise überlappen und/oder die Sequenz kann durch Einsatz von sich nicht überlappenden Oligonucleotiden dargestellt werden. Entsprechend sollen die beschriebenen Polynucleotidsequenzen typischerweise mindestens zwei oder drei voneinander verschiedene Oligonucleotidsequenzen von mindestens 8 Nucleotiden Länge umfassen, die jeweils zum ersten Mal in dem beschriebenen Sequenzprotokoll offenbart werden. Solche Oligonucleotidsequenzen können an jedem Nucleotid beginnen, das in einer Sequenz im Sequenzprotokoll vorkommt und entweder in Sense-Richtung (5'- nach 3') gegenüber der beschriebenen Sequenz oder in Antisense-Richtung fortschreiten.
Mit einer auf Mikroarrays basierenden Analyse lässt sich ein breites Spektrum von genetischer Aktivität entdecken, was zu einem neuen Verständnis der Genfunktionen und dem Gewinnen neuer und unerwarteter Einsichten in die Prozesse der Transkription sowie die biologischen Mechanismen führt. Der Einsatz von ansteuerbaren Arrays mit den zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-9 offenbarten Sequenzen liefert eine genaue Information über in einem spezifischen Stoffwechselweg eine Rolle spielende Veränderungen bei der Transkription, was möglicherweise zur Identifizierung neuer Komponenten oder Genfunktionen führt, die sich selbst als neue Phänotypen zu erkennen geben.
Sonden, die aus zuerst in den SEQ ID NOs: 1-9 offenbarten Sequenzen bestehen, können auch zur Identifizierung, Auswahl und Bestätigung von neuen molekularen Zielen für die Entdeckung von Arzneimitteln verwendet werden. Die Verwendung von diesen einmaligen Sequenzen erlaubt die direkte Bestätigung von Arzneimittelzielen und die Erkennung von arzneimittelabhängigen Veränderungen bei der Genexpression, welche über Stoffwechselwege moduliert werden, die sich von dem beabsichtigten Ziel für das Arzneimittel unterscheiden. Diese Unique-Sequenzen sind daher auch für die Definition und Überwachung von sowohl der Arzneimittelwirkung als auch der Toxizität von Nutzen.
Als Beispiel für ihre Nützlichkeit können die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-9 offenbarten Sequenzen in Mikroarrays oder anderen Array-Formaten Verwendung finden, um Sammlungen genetischen Materials von Patienten, welche in einer besonderen medizinischen Verfassung sind, zu durchsuchen. Diese Untersuchungen können auch durchgeführt werden, indem die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-9 offenbarten Sequenzen in silico eingesetzt werden und indem zuvor gesammelte genetische Datenbanken und die offenbarten Sequenzen mit Hilfe einer dem Fachmann bekannten Computer-Software miteinander verglichen werden
Somit lassen sich die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-9 offenbarten Sequenzen zur Identifizierung von mit einer besonderen Krankheit einhergehenden Mutationen sowie als diagnostischer oder prognostischer Assay einsetzen.
Obwohl die hier beschriebenen Sequenzen speziell mit Hilfe ihrer Nucleotidsequenz beschrieben worden sind, sollte darauf hingewiesen werden, dass sich jede der Sequenzen auch allein durch Verwendung eines breiten Spektrums von zusätzlichen strukturellen Attributen oder Kombinationen derselben beschreiben lässt. Beispielsweise lässt sich eine gegebene Sequenz durch die Nettozusammensetzung der in einer vorgegebenen Region der Sequenz vorkommenden Nucleotide zusammen mit einer oder mehreren der in den SEQ ID NOs: 1-9 offenbarten Sequenz(en) beschreiben. Alternativ kann eine Restriktionskarte, welche die relativen Positionen der Orte für einen Verdau mit einem Restriktionsenzym angibt oder verschiedene Palindromsequenzen oder andere spezifische Sequenzen herangezogen werden, um die Struktur einer gegebenen Sequenz zu beschreiben. Derartige Restriktionskarten, die typischerweise von in breitem Umfang zur Verfügung stehenden Computerprogrammen erstellt werden (z.B. das GCG-Sequenz-Analyse-Paket der Universität von Wisconsin, das SEQUENCHER 3.0 von der Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI usw.) können wahlweise zusammen mit einer oder mehreren diskreten Nucleotidsequenz(en) verwendet werden, die in der Sequenz vorkommen, welche durch die relative Position der Sequenz in Bezug auf eine oder mehrere zusätzliche Sequenz(en) oder einen oder mehrere in der offenbarten Sequenz vorkommende Restriktionsorte beschrieben werden kann. Für Oligonucleotid-Sonden können sich hoch stringente Bedingungen z.B. auf das Waschen in 6 × SSC/0,05% Natriumpyrophosphat bei 37°C (für Oligos von 14 Basen), 48°C (für Oligos von 17 Basen), 55°C (für Oligos von 20 Basen) und 60°C (für Oligos von 23 Basen) beziehen.
Die beschriebenen Oligonucleotide können NGPCR-Antisnese-Moleküle codieren oder als solche wirken, welche z.B. für die Regulation des NGPCR-Gens von Nutzen sind (für und/oder als Antisense-Primer in Amplifikationsreaktionen der Nucleinsäuresequenzen des NGPCR.Gens). Bezüglich der Regulation des NGPCR-Gens können solche Techniken Verwendung finden, um biologische Funktionen zu regulieren. Ferner können derartige Sequenzen als Teil der Ribozym- und/oder der Tripelhelixsequenzen verwendet werden, die ebenfalls für die Regulation des NGPCR-Gens von Nutzen sind.
Die Antisense-Oligonucleotide können zusätzlich mindestens einen modifizierten Basenanteil umfassen, der ausgewählt ist aus der Gruppe mit einschließlich, aber nicht ausschließlich, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminoethyl-2-thiouracil, β-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
Die Antisense-Oligonucleotide können auch mindestens einen modifizierten Zuckerrest umfassen, der ausgewählt ist aus der Gruppe mit einschließlich aber nicht ausschließlich, Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst das Antisense-Oligonucleotid mindestens ein modifiziertes Phosphatgrundgerüst, das ausgewählt ist aus der Gruppe Phosphordithionat, Phosphordithioat, Phosphoramidat, Phosphordiamidat, Methylphosphonat, Alkylphosphotriester und Formacetal oder Analoge derselben.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Oligonucleotid ein α-anomeres Oligonucleotid. Ein α-anomeres Oligonucleotid bildet mit komplentärer RNA spezifische doppelsträngige Hybride, in welchen im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641). Das Oligonucleotid ist ein 2'-O-Methylribonucleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analoges (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).
Die Oligonucleotide der Erfindung lassen sich nach den im Stand der Technik bekannten Standardverfahren synthetisieren, z.B. unter Einsatz eines automatischen Syntheseapparates (wie er im Handel von Biosearch, Applied Biosystems, usw. erworben werden kann). Beispielsweise lassen sich Phosphorthioat-Oligonucleotide nach dem Verfahren von Stein et al. synthetisieren (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209) und Methylphosphonat-Oligonucleotide können durch Einsatz von kontrollierten Polymerträgern mit porösem Glas (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451), usw. synthetisiert werden.
Niedrig stringente Bedingungen sind dem Fachmann wohl bekannt und sie variieren in voraussagbarer Weise, je nach den spezifischen Organismen, aus denen die Bibliothek und die markierten Sequenzen stammen. In Bezug auf Anleitungen für solche Bedingungen siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (sowie periodische Updates davon), Cold Spring Harbor Press, N.Y.; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates an Wiley Interscience, N.Y.
Alternativ können geeignet markierte NGPCR-Nucleotidsonden eingesetzt werden, um unter Verwendung von passend stringenten Bedingungen oder mittels der PCR eine menschliche Genom-Bibliothek zu durchsuchen. Zur Identifizierung von Polymorphismen ist die Identifizierung und Charakterisierung von menschlichen Genom-Klonen, die Ermittlung der Genomstruktur eines gegebenen Locus/Allels und das Konzipieren von diagnostischen Tests hilfreich. Sequenzen, die z.B. aus Regionen stammen, welche neben den Intron/Exon-Grenzen des menschlichen Gens liegen, können dazu verwendet werden, Primer zur Verwendung in Amplifikationstests zu entwerfen, um in den Exons, Introns, Spleißorten (z.B. Spleißakzeptor- und/oder -donorstellen) usw. Mutationen nachzuweisen, was in der Diagnostik und den Pharmacogenomics verwendet werden kann.
Ferner kann aus der Nucleinsäure von einem betreffenden Organismus das Homologe eines NGPCR-Gens isoliert werden, indem unter Verwendung von zwei degenerierten Oligonucleotid-Primer-Pools, welche auf Grundlage der Aminosäuresequenzen innerhalb der hier offenbarten NGPCR-Produkte konzipiert wurden, eine PCR durchgeführt wird. Die Matrize für die Reaktion kann Gesamt-RNA, -mRNA und/oder -cDNA sein, welche mittels reverser Transkription von mRNA erhalten wurden, die aus humanen oder nicht humanen Zelllinien oder Geweben gewonnen wurde, von denen bekannt war oder vermutet wurde, dass sie ein Allel eines NGPCR-Gens exprimieren.
Das PCR-Produkt kann subkloniert und sequenziert werden, um sicher zu stellen, dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenz des gewünschten NGPCR-Gens darstellen. Das PCR-Fragment kann dazu verwendet werden, nach verschiedenen Verfahren einen cDNA-Klon in voller Länge zu isolieren. Das amplifizierte Fragment kann z.B. markiert und dazu benutzt werden, um eine cDNA-Bibliothek wie z.B. eine Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek zu durchsuchen. Alternativ kann das markierte Fragment dazu verwendet werden, über das Screening einer Genom-Bibliothek genomische Klone zu isolieren.
Die PCR-Technologie kann auch eingesetzt werden, um cDNA-Sequenzen in voller Länge zu isolieren. RNA lässt sich z.B. mit Standardverfahren aus einer passenden Zell- oder Gewebequelle (d.h. eine von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie ein NGPCR-Gen exprimiert) isolieren. Auf der RNA lässt sich eine Reaktion mit reverser Transkription (RT) durchführen, indem ein Oligonucleotid-Primer eingesetzt wird, der für das 5'-Ende des amplifizierten Fragments zum Priming der Synthese des ersten Stranges spezifisch ist. Unter Einsatz einer Standardreaktion mit terminaler Transferase kann dann das erhaltene RNA/DNA-Hybrid mit einem "Schwanz" versehen werden, das Hybrid kann mit RNAse H verdaut werden und das Priming der Synthese des zweiten Stranges kann dann mit einem komplementären Primer erfolgen. Somit lassen sich upstream zu dem amplifizierten Fragment gelegene cDNA-Sequenzen leicht isolieren. Zu einem Überblick über die Klonierungsstrategien, die eingesetzt werden können, siehe z.B. Sambrook et al., 1989, supra.
Eine ein mutantes NGPCR-Gen codierende cDNA lässt sich z.B. durch Einsatz der PCR isolieren. In diesem Falle kann der erste DNA-Strang synthetisiert werden, indem ein Oligo-dT-Oligonucleotid an mRNA hybridisiert wird, die aus einem Gewebe isoliert wurde, von dem bekannt war oder vermutet wurde, dass es in einem Individuum exprimiert wird, das vermutlich ein mutiertes NHP-Allel aufweist, und indem der neue Strang mit reverser Transkriptase verlängert wird. Der zweite Strang der cDNA wird sodann unter Einsatz eines Oligonucleotids synthetisiert, das spezifisch an das 5'-Ende des normalen Gens hybridisiert. Unter Einsatz dieser beiden Primer wird das Produkt dann mittels der PCR amplifiziert, wahlweise in einen geeigneten Vektor kloniert und mit dem Fachmann vertrauten Verfahren einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Durch Vergleich der DNA-Sequenz des mutierten NGPCR-Allels mit der eines entsprechenden normalen NGPCR-Allels lässt (lassen) sich die Mautation(en) feststellen, die verantwortlich für den Verlust oder die Veränderung der Funktion des Produkts des mutierten NGPCR-Gens ist (sind).
Alternativ lässt sich eine Genom-Bibliothek unter Einsatz einer DNA aufbauen, die aus einem Individuum erhalten wurde, von dem vermutet wurde oder bekannt war, dass es ein mutiertes NGPCR-Allel aufweist Ein normales NGPCR-Gen oder jedes geeignete Fragment desselben kann sodann markiert und als Sonde eingesetzt werden, um in derartigen Bibliotheken das entsprechende mutierte NGPCR-Allel zu identifizieren. Die mutierte NGPCR-Gensequenz enthaltende Klone können dann gereinigt und nach dem Fachmann bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse unterzogen werden.
Darüber hinaus lässt sich eine Expressions-Bibliothek erstellen, indem eine cDNA verwendet wird, die z.B. aus einer RNA synthetisiert wird, welche aus einem Gewebe isoliert wurde, von dem bekannt war oder vermutet wurde, dass es ein mutiertes NGPCR-Allel in einem Individuum exprimiert, von dem vermutet wurde oder bekannt war, dass es ein derartiges mutiertes Allel aufweist. Auf diese Weise können von dem vermeintlich mutierten Gewebe produzierte Genprodukte exprimiert und unter Einsatz von standardisierten Antikörper-Screening Techniken zusammen mit, wie weiter unten in Abschnitt 5.3. beschrieben, gegen das normale NGPCR-Produkt gerichteten Antikörpern einem Screening unterzogen werden (Zu den Screening-Techniken siehe z.B. Harlow E. und Lane, Hrg., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).
Zusätzlich kann das Screening durch ein Screening mit markierten NGPCR-Fusionsproteinen wie z.B. alkalische Phosphatase-NGPCR oder den Fusionsproteinen von NGPCR-alkalischer Phosphatase erfolgen. In den Fällen, wo eine NGPCR.Mutation zu einem exprimierten Genprodukt mit veränderter Funktion führt (z.B. als Ergebnis einer Missense- oder Frameshift-Mutation), geht ein polyklonaler Satz von gegen ein NGPCR gerichteten Antikörpern mit dem mutierten NGPCR-Genprodukt wahrscheinlich eine Kreuzreaktion ein. Die über ihre Reaktion mit solchen markierten Antikörpern nachgewiesenen Bibliotheks-Klone können gereinigt und nach dem Fachmann bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse unterzogen werden.
Die Erfindung umfasst auch: Nucleotidsequenzen, welche für mutierte NGPCRs, Peptidfragmente von NGPCRs, eingekürzte NGPCRs und NGPCR-Fusionsproteine codieren. Diese umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Nucleotidsequenzen, welche die unten beschriebenen mutanten NGPCRs codieren; Polypeptide oder Peptide, die einer oder mehreren ECD-, TM- und/oder CD-Domänen des NGPCR oder Abschnitten dieser Domänen entsprechen; eingekürzte NGPCRs, in denen eine oder zwei Domänen deletiert sind, z.B. ein löslicher NGPCR, dem die TM- oder sowohl die TM- als auch die CD-Region fehlt, oder ein eingekürzter nicht funktioneller NGPCR, welchem die gesamte oder nur ein Teil der CD-Region fehlt. Fusionsproteine codierende Nucleotide können sein, jedoch nicht ausschließlich, NGPCR-Sequenzen in voller Länge, eingekürzte NGPCRs oder Nucleotide, welche Peptidfragmente des NGPCR codieren, die an ein nicht verwandtes Protein oder Peptid fusioniert sind, wie z.B. eine Transmembran-Sequenz, welche die NGPCR-ECD an der Zellmembran verankert; eine IgFc-Domäne, welche die Stabilität und Halbwertszeit des erhaltenden Fusionsproteins (z.B. NGPCR-Ig) im Blutstrom erhöht; oder ein Enzym, fluoreszierendes Protein oder ein lumineszierendes Protein, das als Marker verwendet werden kann.
Eine zusätzliche Anwendung der beschriebenen neuen menschlichen Polynucleotidsequenzen besteht in ihrer Verwendung bei der molekularen Mutagenese/Evolution von Proteinen, welche zumindest teilweise von den beschriebenen neuen Sequenzen codiert werden, indem z.B. das Polynucleotid-Shuffling oder verwandte methodische Vorgehensweisen eingesetzt werden. Solche Ansätze werden z.B. in den US-Patenten 5,830,721 und 5,837,458 beschrieben.
Die Erfindung umfasst auch: (a) DNA-Vektoren, die eine der vorstehenden NGPCR-codierenden Sequenzen und/oder deren Komplementärsequenzen (d.h. Antisense) enthalten; (b) DNA-Expressionsvektoren, welche eine der vorstehenden NGPCR-codierenden Sequenzen enthalten, die funktionsfähig mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, das die Expression der codierenden Sequenzen lenkt (z.B. ein Baculovirus, wie im US-Patent 5,869,336 beschrieben); und (c) gentechnisch veränderte Wirtszellen, welche eine der vorstehenden NGPCR-codierenden Sequenzen enthalten, die funktionsfähig mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, das in der Wirtszelle die Expression der codierenden Sequenzen lenkt. Der hier verwendete Begriff regulatorische Elemente umfasst, jedoch nicht ausschließlich, induzierbare und nicht induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere dem Fachmann bekannte Elemente, welche die Expression lenken und regulieren. Solche regulatorischen Elemente sind, jedoch nicht ausschließlich, das Immidiate Early Gen des Cytomegalovirus (hCMV), regulierbare Viruselemente (insbesondere LTR-Promotoren von Retroviren), der Early- oder Late-Promotor des SV40 Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, die Hauptoperator- und -promotorabschnitte des Lambdaphagen, die Kontrollabschnitte des fd-Coat-Proteins, der Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), die Promotoren der sauren Phosphatase und die Promotoren der α-Mating-Faktoren der Hefe.
5.2 NGPCR-PROTEINE UND -POLYPEPTIDE
NGPCR-Proteine, -Polypeptide und -Peptidfragmente, mutierte, eingekürzte oder zerstörte Formen des NGPCR und/oder der NGPCR-Fusionsproteine lassen sich für verschiedene Verwendungen herstellen. Diese Verwendungen sind, jedoch nicht ausschließlich, die Erzeugung von Antikörpern, die Verwendung als Reagenzien in diagnostischen Assays, die Identifizierung von anderen mit einem NGPCR in Zusammenhang stehenden zellulären Genprodukten, die Verwendung als Reagenzien in Assays zum Screening nach Verbindungen, die als pharmazeutische Reagenzien bei der therapeutischen Behandlung von mentalen, biologischen oder medizinischen Erkrankungen (d.h. Tempo der Herzschläge usw.) oder Krankheiten von Nutzen sein können.
Das Sequenzprotokoll gibt die von den beschriebenen NGPCR-Polynucleotiden codierten Aminosäuresequenzen wieder. Die NGPCRs verfügen über Initiations-Methionine in DNA-Sequenz-Kontexten, welche mit einer Initiationsstelle für die Translation übereinstimmen, gefolgt von für Membran-assoziierte Proteine typischen hydrophoben Signalsequenzen. Die hier vorgelegten Sequenz-Daten zeigen, dass es für die NGPCRs alternativ gespleißte Formen gibt (welche gewebsspezifisch sein können oder auch nicht).
Die NGPCR-Aminosäuresequenzen der Erfindung umfassen sowohl die im Sequenzprotokoll wiedergegebene Nucleotid- und Aminosäuresequenzen als auch Analoge und Derivate derselben. Ferner werden von der Erfindung auch entsprechende NGPCR-Homologe von anderen Spezies mit umfasst. Faktisch liegt jedes von den oben beschriebenen NGPCR-Nucleotidsequenzen codierte NGPCR-Protein im Geltungsbereich der Erfindung so wie alle neuen Polynucleotidsequenzen, die alle oder jeden neuen Abschnitt einer im Sequenzprotokoll wiedergegebenen Aminosäuresequenz codieren. Die degenerierte Natur des genetischen Codes ist gut bekannt und entsprechend steht für jede im Sequenzprotokoll wiedergegebene Aminosäure generisch das bekannte "Triplett"-Codon für die Aminosäure oder in vielen Fällen Codons, welche die Aminosäure codieren können. Als solche sollen die im Sequenzprotokoll wiedergegebenen Aminosäuresequenzen zusammen mit dem genetischen Code (siehe z.B. Tabelle 4-1 auf Seite 109 von "Molecular Cell Biology", 1986, J. Darnell et al., Hrg., Scientific American Books, New York) generisch für alle verschiedenen Permutationen und Kombinationen von Nucleinsäuresequenzen stehen, welche derartige Aminosäuresequenzen codieren können.
Die Erfindung umfasst auch Proteine, die funktionell zu den von den beschriebenen Nucleotidsequenzen codierten NGPCRs äquivalent sind, wenn sie jeweils nach einer Anzahl von Kriterien beurteilt werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich, der Fähigkeit, einen Liganden für den NGPCR zu binden, der Fähigkeit, einen identischen oder komplementären Stoffwechselweg der Signal-Transduktion (z.B. Ionenfluss, Phosphorylierung von Tyrosin usw.) oder eine Veränderung im Zellmetabolismus zu bewirken, wenn das NGPCR-Äquivalent in einem passenden Zelltyp vorkommt (wie z.B. die Verbesserung, Verhinderung oder Verzögerung eines biochemischen, biophysikalischen oder offenen Phänotyps). Solche funktionell äquivalenten NGPCR-Proteine umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in der von den oben beschriebenen NGPCR-Nucleotidsequenzen codierten Aminosäuresequenz, die aber zu einer stillen Veränderung führen und so ein funktionell äquivalentes Genprodukt produzieren. Die Substitutionen an Aminosäuren können auf Grundlage einer ähnlichen Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur der betroffenen Reste erfolgen. Nicht polare (hydrophobe) Aminosäuren sind z.B. Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin; polare neutrale Aminosäuren sind Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin; positiv geladene (basische) Aminosäuren sind Arginin, Lysin und Histidin und negativ geladene (saure) Aminosäuren sind Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Während an NGPCR-DNA Zufallsmutationen erfolgen (mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Random-Mutagenese-Techniken) und die erhaltenen mutanten NGPCRs auf ihre Aktivität hin untersucht werden können, lassen sich ortsgerichtete Mutationen der die NGPCRs codierenden Sequenz gentechnisch erzeugen (mit Hilfe von dem Fachmann bekannten ortsgerichteten Mutagenese-Techniken), um mutante NGPCRs mit besserer Funktion, z.B. einer größeren Bindungsaffinität für den Zielliganden und/oder einer höheren Signalkapazität; oder mit verminderter Funktion und/oder schlechterer Signaltransduktions-Kapazität zu erzeugen. Ein Ausgangspunkt für eine derartige Analyse besteht darin, dass die beschriebenen humanen Sequenzen mit den entsprechenden Gen/Protein-Sequenzen von z.B. anderen Tieren einem Alignment unterzogen werden, um Strukturprinzipien für Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die zwischen den unterschiedlichen Spezies konserviert sind. Nicht konservative Veränderungen können an verschiedenen Positionen gentechnisch erfolgen, um die Funktion, Die Fähigkeit zur Signal-Transduktion oder beides zu verändern. Wo eine Änderung der Funktion erwünscht ist, lassen sich alternativ eine Deletion oder nicht konservative Veränderungen der konservierten Regionen (d.h. identische Aminosäuren) gentechnisch bewirken, z.B. eine Deletion oder nicht konservative Veränderungen (Substitutionen oder Insertionen) der verschiedenen konservierten Transmembran-Domänen.
Eine zusätzliche Anwendung der beschriebenen NGPCR-Polynucleotidsequenzen stellt die Verwendung bei der molekularen Mutagenese/Evolution der Proteine dar, welche zumindest teilweise von den beschriebenen neuen Sequenzen codiert werden, indem z.B. das Polynucleotid-Shuffling oder verwandte Verfahrensweisen eingesetzt werden. Derartige Ansätze werden in den US-Patenten 5,830,721 und 5,837,458 beschrieben.
Zusätzlich angestrebte Verwendungen für die beschriebenen Sequenzen umfassen das Konstruieren von wahlweise auf "an" geschalteten Varianten zum Einsatz in Zellassays und gentechnisch veränderten Tieren unter Einsatz der in den US-Patentanmeldungen 60/110,906 , 60/106,300 , 60/094,879 und 60/121,851 beschriebenen Verfahren und Anwendungen.
Es können in der den NGPCR codieren Sequenz anderen Mutationen erfolgen, um NGPCRs zu erzeugen, die für eine Expression, Vergrößerung usw. in den ausgesuchten Wirtszellen besser geeignet sind. Beispielsweise lassen sich Cysteinreste deletieren oder durch eine anderen Aminosäure ersetzen, um Disulfid-Brücken zu eliminieren; N-gebundene Glykosylierungsstellen können verändert oder eliminiert werden, um z.B. die Expression eines homogenen Produkts zu erzielen, das aus Hefewirten, von denen bekannte ist, dass sie N-gebundene Stellen hyperglykosylieren, leichter gewonnen und gereinigt wird. Zu diesem Zweck verhindern verschiedene Aminosäuresubstitutionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäureposition von jeweils einem oder mehreren der Erkennungssequenzen der Glykosylierung, die in der ECD (N-X-S oder N- X-T) vorkommen, und/oder eine Deletion der Aminosäure an der zweiten Position an jeweils einer oder mehreren Erkennungssequenzen in der ECD die Glykolysierung des NGPCR an der modifizierten Tripeptidsequenz (siehe z.B. Miyajima et al., 1986, EMBO J. 5(6): 1193-1197).
Peptide, die einer oder mehreren Domänen des NGPCR (z.B. ECD, TM, CD usw.) eingekürzten oder deletierten NGPCRs (z.B. ein NGPCR, in welchem eine ECD, TM und/oder CD deletiert ist) sowie Fusionsproteinen, in welchen ein NGPCR von voller Länge, ein NGPCR-Peptid oder ein eingekürzter NGPCR an ein nicht verwandtes Protein fusioniert ist, entsprechen, liegen ebenfalls im Geltungsbereich der Erfindung und lassen sich auf der Grundlage des gerade beschriebenen NGPCR-Nucleotids und der NGPCR-Aminosäuresequenzen konstruieren. Derartige Fusionsproteine umfassen, jedoch nicht ausschließlich, IgFc-Fusionen, welche das NGPCR-Protein oder -Peptid stabilisieren und die Halbwertszeit in vivo verlängern; oder Fusionen an jede Aminosäuresequenz, welche dem Fusionsprotein gestattet, an der Zellmembran verankert zu werden, was einer ECD gestattet, dass es auf der Zelloberfläche exponiert wird; oder Fusionen an ein Enzym, ein fluoreszierendes Protein oder ein lumineszierendes Protein, was für eine Marker-Funktion sorgt.
Während sich die NGPCR-Polypeptide und -Peptide chemisch synthetisieren lassen (siehe z.B. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y.), können große, von einem NGPCR und NGPCRs von voller Länge stammende Polypeptide vorteilhafterweise mit Hilfe einer rekombinanten DNA Technologie unter Einsatz von im Stand der Technik bekannten Techniken zur Expression von NGPCR-Gensequenzen und oder NGPCR codierenden Sequenzen hergestellt werden. Derartige Verfahren können eingesetzt werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die hier beschriebene NGPCR-Nucleotidsequenzen und geeignete Kontrollsignale der Transkription und Translation enthalten. Diese Verfahren umfassen z.B. in vitro-Techniken mit rekombinanter DNA, Synthesetechniken und genetische Rekombination in vitro. Siehe z.B. die in Sambrook et al., 1989, supra und Ausubel et al., 1989, supra beschriebenen Techniken. Alternativ kann RNA, die dem gesamten oder einem Teil eines von einer NGPCR-Nucleotidsequenz codierten Transkripts entspricht, chemisch synthetisiert werden, indem z.B. Syntheseapparate eingesetzt werden. Siehe z.B. die in "Oligonucleotide Synthesis", 1984 Gait, M.J. Hrg., IRL Press, Oxford beschriebenen Techniken.
Es können verschiedene Wirtsexpressions-Vektorsysteme eingesetzt werden, um die NGPCR-Nucleotidsequenzen der Erfindung zu exprimieren. Wenn das NGPCR-Peptid oder -Polypeptid ein lösliches Derivat ist (z.B. NGPCR-Peptide, welche einer ECD entsprechen; ein eingekürzter oder deletierter NGPCR, in welchem eine TM und/oder eine CD deletiert sind), lässt sich das Peptid oder Polypeptid aus der Kultur gewinnen, d.h. aus der Wirtszelle in den Fällen, wo das NGPCR-Peptid oder -Polypeptid nicht ausgeschieden wird und aus dem Kulturmedium in den Fällen, wo das NGPCR-Peptid oder -Polypeptid aus den Zellen ausgeschieden wird. Solche Expressionssysteme umfassen auch technisch manipulierte Wirtszellen, die einen NGPCR oder ein funktionelles Äquivalent in situ, d.h. in der Zellmembran verankert, exprimieren. Die Reinigung oder Anreicherung eines NGPCR aus solchen Expressionssystemen kann unter Verwendung von geeigneten Detergentien und Lipidmizellen sowie mittels dem Fachmann bekannter Verfahren erfolgen. Derartige technisch manipulierte Wirtszellen selbst können jedoch in Fällen verwendet werden, wo es nicht nur wichtig ist, die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des NGPCR beizubehalten, sondern auch, um die biologische Aktivität zu beurteilen, d.h. in Screening-Assays für Arzneimittel.
Die Expressionssysteme, die für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Mikroorganismen wie Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), welche mit NGPCR-Nucleotidsequenzen enthaltenden Expressionsvektoren aus rekombinanter Bakteriophagen.DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert worden sind; Hefe (z.B. Saccharomyces, Pichia), welche mit NGPCR-Nucleotidsequenzen enthaltenden rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren transformiert worden ist; Systeme aus Insektenzellen, die mit NGPCR-Sequenzen enthaltenden rekombinanten Expressionsvektoren von Viren (z.B. Baculovirus) infiziert worden sind; Zellsysteme aus Pflanzen, die mit NGPCR-Nucleotidsequenzen enthaltenden rekombinanten Expressionsvektoren von Viren (z.B. dem Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; dem Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) transformiert worden sind; oder Zellsysteme aus Säugern (z.B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressions-Konstrukte beherbergen, welche Promotoren enthalten, die aus dem Genom von Säugerzellen (z.B. der Metallothionein- Promotor) oder aus Säuger-Viren (z.B. dem späte Adenovirus-Promotor; dem 7,5K-Promotor des Vaccinia-Virus) stammen.
Bei Bakteriensystemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhafterweise in Abhängigkeit von der für das zu exprimierende NGPCR-Produkt beabsichtigten Verwendung ausgewählt werden. Wenn z.B. eine große Menge eines solchen Proteins zur Gewinnung von pharmazeutischen Zusammensetzungen aus dem NGPCR-Protein oder zur Vermehrung von Antikörpern gegen ein NGPCR-Protein produziert werden soll, können Vektoren erwünscht sein, welche die Expression von hohen Spiegeln von leicht zu reinigenden Fusionsproteinprodukten lenken. Solche Vektoren sind, jedoch nicht ausschließlich, der E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), in welchem eine NGPCR-codierende Sequenz individuell in den Vektor im Raster mit dem lacZ-codierenden Abschnitt ligiert sein kann, so dass ein Fusionsprotein entsteht; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509); und dergl. pGEX-Vektoren können auch eingesetzt werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Derartige Fusionsproteine sind im Allgemeinen löslich und lassen sich leicht mittels Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem Glutathion aus lysierten Zellen reinigen. Die PGEX-Vektoren sind so konzipiert, dass sie Spaltstellen für Thrombin oder die Faktor Xa-Protease aufweisen, so dass das klonierte Zielgenprodukt aus dem GST-Rest freigesetzt werden kann.
In einem Insektensystem wird der Autographa californica-Polyhidrosis-Virus (AcNPV) als Vektor eingesetzt, um fremde Polynucleotide zu exprimieren. Das Virus wachst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Eine NGPCR-codierende Sequenz kann individuell in nicht essentielle Abschnitte (z.B. das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert werden, und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z.B. des Polyhedrin-Promotors) gebracht werden. Eine erfolgreiche Insertion der NGPCR-codierenden Sequenz führt zu einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und der Produktion eines nicht umhüllten rekombinanten Virus (d.h. eines Virus, dem die vom Polyhedrin-Gen codierte Proteinhülle fehlt). Diese rekombinanten Viren werden dann benutzt, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in welchen das insertierte Polynucleotid exprimiert wird (siehe z.B. Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-Patent 4,215,051 ).
In Wirtszellen von Säugern kann eine Anzahl von auf Viren basierenden Expressionssystemen verwendet werden. In den Fällen, wo ein Adenovirus als Expressionsvektor eingesetzt wird kann die fragliche NGPCR-Nucleotidsequenz an einen Transkriptions/Translations-Kontroll-Komplex des Adenovirus ligiert werden, z.B. an den späten Promotor und die dreiteilige Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann dann mittels einer in vitro- oder in vivo-Rekombination in das Genom des Adenovirus insertiert werden. Eine Insertion in eine nicht essentielle Region des viralen Genoms (z.B. in Region E1 oder E2) führt zu einem rekombinanten Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, in infizierten Wirten ein NGPCR-Produkt zu exprimieren (siehe z.B. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659). Für eine effektive Translation von insertierten NGPCR-Nucleotidsequenzen können auch spezifische Initiationssignale benötigt werden. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In Fällen, wo ein ganzes NGPCR-Gen oder eine cDNA, einschließlich deren eigenen Initiationscodons und der angrenzenden Sequenzen, in den passenden Expressionsvektor insertiert wird, brauchen keine zusätzlichen Kontrollsignale für die Translation benötigt zu werden. In Fällen jedoch, wo nur ein Abschnitt einer NGPCR-codierenden Sequenz insertiert wird, müssen exogene Kontrollsignale der Translation, einschließlich vielleicht des Initiationscodons, zur Verfügung gestellt werden. Ferner muss das Initiationscodon in Phase mit dem Leseraster der gewünschten codierenden Sequenz sein, um die Translation des gesamten Insertionsstücks sicher zu stellen. Diese exogenen Kontrollsignale für die Translation sowie die Initiationscodons können aus verschiedenen sowohl natürlichen als auch synthetischen Quellen stammen. Durch Einschluss von passenden Enhancerelementen der Expression, Transkriptions-Terminatoren usw. lässt sich die Effizienz der Expression steigern (siehe Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544).
Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm ausgesucht werden, der die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der spezifischen gewünschten Weise modifiziert oder weiter verarbeitet. Derartige Modifikationen (z.B. Glykosylierung) und Weiterverarbeitung (z.B. Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Unterschiedliche Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die Weiterbehandlung und Modifikation von Proteinen und Genprodukten nach der Translation. Es lassen sich geeignete Zelllinien und Wirtssysteme aussuchen, um die korrekte Modifikation und Weiterbehandlung des exprimierten Fremdproteins sicher zu stellen. Hierzu können eukaryotische Wirtszellen eingesetzt werden, die über die Zellmaschinerie für eine richtige Weiterbehandlung des Primärtranskripts, die Glykosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts verfügen. Derartige Säuger-Wirtszellen sind, jedoch nicht ausschließlich, CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK-, 293-, 3T3- und WI38-Zelllinien.
Für eine Langzeit-Produktion mit hoher Ausbeute an rekombinanten Proteinen ist eine stabile Expression bevorzugt. Zelllinien, welche die oben beschriebenen NGPCR-Sequenzen stabil exprimieren, können z.B. gentechnisch manipuliert werden. Eher als Expressionsvektoren zu verwenden, welche Replikationsursprünge von Viren enthalten, können Wirtszellen mit einer DNA transformiert werden, die von geeigneten Expressions-Kontrollelementen (z.B. Promotor, Enhancersequenzen, Terminatoren der Transkription, Polyadenylierungsstellen usw.) sowie einem auswählbaren Marker kontrolliert wird. Nach Einführung der Fremd-DNA kann man die technisch manipulierten Zellen 1-2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen lassen und sie dann in ein Selektivmedium überführen. Der auswählbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht gegen die Selektion Resistenz und erlaubt den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Foki zu bilden, die ihrerseits geklont und in Zelllinien expandiert werden können. Dieses Verfahren lässt sich vorteilhafterweise einsetzen, um Zelllinien technisch zu manipulieren, welche das NGPCR-Produkt exprimieren. Solche gentechnisch manipulierten Zelllinien können beim Screening und der Beurteilung von Verbindungen von besonderem Nutzen sein, welche die endogene Aktivität des NGPCR-Produkts beeinflussen.
Es lässt sich eine Anzahl von Selektionssystemen einsetzen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, das Thymidinkinase-Gen des Herpes simplex-Virus (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), das Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gen (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Sci. USA 48: 2026 und das Adenin-Phosphoribosyltransferase-Gen (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) können in tk^–-, hgprt^–- bzw. aprt^–-Zellen verwendet werden. Als Grundlage für eine Selektion kann auch Resistenz gegen Antimetabolite für die folgenden Gene genutzt werden: dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78: 1527); gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78: 2072); neo, das Resistenz gegen das Aminoglykosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 140: 1); und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).
Alternativ lässt sich jedes Fusionsprotein leicht reinigen, indem ein Antikörper eingesetzt wird, der spezifisch für das gerade exprimierte Fusionsprotein ist. Mit einem von Janknecht et al. beschriebenen System lassen sich z.B. in menschlichen Zelllinien exprimierte nicht denaturierte Fusionsproteine leicht reinigen (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976). In diesem System wird das fragliche Gen so in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subcloniert, dass das offene Leseraster des Gens mittels einer Translation an ein aus 6 Histidinresten bestehendes aminoendständiges tag fusioniert wird. Die Extrakte aus mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infizierten Zellen werden auf Ni²⁺-Nitrilessigsäure-Agarose-Säulen gepackt und die Histidin-tagged Proteine werden selektiv mit Imidazol enthaltenden Puffern eluiert.
NGPCR-Genprodukte können auch in transgenen Tieren exprimiert werden. Tiere jeder Spezies, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Würmer, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schweine, Mikroschweine, Vögel, Ziegen und nicht humane Primaten, z.B. Waschbären, Affen und Schimpansen, können eingesetzt werden, um NGPCR-transgene Tiere zu erzeugen.
Jede im Stand der Technik bekannte Technik kann eingesetzt werden, um ein NGPCR-Transgen in Tiere einzuführen, um die Founder-Tiere für transgene Tiere zu gewinnen. Solche Techniken sind, aber nicht ausschließlich, die Mikroinjektion in Vorkerne (Hoppe, P.C. und Wagner, T.E., 1989, US-Patent 4,873,191 ); der Retrovirus-vermittelte Gentransfer in Keimbahnen (Van der Putten et al., 1985, Oric. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152); das Gen-Targeting in Stammzellen von Embryonen (Thompson et al., 1989, Cell 56: 313-321); die Elektroporation von Embryonen (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803-1814) und der Sperma-vermittelte Gentransfer (Lavitrano et al., 1989, Cell 57: 717-723) usw. Zu einer Übersicht über derartige Techniken siehe Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229.
Die vorliegende Erfindung stellt nicht nur transgene Tiere zur Verfügung, welche NGPCR-Transgene in allen ihren Zellen enthalten, sondern auch Tiere, welche die Transgene in einigen aber nicht allen ihren Zellen aufweisen, d.h. Mosaik-Tiere oder transgene Tiere mit somatischen Zellen. Die Transgene können als einzelne Transgene oder in Konkatameren integriert sein, z.B. "head-to-head"-Tandems oder "head-to-tail"-Tandems. Die Transgene lassen sich z.B. auch nach der Lehre von Lasko et al., 1992, Proc. Natl. Acad, Sci., USA 89: 6232-6236 selektiv in einen besonderen Zelltyp einführen oder darin aktivieren. Die für eine spezifische Aktivierung eines solchen Zelltyps erforderliche regulatorische Sequenz hängt von dem jeweiligen besonderen Zelltyp ab und ist dem Fachmann bekannt.
Wenn erwünscht ist, dass ein NGPCR-Transgen in den chromosomalen Ort des endogenen NGPCR-Gens integriert wird, ist das Gen-Targeting bevorzugt. Wenn, kurz gesagt, eine derartige Technik eingesetzt werden soll, werden zum Zwecke des Intergrierens über eine homologe Rekombination mit Chromosomensequenzen in die Nucleotidsequenz des endogenen NGPCR-Gens sowie durch Zerstörung von deren Funktion (d.h. "knockout"-Tiere) Vektoren konstruiert, welche einige zu dem endogenen NGPCR-Gen homologe Nucleotidsequenzen enthalten.
Das Transgen kann auch selektiv in einen besonderen Zelltyp eingeführt werden, wobei es so das endogene NGPCR-Gen nur in diesem Zelltyp inaktiviert, indem z.B. nach der Lehre von Gu et al., 1994, Science, 265: 103-106 vorgegangen wird. Die für eine derartige zelltypspezifische Inaktivierung benötigten regulatorischen Sequenzen hängen von dem jeweiligen besonderen Zelltyp ab und sind dem Fachmann bekannt.
Sind die transgenen Tiere erst einmal erzeugt worden, kann die Expression des rekombinanten NGPCR-Gens mit Hilfe von Standardtechniken untersucht werden. Das anfängliche Screening zur Analyse der Tiergewebe kann mit einer Southern-Blot-Analyse oder mit PCR-Techniken erfolgen, um zu untersuchen, ob eine Integration des Transgens stattgefunden hat. Das Ausmaß der mRNA-Expression des Transgens in den Geweben der transgenen Tiere kann auch mit Hilfe von Techniken beurteilt werden, welche, aber nicht ausschließlich, eine Northern-Analyse der aus dem Tier erhaltenen Gewebeproben, eine in situ-Hybridisierungs-Analyse sowie eine RT-PCR umfassen. Die Gewebeproben, welche das NGPCR-Gen exprimieren, lassen sich auch mit Hilfe von spezifisch auf das NGPCR-Transgenprodukt reagierenden Antikörpern auf immuncytochemischem Wege auswerten.
Von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfasst sind Fusionsproteine, welche das NGPCR zu einem Zielorgan lenken und/oder den Transport durch die Membran in das Cytosol erleichtern. Die Konjugation der NGPCRs an Antikörpermoleküle oder deren Fab-Fragmente könnte benutzt werden, um Zellen, die ein besonderes Epitop tragen, anzusteuern. Die Anheftung der passenden Signalfrequenz an das NGPCR würde das NGPCR ebenfalls an den gewünschten Ort innerhalb der Zelle transportieren. Alternativ könnte das Ansteuern von NGPCR oder dessen Nucleinsäuresequenz erreicht werden, indem Abgabesysteme auf Basis von Liposomen oder Lipidkomplexen eingesetzt werden. Derartige Technologien werden in Liposomes: A Practical Approach, New, RRC Hrg., Oxford University Press, New York und in den US-Patenten 4,594,595 , 5,459,127 , 5,948,767 und 6,110,490 und deren entsprechenden Offenbarungen beschrieben. Zusätzlich umfasst sind neue Protein-Konstrukte, die technisch so verändert wurden, dass sie den Transport des NGPCR an den Zielort oder das gewünschte Organ erleichtern, wo sie durch die Zellmembran und/oder die Kernmembran hindurch treten, wo der NGPCR seine funktionelle Aktivität ausüben kann. Dies kann erreicht werden, indem der NGPCR an ein Cytokin oder an einen anderen Liganden gekoppelt wird, der für eine Zielspezifität sorgt, und/oder an eine Protein-transduzierende Domäne (siehe allgemein die US-Anmeldungen 60/111,701 und 60/056,713 als Beispiele für solche transduzierenden Sequenzen), um die Passage durch die Zellmembranen zu erleichtern und er kann wahlweise technisch verändert werden, damit er Sequenzen für eine Lokalisierung im Kern enthält.
5.3 ANTIKÖRPER GEGEN NGPCR-PROTEINE
Antikörper, die spezifisch ein oder mehrere Epitope eines NGPCR erkennen oder Epitope von konservierten Varianten eines NGPCR oder Peptidfragmente eines NGPCR werden ebenfalls von der Erfindung umfasst. Derartige Antikörper sind, jedoch nicht ausschließlich, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte oder chimäre Antikörper, Einzelketten-Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')₂-Fragmente, von einer Fab-Expressionsbibliothek produzierte Fragmente, antiidiotypische Antikörper (Anti-Id) und Epitop-bindende Fragmente von jedem der obigen Vertreter.
Die Antikörper der Erfindung können z.B. beim Nachweis eines NGPCR in einer biologischen Probe eingesetzt werden und können daher als Teil einer diagnostischen oder prognostischen Technik zum Einsatz kommen, wodurch Patienten auf anomale Mengen des NGPCR hin untersucht werden können. Solche Antikörper können z.B. auch zusammen mit Programmen zum Screening von Verbindungen zur Beurteilung der Wirkung von Testverbindungen auf die Expression und/oder Aktivität eines NGPCR-Genprodukts Verwendung finden. Zusätzlich können solche Antikörper zusammen mit einer Gentherapie zum Einsatz kommen, um z.B. normale und/oder technisch veränderte NGPCR-exprimierende Zellen vor ihrer Einführung in den Patienten zu begutachten. Derartige Antikörper können zusätzlich als ein Verfahren zur Hemmung einer anomalen NGPCR-Aktivität verwendet werden. Somit lassen sich solche Antikörper daher als Teil von Behandlungsmethoden für Gewichtsstörungen einsetzen.
Zur Gewinnung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem NGPCR, einem NGPCR-Peptid (z.B. einem, das einer funktionellen Domäne des Rezeptors entspricht, wie z.B. eine ECD, eine TM oder eine CD), gekürzten NGPCR-Polypeptiden (ein NGPCR, in welchem eine oder mehrere Domänen deletiert worden sind, z.B. sind eine TM oder eine CD zerstört worden), funktionellen Äquivalenten des NGPCR oder mutierten Varianten des NGPCR immunisiert werden. Derartige Wirtstiere können, jedoch nicht ausschließlich, Kaninchen, Mäuse, und Ratten umfassen, um nur einige wenige zu nennen. Je nach der Wirtsspezies lassen sich verschiedene Adjuvantien einsetzen, um die Immunantwort zu verstärken, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, das (komplette und nicht komplette) Freund-Adjuvans, Mineralsalze wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, sowie potentiell nützliche menschliche Adjuvantien wie BCG (Bazillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Alternativ könnte die Immunantwort durch Kombination und/oder Kopplung mit Molekülen wie dem Hämocyanin der Schlüssellochschnecke, dem Tetanus-Toxoid, dem Diphtherie-Toxoid, dem Ovalbumin, dem Cholera-Toxin oder Fragmenten derselben gesteigert werden. Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die von den Seren der immunisierten Tiere stammen.
Monoklonale Antikörper, welche homogene Populationen von Antikörpern gegen ein besonderes Antigen sind, können mit Hilfe jeder Technik erhalten werden, welche durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur für die Produktion von Antikörpermolekülen sorgt. Diese sind, jedoch nicht ausschließlich, die Hybridoma-Technik von Köhler und Milstein (1975, Nature 256: 495-497 und das US-Patent 4,376,110 ); die humane B-Zell-Hybridoma-Technik (Kosbor et al., 1083, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) und die EBV-Hybridoma-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., SS. 77-96). Solche Antikörper können von jeder Immunglobulin-Klasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und von jeder Subklasse davon. Die die mABs dieser Erfindung produzierenden Hybridome lassen sich in vitro oder in vivo kultivieren. Die Produktion hoher Titer von mAbs in vivo machen dieses zum derzeitig bevorzugten Produktionsverfahren.
Darüber hinaus können Techniken zum Einsatz kommen, welche für die Produktion von "chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) durch Spleißen der Gene eines Antikörpermoleküls der Maus von geeigneter Antigenspezifität zusammen mit Genen eines humanen Antikörpermoleküls von geeigneter Aktivität entwickelt wurden. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in welchem unterschiedliche Abschnitte von unterschiedlichen Tierspezies stammen, wie z.B. solche mit einer von einem mAb der Maus stammenden variablen Region und einer konstanten Region von einem Immunglobulin des Menschen. Solche Technologien werden in den US-Patenten 6,075,181 und 5,877,397 und deren entsprechenden Offenbarungen beschrieben. Von der vorliegenden Erfindung wird auch die Verwendung von vollständig humanisierten monoklonalen Antikörpern umfasst, wie sie im US-Patent 6,150,584 und dessen entsprechender Offenbarung beschrieben wird.
Alternativ können Techniken übernommen werden, die für die Produktion von Einzelketten-Antikörpern ( US-Patent 4,946,778 ; Bird, 1988, Science 242: 426-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 und Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546) beschrieben wurden, um Einzelketten-Antikörper gegen NGPCR-Genprodukte herzustellen. Einzelketten-Antikörper werden durch Verbindung der schweren und leichten Kettenfragmente der Fv-Region über eine Aminosäurebrücke gebildet, was zu einem Einzelketten-Polypeptid führt.
Antikörper-Fragmente, welche spezifische Epitope erkennen, lassen sich mit bekannten Techniken erzeugen. Solche Fragmente umfassen z.B., jedoch nicht ausschließlich, die F(ab)₂-Fragmente, welche sich durch Pepsin-Verdau des Antikörpermoleküls gewinnen lassen, sowie die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab)₂-Fragmente erzeugt werden können. Alternativ lassen sich Fab-Expressionsbibliotheken konstruieren (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281), um eine schnelle und leichte Identifizierung der monoklonalen Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität zu gestatten.
Antikörper gegen einen NGPCR lassen sich ihrerseits unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken einsetzen, um antiidiotypische Antikörper zu erzeugen, welche einen gegebenen NGPCR "nachahmen". (siehe z.B. Greenspan & Bona, 1993, FASER J. 7(5): 437-444 und Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8): 2429-2438). Beispielsweise können Antikörper verwendet werden, die an eine NGPCR-ECD binden und die Bindung eines Liganden des NGPCR kompetitiv hemmen, um Antiidiotypen zu erzeugen, welche die NGPC-ECD "nachahmen" und daher einen Liganden binden und neutralisieren. Solche neutralisierenden Antiidiotypen oder Fab-Fragmente von solchen Antiidiotypen können in therapeutischen Diäten verwendet werden, bei denen der Signal-Stoffwechselweg des NGPCR eine Rolle spielt.
5.4 DIAGNOSE VON MIT DEM NGPCR IN ZUSAMMENHANG STEHENDEN ANOMALITÄTEN
Für die diagnostische und prognostische Beurteilung von mit der NGPCR-Funktion in Zusammenhang stehenden Störungen sowie für die Identifizierung von Subjekten mit einer Anfälligkeit für solche Störungen lassen sich verschiedene Verfahren verwenden.
In solchen Verfahren können z.B. Reagenzien wie die in Abschnitt 5.1 beschriebenen NGPCR-Nucleotidsequenzen und die in Abschnitt 5.3 beschriebenen NGPCR-Antikörper zum Einsatz kommen. Solche Reagenzien lassen sich spezifisch einsetzen, z.B. für (1) den Nachweis des Auftretens von NGPCR-Genmutationen oder den Nachweis von entweder einer Überexpression oder einer Unterexpression der NGPCR-mRNA im Verhältnis zu einem gegebenen Phänotyp; (2) dem Nachweis von entweder einem übermäßig oder bescheiden exprimierten NGPCR-Genprodukt im Verhältnis zu einem gegebenen Phänotyp und (3) dem Nachweis von Störungen oder Anomalitäten bei dem NGPCR-vermittelten Stoffwechselweg der Signaltransduktion.
Die hier beschriebenen Verfahren lassen sich durchführen, indem z.B. vorverpackte diagnostische Kits mit mindestens einer spezifischen NGPCR-Nucleotidsequenz oder einem hier beschriebenen NGPCR-Antikörper-Reagenzes eingesetzt werden, die auf herkömmliche Weise verwendet werden können, z.B. in klinischen Einrichtungen, um Patienten zu diagnostizieren, die auf Körpergewichtsstörungen beruhende Anomalitäten zeigen.
Zum Nachweis von NGPCR-Mutationen kann als Ausgangsquelle für eine genomische Nucleinsäure jede kernhaltige Zelle verwendet werden. Für den Nachweis einer NGPCR-Genexpression oder von NGPCR-Genprodukten können jeder Zelltyp oder jedes Gewebe verwendet werden, in welchem das NGPCR-Gen exprimiert wird, wie z.B. Magen- oder Hirnzellen.
Im Folgenden werden auf Nucleinsäuren basierende Nachweistechniken und Peptid-Nachweistechniken beschrieben.
5.4.1 NACHWEIS VON NGPCR-GENEN UND -TRANSKRIPTEN
Mutationen in einem NGPCR-Gen lassen sich mit Hilfe einer Anzahl von Techniken nachweisen. Als Startpunkt für derartige Assay-Techniken kann eine Nucleinsäure von jeder kernhaltigen Zelle eingesetzt und nach Standardverfahren für die Nucleinsäurepräparation isoliert werden, welche dem Fachmann bekannt sind.
Eine DNA kann in Hybridisierungs- und Amplifikations-Assays von biologischen Proben verwendet werden, um Anomalitäten nachzuweisen, bei denen die NGPCR-Genstruktur eine Rolle spielt, einschließlich Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und Chromosomenumordnungen. Derartige Assays umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Southern-Analysen, Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analysen (SSCP) und PCR-Analysen.
Eine Rolle spielen können bei derartigen diagnostischen Verfahren zum Nachweis von für NGPCR-Gene spezifischen Mutationen z.B. das in Kontakt Bringen und Inkubieren von Nucleinsäuren einschließlich von rekombinanten DNA-Molekülen, geklonten Genen und degenerierten Varianten derselben, die von einer Probe erhalten wurden, welche z.B. von einer Patientenprobe oder einer anderen passenden zellulären Quelle stammte, einschließlich eines oder mehrerer Reagenzien aus markierten Nucleinsäuren mit rekombinanten DNA-Molekülen, geklonten Genen oder degenerierten Varianten derselben, wie dies in Abschnitt 5.1 beschrieben wurde, unter Bedingungen, die für die spezifische Hybridisierung dieser Reagenzien an ihre komplementären Sequenzen in einem gegebenen NGPCR-Gen günstig sind. Die Längen dieser Nucleinsäurereagenzien betragen vorzugsweise mindestens 15 bis 30 Nucleotide. Nach der Inkubation werden alle nicht hybridisierten Nucleinsäuren von dem Nucleinsäure:NGPCR-Molekül-Hybrid entfernt. Das Vorkommen von Nucleinsäuren, die hybridisiert haben, falls es überhaupt solche Moleküle gibt, wird sodann nachgewiesen. Mit Hilfe eines derartigen Nachweisverlaufs kann die Nucleinsäure aus dem in Frage stehenden Zelltyp oder Gewebe immobilisiert werden, z.B. an einen festen Träger wie z.B. eine Membran, oder an eine Oberfläche aus Kunststoff wie z.B. eine Mikrotiterplatte oder Polystyrolkügelchen. In diesem Falle werden nicht hybridisierte markierte Nucleinsäurereagenzien des in Abschnitt 5.1 beschriebenen Typs nach der Inkubation leicht entfernt. Der Nachweis der restlichen hybridisierten markierten NGPCR-Nucleinsäurereagenzien erfolgt mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Standardtechniken. Die NGPCR-Polynucleotidsequenzen, an welche die Nucleinsäurereagenzien hybridisiert sind, können mit dem Hybridisierungsmuster verglichen werden, das von einer normalen NGPCR-Gensequenz erwartet wird, um zu ermitteln, ob eine NGPCR-Genmutation vorliegt.
Alternative diagnostische Verfahren zum Nachweis von für NGPCR-Gene spezifischen Nucleinsäuremolekülen in Patientenproben oder anderen geeigneten Zellquellen können deren Amplifikation mit Hilfe einer PCR betreffen (deren experimentelle Ausführung in Mullis, K.B., 1987, US-Patent 4,683,202 beschrieben ist), gefolgt von dem Nachweis der amplifizierten Moleküle mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Techniken. Die erhaltenen amplifizierten Sequenzen können mit solchen verglichen werden, die zu erwarten wären, falls die amplifizierten Nucleinsäuren nur normale Kopien eines NGPCR-Gens enthielten, um zu ermitteln, ob eine Mutation des NGPCR-Gens vorliegt.
Zusätzlich lassen sich bekannte Techniken der Gentypisierung durchführen, um Individuen zu identifizieren, die NGPCR-Gen-Mutationen aufweisen. Derartige Techniken sind z.B. der Einsatz von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs), in welchen Sequenzvariationen in einer der Erkennungsstellen für das verwendete spezifische Restriktionsenzym eine Rolle spielen.
Darüber hinaus sind verbesserte Verfahren zur Analyse von DNA-Polymorphismen beschrieben worden, die für die Analyse von NGPCR-Gen-Mutationen eingesetzt werden können, welche aus dem Vorkommen unterschiedlicher Mengen von kurzen DNA-Sequenzen mit Tandem-Repeats zwischen den Restriktionsenzymstellen Nutzen ziehen. Weber ( US-Patent 5,075,217 ) beschreibt z.B. einen auf Längenpolymorphismen in Blöcken von kurzen (dC-dA)n-(dG-dT)n-Tandem-Repeats basierenden DNA-Marker. Die durchschnittliche Trennung von (dC-dA)n-(dG-dT)n-Blöcken wird auf 30.000-60.000 bp geschätzt. Marker, die so eng voneinander beabstandet sind, zeigen eine hohe Häufigkeit von gleichzeitiger Vererbung und sind für die Identifizierung von Genmutationen wie z.B. Mutationen innerhalb eines gegebenen NGPCR-Gens und für die Diagnose von mit NGPCR-Mutationen einhergehenden Krankheiten und Störungen äußerst nützlich.
Caskey et al. ( US-Patent 5,364,759 , welches hiermit vollständig als Referenz eingeführt wird) beschreiben auch einen DNA-Profiling-Assay zum Nachweis von Repeat-Sequenzen aus kurzen Tri- und Tetra-Nucleotiden. Das Verfahren umfasst die Extraktion der betreffenden DNA, wie z.B. des NGPCR-Gens, die Amplifizierung der extrahierten DNA sowie die Markierung der Repeatsequenzen, um von der DNA des Individuums eine Karte des Genotyps zu erstellen.
Das Ausmaß der NGPCR-Gen-Expression kann auch untersucht werden, indem die NGPCR-Transkription nachgewiesen und gemessen wird. Beispielsweise kann die RNA aus einem Zelltyp oder einem Gewebe, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie das NGPCR-Gen exprimieren, wie z.B. Hirn, isoliert und untersucht werden, indem Hybridisierungs- oder PCR-Techniken wie die oben beschriebenen eingesetzt werden. Die isolierten Zellen können von einer Zellkultur oder von einem Patienten stammen. Die Analyse der aus der Kultur entnommenen Zellen kann ein notwendiger Schritt bei der Beurteilung der Zellen sein, welche als Teil einer auf Zellen basierenden Gentherapietechnik eingesetzt werden sollen oder alternativ, um die Wirkung von Verbindungen auf die Expression des NGPCR-Gens zu untersuchen. Solche Analysen können sowohl quantitative als auch qualitative Aspekte des Expressionsmusters des NGPCR-Gens verraten, einschließlich der Aktivierung oder Inaktivierung der Expression des NGPCR-Gens.
In einer Ausführungsform eines derartigen Nachweisablaufs werden aus den entsprechenden RNAs cDNAs synthetisiert (z.B. mittels reverser Transkription des RNA-Moleküls in cDNA). Eine Sequenz innerhalb der cDNA wird sodann als Matrize für eine Amplifizierungsreaktion der Nucleinsäure eingesetzt, wie z.B. für eine PCR-Amplifizierungsreaktion oder dergl. Die als Initiationsreagenzien (z.B. Primer) für die Synthese in die reverse Transkription und die Amplifizierungsschritte dieses Verfahrens eingesetzten Nucleinsäure-Reagenzien werden aus den in Abschnitt 5.1 beschriebenen NGPCR-Nucleinsäure-Reagenzien ausgewählt. Die bevorzugten Längen für derartige Nucleinsäure-Reagenzien betragen mindestens 9-30 Nucleotide. Zum Nachweis des amplifizierten Produkts kann die Nucleinsäure-Amplifizierung mit Hilfe von radioaktiv oder nicht radioaktiv markierten Nucleotiden durchgeführt werden. Alternativ kann ein ausreichend amplifiziertes Produkt hergestellt werden, so dass das Produkt durch standardmäßiges Anfärben mit Ethidiumbromid, mit Hilfe irgendeines anderen geeigneten Anfärbeverfahrens für Nucleinsäuren oder durch Sequenzieren sichtbar gemacht werden kann.
Zusätzlich ist es möglich, derartige Assays für die NGPCR-Gen-Expression "in situ" durchzuführen, d.h. direkt auf (fixierten oder gefrorenen) Gewebeabschnitten des Patienten, welche mittels Biopsien oder Resektionen erhalten wurden, so dass keine Reinigung der Nucleinsäuren nötig ist. Nucleinsäure-Reagenzien wie die oben beschriebenen können für derartige in situ-Verfahren als Sonden und/oder Primer zum Einsatz kommen (siehe z.B. Nuovo, G.J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications", Raven Press, NY).
Falls eine ausreichende Menge an geeigneten Zellen erhalten werden kann, lässt sich alternativ eine standardmäßige Northern-Analyse durchführen, um das Ausmaß der NGPCR-mRNA-Expression zu ermitteln.
5.4.2 NACHWEIS VON NGPCR-GENPRODUKTEN
Antikörper, die gegen Wildtyp-NGPCR-Genprodukte oder mutante NGPCR-Genprodukte oder die oben beschriebenen Varianten oder Peptidfragmente derselben gerichtet sind, lassen sich ebenfalls als diagnostische und prognostische Mittel einsetzen, wie dies hier beschrieben wird. Derartige diagnostische Verfahren können eingesetzt werden, um Anomalitäten im Ausmaß der NGPCR-Gen-Expression oder Anomalitäten in der Struktur und/oder zeitlichen, gewebsspezifischen, zellulären oder subzellulären Lage des NGPCR nachzuweisen und sie können in vivo oder in vitro, wie z.B. auf Biopsie-Gewebe, durchgeführt werden.
Beispielsweise lassen sich gegen Epitope der NGPCR-ECD gerichtete Antikörper in vivo einsetzen, um das Muster und Ausmaß der Expression des NGPCR im Körper zu ermitteln. Solche Antikörper können markiert sein, z.B. mit einer strahlenundurchlässigen oder einer anderen geeigneten Verbindung oder sie können in ein Subjekt injiziert werden, um die Bindung an den im Körper exprimierten NGPCR sichtbar zu machen, indem Verfahren wie Röntgenstrahlen, CAT-Scans oder MRT eingesetzt werden. Für diesen Zweck sind markierte Antikörperfragmente, z.B. der Fab- oder Einzelstrang-Antikörper mit dem kleinsten Teil der Antigen-Bindungs-Region bevorzugt, um den Durchtritt durch die Blut-Hirn.Schranke zu begünstigen und das Markieren der im Hirn exprimierten NGPCRs zu gestatten.
Zusätzlich kann jedes NGPCR-Fusionsprotein oder an einen NGPCR konjugierte Protein, dessen Vorkommen nachgewiesen werden kann, verabreicht werden. Beispielsweise lassen sich mit einer strahlenundurchlässigen oder einer anderen geeigneten Verbindung markierte an NGPCR fusionierte oder konjugierte Proteine verabreichen und in vivo sichtbar machen, wie dies oben für markierte Antikörper beschrieben wurde. Ferner können solche NGPCR-Fusionsproteine wie AP-NGPCR auf NGPCR-Ap-Fusionsproteinen für diagnostische Verfahren in vitro eingesetzt werden.
Alternativ können Immunassays oder Assays zum Nachweis von Fusionsproteinen wie oben beschrieben auf Biopsie- und Autopsie-Proben in vitro eingesetzt werden, um eine Begutachtung der Expressionsmuster des NGPCR zu gestatten. Solche Assays sind nicht auf die Verwendung von Antikörpern beschränkt, die eine NGPCR-ECD definieren, sondern können auch die Verwendung von Antikörpern umfassen, welche gegen die Epitope von jeder der Domänen eines NGPCR, z.B. gegen die ECD, die TM und/oder CD, gerichtet sind. Der Einsatz von jedem oder allen dieser markierten Antikörper liefert eine nützliche Information zur Translation und dem intrazellulären Transport des NGPCR an die Zelloberfläche und kann Defekte bei der Verarbeitung identifizieren.
Der zu analysierende Gewebs- oder Zelltyp umfasst im Allgemeinen solche, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie das NGPCR-Gen exprimieren. Die hier verwendeten Verfahren zur Isolierung von Proteinen können z.B. solche sein, wie sie bei Harlow und Lane (Harlow, E. und Lane, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratora Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben sind. Die isolierten Zellen können von einer Zellkultur oder von einem Patienten stammen. Die Analyse der aus der Kultur entnommenen Zellen kann ein notwendiger Schritt bei der Beurteilung der Zellen sein, welche als Teil einer auf Zellen basierenden Gentherapietechnik eingesetzt werden könnten oder alternativ, um die Wirkung von Verbindungen auf die Expression eines NGPCR-Gens zu untersuchen.
Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, wie die oben in Abschnitt 5.3 beschriebenen, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können z.B. eingesetzt werden, um das Vorkommen von NGPCR-Genprodukten oder konservierten Varianten oder Peptidfragmenten derselben quantitativ oder qualitativ nachzuweisen. Dies kann z.B. mit Hilfe von Fluoreszenztechniken erfolgen, indem ein fluoreszenzmarkierter Antikörper (siehe diesen Abschnitt weiter unten) zusammen mit einem lichtmikroskopischen, flusscytometrischen oder fluorimetrischen Nachweis eingesetzt wird. Derartige Techniken sind besonders bevorzugt, wenn solche NGPCR-Genprodukte auf der Zelloberfläche exprimiert werden.
Die Antikörper (oder Fragmente derselben) oder die an den NGPCR fusionierten oder konjugierten Proteine, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können zusätzlich histologisch, wie z.B. in Immunfluoreszenz-, immunoelektronenmikroskopischen oder nicht Immun-Assays, für einen in situ-Nachweis der NGPCR-Genprodukte oder konservierten Varianten oder Peptidfragmente derselben oder für die NGPCR-Bindung (im Falle eines mit einem NGPCR-Liganden fusionierten markierten Proteins) verwendet werden
Der in situ-Nachweis kann erfolgen, indem einem Patienten eine histologische Probe entnommen wird und ein markierter Antikörper oder ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung zugesetzt wird. Der Antikörper (oder ein Fragment) oder das Fusionsprotein werden vorzugsweise zugegeben, indem der markierte Antikörper (oder das Fragment) auf eine biologische Probe aufgetragen wird. Durch den Einsatz eines solchen Prozessablaufs ist es möglich, nicht nur das Vorkommen eines NGPCR-Genprodukts oder von konservierten Varianten oder Peptidfragmenten oder einer NGPCR-Bindung zu ermitteln, sondern auch deren Verteilung im untersuchten Gewebe. Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist für den Fachmann leicht zu erkennen, dass jede Methode aus einem breiten Spektrum von histologischen Verfahren (wie z.B. Anfärbemethoden) modifiziert werden kann, um einen solchen in situ-Nachweis zur erzielen.
Immunassays und Nicht-Immunassays für NGPCR-Genprodukte oder konservierte Varianten oder Peptidfragmente derselben umfassen typischerweise die Inkubation einer Probe, wie z.B. einer biologischen Flüssigkeit, eines Gewebeextrakts, frisch gewonnener Zellen oder Lysate von Zellen, welche in Zellkultur inkubiert worden sind, in Gegenwart eines nachweisbar markierten Antikörpers, der in der Lage ist, NGPCR-Genprodukte oder konservierte Varianten oder Peptidfragmente derselben zu identifizieren, sowie den Nachweis des gebundenen Antikörpers mit jeder aus einer Anzahl von im Stand der Technik bekannten Techniken.
Die biologische Probe kann mit einer Festphasen-Stützstruktur oder einem -Träger wie z.B. Nitrocellulose in Kontakt gebracht und darauf immobilisiert werden, oder auf einem anderen festen Träger, der in der Lage ist, Zellen, Zellteichen oder lösliche Proteine zu immobilisieren. Der Träger kann dann mit geeigneten Puffer gewaschen werden gefolgt von einer Behandlung mit dem nachweisbar markierten NGPCR-Antikörper oder dem Fusionsprotein mit einem NGPCR-Liganden. Der Festphasenträger kann sodann ein zweites Mal mit dem Puffer gewaschen werden, um nicht gebundene Antikörper oder Fusionsproteine zu entfernen. Die Menge der auf dem Festträger gebundenen Markierung kann dann mit konventionellen Mitteln nachgewiesen werden.
Mit "Festphasen-Stützstruktur oder -Träger" soll jede Stützstruktur bezeichnet werden, die in der Lage ist, ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Bekannte Stützstrukturen oder -Träger sind Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann der Träger entweder bis zu einem gewissen Grad löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch jede mögliche strukturelle Konfiguration einnehmen, solange das daran gekoppelte Molekül in der Lage ist, ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Somit kann die Trägerkonfiguration sphärisch wie bei einem Kügelchen oder zylindrisch wie bei der Innenfläche eines Reagenzglases oder der Außenfläche eines Stabes sein. Alternativ kann die Oberfläche flach wie bei einem Blatt oder Teststreifen usw. sein. Bevorzugte Träger sind Polystyrolkügelchen. Der Fachmann kennt viele weitere geeignete Träger zum Binden eines Antikörpers oder Antigens oder er ist in der Lage, derartige Träger mit Hilfe von Routineuntersuchungen aufzufinden.
Die Bindungsaktivität einer gegebenen Gruppe von Antikörpern oder NGPCR-Ligand-Fusions-Proteinen lässt sich nach bekannten Verfahren ermitteln. Der Fachmann weiß, wie er mit Hilfe von Routineuntersuchungen jeweils operative und optimale Bedingungen für einen Assay ermitteln kann
Was die Antikörper angeht besteht ein Weg, wie der NGPCR-Antikörper nachweisbar markiert werden kann darin, ihn an ein Enzym zu binden und in einem Enzym-Immun-Assay (EIA) einzusetzen (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2: 1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31: 507-520; Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol. 73: 482-523; Maggio, E. (Hrg.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL; Ishikawa, E. et al., (Hrg.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo). Das Enzym, welches an den Antikörper gebunden wird, reagiert mit einem geeigneten Substrat, vorzugsweise einem chromogenen Substrat, auf die Weise, dass es einen chemischen Rest produziert, welcher z.B. mittels spektrophotometrischer, fluorimetrischer oder visueller Mittel nachgewiesen werden kann.
Enzyme, welche eingesetzt werden können, um den Antikörper nachweisbar zu markieren, sind, jedoch nicht ausschließlich, Malatdehydrogenase, Staphylokokken-Nuclease, Delta-5-Steroidisomerase, Alkoholdehydrogenase der Hefe, Alphaglycerophosphat, Dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, Betagalactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase. Der Nachweis kann mit kolorimetrischen Methoden erfolgen, in welchen ein chromogenes Substrat für das Enzym eingesetzt wird. Der Nachweis kann auch durch einen visuellen Vergleich des Ausmaßes der enzymatischen Reaktion eines Substrats mit ähnlich hergestellten Standards erfolgen.
Der Nachweis kann auch mit jedem der verschiedenen anderen Immunassays erfolgen. Beispielsweise ist es möglich, durch radioaktives Markieren der Antikörper oder Antikörperfragmente über den Einsatz eines Radioimmunassays (RIA) einen NGPCR nachzuweisen (siehe z.B. Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course an Radioligand Assay Techniques, The Endicrine Society, März 1986). Das radioaktive Isotop lässt sich mit Mitteln wie der Verwendung eines Gammazählers oder eines Scintillation Counters oder mittels Autoradiographie nachweisen.
Es ist auch möglich, den Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wird der fluoreszenzmarkierte Antikörper Licht mit der richtigen Wellenlänge ausgesetzt, kann sein Auftreten in Folge der Fluoreszenz nachgewiesen werden. Unter den im Allgemeinen am meisten verwendeten Fluoreszenzmarker-Verbindungen sind Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin.
Der Antikörper kann auch nachweisbar markiert werden, indem Fluoreszenz emittierende Metalle wie z.B. ¹⁵²Eu oder andere Vertreter der Lanthaniden eingesetzt werden. Diese Metalle lassen sich unter Einsatz von Metallchelatgruppen wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) an den Antikörper anheften.
Der Antikörper kann auch nachweisbar markiert werden, indem er an eine chemilumineszente Verbindung gekoppelt wird. Das Vorkommen des chemilumineszenz markierten Antikörpers wird dann über den Nachweis des Auftretens einer Lumineszenz ermittelt, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entstanden ist. Beispiele für besonders nützliche Chemilumineszenzmarker sind Luminol, Isoluminol, ein thermatischer Acridiniumester, Imidazol, ein Acridiniumsalz und ein Oxalatester.
Es kann auch eine Biolumineszenzverbindung eingesetzt werden, um den Antikörper der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art von Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen anzutreffen ist, in denen ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszierenden Reaktion erhöht. Das Vorkommen eines biolumineszierenden Proteins wird durch den Nachweis des Auftretens von Lumineszenz ermittelt. Wichtige biolumineszierende Verbindungen für eine Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
5.5 SCREENING-ASSAYS FÜR VERBINDUNGEN, WELCHE DIE NGPCR-EXPRESSION ODER AKTIVITÄT MODULIEREN
Die folgenden Assays werden entworfen, um Verbindungen zu identifizieren, die mit NGPCRs (einschließlich, aber nicht ausschließlich, einer ECD oder CD eines NGPCR) in Wechselwirkung treten (z.B. sich an sie binden), Verbindungen zu identifizieren, die mit mit einem NGPCR wechselwirkenden intrazellulären Proteinen (einschließlich, aber nicht ausschließlich, einer TM oder einer CD eines NGPCR) in Wechselwirkung treten (z.B. sich an sie binden), um Verbindungen zu identifizieren, welche die Wechselwirkung des NGPCR mit bei der NGPCR-vermittelten Signaltransduktion beteiligten Transmembranproteinen oder intrazellulären Proteinen beinträchtigen, sowie um Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität des NGPCR-Gens modulieren (d.h. das Ausmaß der NGPCR-Gen-Expression modulieren) oder die Konzentration des NGPCR modulieren. Zusätzlich können Assays eingesetzt werden, die Verbindungen identifizieren, welche an regulatorische Sequenzen (z.B. Promotorsequenzen) des NGPCR-Gens binden und welche die Expression des NPGR-Gens modulieren können. Siehe z.B. Platt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. 269: 28558-28562.
Die Verbindungen, welche erfindungsgemäß gescreent werden können sind, jedoch nicht ausschließlich, Peptide, Antikörper und Fragmente derselben sowie andere organische Verbindungen (z.B. Peptidodmimetika), die sich an eine ECD eines NGPCR binden und entweder die von dem natürlichen Liganden ausgelöste Aktivität nachahmen (d.h. Agonisten) oder die von dem natürlichen Liganden ausgelöste Aktivität hemmen (d.h. Antagonisten); sowie Peptide, Antikörper und Fragmente derselben und andere organische Verbindungen, welche die ECD des NFPCR (oder einen Teil derselben) nachahmen und sich an den natürlichen Liganden binden oder ihn "neutralisiseren".
Derartige Verbindungen können, jedoch nicht ausschließlich, Peptide sein, wie z.B. lösliche Peptide, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Vertreter von Bibliotheken aus Zufallspeptiden (siehe z.B. Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354: 82-84; Houghton, R. et al., 1991, Nature 354: 84-86) sowie aus der kombinatorischen Chemie stammende Vertreter von Molekülbibliotheken, die aus Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfiguration bestehen, Phosphopeptide (einschließlich, aber nicht ausschließlich, Vertreter aus auf Zufallspeptide oder teilweise degenerierte Phosphopeptide gerichteten Bibliotheken; siehe z.B. Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72: 767-778), Antikörper (einschließlich, aber nicht ausschließlich, polyklonale, monoklonale, humanisierte, antiidiotypische, chimäre oder Einzelketten-Antikörper und FAb, F(ab')₂ und Fragmente aus FAb-Expressionsbibliotheken sowie Epitop-bindende Feagmente derselben) und kleine organische oder anorganische Moleküle.
Andere Verbindungen, die gemäß der Erfindung gescreent werden können sind, jedoch nicht ausschließlich, kleine organische Moleküle, welche durch die Blut-Hirn-Schranke hindurch treten, in eine geeignete Zelle eintreten (z.B. das Cerebellum, den Hypothalamus usw.) und die Expression eines NGPCR-Gens oder einiger anderer beim Stoffwechselweg der Signaltransduktion beteiligter Gene beeinflussen können (z.B. durch Wechselwirkung mit der regulatorischen Region oder den bei der Genexpression eine Rolle spielenden Transkriptionsfaktoren); oder solche Verbindungen, welche die Aktivität des NGPCR beeinflussen (z.B. durch Hemmung oder Steigerung der enzymatischen Aktivität einer CD) oder die Aktivität von einigen anderen intrazellulären Faktoren, die beim Stoffwechselweg der NGPCR-Signaltransduktion beteiligt sind.
Modeling- und Such-Technologien mit dem Computer gestatten die Identifizierung von Verbindungen oder die Verbesserung schon identifizierter Verbindungen, welche Die GPCR-Expression oder -Aktivität modulieren können. Nach der Identifizierung einer derartigen Verbindung oder Zusammensetzung werden die aktiven Zentren oder Abschnitte identifiziert. Solche aktiven Zentren könnten typischerweise Bindungsstellen für Liganden sein. Das aktive Zentrum lässt sich mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Methoden identifizieren, z.B. aus den Aminosäuresequenzen der Peptide, aus den Nucleotidsequenzen der Nucleinsäuren oder aus der Untersuchung von Komplexen der relevanten Verbindung oder Zusammensetzung mit ihrem natürlichen Liganden. Im letzteren Fall können chemische oder röntgenkristallographische Verfahren eingesetzt werden, um das aktive Zentrum aufzufinden, indem herausgefunden wird, wo der komplexierte Ligand auf dem Faktor gefunden wird.
Als nächstes wird die dreidimensionale geometrische Struktur des aktiven Zentrums ermittelt. Dies kann nach bekannten Verfahren geschehen, einschließlich der Röntgenstrahl-Kristallographie, mit welcher man eine vollständige Molekülstruktur ermitteln kann. Andererseits kann eine Fest- oder Flüssigphasen-NMR eingesetzt werden, um bestimmte intramolekulare Abstände zu bestimmen. Es lässt sich jede andere experimentelle Methode zur Strukturermittlung einsetzen, um teilweise oder vollständige geometrische Strukturen zu erhalten. Die geometrischen Strukturen können mit einem natürlichen oder künstlichen komplexierten Liganden gemessen werden, was zur Erhöhung der Genauigkeit der ermittelten Struktur für das aktive Zentrums beitragen kann.
Falls eine unvollständige oder nicht ausreichend genaue Struktur ermittelt wird, lässt sich das Verfahren des auf Computer basierenden Numerischen Modeling einsetzen, um die Struktur zu vervollständigen und deren Genauigkeit zu verbessern. Es lässt sich jedes anerkannte Modeling-Verfahren verwenden, einschließlich der spezifisch für besondere Biopolymere wie Proteine oder Nucleinsäuren parametrisierten Modelle, der auf der Berechnung von Molekülbewegungen beruhenden molekulardynamischen Modelle, der auf thermischen Ensembles beruhenden statistisch-mechanischen Modelle oder kombinierter Modelle. Für die meisten Modelltypen sind molekulare Standard-Kraftfelder, welche die Kräfte zwischen den beteiligten Atomen und Gruppen widerspiegeln, notwendig und können aus in der Physikalischen Chemie bekannten Kraftfeldern ausgewählt werden. Die unvollständigen oder weniger genauen experimentellen Strukturen können als Beschränkungen für die vollständigen und genaueren Strukturen dienen, die von diesen Modeling-Verfahren berechnet wurden.
Nachdem schließlich die Struktur des aktiven Zentrums entweder experimentell, mittels Modeling oder mit einer Kombination von beidem ermittelt worden ist, können in Frage kommende modulierende Verbindungen mittels Durchsuchens von Datenbanken identifiziert werden, welche Verbindungen zusammen mit einer Information über ihre Molekülstruktur enthalten. Bei einer solchen Durchsuchung wird nach Verbindungen mit Strukturen gesucht, welche zu der ermittelten Struktur des aktiven Zentrums passen und mit den das aktive Zentrum definierenden Gruppen in Wechselwirkung treten. Eine derartige Durchsuchung kann per Hand erfolgen, geschieht aber vorzugsweise mit Unterstützung eines Computers. Diese bei dieser Suche aufgefundenen Verbindungen stellen potentielle NGPCR-modulierende Verbindungen dar.
Alternativ lassen sich diese Verfahren einsetzen, um verbesserte modulierende Verbindungen aus einer schon bekannten modulierenden Verbindung oder einem Liganden zu identifizieren. Die Zusammensetzung der bekannten Verbindung kann modifiziert werden und die strukturellen Effekte der Modifikation lassen sich ermitteln, indem die oben beschriebenen experimentellen Verfahren oder Computer-Modeling-Methoden bei der neuen Zusammensetzung zur Anwendung kommen. Die veränderte Struktur wird sodann mit der Struktur des aktiven Zentrums der Verbindung verglichen, um zu ermitteln, ob sich eine bessere Passung oder Wechselwirkung ergibt. Auf diese Weise lassen sich systematische Veränderungen in der Zusammensetzung, wie z.B. veränderte Seitengruppen, schnell auswerten, um modifizierte modulierende Verbindungen oder Liganden mit einer besseren Spezifität oder Aktivität zu erhalten.
Dem Fachmann erschließen sich weitere experimentelle Verfahren oder Computer-Modeling-Methoden zur Identifizierung von auf der Identifizierung der aktiven Zentren eines NGPCR basierenden modulierenden Verbindungen und damit in Zusammenhang stehenden Transduktions- und Transkriptionsfaktoren.
Beispiele für Molekül-Modeling-Systeme sind die CHARMm- und QUANTA-Programme (Polygen Corporation, Waltham, MA). CHARMm führt die Energieminimierung und die molekulardynamischen Funktionen aus. QUANTA führt die Konstruktion, das graphische Modeling und die Analyse der Molekülstruktur aus. QUANTA gestattet die interaktive Konstruktion, Modifizierung, Sichtbarmachung und Analyse des Verhaltens von Molekülen untereinander.
Eine Anzahl von Schriften geben einen Überblick über das Computer-Modeling von Arzneimitteln, die mit spezifischen Proteinen Wechselwirken, wie z.B. Rotivinenet et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (16. Juni 1988); McKinaly und Rossmann, 1989, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29: 111-122; Perry und Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design SS. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis und Dean, 1989, Proc. R. Soc. Lond. 236: 125-140 und 141-162; und bezüglich eines Modellrezeptors für Nucleinsäurekomponenten, Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 11: 1082-1090. Andere Computerprogramme, welche chemische Stoffe screenen und graphisch darstellen, können von Firmen wie BioDesign, Inc. (Pasadena, CA), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Kanada) und Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario) bezogen werden. Obwohl diese in erster Linie für die Anwendung von spezifisch gegen besondere Proteine gerichteten Arzneimitteln entworfen sind, können sie an das Design von Arzneimitteln angepasst werden, die spezifisch auf DNA- oder RNA-Abschnitte gerichtet sind, wenn dieser Abschnitt erst einmal identifiziert ist.
Obwohl oben mit Bezug auf das Design und die Erzeugung von Verbindungen beschrieben, welche die Bindung verändern könnten, könnte man auch Bibliotheken von bekannten Verbindungen nach Verbindungen durchsuchen, die Inhibitoren oder Aktivatoren sind, einschließlich Naturprodukten oder synthetischen chemischen Stoffen sowie biologisch aktiven Materialien, einschließlich Proteinen.
Auf Zellen basierende Systeme können ebenfalls verwendet werden, um sowohl Verbindungen zu identifizieren, die NGPCRs binden, als auch die mit einer solchen Bindung in lebenden Zellen einhergehende veränderte Aktivität zu bewerten. Ein Werkzeug von besonderem Interesse für derartige Assays ist das grüne fluoreszierende Protein, das u.a. in dem US-Patent 5,625,048 beschrieben wird. Zellen, die in solchen Zellassays zum Einsatz kommen können sind, jedoch nicht ausschließlich, Leukocyten oder von Leukocyten abstammende Zelllinien, Lymphocyten, Stammzellen, einschließlich embryonale Stammzellen, und dergl. Darüber hinaus können exprimierende Wirtszellen (z.B. B95-Zellen, COS-Zellen, CHO-Zellen, OMK-Zellen, Fibroblasten, Sf9-Zellen), die gentechnisch verändert wurden, um einen in Frage kommenden funktionellen NGPCR zu exprimieren und auf die Aktivierung durch den Test zu reagieren, oder ein natürlicher Ligand, der durch seine chemische oder phänotypische Veränderung gemessen wurde, oder die Induktion eines anderen Gens der Wirtszelle als Endpunkt in dem Assay benutzt werden.
Verbindungen, die mit Assays identifiziert wurden, wie sie hier beschrieben werden, können z.B. bei der Ausarbeitung der biologischen Funktion eines NGPCR-Genprodukts von Nutzen sein. Solche Verbindungen können einem Patienten in therapeutisch wirksamen Dosen zur Behandlung von jeder der verschiedenen physiologischen oder mentalen Erkrankungen verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf die Menge der Verbindung, welche ausreicht, um zu irgendeiner Verbesserung, Funktionsstörung, Verhinderung, oder Änderung irgendeines biologischen oder offenkundigen Symptoms zu führen.
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit von solchen Verbindungen kann mit standardisierten pharmazeutischen Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren ermittelt werden, z.B. zur Bestimmung der LD₅₀ (Dosis, die für 50% der Population tödlich ist) und der ED₅₀ (Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das Verhältnis der Dosen von toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen, welche große therapeutische Indizes aufweisen, sind bevorzugt. Während Verbindungen, welche toxische Nebenwirkungen zeigen, verwendet werden können, sollte Sorgfalt darauf verwendet werden, dass ein Abgabesystem entworfen wird, welches solche Verbindungen gezielt an den Ort des affizierten Gewebes lenkt, um einen möglichen Schaden an nicht infizierten Zellen möglichst gering zu halten und dadurch die Nebenwirkungen zu verringern.
Die aus den Zellkultur-Assays und den Tierstudien erhaltenen Daten können dazu verwendet werden, einen Dosierungsbereich für den Einsatz beim Menschen zu formulieren. Die Dosierung von solchen Verbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich von zirkulierenden Konzentrationen, welche die ED₅₀ mit geringer oder keiner Toxizität enthalten. Je nach der Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg kann die Dosierung in diesem Bereich variieren. Für jede in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis am Anfang aus Zellkultur-Assays abgeschätzt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, um ein zirkulierendes Plasma zu erzielen, welches die in Zellkultur ermittelte IC₅₀ enthält (d.h. die Konzentration der Testverbindung, mit welcher eine halbmaximale Hemmung der Symptome erreicht wird). Eine derartige Information kann dazu verwendet werden, um für den Menschen nützliche Dosen genauer zu bestimmen. Die Spiegel im Plasma können z.B. mit der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gemessen werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen für eine erfindungsgemäße Verwendung lassen sich auf herkömmliche Weise formulieren, indem eine oder mehrere physiologisch verträgliche Träger oder Vehikel verwendet werden. Somit lassen sich die Verbindungen und ihre physiologisch verträglichen Salze und gelösten Stoffe für eine Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation (entweder durch den Mund oder die Nase) oder für eine orale, bukkale, parenterale, intrakraniale, intrathekale oder rektale Verabreichung formulieren.
Für eine orale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form von z.B. Tabletten oder Kapseln einnehmen, die mit Hilfe konventioneller Mittel mit pharmazeutisch verträglichen Vehikeln wie z.B. Bindemitteln (z.B. vorgelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Schmierstoffen (z.B. Magnesiumstearat, Talk oder Silica); Aufschlussmitteln (z.B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglykolat) oder Benetzungsmitteln (z.B. Natriumdodecylsulfat) hergestellt wurden. Die Tabletten können mit im Stand der Technik bekannten Verfahren mit einem Überzug versehen werden. Flüssige Präparate für eine orale Verabreichung können z.B. die Form von Lösungen, Sirups oder Suspensionen einnehmen oder sie können als Trockenprodukt zum Auflösen mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor Gebrauch angeboten werden. Solche flüssigen Zusammensetzungen lassen sich mit Hilfe herkömmlicher Mittel mit pharmazeutisch verträglichen Additiven wie z.B. Suspensionsmedien (z.B. Sorbitsirup, Cellulosederivaten oder hydrierten essbaren Fetten); Emulgatoren (z.B. Lecithin oder Gummi arabicum); nicht-wässrigen Vehikeln (z.B. Mandelöl, Ölester, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenölen) und Konservierungsstoffen (z.B. Methyl- oder Propyl-p-Hydroxybenzoat oder Sorbinsäure) herstellen. Die Präparate können auch je nach Eignung Puffersalze, Aromastoffe, Farb- und Süßstoffe enthalten.
Die Präparate für eine orale Verabreichung können auf geeignete Weise formuliert sein, damit die aktive Verbindung kontrolliert freigesetzt wird.
Für eine bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen einnehmen, die auf konventionelle Weise formuliert wurden.
Für eine Verabreichung durch Inhalation werden die für eine erfindungsgemäße Verwendung vorgesehenen Verbindungen auf herkömmliche Weise in Form einer Aerosolspray-Präsentation aus unter Druck stehenden Packungen oder Zerstäubern abgegeben, wobei ein geeignetes Treibgas wie z.B. Dichlordifluormethan oder Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas verwendet wird. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosiseinheit ermittelt werden, indem ein Ventil vorgesehen wird, um eine abgemessene Menge abzugeben. Es lassen sich Kapseln und Kartuschen aus z.B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator formulieren, die ein Pulvergemisch aus der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis wie z.B. Lactose oder Stärke enthalten.
Die Verbindungen können für eine parenterale Verabreichung mittels Injektion, z.B. durch eine Bolus-Injektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen für eine Injektion können in Form einer Einheitsdosis angeboten werden, z.B. in Ampullen oder in Mehrfachdosis-Behältern mit einem zusätzlichen Konservierungsstoff. Die Zusammensetzungen können auch Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln einnehmen und sie können Formulierungsstoffe wie Suspensionsmittel, Stabilisatoren und/oder Dispersionsmittel enthalten. Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff zur Auflösung vor seiner Verwendung mit einem geeigneten Vehikel, wie z.B. sterilem Pyrogen-freiem Wasser, in Pulverform vorliegen.
Die Verbindungen können in rektalen Zusammensetzungen auch als Suppositorien oder Retentionsklistiere formuliert sein, die z.B. herkömmliche Suppositoriumsgrundstoffe wie z.B. Kokosbutter oder andere Glyceride enthalten.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotpräparate formuliert sein. Derart lang wirkende Formulierungen können durch Implantation (z.B. subkutan oder intramuskulär) verabreicht werden oder durch eine intramuskuläre Injektion. Somit können die Verbindungen z.B. mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Stoffen (z.B. als Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauscherharzen oder als mäßig lösliche Derivate, z.B. als mäßig lösliches Salz, formuliert werden.
Die Zusammensetzungen können, falls erwünscht, in einer Verpackung oder Dispergiervorrichtung dargeboten werden, welche eine oder mehrere Einheitsdosisformen enthalten, die den aktiven Inhaltsstoff enthalten. Die Verpackung kann z.B. wie eine Blister-Packung eine Metall- oder Kunststofffolie umfassen. In der Verpackung oder der Dispergiervorrichtung können Hinweise für die Verabreichung enthalten sein.
5.5.1 IN VITRO-SCREENING-ASSAYS FÜR VERBINDUNGEN, WELCHE SICH AN NGPCRs BINDEN
Es können in vitro-Systeme entworfen werden, um Verbindungen zu identifizieren, die mit einem NGPCR (einschließlich, aber nicht auschließlich einem ECD- oder CD-NGPCR) in Wechselwirkung treten (z.B. sich an ihn binden). Die identifizierten Verbindungen können z.B. bei der Modulierung der Aktivität von Wildtyp- und/oder mutanten NGPCR-Genprodukten von Nutzen sein; sie können bei der Aufklärung der biologischen Funktion des NGPCR von Nutzen sein; sie können bei Durchsuchungen zur Identifizierung von Verbindungen von Nutzen sein, welche normale NGPCR-Wechselwirkungen unterbrechen; oder sie können selbst solche Wechselwirkungen unterbrechen.
Das Prinzip der Assays, die zur Identifizierung von sich an den NGPCR bindenden Verbindungen eingesetzt werden, umfasst die Herstellung einer Reaktionsmischung aus dem NGPCR und der Testverbindung unter Bedingungen und über eine Zeitspanne, die ausreichen, damit die beiden Komponenten in Wechselwirkung treten und sich aneinander binden können und so einen Komplex bilden, der entfernt werden und/oder in der Reaktionsmischung nachgewiesen werden kann. Je nach dem Ziel des Screening-Assays kann die verwendete NGPCR-Spezies variieren. Wenn Agonisten des natürlichen Liganden gesuchte werden, kann z.B. ein NGPCR mit voller Länge oder ein löslicher eingekürzter NGPCR zum Einsatz kommen, in dem z.B. die TM und/oder die CD aus dem Molekül deletiert sind, oder es kann ein Peptid zum Einsatz kommen, das einer ECD oder einem Fusionsprotein entspricht, das eine oder mehrere NGPCR-ECDs enthält, die an ein Protein oder an ein Polypeptid fusioniert sind, was im Assay-System Vorteile bietet (z.B. beim Markieren, bei der Isolierung des erhaltenen Komplexes, usw.). Wenn Verbindungen zur Identifitierung gesucht werden, die mit der cytoplasmatischen Domäne in Wechselwirkung treten, können Peptide eingesetzt werden, die dem NGPCR und den die NGPCR-CD enthaltenden Fusionsproteinen entsprechen.
Die Screening-Assays können auf verschiede Weisen durchgeführt werden. Ein Verfahren zur Durchführung eines solchen Assays würde z.B. die Verankerung des NGPCR-Proteins, -Polypeptids, -Peptids, oder -Fusionsproteins oder der Testsubstanz auf einer Festphase betreffen und am Ende der Reaktion den Nachweis des auf der Festphase verankerten NGPCR/Test-Verbindungskomplexes. In einer Ausführungsform eines derartigen Verfahrens kann der NGPCR-Reaktionspartner auf einer festen Oberfläche verankert werden und die Testverbindung, die nicht verankert ist, kann entweder direkt oder indirekt markiert werden.
In der Praxis können Miktotiterplatten auf konventionelle Weise als Festphase eingesetzt werden. Die verankerte Komponente kann durch nicht-kovalentes oder kovalentes Anheften immobilisiert sein. Eine nicht-kovalente Anheftung kann durch einfaches Beschichten der festen Oberfläche mit einer Proteinlösung und durch Trocknen erfolgen. Alternativ kann ein immobilisierter Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende Protein spezifisch ist, eingesetzt werden, um das Protein an der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können vorher hergestellt und aufbewahrt werden.
Um den Assay durchzuführen, wird die nicht-immobilisierte Komponente der beschichteten, die verankerte Komponente enthaltenden Oberfläche zugesetzt. Nach Ende der Reaktion werden die nicht reagierten Komponenten unter Bedingungen entfernt (z.B. abgewaschen), dass jeder der gebildeten Komplexe auf der festen Oberfläche immobilisiert bleibt. Der Nachweis der auf der festen Oberfläche verankerten Komplexe kann auf verschiedene Weise erfolgen. Wenn die vorher nicht immobilisierte Komponente vormarkiert ist, zeigt der Nachweis einer auf der Oberfläche immobilisierten Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn die vorher nicht immobilisierte Komponente nicht vormarkiert ist, kann eine indirekte Markierung benutzt werden, um die auf der Oberfläche verankerten Komplexe nachzuweisen, z.B. indem ein markierter Antikörper, der für die vorher nicht immobilisierte Komponente spezifisch ist, verwendet wird (der Antikörper selbst kann mit einem markierten Anti-Ig-Antikörper direkt oder indirekt markiert sein).
Alternativ kann eine Reaktion in einer flüssigen Phase durchgeführt werden, wobei die Reaktionsprodukte von nicht reagierten Komponenten abgetrennt werden und die Komplexe werden nachgewiesen, indem z.B. ein immobilisierter Antikörper verwendet wird, der für ein NGPCR-Protein, -Polypeptid, -Peptid oder -Fusionsprotein oder die Testverbindung spezifisch ist, um alle in der Lösung gebildeten Komplexe zu verankern, oder es wird ein markierter Antikörper verwendet, der spezifisch für die andere Komponente des möglichen Komplexes ist, um die verankerten Komplexe nachzuweisen.
Alternativ können auf Zellen basierende Assays eingesetzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die mit dem NGPCR in Wechselwirkung treten. Hierfür können Zelllinien eingesetzt werden, die den NGPCR exprimieren, oder es können Zelllinien (z.B. COS-Zellen, CHO-Zellen, Fibroblasten usw.) verwendet werden, welche gentechnisch verändert wurden, damit sie einen NGPCR exprimieren (z.B. mittels Transfektion oder Transduktion der NGPCR-DNA). Die Wechselwirkung der Testverbindung mit z.B. einer ECD eines von der Wirtszelle exprimierten NGPCR lässt sich durch einen Vergleich oder durch Kompetition mit einem nativen Liganden ermitteln.
5.5.2 ASSAYS FÜR INTRAZELLULÄRE PROTEINE, DIE MIT NGPCRs IN ^ WECHSELWIRKUNG TRETEN
Jedes für den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen geeignete Verfahren kann verwendet werden, um Transmembran-Proteine oder intrazelluläre Proteine zu identifizieren, welche mit einem NGPCR in Wechselwirkung treten. Unter den traditionellen Verfahren, die eingesetzt werden können, sind die Co-Immunopräzipitation, die Quervernetzung und Co-Reinigung durch Gradienten oder chromatographische Säulen oder Zelllysate oder aus Zelllysaten erhaltene Proteine sowie ein NGPCR, um in dem Lysat Proteine zu identifizieren, die mit dem NGPCR in Wechselwirkung treten. Für diese Assays kann die eingesetzte NGPCR-Komponente ein NGPCR mit voller Länge, ein lösliches Derivat ohne die Membran-Verankerungsregion (z.B. ein verkürzter NGPCR, in welchem eine TM deletiert ist, was zu einem verkürzten Molekül mit einer an eine CD fusionierten ECD führt) oder ein einer CD oder einem Fusionsprotein mit einer CD eines NGPCR entsprechendes Peptid sein. Ist es erst einmal isoliert, kann ein solches intrazelluläres Protein identifiziert werden und es kann seinerseits zusammen mit Standardtechniken dazu verwendet werden, Proteine zu identifizieren, mit welchen es in Wechselwirkung tritt. Beispielsweise kann zumindest ein Teil der Aminosäuresequenz eines intrazellulären Proteins identifiziert werden, indem dem Fachmann bekannte Techniken, wie z.B. die Technik des Edmann-Abbaus, eingesetzt werden (siehe z.B. Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principles", W.H. Freeman & Co., N.Y., SS 34-49). Die erhaltene Aminosäuresequenz kann als Führer für die Erzeugung von Oligonucleotidgemischen verwendet werden, welche zum Screening nach Gensequenzen eingesetzt werden können, die solche intrazellulären Proteine codieren. Das Screening kann z.B. mit Hilfe von Hybridisierungs- oder PCR-Techniken erfolgen. Techniken zur Erzeugung von Oligonucleotidgemischen sowie das Screening sind bekannt (siehe z.B. Ausubel, supra und PCR Protocols: A Guide zu Methods and Applications, 1990, Innis, M. et al., Hrg. Academic Press, Inc., New York).
Darüber hinaus lassen sich Verfahren einsetzen, die zu der gleichzeitigen Identifizierung von Genen führen, welche die Transmembranproteine oder die intrazellulären Proteine codieren, die mit dem NGPCR in Wechselwirkung treten. Diese Verfahren umfassen z.B. das Sondieren von Expressionsbibliotheken auf eine ähnliche Weise, wie die bekannte Technik der Antikörper-Sondierung der λgt11-Bibliotheken, indem ein markiertes NGPCR-Protein oder ein NGPCR-Polypeptid, ein Peptid oder ein Fusionsprotein, z.B. ein an einen Marker (z.B. ein Enzym, Fluor, ein lumineszierendes Protein oder einen Farbstoff) fusioniertes Polypeptid oder eine NGPCR-Domäne oder eine Ig-Fc-Domäne eingesetzt werden.
Ein Verfahren, welches Protein-Wechselwirkungen in vivo nachweist, das Zwei-Hybrid-System, wird ausführlich nur zum Zwecke der Veranschaulichung und keineswegs der Einschränkung beschrieben. Eine Version dieses Systems ist beschrieben worden (Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 9578-9582) und ist im Handel von Clontech (Palo Alto, CA) erhältlich.
Bei Einsatz eines derartigen Systems werden kurz gesagt Plasmide konstruiert, welche zwei Hybrid-Proteine codieren: ein Plasmid besteht aus Nucleotiden, welche die DNA-Bindungs-Domäne eines Transkriptions-Aktivator-Proteins codieren, das an eine den NGPCR codierende NGPCR_Nucleotidsequenz, an ein NGPCR-Polypeptid, -Peptid oder -Fusionsprotein fusioniert ist, und das andere Plasmid besteht aus Nucleotiden, welche die Aktivierungs-Domäne des Transkriptions-Aktivator-Proteins codieren, wobei die Aktivierungs-Domäne an eine cDNA fusioniert ist, welche ein unbekanntes Protein codiert, das in dieses Plasmid als Teil einer cDNA-Bibliothek rekombiniert worden ist. Das DNA-Bindungsdomänen-Fusionsplasmid und die cDNA-Bibliothek werden in einen Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae transformiert, der ein Rezeptor-Gen enthält (z.B. HBS oder lacZ), dessen regulatorische Region die Bindungsstelle des Transkriptions-Aktivators enthält. Jedes der Hybrid-Proteine allein kann die Transkription des Reportergens nicht aktivieren: das DNA Bindungsdomänen-Hybrid kann es nicht, weil es keine Aktivierungsfunktion ausübt und das Aktivierngsdomänen-Hybrid kann es nicht, weil es sich an den Bindungsstellen des Aktivators nicht festsetzen kann. Die Wechselwirkung der zwei Hybrid-Proteine stellt das funktionelle Aktivatorprotein wieder her und führt zur Expression des Reportergens, welches mit einem Assay für das Reportergen-Produkt nachgewiesen wird.
Das Zwei-Hybrid-System oder eine verwandte Methodik kann eingesetzt werden, um Bibliotheken von Aktivierungsdomänen nach Proteinen zu durchsuchen, welche mit dem "Köder"-Genprodukt in Wechselwirkung treten. Nur als Beispiel und nicht einschränkend kann ein NGPCR als Köder-Genprodukt eingesetzt werden. Die gesamten Genom- oder cDNA-Sequenzen werden an die DNA fusioniert, welche eine Aktivierungsdomäne codiert. Diese Bibliothek und ein Plasmid, welches ein Hybrid eines an die DNA-Bindungs-Domäne fusionierten Köder-NGPCR-Genprodukt codiert, werden zusammen in einen Reporter-Stamm der Hefe transformiert und die erhaltenen Transformanten werden nach denjenigen durchsucht, welche das Reportergen exprimieren. Nur als Beispiel und nicht einschränkend kann eine Sequenz des Köder-NGPCR-Gens, wie z.B. das offene Leseraster für einen NGPCR (oder für eine Domäne eines NGPCR) in einen Vektor cloniert werden, so dass sie über eine Translation an die DNA fusioniert wird, welche die DNA-Bindungs-Domäne des GAL4-Proteines codiert. Diese Kolonien werden gereinigt und die Bibliotheks-Plasmide, welche für die Expression des Reportergens verantwortlich sind, werden isoliert. Es wird sodann eine DNA-Sequenzierung benutzt, um die von den Bibliotheks-Plasmiden codierten Proteine zu identifizieren.
Mit Hilfe von im Stand der Technik routinemäßig durchgeführter Verfahren lässt sich eine cDNA-Bibliothek derjenigen Zelllinien erstellen, aus welchen Proteine, die mit dem Köder-NPCR-Genprodukt in Wechselwirkung treten, nachgewiesen werden sollen. Nach dem hier beschriebenen besonderen System können z.B. die cDNA-Fragmente so in einen Vektor insertiert werden, dass sie über eine Translation an die Aktivierungsdomäne für die Translation des GAL4 fusioniert werden. Diese Bibliothek kann zusammen mit dem Köder-NGPCR-Gen-GAL4-Fusionsplasmid in einen Hefestamm transformiert werden, der ein lacZ-Gen enthält, das von einem Promotor angetrieben wird, welcher die GAL4-Aktivierungssequenz enthält. Ein von der cDNA codiertes Protein, welches an die mit dem Köder-NGPCR-Genprodukt in Wechselwirkung tretende Aktivierungsdomäne für die Translation des GAL4 fusioniert wurde, stellt wieder ein aktives GAL4-Protein her und treibt dadurch die Expression des HIS3-Gens an. Kolonien, welche HIS3 exprimieren, lassen sich durch ihr Wachstum in Petrischalen nachweisen, welche auf halbfestem Agar basierende Medien ohne Histidin enthalten. Die cDNA kann dann aus diesen Stämmen gereinigt und dazu verwendet werden, mit Hilfe von im Stand der Technik routinemäßig durchgeführter Techniken das mit dem Köder-NGPCR-Gen in Wechselwirkung tretende Protein zu produzieren und zu isolieren.
5.5.3. ASSAYS FÜR VERBINDUNGEN, WELCHE DIE WECHSELWIRKUNG VON NGPCR/INTRAZELLULÄRES MAKROMOLEKÜL oder NGPCR/TRANSMEMBRAN-MAKROMOLEKÜL BEEINTRÄCHTIGEN
Zum Zwecke dieser Erörterung werden die Makromoleküle, die mit dem NGPCR in Wechselwirkung treten als "Bindungspartner" bezeichnet. Diese Bindungspartner spielen wahrscheinlich im Stoffwechselweg der NGPCR-Signaltransduktion eine Rolle. Daher ist es erwünscht, Verbindungen zu identifizieren, welche die Wechselwirkung solcher Bindungspartner, die bei der Regulation der Aktivität eines NGPCR und der Kontrolle von mit der NGPCR-Aktivität einhergehenden Störungen von Nutzen sein können, beeinträchtigen oder unterbrechen. Es wird z.B. erwartet, dass die beschriebenen NGPCRs bei gegebenem Expressionsmuster in Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen besonders nützlich sind, die bei der therapeutischen Behandlung einer Fettsucht, einer Entzündung, einer Immunkrankheit, eines Diabetes, einer Herz- und Kreislauferkrankung, von Stoffwechselkrankheiten und von Krebs von Nutzen sind.
Das grundlegende Prinzip von Assaysystemen, welche zur Identifizierung von Verbindungen eingesetzt werden, welche die Wechselwirkung zwischen einem NGPCR und seinem Bindungspartner oder seinen Bindungspartnern beeinflussen, umfasst die Herstellung eines Reaktionsgemischs mit einem NGPCR-Protein, -Polypeptid, -Peptid oder -Fusionsprotein, wie dies oben in den Abschnitten 5.5.1 und 5.5.2 beschrieben wurde, sowie dem Bindungspartner unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, den beiden die Wechselwirkung und Bindung aneinander zu gestatten und so einen Komplex zu bilden. Um eine Verbindung auf inhibitorische Aktivität hin zu prüfen, wird das Reaktionsgemisch in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung hergestellt. Die Testverbindung kann am Anfang im Rektionsgemisch enthalten sein oder sie kann zu einem Zeitpunkt nach der Zugabe des NGPCR-Rests und dessen Bindungspartners zugesetzt werden. Es werden Kontroll-Reaktionsgemische ohne die Testverbindung oder mit einem Placebo inkubiert. Sodann wird die Bildung von irgendwelchen Komplexen zwischen dem NGPCR-Rest und dem Bindungspartner nachgewiesen. Die Bildung eines Komplexes in der Kontrollreaktion, aber nicht in dem Reaktionsgemisch mit der Testverbindung, weist darauf hin, dass die Verbindung die Wechselwirkung des NGPCR und des interaktiven Bindungspartners beeinträchtigt. Zusätzlich kann auch die Komplexbildung in den Reaktionsgemischen, welche die Testverbindung und normales NGPCR-Protein enthalten, mit der Komplexbildung in den Reaktionsgemischen, welche die Testverbindung und einen mutanten NGPCR enthalten, verglichen werden. Dieser Vergleich kann in solchen Fällen wichtig sein, in denen es erwünscht ist, Verbindungen zu identifizieren, die Wechselwirkungen von mutanten oder mutierten NGPCRs, aber nicht von normalen NGPCRs, spezifisch unterbrechen.
Der Assay für Verbindungen, welche die Wechselwirkung eines NGPCR und seiner Bindungspartner beeinträchtigen, kann in heterogenem oder homogenem Format durchgeführt werden. Bei heterogenen Assays spielt die Verankerung entweder des Produkts des NGPCR-Rests oder des Bindungspartners auf einer Festphase und der Nachweis der auf der Festphase verankerten Komplexe am Ende der Reaktion eine Rolle. In homogenen Assays erfolgt die gesamte Reaktion in flüssiger Phase. In jedem dieser Ansätze kann die Reihenfolge der Zugabe der Reaktanten variiert werden, um eine unterschiedliche Information über die zu testenden Verbindungen zu erhalten. Testverbindungen, welche die Wechselwirkung durch Kompetition beeinträchtigen, können z.B. identifiziert werden, indem die Reaktion in Gegenwart der Testsubstanz durchgeführt wird, d.h. durch Zusatz der Testsubstanz zum Reaktionsgemisch vor oder gleichzeitig mit einem NGPCR-Rest und dem interaktiven Bindungspartner. Alternativ können Testverbindungen, welche zuvor gebildete Komplexe auseinander reißen, z.B. Verbindungen mit höheren Bindungskonstanten, welche eine der Komponenten aus dem Komplex verdrängen, untersucht werden, indem die Testverbindung dem Reaktionsgemisch nach der Bildung der Komplexe zugesetzt werden. Die verschiedenen Formate werden unten kurz beschrieben.
In einem heterogenen Assaysystem werden entweder ein NGPCR-Rest oder ein interaktiver Bindungspartner auf einer festen Oberfläche verankert, während die nicht-verankerte Spezies entweder direkt oder indirekt markiert wird. In der Praxis werden gewöhnlich Mikrotiterplatten verwendet. Die verankerte Spezies kann über eine nicht-kovalente oder kovalente Anheftung immobilisiert werden. Eine nicht-kovalente Anheftung kann erfolgen, indem die feste Oberfläche einfach mit einer Lösung des NGPCR-Genprodukts oder des Bindungspartners beschichtet und getrocknet wird. Alternativ kann ein Antikörper eingesetzt werden, der spezifisch für die zu verankernde Spezies ist, um die Spezies an der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können zuvor hergestellt und aufbewahrt werden.
Um den Assay durchzuführen, wird der Partner der immobilisierten Spezies der beschichteten Oberfläche mit oder ohne die Testverbindung ausgesetzt. Nach Ende der Reaktion werden nicht reagierte Komponenten entfernt (z.B. durch Waschen) und jeder der gebildeten Komplexe bleibt auf der festen Oberfläche immobilisiert. Der Nachweis der auf der festen Oberfläche verankerten Komplexe kann auf verschiedene Weise erfolgen. Wenn die nicht immobilisierte Spezies vormarkiert ist, weist der Nachweis der auf der Oberfläche immobilisierten Markierung darauf hin, dass Komplexe gebildet wurden. Wenn die nicht immobilisierte Spezies nicht vormarkiert ist, kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um auf der Oberfläche verankerte Komplexe nachzuweisen, indem z.B. ein markierte Antikörper eingesetzt wird, der spezifisch für die am Anfang nicht immobilisierte Spezies ist (der Antikörper selbst kann mit einem markierten Anti Ig-Antikörper direkt oder indirekt markiert sein). Je nach der Reihenfolge der Zugabe der Reaktionskomponenten lassen sich Testverbindungen nachweisen, welche eine Komplexbildung hemmen oder welche zuvor gebildete Komplexe auseinander reißen.
Alternativ können die Reaktion in flüssiger Phase in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt, die Reaktionsprodukte von den nicht reagierten Komponenten abgetrennt und die Komplexe nachgewiesen werden, indem z.B. ein immobilisierter für eine der Bindungskomponenten spezifischer Antikörper eingesetzt wird, um alle in der Lösung gebildeten Komplexe zu verankern und indem ein für die anderen Partner spezifischer markierter Antikörper eingesetzt wird, um verankerte Komplexe nachzuweisen. Je nach der Reihenfolge der Zugabe der Reaktionspartner zu der flüssigen Phase lassen sich wieder die Testverbindungen identifizieren, welche den Komplex hemmen oder zuvor gebildete Komplexe auseinander reißen.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann ein homogener Assay eingesetzt werden. In diesem Ansatz wird ein vorher gebildeter Komplex aus einem NGPCR-Rest und einem interaktiven Bindungspartner hergestellt, in welchem entweder der NGPCR oder seine Bindungspartner markiert sind, aber das von der Markierung erzeugte Signal wird in Folge der Bildung des Komplexes unterdrückt (siehe z.B. US-Patent 4,109,496 von Rubenstein, in welchem dieser Ansatz für Immunassays verwendet wird). Der Zusatz einer Testsubstanz, welche mit einer der Spezies aus dem zuvor gebildeten Komplex in Kompetition tritt und sie ersetzt, führt zu der Erzeugung eines über dem Hintergrundrauschen liegenden Signals. Auf diese Weise lassen sich Testsubstanzen identifizieren, welche die Wechselwirkung von NGPCR/intrazellulärem Bindungspartner unterbrechen.
In einer besonderen Ausführungsform kann eine NGPCR-Fusion für die Immobilisierung hergestellt werden. Beispielsweise kann ein NGPCR oder ein Peptidfragment, das z.B. einer CD entspricht, an ein Glutathion-S-Transferase (TST)-Gen fusioniert werden, indem ein Fusionsvektor wie z.B. pGEX-5X-1 so eingesetzt wird, dass dessen Bindungsaktivität im erhaltenen Fusionsprotein beibehalten wird. Der interaktive Bindungspartner kann gereinigt und eingesetzt werden, um mit Hilfe von im Stand der Technik routinemäßig ausgeführter und oben in Abschnitt 5.3 beschriebener Verfahren einen monoklonalen Antikörper zu erzeugen. Dieser Antikörper lässt sich mit dem radioaktiven Isotop ¹²⁵I markieren, z.B. mit im Stand der Technik routinemäßig durchgeführter Verfahren. In einem heterogenen Assay kann z.B. das GST-NGPCR-Fusionsprotein an Glutathion-Agarose-Kügelchen verankert werden. Der interaktive Bindungspartner kann dann in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung in einer Weise zugegeben werde, welche eine Wechselwirkung und Bindung gestattet. Am Ende des Reaktionszeitraums kann nicht-gebundenes Material ausgewaschen werden und der markierte monoklonale Antikörper kann dem System zugesetzt werden und sich an die komplexierten Komponenten binden lassen. Die Wechselwirkung zwischen einem NGPCR-Genprodukt und dem interaktiven Bindungspartner lässt sich nachweisen, indem die Menge an Radioaktivität gemessen wird, die mit den Glutathion-Agarose-Kügelchen assoziiert bleibt. Eine erfolgreiche Hemmung der Wechselwirkung durch die Testverbindung führt zu einem Anstieg bei der gemessenen Aktivität.
Alternativ können das GST-NGPCR-Fusionsprotein und der interaktive Bindungspartner in flüssiger Phase in Abwesenheit der festen Glutathion-Agarose-Kügelchen miteinander vermischt werden. Die Testverbindung kann entweder während oder nachdem den Spezies gestattet wird, in Wechselwirkung zu treten, zugesetzt werden. Das Gemisch kann dann zu den Glutathion-Agarose-Kügelchen gegeben und nicht-gebundenes Material ausgewaschen werden. Das Ausmaß der Hemmung der Wechselwirkung von NGPCR/Bindungspartner kann wieder nachgewiesen werden, indem der markierte Antikörper zugesetzt und die mit den Kügelchen assoziierte Radioaktivität gemessen wird.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die gleichen Techniken eingesetzt werden, indem an Stelle des einen oder beider Proteine mit voller Länge Peptidfragmente verwendet werden, welche den Bindungsdomänen eines NGPCR und/oder dem interaktiven Bindungspartner (in den Fällen, wo der Bindungspartner ein Protein ist) entsprechen. Jede Anzahl der im Stand der Technik routinemäßig durchgeführten Verfahren lässt sich einsetzen, um die Bindungsstellen zu identifizieren und zu isolieren. Diese Verfahren umfassen, jedoch nicht ausschließlich, die Mutagenese des Gens, das eines der Proteine codiert, sowie das Screening nach einer Spaltung der Bindung in einem Co-Immunopräzipitations-Assay. Kompensatorische Mutationen in dem Gen, welches die zweite Spezies in dem Komplex codiert, lassen sich dann auswählen. Eine Sequenzanalyse der Gene, welche die entsprechenden Proteine codieren, verrät die Mutationen, welche der Region des Proteins entsprechen, die bei der interaktiven Bindung beteiligt ist. Alternativ kann unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahren ein Protein an einer festen Oberfläche verankert werden und kann mit seinem markierten Bindungspartner in Wechselwirkung treten und sich an ihn binden lassen, welches Protein mit einem proteolytischen Enzym wie Trypsin behandelt worden war. Nach dem Waschen kann ein relativ kurzes markiertes Peptid mit dem festen Material assoziiert bleiben, welches Peptid isoliert und durch Sequenzierung der Aminosäuren identifiziert werden kann. Hat man das Gen, welches für den intrazellulären Bindungspartner codiert, erst einmal erhalten, lassen sich auch kurze Gensegmente technisch herstellen, um die Peptidfragmente des Proteins zu exprimieren, welche dann auf ihre Bindungsaktivität hin untersucht und gereinigt oder synthetisiert werden können.
Als Beispiel und keineswegs als Einschränkung kann ein NGPCR-Genprodukt wie oben beschrieben an einem festen Material verankert werden, indem ein GST-NGPCR-Fusionsprotein hergestellt und an Glutathion-Agarose-Kügelchen binden gelassen wird. Der interaktive Bindungspartner kann mit einem radioaktiven Isotop wie z.B. ³⁵S markiert sein und mit einem proteolytischen Enzym wie Trypsin gespalten werden. Die Spaltprodukte können sodann zu dem verankerten GST-NGPCR-Fusionsprotein gegeben werden und sich daran binden lassen. Nach dem Auswaschen der nicht gebundenen Peptide kann das markierte gebundene Material, welches die Bindungsdomäne des intrazellulären Bindungspartners darstellt, eluiert, gereinigt und nach bekannten Verfahren auf seine Aminosäuresequenz hin analysiert werden. Die so identifizierten Peptide können synthetisch hergestellt oder mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie an geeignete fakultative Proteine fusioniert werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls umfassend eine Nucleotidsequenz, welche für die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt wird, kodiert, in einem Verfahren zur Diagnose einer Gewichtsstörung, einem Verfahren zum Wirkstoffscreening zur Verwendung bei der Behandlung einer Gewichtsstörung oder einem Verfahren zur Überwachung eines klinischen Versuchs einer Behandlung einer Gewichtsstörung, unter der Bedingung, dass Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und Diagnostizierverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden, nicht beansprucht sind.
Verwendung eines Polypeptids umfassend die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt wird, in einem Verfahren zur Diagnose einer Gewichtsstörung, in einem Verfahren zum Wirkstoffscreening zur Verwendung bei der Behandlung einer Gewichtsstörung oder in einem Verfahren zur Überwachung eines klinischen Versuchs einer Behandlung einer Gewichtsstörung, mit der Einschränkung, dass Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und Diagnostizierverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden, nicht beansprucht sind.
Verwendung eines Antikörpers, welcher spezifisch ein oder mehrere Epitope eines Polypeptids erkennt, welches die Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt ist, oder eines Epitop bindenden Fragments oder Derivats des Antikörpers, z.B., eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers, eines einsträngigen Antikörpers, eines Fab Fragments, eines F(ab')₂, eines Fragments hergesellt mittels einer Fab Expressionsbibliothek, oder eines anti-idiotypischen (anti Id) Antikörpers, in einem Verfahren zur Diagnose einer Gewichtsstörung, einem Verfahren zum Wirkstoffscrenning zur Verwendung bei der Behandlung einer Gewichtsstörung oder in einem Verfahren zur Überwachung eines klinischen Versuchs einer Behandlung einer Gewichtsstörung, mit der Einschränkung, dass Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und Diagnostizierverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden, nicht beansprucht sind.
Verwendung eines Antikörpers, welcher spezifisch ein oder mehrere Epitope eines Polypeptids erkennt, welches die Aminosäuresequenz, welche in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 dargestellt ist umfasst, oder eines Epitop bindenden Fragments oder Derivats des Antikörpers, beispielsweise eines polyklonalen oder eines monoklonalen Antikörpers, eines einsträngigen Antikörpers, eines Fab Fragments, eines F(ab')₂, eines Fragments hergestellt mittels einer Fab Expressionsbibliothek, oder eines anti-idiotypischen (anti-Id) Antikörpers, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Gewichtsstörung.
Ein Antisens-Nukleinsäuremolekül, welches die Expression eines Polypeptids inhibiert, umfassend die Aminosäuresequenz, welche in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt wird, zur Verwendung als Medikament zur Behandlung einer Gewichtsstörung.
Verwendung eines Antisens-Nukleinsäuremoleküls, welches die Expression eines Polypeptids inhibiert, das die Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt wird bei, der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Gewichtsstörung.