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1. Einführung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung
und Diagnose von Immunstörungen,
insbesondere mit T-Helfer-(TH)-Zellen und TH-ähnlichen Zellen verbundene
Störungen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Diagnose und Zusammensetzungen
für die
Behandlung derartiger Störungen
und Verfahren zur Überwachung
der Effizienz der in klinischen Studien verwendeten Verbindungen
bereit.
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2. Stand der
Technik
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Es
werden zwei unterschiedliche Arten von T-Lymphozyten unterschieden:
CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten (ZTLs) und
CD4+-T-Helfer-Lymphozyten (TH-Zellen). ZTLs
erkennen und töten
Zellen, die fremde Antigene auf ihrer Oberfläche aufweisen. ZTL-Vorläufermoleküle weisen
T-Zell-Rezeptoren
auf, die prozessierte Peptide, die aus fremden Proteinen stammen,
gekoppelt mit MHC-Klasse-I-Molekülen auf
anderen Zelloberflächen
erkennen. Dieser Erkennungsprozess löst die Aktivierung, Reifung
und Proliferation der ZTL-Vorläufermoleküle aus,
was zu ZTL-Klonen führt,
die Zellen, die als fremd erkannte Antigene aufweisen, zerstören können.
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TH-Zellen
sind sowohl bei den humoralen wie auch den zellvermittelten Formen
der Effektorimmunantworten beteiligt. Bezüglich der humoralen, oder Antikörper-, Immunantwort,
werden Antikörper
von B-Lymphozyten durch Wechselwirkung mit TH-Zellen produziert.
Insbesondere werden extrazelluläre
Antigene durch Antigen-präsentierende
Zellen (APCs) endozytosiert, prozessiert und vorzugsweise zusammen
mit Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Klasse-II-Molekülen den
auf CD4+-MHC-Klasse-II beschränkten TH-Zellen präsentiert.
Diese TH-Zellen aktivieren ihrerseits B-Lymphozyten, was zu einer Antikörperproduktion
führt.
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Die
zellvermittelte, oder zelluläre,
Immunantwort funktioniert so, dass Mikroorganismen, die intrazelluläre Orte
bewohnen, neutralisiert werden. Fremde Antigene, wie zum Beispiel
virale Antigene, werden in infizierten Zellen synthetisiert und
auf den Oberflächen
solcher Zellen zusammen mit MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert. Dies führt dann
zur Stimulierung der auf CD8+-MHC-Klasse-I
beschränkten
ZTLs.
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Einige
Erreger, wie Mykobakterien, die Tuberkulose und Lepra verursachen,
werden von Makrophagen umschlossen und in Bläschen prozessiert, die proteolytische
Enzyme und andere toxische Substanzen enthalten. Während diese
Makrophagenbestandteile die meisten Mikroorganismen töten und
verdauen können, überleben
Erreger wie Mykobakterien und vermehren sich die Erreger-Antigene
werden dennoch von den Makrophagen prozessiert und vorzugsweise
zusammen mit MHC-Klasse-II-Molekülen
den auf CD4+-MHC-Klasse-II beschränkten TH-Zellen
präsentiert,
welche stimuliert werden, um Interferon-γ zu sezernieren, das seinerseits
die Makrophagen aktiviert. Eine derartige Aktivierung führt zu einer
erhöhten
bakteriziden Fähigkeit
der Zellen.
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TH-Zellen
bestehen aus mindestens zwei getrennten Subpopulationen, der TH1-
und TH2-Zell-Subpopulation. Nachweise legen nahe, dass TH1- und
TH2-Subtypen extrem polarisierte Populationen von TH-Zellen darstellen.
Während
derartige Subpopulationen ursprünglich
in murinen Systemen entdeckt wurden (Review in: Mosmann, T. R. und
Coffman, R. L., 1989, Ann. Rev. Immunol. 7: 145), wurde die Existenz
von TH1- und TH2-ähnlichen
Subpopulationen auch bei Menschen festgestellt (Del Prete, A. F.
et al., 1991, J. Clin. Invest. 88: 346; Wiernenga, E. A. et al.,
1990, J. Imm. 144: 4651; Yamamura, M. et al., 1991, Science 254:
277; Robinson, D. et al., 1993, J. Allergy Clin. Imm. 92: 313).
Während
TH1-ähnliche
und TH2-ähnliche
Zellen die am stärksten
polarisierten TH-Zell-Subpopulationen darstellen, stellen andere
TH-Zell-Subpopulationen wie THO-Zellen (Firestein, G. S. et al.,
1989, J. Imm. 143: 518) TH-Zellen
dar, welche Eigenschaften der TH1- und TH2-Zell-Subpopulationen aufweisen.
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TH1-ähnliche
und TH2-ähnliche
Zellen scheinen als Teil der unterschiedlichen Effektorfunktionen
des Immunsystems zu funktionieren (Mosmann, T. R. und Coffmann,
R. L., 1989, Ann. Rev. Imm. 7: 145). Insbesondere steuern TH1-ähnliche
Zellen die Entwicklung der zellvermittelten Immunität, lösen die
Phagozyten-vermittelte Wirtsverteidigung aus und sind mit einer
verzögerten
Hypersensitivität
verbunden. Demzufolge neigen Infektionen mit intrazellulären Mikroorganismen
dazu, eine TH1-Typ-Antwort zu induzieren. TH2-Zellen steuern humorale
Immunantworten, welche, zum Beispiel, mit der Verteidigung gegen
helminthische Parasiten verbunden sind, und sind bei Antiköper- und
allergischen Antworten beteiligt.
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Es
wurde festgestellt, dass die Fähigkeit
der verschiedenen TH-Zelltypen, unterschiedliche Immuneffektorantworten
zu steuern, in den ausschließlichen
Kombinationen von Zytokinen begründet
liegt, die innerhalb einer bestimmten TH-Zell-Subpopulation exprimiert werden. Zum
Beispiel ist von TH1-Zellen bekannt, dass sie Interleukin-2 (IL-2),
Interferon-γ (IFN-γ) und Lymphotoxin
sezernieren, während
TH2-Zellen Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5) und Interleukin-10
(IL-10) sezernieren.
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Man
glaubt, dass TH1- und TH2-Subpopulationen aus dem gleichen naiven
Vorläufermolekül entstehen
(bezeichnet als THP). Zum Beispiel können naive CD4+-Zellen
aus Mäusen,
welche einen einzelnen transgenen T-Zell-Rezeptor exprimieren, induziert werden,
um sich entweder in den TH1- oder den TH2-Zelltyp zu entwickeln.
Die Bedingungen der Antigenstimulierung, einschließlich der
Art und Menge an beteiligtem Antigen, die Art der antigenpräsentierenden
Zellen und die Art der anwesenden Hormon- und Zytokinmoleküle scheinen
alle Determinanten des Musters von TH1- versus TH2-Differenzierung
darzustellen, wobei, vielleicht, die anwesenden Zytokine die entscheidende
Rolle übernehmen.
Bei einer derartigen komplexen Reihe von möglichen Determinanten ist eine
vollständige
Erklärung
der genauen Faktoren, die für
die Steuerung der TH1- oder
TH2-Differenzierung wichtig sind, bisher weitestgehend unbekannt.
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Weiterhin
wurde kürzlich
festgestellt, dass zusätzlich
zu CD4+-TH-Zellen, CD8+-ZTLs
unter bestimmten Bedingungen auch TH-1-ähnliche oder TH2-ähnliche
Zytokinprofile aufweisen können
(Seder, R. A. et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 5–7; Manetti, R. et al., 1994,
J. Exp. Med. 180: 2407–2411;
Maggi, E. et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 489–495). Während die genaue funktionelle
Rolle derartiger CD8+-TH-ähnlichen
Zellen derzeit noch unbekannt ist, scheinen diese Zell-Subpopulationen
eine größere Relevanz
für Immunantworten
gegenüber
infektiösen
Erregern wie Viren und intrazelluläre Parasiten zu haben.
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Sind
die TH1- und TH2-Subpopulationen einmal expandiert, neigen die Zelltypen
dazu, sich gegenseitig durch die Wirkung der Zytokine, die ihnen
jeweils zu Eigen sind, negativ zu regulieren. Zum Beispiel reguliert
TH1-produziertes IFN-γ negativ
TH2-Zellen, während
TH2-produziertes IL-10 TH1-Zellen negativ reguliert. Darüber hinaus
sind von TH1 und TH2 produzierte Zytokine Antagonisten der Effektorfunktion
für einander (Mosmann,
T. R. und Moore, 1991, Immunol. Today 12: 49).
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Das
Versagen der Kontrolle oder der Lösung eines infektiösen Prozesses
resultiert oftmals eher aus einer ungeeigneten, als aus einer unzureichenden
Immunantwort und dies kann einer Vielzahl von unterschiedlichen
immunologischen Störungen
zu Grunde liegen. Derartige Störungen
können,
zum Beispiel, atopische Zustände
umfassen (das sind IgE-vermittelte allergische Zustände) wie
Asthma, Allergie, einschließlich Rhinitis
allergica, Dermatitis, einschließlich Psoriasis, pathogene
Reizbarkeiten, chronische Entzündungskrankheiten,
organspezifische Autoimmunität, Transplantatabstoßungen und „graft-versus-host"-Reaktionen. Zum Beispiel resultieren
nichtheilende Formen von humaner und muriner Leishmaniasis aus starken
aber kontraproduktiven TH2-ähnlich
dominierten Immunantworten. Lepromatöse Lepra scheint sich auch
durch eine prävalente,
aber ungeeignete, TH2-ähnliche
Antwort auszuzeichnen.
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Möglicherweise
kann ein anderes Beispiel die HIV-Infektion sein. Hier wurde vorgeschlagen,
dass ein Absinken des Verhältnisses
von TH1-ähnlichen
Zellen zu anderen TH-Zell-Subpopulationen eine kritische Rolle beim
Fortschreiten zu Krankheitssymptomen spielen kann. Weiterhin wurde
festgestellt, dass zumindest in vitro, TH2-ähnliche Klone effizientere
Unterstützer
der HIV-viralen
Replikation zu sein scheinen als TH1-ähnliche Klone.
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Weiterhin
sind, während
TH1-vermittelte Entzündungsantworten
auf viele pathogene Mikroorganismen vorteilhaft sind, derartige
Antworten auf Selbstantigene gewöhnlich
schädlich.
Es wurde vorgeschlagen, dass die bevorzugte Aktivierung von TH1-ähnlichen Antworten im Mittelpunkt
der Pathogenese derartiger humaner entzündlicher Immunerkrankungen
wie Multipler Sklerose und insulinabhängiger Diabetes steht. Zum Beispiel
herrschen TH1-Typ-Zytokine in der zerebrospinalen Flüssigkeit
von Patienten mit Multipler Sklerose, in Bauchspeicheldrüsen von
Patienten mit insulinabhängiger
Diabetes, den Schilddrüsen
bei Hashimoto-Thyreoiditis, dem Darm bei Patienten mit Morbus Crohn
vor, was darauf hindeutet, dass derartige Patienten eine TH1-ähnliche
und keine TH2-ähnliche
Antwort auf das/die bei der Äthiopathogenese
derartiger Störungen
beteiligte(n) Antigen(e) in Gang setzen.
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Ein
primäres
Ziel sowohl aus diagnostischen wie auch therapeutischen Gründen wäre daher
die Fähigkeit,
Elemente einer bestimmten TH-Zell-Subpopulation zu identifizieren,
zu isolieren und/oder sie anzusteuern. Die Fähigkeit solche Gene zu identifizieren,
welche innerhalb und/oder unter einer solchen TH-Zell- Subpopulation differenziell
exprimiert werden, wird benötigt,
um ein derartiges Ziel zu erreichen. Bisher waren Untersuchungen
auf die Expression einer begrenzten Anzahl an spezifisch bekannten
Zytokinen und Zytokinrezeptoren in der TH-Zellpopulation gerichtet.
Zytokine üben
jedoch Wirkungen zusätzlich
zu spezifischen TH-Zell-Subpopulationen auf Zelltypen auf, das heißt, sie
zeigen eine Vielzahl von pleiotropen Wirkungen. Daher wäre es von
Vorteil, verlässliche
Marker (z.B. Gensequenzen) von TH-Zell-Subpopulationen zu identifizieren,
deren Wirkungen spezifisch für
TH-Zell-Subpopulationen
sind, z.B. welche, anders als sezernierte Zytokine, spezifisch für TH-Zellensubpopulationen
sind.
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Lederer
et al. (J. Immunol. 1994, vol. 152, 77–86) haben die Expression von
Promoter-CAT-Konstrukten gemessen, um zu zeigen, dass die differentielle
Expression von IL-2 und IL-4 in TH1- und TH2-Zellen transkriptorisch
kontrolliert ist und verbanden den Mangel an IL-2-Transkription
in aktivierten TH2-Zellen mit einem Versagen, IL-2-Genpromoter-bindende
Proteine zu erzeugen, insbesondere NF-kappa-B im Zellkern. Ramsdell
et al. (Int. Immunol. 1994, vol. 6, 1545–1553) haben gezeigt, dass
geklonte TH1-Zellen hohe Spiegel an Fas-L exprimieren, dem Liganden
für Fas
(CD95), während
geklonte TH1-Zellen geringe Spiegel exprimieren. Diese Expressionsspiegel
sind mit einer relativen Fähigkeit
der TH1- und TH2-Zelltypen korreliert, einen aktivierungsinduzierten
Zelltod zu erleiden, der nicht mit der Gegenwart von verschiedenen
Zytokinen einherzugehen scheint.
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3. Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung
von Immunstörungen,
insbesondere von mit T-Helfer-(TH)-Zellen und TH-ähnlichen Zellen verbundenen
Störungen.
Zunächst
werden Gene identifiziert und beschrieben, welche innerhalb und
unter TH-Zellen und TH-Zell-Subpopulationen
differenziell exprimiert werden. Als nächstes werden Gene identifiziert
und beschrieben, welche innerhalb von TH-Zell-Subpopulationen bei
mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen differenziell exprimiert
werden. Die Veränderung
der Expression der identifizierten Gene und/oder der Aktivität der identifizierten
Genprodukte kann therapeutisch genutzt werden, um die Symptome von
Immunstörungen
zu verbessern und die Reaktionsfähigkeit
der TH-Zellen, zum Beispiel die Reaktionsfähigkeit auf Antigene, zu verändern. Weiterhin
können
die identifizierten Gene und/oder Genprodukte verwendet werden,
um Individuen, die derartige Immunstörungen zeigen oder dafür prädisponiert
sind, zu diagnostizieren. Und weiterhin können die identifizierten Gene
und/oder Genprodukte verwendet werden, um die Reaktionsfähigkeit
der TH-Zellen, zum Beispiel, die Reaktionsfähigkeit auf Antigene, zu detektieren.
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„Differenzielle
Expression", wie
hier verwendet, bezeichnet sowohl die quantitativen wie auch die
qualitativen Unterschiede bei den temporalen und/oder zellulären Expressionsmustern
der Gene innerhalb und unter der TH-Zell-Subpopulation. Differenziell
exprimierte Gene können „Fingerprintgene" und/oder „Zielgene" darstellen.
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„Fingerprintgen", wie hier verwendet,
bezeichnet ein differenziell exprimiertes Gen, dessen Expressionsmuster
als Teil einer prognostischen oder diagnostischen Untersuchung von
Immunstörungen,
z.B. mit TH-Zellen verbundene Störungen,
genutzt werden kann oder das, alternativ, in Verfahren zur Identifizierung von
Verbindungen verwendet wird, die für die Behandlung von derartigen
Störungen
nützlich
sind. Zum Beispiel kann die Wirkung einer Verbindung auf die Fingerprintgenexpression,
die normalerweise zusammen mit der Störung auftritt, verwendet werden,
um die Effizienz der Verbindung als Behandlung für eine derartige Störung zu
untersuchen, oder kann, zusätzlich,
verwendet werden, um Patienten zu überwachen, die sich einer klinischen
Untersuchung für
die Behandlung derartiger Störungen
unterziehen.
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„Fingerprintmuster", wie hier verwendet,
bezeichnet das Muster, dass erzeugt wird, wenn das Expressionsmuster
einer Reihe (welche zwischen zwei und bis zu allen Fingerprintgenen
reichen kann, die für
einen gegebenen Zustand existieren) von Fingerprintgenen bestimmt
wird. Ein Fingerprintmuster kann bei den gleichen diagnostischen,
prognostischen und verbindungsidentifizierenden Verfahren als Expression
eines einzelnen Fingerprintgens verwendet werden.
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„Zielgen", wie hier verwendet,
bezeichnet ein differenziell exprimiertes Gen, das an Immunstörungen beteiligt
ist, z.B. an mit TH-Zellen verbundenen Störungen, so dass die Veränderung
des Spiegels an Zielgenexpression oder der Wirkung eines Zielgenprodukts
so wirken kann, dass die Immunstörung
verbessert wird. Verbindungen, welche die Zielgenexpression oder
Aktivität
des Zielgenprodukts verändern,
können
bei der Behandlung von Immunstörungen
verwendet werden.
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Weiterhin
sind „Pathwaygene" über ihre Fähigkeit ihrer Genprodukte definiert,
mit Genprodukten zu wechselwirken, die an TH-Zell-Subpopulation
verbundenen Immunstörungen
beteiligt sind, und/oder mit Genprodukten zu wechselwirken, die
an der Differenzierung und der Effektorfunktion der TH-Zell-Subpopulation beteiligt
sind. Pathwaygene können
auch Zielgen- und/oder Fingerprintgen-Eigenschaften aufweisen.
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Obwohl
die hier beschriebenen Ziel-, Fingerprint- und/oder Pathwaygene innerhalb und
unter TH-Zell-Subpopulationen
differenziell exprimiert werden und/oder mit TH-Zell-Subpopulationsgenprodukten wechselwirken
können,
können
die Gene auch an Mechanismen beteiligt sein, die für weitere
Immunprozesse wichtig sind.
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Die
Erfindung schließt
die folgenden Nucleotide, derartige Nucleotide exprimierende Wirtszellen
und die Expressionsprodukte derartiger Nucleotide mit ein: (a) Nucleotide,
die ein bei Säugetieren
differenziell exprimiertes 200-Genprodukt, einschließlich eines
humanen und murinen 200-Genprodukts kodieren; (b) Nucleotide, die
Teile von differenziell exprimierten und/oder Pathway-200-Genprodukten
kodieren, die dessen Funktionsdomäne entsprechen, und die Polypeptidprodukte,
die von derartigen Nucleotidsequenzen kodiert werden, und in welchen,
im Falle von Rezeptortyp-Genprodukten, derartige Domänen extrazelluläre Domänen (ECD),
transmembrane Domänen
(TM) und zytoplasmatische Domänen
(CD) umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind; (c) Nucleotide, die
Mutanten eines differenziell exprimierten 200-Genprodukt kodieren, in welchem alle
oder Teile von einer seiner Domänen
entfernt oder verändert
wurden, und welche, im Falle von Rezeptortyp-Genprodukten solche
Mutanten mit löslichen
Rezeptoren umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, in welchen alle oder
ein Teil der TM entfernt wurden, und nichtfunktionelle Rezeptoren,
in welchen alle oder Teile der CD entfernt wurden; und (d) Nucleotide,
die Fusionsprotein kodieren, die ein differenziell exprimiertes
200-Genprodukt enthalten
oder bei dem eine seiner Domänen
mit einem anderen Polypeptid verschmolzen ist.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Produkte derartiger Fingerprint-,
Ziel- und Pathwaygene wie auch die Antikörper derartiger Genprodukte.
Weiterhin werden auch die Veränderung
und Verwendung von Zell- und tierbasierten Modellen von mit TH-Zell-Subpopulation
verbundenen Störungen,
zu denen derartige Genprodukte beitragen können, beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur prognostischen
und diagnostischen Untersuchung von verschiedenen mit einer TH-Zell-Subpopulation
verbundenen Störungen
und für
die Identifizierung von Patienten, die für solche Störungen prädisponiert sind.
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Weiterhin
stellt die Erfindung Verfahren zur Untersuchung der Effizienz von
Wirkstoffen für
Immunstörungen
und die Überwachung
des Fortschritts bei Patienten, die an klinischen Studien über die
Behandlung derartiger Störungen
beteiligt sind, bereit.
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Die
hier beschriebenen mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen können, zum
Beispiel, mit TH1- oder
TH1-ähnlich
verbundene Störungen
umfassen oder können,
alternativ, mit TH2- oder TH2-ähnlich
verbundene Störungen
umfassen. Beispiele für
mit TH1- oder TH1-ähnlich verbundene
Störungen
umfassen chronische Entzündungskrankheiten
und Störungen
wie Morbus Crohn, reaktive Arthritis einschließlich Lyme-Borreliose, insulin-abhängige Diabetes,
organspezifische Autoimmunität
einschließlich
Multipler Sklerose, Hashimoto-Thyreoiditis und Morbus Basedow, Kontaktdermatitis,
Psoriasis, Transplantatabstoßung, „Graft-versus-host"-Reaktionen und Sarkoidose.
Beispiele für
mit TH2- oder TH2-ähnlich
verbundene Störungen
umfassen atopische Zustände
wie Asthma und Allergie, einschließlich Rhinitis allergica, gastrointestinale Allergien,
einschließlich
Lebensmittelallergien, Eosinophilie, Konjunktivitis, Glomerulonephritis,
bestimmten pathogenen Empfindlichkeiten wie helminthischen (z.B.
Leishmaniasis) und bestimmten viralen Infektionen, einschließlich HIV,
und bakteriellen Infektionen, einschließlich Tuberkulose und lepromatöser Lepra.
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Weiterhin
werden Betrachtungen darüber
angestellt, dass hier beschriebene Verfahren und Zusammensetzungen
bei der prognostischen und diagnostischen Untersuchung von Störungen genutzt
werden können,
die andere Immunzellen, einschließlich CD8+-ZTLs,
beteiligen, die ein TH-ähnliches
Zell-Subpopulationsgenexpressionsmuster
und/oder -aktivität
aufweisen. Und weiterhin werden Betrachtungen darüber angestellt, dass
hier beschriebene Verfahren und Zusammensetzungen zur Verbesserung
von Symptomen genutzt werden können,
die aus Störungen
stammen, an denen derartige Immunzellen, einschließlich solche
wie CD8+-ZTLs, beteiligt sind, die ein TH-ähnliches
Zell-Subpopulationsgenexpressionsmuster
und/oder -aktivität aufweisen.
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Die
Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen
bereit, welche die Expression von Genen oder die Aktivität von Genprodukten
anpassen, die an mit TH-Zell-Subpopulationen
verbundenen Störungen
und Prozessen beteiligt sind, die bei der Differenzierung, Aufrechterhaltung
und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen relevant sind. Und
weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung
von mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen bereit, welche, zum
Beispiel, die Verwaltung von solchen angepassten Verbindungen bei
Individuen beteiligen können,
die Symptome oder Neigungen zu mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen aufweisen.
Zusätzlich
kann die Behandlung zur Stimulierung oder Entleerung von einer oder
mehreren der TH-Zell-Subpopulationen
führen.
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„Stimulierung", wie hier verwendet,
kann eine effiziente Zunahme der Anzahl von Zellen bezeichnen, die
zu einer TH-Zell-Subpopulation gehören, über, zum Beispiel, die Proliferation
von derartigen TH-Zell-Subpopulationszellen.
Der Begriff kann auch eine Zunahme der Aktivität von zu einer TH-Zell-Subpopulation gehörenden Zellen
bezeichnen, wie zum Beispiel durch eine Pro-Zelle-Zunahme bei der
Expression des für
die TH-Zell-Subpopulation spezifischen Zytokinmusters nachgewiesen
würde.
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„Entleerung", wie hier verwendet,
kann eine effiziente Verminderung der Anzahl von Zellen bezeichnen,
die zu einer TH-Zell-Subpopulation gehören, über, zum Beispiel, eine Verminderung
der Proliferation von derartigen TH-Zell-Subpopulationszellen. Der
Begriff kann auch eine Abnahme der Aktivität von zu einer TH-Zell-Subpopulation
gehörenden
Zellen bezeichnen, wie zum Beispiel durch eine Pro-Zelle-Abnahme
bei der Expression des für
die TH-Zell-Subpopulation spezifischen Zytokinmusters nachgewiesen
würde.
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Die
Erfindung basiert, zum Teil auf systematischen Suchstrategien, die
Musterbeispiele beteiligen, die TH0, TH1, TH2, TH1-ähnliche
und TH2-ähnliche
Zellen nutzen, in Systemen, welche die Aktivität des Immunsystems oder Immunstörungen nachahmen,
gekoppelt mit sensitiven und Hochdurchsatz-Genexpressionsassays,
um Gene zu identifizieren, die innerhalb und/oder unter TH-Zell-Subpopulationen
differenziell exprimiert wurden. Im Gegensatz zu Ansätzen, bei
denen nur die Expression eines einzigen bekannten Genprodukts untersucht
wird, von dem man annimmt, dass es bei einigen mit Immunzellen verbundenen
Prozessen oder Störungen
eine Rolle spielt, ermöglichen
die hier verwendeten Suchstrategien und Assays die Identifizierung
aller Gene, egal ob bekannt oder neu, welche innerhalb und unter
TH-Zell-Subpopulationen differenziell exprimiert werden, und dabei
auch die Charakterisierung ihrer temporären Regulierung und Funktion
bei der TH-Zellantwort und/oder bei TH-Zell-vermittelten Störungen möglich macht. Dieser umfassende
Ansatz und die Untersuchung ermöglichen
die Entdeckung neuer Gene und Genprodukte, wie auch die Identifizierung
eine Konstellation von Genen und Genprodukten (egal ob neu oder
bekannt), die in neuen Stoffwechselwegen (z.B. Anpassungsstoffwechselwege)
beteiligt sind, die eine wesentliche Rolle bei TH-Zell-vermittelten Immunantworten und
mit TH-Zell-Subpopulation
verbundenen Störungen
spielen. So ermöglicht
die vorliegende Erfindung die Identifizierung und Charakterisierung
von Zielen, die für
Prognose, Diagnose, Überwachung,
rationales Wirkstoffdesign und/oder einer therapeutischen Intervention
von Immunsystemstörungen
nützlich
sind.
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Die
in den folgenden Abschnitten 6 bis 8 beschriebenen Beispiele zeigen
die erfolgreiche Verwendung von Suchstrategien dieser Erfindung
zur Identifizierung von Genen, welche unter und/oder innerhalb von TH-Zell- Subpopulationen differenziell
exprimiert werden. Abschnitt 9 beschreibt das erfolgreiche Klonen
von humanen Homologen von einem der identifizierten Gene (das 200-Gen).
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Es
wird nachgewiesen, dass das murine 200-Gen innerhalb der TH1-Zell-Subpopulation
differenziell exprimiert wird. Insbesondere wird dieses Gen in Spiegeln
exprimiert, die in TH1-Zell-Subpopulationen um ein vielfaches höher liegen
als in TH2-Zell-Subpopulationen.
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Eine
Ausführungsform „C1" der vorliegenden
Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend:
- (a) die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23;
- (b) eine Nucleotidsequenz, welche ein Polypeptid kodiert, umfassend
die Aminosäurensequenz,
die durch den cDNA-Einschub des Klons codiert wird, der in den Klonen
von E. coli enthalten ist, die unter der American Type Culture Collection
(ATCC) Accession Number 69967, der Agricultural Research Service
Culture Collection (NRRL) Accession Number B-21395, der NRRL Accession
Number B-21415, oder der NRRL Accession Number B-21457 hinterlegt
sind, wobei genannter cDNA-Einschub
unter stringenten Bedingungen „S" an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert,
das ein Komplement einer Nucleinsäure mit der Nucleotidsequenz
SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 ist, und wobei genannte stringente
Bedingungen „S" die Hybridisierung
an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4,
7% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und Waschen in 0,1 × SSC/0,1%
SDS bei 68°C
umfassen; oder
- (c) eine Nucleotidsequenz, welche ein Polypeptid kodiert, umfassend
die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24.
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Eine
weitere Ausführungsform „C2" der vorliegenden
Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz,
welche mindestens eine der folgenden Peptiddomänen kodiert, die in 17 (SEQ ID NO: 10) oder 24 (SEQ
ID NO: 24) abgebildet sind: (a) Signalsequenzdomäne, (b) extrazelluläre Domäne, (c)
gereifte extrazelluläre
Domäne,
(d) variable SET-Domäne
vom Ig-Typ, (e) transmembrane Domäne oder (f) zytoplasmatische
Domäne.
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Eine
weitere Ausführungsform „C5" der vorliegenden
Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, welches unter stringenten
Bedingungen „S" (beschrieben unter
Ausführungsform „C1" (b)) an das Nucleinsäuremolekül nach Ausführungsform „C1" (a) oder Ausführungsform „C1" (b) oder an sein
Komplement hybridisiert, wobei die Waschbedingungen gegebenenfalls
0,2 × SSC/0,1%
SDS bei 42°C
sein können.
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Eine
weitere Ausführungsform „C6" der vorliegenden
Erfindung ist eine isolierte Nucleotidsequenz, welche ein Polypeptid
kodiert, welchem mindestens eine der folgenden Peptiddomänen fehlt,
die in 17 (SEQ ID NO: 10) oder 24 (SEQ ID NO: 24) abgebildet sind: (a)
Signalsequenzdomäne,
(b) extrazelluläre Domäne, (c)
gereifte extrazelluläre
Domäne,
(d) variable SET-Domäne
vom Ig-Typ, (e) transmembrane Domäne oder (f) zytoplasmatische
Domäne,
wobei das Polypeptid durch eine Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder einem
Teil davon kodiert wird.
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Eine
weitere Ausführungsform „C9" der vorliegenden
Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz,
die ein Fusionsprotein kodiert, welches das Nucleinsäuremolekül aus einem
der Ausführungsformen „C1", „C2", „C5" oder „C6" und ein heterologes
Polypeptid umfasst.
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Eine
weitere Ausführungsform „C11" der vorliegenden
Erfindung ist ein Vektor, umfassend ein Nucleinsäuremolekül aus irgendeiner der Ausführungsformen „C1", „C2", „C5", „C6" oder „C9". Weitere Ausführungsformen „C13" und „C14" sind, jeweils, eine
Wirtszelle, umfassend den Vektor aus Ausführungsform „C11" oder eine genetisch veränderte Wirtszelle,
welche die Nucleinsäuresequenz
aus irgendeiner der Ausführungsformen „C1", „C2", „C5", „C6" oder „C9" enthält. Eine
Ausführungsform „C15" ist die Wirtszelle
aus Ausführungsform „C14" in operativer Einheit
mit einem Regulierungselement für
die Nucleotidsequenz, welche die Expression der Nucleotidsequenz
in der Wirtszelle kontrolliert.
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Eine
weitere Ausführungsform „C16" der vorliegenden
Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das
durch die Nucleinsäure
aus irgendeiner der Ausführungsformen „C1", „C2", „C5", „C6" oder „C9" kodiert wird, umfassend:
Kultivieren der Wirtszelle aus Ausführungsform „C13", „C14" oder „C15", so dass das Polypeptid
in der Zellkultur exprimiert wird, und Gewinnung des Polypeptids
aus der Zellkultur.
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Eine
weitere Ausführungsform „C17" der vorliegenden
Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid, umfassend: (a) die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24; (b) die Aminosäuresequenz,
die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO:
23 kodiert wird; oder (c) die Aminosäuresequenz, die durch den oben
unter Ausführungsform „C1" (b) beschriebenen
cDNA-Einschub kodiert wird.
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Eine
weitere Ausführungsform „C18" der vorliegenden
Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid, umfassend: (a) SEQ ID NO:
10 Aminosäurereste
1–20,
1–192,
1–214,
21–192,
21–214,
21–281,
193–214,
193–281 und/oder
215–281;
und/oder (b) SEQ ID NO: 24 Aminosäurereste 1–20, 1–200, 1–224, 21–200, 21–224, 21–301, 30–128, 201–224, 201–301, 225–301.
-
Eine
weitere Ausführungsform „C21" der vorliegenden
Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid, welches durch ein Nucleinsäuremolekül kodiert
wird, das unter stringenten Bedingungen „S" (beschrieben unter Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement
der Nucleotidsequenz hybridisiert, welches die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24 kodiert.
-
Eine
weitere Ausführungsform „C22" der vorliegenden
Erfindung ist ein Fusionsprotein, umfassend das Polypeptid aus irgendeiner
der Ausführungsformen „C17", „C18" oder „C21" und einem unverbundenen Polypeptid.
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Eine
weitere Ausführungsform „C24" der vorliegenden
Erfindung ist ein Antikörper
oder Epitop-bindendes Fragment davon, welches spezifisch an das
Polypeptid aus irgendeiner der Ausführungsformen „C17", „C18" oder „C21" bindet.
-
Eine
weitere Ausführungsform „C30" der vorliegenden
Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den
Antikörper
oder das Epitop-bindende Fragment davon nach Ausführungsform „C24" und
ein physiologisch zulässiger
Träger.
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Eine
weitere Ausführungsform „C31" der vorliegenden
Erfindung ist ein Antikörperfusionspolypeptid, umfassend
eine Antikörper-Fc-Domäne, die
verbunden ist mit (a) der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 24, oder der Aminosäuresequenz,
die durch den oben unter Ausführungsform „C1" (b) beschriebenen
cDNA-Einschub kodiert
wird, Aminosäurereste
1–20,
1–200,
1–224,
21–200,
21–224,
21–301, 30–128, 201–224, 201–301 und/oder
225–301
von SEQ ID NO: 24 kodiert werden, oder (c) den Aminosäureresten
1–20,
1–192,
1–214,
21–192,
21–214,
21–281,
193–214,
193–281
und/oder 215–281
von SEQ ID NO: 10.
-
Eine
weitere Ausführungsform „C32" der vorliegenden
Erfindung ist ein Antikörperfusionspolypeptid, umfassend
eine Antikörper-Fc-Domäne, die
mit einer Aminosäuresequenz
verbunden ist, welche durch ein Nucleinsäuremolekül kodiert wird, das unter stringenten
Bedingungen „S" (beschrieben unter
Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement
der Nucleotidsequenz bestehend aus SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO:
23 hybridisiert.
-
Eine
weitere Ausführungsform „C35" der vorliegenden
Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion einer 200-Genexpression in
einer Probe, umfassend: Detektion der Anwesenheit eines 200-Genprodukt
oder einem RNA-Molekül, welches
das 200-Genprodukt kodiert, wobei das 200-Genprodukt umfasst: (a)
die Aminosäuresequenz,
die unter Ausführungsform „C17"(a), „C17"(b) oder „C17"(c) beschrieben wird;
(b) die Aminosäurereste,
die unter „C18" (a) oder „C18"(b) beschrieben werden,
oder (c) eine Aminosäuresequenz,
die durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, welche unter stringenten
Bedingungen „S" (beschrieben unter
Ausführungsform „C1" (b)) an (i) das
Komplement der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder eines Teiles
davon, oder (ii) an das Komplement der Nucleotidsequenz von SEQ
ID NO: 23 oder eines Teiles davon hybridisiert.
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Eine
weitere Ausführungsform „C40" der vorliegenden
Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose einer mit einer TH-Zell-Subpopulation
verbundenen Störung,
umfassend die Detektion in einer Probe aus einem Patienten, bei
dem eine derartige Störung
vermutet wird, des Spiegels an 200-Genprodukt oder an RNA-Molekülen, welche
das 200-Genprodukt kodieren, so dass, wenn der detektierte Spiegel
sich von dem der Kontrollprobe unterscheidet, eine mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundene
Störung
diagnostiziert wird, wobei das 200-Genprodukt ist:
- (a) die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 24;
- (b) die Aminosäuresequenz,
die durch die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 23 kodiert wird;
- (c) die Aminosäuresequenz,
die durch den oben unter Ausführungsform „C1"(b) beschriebenen
cDNA-Einschub kodiert wird;
- (d) Aminosäurereste
1–20,
1–200,
30–128,
201–224
oder 225–301
von SEQ ID NO: 24; oder
- (e) eine Aminosäuresequenz,
die durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, welche unter stringenten
Bedingungen „S" (beschrieben unter
Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement
der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 23 hybridisiert.
-
Eine
weitere Ausführungsform „C46" der vorliegenden
Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung einer Testverbindung,
die an ein 200-Genprodukt bindet und/oder die Aktivität des 200-Genprodukts
anpasst, umfassend:
- (a) In-Kontakt-Bringen
einer Testverbindung mit einem 200-Genprodukt für eine Zeit, die ausreicht,
an das Produkt gebunden zu werden und einen 200- Genprodukt/Verbindungs-Komplex zu bilden;
- (b) Entfernen ungebundener Testverbindung; und
- (c) Detektion des Komplexes, in welchem das 200-Genprodukt umfasst:
- (i) die Aminosäuresequenz,
die oben unter Ausführungsform „C17"(a) „C17"(b) oder „C17"(c) beschrieben wird;
- (ii) die Aminosäuresequenz,
die durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, welche unter stringenten
Bedingungen „S" (beschrieben oben
unter Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement
der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 23 hybridisiert;
oder
- (iii) die Aminosäuresequenz,
die durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, welche unter stringenten
Bedingungen „S" (beschrieben oben
unter Ausführungsform „C1" (b)) an das Komplement
des oben unter Ausführungsform „C1"(b) beschriebenen
cDNA-Einschubs hybridisiert, so dass, wenn ein(e) 200-Genprodukt/Verbindung
in (c) detektiert wird, eine an das 200-Genprodukt bindende Testverbindung
identifiziert wird.
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Die
Identifizierung von spezifischen Markern für die TH-Zell-Subpopulation
kann bei der Behandlung einer Anzahl an Immunstörungen genutzt werden, insbesondere
bei mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen. Zum Beispiel, können Marker
für die
TH2-Subpopulation verwendet werden, um Zustände zu verbessern, die an einer
ungeeigneten IgE-Immunantwort beteiligt sind, einschließlich, aber
nicht begrenzt auf, Symptome, die atopische Zustände wie Allergie und/oder Asthma
begleiten. IgE-Typ-Antikörper
werden durch stimulierte B-Zellen produziert, welche, zumindest
teilweise, von der TH2-Zell-Subpopulation produziertes IL-4 benötigen. Daher
wird eine Behandlung, welche die effektive Konzentration an sezerniertem
IL-4, z.B. durch Verminderung der Aktivität oder der Anzahl an TH2-Zellen vermindert,
eine Verminderung des Spiegels von zirkulierendem IgE herbeiführen, was
dann wieder zu einer Verbesserung oder Beseitigung der atopischen Zustände führt. Jegliche
der hier beschriebenen TH2-spezifischen
Genprodukte kann daher als Ziel verwendet werden, um die Anzahl
und/oder die Aktivität
von TH2-Zell-Subpopulationszellen
für die
Behandlung derartiger Zustände
zu vermindern oder zu beseitigen.
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Die
Identifizierung von spezifischen Markern für die TH-Zell-Subpopulation
kann zusätzlich
bei der Behandlung von mit der TH1-Zell-Subpopulation verbundenen
Störungen
genutzt werden. Zum Beispiel, können Marker
für die
TH1-Zell-Subpopulation verwendet werden, um Zustände zu verbessern, die an einer
ungeeigneten zellvermittelten Immunantwort beteiligt sind, einschließlich, aber
nicht begrenzt auf, chronische entzündliche und Autoimmunstörungen.
Weiterhin können
transgene Tiere, die derartige Gensequenzen überexprimieren oder fehlexprimieren,
und/oder transgene „Knockout"-Tiere, welche nur
eine geringe oder gar keine Expression einer derartigen Sequenz
aufweisen, als Tiermodelle für
mit TH-Zell-Subpopulationen
verbundenen Störungen
verwendet werden. Das weiter unten in Abschnitt 11 präsentierte
Beispiel, beschreibt die Herstellung von 200-Gen-transgenen Tieren.
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TH1-Zell-Subpopulations
spezifische Gensequenzen und/oder Genprodukte wie das 200-Gen (dessen
murines Homolog ein transmembranes Genprodukt mit 280 Aminosäuren kodiert,
dessen humanes Homolog ein transmembranes Genprodukt mit 301 Aminosäuren kodiert,
und von denen beide Mitglieder der Ig-Superfamilie sind) kann daher
für eine
Verbesserung derartiger mit TH1-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen geeignet
sein. Das 200-Genprodukt kann insbesondere für einen solchen Zweck geeignet
sein, bei dem es nicht nur auf die TH1-Zell-Subpopulation beschränkt ist,
sondern das Ig-Superfamilien-200-Genprodukt ist außerdem membrangebunden.
Daher können
natürliche
Liganden, Derivate von natürlichen
Liganden und Antikörper,
welche an das 200-Genprodukt binden, genutzt werden, um die Anzahl
von anwesenden TH1-Zellen zu vermindern, entweder durch physikalische
Trennung derartiger Zellen von anderen Zellen in einer Population,
oder, alternativ, durch Lenken der spezifischen Zerstörung von
TH1-Zellen oder Inhibierung der Proliferation derartiger TH1-Zellen.
Zusätzlich
können
Verbindungen wie 200-Gensequenzen oder Genprodukte wie lösliche 200-Genprodukte genutzt
werden, um den Spiegel an TH2-Zellaktivität zu vermindern
und so eine Verbesserung der mit TH1-Zell-Subpopulationen verbundenen
Störungen
herbeizuführen.
Zum Beispiel können
die Verbindungen mit dem endogenen (d.h. dem natürlichen) Liganden für das 200-Genprodukt kompetitieren.
Die resultierende Verminderung der Menge an Liganden gebundenem
200-Gen-Transmembranprotein
wird die TH2-Zellaktivität
anpassen. Lösliche
Proteine oder Peptide des 200-Genprodukts,
wie die extrazelluläre
Domäne
umfassende Peptide, oder Teile (wie, zum Beispiel, der Ig-Teil)
und/oder Analoga davon, einschließlich, zum Beispiel von Fusionsproteinen
wie Fusionsproteine mit einem Ig-Schwanz,
können insbesondere
für diesen
Zweck von Nutzen sein. Das weiter unten in Abschnitt 10 präsentierte
Beispiel beschreibt die Konstruktion und Expression von 200-Genprodukt-Ig-Fusionskonstrukten
und -proteinen.
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3.1 Definitionen
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Der
Begriff „TH-Zell-Subpopulation", wie hier verwendet,
bezeichnet eine Population von TH-Zellen, welche ein Genexpressionsmuster
(z.B. ein einzelnes Muster von Zytokinen und/oder Rezeptoren oder
anderen Zelloberflächenmolekülen) und
Aktivität,
die sich von dem Expressionsmuster unterscheidet, und eine Aktivität von anderen
TH-Zellen aufweisen. Derartige TH-Zell-Subpopulationen können TH0-, TH1- und TH2-Subpopulationen umfassen,
sind aber nicht darauf beschränkt,
und diese werden, zur Verdeutlichung und als Beispiel, und nicht
zur Einschränkung,
hier häufig
als repräsentative
TH-Zell-Subpopulationen verwendet werden.
-
Der
Begriff „TH-ähnliche
Zell-Subpopulation",
(z.B. „TH1-ähnlich" oder „TH2-ähnlich"), wie hier verwendet,
soll nicht nur eine Population von CD4+-TH-Zellen
mit den oben beschriebenen Eigenschaften für eine TH-Zell-Subpopulation bezeichnen,
sondern auch CD4+-Zellen, einschließlich CD8+-ZTLs, bezeichnen, welche ein TH-ähnliches Zytokinexpressionsmuster
aufweisen.
-
„Differenzielle
Expression", wie
hier verwendet, bezeichnet sowohl die quantitativen wie auch die
qualitativen Unterschiede bei den temporalen und/oder zellulären Expressionsmustern
der Gene.
-
„Zielgen", wie hier verwendet,
bezeichnet ein differenziell exprimierte Gen, das an Immunstörungen und/oder
an der Differenzierung, Aufrechterhaltung und/oder Effektorfunktion
von TH-Zell-Subpopulationen beteiligt ist, so dass die Veränderung
des Spiegels an Zielgenexpression oder an Gegenwart und/oder Aktivität eines
Zielgenprodukts, zum Beispiel, so wirken kann, dass eine spezifische
Entleerung oder Unterdrückung, oder,
alternativ, die Stimulierung und Erhöhung von einer oder mehrerer
TH-Zell-Subpopulationen resultiert, was dann wieder zu einer Verbesserung
der Symptome der Immunstörungen,
z.B. mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen, führt. Ein Zielgen kann auch
Fingerprint- und/oder Pathwaygeneigenschaften aufweisen.
-
„Fingerprintgen", wie hier verwendet,
bezeichnet ein differenziell exprimiertes Gen, dessen mRNA-Expressionsmuster,
Proteinspiegel und/oder Aktivität
als Teil einer prognostischen oder diagnostischen Untersuchung von
Immunstörungen,
z.B. mit TH-Zellen verbundene Störungen
genutzt werden kann, oder das, alternativ, in Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen verwendet werden kann, die für die Behandlung von derartigen
Störungen
nützlich
sind, z.B. durch Untersuchung der Wirkung der Verbindung auf die
Fingerprintgenexpression, die normalerweise in Verbindung mit der
Störung
gezeigt wird. Ein Fingerprintgen kann auch Zielgen- und/oder Pathwaygeneigenschaften
aufweisen.
-
„Fingerprintmuster", wie hier verwendet,
bezeichnet das Muster, dass erzeugt wird, wenn das mRNA-Expressionsmuster,
der Proteinspiegel und/oder die Aktivität einer Reihe (welche zwischen
zwei bis zu allen Fingerprintgenen reichen kann, die für einen
gegebenen Zustand existieren) von Fingerprintgenen bestimmt wird.
Ein Fingerprintmuster kann ein Teil der gleichen, weiter oben für die Expression
eines einzelnen Fingerprintgens beschriebenen Verfahren sein. „Pathwaygen", wie hier verwendet,
bezeichnet ein Gen, dessen Produkt eine Fähigkeit aufweist, mit Genprodukten
zu wechselwirken, die an Immunstörungen,
z.B. an mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen,
beteiligt sind, und/oder mit Genprodukten zu wechselwirken, die
an der Differenzierung und der Effektorfunktion von TH-Zell-Subpopulationen
beteiligt sind. Pathwaygene können
auch Zielgen- und/oder Fingerprintgeneigenschaften aufweisen.
-
"Negative Anpassung", wie hier verwendet,
bezeichnet eine Verminderung des Spiegels und/oder der Aktivität von Zielgenprodukt
in Bezug auf den Spiegel und/oder die Aktivität des Zielgenprodukts in Abwesenheit
einer anpassenden Behandlung. Alternativ bezeichnet der Begriff,
wie hier verwendet, eine Verminderung der Anzahl und/oder Aktivität von Zellen,
die zu der TH-Zell-Subpopulation
gehören,
in Bezug auf die Anzahl und/oder Aktivität der TH-Zell-Subpopulation
in Abwesenheit der anpassenden Behandlung.
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"Positive Anpassung", wie hier verwendet,
bezeichnet eine Steigerung des Spiegels und/oder der Aktivität von Zielgenprodukt
in Bezug auf den Spiegel und/oder die Aktivität des Zielgenprodukts in Abwesenheit einer
anpassenden Behandlung. Alternativ bezeichnet der Begriff, wie hier
verwendet, eine Steigerung der Anzahl und/oder Aktivität von Zellen,
die zu der TH-Zell-Subpopulation
gehören,
in Bezug auf die Anzahl und/oder Aktivität der TH-Zell-Subpopulation
in Abwesenheit der anpassenden Behandlung.
-
4. Beschreibung
der Abbildungen
-
1.
Differential-Display-Analyse von RNA aus murinen TH-Zell-Subsets.
Milz-T-Zellen, die aus transgenen Mäusen mit T-Zellrezeptoren stammten,
wurden in vitro differenziert, um zu polarisierten Populationen
vom TH1- oder TH2-Subtyp zu werden. Spur 1: TH2-Population 24 Stunden
nach tertiärer
Stimulierung; Spur 2: TH1-Population 24 Stunde nach tertiärer Stimulierung;
Spur 3: TH2-Population 1 Woche nach sekundärer Stimulierung; Spur 4: TH1-Population
1 Woche nach sekundärer
Stimulierung; Spur 5: TA3-Zelllinie,
welche als eine Antigen-präsentierende
Zelle (APZ) für
die in vitro-Stimulierung verwendet wurde. (Diese Probe wurde als
eine Negativkontrolle verwendet.) Jedes Set von Spuren besteht aus
Duplikaten (a und b), in welchen cDNAs unabhängig von der gleichen RNA-Quelle
erzeugt wurden. Der Pfeil zeigt auf das differentiell exprimierte
Sequenzband 102. Alle Spuren sind Produkte einer Polymerasekettenreaktion
(PCR), in welcher T11GG als das 3'-Oligonucleotid verwendet
wurde und ein zufälliges
10mer Oligonucleotid (Oligo #4, OP-D kit, Operon, Inc.) als das
5'-Oligonucleotid
verwendet wurde.
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17A–17D. Nucleotide und Aminosäuresequenz
des murinen 200-Gens in voller Länge.
Untere Reihe: murine 200-Gennucleotidsequenz (SEQ ID NO: 8); obere
Reihe: murines 200-Genprodukt, das von der Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 10) stammt.
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18. Northern-Blot-Analyse von muriner
200-Genexpression
in repräsentativen
murinen TH-Zelllinien (TH2: CDC25, D10.G4, DAX; TH1: AE7.A, Dorris,
D1.1). Klone wurden entweder für
6 Stunden mit platten-gebundenem
Anti-CD3-Antikörper
stimuliert (+) oder nicht stimuliert (–). Die Positionen der RNA-Marker
in Kilobasen sind als Referenz abgebildet. Der Pfeil markiert die
Position der 200-Gen-mRNA.
-
24A–24D. Nucleotide und Aminosäuresequenz
des humanen 200-Gens in voller Länge.
Untere Reihe: humane 200-Gennucleotidsequenz (SEQ ID NO: 23); obere
Reihe: humanes 200-Genprodukt, das von der Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 24) stammt.
-
5. Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Es
werden Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung und Diagnose
von Immunstörungen,
insbesondere von mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, atopische Zustände
wie Asthma und Allergie, einschließlich Rhinitis allergica, Psoriasis,
den Wirkungen von pathogenen Infektionen, chronischen Entzündungskrankheiten,
organspezifischer Autoimmunität, Transplantatabstoßungen und „graft-versus-host"-Reaktionen beschrieben.
Die Erfindung basiert, zum Teil, auf der Untersuchung der Expression
und der Rolle aller Gene, die innerhalb und/oder unter TH-Zell-Subpopulationen
differentiell exprimiert werden in Musterbeispielen, die für TH-vermittelte
Immunantworten und/oder mit TH-Subpopulationen verbundene Störungen physiologisch
von Bedeutung sind. Dies ermöglicht
die Definition von Krankheitsstoffwechselwegen, die sowohl für Diagnose
als Therapie nützlich
sind.
-
Zunächst werden
in Abschnitt 5.4 Gene beschrieben, bezeichnet als „Zielgene" und/oder „Fingerprintgene", welche innerhalb
und unter TH-Zellen und TH-Zell-Subpopulationen
bei normalen und/oder Krankheitszuständen und/oder während der
Differenzierung in derartigen gereiften Subpopulationen differenziell
exprimiert werden. Zusätzlich
werden in Abschnitt 5.4 Gene beschrieben, bezeichnet als „Pathwaygene", deren Genprodukte
eine Fähigkeit
aufweist, mit Genprodukten zu Wechselwirken, die an mit TH-Zell-Subpopulationen
verbundenen Störungen
beteiligt sind, und/oder mit Genprodukten, die an der Differenzierung
und der Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt sind. Pathwaygene
können
zusätzlich
Fingerprint- und/oder Zielgeneigenschaften aufweisen. Verfahren
zur Identifizierung von derartigen Fingerprint-, Ziel- und Pathwaygenen
werden auch in den Abschnitten 5.1 und 5.2 beschrieben.
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Weiterhin
werden in Abschnitt 5.5 die Genprodukte derartiger Fingerprint-,
Ziel- und Pathwaygene beschrieben, in Abschnitt 5.6 werden Antikörper für derartige
Genprodukte beschrieben, und in Abschnitt 5.7. werden zell- und
tierbasierte Modelle für
die TH-Zell-Subpopulationsdifferenzierung
und mit TH-Zell-Subpopulationen
verbundene Störungen,
zu welchen derartige Genprodukte betragen können, beschrieben.
-
In
Abschnitt 5.11 werden Verfahren zur prognostischen und diagnostischen
Untersuchung von verschiedenen mit einer TH-Zell-Subpopulation verbundenen
Störungen,
für die
Identifizierung von Patienten, die eine Prädisposition für derartige
Störungen
aufweisen, und zur Überwachung
der Effizienz von in klinischen Studien verwendeten Verbindungen
beschrieben.
-
In
Abschnitt 5.8 werden Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen
beschrieben, welche die Expression von Genen oder die Aktivität von Genprodukten
verändern,
die an mit TH-Zell-Subpopulationen verbundenen Störungen und
an der Differenzierung, und Effektorfunktion der TH-Zell-Subpopulationen
beteiligt sind, und in Abschnitt 5.9 werden Verfahren zur Behandlung
der Immunstörungen
beschrieben.
-
5.1 Identifizierung von
differenziell exprimierten Genen
-
Hier
werden Verfahren zur Identifizierung von differenziell exprimierten
Genen beschrieben, die an Immunerkrankungen, z.B. mit der TH-Zellen-Subpopulation in
Verbindung stehenden Erkrankungen, beteiligt sind und/oder die an
der Differenzierung, dem Erhalt und der Effektorfunktion der Subpopulationen
beteiligt sind. Die differenzielle Expression derartiger Gene kann
sich auf zahlreichen Ebenen zeigen. Differenzielle Expression kann
beispielsweise in undifferenzierten TH-Zellen gegenüber differenzierten
oder differenzierenden TH-Zellen stattfinden (wenn auch nicht notwendigerweise
innerhalb einer TH-Zellen-Subpopulation gegenüber einer anderen), in naiven
TH-Zellen gegenüber
Gedächtnis-TH-Zellen,
innerhalb einer TH-Zellen-Subpopulation gegenüber einer anderen (z.B. TH1-
gegenüber
TH2-Subpopulationen), in reifen stimulierten Zellen gegenüber reifen
unstimulierten Zellen in einer gegebenen TH-Zellen-Subpopulation oder
in mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungszuständen gegenüber ihrer
Expression in normalen oder nicht mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden
Erkrankungszuständen.
Solche differenziell exprimierten Gene können Target- und/oder Fingerabdruck-Gene
wiedergeben.
-
Verfahren
zur Identifizierung derartiger differenziell exprimierten Gene sind
anschließend
in Abschnitt 5.1.1 beschrieben. Verfahren zur weiteren Charakterisierung
derartiger differenziell exprimierter Gene und ihrer Kategorisierung
als Target- und/oder Fingerabdruck-Gene werden anschließend in
Abschnitt 5.3 dargestellt.
-
"Differenzielle Expression" bezieht sich hier
auf sowohl quantitative als auch qualitative Unterschiede in den
temporären
und/oder Zelltyp-Expressionsmustern der Gene. Bei einem differenziell
exprimierter Gen kann seine Expression somit beispielsweise in normalen
gegenüber
mit TH-Zellen-Subpopulationen in Verbindung stehenden Erkrankungszuständen, in
einer TH-Zellen-Subpopulation
gegenüber
einer anderen (z.B. TH1 gegenüber
TH2), in antigen-stimulierten gegenüber unstimulierten Sets von
TH-Zellen oder in undifferenzierten gegenüber differenzierten oder differenzierenden
TH-Zellen aktiviert oder vollständig
inaktiviert sein. Ein dermaßen
qualitativ reguliertes Gen zeigt ein Expressionsmuster innerhalb
eines Zustands oder Zelltyps, das nach Standardtechniken in einem
derartigen Zustand oder Zelltyp detektierbar ist, jedoch nicht in
beiden detektierbar ist.
-
Alternativ
kann ein differenziell exprimiertes Gen ein Expressionsniveau zeigen,
das sich bei normalen gegenüber
mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungszuständen, bei
antigen-stimulierten
gegenüber
unstimulierten Sets von TH-Zellen,
in einer TH-Zellen-Subpopulation gegenüber einer anderen oder in undifferenzierten
gegenüber
differenzierten oder differenzierenden TH-Zellen unterscheidet,
d. h. quantitativ erhöht
oder erniedrigt ist. Weil Differenzierung ein mehrstufiges Ereignis
ist, können
Gene, die differenziell exprimiert sind, auch in jedem derartigen
intermediären
Differenzierungszustand identifiziert werden.
-
Der
Grad, bis zu dem sich die Expression unterscheidet, muss lediglich
ausreichend groß sein,
um sich durch Standard-Charakterisierungstechniken, wie beispielsweise
die nachfolgend beschriebene Differenzialanzeigetechnik, visualisieren
zu lassen. Andere derartige Standard-Charakterisierungstechniken,
nach denen Expressionsunterschiede visualisiert werden können, umfassen
quantitative RT (reverse Transkriptase)-PCR und Northern-Analysen
und RNase-Schutztechniken,
sind jedoch nicht auf diese begrenzt.
-
Differenziell
exprimierte Gene können
ferner als Target-Gene und/oder Fingerabdruck-Gene beschrieben werden. "Fingerabdruck-Gen" bezieht sich hier
auf ein differenziell exprimiertes Gen, dessen Expressionsmuster
als Teil einer prognostischen oder diagnostischen Bewertung von
mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehenden Erkrankungen verwendet werden kann, oder
das alternativ in Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen
verwendet werden kann, die zur Behandlung von mit TH-Zellen-Subpopulation in
Verbindung stehenden Erkrankungen brauchbar sind. Ein Fingerabdruck-Gen
kann auch die Charakteristika eines Target-Gens oder eines Stoffwechsel-Gens
(siehe unten in Abschnitt 5.2) haben.
-
"Fingerabdruckmuster" bezieht sich hier
auf das Muster, das erzeugt wird, wenn die Expressionsmuster einer
Reihe (die im Bereich von zwei bis zu allen der Fingerabdruck-Gene
liegen kann, die es für
einen gegebenen Zustand gibt) von Fingerabdruck-Genen bestimmt werden.
Ein Fingerabdruckmuster kann auch in Verfahren zum Identifizieren
von Verbindungen verwendet werden, die zur Behandlung von Immunerkrankungen
brauchbar sind, z.B. durch Bewerten der Wirkung der Verbindung auf
das Fingerabdruckmuster, das normalerweise im Zusammenhang mit der
Erkrankung gezeigt wird.
-
"Target-Gen" (Ziel-Gen) bezieht
sich hier auf ein differenziell exprimiertes Gen, das an mit TH-Zellen-Subpopulation in
Verbindung stehenden Erkrankungen und/oder an Differenzierung, Erhalt
und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen in einer Weise beteiligt
sind, nach der Modulation des Niveaus der Target-Gen-Expression
oder der Target-Gen-Produktaktivität so wirken
kann, dass Symptome der mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung
stehenden Erkrankungen gelindert werden. Eine derartige Modulation
kann beispielsweise entweder zur Depletion oder zur Stimulation
von einer oder mehreren TH-Zellen-Subpopulationen führen, was wiederum zur Linderung
der Symptome der Immunerkrankung führt, z.B. der TH-Zellen-Subpopulationserkrankung.
-
"Stimulation" kann sich hier auf
einen effektiven Anstieg der Anzahl der Zellen, die zu einer T-Zellen-Population gehören, wie
einer TH-Zellen-Subpopulation, durch beispielsweise die Proliferation
derartiger TH- Zellen-Subpopulationszellen
beziehen. Der Begriff kann sich auch auf einen Anstieg der Aktivität der Zellen beziehen,
die zu einer TH-Zellen-Subpopulation gehören, wie sich beispielsweise
durch einen Anstieg der Expression des TH-Zellen-Subpopulations-spezifischen
Cytokinmusters pro Zelle zeigen würde.
-
"Depletion" (Erschöpfung) kann
sich hier auf eine effektive Reduktion der Anzahl der Zellen, die
zu einer T-Zellen-Population, wie einer TH-Zellen-Subpopulation,
gehören,
durch beispielsweise eine Reduktion der Proliferation derartiger
TH-Zellen-Subpopulationszellen beziehen. Der Begriff kann sich auch
auf eine Abnahme der Aktivität
der Zellen beziehen, die zu einer TH-Zellen-Subpopulation gehören, wie
sich beispielsweise durch eine Abnahme der Expression des TH-Zellen-Subpopulations-spezifischen
Cytokinmusters pro Zelle zeigen würde.
-
Zu
mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen
gehören
beispielsweise atopische Krankheiten, wie Asthma und Allergie einschließlich allergischer
Rhinitis, die Effekte pathogener einschließlich viraler Infektion, chronische
entzündliche
Erkrankungen, Psoriasis, Glomerunephritis, organspezifische Autoimmunität, Transplantatabstoßung und
Graft-versus-Host-Erkrankung. Ein Target-Gen kann auch die Charakteristika
eines Fingerabdruck-Gens oder eines Stoffwechsel-Gens (siehe unten
in Abschnitt 5.2) haben.
-
5.1.1 Verfahren zur Identifizierung
von differenziell exprimierten Genen
-
Eine
Vielfalt von Verfahren kann zur Identifizierung von Genen, die an
Immun-Erkrankungszuständen, z.B.
mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungszuständen, beteiligt
sind und/oder die an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion
der Subpopulationen beteiligt sind, verwendet werden. In Abschnitt
5.1.1.1 sind experimentelle Paradigmen beschrieben, die zur Erzeugung
von Subjekten und Proben eingesetzt werden können, die zur Identifizierung
derartiger Gene verwendet werden können. In Paradigmakategorien
erzeugtes Material kann nach Anwesenheit differenziell exprimierter
Gensequenzen charakterisiert werden, wie anschließend in
Abschnitt 5.1.1.2 erörtert
wird.
-
5.1.1.1 Paradigmen zur
Identifizierung von differenziell exprimierten Genen
-
Beschrieben
werden hier Paradigmen, die Modelle für normale und abnormale Immunreaktionen
repräsentieren.
Diese Paradigmen können
zur Identifizierung von Genen verwendet werden, die innerhalb von und
unter TH-Zellen-Subpopulationen
einschließlich,
aber nicht begrenzt auf TH1- und TH2-Subpopulationen, differenziell
exprimiert sind. Solche Gene können
beispielsweise an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion
von TH-Zellen-Subpopulationen und an mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehenden Erkrankungen beteiligt sein. TH-Zellen können beispielsweise
dazu gebracht werden, sich in entweder TH1- oder TH2-Zustände zu differenzieren,
können
mit beispielsweise einem Fremd-Antigen stimuliert werden und können an
verschiedenen Punkten während
des Verfahrens zur Analyse der differenziellen Genexpression aufgefangen
werden.
-
In
einer Ausführungsform
eines solchen Paradigmas, das hier als "transgenes T-Zellen-Paradigma" bezeichnet wird,
werden transgene Tiere, vorzugsweise Mäuse, eingesetzt, die gentechnisch
verändert
worden sind, damit sie einen speziellen T-Zellen-Rezeptor exprimieren,
so dass die überwiegende
T-Zellen-Population
des Immunsystems eines derartigen transgenen Tieres nur ein Antigen
erkennt. Ein solches System ist bevorzugt, da es eine Quelle für eine große Population
identischer T-Zellen zur Verfügung
stellt, deren Naivität gewährleistet
werden kann und deren Reaktion auf das einzige Antigen, das es erkennt,
auch gewährleistet ist.
Aus einem solchen transgenen Tier isolierte T-Helferzellen werden
in vitro zum Differenzieren in TH-Zellen-Subpopulationen wie TH1-,
TH2- oder TH0-Zellen-Subpopulationen gebracht. In einer speziellen
Ausführungsform
wird eine T-Helferzellengruppe
(die TH1-Gruppe) IL-12 ausgesetzt, einem Cytokin, das bekanntermaßen Differenzierung
in den TH1-Zustand induziert, eine zweite T-Helferzellengruppe (die TH2-Gruppe)
wird IL-4 ausgesetzt, einem Cytokin, das bekanntermaßen Differenzierung
zu dem TH2-Zustand induziert, und eine dritte Gruppe wird durch
Fehlen von Cytokin-vermittelter
Induktion in einen ungerichteten TH-Zustand eintreten gelassen.
-
Verwendet
werden kann ein zweites Paradigma, das hier als "T-Zelllinien-Paradigma" bezeichnet wird, das
reife TH-Zellklone, wie TH1 und TH2 und TH1-artige und TH2-artige Zelllinien,
vorzugsweise humane Zelllinien verwendet. Zu derartigen TH-Zelllinien
können
die folgenden wohlbekannten Ratten-Zelllinien Doris, AE7, D10.G4,
DAX, D1.1 und CDC25 gehören,
sie sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Solche T-Zelllinien können von
normalen Individuen sowie von Individuen stammen, die mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehende Erkrankungen haben, wie beispielsweise chronische
entzündliche
Krankheiten und Erkrankungen, wie Morbus Crohn, reaktive Arthritis
einschließlich
Lyme-Erkrankung,
insulinabhängigen
Diabetes, organspezifische Autoimmunität einschließlich multipler Sklerose, Thyroiditis
Hashimoto und Morbus Basedow, Kontaktdermatitis, Psoriasis, Transplantatabstoßung, Graft-versus-Host-Erkrankung,
Sarkoidose, atopische Erkrankungen wie Asthma und Allergie einschließlich allergischer
Rhinitis, gastrointestinale Allergien einschließlich Nahrungsmittelallergien,
Eosinophilie, Konjunktivitis, Glomerunephritis, bestimmte pathogene Empfänglichkeiten,
wie Wurmerkrankungen (z.B. Leishmaniose) und bestimmte Virusinfektionen
einschließlich
HIV und bakterielle Infektionen einschließlich tuberkulöser und
lepromatöser
Lepra.
-
Die
TH-Zellklone können
auf vielerlei Weise stimuliert werden. Zu diesen Stimulationsverfahren
gehören
pharmakologische Verfahren, wie Einwirkung von Phorbolestern, Calciuimionophoren
oder Lektinen (z.B. Concanavalin A), Behandlung mit Antikörpern, die
gegen T-Zellen-Rezeptorepitope gerichtet sind (z.B. Anti-CD3-Antikörper) oder
Einwirkung eines Antigens, das die speziellen TH-Zellen bekanntermaßen erkennen, in
Gegenwart einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle (APC), sie
sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Nach dieser Primärstimulation
können
die Zellen ohne Stimulation und beispielsweise in Gegenwart von
IL-2 unter Verwendung von Standardtechniken, die Fachleuten wohl
bekannt sind, in Kultur gehalten werden. Die Zellen können dann
einer oder mehreren weiteren Stimulations- und Erhaltzyklen ausgesetzt
werden.
-
Ein
drittes Paradigma, das hier als "in
vivo-Paradigma" bezeichnet
wird, kann auch verwendet werden, um differenziell exprimierte Gensequenzen
aufzufinden. In vivo-Stimulation von Tiermodellen bildet die Grundlage
für dieses
Paradigma. Die in vivo-Natur der Stimulation kann sich als besonders
aussagefähig
für die
analogen Reaktionen bei lebenden Patienten erweisen. Die Stimulation
kann nach vielerlei Verfahren bewirkt werden. Tiere, wie die zuvor
in diesem Abschnitt beschriebenen transgenen Tiere, können beispielsweise
passendes Antigen und passendes Cytokin als Injektion erhalten,
um die gewünschte
TH-Zellen-Differenzierung anzutreiben. Die Drainage von Lymphknoten
kann dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation verwertet
werden. Die Lymphknoten von beispielsweise TH1-orientierten Tieren
können
mit jenen von TH2-orientiert
Tieren verglichen werden.
-
Für dieses
in vivo-Paradigma kann ein weiter Bereich von Tiermodellen verwendet
werden, der sowohl Modelle der normalen Immundifferenzierung und
-funktion als auch jene wiedergibt, die Immunerkrankungen wiedergeben.
Beispielsweise können
beliebige der Tiermodelle verwendet werden, sowohl rekombinante
als auch nicht-rekombinante, die nachfolgend in Abschnitt 5.7.1
beschrieben sind.
-
An
jedem Punkt eines derartigen Verfahrens können Zellproben aufgefangen
werden. Zellen können beispielsweise
nach jeder beliebigen Stimulationsperiode und/oder jeder beliebigen
Erhaltperiode erhalten werden. Zellen können zudem an verschiedenen
Punkten während
des TH-Zellen-Differenzierungsprozesses aufgefangen
werden. Aus solchen Proben aufgefangene RNA kann nach beispielsweise
Verfahren verglichen und analysiert werden, die nachfolgend in Abschnitt
5.1.1.2 beschrieben sind. RNA aus TH0-, TH1- und TH2-Gruppen, die
zu einem gegebenen Zeitpunkt isoliert worden sind, kann dann analysiert
und verglichen werden. RNA aus stimulierten und nicht-stimulierten
Zellen innerhalb einer gegebenen TH-Zellgruppe kann außerdem auch
verglichen und analysiert werden. RNA, die aus undifferenzierten
TH-Zellen aufgefangen wurde, kann außerdem mit RNA verglichen werden,
die in verschiedenen Stadien während
des Differenzierungsprozesses aus Zellen aufgefangen wurde, der
letztendlich TH-Zellen-Subpopulationen ergibt.
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5.1.1.2 Analyse des Paradigmamaterials
-
Um
differenziell exprimierte Gene zu identifizieren, kann RNA, entweder
die gesamte RNA oder mRNA, aus den in Paradigmen wie in Abschnitt
5.1.1.1 beschrieben verwendeten TH-Zellen isoliert werden. Es können beliebige
RNA-Isolierungstechniken zur Reinigung derartiger RNA-Proben verwendet
werden, die nicht gegen die Isolierung von mRNA selektieren. Siehe
beispielsweise F. M. Ausubel et al., Herausgeber, 1987–1993, Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, hier vollständig zitiert zum
Zweck der Bezugnahme. Es können
zusätzlich
leicht große
Zahlen von Zellproben unter Verwendung von Techniken verarbeitet
werden, die Fachleuten wohl bekannt sind, wie beispielsweise dem
einstufigen RNA-Isolierungsprozess
von P. Chomczynski, (1989, US-A-4,843,155),
hier vollständig
zitiert zum Zweck der Bezugnahme.
-
Transkripte
innerhalb der aufgefangenen RNA-Proben, die RNA repräsentieren,
die durch differenziell exprimierte Gene produziert worden ist,
können
durch Einsatz vielerlei Verfahren identifiziert werden, die Fachleuten
wohl bekannt sind. Differential-Screening (T. F. Tedder, et al.
1988, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 208–212), subtraktive Hybridisierung
(S. M. Hedrick et al. 1984, Nature 308: 149–153; S. W. Lee et al., 1984, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88: 2825) und vorzugsweise Differenzialanzeige
(P. Liang und A. B. Pardee, 1992, Science 257: 967–971; US-A-5,262,311,
hier vollständig
zitiert zum Zweck der Bezugnahme) können beispielsweise zur Identifizierung
von Nukleinsäuresequenzen
verwendet werden, die von Genen stammen, die differenziell exprimiert
sind.
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Differential-Screening
beinhaltet das doppelt ausgeführte
Screening einer cDNA-Bibliothek, wobei eine Kopie der Bibliothek
Screening mit einer Vollzell-cDNA-Sonde unterzogen wird, die der mRNA-Population eines
Zelltyps entspricht, während
eine zweite Kopie der cDNA-Bibliothek Screening mit einer Voll-cDNA-Sonde
unterzogen wird, die der mRNA-Population eines zweiten Zelltyps
entspricht. Eine cDNA-Sonde kann beispielsweise einer Vollzell-cDNA-Sonde
eines Zelltyps oder Gewebes entsprechen, der bzw. das von einem Kontrollsubjekt
stammt, während
die zweite cDNA-Sonde einer Vollzell-cDNA-Sonde desselben Zelltyps
oder Gewebes entsprechen kann, der bzw. das von einem experimentellen
Subjekt stammt. Jene Klone, die an eine Sonde hybridisieren, jedoch
nicht an die andere, stehen möglicherweise
für Klone,
die von Genen stammen, die in dem interessierenden Zelltyp bei Kontroll-
gegenüber
exprimentellen Subjekten differenziell exprimiert sind.
-
Subtraktive
Hybridisierungstechniken beinhalten allgemein die Isolation von
mRNA, die aus zwei unterschiedlichen Quellen genommen ist, die Hybridisierung
der mRNA oder einzelsträngigen
cDNA, die durch reverse Transkription aus der isolierten mRNA erhalten
wurde, und die Entfernung aller hybridisierten und daher doppelsträngigen Sequenzen.
Die verbleibenden nicht-hybridisierten einzelsträngigen cDNAs repräsentieren
potentiell Klone, die von Genen stammen, die unter den beiden mRNA-Quellen
differenziell exprimiert sind. Derartige einzelsträngige cDNAs
werden danach als Ausgangsmaterial zum Aufbau einer Bibliothek verwendet,
die von differenziell exprimierten Genen stammende Klone umfasst.
-
Die
Differenzialanzeigetechnik ist ein Verfahren, das die wohl bekannte
Polymerasekettenreaktion einsetzt (PCR; die experimentelle Ausführungsform
ist in K. B. Multis, 1987, US-A-4,683,202 beschrieben), das die
Identifizierung von Sequenzen ermöglicht, die von Genen stammen,
die differenziell exprimiert sind. Zuerst wird isolierte RNA unter
Verwendung von Standardtechniken, die Fachleuten wohl bekannt sind,
durch reverse Transkription in einzelsträngige cDNA überführt. Zu Primern für die reverse-Transkriptase-Reaktion
können Oligo-dT-enthaltende
Primer, vorzugsweise vom 3'-Primertyp des Oligonukleotids
gehören,
das nachfolgend beschrieben wird.
-
Diese
Technik verwendet als nächstes
Paare von PCR-Primern
wie nachfolgend beschrieben, die die Amplifizierung von Klonen ermöglichen,
die einen reproduzierbaren Subset der RNA-Transkripte repräsentieren,
der innerhalb jeder gegebenen Zelle vorhanden ist. Die Verwendung
unterschiedlicher Paare von Primern ermöglichen das Amplifizieren von
jedem der geprimten mRNA-Transkripte, die in einer Zelle vorhanden
sind. Unter derartigen amplifizierten Transkripten können jene
identifiziert werden, die aus differenziell exprimierten Genen produziert
worden sind.
-
Der
3'-Oligonukleotid-Primer
der Primerpaare kann einen Oligo-dT-Stretch von 10–13, vorzugsweise 11
dT-Nukleotiden an
seinem 5'-Ende enthalten,
der zu dem Poly(A)-Schwanz von mRNA oder zu dem Komplement einer
cDNA hybridisiert, die durch reverse Transkription aus einem mRNA-Poly(A)-Schwanz
erhalten wurde. Der Primer kann ein oder mehrere, vorzugsweise zwei
zusätzliche
Nukleotide an seinem 3'-Ende
enthalten, um die Spezifität
des 3'-Primers zu
erhöhen.
Weil statistisch nur ein Subset der von mRNA stammenden Sequenzen,
die in der interessierenden Probe vorhanden sind, zu solchen Primern
hybridisieren wird, ermöglichen
die zusätzlichen
Nukleotide den Primern lediglich das Amplifizieren eines Subsets
der von mRNA stammenden Sequenzen, die in der interessierenden Probe
vorhanden sind. Dies ist bevorzugt, da genauere und vollständige Visualisierung
und Charakterisierung von jeder der Banden ermöglicht wird, die amplifizierte Sequenzen
repräsentieren.
-
Der
5'-Primer kann eine
Nukleotidsequenz enthalten, von der statistisch erwartet werden
kann, dass sie die Fähigkeit
zur Hybridisierung an cDNA-Sequenzen hat, die von den interessierenden
Zellen oder Geweben stammen. Die Nukleotidsequenz kann willkürlich sein,
und die Länge
des 5'-Oligonukleotid-Primers
kann im Bereich von etwa 9 bis etwa 15 Nukleotiden liegen, wobei
etwa 13 Nukleotide bevorzugt sind.
-
Willkürliche Primersequenzen
führen
dazu, dass die Längen
der produzierten amplifizierten partiellen cDNAs variabel sind,
wodurch das Trennen verschiedener Klone durch Verwendung von Standard-Denaturierungs-Sequenzierungs-Gelelektrophorese
möglich
wird.
-
Es
sollten PCR-Reaktionsbedingungen gewählt werden, die die Ausbeute
an amplifiziertem Produkt und Spezifität zu amplifiziertem Produkt
optimieren und zusätzlich
amplifizierte Produkte mit Längen
produzieren, die unter Verwendung von Standard-Gelelektrophoresetechniken aufgelöst werden
können.
Fachleuten sind derartige Reaktionsbedingungen wohl bekannt, und
zu wichtigen Reaktionsparametern gehören beispielsweise Länge und
Nukleotidsequenz von Oligonukleotid-Primern wie bereits erörtert und
Temperaturen und Reaktionszeiten der Annealing- und Verlängerungsstufe.
-
Das
Muster der aus der reversen Transkription und Amplifizierung der
mRNA von zwei verschiedenen Zelltypen resultierenden Klone wird
durch Sequenzierungs-Gelelektrophorese angezeigt und verglichen.
Differenziell exprimierte Gene werden durch Unterschiede der beiden
Banding-Muster angezeigt.
-
Nachdem
potentiell differenziell exprimierte Gensequenzen über Massentechniken
wie beispielsweise die oben beschriebenen identifiziert worden sind,
sollte die differenzielle Expression dieser mutmaßlich differenziell
exprimierten Gele bestätigt
werden. Die Bestätigung
kann beispielsweise durch wohl bekannte Techniken wie Northern-Analyse,
quantitative RT/PCR oder RNAse-Schutz bewirkt werden.
-
Nach
der Bestätigung
können
die differenziell exprimierten Gele weiter charakterisiert werden
und können
als Target- und/oder Fingerabdruck-Gene charakterisiert werden,
wie anschließend
in Abschnitt 5.3 erörtert
wird.
-
Die
amplifizierten Sequenzen differenziell exprimierter Gene, die beispielsweise
durch Differenzialanzeige erhalten wurden, können verwendet werden, um Klone
des entsprechenden Gens in voller Länge zu isolieren. Der Kodierabschnitt
des Gens in voller Länge
kann leicht ohne unnötige
Experimente durch molekularbiologische Techniken isoliert werden,
die in der Technik wohl bekannt sind. Das isolierte, differenziell
exprimierte, amplifizierte Fragment kann beispielsweise markiert
und zum Screening einer cDNA-Bibliothek verwendet werden. Das markierte
Fragment kann alternativ zum Screening einer Genombibliothek verwendet werden.
-
Zum
Isolieren von cDNA-Sequenzen in voller Länge kann auch die PCR-Technologie
verwendet werden. Wie oben in diesem Abschnitt beschrieben ist,
haben die isolierten amplifizierten Genfragmente, die durch Differenzialanzeige
erhalten worden sind, 5'-terminale
Enden an einigen statistischen Punkten innerhalb des Gens und üblicherweise
3'-terminale Enden
an einer Position, die dem 3'-Ende
des transkribierten Abschnitts des Gens entspricht. Nachdem die
Nukleotidsequenzinformationen aus einem amplifizierten Fragment
erhalten worden sind, kann der Rest des Gens (d. h. das 5'-Ende des Gens, wenn
Differenzialanzeige verwendet wird) beispielsweise unter Verwendung
von RT-PCR erhalten
werden.
-
In
einer Ausführungsform
eines derartigen Verfahrens zur Identifizierung und zum Klonen von
Gensequenzen in voller Länge
kann RNA nach Standardverfahren aus einem passenden Gewebe oder
einer passenden zellulären
Quelle isoliert werden. Dann kann mit der RNA unter Verwendung eines
Oligonukleotid-Primers, der zu der mRNA komplimentär ist, die
dem amplifizierten Fragment entspricht, zum Priming der Synthese
des ersten Strangs eine reverse Transkriptionsreaktion durchgeführt werden.
Da der Primer zu der mRNA antiparallel ist, geht die Verlängerung
in Richtung des 5'-Endes
der mRNA. Der resultierende RNA/DNA-Hybrid kann dann mit Guaninen
unter Verwendung einer Standard-terminalen Transferase-Reaktion "mit einem Schwanz
versehen" werden,
der Hybrid kann mit RNAase H verdaut werden, und die Synthese des
zweiten Strangs kann danach mit Poly-C Primer geprimt werden. Unter
Verwendung der beiden Primer wird der 5'-Abschnitt des Gens unter Verwendung
von PCR amplifiziert. Danach können
erhaltene Sequenzen isoliert und mit zuvor isolierten Sequenzen
rekombiniert werden, um eine cDNA der differenziell exprimierten Gene
der Erfindung in voller Länge
zu erzeugen. Hinsichtlich eines Überblicks über Klonierungsstrategien
und rekombinante DNA-Techniken siehe z.B. Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Bände 1–3) Cold Spring Harbor Press,
N. Y.; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular
Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.
Y.
-
5.2 Verfahren zur Identifizierung
von Stoffwechsel-Genen
-
Hier
werden Verfahren zur Identifizierung von Stoffwechsel-Genen beschrieben. "Stoffwechsel-Gen" bezieht sich hier
auf ein Gen, dessen Genprodukt die Fähigkeit zeigt, mit Genprodukten
in Wechselwirkung zu treten, die an mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehenden Erkrankungen beteiligt sind, und/oder mit Genprodukten
in Wechselwirkung zu treten, die an Differenzierung, Erhalt und/oder
Effektorfunktion von TH-Zellen-Subpopulationen beteiligt sind. Ein
Stoffwechsel-Gen kann differenziell exprimiert sein und daher die
Charakteristika eines Target- und/oder Fingerabdruck-Gens haben,
wie bereits in Abschnitt 5.1 beschrieben wurde.
-
Es
kann jedes beliebige Verfahren zum Identifizieren von Stoffwechsel-Genprodukten
verwendet werden, das zum Detektieren von Protein-Protein-Wechselwirkungen
geeignet sind, indem Wechselwirkungen zwischen Genprodukten und
Genprodukten, die bekanntermaßen
an mit TH-Zellen-Subpopulationen in Verbindung stehenden Erkrankungen
und/oder an Differenzierung, Erhalt und/oder Effektorfunktion der
Subpopulationen beteiligt sind, identifiziert werden. Solche bekannte
Genprodukte können
zelluläre
oder extrazelluläre Proteine
sein. Diese Genprodukte, die mit derartigen bekannten Genprodukten
in Wechselwirkung treten, repräsentieren
Stoffwechsel-Genprodukte, und die Gene, die sie kodieren, repräsentieren
Stoffwechsel-Gene.
-
Co-Immunopräzipitation,
Vernetzen und Co-Reinigung durch Gradienten- oder Chromatographiesäulen sind
die traditionellen Verfahren, die verwendet werden können. Die
Verwendung von derartigen Verfahren ermöglicht die Identifizierung
von Stoffwechsel-Genprodukten. Ein Stoffwechsel-Genprodukt kann,
nachdem es identifiziert worden ist, zusammen mit Standard-Techniken
verwendet werden, um sein entsprechendes Stoffwechsel-Gen zu identifizieren.
Mindestens ein Abschnitt der Aminosäuresequenz des Stoffwechsel-Genprodukts
kann beispielsweise unter Verwendung von Techniken ermittelt werden,
die Fachleuten wohl bekannt sind, wie mittels der Abbautechnik nach
Edman (siehe z.B. Creighton, 1983, "Proteins: Structures and Molecular Principles", W. H. Freeman & Co., N. Y., Seiten
34–49).
Die erhaltene Aminosäuresequenz
kann als Richtlinie für
die Erzeugung von Oligonukleotidmischungen verwendet werden, die
zum Screening auf Stoffwechsel-Gensequenzen verwendet werden können. Screening
kann beispielsweise durch Standard-Hybridisierungs- oder PCR-Techniken
bewirkt werden. Techniken zur Erzeugung von Oligonukleotidmischungen
und zum Screening sind wohl bekannt. (Siehe z.B. Ausubel (bereits
genannt) und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,
1990, M. Innis et al., Herausgeber, Academic Press, Inc., New York).
-
Es
können überdies
Verfahren verwendet werden, die zur simultanen Identifizierung von
Stoffwechsel-Genen führen,
die Proteine kodieren, die mit einem Protein in Wechselwirkung treten,
das an mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehenden Krankheitszuständen und/oder an Differenzierung,
Erhalt und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt ist.
Zu diesen Verfahren gehören
beispielsweise Sondieren von Expressionsbibliotheken mit markiertem
Protein, das bekanntermaßen
oder vermutlich an den Erkrankungen und/oder der Differenzierung,
dem Erhalt und/oder der Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt
ist, wobei dieses Protein in ähnlicher
Weise wie in der wohl bekannten Technik der Antikörper-Sondierung von λgt11-Bibliotheken
verwendet wird.
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Ein
Verfahren, das Proteinwechselwirkungen in vivo detektiert, das Zwei-Hybrid-System,
wird lediglich zu Veranschaulichungszwecken und nicht als Einschränkung detailliert
beschrieben. Eine Variante dieses Systems ist (Chien et al., 1991,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578–9582) beschrieben worden und
im Handel von Clontech (Palo Alto, CA, USA) erhältlich.
-
Bei
Verwendung eines derartigen Systems werden kurz gesagt Plasmide
aufgebaut, die zwei Hybridproteine kodieren: eines besteht aus der
DNA-Bindungsdomäne
eines Transkriptionsaktivatorproteins, fusioniert an ein bekanntes
Protein, in diesem Fall ein Protein, das bekanntermaßen an TH-Zellen-Subpopulations-Differenzierung oder
-Effektorfunktion oder an mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehenden Erkrankungen beteiligt ist, und das andere
besteht aus der Aktivierungsdomäne
des Aktivatorproteins, fusioniert an ein unbekanntes Protein, das
durch eine cDNA kodiert ist, die als Teil einer cDNA-Bibliothek
in dieses Plasmid rekombiniert worden ist. Die Plasmide werden in
einen Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae transformiert, der
ein Reporter-Gen enthält
(z.B. lacZ), dessen Regulatorbereich die Bindungsstellen des Transkriptionsaktivators
enthält.
Keines der Hybridproteine kann allein die Transkription des Reporter-Gens
aktivieren, der DNA-Bindungsdomänen-Hybrid kann es nicht,
weil er keine Aktivierungsfunktion bereitstellt, und der Aktivierungsdomänen-Hybrid
kann es nicht, weil er die Bindungsstellen des Aktivators nicht
lokalisieren kann. Die Wechselwirkung der beiden Hybridproteine
stellt das funktionale Aktivatorprotein wieder her (Rekonstitution) und
führt zur
Expression des Reporter-Gens,
das durch einen Assay für
das Reporter-Genprodukt detektiert wird.
-
Das
Zwei-Hybrid-System oder eine verwandte Methodik kann zum Screening
von Aktivierungsdomänenbibliotheken
auf Proteine verwendet werden, die mit einem bekannten "Köder"-Genprodukt in Wechselwirkung treten.
Als die Köder-Genprodukte
können
beispielhaft und nicht einschränkend
Genprodukte verwendet werden, die bekanntermaßen an mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehenden Erkrankungen und/oder an Differenzierung,
Erhalt und/oder Effektorfunktion der Subpopulationen beteiligt sind.
Gesamtgenom- oder cDNA-Sequenzen
werden an die DNA fusioniert, die eine Aktivierungsdomäne kodiert.
Diese Bibliothek und ein Plasmid, das einen Hybrid des Köder-Genprodukts
kodiert, das an die DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist, werden in
einen Hefe-Reporter-Stamm cotransformiert, und die resultierenden
Transformanten werden einem Screening auf jene unterzogen, die das
Reporter-Gen exprimieren. Das Köder-Gen
kann als Beispiel und nicht einschränkend in einen Vektor kloniert
werden, so dass es durch Translation an die DNA fusioniert wird,
die die DNA-Bindungsdomäne
des GAL4-Proteins kodiert. Diese Kolonien werden gereinigt, und
die für
die Reporter-Gen-Expression
verantwortlichen Bibliotheksplasmide werden isoliert. Danach wird DNA-Sequenzierung
zur Identifizierung der Proteine verwendet, die durch die Bibliotheksplasmide
kodiert werden.
-
Eine
cDNA-Bibliothek der Zelllinie, aus der Proteine detektiert werden
sollen, die mit Köder-Genprodukt
in Wechselwirkung treten, kann nach Verfahren hergestellt werden,
die in der Technik routinemäßig durchgeführt werden.
Gemäß dem hier
beschriebenen speziellen System können die cDNA-Fragmente beispielsweise
in einen Vektor inseriert werden, so dass sie durch Translation
an die Aktivierungsdomäne
von GAL4 fusioniert werden. Diese Bibliothek kann zusammen mit dem
Köder-Gen-GRL4-Fusionsplasmid in
einen Hefestamm co-transformiert werden, der ein lacZ-Gen enthält, das
von einem Promotor angetrieben wird, der GAL4-Aktivierungssequenz
enthält.
Ein cDNA-kodiertes Protein, das an eine GAL4-Aktivierungsdomäne fusioniert ist, die mit
Köder-Genprodukt in Wechselwirkung
tritt, wird ein aktives GAL4-Protein rekonstituieren und dadurch
die Expression des lacZ-Gens antreiben. Kolonien, die lacZ exprimieren,
können
durch ihre blaue Farbe in Gegenwart von X-gal detektiert werden.
Aus diesen Stämmen
kann die cDNA gereinigt und verwendet werden, um das mit Köder-Gen
in Wechselwirkung tretende Protein unter Verwendung von Techniken,
die in der Technik routinemäßig durchgeführt werden,
zu produzieren und zu isolieren.
-
Nachdem
ein Stoffwechsel-Gen identifiziert und isoliert worden ist, kann
es weiter charakterisiert werden, wie beispielsweise nachfolgend
in Abschnitt 5.3 erörtert
wird.
-
5.3 Charakterisierung
von differenziell exprimierten und Stoffwechsel-Genen
-
Differenziell
exprimierte Gene wie jene, die nach den bereits im Abschnitt 5.1
erörterten
Verfahren identifiziert wurden, und Stoffwechsel-Gene wie jene, die
nach den bereits im Abschnitt 5.2 erörterten Verfahren identifiziert
wurden, sowie Gene, die mit alternativen Mitteln identifiziert wurden,
können
unter Verwendung von beispielsweise Verfahren, die hier nachfolgend
erörtert
werden, weiter charakterisiert werden. Derartige Gene werden hier
als "identifizierte
Gene" bezeichnet.
-
Analysen
wie die hier beschriebenen geben Informationen über die biologische Funktion
der identifizierten Gene. Eine Bewertung der biologischen Funktion
der differenziell exprimierten Gene ermöglicht zusätzlich ihre Bezeichnung als
Target- und/oder Fingerabdruck-Gene.
-
Jegliche
der differenziell exprimierten Gene, deren weitere Charakterisierung
ergibt, dass eine Modulierung der Expression des Gens oder eine
Modulation der Aktivität
des Genprodukts irgendwelche der mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden
interessierenden Erkrankungen lindern kann, werden als "Target-Gene" bezeichnet, wie
bereits in Abschnitt 5.1 definiert wurde. Solche Target-Gene und
Target-Genprodukte
bilden zusammen mit den nachfolgend erörterten den Kern der nachfolgend
in Abschnitt 5.8 erörterten
Verbindungsauffindungsstrategien. Derartige Target-Gene, Target-Genprodukte
und/oder Modulierungsverbindungen können ferner als Teil der nachfolgend
in Abschnitt 5.9 beschriebenen Behandlungsverfahren für TH-Zellen-Subpopulations-Erkrankungen verwendet
werden. Zu derartigen Verfahren können beispielsweise Verfahren
gehören,
durch die die interessierende TH-Zellen-Subpopulation selektiv erschöpft oder
unterdrückt
oder alternativ stimuliert oder verstärkt wird.
-
Jegliche
der differenziell exprimierten Gene, deren weitere Charakterisierung
anzeigt, dass solche Modulationen interessierende, mit TH-Zellen- Subpopulation in
Verbindung stehende Erkrankungen nicht positiv beeinflussen können, deren
Expressionsmuster jedoch zu einem Genexpressions-"Fingerabdruck"-Muster beitragen,
das beispielsweise mit einem mit TH1/TH2 in Verbindung stehenden
Krankheitszustand korreliert, werden als "Fingerabdruck-Gen" bezeichnet. "Fingerabdruckmuster" werden nachfolgend in Abschnitt 5.11.1 ausführlicher
erörtert.
Es sei darauf hingewiesen, dass jegliche der Target-Gene auch als
Fingerabdruck-Gene wirken können,
ebenso wie die gesamten oder ein Teil der Stoffwechsel-Gene.
-
Es
sei ferner darauf hingewiesen, dass die Stoffwechsel-Gene auch gemäß den hier
beschriebenen Techniken charakterisiert werden können. Jene Stoffwechsel-Gene,
die Informationen geben, welche zeigen, dass Modulation der Expression
des Gens oder Modulation der Aktivität des Genprodukts irgendeine
mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehende Erkrankung lindern
kann, werden auch als "Target-Gene" bezeichnet. Solche
Target-Gene und Target-Genprodukte bilden zusammen mit den bereits
erörterten
den Kern der nachfolgend in Abschnitt 5.8 erörterten Verbindungsauffindungsstrategien
und können
als Teil der in dem folgenden Abschnitt 5.9 beschriebenen Behandlungsverfahren
verwendet werden.
-
In
Fällen,
bei denen die Charakterisierung eines Stoffwechsel-Gens zeigt, dass
Modulation der Genexpression oder Aktivität des Genprodukts interessierende,
mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehende Erkrankungen
nicht positiv beeinflussen kann, dessen Expression jedoch differenziell
exprimiert ist und zu einem Genexpressions-Fingerabdruckmuster beiträgt, das
mit beispielsweise einem mit TH1/TH2 in Verbindung stehenden Erkrankungszustand
korreliert, können
derartige Stoffwechsel-Gene zusätzlich
als Fingerabdruck-Gene bezeichnet werden.
-
Es
können
viele verschiedene Techniken verwendet werden, um die identifizierten
Gene weiter zu charakterisieren. Erstens kann die Nukleotidsequenz
der identifizierten Gene, die unter Verwendung von Standardtechniken
erhalten werden kann, die Fachleuten wohl bekannt sind, beispielsweise
zum Aufzeigen von Homologien mit einem oder mehreren bekannten Sequenzmotiven
verwendet werden, was Informationen hinsichtlich der biologischen
Funktion des identifizierten Genprodukts geben kann.
-
Zweitens
kann unter Verwendung von Standardtechniken, die Fachleuten wohl
bekannt sind, eine Analyse der Gewebe- und/oder Zelltypverteilung
der durch die identifizierten Gene produzierten mRNA durchgeführt werden.
Zu derartigen Techniken können
beispielsweise Northern, RNase-Schutz und RT-PCR-Analysen gehören. Solche
Analysen liefern beispielsweise Informationen darüber, ob
die identifizierten Gene in Zelltypen exprimiert werden, von denen
erwartet wird, dass sie zu den speziellen, interessierenden, mit
TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehenden Erkrankungen beitragen. Solche Analysen
können
auch quantitative Informationen in Bezug auf Regulierung der mRNA
im Fließgleichgewicht
liefern, Daten ergeben, die sich damit befassen, welches der identifizierten
Gene ein hohes Regulierungsniveau in Zelltypen zeigt, von denen erwartet
werden kann, dass sie zu der interessierenden, mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehenden Erkrankungen beitragen. Standard-in-situ-Hybridisierungstechniken
können
auch eingesetzt werden, um Informationen darüber zu liefern, welche Zellen
innerhalb eines gegebenen Gewebes oder einer gegebenen Population
von Zellen das identifizierte Gen exprimieren. Eine solche Analyse
kann Informationen hinsichtlich der biologischen Funktion eines
identifizierten Gens in Bezug auf eine gegebene, mit TH-Zellen-Subpopulation in
Verbindung stehende Erkrankung in Fällen liefern, bei denen vermutlich
nur ein Subset der Zellen innerhalb eines Gewebes oder einer Population
von Zellen für
die Erkrankung relevant ist.
-
Drittens
können
die Sequenzen der identifizierten Gene unter Verwendung von Standardtechniken verwendet
werden, um die Gene auf Genkarten zu positionieren, z.B. Genomkarten
der Maus (N. G. Copeland und N. A. Jenkins, 1991, Trends in Genetics
7: 113–118)
und des Menschen (D. Cohen et al., 1993, Nature 366: 698–701) Derartige
Kartierungsinformationen können
Informationen über
die Bedeutung von Genen für Erkrankungen
des Menschen enthalten, indem beispielsweise Gene identifiziert
werden, die auf genetische Regionen verweisen, auf die bekannte
genetische, mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehende Erkrankungen verweisen. Zu derartigen Regionen
gehört
beispielsweise der Locus Scl-1 der Maus, der vermutlich an Leishmaniose
beteiligt ist, oder die Chromosomenregion 5g31.1 des Menschen, die
ein oder mehrere Loci enthält,
die vermutlich die IgE-Produktion in nicht-antigenspezifischer Weise regulieren
und daher an Allergie beteiligt sein können, einer TH2-artig zusammenhängenden
Erkrankung (D. Marsh et al., 1994, Science 264: 1152–1156).
-
Viertens
kann die biologische Funktion der identifizierten Gene direkter
durch Einsatz relevanter in vivo- und in vitro-Systeme bewertet
werden. Zu in vivo-Systemen können
tierische Systeme gehören,
sie sind jedoch nicht darauf begrenzt, die natürlicherweise die Symptome der
Immunerkrankungen zeigen, oder solche, die gentechnisch verändert worden
sind, um derartige Symptome zu zeigen. Solche Systeme können zudem
Systeme zur weiteren Charakterisierung der Zelltyp-Differenzierungs-
und Effektorfunktion beinhalten und können transgene tierische Systeme,
wie die bereits in Abschnitt 5.1.1.1. und dem folgenden Abschnitt
5.7.1 beschriebenen, umfassen, sind jedoch nicht auf diese begrenzt.
In vitro-Systeme können
Systeme auf Zellbasis beinhalten, die beispielsweise TH1- oder TH2-Zelltypen
umfassen, sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Die TH-Subpopulationszellen
können
Zellen vom Wildtyp oder Zellen sein, die nicht dem Wildtyp angehören, die
Modifikationen enthalten, die bekanntermaßen oder vermutlich zu der
interessierenden, mit TH-Zellen-Subpopulation
in Verbindung stehenden Erkrankung beitragen. Derartige Systeme
werden nachfolgend in Abschnitt 5.7.2 ausführlich erörtert.
-
Bei
der weiteren Charakterisierung der biologischen Funktion der identifizierten
Gene kann die Expression dieser Gene innerhalb der in vivo- und/oder
in vitro-Systeme
moduliert werden, d. h. in beispielsweise transgenen Tieren und/oder
Zelllinien entweder überexprimiert
oder unterexprimiert werden, und danach kann ihre anschließende Wirkung
auf das System in Assays untersucht werden. Die Aktivität der Produkte
des identifizierten Gens kann alternativ moduliert werden, indem
das Aktivitätsniveau
in dem interessierenden in vivo- und/oder in vitro-System erhöht oder
abgesenkt wird und ihre anschließende Wirkung danach durch
Assays bewertet wird.
-
Die
durch solche Charakterisierung erhaltenen Informationen können relevante
Verfahren zur Behandlung oder Kontrolle von Immunerkrankungen nahe
legen, wie mit TH-Zellen-Subpopulation in Verbindung stehenden Erkrankungen,
an denen das interessierende Gen beteiligt ist. Zu relevanten Behandlungsverfahren können beispielsweise
nicht nur eine Modulation der Genexpression und/oder der Aktivität des Genprodukts gehören, sondern
auch eine selektive Depletion oder Stimulation der interessierenden
TH-Zellen-Subpopulation.
Charakterisierungsverfahren, wie die hier beschriebenen, können zeigen,
ob eine derartige Modulation positiv oder negativ wäre. "Positive Modulation" bezieht sich hier
auf einen Anstieg der Genexpression oder Aktivität des interessierenden Gens
oder Genprodukts, oder eine Stimulierung einer TH-Zellen-Subpopulation gegenüber derjenigen,
die in Abwesenheit der Modulationsbehandlung beobachtet wird. "Negative Modulation" bezieht sich hier
auf die Abnahme der Genexpression oder Aktivität oder eine Depletion einer
TH-Zellen-Subpopulation relativ zu derjenigen, die in Abwesenheit
der Modulationsbehandlung beobachtet wurde. "Stimulation" und "Depletion" sind wie oben in Abschnitt 3 definiert.
Behandlungsverfahren werden nachfolgend in Abschnitt 5.9 erörtert.
-
5.4 DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE
UND PATHWAY-GENE
-
Im
Folgenden sind differentiell exprimierte Gene wie die oben in Abschnitt
5.1.1 identifizierten und Pathway-Gene wie die oben in Abschnitt
5.2 identifizierten beschrieben.
-
Das
differentiell exprimierte und Pathway-Gen der Erfindung ist unten
in Tabelle 1 aufgelistet. Differentiell exprimierte Gensequenzen
sind in 17 und 24 aufgelistet.
Nukleotidsequenzen, die über
Differential-Display-Technik identifiziert wurden, werden im Folgenden
als Band 200 bezeichnet. Das Gen, das diesen Sequenzen entspricht,
wird im Folgenden als das Gen 200 bezeichnet. Tabelle 1 listet ein
differentiell exprimiertes Gen auf, das beispielsweise durch die
Paradigmen identifiziert wurde, welche oben in Abschnitt 5.1.1.1 und
unten in den Beispielen in den Abschnitten 6–8 diskutiert werden.
-
Tabelle
1 fasst Informationen bezüglich
der weiteren Charakterisierung eines solchen Gens zusammen. Tabelle
2 listet E. coli-Klone auf, die bei der Agricultural Research Service
Culture Collection (NRRL) oder der American Type Culture Collection
(ATCC) hinterlegt sind und die Sequenzen enthalten, die in dem Gen
der Tabelle 1 gefunden wurden.
-
In
Tabelle 1 gibt die Spalte mit dem Titel „Diff. Exp." das Merkmal der
differentiellen Expression an, anhand dessen die Sequenz identifiziert
wurde.
-
In
dieser Spalte bezeichnet „TH1" eine Sequenz, die
einem Gen entspricht, das bevorzugt in reifen, voll differenzierten
TH1-Zellen relativ zu TH2-Zellen exprimiert ist. Bevorzugte Expression
kann quantitativ oder quantitativ sein, wie oben in Abschnitt 5.1
beschrieben.
-
Gewebeexpressionsmuster
sind ebenfalls in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Spalte mit dem
Titel „Gewebe-/Zelldist." listet Gewebe- und/oder
Zelltypen auf, in denen die Expression des Gens getestet wurde und
ob eine Expression des Gens innerhalb eines gegebenen Gewebe- bzw.
Zelltyps beobachtet wurde. Im Besonderen zeigt „+" nachweisbare mRNA aus dem fraglichen
Gen an. Wenn nicht anderweitig vermerkt, bezieht sich „+" auf alle Proben
eines gegebenen Gewebe- bzw. Zelltyps, der getestet wurde. „Nachweisbar" hat in der vorliegenden
Beschreibung die oben in Abschnitt 5.1 beschriebene Bedeutung.
-
Das
Gen, das in Tabelle 1 aufgelistet ist, kann unter Benutzung von
Klonverfahren gewonnen werden, die dem Fachmann gut bekannt sind
und zu denen insbesondere die Benutzung von geeigneten Sonden zählt, um
das Gen innerhalb einer geeigneten cDNA- oder gDNA (genomische DNA)-Bibliothek
nachzuweisen. (Siehe beispielsweise Sambrook u.a., 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, was
per Verweis in diese Patentschrift eingebunden ist.) Sonden für die Sequenzen,
die in dieser Patentschrift beschrieben werden, können direkt
aus den isolierten Klonen gewonnen werden, die bei der NRRL hinterlegt sind,
wie unten in Tabelle 2 angegeben. Alternativ können Oligonukleotidsonden für die Gene
auf der Grundlage der DNA-Sequenzen synthetisiert werden, die in
dieser Patentschrift in 17 und 24 offenbart werden.
-
Die
Sonden können
benutzt werden, um cDNA-Bibliotheken zu durchsuchen, die aus einer
geeigneten Zelle oder Zelllinie hergestellt werden, in denen das
Gen transkribiert wird. Geeignete Zelllinien können u.a. Dorris-, Ae7-, D10.G4-,
DAX-, D1.1- und CDC25-Zelllinien
sein. Außerdem
können
gereinigte primäre
naive T-Zellen benutzt werden, die entweder aus transgenen oder
aus nicht-transgenen Stämmmen
abgeleitet wurden. Alternativ können
die in dieser Patentschrift beschriebenen Gene aus einer cDNA-Bibliothek kloniert
werden, die beispielsweise aus NIH-3T3-Zelllinien, welche mit dem Ha-ras(EJ)-Gen
transfiziert wurden, aus 5C10-Zellen und peripheren Blutlymphozyten
erstellt wurde.
-
TABELLE
1 DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTE UND PATHWAY-GENE
-
Tabelle
2 unten listet isolierte E. coli-Klone auf, die Sequenzen innerhalb
des neuartigen Gens enthalten, das in Tabelle 1 aufgelistet ist.
-
-
-
In
dieser Patentschrift bezeichnet „differentiell exprimiertes
Gen" (d.h. Target-
oder Fingerprint-Gen) oder „Pathway-Gen" (a) ein Gen, das
enthält:
mindestens eine der DNA-Sequenzen, die in dieser Patentschrift offenbart
werden (wie in 17 und 24 dargestellt),
oder die in den in Tabelle 2 aufgelisteten Klonen enthalten sind,
die bei der NRRL oder ATCC hinterlegt sind; (b) eine beliebige DNA-Sequenz,
die die Aminosäurensequenz
kodiert, welche kodiert ist durch: die DNA-Sequenzen, die in dieser
Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt), die in den in Tabelle
2 aufgelisteten Klonen enthalten sind, welche bei der NRRL oder
ATCC hinterlegt sind, die in der Kodierregion des Gens enthalten
sind, zu dem die DNA-Sequenzen gehören, in dieser Patentschrift
offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt) oder die in den Klonen
enthalten sind, welche in den in Tabelle 2 aufgelisteten Klonen
enthalten sind und welche bei der NRRL oder ATCC hinterlegt sind;
(c) eine beliebige DNA-Sequenz, die zum Komplement zu: den Kodiersequenzen,
die in dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt),
die in den Klonen enthalten sind, welche in Tabelle 2 aufgelistet
und bei der NRRL oder ATCC hinterlegt sind, oder die in der Kodierregion
des Gens enthalten sind, zu dem die DNA-Sequenzen gehören, in
dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt) oder die in den Klonen
enthalten sind, welche in Tabelle 2 aufgelistet und bei der NRRL oder
ATCC hinterlegt sind, unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert,
z.B. Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaPHO4, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA
bei 65°C
und Waschen in 0,1 × SSC/0,1%
SDS bei 68°C
(Ausubel F. M. u.a., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular
Biology, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & sons, Inc., New
York, auf S. 2.10.3), und die ein Genprodukt kodiert, das funktional äquivalent
ist zu einem Genprodukt, das kodiert ist durch ein Gen aus (a) oben;
und/oder (d) einer beliebigen DNA-Sequenz, die zum Komplement zu:
den Kodiersequenzen, die in dieser Patentschrift offenbart werden
(wie in 17 und 24 dargestellt),
die in den Klonen enthalten sind, welche in Tabelle 2 aufgelistet
und bei der NRRL hinterlegt sind, oder die in der Kodierregion des
Gens enthalten sind, zu dem die DNA-Sequenzen gehören, in
dieser Patentschrift offenbart werden (wie in 17 und 24 dargestellt) oder die in den Klonen
enthalten sind, welche in Tabelle 2 aufgelistet und bei der NRRL
oder ATCC hinterlegt sind, unter weniger stringenten Bedingungen
wie beispielsweise moderat stringenten Bedingungen hybridisiert,
z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1%
SDS bei 42°C
(Ausubel u.a., 1989, supra), das jedoch immer noch ein Genprodukt kodiert,
das funktional äquivalent
ist zu einem Genprodukt, das kodiert ist durch ein Gen aus (a) oben.
Die Erfindung schließt
auch degenerierte Varianten der Sequenzen (a) bis (d) ein.
-
Die
Erfindung umfasst die folgenden Nukleotide, Wirtszellen, die solche
Nukleotide exprimieren, und die Expressionsprodukte solcher Nukleotide:
(a) Nukleotide, die ein Produkt eines differentiell exprimierten und/oder
Pathway-Gens eines Säugetiers
kodieren, insbesondere ein humanes oder murines Gen-200-Produkt;
(b) Nukleotide, die Abschnitte eines Produktes eines differentiell
exprimierten und/oder Pathway-Gens kodieren, die seinen funktionalen
Domänen
entsprechen, sowie die Polypeptidprodukte, die von solchen Nukleotidsequenzen
kodiert werden, und bei denen, im Falle von Genprodukten des Rezeptor-Typs,
zu solchen Domänen
insbesondere extrazelluläre
Domänen
(ECD), Transmembrandomänen
(TM) und zytoplasmatische Domänen
(CD) gehören;
(c) Nukleotide, die Mutanten eines differentiell exprimierten Gen-200-Produktes
kodieren, bei dem alle Domänen
oder ein Teil seiner Domänen
zerstört
oder verändert
sind, und wobei, im Falle von Genprodukten des Rezeptor-Typs, zu
solchen Mutanten insbesondere lösliche
Rezeptoren, bei denen die gesamte oder ein Abschnitt der TM zerstört ist,
und nicht-funktionale
Rezeptoren, bei denen die gesamte oder ein Abschnitt der CD zerstört ist,
gehören;
und (d) Nukleotide, die Fusionsproteine kodieren, welche ein differentiell
exprimiertes Gen-200-Produkt enthalten oder eine seiner Domänen, die
mit einem anderen Polypeptid fusioniert ist.
-
Die
Erfindung schließt
auch Nukleinsäuremoleküle, vorzugsweise
DNA-Moleküle,
ein, die mit den DNA-Sequenzen
(a) bis (d) des vorhergehenden Absatzes hybridisieren und daher
deren Komplemente sind. Solche Hybridisierungsbedingungen können wie
oben beschrieben hoch stringent oder weniger stringent sein. In
Fällen,
in denen die Nukleinsäuremoleküle Deoxyoligonukleotide
(„Oligos") sind, können hoch
stringente Bedingungen z.B. Waschen in 6 × SSC/0,05% Natriumpyrophosphat
bei 37°C
(bei 14 bp Oligos), 48°C
(bei 17 bp Oligos), 55°C
(bei 20 bp Oligos) und 60°C
(für 23
bp Oligos) bedeuten. Diese Nukleinsäuremoleküle können als Antisense-Moleküle des Target-Gen
agieren, die beispielsweise nützlich
sind bei der Regulierung des Target-Gens und/oder als Antisense-Primer
in Amplifikationsreaktionen von Nukleinsäuresequenzen von Target-, Fingerprint-
und/oder Pathway-Genen. Daneben können solche Sequenzen als Teil
von Sequenzen von Ribozymen und/oder Dreifach-Helices benutzt werden,
was ebenfalls nützlich
bei der Regulierung des Target-Gens ist. Des Weiteren können solche
Moleküle
als Komponenten diagnostischer Verfahren benutzt werden, mit denen
die Gegenwart oder Prädisposition
zu einer Immunstörung,
z.B. einer durch TH-Zell-Subpopulationen bedingten Störung, nachgewiesen
werden können.
-
Die
Erfindung umfasst auch (a) DNA-Vektoren, die eine/s der vorgenannten
Kodiersequenzen und/oder ihrer Komplemente (d.h. Antisense) enthält; (b)
DNA- Expressionsvektoren,
die eine der vorgenannten Kodiersequenzen enthalten, welche operativ
mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, das die Expression
der Kodiersequenzen regelt; und (c) genetisch veränderte Wirtszellen,
die eine der vorgenannten Kodiersequenzen enthalten, welche operativ
mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, das die Expression
der Kodiersequenzen in der Wirtszelle regelt. Im Sinne dieser Patentschrift
gehören
zu den regulatorischen Elementen insbesondere induzierbare und nicht-induzierbare
Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere dem Fachmann bekannte
Elemente, die die Expression antreiben und regulieren. Zu solchen
regulatorischen Elementen gehören
insbesondere das unmittelbare frühe
Gen des Zytomegalovirus hCMV, die frühen oder späten Promotoren des SV40-Adenovirus,
das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, die Hauptoperator-
und -promotorregionen des Phagus A, die Steuerregionen des fd-Mantelproteins,
der Promotor der 3-Phosphoglycerat-Kinase, die Promotoren der Säurephosphatase
und die Promotoren der α-Mating-Faktoren der Hefe.
Die Erfindung schließt
Fragmente jeder der in dieser Patentschrift offenbarten DNA-Sequenzen ein.
-
Zusätzlich zu
den oben beschriebenen Gensequenzen können Homologe dieser Gensequenzen und/oder
Kodiersequenzen dieser Gene in ihrer vollen Länge, wie sie in derselben oder
in anderen Spezies anwesend sein können, ohne unnötiges Experimentieren
durch molekularbiologische Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt
sind, identifiziert und isoliert werden. Daneben können Gene
an anderen genetischen Loci innerhalb des Genoms derselben Spezies
existieren, die Proteine kodieren, welche eine weitgehende Homologie
zu einer oder mehreren Domänen
solcher Genprodukte aufweisen. Diese Gene können ebenfalls über ähnliche
Techniken identifiziert werden.
-
Beispielsweise
kann die isolierte differentiell exprimierte Gensequenz markiert
und zur Durchsuchung einer cDNA-Bibliothek benutzt werden, die aus
mRNA erstellt wurde, welche aus dem fraglichen Organismus gewonnen
wurde. Die Hybridisierungsbedingungen sollten von geringerer Stringenz
sei, wenn die cDNA-Bibliothek von einem anderen Organismus abgeleitet
wurde als dem Organismus-Typ, aus dem die markierte Sequenz abgeleitet
wurde. cDNA-Screening kann auch Klone identifizieren, die aus alternativ
gespleißten
Transkripten in derselben oder einer anderen Spezies abgeleitet
wurde. Alternativ kann das markierte Fragment benutzt werden, um
eine Genombibliothek zu durchsuchen, die von dem fraglichen Organismus
abgeleitet wurde, wobei wiederum angemessen stringente Bedingungen
angelegt werden. Niedrige Stringenzbedingungen werden dem Fachmann
gut bekannt sein und variieren vorhersehbar in Abhängigkeit
von dem spezifischen Organismus, aus dem die Bibliothek und die
markierten Sequenzen abgeleitet sind. Als Leitlinie bezüglich solcher
Bedingungen siehe beispielsweise Sambrook u.a., 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, N.
Y. und Ausubel u.a., 1989, Current Protocols in Molecular Biology,
(Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.).
-
Daneben
kann eine bislang unbekannte Sequenz vom Typ eines differentiell
exprimierten oder eines Pathway-Gens
isoliert werden, indem eine PCR unter Verwendung von zwei degenerierten
Oligonukleotid-Primerpoolen durchgeführt wird, welche auf der Grundlage
von Aminosäuresequenzen
in dem fraglichen Gen angelegt werden. Das Template für die Reaktion
kann cDNA sein, die durch reverse Transkription von mRNA gewonnen
wird, die aus humanen oder nicht-humanen Zelllinien oder Geweben
erstellt wurde, von denen bekannt ist oder gemutmaßt wird,
dass sie ein Allel eines differentiell exprimierten oder Pathway-Gens
exprimieren. Das PCR- Produkt
kann subkloniert und sequenziert werden um sicherzustellen, dass
die amplifizierten Sequenzen die Sequenzen einer Nukleinsäuresequenz
in der Art differentiell exprimierter oder Pathway-Gene abbilden.
-
Das
PCR-Fragment kann dann benutzt werden, um mit verschiedenen Verfahren
einen cDNA-Klon in voller Länge
zu isolieren. Beispielsweise kann das amplifizierte Fragment benutzt
werden, um eine Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek zu durchsuchen. Alternative
kann das markierte Fragment benutzt werden, um eine genomische Bibliothek
zu durchsuchen.
-
PCR-Technik
kann auch eingesetzt werden, um cDNA-Sequenzen in voller Länge zu isolieren.
Beispielsweise kann RNA nach standardmäßigen Methoden aus einer geeigneten
zellularen oder Gewebsquelle isoliert werden. An der RNA kann eine
reverse Transriptionsreaktion durchgeführt werden, wobei ein Oligonukleotid-Primer,
der spezifisch für
das 5'-Ende des
amplifizierten Fragments ist, als Startpunkt für die Synthese des ersten Stranges
benutzt wird. Der daraus resultierende RNA/DNA-Hybrid kann dann
unter Anwendung einer standardmäßigen terminalen
Transferasereaktion mit einem Schweif aus Guaninen versehen werden,
der Hybrid kann mit RNAase H verdaut werden, und die Zweitstrangsynthese
kann dann mit einem PolyC-Primer ausgelöst werden. So können die
cDNA-Sequenzen aufwärts vom
amplifizierten Fragment isoliert werden. Als Review von Klonierstrategien,
die benutzt werden können,
siehe z.B. Sambrook u.a., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratorien, N. Y. und Ausubel u.a.,
1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing
Associates and Wiley Interscience, N. Y.).
-
In
Fällen,
in denen das identifizierte differentiell exprimierte oder Pathway-Gen
das normale oder Wildtyp-Gen
ist, kann dieses Gen benutzt werden, um Mutantenallele des Gens
zu isolieren. Solch eine Isolierung ist bei Prozessen und Störungen vorzuziehen,
von denen bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass sie eine genetischen
Ursache haben. Mutantenallele können
aus Individuen isoliert werden, von denen entweder bekannt ist oder
gemutmaßt
wird, dass sie einen Genotyp aufweisen, der zu Symptomen, die durch
Störungen
der T-Zell-Subpopulation
bedingt sind, beiträgt.
Mutantenallele und Mutantenallelprodukte können dann in den unten beschriebenen
therapeutischen und diagnostischen Assay-Systemen eingesetzt werden.
-
Eine
cDNA eines Mutantengens kann beispielsweise mittels PCR isoliert
werden, eine Technik, die dem Fachmann gut bekannt ist. In diesem
Fall kann der erste cDNA-Strang synthetisiert werden, indem ein Oligo-dT-Oligonukleotid auf
mRNA hybridisiert wird, die aus Gewebe isoliert wurde, von dem bekannt
ist oder gemutmaßt
wird, dass es in einem Individuum exprimiert ist, das vermutlich
das Mutantenallel trägt,
und indem der neue Strang mit reverser Transkriptase erweitert wird.
Der zweite Strang der cDNA wird dann unter Verwendung eines Oligonukleotids
synthetisiert, das spezifisch an dem 5'-Ende des normalen Gens hybridisiert. Mittels
dieser beiden Primer wird das Produkt dann über PCR amplifiziert, in einen
geeigneten Vektor kloniert und einer DNA-Sequenzanalyse nach Verfahren
unterzogen, die dem Fachmann gut bekannt sind. Durch Vergleichen
der DNA-Sequenz des Mutantengens mit der des normalen Gens können Mutation(en),
die für
den Verlust oder die Veränderung
der Funktion des Mutantengenproduktes verantwortlich ist/sind, bestimmt
werden.
-
Alternativ
kann aus einem Gewebe, von dem bekannt ist oder gemutmaßt wird,
dass es das fragliche Gen in einem Individuum exprimiert, von dem
bekannt ist oder gemutmaßt
wird, dass es das Mutantenallel trägt, eine genomische oder cDNA-Bibliothek
erstellt und mittels DNA bzw. RNA durchsucht werden. Das normale
Gen oder ein beliebiges passendes Fragment davon kann dann markiert
und als Sonde benutzt werden, um das entsprechende Mutantenallel
in der Bibliothek zu identifizieren. Der Klon, der dieses Gen enthält, kann dann
mit Verfahren, die auf dem Fachgebiet routinemäßig praktiziert werden, gereinigt
und der Sequenzanalyse wie oben in diesem Abschnitt beschrieben
unterzogen werden.
-
Außerdem kann
eine Expressionsbibliothek erstellt werden mit DNA, die aus einem
Gewebe, von dem bekannt ist oder gemutmaßt wird, dass es das fragliche
Gen in einem Individuum exprimiert, von dem bekannt ist oder gemutmaßt wird,
dass es das Mutantenallel trägt,
isoliert wurde oder mit cDNA, die aus solchem Gewebe synthetisiert
wurde. Auf diese Weise können
Genprodukte, die von dem mutmaßlichen
Mutantengewebe produziert wurden, exprimiert und mit standardmäßigen Antikörper-Screening-Techniken
in Verbindung mit Antikörpern,
die gegen das normale Genprodukt gezüchtet wurden, durchsucht werden
wie unten in Abschnitt 5.6 beschrieben. (Zu Screening-Techniken
siehe beispielsweise Harlow, E. und Lane, Hrsg., 1988, Antibodies: „A Laboratory
Manual", Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor.) In Fällen, in denen die Mutation
zu einem exprimierten Genprodukt mit veränderter Funktion führt (z.B.
als Resultat einer Missense-Mutation), ist es sehr wahrscheinlich,
dass Kreuzreaktionen zwischen einem multiklonalen Antikörper und
dem Mutantengenprodukt auftreten. Bibliotheksklone, die über ihre
Reaktion mit solchen markierten Antikörpern nachgewiesen wurden, können gereinigt
und einer Sequenzanalyse wie oben in diesem Abschnitt beschrieben
unterzogen werden.
-
5.5 PRODUKTE DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTER UND PATHWAY-GENE
-
Zu
den Produkten differentiell exprimierter und Pathway-Gene gehören diejenigen
Proteine, die von den differentiell exprimierten und Pathway-Genen
kodiert werden, welche den oben in Abschnitt 5.4 beschriebenen Gensequenzen
entsprechen, wie beispielsweise die Peptide, die in 17 und 24 aufgelistete sind.
-
Außerdem können zu
den Produkten differentiell exprimierter und Pathway-Gene Proteine
gehören, die
funktional äquivalente
Genprodukte darstellen. Zu solchen Genprodukten gehören insbesondere
natürliche Varianten
der Peptide, die in 17 und 24 aufgelistete sind. Solch ein äquivalentes
Produkt differentiell exprimierter und Pathway-Gene kann Löschungen,
Hinzufügungen
oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb
der Aminosäuresequenz,
die von den oben im Abschnitt 5.4 beschriebenen differentiell exprimierten und
Pathway-Gensequenzen kodiert werden, enthalten, die aber zu einer
stillen Veränderung
führen
und so ein funktional äquivalentes
Produkt differentiell exprimierter und Pathway-Gene produzieren.
Aminosäuresubstitutionen
können
auf der Grundlage von Ähnlichkeiten
in der Polarität,
Ladung, Löslichkeit,
Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder
der amphipathischen Natur der beteiligten Reste vorgenommen werden.
Beispielsweise gehören
zu den nicht-polaren (hydrophobischen) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin,
Valin, Proline, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin; zu den polaren
Aminosäuren
gehören
Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin;
zu den positiv geladenen (basischen) Aminosäuren gehören Arginin, Lysin und Histidin;
und zu den negativ geladenen (sauren) Aminosäuren gehören Aspartinsäure und
Glutaminsäure.
In dieser Patentschrift bezeichnet „funktional äquivalent" ein Protein, das
in der Lage ist, eine im Wesentlichen ähnliche in-vivo-Aktivität zu zeigen
wie die Produkte endogener differentiell exprimierter und Pathway-Gene,
die von den oben in Abschnitt 5.4 beschriebenen differentiell exprimierten
und Pathway-Gensequenzen kodiert werden. Alternativ, wenn sie als
Abschnitt von Assays wie die oben in Abschnitt 5.3 beschriebenen
eingesetzt werden, kann „funtional äquivalent" Peptide bezeichnen,
die in der Lage sind, mit anderen zellulären und extrazellulären Molekülen in einer
Weise zu interagieren, die im Wesentlichen ähnlich der Art und Weise ist,
wie der entsprechende Abschnitt des Produktes endogener differentiell
exprimierter und Pathway-Gene dies tun würde.
-
Peptide,
die einer oder mehreren Domänen
des differentiell exprimierten Gen-200-Produktes (z.B. TM, ECD oder
CD) oder der verkürzten
oder gelöschten
differentiell exprimierten Gen-200-Produkte (z.B. im Fall von Genprodukten
des Rezeptor-Typs) oder der Proteine, in denen die differentiell
exprimierten Gen-200-Produkte
in voller Länge,
ein differentiell exprimiertes Gen-200-Peptid oder ein verkürztes oder
gelöschtes
differentiell exprimiertes Gen-200-Produkt mit einem nicht verwandten
Protein fusioniert ist, entsprechen, gehören ebenfalls zum Umfang der
Erfindung und können
auf der Grundlage der differentiell exprimierten Gen-200-Nukleotide
und Aminosäuresequenzen,
die in diesem Abschnitt und oben im Abschnitt 5.4 offenbart sind,
gestaltet sein. Zu solchen Fusionsproteinen gehören insbesondere IgFC-Fusionen, die das
differentiell exprimierte oder Pathway-Gen stabilisieren und das
Halbleben in vivo verlängern;
oder Fusionen mit einer beliebigen Aminosäuresequenz, die es dem Fusionsprotein
erlauben, an der Zellmembran verankert zu werden und dass Peptide
an der Zelloberfläche
gezeigt werden, oder Fusionen mit einem Enzym, fluoreszierenden
Protein oder lumineszenten Protein, die eine Markerfunktion bereitstellen.
-
Andere
Mutationen an der Kodiersequenz des Produktes differentiell exprimierter
oder Pathway-Gene können produziert
werden, um Polypeptide zu generieren, die besser für die Expression,
das Scale-up usw. in den gewählten
Wirtszellen geeignet sind. Beispielsweise können Cystein-Reste gelöscht oder
durch eine andere Aminosäure
ersetzt werden, um Disulfidbrücken
zu eliminieren; im Falle abgesonderter oder transmembraner Proteine
können
N-verbundene Glykosylierungsstelle verändert oder eliminiert werden,
um beispielsweise die Expression eines homogenen Produktes zu erreichen,
das leichter aus Hefewirten, von denen bekannt ist, dass sie N-verbunde
Stellen hyperglykosylieren, entnommen und gereinigt werden kann.
Zu diesem Zweck werden verschiedene Aminosäuresubstitutionen an einer
oder beiden der ersten oder dritten Aminosäurepositionen von einer oder
mehreren beliebigen Erkennungssequenzen für die Glykosylierung (N-X-S oder
N-X-T) und/oder eine Aminosäurendeltion
an der zweiten Position einer oder mehrerer beliebiger solcher Erkennungssequenzen
die Glykosylierung des Proteins an der modifizierten Tripeptidsequenz
verhindern. (Siehe, z.B. Miyajima u.a., 1986, EMBO J. 5 (6): 1193–1197).
-
Die
Produkte differentiell exprimierter oder Pathway-Gene können durch Synthesetechniken
oder über rekombinante
DNA-Technologie unter Verwendung von Techniken hergestellt werden,
die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. So werden in dieser Patentschrift
Verfahren zur Herstellung der differentiell exprimierten oder Pathway-Gen-Polypeptide
und -Peptide der Erfindung beschrieben. Erstens können die
Polypeptide und Peptide der Erfindung mit Techniken, die auf dem
Fachgebiet gut bekannt sind, synthetisiert oder hergestellt werden.
Siehe beispielsweise Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular
Principles, W. H. Freeman and Co., N. Y., was per Verweis in diese
Patentschrift eingebunden ist. Peptide können beispielsweise auf einer festen
Unterlage oder in Lösung
synthetisiert werden.
-
Alternativ
können
rekombinante DNA-Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, benutzt
werden, um Expressionsvektoren zu erstellen, die Kodiersequenzen
des differentiell exprimierten oder Pathway-Genproteins und geeignete
Steuersignale für
Transkriptions/Translation enthalten. Zu diesen Verfahren gehören beispielsweise
rekombinante in-vitro DNA-Techniken, Synthesetechniken und in-vivo
Rekombination/genetische Rekombination. Siehe beispielsweise die
Techniken, die bei Sambrook u.a., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., was
per Verweis in diese Patentschrift eingebunden ist, und bei Ausubel,
1989, supra beschrieben sind. Alternativ kann RNA, die zur Kodierung
von Proteinsequenzen von differentiell exprimierten oder Pathway-Genen
fähig ist,
chemisch synthetisiert werden, beispielsweise unter Verwendung von
Synthetisierern. Siehe beispielsweise die Techniken, die bei Gait,
M. J., Hrsg., 1984, „Oligonukleotide
Synthesis", IRL
Press, Oxford, was per Verweis in diese Patentschrift eingebunden
ist, beschrieben sind.
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Es
können
verschiedene Wirt-Expressionsvektorsysteme genutzt werden, um die
Kodiersequenzen von differentiell exprimierten oder Pathway-Genen
der Erfindung zu exprimieren. Solche Wirt-Expressionssyteme stellen
Vehikel dar, mit denen die fraglichen Kodiersequenzen produziert
und dann gereinigt werden können,
sie stellen aber auch Zellen dar, die, wenn mit den geeigneten Nukleotidkodiersequenzen
transformiert oder transfiziert, das Protein des differentiell exprimierten
oder Pathway-Gens der Erfindung in situ zeigen. Zu diesen gehören insbesondere
Mikroorganismen wie Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), die mit
Expressionsvektoren aus rekombinanter Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA
oder Kosmid-DNA transformiert wurden, welche die Proteinkodiersequenzen
des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens enthalten; Hefen
(z.B. Saccharomyces, Pichia), die mit rekombinanten Hefe Expressionsvektoren
transformiert wurden, welche die Proteinkodiersequenten des differentiell
exprimierten oder Pathway-Gens enthalten; Insektenzellsysteme, die mit
rekombinanten Viren-Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infiziert
wurden, welche die Proteinkodiersequenten des differentiell exprimierten
oder Pathway-Gens enthalten; Planzenzellsysteme die mit rekombinanten
Viren-Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus,
TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid)
transformiert wurden, welche die Proteinkodiersequenten des differentiell
exprimierten oder Pathway-Gens enthalten; oder Säugetier-Zellsysteme (z.B. COS,
CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressionsprodukte beherbergen,
welche Promotoren enthalten, die vom Genom von Säugetierzellen (z.B. Metallohioneinpromotor)
oder von Säugetierviren
(z.B. später Promotor
des Adenovirus; der Promotor des Vacciniavirus 7.5K) abgeleitet
sind.
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In
bakteriellen Systemen können
eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhaft ausgewählt werden, in
Abhängigkeit
von der beabsichtigten Verwendung des Proteins des differentiell
exprimierten oder Pathway-Gens,
das exprimiert wird. Wenn beispielsweise eine große Menge
eines solchen Proteins produziert werden soll, beispielsweise zur
Generierung von Antikörpern
oder zur Überprüfung einer
Peptidbibliothek, können
Vektoren wünschenswert
sein, die die Expression hoher Grade von Fusionsproteinprodukten,
die einfach gereinigt werden, veranlassen. Zu solchen Vektoren gehören insbesondere
der Expressionsvektor pUR278 des E. coli (Ruther u.a., 1983, EMBO
J. 2: 1791), bei dem die Proteinkodiersequenten des differentiell
exprimierten oder Pathway-Gens individuell in den Vektor im Rahmen
mit der lacZ-Kodierregion ligiert werden können, so dass ein Fusionsprotein
produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res.
13: 3101–3109;
Van Heeke & Schuster,
1989, J. Biol. Chem. 264: 5503–5509)
und ähnliche.
pGEX-Vektoren können ebenfalls
benutzt werden, um fremde Polypeptide mit Gluthion-S-Transferase
(GST) als Fusionsproteine zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche
Fusionsproteine löslich
und können
leicht durch Anlagerung an Glutathion-Agarose-Kügelchen und nachfolgend durch
Elution in Anwesenheit von freiem Gluthathion aus lysierten Zellen
gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren sind so beschaffen, dass sie
Abspaltungsstellen für Thrombin
oder Faktor-Xa-Protease enthalten, so dass das klonierte Target-Genprotein
von der GST-Moietät gelöst werden
kann.
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In
einem Insektensystem wird der Nuklearpolyhedrose-Virus Autographa californica (AcNPV)
als ein Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Der Virus
wächst
in Spodoptera-frugiperda-Zellen. Die Kodiersequenz des differentiell
exprimierten oder Pathway-Gens kann individuell in die nicht lebenswichtigen
Regionen (beispielsweise das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert
und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (beispielsweise des
Polyhedrin-Promotors) gestellt werden. Die erfolgreiche Einsetzung
der Kodiersequenz des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens
wird zur Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und zur Produktion eines
nicht-okkludierten
rekombinanten Virus (d.h. eines Virus, dem der Proteinmantel fehlt,
für den
das Polyhedrin-Gen kodiert) führen.
Diese rekombinanten Viren werden dann benutzt, um Spodoptera-frugiperda-Zellen,
in denen das eingesetzte Gen exprimiert ist, zu infizieren (z.B.
siehe Smith u.a., 1983, J. Viol. 46: 584; Smith US-Patentschrift 4,215,051).
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In
Säugetier-Wirtszellen
kann eine Anzahl von viral-basierten
Expressionssystemen benutzt werden. In Fällen, in denen ein Adenovirus
als ein Expressionsvektor benutzt wird, kann die fragliche Kodiersequenz des
differentiell exprimierten oder Pathway-Gens an einen Transkriptions-/Translations-Steuerkomplex, z.B. an
den späten
Promotor und die tripartite Leadersequenz) angelagert sein. Dieses
chimärische
Gen kann dann durch Rekombination in vitro oder in vivo in das Adenovirusgenom
eingesetzt werden. Das Einsetzen in eine nicht-lebensnotwendige
Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) wird zu einem
rekombinanten Virus führen,
der lebensfähig
und in der Lage ist, ein Protein des differentiell exprimierten
oder Pathway-Gens in infizierten Wirten zu exprimieren (z.B. siehe
Logan & Shenk,
1984, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 3655–3659). Spezifische Initiationssignale
können
ebenfalls zur effizienten Translation eingesetzter Kodiersequenzen
des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens notwendig sein.
Zu diesen Signalen gehören
das ATG-Initiationskodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, in
denen ein gesamtes differentiell exprimiertes oder Pathway-Gen,
einschließlich
seines eigenen Initiationskodons und benachbarter Sequenzen, in
den geeigneten Expressionsvektor einsetzt wird, können zusätzliche
Translationssteuersignale unnötig
sein. In Fällen jedoch,
in denen nur ein Abschnitt der Kodiersequenz des differentiell exprimierten
oder Pathway-Gens eingesetzt wird, müssen exogene Translationssteuersignale,
einschließlich
vielleicht des ATG-Initiationskodons, bereitgestellt werden. Daneben
muss das Initiationskodon in Phase mit dem Leserahmen der gewünschten
Kodiersequenz sein, um die Translation des gesamten Einsatzes sicherzustellen.
Diese exogenen Translationssteuersignale und Initiationskodone können verschiedener
Herkunft, sowohl synthetischer als auch natürlicher, sein. Die Effizienz
der Expression kann durch das Einschließen von geeigneten Transkriptions-Enhancerelementen,
Transkriptionsterminatoren usw. gefördert werden (siehe Bittner
u.a., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516–544).
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Außerdem kann
ein Wirtszellenstamm ausgewählt
werden, der die Expression der eingesetzten Sequenzen moduliert
oder das Genprodukt in der spezifisch gewünschten Weise modifiziert und
verarbeitet. Solche Modifikationen (z.B. Glykosilierung) und Verarbeitung
(z.B. Abspaltung) der Proteinprodukte kann für die Funktion des Proteins
wichtig sein. Unterschiedliche Wirtszellen haben charakteristische
und spezifische Mechanismen zur post-translationalen Verarbeitung
und Modifizierung von Proteinen. Es können geeignete Zelllinien oder
Wirtssysteme ausgewählt
werden, um die korrekte Modifizierung und Verarbeitung des fremden
exprimierten Proteins sicherzustellen. Zu diesem Zweck können eukaryotische
Wirtszellen verwendet werde, die die zelluläre Maschinerie zur richtigen
Verarbeitung des primären
Transkripts, zur Glykosilierung und zur Phosphorylisierung der Genprodukte
besitzen. Zu solchen Säugetier-Wirtszellen
gehören
insbesondere CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 usw.
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Zur
langfristigen, hochergiebigen Produktion von rekombinanten Proteinen
wird stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien,
die das Protein des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens stabil exprimieren,
erzeugt werden. Statt Expressionsvektoren zu benutzen, die virale
Ursprünge
der Replikation enthalten, können
Wirtszellen mit DNA, die von geeigneten Expressionssteuerelementen
(z.B. Promotoren, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren,
Polyadenylationsstellen usw.) gesteuert wird, und einem wählbaren
Marker transformiert werden. Nach der Einführung der fremden DNA können veränderte Zellen 1–2 Tage
in einem angereicherten Medium zum wachsen angesetzt und dann in
ein selektives Medium versetzt werden. Der wählbare Marker im rekombinanten
Plasmid gibt Widerstand bei die Selektion und ermöglicht es
den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren
und zu wachsen, um Foci zu bilden, die ihrerseits kloniert und zu
Zelllinien erweitert werden können.
Dieses Verfahren kann vorteilhaft verwendet werden, um Zelllinien
zu erzeugen, die das Protein des differentiell exprimierten oder
Pathway-Gens exprimieren. Solche veränderten Zelllinien können besonders
nützlich
bei der Überprüfung und
Bewertung von Verbindungen sein, die die endogene Aktivität des Proteins
des differentiell exprimierten oder Pathway-Gens beeinflussen.
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Es
kann eine Anzahl von Auswahlsystemen verwendet werden, insbesondere
können
die Herpes Simplex Virus-Thymidinkinase-
(Wigler u.a., 1977, Cell 11: 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase- (Szybalska & Szybalski, 1962,
Proc: Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und die Adenin-Phosphoribosyltransferase- (Lowy u.a., 1980,
Cell 22: 817) Gene in tk–-, hgprt–- bzw. aprt–-Zellen
eingesetzt werden. Antimetabolit-Widerstand
kann ebenfalls als Grundlage benutzt werden für die Selektion von Genen für dhfr,
das Widerstand gegen Methotrexat gibt (Wigler u.a., 1980, Natl.
Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare
u.a., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); für gpt, das
Widerstand gegen Mycophenolsäure
gibt (Mulligan & Berg,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072), für neo, das Widerstand gegen
das Aminoglykosid G-418 gibt (Colberre-Garapin u.a., 1981, J. Mol.
Biol. 150: 1) und für
hygro, das Widerstand gegen Hygromycin gibt (Santerre u.a., 1984,
Gene 30: 147).
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Alternativ
kann ein beliebiges Fusionsprotein einfach gereinigt werden, indem
ein Antikörper,
der spezifisch für
das Fusionsprotein ist, das exprimiert wird, benutzt wird. Beispielsweise
erlaubt ein von Janknecht u.a. beschriebenes System die leichte
Reinigung von nicht-denaturierten Fusionsprotein, die in humanen
Zelllinien exprimiert sind (Janknecht u.a., 1991, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88: 8972–8976).
In diesem System wird das fragliche Gen so in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid
subkloniert, dass der offene Leserahmen des Gens translational an
einen Aminosäureanhang,
der aus sechs Histidinresten besteht, angelagert wird. Extrakte
aus Zellen, die mit einem rekombinanten Vacciniavirus infiziert
sind, werden auf Ni2+-Nitriloethansäure-Agarose-Säulen geladen,
und Proteine mit Histidin-Anhang werden selektiv mit Imidazol-haltigen
Puffern eluiert.
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Wenn
es als Bestandteil in einem Assay-System wie den vorliegend beschriebenen
benutzt wird, kann das differentiell exprimierte oder Pathway-Gen
entweder direkt oder indirekt markiert werden, um den Nachweis eines
Komplexes zu erleichtern, der zwischen dem Protein des differentiell
exprimierten oder Pathway-Gens
und der Testsubstanz gebildet wurde. Jedes beliebige von verschiedenen
geeigneten Markersystemen kann benutzt werden, insbesondere Radioisotope
wie 125I; Enzymmarkersysteme, die ein nachweisbares
colorimetrisches Signal oder Licht generieren, wenn sie einem Substrat
ausgesetzt werden; und fluoreszierende Marker.
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Indirektes
Markieren beinhaltet die Benutzung eines Proteins, wie etwa einen
markierten Antikörper, das
spezifisch an ein Genprodukt entweder des differentiell exprimierten
oder des Pathway-Gens bindet. Zu solchen Antikörpern gehören insbesondere polyklonale,
monoklonale, chimärische,
einkettige, Fab-Fragmente und Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek
produziert werden.
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Wird
rekombinante DNA-Technologie benutzt, um das Protein des differentiell
exprimierten oder Pathway-Gens
für solche
Assay-Systeme zu produzieren, kann es vorteilhaft sein, Fusionsproteine
zu erzeugen, die das Markieren (entweder direkt oder indirekt),
die Immobilisierung, die Löslichkeit
und/oder den Nachweis erleichtern.
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Zu
den Fusionsproteinen, die die Löslichkeit
und/oder Expression erleichtern können und das Halbleben des
Proteins in Blut erhöhen
können,
können
insbesondere lösliche
Ig-geschweifte Fusionsproteine gehören. Verfahren zur Erzeugung
solcher löslichen
Ig-geschweiften
Anlagerungsproteine sind dem Fachmann gut bekannt. Siehe beispielsweise
US-Patentschrift 5,116, 964, die per Verweis in diese Patentschrift
eingebunden ist.
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Daneben
kann zusätzlich
zur Ig-Region, die durch den IgG1-Vektor kodiert wird, der Fc-Abschnitt
der genutzten Ig-Region durch Aminosäurensubstitution modifiziert
werden, um Komlemtaktivierung und Fc-Anlagerung zu reduzieren. (Siehe z.B.
EP 239 400 B1 ,
3. August 1994).
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Unter
den löslichen
Ig-geschweiften Fusionsproteinen, die produziert werden können, befinden
sich lösliche
Ig-geschweifte Fusionsproteine, die Gen-200-Produkte enthalten.
Das Gen 200, das in solchen Fusionsproteinen enthalten ist, kann
beispielsweise jeweils die extrazelluläre Domäne des Gens 200 oder Abschnitte
davon, vorzugsweise Ligand-bindende Abschnitte, umfassen.
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Die
Signalsequenz, extrazelluläre,
transmembrane und zytoplasmatische Domänen sowohl der murinen als
auch der humanen Gen-200-Produkte sind erklärt worden und können beispielsweise
für die
Konstruktion von Ig-Fusionsproteinen
des Gen-200-Produkts genutzt werden. Insbesondere das murine Gen-200-Produkt
mit 280 Aminosäuren
(17A–17D;
SEQ-ID-Nr.: 10) enthält
eine Signalsequenz von etwa Aminosäurerest 1 bis etwa etwa Aminosäurerest
20, eine extrazelluläre
Domäne
von etwa Aminosäurerest
21 bis etwa Aminosäurerest
192, eine transmembrane Domäne
von etwa Aminosäurerest
193 bis etwa Aminosäurerest 214
und eine zytoplasmatische Domäne
von etwa Aminosäurerest
215 bis Aminosäurerest
280. Daneben enthält
das humane Gen-200-Produkt mit 301 Aminosäuren (24A–24D; SEQ-ID-Nr.: 24) eine Signalsequenz von
Aminosäurerest
1 bis etwa 20, eine reife extrazelluläre Domäne von etwa Aminosäurerest
21 bis 200, eine transmembrane Domäne von etwa Aminosäurerest
201 bis 224 und eine zytoplasmatische Domäne von etwa Aminosäurerest
225 bis 310. Mit der Erläuterung
dieser Domänen
wäre ein
Fachmann ohne Weiteres in der Lage, Fusionsproteine für das lösliche Ig-geschweifte
Gen-200-Produkt zu produzieren. Das unten in Abschnitt 10 präsentierte
Beispiel beschreibt die Konstruktion von murinen und humanen Ig-Fusionsproteinen
des Gen-200-produktes.
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5.6 FÜR DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE
ODER PATHWAY-GEN-PRODUKTE
SPEZIFISCHE ANTIKÖRPER
-
In
dieser Patentschrift sind Verfahren für die Produktion von Antikörpern beschrieben,
die in der Lage sind, ein oder mehrere Epitope des Produktes differentiell
exprimierter oder Pathway-Gene spezifisch zu erkennen. Zu solchen
Antikörpern
können
insbesondere polyklonale Antikörper,
monoklonale Antikörper
(mAbs), humanisierte oder chimärische
Antikörper,
einkettige Antikörper,
Fab-Fragmente, F(ab')
2-Fragmente, Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek
produziert wurden, anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper und Epitop-bindende
Fragmente jedes der oben genannten Antikörper gehören. Die Ig-Schweife solcher
Antikörper können modifiziert
sein, um Komplemetaktivierung und Fc-Bindung zu reduzieren. (siehe
beispielsweise
EP 239
400 B1 , 3. August 1994).
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Solche
Antikörper
können
beispielsweise bei dem Nachweis eines Produktes eines Fingerprint-,
Target- oder Pathway-Gens
in einer biologischen Probe benutzt werden, und sie können als
Teil von Diagnosetechniken benutzt werden. Alternativ können solche
Antikörper
als Teil eines Behandlungsverfahrens für Immunstörungen wie unten in Abschnitt
5.9 beschrieben benutzt werden. Beispielsweise können die Antikörper benutzt
werden, um die Aktivität
eines Target-Gens zu modulieren, um die Differenzierungs-, Erhaltungs- und/oder
Effektorfunktion von TH-Zell-Subpopulationen zu modulieren oder,
im Fall von Antikörpern,
die auf Epitope der Zelloberfläche
gerichtet sind, um eine fragliche TH-Zell-Subpopulation zu isolieren,
entweder zum Zwecke des Abbaus oder der Vermehrung.
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Zur
Produktion von Antikörpern
gegen ein differentiell exprimiertes oder Pathway-Gen können verschiedene
Wirtstiere durch Injektion mit einem Protein des differentiell exprimierten
oder Pathway-Gens oder eines Abschnitts davon immunisiert werden.
Zu solchen Wirtstieren können
insbesondere Kaninchen, Mäuse und
Ratten gehören,
um nur einige wenige zu nennen. Es können verschiedene Zusatzstoffe
verwendet werden, um die Immunreaktion in Abhängigkeit von der Wirtsspezies
zu erhöhen,
insbesondere Freunds (komplett und inkomplett), Mineralgele wie
Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive
Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen,
Keyhole-Limpet-Hämocynin,
Dinitrophenol und potentiell nützliche
Zusatzstoffe wie BCG (Bacille Calmette-Guérin)
und Corynebacterium parvum.
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Polyklonale
Antikörper
sind heterogene Populationen von Antikörper-Molekülen, die aus Seren von Tieren
abgeleitet werden, welche mit einem Antigen wie einem Target-Genprodukt
oder einem antigenischen funktionalen Derivat davon, immunisiert
wurden. Zur Produktion von polyklonalen Antikörpern können Wirtstiere wie die oben
beschriebenen durch Injektion mit einem Produkt des differentiell
exprimierten oder Pathway-Gens unter Zusatz von Zusatzstoffen, ebenfalls
wie oben beschrieben, immunisiert werden.
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Monoklonale
Antikörper,
bei denen es sich um homogene Populationen von Antikörpern gegen
ein bestimmtes Antigen handelt, können mit jeder Technik gewonnen
werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien-Kulturen
ermöglicht.
Zu diesen Techniken gehören
insbesondere die Hybridoma-Technik
nach Köhler
und Milstein (1975, Nature 256: 495–497; und US-Patentschrift
4,376,110), die Hybridoma-Technik
aus humanen B-Zellen (Kosbor u.a., 1983, Immunology Today 4: 72;
Cole u.a., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 2026–2030) und
die EBV-Hybridoma-Technik
(Cole u.a., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan
R. Liss, Inc, S. 77–96).
Solche Antikörper
können
einer der Immunglobinklassen, einschließlich IgG, IgM, igE, IgA, IgD,
und jeder ihrer Unterklassen angehören. Das Hybridoma, das die
mAbs dieser Erfindung produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert
werden. Die Produktion von hohen Titern von mAbs in vivo macht dies
zum gegenwärtig
bevorzugten Produktionsverfahren.
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Außerdem können Techniken
benutzt werden, die für
die Produktion „chimärischer
Antikörper" entwickelt wurden,
bei denen die Gene aus einem Antikörpermolekül einer Maus mit geeigneter
Antigen-Spezifität mit
einem humanen Antigenmolekül
mit geeigneter biologischer Aktivität gespleißt werden (Morrison u.a., 1984,
Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6851–6855; Neuberger u.a., 1984,
Nature 312: 604–608,
Takeda u.a., 1985, Nature 314: 452–454; US-Patentschrift 4,816,567).
Ein chimärischer
Antikörper
ist ein Molekül,
bei dem verschiedene Abschnitte von verschiedenen Tierspezies abgeleitet
sind, wie etwa solche mit einer variablen Region, die von einem
murinen mAb und einer konstanten Region humanen Immunglobins abgeleitet
sind.
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Alternativ
können
Techniken, die für
die Produktion von einkettigen Antikörpern (US-Patentschrift 4,946,778;
Bird, 1988, Science 242: 423–426;
Huston u.a. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879–5883 und Ward
u.a., 1989; Nature 334: 544–546)
und für
die Herstellung humanisierter monoklonaler Antikörper (US-Patentschrift 5,225,539, die per Verweis
in diese Patentschrift eingebunden ist) beschrieben wurden, benutzt
werden, um Antikörper
gegen das Produkt eines differentiell exprimierten oder Pathway-Gens
zu produzieren.
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Antikörperfragmente,
die bestimmte Epitope erkennen, können durch bekannte Techniken
generiert werden. Beispielsweise gehören zu solchen Fragmenten insbesondere:
die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsinverdauung des
Antikörpermoleküls produziert
werden können,
und die Fab-Fragmente, die durch Reduzieren der Sulfidbrücken des
F(ab')2-Fragments
generiert werden können.
Alternativ können
Fab-Expressionsbibliotheken
aufgebaut werden (Huse u.a., 1989, Science 246: 1275–1281),
um die schnelle und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente
mit der gewünschten
Spezifität
zu ermöglichen.
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Antikörper gegen
die Produkte eines differentiell exprimierten oder Pathway-Gens
können
wiederum genutzt werden, um anti-idiotypische Antikörper, die
solche Genprodukte „imitieren", zu generieren,
wobei Techniken benutzt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt
sind. (Siehe, z.B. Greenspan & Bona,
1993, FASEB J. 7 (5): 437–444
und Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147 (8): 2429–2438). Beispielsweise können im
Falle von Molekülen
des Rezeptortyps (z.B. Produkte der Gene 10, 103 und 200) Antikörper, die
an die ECD binden und konkurrierend die Bindung von Liganden an
den Rezeptor hemmen, benutzt werden, um Anti-Idiotypen zu generieren,
die die ECD „imitieren" und daher den Liganden
binden und neutralisieren. Solche neutralisierenden Anti-Idiotypen
oder Fab-Fragmente solcher Anti-Idiotypen können in therapeutischen Kurbehandlungen bei
durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen genutzt werden.
-
ZELLBASIERTE
ASSAYS
-
Zellen,
die Target-Gen-Sequenzen, welche Proteine des Target-Gens kodieren,
enthalten und exprimieren und die außerdem zelluläre Phänotypen
zeigen, die mit einer fraglichen, durch TH-Zell-Subpopulationen
bedingten Störung
einhergehen, können
benutzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Fähigkeit
zeigen, Symptome von durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen zu
lindern. Zu den zellulären
Phänotypen,
die die Fähigkeit
anzeigen können,
Symptome von durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen zu
lindern, gehören
beispielsweise eine Hemmung oder Potenzierung der Expression von
Zytokin oder Zelloberflächenmarkern,
die mit der fraglichen TH-Zellen-Subpopulation
einhergeht, oder alternativ eine Hemmung oder Potenzierung spezifischer
TH-Zellen-Subpopulationen.
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Daneben
kann das Fingerprintmuster der Genexpression fraglicher Zellen analysiert
und mit dem normalen Fingerprintmuster verglichen werden, das nicht
durch eine durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störung gestört ist.
Diejenigen Verbindungen, die Zellen, welche zelluläre Phänotypen
zeigen, die ähnlich
den durch TH-Zell-Subpopulationen bedingte Störungen sind, dazu veranlasst,
ein Fingerprintmuster zu produzieren, das eher einem für die fragliche
Zelle normalen Fingerprintmuster entspricht, können als Kandidaten betrachtet
werden für
weitere Tests hinsichtlich der Fähigkeit,
Symptome einer durch TH-Zell-Subpopulationen bedingten Störung zu
lindern.
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Zu
den Zellen, die für
solche Assays benutzt werden können,
können
beispielsweise nicht-rekombinante Zelllinien wie Dorris-, AE7-,
DAX-, D10.G4-, D1.1- und CDC25-Zelllinien gehören. Außerdem können gereinigte primäre naive
T-Zellen, die entweder aus transgenischen oder nicht-transgenischen
Stämmen
abgeleitet sind, benutzt werden.
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Daneben
können
zu den Zellen, die für
solche Assays benutzt werden können,
auch rekombinante, transgenische Zelllinien gehören. Beispielsweise können die
Tiermodelle der Erfindung für
durch TH-Zell-Subpopulationen
bedingte Störungen,
die oben in Abschnitt 5.7.1 diskutiert wurden, benutzt werden, um
beispielsweise TH1-artige und/oder TH2-artige Zelllinien zu generieren,
die als Zellkulturmodelle für
die fragliche Störung
benutzt werden können.
Obwohl Primärkulturen,
die aus transgenischen Tieren mit durch TH-Zell-Subpopulationen
bedingte Störungen
abgeleitet wurden, benutzt werden können, wird die Generierung
von kontinuierlichen Zelllinien bevorzugt. Zu Beispielen für Techniken,
die genutzt werden können,
um eine kontinuierliche Zelllinie aus transgenischen Tieren abzuleiten,
siehe Small u.a., 1985, Mol. Cel Biol. 5: 642–648.
-
Alternative
können
Zellen eines Zelltyps, von dem bekannt ist, dass er mit durch TH-Zell-Subpopulationen
bedingte Störungen
im Zusammenhang steht, mit Sequenzen transfiziert werden, die in
der Lage sind, das Ausmaß der
Expression des Target-Gens innerhalb der Zelle zu vergrößern oder
zu verkleinern. Beispielsweise können
Target-Gen-Sequenzen in das Genom der fraglichen Zelle eingeführt und
dort überexprimiert werden,
oder, falls Sequenzen eines endogenen Target-Gens vorliegen, können diese
entweder überexprimiert
werden oder alternativ unterbunden werden, um die Exprimierung des
Target-Gens zu unterexprimieren oder zu deaktivieren.
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Um
eine Target-Gensequenz zu überexprimieren,
kann der Kodierabschnitt der Target-Gensequenz an eine regulierende
Sequenz angelagert werden, die in der Lage ist, die Genexpression
in dem fraglichen Zelltyp anzutreiben. Solche regulierenden Sequenzen
werden dem Fachmann bekannt sein und können ohne unnötiges Experimentieren
benutzt werden.
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Zur
Unterexpression einer Sequenz eines endogenen Target-Gens kann eine
solche Sequenz isoliert und so verändert werden, dass, wenn sie
wieder in das Genom des fraglichen Zelltyps eingefügt wird,
die Allele des endogenen Target-Gens deaktiviert werden. Vorzugsweise
wird die veränderte
Target-Gensequenz so über
Gen-Targeting eingeführt, dass
die endogene Target-Sequenz nach Einfügung der veränderten
Target-Gensequenz in das Genom der Zelle unterbunden wird. Gen-Targeting
ist oben in Abschnitt 5.7.1 beschrieben.
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Transfektion
von Nukleinsäure
der Target-Gensequenz kann unter Nutzung standardmäßiger Techniken
durchgeführt
werden. Siehe beispielsweise Ausubel, 1989, supra. Transfizierte
Zellen sollten auf das Vorhandensein der rekombinanten Target-Gensequenzen,
auf Expression und Akkumulation von mRNa des Target-Gens und auf das
Vorhandensein von Produktion des Proteins des Target-Gens geprüft werden.
In Fällen, in
denen eine Verminderung der Expression des Target-Gens gewünscht ist,
können
Standardtechniken benutzt werden, um zu zeigen, ob eine Verminderung
der Expression des endogenen Target-Gens und/oder der Produktion
eines Target-Genprodukts erreicht wird.
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5.8 SCREENING ASSAYS FÜR ZUSAMMENSETZUNGEN,
DIE MIT DEM TARGET-GENPRODUKT INTERAGIEREN
-
Die
folgenden Assays sind dafür
vorgesehen, Verbindungen zu identifizieren, die an Target-Genprodukte binden,
an andere zelluläre
Proteine binden, die mit dem Target-Genprodukt interagieren oder
an Verbindungen, die die Interaktion des Target-Genproduktes mit anderen zellulären Proteinen
stören.
Beispielsweise können
im Fall des Gen-200-Produktes, bei dem davon ausgegangen wird, dass
es sich um ein transmembranes Rezeptorprotein handelt, solche Techniken
Liganden für
solche Rezeptoren identifizieren. Ein Ligand für das Gen-200-Produkt kann
beispielsweise als Grundlage für
die Linderung von TH-spezifischen
Störungen auftreten.
-
Zu
den Zusammensetzungen können
insbesondere andere zelluläre
Proteine gehören.
Daneben können
zu solchen Zusammensetzungen Peptide gehören wie beispielsweise lösliche Peptide,
insbesondere Ig-geschweifte Fusionspeptide, die extrazelluläre Abschnitte
transmembraner Rezeptoren für
das Target-Genprodukt umfassen, Angehörige von Random-Peptidbibliotheken
(siehe z.B. Lam, K.S. u.a., 1991, Nature 354: 82–84; Houghton, R. u.a., 1991,
Nature 354: 84–86),
die aus Aminosäuren
der D- und/oder L-Konfiguration aufgebaut sind, Phosphopeptide (insbesondere
Mitglieder von teilweise degenerierten, gerichteten oder von Random-Phosphopeptidbibliotheken;
siehe z.B. Songyang, Z. u.a., 1993, Cell 72: 767–778), Antikörper (insbesondere
polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimärische oder
einkettige Antikörper und
Biblotheksfragmente von FAb-, F(ab')2- und FAb-Expressionen
sowie Epitop-bindende Fragmente davon) und kleine organische und
anorganische Moleküle.
Im Falle von Targetmolekülen
des Rezeptortyps können
zu solchen Verbindungen organische Moleküle (z.B. Peptidomimetika) gehören, die
an die ECD binden und die Aktivität imitieren, die von dem natürlichen
Liganden (z.B. Agonisten) ausgelöst
wird; sowie Peptide, Antikörper oder
Fragmente davon und andere organische Verbindungen, die die ECD
imitieren (oder einen Abschnitt davon) und einen natürlichen
Liganden binden, um ihn zu „neutralisieren".
-
Computermodell
und -durchsuchungstechnologien ermöglichen die Identifizierung
von Verbindungen oder die Verbesserung bereits identifizierter Verbindungen,
die die Expression oder Aktivität
von Target- oder Pathway-Genen modulieren können. Ist solch eine Verbindung
oder Zusammensetzung identifiziert, werden die aktiven Stellen oder
Regionen identifiziert.
-
Im
Falle von Verbindungen, die Rezeptormoleküle beeinflussen, könnten solche
aktiven Stellen typischerweise Ligand-bindende Plätze sein
wie etwa die Interaktionsdomänen
zwischen Ligand und dem Rezeptor selbst. Die aktive Stelle kann
mit Verfahren identifiziert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt
sind, beispielsweise aus den Aminosäuresequenzen von Peptiden,
aus den Nukleotidsequenzen von Nukleinsäuren oder aus der Untersuchung
von Komplexen aus der betreffenden Verbindung oder Zusammensetzung
und ihrem natürlichen
Liganden. In letzterem Fall können
chemische oder Röntgenkristallographie-Verfahren
benutzt werden, um die aktive Stelle zu finden, indem herausgefunden
wird, wo auf dem Faktor sich der komplexierte Ligand befindet.
-
Danach
wird die drei-dimensionale geometrische Struktur der aktiven Stelle
bestimmt. Dies kann mit bekannten Verfahren geschehen, einschließlich der
Röntgenkristallographie,
die eine komplette molekulare Struktur bestimmen kann. Andererseits
kann NMR in fester oder flüssiger
Phase genutzt werden, um bestimmte intramolekulare Distanzen zu
bestimmen. Es kann jedes andere experimentelle Verfahren zur Strukturbestimmung
genutzt werden, um partielle oder vollständige geometrische Strukturen
zu erhalten. Die geometrischen Strukturen können mit einem komplexierten
Liganden, natürlich
oder künstlich,
vermessen werden, was die Genauigkeit der Struktur der bestimmten
aktiven Stelle erhöht.
-
Wird
eine unvollständige
oder nicht ausreichend genaue Struktur bestimmt, können die
Verfahren Computergestützter
numerischer Modelle genutzt werden, um die Struktur zu vervollständigen oder
ihre Genauigkeit zu erhöhen.
Jedes anerkannte Modellverfahren kann genutzt werden, einschließlich parameterisierter
Modelle, die spezifisch für
bestimmte Biopolymere wie Proteine oder Nukleinsäuren sind, Molekulardynamik-Modelle
auf der Grundlage von Computerberechnungen der Molekularbewegungen,
Modelle statistischer Mechanik auf der Grundlage thermischer Ensembles,
oder kombinierte Modelle. Für
die meisten Modellarten sind standardmäßige molekulare Kraftfelder
nötig,
die die Kräfte
zwischen enthaltenen Atomen und Gruppen darstellen, und können aus
den Kraftfeldern, die aus der physikalischen Chemie bekannt sind,
ausgewählt werden.
Die unvollständigen
oder weniger genauen experimentellen Strukturen können als
Beschränkungen der
vollständigen
oder genaueren Strukturen, die mit diesen Modellverfahren berechnet
werden, dienen.
-
Schließlich können, wenn
die Struktur des aktiven Platzes entweder experimentell, durch Modelle
oder in Kombination bestimmt ist, potentielle modulierende Verbindungen
identifiziert werden über
das Recherchieren von Datenbanken, welche Verbindungen sowie Informationen
zu deren molekularer Struktur enthalten. Solch eine Recherche sucht
nach Verbindungen mit Strukturen, die auf die bestimmte Struktur
der aktiven Stelle passen und die mit den Gruppen, die die aktive
Stelle definieren, interagieren. Solch eine Recherche kann manuell
geschehen, ist aber vorzugsweise Computer-gestützt. Diese Verbindungen, die
in dieser Recherche gefunden werden, sind potentielle modulierende
Verbindungen für
Target- oder Pathway-Gene.
-
Alternativ
können
diese Verfahren genutzt werden, um verbesserte modulierende Verbindungen
aus einer bereits bekannten modulierenden Verbindung oder einem
modulierenden Liganden zu identifizieren. Die Zusammensetzung der
bekannten Verbindung kann verändert
werden und die strukturellen Auswirkungen der Veränderung
können
bestimmt werden, indem die oben beschriebenen experimentellen und
Computermodell-Verfahren
auf die neue Verbindung angewendet werden. Die veränderte Struktur
wird dann mit der Struktur der aktiven Stelle der Verbindung verglichen,
um zu bestimmen, ob eine bessere Passform oder Interaktion daraus
resultiert. Auf diese Weise können
systematische Variationen in der Zusammensetzung, wie etwa durch
Variieren der Seitengruppen, schnell geprüft werden, um veränderte modulierende
Verbindungen oder Liganden von verbesserter Spezifität oder Aktivität zu erhalten.
-
Weitere
experimentelle und Computermodell-Verfahren, die zum Identifizieren
modulierender Verbindungen auf der Grundlage der Identifikation
der aktiven Stellen von Target- oder Pathway-Genen bzw. Genprodukten
und der damit verbundenen Transduktions- und Transkriptionsfaktoren
nützlich
sind, werden dem Fachmann offensichtlich sein.
-
Beispiele
für molekulare
Modellsysteme sind die Programme CHARMm und QUANTA (Polygen Corporation,
Waltham, MA). CHARMm führt
die Funktionen der Energieminimierung und molekularer Dynamik aus.
QUANTA führt
die Konstruktion, graphischen Modelle und Analyse molekularer Struktur
aus. QUANTA ermöglicht
interaktive Konstruktion, Veränderung,
Visualisierung und Analyse des Verhaltens von Molekülen miteinander.
-
Eine
Anzahl von Artikeln besprechen Computermodellverfahren für Arzneistoffe,
die mit spezifischen Proteinen interaktiv sind, wie Rotivinen u.a.,
1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159–166; Ripka, New Scientist
54–57
(16. Juni 1988); McKinaly und Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 29: 111–122;
Perry und Davies, OSAR: Quantitaive Structure-Activity Relationships
in Drug Design, S. 189–193
(Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis und Dean, 1989, Proc. R. Soc. Lond.
236: 125–140
und 141–162
sowie, hinsichtlich eines Modellrezeptoren für Nukleinsäurekomponenten, Askew u.a.,
1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 1082–1090. Andere Computerprogramme,
die Chemikalien durchsuchen und graphisch darstellen, sind von Firmen
wie BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Allelix, Inc. (Mississauga,
Ontario, Kanada) und Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario) erhältlich.
Obwohl diese vorrangig für
die Anwendung auf Arzneistoffe, die für bestimmte Proteine spezifisch
sind, vorgesehen sind, können
sie für
die Erstellung von Arzneistoffen angepasst werden, die für bestimmte
Regionen von DNA oder RNA spezifisch sind, wenn erst einmal diese
Region identifiziert ist.
-
Obwohl
sich die Beschreibung oben im Allgemeinen auf die Gestaltung und
Generierung von Verbindungen bezog, die das Bindungsverhalten verändern könnten, könnten die
Bibliotheken bekannter Verbindungen, einschließlich natürlicher Produkte oder synthetischer
Chemikalien, und Bibliotheken biologisch aktiver Materialien, einschließlich Proteinen,
auch auf Verbindungen durchsucht werden, die Inhibitoren oder Aktivatoren
sind.
-
Über Assays
identifizierte Verbindungen wie die vorliegend beschriebenen können beispielsweise nützlich sein
bei der Ausführung
der biologischen Funktion des Target-Genproduktes und für die Linderung
der Symptome von Immunstörungen.
In Fällen
beispielsweise, in denen die Situation einer durch TH-Zell-Subpopulationen
bedingten Störung
aus einem insgesamt niedrigen Grad der Expression des Target-Gens,
des Target-Genproduktes und/oder der Aktivität des Target-Genproduktes in
einer Zelle oder einem Gewebe resultiert, das in eine solche Störung involviert
ist, können
zu den Verbindungen, die mit dem Target-Genprodukt interagieren,
solche gehören,
die die Aktivität
des gebundenen Target-Genproteins akzentuieren und verstärken. Solche
Verbindungen würden
eine effektive Erhöhung
des Grades der Aktivität
des Traget-Gens mit sich bringen und so Symptome lindern. In Fällen, in
denen Mutationen in dem Target-Gen dazu führen, dass abweichende Target-Genproteine
gebildet werden, die eine schädliche
Wirkung haben, welche zu der durch TH-Zell-Subpopulationen bedingten
Störung
führt,
oder alternativ in Fällen,
in denen normale Aktivität
des Target-Gens gegeben sein muss, damit eine durch TH-Zell-Subpopulationen
bedingte Störung
auftritt, können Verbindungen
identifiziert werden, die Target-Genprotein binden und die Aktivität des gebundenen
Target-Genproteins hemmen. In Abschnitt 5.8.4. unten werden Assays
zum Identifizieren zusätzlicher
Verbindungen sowie zum Testen der Wirksamkeit der Verbindungen diskutiert,
die beispielsweise mit Techniken wie den in Abschnitt 5.8.1.–5.8.3 beschriebenen
identifiziert werden, diskutiert.
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5.8.1 IN-VITRO SCEENING
ASSAYS FÜR
VERBINDUNGEN, DIE AN EIN TARGET-GENPRODUKT BINDEN
-
Es
können
in-vitro Systeme gestaltet werden, um Verbindungen zu identifizieren,
die in der Lage sind, die Target-Genprodukte der Erfindung zu binden.
Identifizierte Verbindungen können
beispielsweise für
das Modulieren der Aktivität
von Produkten von Wildtypen und/oder Mutanten des Target-Gens nützlich sein,
können
für das
Ausführen
der biologischen Funktion von Target-Genprodukten nützlich sein,
können
in Screens zum Identifizieren von Verbindungen verwendet werden,
die normale Interaktionen des Target-Genproduktes unterbinden, oder können selbst
solche Interaktionen unterbinden.
-
Das
Prinzip der Assays, die zum Identifizieren von Verbindungen verwendet
werden, die an das Target-Genprodukt
binden, umfasst das Herstellen eines Reaktionsgemischs aus dem Target-Genprodukt
und der Testverbindung unter Bedingungen und für eine zeitliche Dauer, die
genügen,
um den beiden Komponenten die Interaktion und die Bindung zu ermöglichen
und so einen Komplex zu bilden, der aus dem Reaktionsgemisch entfernt
und/oder in diesem nachgewiesen werden kann. Diese Assays können auf
verschiedene Weise durchgeführt
werden. Beispielsweise würde
ein Verfahren zur Durchführung
eines solchen Assays das Verankern des Target-Genproduktes oder
der Testsubstanz an einer festen Phase und das Nachweisen von Target-Genprodukt/Testverbindungs-Komplexen,
die an der festen Phase verankert sind, am Ende der Reaktion umfassen.
In einer Ausführungsform
eines solchen Verfahrens kann das Target-Genprodukt an einer festen Fläche verankert
sein, und die Testverbindung, die nicht verankert ist, kann entweder
direkt oder indirekt markiert sein.
-
In
der Praxis können
Mikrotiterplatten praktischerweise als feste Phase benutzt werden.
Die verankerte Komponente kann durch nicht-kovalente oder kovalente
Anhänge
immobilisiert werden. Nicht-kovalente Anhänge können einfach durch Beschichten
der festen Fläche
mit einer Lösung
des Proteins und durch Trocknen erreicht werden. Alternativ kann
ein immobilisierter Antikörper,
vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende Protein
spezifisch ist, benutzt werden, um das Protein an der festen Fläche zu verankern.
Diese Fläche
kann vorab vorbereitet und gelagert werden.
-
Um
das Assay durchzuführen,
wird die nicht-immobilisierte
Komponente zu der beschichteten Fläche, die die verankerte Komponente
enthält,
hinzugefügt.
Nach Abschluss der Reaktion werden die nicht verbrauchten Komponenten
unter derartigen Bedingungen entfernt (z.B. durch waschen), dass
gebildete Komplexe immobilisiert an der festen Fläche zurückbleiben.
Der Nachweis von Komplexen, die an der festen Fläche verankert sind, kann auf
mehreren Wegen erreicht werden. Wo die vorher nicht-immobilisierte
Komponente vorab markiert wird, zeigt der Nachweis von Markierung,
die an der Fläche
immobilisiert wurde, an, dass Komplexe gebildet wurden. Wo die vorher
nicht-immobilisierte
Komponente vorab nicht markiert wird, kann ein indirekter Marker
genutzt werden, um an der Fläche
verankerte Komplexe nachzuweisen; z.B. ein markierter Antikörper, der
für die
vorher nicht-immobilisierte
Komponente spezifisch ist (der Antikörper kann wiederum direkt oder
indirekt mit einem markierten Anti-Ig-Antikörper markiert sein).
-
Alternativ
kann die Reaktion in einer flüssigen
Phase durchgeführt
werden, die Reaktionsprodukte können
von den nicht verbrauchten Komponenten getrennt und die Komplexe
nachgewiesen werden, z.B. indem ein immobilisierter Antikörper, der
für das
Target-Genprodukt
oder die Testverbindung spezifisch ist, benutzt wird, um in Lösung gebildete
Komplexe zu verankern, und ein markierter Antikörper, der für die andere Komponente des
möglichen
Komplexes spezifisch ist, um verankerte Komplexe nachzuweisen.
-
5.8.2. ASSAYS FÜR ZELLULÄRE PROTEINE
DIE MIT DEM TARGET-GENPROTEIN INTERAGIEREN
-
Jedes
Verfahren, das zum Nachweisen von Protein-Protein-Wechselwirkungen geeignet ist,
kann zum Identifizieren neuartiger zellulärer oder extrazellulärer Wechselwirkungen
des Target-Proteins eingesetzt werden. Diese Verfahren sind oben
in Abschnitt 5.2. für
das Identifizieren von Pathway-Genen umrissen und können nach
dieser Patentschrift auch im Hinblick auf die Identifizierung von
Proteinen, die mit identifizierten Target-Proteinen interagieren,
benutzt werden.
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5.8.3. ASSAYS FÜR VERBINDUNGEN,
DIE DIE WECHSELWIRKUNG ZIELGENPRODUKT/ZELLULÄRES MAKROMOLEKÜL BEEINTRÄCHTIGEN
-
Die
Zielgenprodukte der Erfindung können
in vivo mit einem oder mehreren zellulären oder extrazellulären Makromolekülen wie
Proteinen in Wechselwirkung treten. Diese Makromoleküle können enthalten,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, Nukleinsäuremoleküle und die
Proteine, die mit Verfahren nachgewiesen werden wie die, die zuvor
in Abschnitt 5.8.2. beschrieben wurden. Im Sinne dieser Abhandlung
werden diese zellulären und
extrazellulären
Makromoleküle
hier als „Bindungspartner" bezeichnet. Verbindungen,
die diese Wechselwirkungen beeinträchtigen, können bei der Regulierung der
Wirksamkeit des Zielgenproteins von Nutzen sein, insbesondere von
mutanten Zielgenproteinen. Diese Verbindungen können enthalten, sind jedoch
nicht beschränkt
auf, Moleküle
wie Antikörper,
Peptide und Ähnliches,
wie sie zum Beispiel zuvor in Abschnitt 5.8.1. beschrieben wurden.
-
Das
Grundprinzip der Assaysysteme, die zum Nachweis von Verbindungen
eingesetzt werden, die die Wechselwirkung zwischen dem Zielgenprodukt
und seinem bzw. seinen zellulären
oder extrazellulären
Bindungspartner bzw. Bindungspartnern beeinträchtigen, umfasst die Herstellung
eines Reaktionsgemischs, das das Zielgenprodukt und den Bindungspartner
enthält,
unter Bedingungen und über
einen ausreichenden Zeitraum, damit die beiden Wechselwirken und
sich verbinden können
und damit einen Komplex bilden. Um eine Verbindung auf ihre Hemmwirkung
zu testen, wird das Reaktionsgemisch in Gegenwart und Abwesenheit
der Testverbindung hergestellt. Die Testverbindung kann zu Beginn
im Reaktionsgemisch enthalten sein oder kann zu einem Zeitpunkt
nach der Zugabe des Zielgenprodukts und seines zellulären oder
extrazellulären
Bindungspartners hinzugegeben werden. Kontrollreaktionsgemische
werden ohne die Testverbindung oder mit einem Placebo inkubiert.
Anschließend
wird die Bildung von Komplexen zwischen dem Zielgenprotein und dem
zellulären
oder extrazellulären
Bindungspartner nachgewiesen. Die Bildung eines Komplexes in der
Kontrollreaktion, jedoch nicht in dem Reaktionsgemisch, das die
Testverbindung enthält,
zeigt an, dass die Verbindung die Wechselwirkung zwischen dem Zielgenprotein
und dem wechselwirkenden Bindungspartner beeinträchtigt. Außerdem kann die Komplexbildung
in Reaktionsgemischen, die die Testverbindung und das normale Zielgenprotein
enthalten, mit der Komplexbildung in Reaktionsgemischen verglichen
werden, die die Testverbindung und ein mutantes Zielgenprotein enthalten.
Dieser Vergleich kann in den Fällen
von Bedeutung sein, in denen es wünschenswert ist, Verbindungen
nachzuweisen, die die Wechselwirkungen von mutanten, jedoch nicht von
normalen Zielgenproteinen beeinträchtigen.
-
Der
Assay für
Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen den Zielgenprodukten
und den Bindungspartnern beeinträchtigen,
kann heterogen oder homogen durchgeführt werden. Heterogene Assays
umfassen die Verankerung des Zielgenprodukts oder des Bindungspartners
an eine Festphase und den Nachweis von Komplexen, die an der Festphase
verankert sind, am Ende der Reaktion. Bei homogenen Assays wird
die gesamte Reaktion in einer Flüssigphase
durchgeführt.
Bei beiden Verfahren kann die Reihenfolge der Zugabe der Reaktionspartner
verändert
werden, um unterschiedliche Angaben über die Verbindungen zu erhalten,
die getestet werden. Beispielsweise können Testverbindungen, die
die Wechselwirkung zwischen den Zielgenprodukten und den Bindungspartnern
beeinträchtigen,
z.B. durch eine Konkurrenzreaktion, nachgewiesen werden, indem die
Reaktion in Gegenwart der Testsubstanz durchgeführt wird; d.h. durch Zugabe
der Testsubstanz zum Reaktionsgemisch vor oder gleichzeitig mit
dem Zielgenprotein und dem wechselwirkenden zellulären oder
extrazellulären
Bindungspartner. Wahlweise können
Testverbindungen, die vorgeformte Komplexe aufspalten, z.B. Verbindungen
mit höheren
Bindungskonstanten, die einen der Bestandteile aus dem Komplex verdrängen, durch
Zugabe der Testverbindung zum Reaktionsgemisch getestet werden,
nachdem sich Komplexe gebildet haben. Die verschiedenen Ausführungen
werden im Folgenden kurz beschrieben.
-
Bei
einem heterogenen Assaysystem wird entweder das Zielgenprotein oder
der wechselwirkende zelluläre
oder extrazelluläre
Bindungspartner an einer Festkörperoberfläche verankert,
während
die nicht verankerte Spezies entweder direkt oder indirekt markiert
wird. In der Praxis ist es günstig,
wenn Mikrotiterplatten verwendet werden. Die verankerte Spezies
kann durch eine nichtkovalente oder kovalente Bindung immobilisiert
werden. Eine nichtkovalente Bindung kann einfach durch Beschichtung
der Festkörperoberfläche mit
einer Lösung
des Zielgenprodukts oder des Bindungspartners und Trocknung erreicht
werden. Wahlweise kann zur Verankerung der Spezies an der Festkörperoberfläche ein
immobilisierter Antikörper
verwendet werden, der für
die Spezies spezifisch ist, die verankert werden soll. Die Flächen können im
Voraus vorbereitet und gelagert werden.
-
Um
den Assay durchzuführen,
wird der Partner der immobilisierten Spezies mit der beschichteten
Fläche
mit oder ohne die Testverbindung in Berührung gebracht. Nachdem die
Reaktion abgeschlossen ist, werden nicht umgesetzte Bestandteile
entfernt (z.B. durch Abwaschen) und alle gebildeten Komplexe bleiben
auf der Festkörperoberfläche immobilisiert.
Der Nachweis von Komplexen, die auf der Festkörperoberfläche verankert sind, kann auf
mehrere Arten erfolgen. Wurde die nicht-immobilisierte Spezies vorher
markiert, zeigt der Nachweis der Markierung, die auf der Oberfläche immobilisiert ist,
dass sich Komplexe gebildet haben. Wurde die nicht-immobilisierte
Spezies vorher nicht markiert, kann eine indirekte Markierung zum
Nachweis von Komplexen verwendet werden, die an der Fläche verankert
sind; z.B. unter Verwendung eines markierten Antikörpers, der
für die
anfänglich
nicht-immobilisierte Spezies spezifisch ist (der Antikörper kann
wiederum direkt markiert oder mit einem markierten anti-Ig-Antikörper indirekt
markiert werden). In Abhängigkeit
von der Reihenfolge der Zugabe der Reaktionsbestandteile können Testverbindungen
nachgewiesen werden, die die Komplexbildung hemmen oder vorgeformte
Komplexe aufspalten.
-
Wahlweise
kann die Reaktion in einer Flüssigphase
in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt werden,
können
die Reaktionsprodukte von nicht umgesetzten Bestandteilen getrennt
und Komplexe nachgewiesen werden; z.B. unter Verwendung eines immobilisierten
Antikörpers,
der für
einen der Bindungsbestandteile spezifisch ist, zur Verankerung von
Komplexen, die in der Lösung
gebildet wurden, und eines markierten Antikörpers, der für den anderen
Partner spezifisch ist, zum Nachweis verankerter Komplexe. Wiederum
können
in Abhängigkeit
von der Reihenfolge der Zugabe der Reaktionspartner zur Flüssigphase Testverbindungen
nachgewiesen werden, die die Komplexbildung hemmen oder vorgeformte
Komplexe aufspalten.
-
Bei
einer wahlweisen Ausführungsform
der Erfindung kann ein homogener Assay eingesetzt werden. Bei diesem
Verfahren wird ein vorgeformter Komplex aus dem Zielgenprotein und
dem wechselwirkenden zellulären
oder extrazellulären
Bindungspartner hergestellt, in der entweder das Zielgenprodukt
oder sein Bindungspartner markiert wird, jedoch wird das Signal,
das durch die Markierung entsteht, durch die Komplexbildung ausgelöscht (siehe
z.B. die US-Patentschrift 4,109,496 von Rubenstein, bei der dieses
Verfahren für
Immunoassays verwendet wird). Die Zugabe einer Testsubstanz, die
mit einer der Spezies konkurriert und sie aus dem vorgeformten Komplex
verdrängt,
führt zur
Entstehung eines Signals über
dem Untergrund. Auf diese Art können
Testsubstanzen nachgewiesen werden, die die Wechselwirkung Zielgenprotein/zellulärer oder
extrazellulärer
Bindungspartner Wechselwirkung beeinträchtigen.
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Bei
einer besonderen Ausführungsform
kann das Zielgenprodukt auf die Immobilisierung unter Verwendung
von DNA-Rekombinationsverfahren vorbereitet werden, die zuvor in
Abschnitt 5.5 beschrieben wurden. Beispielsweise kann der kodierende
Bereich des Zielgens unter Verwendung eines Fusionsvektors wie pGEX-5X-1
mit einem Glutathion-S-Transferase(GST)-Gen derart verschmolzen
werden, dass seine Bindungsaktivität im entstehenden Fusionsprotein
erhalten bleibt. Der wechselwirkende zelluläre oder extrazelluläre Bindungspartner
kann gereinigt werden und zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers verwendet werden,
unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet routinemäßig angewendet
werden und zuvor in Abschnitt 5.6 beschrieben sind. Dieser Antikörper kann
mittels Verfahren, die im Fachgebiet routinemäßig angewendet werden, beispielsweise
mit dem radioaktiven Isotop 125I markiert
werden. Bei einem heterogenen Assay kann z.B. das GST-Zielgen-Fusionsprotein an
Glutathion-Agarose-Kügelchen
verankert werden. Der wechselwirkende zelluläre oder extrazelluläre Bindungspartner
kann anschließend
in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung so hinzugefügt werden,
dass die Wechselwirkung und Bindung erfolgen können. Am Ende des Reaktionszeitraums
kann ungebundenes Material weggewaschen und der markierte monoklonale
Antikörper
zum System hinzugegeben werden und sich an die komplexierten Bestandteile
binden. Die Wechselwirkung zwischen dem Zielgenprotein und dem wechselwirkenden
zellulären
oder extrazellulären
Bindungspartner kann durch Messung der Menge Radioaktivität nachgewiesen
werden, die weiter mit den Glutathion-Rgarose-Kügelchen
verbunden ist. Eine erfolgreiche Hemmung der Wechselwirkung durch
die Testverbindung führt
zu einer Abnahme der gemessenen Radioaktivität.
-
Wahlweise
können
das GST-Zielgen-Fusionsprotein und der wechselwirkende zelluläre oder
extrazelluläre
Bindungspartner in einer Flüssigkeit
in Abwesenheit der festen Glutathion-Agarose-Kügelchen miteinander vermischt
werden. Die Testverbindung kann hinzugegeben werden entweder während oder
nachdem die Spezies miteinander in Wechselwirkung treten können bzw.
treten konnten. Dieses Gemisch kann anschließend zu den Glutathion-Agarose-Kügelchen
hinzugegeben werden und ungebundenes Material wird weggewaschen.
Wieder kann der Grad der Hemmung der Zielgenprodukt/Bindungspartner-Wechselwirkung
durch Zugabe des markierten Antikörpers und Messung der Radioaktivität ermittelt
werden, die mit den Kügelchen verbunden
ist.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung können
dieselben Verfahren unter Verwendung von Peptidfragmenten eingesetzt
werden, die den Bindungsdomänen
des Zielgenprodukts und/oder des wechselwirkenden zellulären oder
extrazellulären
Bindungspartners entspricht (in den Fällen, in denen der Bindungspartner
ein Protein ist), anstatt eines der vollständigen oder beider vollständiger Proteine.
Jede Anzahl von Verfahren, die routinemäßig im Fachgebiet angewendet
werden, können
zum Nachweis und zur Isolierung der Bindungsstellen eingesetzt werden.
Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf,
die Mutagenese des Gens, das eins der Proteine verschlüsselt, und
die Durchmusterung nach der Aufbrechung der Bindung in einer Co-Immunopräzipitation.
Anschließend
können
kompensierende Mutationen des Gens ausgewählt werden, das die zweite
Spezies des Komplexes verschlüsselt.
Die Sequenzanalyse der Gene, die die jeweiligen Proteine verschlüsseln, offenbart
die Mutationen, die dem Bereich des Proteins entsprechen, der an der
Bindung durch Wechselwirkung beteiligt ist. Wahlweise kann ein Protein
unter Verwen dung von Verfahren an einer Festkörperoberfläche verankert werden, die zuvor
in diesem Abschnitt beschrieben wurden, und mit seinem markierten
Bindungspartner, der mit einer Protease wie Trypsin behandelt wurde,
Wechselwirken bzw. sich daran binden. Nach dem Waschen kann ein
kurzes markiertes Peptid, das die Bindungsdomäne umfasst, mit dem Feststoff
verbunden bleiben, das isoliert und durch Aminosäurensequenzierung nachgewiesen
werden kann. Außerdem
können,
sobald das Gen für
den zellulären
oder extrazellulären
Bindungspartner gewonnen wurde, kurze Genabschnitte so verändert werden,
dass sie Peptidfragmente des Proteins exprimieren, die anschließend auf
ihre Bindungsaktivität
getestet und gereinigt oder synthetisiert werden können.
-
Beispielsweise
und nicht einschränkend
gemeint kann ein Zielgenprodukt an einem Feststoff verankert werden,
wie es zuvor in diesem Abschnitt beschrieben wurde, indem ein GST-Zielgen-Fusionsprotein
hergestellt wird und sich an Gluthation-Agarose-Kügelchen
binden kann. Der wechselwirkende zelluläre oder extrazelluläre Bindungspartner
kann mit einem radioaktiven Isotop wie 35S
markiert und mit einer Protease wie Trypsin gespalten werden. Die
Spaltprodukte können
anschließend
dem verankerten GST-Zielgen-Fusionsprotein zugegeben werden und
können
sich binden. Nach dem Wegwaschen ungebundener Peptide kann das markierte
gebundene Material, das die Bindungsdomäne des zellulären oder
extrazellulären
Bindungspartners darstellt, mit bekannten Verfahren herausgelöst, gereinigt
und auf seine Aminosäuresequenz
untersucht werden. So nachgewiesene Peptide können synthetisch hergestellt
oder unter Verwendung der bekannten DNA-Rekombinationstechnik mit
geeigneten erleichternden Proteinen verschmolzen werden.
-
5.8.4 ASSAYS ZUR BESSERUNG
DER SYMPTOME VON IMMUNSTÖRUNGEN
UND/ODER MODULATION DER FUNKTION DES ZIELGENPRODUKTS
-
Alle
bindenden Verbindungen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
Verbindungen wie die, die in den vorstehenden Assaysystemen nachgewiesen
wurden, können
auf die Fähigkeit
zur Besserung von Symptomen von Immunstörungen getestet werden, z.B.
Störungen
im Zusammenhang mit TH-Zellsubpopulationen. Im Folgenden sind zellbasierte
Assays und Assays auf der Grundlage von Tiermodellen zum Nachweis von
Verbindungen beschrieben, die diese Fähigkeit zur Besserung von Symptomen
von Immunstörungen
aufweisen.
-
Erstens
können
zellbasierte Systeme wie die, die zuvor in Abschnitt 5.7.2 beschrieben
wurden, zum Nachweis von Verbindungen verwendet werden, die so wirken
können,
dass sie Symptome von Störungen bessern
können,
die im Zusammenhang mit TH-Zellsubpopulationen stehen. Beispielsweise
können
diese Zellsysteme in einer ausreichenden Konzentration und über einen
Zeitraum, der genügt,
um in den Zellen, die damit in Berührung gebracht werden, diese
Besserung auszulösen,
mit einer Verbindung in Berührung
gebracht werden, von der vermutet wird, dass sie die Symptome der
Störung
bessern kann. Nach dem Kontakt werden die Zellen untersucht, um
zu ermitteln, ob einer oder mehrere der der den Störungen,
die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen, ähnlichen
Zellphänotypen
so verändert
wurde bzw. wurden, dass er bzw. sie einem Phänotyp ähnelt bzw. ähneln, durch den eher eine
geringere Häufigkeit
oder Schwere der Symptome der Störungen
entsteht. Weitere zellbasierte Assays werden im Folgenden in Abschnitt
5.8.4.1 besprochen.
-
Wird
die Störung
Asthma betrachtet, die in Zusammenhang mit einer TH-Zellsubpopulation
steht, die insbesondere eine Störung
im Zusammenhang mit TH2-Ähnlichen
ist, kann jedes TH2- oder TH2-ähnliches Zellsystem
verwendet werden. Unter dem Einfluss dieser Zellsysteme können Verbindungen
auf ihre Fähigkeit untersucht
werden, den TH2-ähnlichen
Phänotyp
dieser Zellen zu modulieren, sodass die Zellen einen Verlust eines
TH2-ähnlichen
Phänotyps
aufweisen. Verbindungen mit dieser Fähigkeit zur TH2-Modulation
sind Verbindungen, die möglicherweise
die Fähigkeit
aufweisen, asthmabezogene Symptome in vivo zu bessern.
-
Außerdem können tierbasierte
Systeme wie die, die zuvor in Abschnitt 5.7.1 beschrieben wurden,
zum Nachweis von Verbindungen verwendet werden, die in der Lage
sind, den Störungen,
die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen, ähnliche
Symptome zu bessern. Diese Tiermodelle können als Testträger für den Nachweis
von Arzneimitteln, Pharmazeutika, Behandlungen und Maßnahmen
verwendet werden, die bei der Behandlung dieser Störungen wirksam
sein können.
Beispielsweise können
Tiermodelle in einer ausreichenden Konzentration und über einen
Zeitraum, der genügt,
um bei den Tieren, die damit in Verbindung gebracht werden, diese
Besserung auszulösen,
mit einer Verbindung in Berührung
gebracht werden, von der vermutet wird, dass sie die Symptome von
Störungen
bessern kann, die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen.
Die Reaktion der Tiere auf den Kontakt und damit die Wirksamkeit
der fraglichen Verbindung kann durch die Bewertung der Umkehrung
der Störungen überwacht
werden, die mit den interessierenden Störungen verbunden sind, die
mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen. Was Maßnahmen
betrifft, sollte jede Behandlung, durch die ein Gesichtspunkt der
den Störungen,
die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen, ähnlichen
Symptomen als Möglichkeit
für eine
entsprechende therapeutische Maßnahme
beim Menschen für
Störungen
betrachtet werden, die mit TH-Zellsubpopulationen
in Verbindung stehen. Die Dosierung der Teststoffe kann durch Ableitung
von Dosis-Wirkungskurven ermittelt werden, wie sie im Folgenden
in Abschnitt 5.10 besprochen sind.
-
In
Verbindung mit den zellbasierten oder den tierbasierten Systemen
können
Genexpressionsmuster zur Beurteilung der Fähigkeit einer Verbindung verwendet
werden, die den Störungen,
die mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen, ähnlichen
Symptome zu bessern. Beispielsweise kann das Expressionsmuster eines
oder mehrerer Fingerabdruckgene Teil eines Fingerabdruckprofils
bilden, das anschließend
bei einer solchen Beurteilung verwendet werden kann. Fingerabdruckprofile
werden im Folgenden in Abschnitt 5.11 beschrieben. Fingerabdruckprofile
können
in den zell- und/oder tierbasierten Modellsystemen für bekannte
Zustände
beschrieben werden, entweder für
Störungszustände, die
mit TH-Zellsubpopulationen in Verbindung stehen, oder für normale
TH-Zelldifferenzierungszustände.
-
5.8.4.1. VERFAHREN ZUM
NACHWEIS VON VERBINDUNGEN, DIE DIE FUNKTION DES ZIELGENPRODUKTS
MODULIEREN
-
In
diesem Abschnitt sind Verfahren zum Nachweis von Verbindungen beschrieben,
die entweder als Agonisten oder als Antagonisten von Rezeptorzielgenprodukten
dienen.
-
Die
getesteten Verbindungen können
beispielsweise Verbindungen sein wie die, die durch die Assays nachgewiesen
werden, die zuvor in Abschnitt 5.8.1 bis 5.8.3 beschrieben wurden.
Diese Verbindungen können enthalten,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, Peptide wie beispielsweise lösliche Peptide, einschließlich, jedoch nicht
beschränkt
auf, Fusionspeptide mit Ig-Anhang, die extrazelluläre Abschnitte
der Transmembranrezeptoren des Zielgenprodukts umfassen, und Mitglieder
von Zufallspeptidbibliotheken (siehe z.B. Lam, K. S. et al., 1991,
Nature 354: 82–84;
Houghten, R. et al., 1991, Nature 354: 84–86) aus Aminosäuren mit
D- und/oder L-Konfiguration,
Phosphopeptide (einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Mitglieder von Bibliotheken von Zufalls- oder teilweise degenerierten,
gerichteten Phosphopeptiden; siehe z.B. Songyang, Z. et al., 1993,
Cell 72: 767–778),
Antikörper
(einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimäre oder
Einkettenantikörper,
und FAb-, F(ab')2- und FAb-Expressionsbibliothekfragmente
sowie epitopbindende Fragmente davon) und kleine organische oder
anorganische Moleküle.
-
Die
hier beschriebenen Assays sind Funktionsassays, mit denen Verbindungen
nachgewiesen werden, die die Wirksamkeit des Rezeptorzielgens beeinflussen,
indem sie die Stärke
der intrazellulären
Kalziumabgabe beeinflussen. Die Modulation (d.h. Agonisierung oder
Antagonisierung) der Funktion des Rezeptorzielgenprodukts würde dann
zu einem unterschiedlichen intrazellulären Kalziumgehalt führen.
-
Die
Assays umfassen die Kontaktierung einer Zelle, die ein Rezeptorzielgen
exprimiert, mit einer Testverbindung und die Messung des Gehalts
an intrazellulärem
Kalzium. Die Verbindungen, die ein intrazelluläres Kalziumprofil erzeugen,
das sich von dem unterscheidet, das die Zelle bei Abwesenheit der
Verbindung aufweisen würde,
stellen entweder Agonisten oder Antagonisten dar. Eine agonistische
Verbindung würde
eine Erhöhung
des intrazellulären
Kalziumgehalts in Bezug auf Kontrollzellen bewirken, während ein
Antagonist eine Abnahme des intrazellulären Kalziumgehalts in Bezug
auf Vergleichszellen bewirken würde.
-
Es
ist bevorzugt, dass Zellen verwendet werden, deren intrazellulärer Kalziumgehalt
einfach gemessen werden kann. Xenopus-Eizellen zählen aufgrund ihrer großen Größe zu diesen
bevorzugten Zellen, da ihnen leicht intrazelluläre Kalziumreporterverbindungen
eingespritzt werden können.
Außerdem
können
Myelomzellen verwendet werden. Diese Reporterverbindungen enthalten,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, kalziumbindende Stoffe wie die bekannten FURA-2 und INDO-2.
FURA2/Kalzium-Komplexe und INDO-2/Kalziumkomplexe fluoreszieren
und ermöglichen
so die Messung von Unterschieden des intrazellulären Kalziumgehalts.
-
Im
Sinne der hier beschriebenen Assays sollten die Xenopus-Eizellen
mit Nukleotidsequenzen transfiziert werden, die das interessierende
Zielprotein verschlüsseln.
Die Zellen können
mittels Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind und die beispielsweise
Verfahren wie die enthalten können,
die zuvor in Abschnitt 5.5 beschrieben sind, transfiziert werden
und die interessierende Sequenz exprimieren. In Xenopus-Eizellen
kann RNA eingespritzt werden, die das interessierende Zielgenprodukt
verschlüsselt,
sodass die geimpften Eizellen das Genprodukt exprimieren.
-
Die
Assays, die in diesem Abschnitt beschrieben sind, können erstens
zum Nachweis von Verbindungen verwendet werden, die als Agonisten
des interessierenden Zielgenprodukts dienen. „Agonist", so wie es hier verwendet ist, bezeichnet
eine Verbindung, die die Wirksamkeit des Zielgenprodukts durch Steigerung
der Wirksamkeit des Zielgenprodukts moduliert, beurteilt durch die
Fähigkeit
der Verbindung, eine Steigerung des Kalziumeinstroms zu bewirken,
was zu einer Zunahme des intrazellulären Kalziumgehalts führt. Zu
diesen Agonisten kann beispielsweise der natürliche Ligand für das Rezeptorzielgenprodukt
zählen.
-
Agonisten,
die mit diesen Assays nachgewiesen werden, können als nützliche therapeutische Wirkstoffe
zur Besserung einer großen
Bandbreite von Störungen
dienen, die mit T-Zellen in Zusammenhang stehen, einschließlich beispielsweise
Störungen,
die mit TH-Zellsubpopulationen
in Zusammenhang stehen, in Fällen,
in denen diese Störungen
durch eine verminderte oder nicht-vorhandene Wirksamkeit des Zielgenprodukts verursacht
sind. Alle agonistischen Verbindungen, die hier nachgewiesen werden,
können
beispielsweise als Bestandteil der Behandlungsverfahren verwendet
werden, die im Folgenden in Abschnitt 5.9.2 beschrieben sind. Ferner
können
diese Agonisten zum Nachweis von Antagonisten des interessierenden
Rezeptorzielgenprodukts verwendet werden, z.B. wie im Folgenden
beschrieben.
-
„Antagonist", so wie es hier
verwendet ist, bezeichnet eine Verbindung, die die Wirksamkeit des
Zielgenprodukts durch Senkung der Wirksamkeit des Zielgenprodukts
moduliert, beurteilt durch die Fähigkeit
der Verbindung, eine Abnahme des Kalziumeinstroms zu bewirken. Antagonisten,
die mit diesen Assays nachgewiesen werden, können als nützliche therapeutische Wirkstoffe
zur Besserung einer großen
Bandbreite von Störungen
dienen, die mit T-Zellen in Zusammenhang stehen, einschließlich beispielsweise
Störungen,
die mit TH-Zellsubpopulationen
in Zusammenhang stehen, in Fällen,
in denen die Störung
durch eine erhöhte
oder unangemessene Wirksamkeit des Zielgenprodukts verursacht ist.
-
Es
kann ein Antagonisten-Siebtest durchgeführt werden, unter Verwendung
von Zellen, die das Zielgenprodukt exprimieren, wie es zuvor beschrieben
ist. In diesen Fällen,
in denen die Störung,
die mit T-Zellen in Verbindung steht, durch ein mutantes Zielgenprodukt
bedingt ist, können
die Zellen, die beim Antagonisten-Nachweis verwendet werden, Zellen sein,
die das mutante Rezeptorzielgenprodukt exprimieren, das an der Verursachung
der Störung,
die mit T-Zellen in Verbindung steht, beteiligt ist.
-
Um
einen Antagonisten-Siebtest durchzuführen, wird eine Zelle, die
das Zielgen exprimiert, 1) mit einem Agonisten des Zielgenprodukts
und 2) mit einer Testverbindung über
einen bestimmten Zeitraum in Berührung
ge bracht. Anschließend
wird der Gehalt an intrazellulärem
Kalzium in den Zellen gemessen und in Zellen, die nur mit dem Agonisten
in Berührung
gebracht wurden. Eine Testverbindung wird als Antagonist betrachtet,
wenn die Stärke
der intrazellulären
Kalziumabgabe in Gegenwart der Testverbindung niedriger ist als die
Stärke
der intrazellulären
Kalziumabgabe bei Fehlen der Testverbindung.
-
Alle
antagonistischen Verbindungen, die hier nachgewiesen werden, können beispielsweise
als Bestandteil der Behandlungsverfahren verwendet werden, die im
Folgenden in Abschnitt 5.9.1 beschrieben sind.
-
Unter
den möglichen
antagonistischen Verbindungen der Rezeptorzielgenprodukte mit 7-Transmembrandomänen, die
hier beschrieben sind, befinden sich Peptide, die eine der oder
mehrere extrazelluläre
Domänen
des Rezeptorzielgenprodukts enthalten, vorzugsweise sind die Domänen Domänen, die
für die
Ligandenbindung zuständig
sind, sodass die Peptide derart wirken, dass sie mit dem endogenen
Rezeptor um den Liganden konkurrieren.
-
5.9. VERBINDUNGEN UND
VERFAHREN ZUM BEHANDELN VON IMMUNSTÖRUNGEN UND ZUM MODULIEREN DER
TH-ZELLREAKTIONSFÄHIGKEIT
-
Im
Folgenden sind Verfahren und Zusammensetzungen beschrieben, die
zur Besserung der Symptome von Immunstörungen über beispielsweise eine Modulation
der interessierenden TH-Zellsubpopulation verwendet werden können. Diese
Modulation kann je nach der konkreten Situation positiver oder negativer
Art sein, jedoch führt
jedes Modulationsereignis zu einem Ergebnis, das die Symptome der
Immunstörung
bessert. Ferner sind im Folgenden Verfahren zur Modulation der Reaktionsfähigkeit
von TH-Zellen auf Antigene beschrieben.
-
„Negative
Modulation", so
wie sie hier verwendet wird, bezeichnet eine Verringerung des Gehalts und/oder
der Wirksamkeit des Zielgenprodukts bezüglich des Gehalts und/oder
der Wirksamkeit des Zielgenprodukts bei Fehlen der Modulationsbehandlung.
Wahlweise bezeichnet der Begriff, so wie er hier verwendet wird,
eine Abnahme der T-Zellsubpopulation (z.B. über eine Verringerung der Anzahl
der Zellen, die zur TH-Zellsubpopulation gehören) bezüglich zu der Anzahl, die bei
Fehlen der Modulationsbehandlung vorhanden ist. „Abnahme", so wie sie hier verwendet wird, ist
so gemeint, wie es zuvor in Abschnitt 3 definiert ist.
-
„Positive
Modulation", so
wie sie hier verwendet wird, bezeichnet eine Erhöhung des Gehalts und/oder der
Wirksamkeit des Zielgenprodukts bezüglich des Gehalts und/oder
der Wirksamkeit des Genprodukts bei Fehlen der Modulationsbehandlung.
Wahlweise bezeichnet der Begriff, so wie er hier verwendet wird,
eine Stimulation der T-Zellsubpopulation (z.B. über eine Erhöhung der
Anzahl der Zellen, die zur TH-Zellsubpopulation gehören) bezüglich zu
der Anzahl, die bei Fehlen der Modulationsbehandlung vorhanden ist. „Stimulation", so wie sie hier
verwendet wird, ist so gemeint, wie es zuvor in Abschnitt 3 definiert
ist.
-
Es
ist möglich,
dass eine Störung,
die mit einer TH-Zellsubpopulation
in Zusammenhang steht, oder eine andere Immunstörung als Folge der normalen
Zielgenwirksamkeit auftreten kann, während beispielsweise der Beeinflussung
durch ein bestimmtes Antigen, das eine Immunantwort auslöst, die
zur Ausbildung der Störung
führt.
Beispielsweise kommen die Störungen
Asthma und Allergie, die mit TH2-Ähnlichen in Zusammenhang stehen,
möglicherweise
für Störungen in
Frage, die diesen Mechanismus aufweisen. Außerdem kann eine Störung, zumindest
teilweise, durch einen außergewöhnlich hohen
Gehalt des Zielgenprodukts oder durch die Gegenwart eines Zielgenprodukts
bedingt sein, das eine außerge wöhnliche
Wirksamkeit aufweist. Damit würde
ein Verfahren, das eine negative Modulationswirkung hervorruft,
d.h. eine Verringerung des Gehalts und/oder der Wirksamkeit des
Zielgenprodukts bewirkt oder wahlweise eine Abnahme der TH-Zellsubpopulation
hervorruft (z.B. über
eine Verringerung der Anzahl von Zellen, die zur TH-Zellsubpopulation
gehören), in
beiden vorstehenden Fällen
eine Besserung der Symptome von Störungen bewirken, die mit einer
TH-Zellsubpopulation in Zusammenhang stehen.
-
Negative
Modulationsverfahren zur Verminderung der Stärke der Zielgenexpression oder
der Wirksamkeit des Zielgenprodukts (entweder gewöhnlich oder
außergewöhnlich)
und zur Senkung der Anzahl der Zellen einer bestimmten TH-Zellsubpopulation
sind im Folgenden in Abschnitt 5.9.1 besprochen.
-
Wahlweise
ist es möglich,
dass eine Störung,
die mit einer TH-Zellsubpopulation in Zusammenhang steht, oder andere
Immunstörungen,
zumindest teilweise, durch das Fehlen oder die Verringerung der
Stärke der
Zielgenexpression, eine Verminderung der Wirksamkeit des Zielgenprodukts
oder eine Senkung der Gesamtzahl von Zellen verursacht werden kann,
die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören. Damit würde ein
Verfahren, das eine positive Modulationswirkung hervorruft, d.h.
eine Zunahme der Stärke
der Zielgenexpression und/oder der Wirksamkeit dieser Genprodukte
bewirkt oder wahlweise eine Stimulation der TH-Zellsubpopulation
hervorruft (z.B. über
eine Erhöhung
der Anzahl der Zellen, die zu einer TH-Zellsubpopulation gehören), eine
Besserung der Symptome von Immunstörungen bewirken.
-
Zum
Beispiel kann eine Senkung der Gesamtzahl TH1-ähnlicher
Zellen bezüglich
TH2-ähnlicher
Zellen bei einer HIV-infizierten Person mit der Entwicklung hin
zu AIDS in einer Wechselbeziehung stehen (Clerci, M. et al., 1993,
J. Clin. Invest. 91: 759; Clerci, M. et al., 1993, Science 262:
1721; Maggi, E. et al., 1994, Science 265: 244). Eine Behandlung,
die in der Lage ist, die Anzahl TH1-ähnlicher Zellen bezüglich TH2-ähnlicher Zellen
bei einer HIV-infizierten Person zu erhöhen, kann daher zur Verhinderung
oder Verlangsamung der Entwicklung hin zur Krankheit dienen.
-
Positive
Modulationsverfahren zur Erhöhung
der Stärke
der Zielgenexpression oder der Wirksamkeit des Zielgenprodukts und
zur Erhöhung
des Gehalts an Zellen einer bestimmten TH-Zellsubpopulation sind
im Folgenden in Abschnitt 5.9.2 besprochen.
-
Zu
den Immunstörungen,
deren Symptome bessert werden können,
zählen
Immunstörungen,
die mit TH1 oder TH1-Ähnlichen
in Zusammenhang stehen und Immunstörungen, die mit TH2 oder TH2-Ähnlichen
in Zusammenhang stehen. Zu Beispielen für Störungen, die mit TH1 oder TH1-Ähnlichen
in Zusammenhang stehen, zählen
chronische Entzündungserkrankungen
und Störungen
wie Morbus Crohn, reaktive Arthritis einschließlich der Lyme-Borreliose,
insulinabhängige
Diabetes, organspezifische Autoimmunität einschließlich multipler Sklerose, Hashimoto-Thyroiditis
und Basedow-Krankheit, Kontaktdermatitis, Psoriasis, Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit
und Sarkoidose. Zu Beispielen für
Störungen,
die mit TH2 oder TH2-Ähnlichen
in Zusammenhang stehen, zählen
atopische Erkrankungen wie Asthma und Allergie einschließlich Rhinitis
allergica, gastrointestinale Allergien einschließlich Lebensmittelallergien,
Eosinophilie, Bindehautentzündung,
Nierenglomerulumentzündung,
bestimmte Anfälligkeiten
gegenüber
Krankheitserregern wie Wurmbefall (z.B. Leishmaniase) und bestimmte
Virusinfektionen einschließlich
HIV, und Bakterieninfektionen einschließlich Tuberkulose und lepromatöser Lepra.
-
Die
Verfahren, die hier beschrieben sind, können außerdem zur Modulation der Stärke der
Reaktionsfähigkeit
einer TH-Zellsubpopulation verwendet werden, beispielsweise der
Reaktionsfähigkeit
auf Antigene. Diese Verfahren sind insoweit von Bedeutung, da viele
Immunstörungen
vielmehr mit einer unangemessenen als einer unzureichenden Immunantwort
verbunden sind. Beispielsweise sind Störungen wie atopische, IgE-vermittelte
allergische Erkrankungen einschließlich Asthma, Anfälligkeiten
gegenüber
Krankheitserregern und chronische Entzündungserkrankungen mit starken
TH2-vermittelten Immunantworten verbunden, die jedoch das Gegenteil
bewirken. Ferner sind unangemessene TH1-vermittelte Immunantworten
auf Selbstantigene ein sehr wichtiger Punkt bei der Ausbildung von
Störungen
wie multipler Sklerose, Psoriasis, insulinabhängiger Diabetes, Hashimoto-Thyroiditis
und Morbus Crohn.
-
Verfahren
zur Modulation der Reaktionsfähigkeit
von TH-Zellen können beispielsweise
die Kontaktierung einer Verbindung mit einer TH-Zelle umfassen,
sodass die Reaktionsfähigkeit
der T-Helferzelle bezüglich der
Reaktionsfähigkeit
der T-Helferzelle bei Fehlen der Verbindung moduliert ist. Durch
die Modulation kann die Reaktionsfähigkeit der TH-Zelle erhöht oder
gesenkt werden. Alle Verfahren, die im Folgenden in Abschnitt 5.9.1
bis 5.9.3.2 beschrieben sind, können
zum Bewirken einer entsprechenden Modulation der Reaktionsfähigkeit
von TH-Zellen verwendet werden.
-
5.9.1 NEGATIVE MODULATIONSVERFAHREN
-
Wie
zuvor besprochen wurde, kann die erfolgreiche Behandlung bestimmter
Immunstörungen
durch Verfahren bewirkt werden, die der Hemmung der Expression oder
der Wirksamkeit der Zielgenprodukte dienen oder die wahlweise der
Senkung der Gesamtzahl von Zellen dienen, die zu einer bestimmten
TH-Zellsubpopulation gehören.
-
Beispielsweise
können
Verbindungen wie die, die durch die Assays nachgewiesen werden,
die zuvor in Abschnitt 5.8 beschrieben wurden, die eine negative
Modulationswirkung aufweisen, in Übereinstimmung mit der Erfindung
zur Besserung bestimmter Symptome von Störungen verwendet werden, die
mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen. Wie zuvor in
Abschnitt 5.8 besprochen wurde, können diese Moleküle enthalten,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, Peptide (wie beispielsweise Peptide, die lösliche extrazelluläre Abschnitte
der Transmembranrezeptoren des Zielgenprodukts darstellen), Phosphopeptide,
kleine organische oder anorganische Moleküle oder Antikörper (einschließlich beispielsweise
polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimäre oder
Einkettenantikörper
und FAb-, F(ab')2- und FAb-Expressionsbibliothekfragmente
sowie epitopbindende Fragmente davon). Verfahren zur Bestimmung
der Wirkdosis und zur Verabreichung dieser Verbindungen sind im
Folgenden in Abschnitt 5.10 beschrieben.
-
Ferner
können
in Übereinstimmung
mit der Erfindung zur Senkung der Stärke der Zielgenexpression und
damit zur wirksamen Senkung der Stärke der Zielgenwirksamkeit
auch Antisense- und Ribozymmoleküle verwendet
werden, die die Expression des Zielgens hemmen. Ferner können Moleküle mit dreisträngiger Helix bei
der Senkung der Stärke
der Zielgenwirksamkeit verwendet werden. Diese Verfahren sind im
Folgenden in Abschnitt 5.9.1.1 beschrieben.
-
Außerdem sind
im Folgenden in Abschnitt 5.9.3 Verfahren zur Abnahme bestimmter
TH-Zellsubpopulationen besprochen. Bei diesen Verfahren können beispielsweise
neuartige Oberflächenmarker
genutzt werden, die spezifisch für
die TH-Zellsubpopulation sind, die verringert werden soll, und können die
gezielte Zerstörung
in vivo oder in vitro oder wahlweise die gezielte Entfernung der
interessierenden TH-Zellsubpopulation durch Reinigung umfassen.
-
Das
neuartige 200-Gen, das ein Rezeptorzielgenprodukt verschlüsselt, das
ein Mitglied der Ig-Superfamilie ist, weist ein TH1-spezifisches
Muster der Genexpression auf. Das 200-Gen, insbesondere das menschliche
200-Gen, und seine Produkte können
daher bei der Behandlung von Störungen
eingesetzt werden, die mit der TH1-Zellsubpopulation in Zusammenhang
stehen, beispielsweise bei chronischen Entzündungskrankheiten, Psoriasis,
Transplantatabstoßung
und der Transplantatgegen-Empfänger-Krankheit.
-
Die
Behandlung einer derartigen Störung
kann eine Verringerung der Wirksamkeit und/oder der wirksamen Konzentration
der TH1-Zellsubpopulation erfordern, die an der interessierenden
Störung
beteiligt ist. So ist eine Reihe von Verfahren vorhanden, bei denen
die TH1-spezifischen
200-Gen-Produkte verwendet werden können, um diese Verringerung
der Wirksamkeit und/oder der wirksamen Konzentration von TH1-Zellen
zu bewirken. Beispielsweise können
natürliche
Liganden, Abkömmlinge
natürlicher
Liganden und Antikörper,
die sich an das 200-Genprodukt binden, zur Senkung der Anzahl der
vorhandenen TH1-Zellen verwendet werden, indem diese Zellen entweder
physisch von anderen Zellen in einer Population getrennt werden,
wodurch die TH1-Zellsubpopulation ausgelöscht wird, oder wahlweise indem
auf die spezifische Zerstörung
von TH1-Zellen abgezielt wird. Diese Verfahren werden im Folgenden
in Abschnitt 5.9.3 beschrieben. Ferner können diese Verbindungen zur
Hemmung der Vermehrung von TH1-Zellen verwendet werden.
-
Außerdem können Verbindungen
verabreicht werden, die mit dem endogenen Liganden für das 200-Genprodukt
konkurrieren. Diese Verbindungen würden sich an den zirkulierenden
Liganden binden und ihn „neutralisieren". Der sich daraus
ergebende Rückgang
der Menge an 200-Gen-Transmembranprotein, das an den Liganden gebunden
ist, moduliert die Wirksamkeit der TH1-Zellen. Verbindungen, die
besonders nützlich
für diesen
Zweck sein können,
enthalten beispielsweise lösliche
Proteine oder Peptide, zum Beispiel Peptide, die vom 200-Genprodukt
die extrazelluläre
Domäne
oder Abschnitte und/oder Analoga davon umfassen, einschließlich beispielsweise
lösliche
Fusionsproteine wie Fusionsproteine mit Ig-Anhang oder Antikörper.
-
(Zu
einer Erörterung
der Herstellung von Fusionsproteinen mit Ig-Anhang siehe zum Beispiel
die US-Patentschrift 5,116,964.)
-
Zu
diesem Zweck können
Peptide, die der extrazellulären
Domäne
des 200-Genprodukts entsprechen, lösliche Deletionsmutanten des
200-Genprodukts oder jede dieser 200-Genproduktdomänen oder -mutanten, die mit
einem anderen Polypeptid verschmolzen sind (z.B. ein IgFc-Polypeptid)
verwendet werden. Wahlweise können
anti-idiotypische Antikörper
oder Fab-Fragmente anti-idiotypischer Antikörper verwendet werden, die
die extrazelluläre
Domäne
des 200-Genprodukts nachahmen und den Liganden für das 200-Genprodukt neutralisieren.
Diese Peptide, Proteine, Fusionsproteine, anti-idiotypischen Antikörper oder
Fab des 200-Genprodukts werden einer Person in ausreichender Menge
verabreicht, um Ob zu neutralisieren und eine Besserung einer Störung zu
bewirken, die mit einer T-Zellen-Subpopulation
in Zusammenhang steht.
-
Es
können
Peptide des 200-Genprodukts verwendet werden, die der extrazellulären Domäne entsprechen,
die die Aminosäuresequenz
aufweist, die in 17 dargestellt ist,
von etwa Aminosäurerest
Nummer 21 bis etwa 192. Peptide des menschlichen 200-Genprodukts,
die der extrazellulären
Domäne
entsprechen, die die Aminosäureabfolge
aufweist, die in 24 dargestellt ist,
von etwa Aminosäurerest
Nummer 21 bis etwa 200. Es könnten
auch Mutanten verwendet werden, in denen die gesamte oder ein Teil
der hydrophoben Verankerungssequenz (z.B. etwa Aminosäurerest
Nummer 193 bis 214 in 17 oder etwa
201 bis etwa 224 in 24). Die Verschmelzung
dieser Peptide mit einem IgFc-Polypeptid sollte nicht nur die Stabilität der Zubereitung
erhöhen,
sondern erhöht
auch die Halbwertszeit und Wirksamkeit des Fusionsproteins in vivo.
Der Fc-Bereich des Ig-Abschnitts des Fusionsproteins kann weiter
verändert
werden, um die Effektorfunktion des Immunoglobulins herabzusetzen.
Beispielsweise können
Nukleotidsequenzen, die das Fusionsprotein verschlüsseln, derart
verändert
werden, dass sie Fusionsproteine verschlüsseln, die Cysteinreste in
der Gelenkregion durch Serinreste und/oder Aminosäuren in
der CH2-Domäne
ersetzen, die vermutlich für
die Bindung von IgG an FC-Rezeptoren und die Komplementaktivierung
erforderlich sind.
-
Bei
einer wahlweisen Ausführungsform
zur Neutralisierung des zirkulierenden Liganden des 200-Genprodukts
können
einem Patienten Zellen verabreicht werden, die derart genetisch
verändert
sind, dass sie diese löslichen
oder abgesonderten Formen des 200-Genprodukts exprimieren, woraufhin
sie in vivo als „Bioreaktoren" dienen, um eine
ständige
Zufuhr des Proteins bereitzustellen, das den Liganden des 200-Genprodukts
neutralisiert. Diese Zellen können
von dem Patienten oder einem HLA-kompatiblen Spender gewonnen werden
und können
enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Fibroblasten, Blutzellen
(z.B. Lymphozyten), Fettzellen, Muskelzellen, Endothelzellen usw.
Die Zellen werden in vitro unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren
genetisch verändert,
um die kodierende Sequenz für
das Peptid des 200-Genprodukts oder für Fusionsproteine des 200-Genprodukts
(zuvor erörtert)
in die Zellen einzubringen, z.B. durch Transduktions- (unter Verwendung
viraler Vektoren und vorzugsweise von Vektoren, die das Transgen
in das Zellgenom einbauen) oder Transfektionsvorgänge, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf, die Verwendung von Plasmiden, Cosmiden, YACs, Elektroporation,
Liposomen usw. Die kodierende Sequenz für das 200-Genprodukt kann unter
die Kontrolle eines starken konstitutiven oder induzierbaren Promotors/Enhancers
gestellt werden, damit die Expression und Absonderung des Peptids
oder Fusionsproteins des 200-Gens erreicht wird. Die veränderten
Zellen, die das gewünschte
200-Genprodukt exprimieren und absondern, können systemisch in den Patienten
eingebracht werden, z.B. in den Kreislauf, oder intraperitoneal.
Wahlweise können
die Zellen in eine Matrix eingearbeitet und in den Körper eingepflanzt
werden, z.B. können
genetisch veränderte
Fibroblasten als Teil eines Hauttransplantats eingepflanzt werden;
genetisch veränderte
Endothelzellen können
als Teil eines Gefäßtransplantats
eingepflanzt werden. (Siehe beispielsweise Anderson et al. US-Patentschrift 5,399,349;
und Mulligan & Wilson,
US-Patentschrift 5,460,959, von denen jede hier durch Literaturhinweis
in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist).
-
Wenn
die Zellen, die verabreicht werden sollen, keine Zellen des Empfängers sind,
können
sie unter Verwendung bekannter Verfahren verabreicht werden, mit
denen die Ausbildung einer Immunantwort des Empfängers gegen die eingebrachten
Zellen verhindert wird. Beispielsweise können die Zellen in verkapselter Form
eingebracht werden, durch die, obwohl sie einen Austausch der Bestandteile
mit der unmittelbaren extrazellulären Umgebung ermöglicht,
die eingebrachten Zellen vom Immunsystem des Empfängers nicht
erkannt werden können.
-
Es
versteht sich, dass, obwohl diese Vorgehensweisen und Verfahren
der Klarheit halber unter Verwendung des 200-Genprodukts als Beispiel
beschrieben sind, sie auf alle Ziel- und/oder Pathway-Genprodukte
angewendet werden können,
die diesen rezeptorartigen Aufbau aufweisen.
-
5.9.1.1. NEGATIVE MODULATIONSVERFAHREN
UNTER VERWENDUNG VON RIBOZYMEN UND MOLEKÜLEN MIT DREISTRÄNGIGER HELIX
-
Unter
den Verbindungen, die die Fähigkeit
aufweisen können,
die Symptome von Störungen
zu bessern, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen,
befinden sich Ribozymmoleküle
und Moleküle
mit dreisträngiger
Helix. Diese Moleküle
können
derart ausgestaltet sein, dass sie Wirksamkeit von Wildtypzielgenen
oder gegebenenfalls von mutanten Zielgenen senken oder hemmen. Dem
Fachmann sind die Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser
Moleküle
bekannt.
-
Ribozyme
sind enzymatische RNA-Moleküle,
die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren
(als Überblick
siehe zum Beispiel Rossi, J., 1994, Current Biology 4: 469–471). Der
Ablauf der Ribozymwirkung umfasst die sequenzspezifische Hybridisierung
des Ribozymmoleküls
an komplementäre Ziel-RNA,
gefolgt von einer endonukleolytischen Spaltung. Der Aufbau der Ribozymmoleküle muss
eine oder mehrere Sequenzen enthalten, die komplementär zur Zielgen-mRNA
ist bzw. sind und muss die bekannte katalytische Sequenz enthalten,
die für
die Spaltung der mRNA zuständig
ist. Zu dieser Sequenz siehe US-Patentschrift 5,093,246, die hier
durch Literaturhinweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist. Damit
sind im Schutzumfang der Erfindung veränderte Hammerkopf-Ribozymmoleküle enthalten,
die die endonukleolytische Spaltung von RNA-Sequenzen, die Zielgenproteine verschlüsseln, spezifisch
und wirksam katalysieren.
-
Ribozymmoleküle, die
so ausgestaltet sind, dass sie die mRNA-Transkripte von Ziel- oder
Pathway-Genen katalytisch spalten, können auch dafür verwendet
werden, die Translation von Ziel- oder Pathway-Gen-mRNA und die
Expression von Ziel- oder Pathway-Genen zu verhindern. (Siehe z.B.
die internationale PCT-Veröffentlichung
WO 90/11364, veröffentlicht
am 4. Oktober 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222–1225).
Obwohl Ribozyme, die die mRNA an regiospezifischen Erkennungsregionen
spalten, zur Zerstörung
der mRNA von Ziel- oder Pathway-Genen verwendet werden kann, ist
die Verwendung von Hammerkopfribozymen bevorzugt. Hammerkopfribozyme
spalten mRNAs an Stellen, die durch flankierende Bereiche vorgeschrieben
werden, die mit der Ziel-mRNA komplementäre Basenpaare bilden. Die einzige
Anforderung ist, dass die Ziel-mRNA die folgende Sequenz aus zwei
Basen aufweist: 5'-UG-3'. Der Aufbau und
die Herstellung von Hammerkopfribozymen sind im Fachgebiet bekannt
und ausführlicher
beschrieben in Haseloff und Gerlach, 1988, Nature, 334: 585–591. Vorzugsweise
wird das Ribozym derart verändert,
dass die Erkennungsregion für
die Spaltung nahe dem 5'-Ende
der mRNA des Ziel- oder Pathway-Gens liegt; d.h. zur Erhöhung der Wirksamkeit
und Verringerung der intrazellulären
Ansammlung von funktionsuntüchtigen
mRNA-Transkripten auf ein Mindestmaß.
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Die
Ribozyme der vorliegenden Erfindung enthalten auch RNA-Endoribonukleasen
(im Folgenden „Cech-Ribozyme") wie die, die natürlich in
Tetrahymena Thermophila vorkommt (bekannt als IVS- oder L-19 IVS-RNA)
und eingehend von Thomas Cech und seinen Mitarbeitern beschrieben
wurde (Zaug et al., 1984, Science, 224: 574–578; Zaug und Cech, 1986,
Science, 231: 470–475;
Zaug et al., 1986, Nature, 324: 429–433; veröffentlichte internationale
Patentanmeldung WO 88/04300 von University Patents Inc.; Been und Cech,
1986, Cell, 47: 207–216).
Die Cech-Ribozyme
weisen ein aktives Zentrum von acht Basenpaaren auf, das an eine
Ziel-RNA-Sequenz hybridisiert, wonach die Spaltung der Ziel-RNA
stattfindet. Die Erfindung umfasst die Cech-Ribozyme, die auf die
Sequenzen des aktiven Zentrums von acht Basenpaaren abzielen, die
in Ziel- oder Pathway-Genen vorhanden sind.
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Die
Ribozyme können
aus modifizierten Oligonukleotiden bestehen (z.B. für eine verbesserte
Stabilität,
Targe ting usw.) und sollten zu Zellen gebracht werden, die das Ziel-
oder Pathway-Gen in vivo exprimieren. Ein bevorzugtes Einbringungsverfahren
umfasst die Verwendung eines DNA-Konstrukts, das das Ribozym unter
der Kontrolle eines starken konstitutiven pol III- oder pol II-Promotors „verschlüsselt", sodass transfizierte Zellen
ausreichende Mengen des Ribozyms erzeugen, damit endogene Ziel-
oder Pathway-Genbotschaften zerstört werden und die Translation
gehemmt wird. Da Ribozyme katalytisch wirksam sind, ist eine geringere intrazelluläre Konzentration
erforderlich, damit sie wirksam werden.
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In
Fällen,
in denen die Ribozymmoleküle
und/oder Moleküle
mit dreisträngiger
Helix, die hier beschrieben sind, zur Hemmung der Expression mutanter
Gene verwendet werden, ist es möglich,
dass durch das Verfahren auch die Transkription (dreisträngige Helix)
und/oder die Translation (Antisense, Ribozym) von mRNA wirksam vermindert
oder gehemmt wird, die von normalen Zielgenallelen gebildet wird,
sodass es möglich
sein kann, dass die Konzentration des vorhandenen normalen Zielgenprodukts
geringer sein kann, als es für
einen normalen Phänotyp
notwendig ist. In diesen Fällen
können
daher zur Sicherstellung, dass eine im Wesentlichen normale Stärke der
Zielgenwirksamkeit erhalten bleibt, Nukleinsäuremoleküle, die Zielgenpolypeptide verschlüsseln und
exprimieren, die eine normale Zielgenwirksamkeit aufweisen, mittels
gentherapeutischer Verfahren wie denen, die im Folgenden in Abschnitt
5.9.2 beschrieben sind, in Zellen eingebracht werden, die keine
Sequenzen enthalten, die empfindlich gegenüber Behandlungen mit Ribozymen
oder Molekülen
mit dreisträngiger
Helix sind, unabhängig
davon, welche eingesetzt werden. Wahlweise kann es in Fällen, in
denen das Zielgen ein extrazelluläres Protein verschlüsselt, bevorzugt
sein, das normale Zielgenprotein mit zu verabreichen, um die erforderliche
Stärke
der Zielgenwirksamkeit zu erhalten.
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Ribozymmoleküle der Erfindung
und Moleküle
der Erfindung mit dreisträngiger
Helix können
mit jedem Verfahren hergestellt werden, das im Fachgebiet zur Synthese
von DNA- und RNA-Molekülen
bekannt ist. Dazu gehören
Verfahren zur chemischen Synthese von Oligodesoxyribonukleotiden
und Oligoribonukleotiden, die im Fachgebiet bekannt sind, beispielsweise
die chemische Phosphoramidit-Festphasensynthese. Wahlweise können RNA-Moleküle durch
in vitro und in vivo Transkription von DNA-Sequenzen erzeugt werden,
die das Antisense-RNA-Molekül
verschlüsseln.
Diese DNA-Sequenzen können
in eine große
Vielfalt von Vektoren eingebaut werden, die geeignete RNA-Polymerasepromotoren
wie die T7- oder SP6-Polymerasepromotoren enthalten.
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Als
Mittel zur Erhöhung
der intrazellulären
Stabilität
und der Halbwertszeit können
verschiedene bekannte Modifikationen der DNA-Moleküle eingebracht
werden. Mögliche
Modifikationen enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf,
die Zugabe von flankierenden Sequenzen von Ribo- oder Desoxynukleotiden
zum 5'- und/oder
3'-Ende des Moleküls oder
die Verwendung von Phosphorothioat- oder 2'-O-Methyl- anstatt Phosphodiesterasebindungen
in der Hauptkette des Oligodesoxyribonukleotids.
-
Die
endogene Ziel- und/oder Pathway-Genexpression kann auch durch Unwirksammachen
oder „Ausschalten" des Ziel- und/oder Pathway-Gens
oder seines Promotors unter Verwendung der gezielten homologen Rekombination
vermindert werden. (Siehe z.B. Smithies et al., 1985, Nature 317:
230–234;
Thomas & Capecchi,
1987, Cell 51: 503–512;
Thompson et al., 1989 Cell 5: 313–321; von denen alle hier durch
Literaturhinweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind). Zum Beispiel
kann ein mutantes, funktionsuntüchtiges
Ziel- und/oder Pathway-Gen (oder eine ganz und gar nicht verwandte
DNA-Sequenz), flankiert von DNA, die zum endogenen Ziel- und/oder Pathway-Gen
homolog ist (entweder die kodierenden oder die regulatorischen Bereiche
des Ziel- und/oder Pathway-Gens) zur Transfektion von Zellen, die
in vivo das Ziel- und/oder Pathway-Gen exprimieren, verwendet werden,
mit oder ohne einen wählbaren
Marker und/oder einen negativen Marker. Das Einsetzen des DNA-Konstrukts
mittels der gezielten homologen Rekombination führt zum Unwirksammachen des
Ziel- und/oder Pathway-Gens.
Diese Verfahren sind besonders geeignet in der Landwirtschaft, wo
Modifikationen von ES (embryonale Stamm-)-Zellen zur Zeugung von
Tiernachwuchs mit einem unwirksamen Ziel- und/oder Pathway-Gen eingesetzt
werden können
(siehe z.B. Thomas & Capecchi
1987 und Thompson 1989, siehe oben). Diese Verfahren können auch
zur Schaffung von Tiermodellen für
Störungen verwendet
werden, die mit T-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen. Es
sollte festgehalten werden, dass dieses Verfahren für die Verwendung
beim Menschen unter der Voraussetzung angepasst werden kann, dass
die rekombinierten DNA-Konstrukte unmittelbar verabreicht oder unter
Verwendung von geeigneten viralen Vektoren an die erforderliche
Stelle in vivo gebracht werden, z.B. von Herpesvirusvektoren.
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Wahlweise
kann die endogene Ziel- und/oder Pathway-Genexpression durch Targeting von Desoxyribonukleotidsequenzen,
die zum regulatorischen Bereich des Ziel- und/oder Pathway-Gens komplementär sind (d.h.
der Promotor des Ziel- und/oder Pathway-Gens und/oder Enhancer),
vermindert werden, sodass dreisträngige Helixstrukturen gebildet
werden, die die Transkription des Ziel- oder Pathway-Gens in Zielzellen im
Körper
verhindern. (Siehe ganz allgemein Helene, C. 1991, Anticancer Drug
Des., 6 (6): 569–84;
Helene, C. et al., 1992, Ann, N. Y. Accad. Sci., 660: 27–36; und
Maher, L. J., 1992, Bioassays 14 (12): 807–15). Bei noch einer weiteren
Ausführungsform
der Erfindung kann die Wirksamkeit des Ziel- und/oder Pathway-Gens unter
Verwendung eines „dominant-negativen" Verfahrens vermindert werden.
Zu diesem Zweck können
in gentherapeutischen Verfahren zur Verminderung der Wirksamkeit
des Ziel- und/oder
Pathway-Genprodukts in entsprechenden Zielzellen Konstrukte verwendet
werden, die fehlerhafte Ziel- und/oder Pathway-Genprodukte verschlüsseln.
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5.9.2. POSITIVE MODULATIONSVERFAHREN
-
Wie
zuvor besprochen wurde, kann die erfolgreiche Behandlung bestimmter
Immunstörungen
durch Verfahren bewirkt werden, die der Erhöhung der Stärke der Zielgenexpression oder
der Erhöhung
der Wirksamkeit des Zielgenprodukts dienen oder die wahlweise, der
wirksamen Erhöhung
der Gesamtzahl von Zellen dienen, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation
gehören.
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Beispielsweise
können
Verbindungen wie die, die durch die Assays nachgewiesen werden,
die zuvor in Abschnitt 5.8 beschrieben wurden, die eine positive
Modulationswirkung aufweisen, in Übereinstimmung mit der Erfindung
zur Besserung bestimmter Symptome von Störungen verwendet werden, die
mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen. Wie zuvor in
Abschnitt 5.8 besprochen wurde, können diese Moleküle enthalten,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, Peptide, die lösliche
extrazelluläre
Abschnitte der Transmembranrezeptoren des Zielgenprodukts darstellen,
Phosphopeptide, kleine organische oder anorganische Moleküle oder
Antikörper
(einschließlich
beispielsweise polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische,
chimäre
oder Einkettenantikörper
und FAb-, F(ab')2- und FAb-Expressionsbibliothekfragmente
sowie epitopbindende Fragmente davon).
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Zum
Beispiel kann eine Verbindung wie ein Zielgenprotein in einer Menge,
die ausreicht, die Symptome von Immunstörungen zu bessern, einem Patienten
verabreicht werden, der diese Symptome zeigt. Alle Verfahren, die
im Folgenden in Abschnitt 5.10 besprochen sind, können für diese
Verabreichung eingesetzt werden. Ein Fachmann wird ohne Weiteres
wissen, wie die Konzentration der ungiftigen Wirkdosis der Verbindung
bestimmt wird, wobei er Verfahren wie die verwendet, die im Folgenden
in Abschnitt 5.10.1 beschrieben sind.
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In
den Fällen,
in denen die Verbindung, die verabreicht werden soll, eine Peptidverbindung
ist, können einem
Patienten, der Symptome von Immunstörungen zeigt, unmittelbar DNA-Sequenzen,
die die Peptidverbindung verschlüsseln,
in einer Konzentration verabreicht werden, die ausreicht, einen
Gehalt der Peptidverbindung zu erzeugen, der ausreicht, die Symptome
der Störung
zu bessern. Alle Verfahren, die im Folgenden in Abschnitt 5.10 besprochen
sind, die eine intrazelluläre
Verabreichung von Verbindungen bewirken, beispielsweise die Verabreichung
von Liposomen, können
für die
Verabreichung dieser DNA-Moleküle
verwendet werden. Die DNA-Moleküle können beispielsweise
mit bekannten Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
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Im
Fall von Peptidverbindungen, die extrazellulär wirken, können die DNA-Moleküle, die
diese Peptide verschlüsseln,
solange von jedem Zelltyp aufgenommen und exprimiert werden, wie
sich eine ausreichende Konzentration zirkulierenden Peptids zur
Auslösung
einer Verminderung der Symptome von Immunstörungen ergibt. Bei Verbindungen,
die intrazellulär
wirken, müssen
die DNA-Moleküle,
die diese Peptide verschlüsseln, von
der interessierenden TH-Zellsubpopulation in ausreichendem Maße aufgenommen
und exprimiert werden, damit sie die Verminderung von Immunstörungen bewirken.
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Daher
ist bei den DNA-Molekülen,
die Peptide verschlüsseln,
die intrazellulär
wirken, jedes Verfahren bevorzugt, das dazu dient, DNA-Moleküle gezielt
der interessierenden TH-Zellsubpopulation zu verabreichen. Bei Asthma
zum Beispiel werden Verfahren bevorzugt, mit denen gezielt den TH-Zellsubpopulationen
Moleküle
verabreicht werden, die sich im Lungengewebe befinden.
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Ferner
können
Patienten in Fällen,
in denen die Störung,
die mit der TH-Zellsubpopulation in Zusammenhang steht, ein abweichendes
Gen umfasst, mit einer Genersatztherapie behandelt werden. Eine
oder mehrere Kopien eines normalen Zielgens oder ein Abschnitt des
Gens, das die Herstellung eines normalen Zielgenproteins mit Zielgenfunktion
bestimmt, kann in Zellen eingesetzt werden, unter Verwendung von
Vektoren, die enthalten, jedoch nicht beschränkt sind auf, Adenovirus-,
adeno-assoziierte
Virus- und Retrovirusvektoren, zusätzlich zu anderen Teilchen,
die DNA in Zellen einbringen, beispielsweise Liposome.
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Diese
Genersatzverfahren können
entweder in vivo oder in vitro durchgeführt werden. Wie zuvor ist bei
Genen, die extrazelluläre
Moleküle
verschlüsseln,
der Zelltyp, der das Zielgen exprimiert, für die Besserung von Immunstörungen weniger
wichtig, als dass eine ausreichende Konzentration des zirkulierenden
extrazellulären
Moleküls
erreicht wird. Ferner muss wie zuvor das Gen bei dem interessierenden
Zelltyp der TH-Zellsubpopulation exprimiert werden, wenn das Gen
eine Zelle verschlüsselt,
die intrazellulär
wirkt oder als Transmembranmolekül
dient. Daher sind Verfahren, bei denen die Expression im interessierenden
Zelltyp gewählt wird,
bei dieser letzten Klasse von Zielgenen bevorzugt. In vivo kann
zu diesen Verfahren beispielsweise die geeignete örtliche
Verabreichung von Zielgensequenzen gehören.
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Weitere
Verfahren, die zur Erhöhung
der Gesamtstärke
der Ziel- und/oder Pathway-Genexpression und oder der Ziel- und/oder
Pathway-Genwirksamkeit eingesetzt werden können, umfassen die Einbringung geeigneter
Zellen, die das Ziel- und/oder Pathway-Gen exprimieren, vorzugsweise
autologe Zellen, in einen Patienten an Stellen und in einer Zahl,
die ausreichend ist für
die Besserung der Symptome von Störungen, die mit T-Zellsubpopulationen
in Verbindung stehen. Diese Zellen können entweder rekombinant oder
nicht-rekombinant sein. Unter den Zellen, die zur Erhöhung der
Gesamtstärke
der Ziel- und/oder
Pathway-Genexpression bei einem Patienten verabreicht werden können, befinden
sich normale Zellen, die das Ziel- und/oder Pathway-Gen exprimieren.
Die Zellen können
an der anatomischen Stelle der Expression oder als Teil eines Gewebetransplantats
verabreicht werden, das sich an einer anderen Stelle im Körper befindet.
Diese zellbasierten gentherapeutischen Verfahren sind dem Fachmann
bekannt, siehe z.B. Anderson et al., US-Patentschrift 5,399,349;
Mulligan & Wilson,
US-Patentschrift 5,460,959.
-
In
vitro können
Zielgensequenzen in autologe Zellen eingebracht werden. Diese Zellen,
die die interessierende Zielgensequenz exprimieren, können, vorzugsweise
mittels intravenöser
Verabreichung, wieder in den Patienten eingebracht werden, damit
dadurch eine Besserung der Symptome der Störung bewirkt wird.
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Wahlweise
können
TH-Zellen, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören, derart
einem Patienten verabreicht werden, dass die Gesamtzahl der Zellen,
die zu dieser TH-Zellsubpopulation gehört, bezüglich der Zellen anderer TH-Zellsubpopulationen
erhöht
wird, was zu einer Besserung einer Störung führt, die mit einer TH-Zellsubpopulation
in Verbindung steht. Verfahren für
diese Vermehrung einer TH-Zellsubpopulation sind im Folgenden in
Abschnitt 5.9.3.2 beschrieben.
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5.9.3 NEGATIVE ODER POSITIVE
MODULATIONSVERFAHREN
-
Hier
sind Modulationsverfahren beschrieben, die je nach der besonderen
Anwendung, für
die sie eingesetzt werden, entweder positive oder negative Reaktionen
ergeben können,
die zur Besserung von Immunstörungen
führen,
einschließlich
Störungen,
die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen. Damit können in
entsprechenden Fällen
die Verfahren aus diesem Abschnitt in Verbindung mit den negativen
Modulationsverfahren verwendet werden, die zuvor in Abschnitt 5.9.1
beschrieben sind, oder wahlweise in Verbindung mit den positiven
Modulationsverfahren, die zuvor in Abschnitt 5.9.2 beschrieben sind.
-
5.9.3.1. VERFAHREN UNTER
VERWENDUNG VON ANTIKÖRPERN
-
Antikörper, die
zur Modulation in der Lage sind, können zur Besserung von Immunstörungen wie
von Störungen
eingesetzt werden, die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang
stehen. In Abhängigkeit
von dem jeweiligen Antikörper
kann die Modulationswirkung negativ sein und kann daher als Teil
der Verfahren verwendet werden, die zuvor in Abschnitt 5.9.1 beschrieben
sind, oder kann positiv sein und kann daher in Verbindung mit den
Verfahren verwendet werden, die zuvor in Abschnitt 5.9.2 beschrieben
sind.
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Ein
Antikörper,
der zur negativen Modulation in der Lage ist, bezeichnet einen Antikörper, der
sich spezifisch an ein Protein bindet und die Wirkung dieses Proteins
beeinträchtigt.
Im Falle eines extrazellulären
Rezeptors würde
dieser Antikörper
beispielsweise die extrazelluläre
Domäne
des Rezeptors auf eine Art und Weise spezifisch binden, durch die
der Rezeptor nicht aktiviert wird, durch die jedoch die Fähigkeit
des Rezeptors beeinträchtigt
wird, seinen natürlichen
Liganden zu binden. Zum Beispiel können Antikörper, die gegen die extrazelluläre Domäne des 200-Genprodukts
gerichtet sind, als derartige negative Modulatoren dienen. Diese Antikörper können unter
Verwendung der gängigen
Verfahren, die zuvor in Abschnitt 5.6 beschrieben sind, gegen vollständige Wildtyp-
oder mut ante Proteine oder gegen Peptide erzeugt werden, die Abschnitten
der Proteine entsprechen. Die Antikörper enthalten, sind jedoch
nicht beschränkt
auf, polyklonale, monoklonale, Fab-Fragmente, Einkettenantikörper, chimäre Antikörper und Ähnliches.
-
Ein
Antikörper,
der zur positiven Modulation in der Lage ist, bezeichnet einen Antikörper, der
sich spezifisch an ein Protein bindet und durch die Bindung dazu
dient, die Funktion des Proteins, das es erkennt, entweder direkt
oder indirekt zu aktivieren. Beispielsweise kann sich ein Antikörper derart
an den extrazellulären Abschnitt
eines Transmembranproteins binden, dass das Transmembranprotein
dazu veranlasst wird, so zu arbeiten, als ob sein endogener Ligand
sich daran binden würde,
wodurch zum Beispiel ein Signalwandlungsablauf in Gang gebracht
wird. Antikörper
können
unter Verwendung der gängigen
Verfahren, die zuvor in Abschnitt 5.6 beschrieben wurden, gegen
vollständige
Wildtyp- oder mutante Proteine oder gegen Peptide erzeugt werden,
die Abschnitten der Proteine entsprechen. Die Antikörper enthalten,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, polyklonale, monoklonale, FAb-Fragmente, Einkettenantikörper, chimäre Antikörper und Ähnliches.
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In
Fällen,
in denen das Protein, zum Beispiel ein Zielgenprotein, auf das der
Antikörper
gerichtet ist, intrazellulär
ist und ganze Antikörper
verwendet werden, können „verinnerlichte" Antikörper bevorzugt
werden. Jedoch kann Lipofectin oder können Liposome verwendet werden,
um den Antikörper
oder ein Bruchstück
der Fab-Region, das sich an das Epitop des Genprodukts bindet, in
Zellen hineinzubringen. Wenn Bruchstücke des Antikörpers verwendet
werden, wird das kleinste inhibitorische Bruchstück bevorzugt, das sich an die
Bindungsdomäne
des Proteins bindet. Zum Beispiel können Peptide verwendet werden,
die eine Aminosäuresequenz
aufweisen, die der Domäne
der variablen Region des Antikörpers
entspricht, der sich an das Protein bindet. Diese Peptide können chemisch
synthetisiert oder über
die DNA-Rekombinationstechnik unter Verwendung von Verfahren hergestellt
werden, die im Fachgebiet bekannt sind (siehe z.B. Creighton, 1983,
siehe oben; und Sambrook et al., 1989, oben). Wahlweise können auch
Einkettenantikörper
verabreicht werden, zum Beispiel neutralisierende Antikörper, die
sich an intrazelluläre
Epitope binden. Diese Einkettenantikörper können zum Beispiel verabreicht
werden, indem Nukleotidsequenzen exprimiert werden, die Einkettenantikörper in
der Zielzellpopulation verschlüsseln,
zum Beispiel unter Verwendung von Verfahren wie denen, die in Marasco
et al. (Marasco, W. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
7889–7893)
beschrieben sind.
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In
Fällen,
in denen das Protein, auf das der Antikörper gerichtet ist, extrazellulär oder ein
Transmembranprotein ist, kann jedes Verabreichungsverfahren, das
im Folgenden in Abschnitt 5.10 beschrieben ist und für die Verabreichung
von Peptiden geeignet ist, zur wirksamen Verabreichung der Antikörper an
ihre Wirkort eingesetzt werden.
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5.9.3.2 VERFAHREN ZUR
ERHÖHUNG
ODER VERMINDERUNG DER KONZENTRATION EINER BESTIMMTEN TH-ZELLSUBPOPULATION
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Die
Verfahren, die hier beschrieben sind, können entweder zur Verminderung
oder zur Erhöhung
der Gesamtzahl der Zellen verwendet werden, die zu einer bestimmten
TH-Zellsubpopulation gehören,
wodurch das Verhältnis
der interessierenden TH-Zellsubpopulation zu anderen TH-Zellsubpopulationen
wirksam erhöht oder
vermindert wird. Insbesondere sind Trennverfahren beschrieben, die
entweder zur Verringerung oder zur Vermehrung der Gesamtzahl der
Zellen verwendet werden, die in einer TH-Zellsubpopulation vorliegt,
und ferner sind Targeting-Verfahren beschrieben, die zur Verringerung
be stimmter TH-Zellsubpopulationen eingesetzt werden können.
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In
Abhängigkeit
von der jeweiligen Anwendung kann die Änderung der Anzahl von Zellen,
die zu einer TH-Zell-subpopulation
gehören,
entweder fördernde
oder hemmende Reaktionen hervorrufen, die zur Besserung von Störungen führen, die
mit TH-Zellsubpopulationen verbunden sind. Damit können die
Verfahren aus diesem Abschnitt in entsprechenden Fällen in
Verbindung mit den hemmenden Verfahren eingesetzt werden, die zuvor
in Abschnitt 5.9.1 beschrieben sind, oder wahlweise in Verbindung
mit den fördernden
Verfahren, die zuvor in Abschnitt 5.9.2 beschrieben sind.
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Die
Trennverfahren, die hier beschrieben sind, beruhen auf der Gegenwart
oder dem Fehlen von bestimmten Oberflächenmarkern, vorzugsweise Transmembranmarkern.
Diese Marker können
enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Marker der extrazellulären Domäne des TH1-spezifischen 200-Genprodukts.
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In
Fällen,
in denen das Ziel der Trennung die Erhöhung oder Vermehrung der Anzahl
von Zellen ist, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation gehören, kann
der verwendete Antikörper
auch spezifisch für Oberflächenmarker
sein, die auf undifferenzierten oder teilweise undifferenzierten
TH-Zellen vorliegen. Nach der Trennung und Reinigung dieser undifferenzierten
oder teilweise undifferenzierten TH-Zellen können die Zellen in physiologischem
Puffer oder Nährmedium
gezüchtet
werden und durch Züchtung
in Gegenwart von geeigneten Größen zur
Differenzierung veranlasst werden. Zum Beispiel kann IL-4 hinzugegeben
werden, damit die TH-Zellen
zur Differenzierung zu TH2-Zellen veranlasst werden, während das
Zytokin IL-12 hinzugegeben werden kann, um TH-Zellen zur Differenzierung
zu TH1-Zellen zu veranlassen. Nach der Differenzierung können die
Zellen gewaschen, wieder in zum Beispiel gepufferter physio logischer
Kochsalzlösung
suspendiert und, vorzugsweise intravenös, wieder in einen Patienten
eingebracht werden.
-
Es
können
Trennverfahren eingesetzt werden, mit denen Zellen in vitro aus
einer Population von Zellen wie blutbildenden Zellen getrennt und
gereinigt werden, die aus dem Körper
des behandelten Patienten stammen. Eine Startpopulation von Zellen,
die eine TH-Zellsubpopulation enthält, beispielsweise blutbildende Zellen,
kann unter Verwendung von gängigen
Verfahren gewonnen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Als eine
mögliche
Ausgangsquelle für
diese Verfahren kann peripheres Blut verwendet werden und kann beispielsweise über Venenpunktion
und Auffangen in heparinisierten Röhrchen gewonnen werden.
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Sobald
die Ausgangsquelle für
autologe Zellen gewonnen wurde, können die T-Zellen wie TH1-
oder TH2-Zellen entfernt werden, und damit durch verschiedene Verfahren
gezielt getrennt und gereinigt werden, bei denen Antikörper verwendet
werden, die bestimmte Marker binden, die auf der interessierenden
T-Zellpopulation vorhanden sind, während sie auf anderen Zellen
in der Ausgangsquelle nicht vorhanden sind. Diese Verfahren können zum
Beispiel die Durchflusszytometrie unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten
Zellsortierers (FACS) und bestimmter Fluoreszenzfarbstoffe umfassen,
Biotin-Avidin- oder
Biotin-Streptavidin-Trennverfahren unter Verwendung von Biotin,
das an Antikörpern
gekoppelt ist, die spezifisch für
Oberflächenmarker
sind, und Avidin oder Streptavidin, das an einen festen Träger gebunden
ist, beispielsweise die Matrix einer Affinitätssäule oder Kunststoffoberflächen, oder
magnetische Trennverfahren unter Verwendung von magnetischen Kügelchen,
die mit einem Antikörper
beschichtet sind.
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Die
Trennung über
Antikörper
für bestimmte
Marker kann durch negative oder positive Auswahlverfahren erfolgen.
-
Bei
der negativen Trennung werden Antikörper verwendet, die spezifisch
für Marker
sind, die sich auf unerwünschten
Zellen befinden. Zum Beispiel könnten
im Fall einer Störung,
die mit der TH1-Zellsubpopulation in Zusammenhang steht, bei der
es wünschenswert
wäre, die
Anzahl der TH1-Zellen zu verringern, diese Antikörper auf die extrazelluläre Domäne des 200-Genprodukts
gerichtet sein.
-
Bei
der positiven Trennung werden Antikörper verwendet, die spezifisch
für Marker
sind, die sich auf den erwünschten
interessierenden Zellen befinden. Zum Beispiel könnten im Fall einer Störung, die
mit der TH1-Zellsubpopulation
in Zusammenhang steht, bei der es wünschenswert wäre, die
Anzahl der TH1-Zellen zu erhöhen,
diese Antikörper
auf die extrazelluläre
Domäne
des 200-Genprodukts gerichtet sein. Zellen, die vom Antikörper gebunden
werden, werden getrennt und zurückgehalten.
Es versteht sich, dass positive und negative Trennverfahren im Wesentlichen
gleichzeitig oder aufeinander folgend verwendet werden können.
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Ein übliches
Verfahren der Trennung auf der Grundlage von Antikörpern ist
die Verwendung der Durchflusszytometrie, beispielsweise mit einem
fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS). Üblicherweise erfolgt die Trennung
durch Durchflusszytometrie folgendermaßen. Das suspendierte Zellgemisch
wird zentrifugiert und in Medien erneut suspendiert. Es werden Antikörper, die
an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt sind, hinzugegeben, damit
sich die Antikörper
an bestimmte Oberflächenmarker
binden können.
Das Zellgemisch wird anschließend
in einem oder mehreren Zentrifugations- und Resuspensionsschritten
gewaschen. Das Gemisch durchläuft
anschließend
einen FACS, der die Zellen auf der Grundlage verschiedener Fluoreszenzeigenschaften
trennt. FACS-Systeme sind in verschiedenen Leistungsstufen erhältlich,
einschließlich Mehrfarbanalyse.
Die „facilitating" Zelle kann mittels
eines kennzeichnenden Profils aus Vorwärts- und Seitwärtsstreuung
nachgewiesen werden, das durch Größe und Granularität sowie
durch positive und/oder negative Expression bestimmter Oberflächenmarker
beeinflusst wird.
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Weitere
Trennverfahren neben der Durchflusszytometrie können ebenfalls für eine schnelle
Trennung sorgen. Ein solches Verfahren ist die Trennung auf der
Grundlage von Biotin und Avidin mittels Affinitätschromatographie. Üblicherweise
wird dieses Verfahren durch Inkubation von Zellen mit an Biotin
gekoppelten Antikörpern
für bestimmte
Marker durchgeführt,
mit anschließendem
Durchlauf durch eine Avidinsäule.
Biotin-Antikörper-Zellkomplexe
binden sich über
die Biotin-Avidin-Wechselwirkung
an die Säule,
während
andere Zellen durch die Säule
durchlaufen. Die Spezifität
des Biotin-Avidin-Systems ist gut geeignet für schnelle positive Trennungen.
Mehrere Durchläufe
können
die Trennung einer ausreichenden Menge der interessierenden TH-Zellsubpopulation
gewährleisten.
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In
Fällen,
in denen das Ziel des Trennverfahrens darin besteht, die Gesamtzahl
der Zellen zu verringern, die zu einer TH-Zellsubpopulation gehören, können die
Zellen, die aus der Ausgangsquelle von Zellen gewonnen wurden, der
jetzt wirksam die Zellen der TH-Zellsubpopulation entzogen wurden,
wieder in den Patienten eingebracht werden. Diese Abnahme der TH-Zellsubpopulation
führt zur
Besserung von Störungen,
die mit TH-Zellsubpopulationen
in Zusammenhang stehen und mit der Wirksamkeit oder übermäßigen Wirksamkeit
der TH-Zell-subpopulation
verbunden sind. Das erneute Einbringen der Zellen, denen die TH-Zellsubpopulation
entzogen wurde, kann erfolgen, indem die Zellen gewaschen, in zum
Beispiel gepufferter physiologischer Kochsalzlösung erneut suspendiert und
die Zellen intravenös
einem Patienten verabreicht werden.
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Wenn
die Lebensfähigkeit
und die Ausbeute der Zellen ausreichen, können Zellen, denen die TH-Zellsubpopulation
entzogen wurde, sofort nach der Trennung wieder in Patienten eingebracht
werden. Wahlweise können
Zellen, denen die TH-Zellsubpopulation entzogen wurde, ex vivo gezüchtet und
vervielfältigt
werden, bevor sie einem Patienten verabreicht werden. Die Vervielfältigung
kann über
bekannte Verfahren erfolgen, bei denen physiologische Puffer oder
Nährmedien
in der Gegenwart geeigneter Faktoren zur Vervielfältigung
wie Interleukinen und anderen bekannten Wachstumsfaktoren verwendet
werden.
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In
Fällen,
in denen das Ziel des Trennverfahrens darin besteht, die Gesamtzahl
der Zellen zu vermehren oder erhöhen,
die zu einer TH-Zellsubpopulation gehören, können Zellen, die aus den gereinigten
Zellen der TH-Zellsubpopulation
wieder in den Patienten eingebracht werden, was zur Besserung von
Störungen führt, die
mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen und mit einer
zu geringen Wirksamkeit der TH-Zellsubpopulation verbunden sind.
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Die
Zellen, die wieder eingebracht werden sollen, werden vor dem erneuten
Einbringen ex vivo gezüchtet
und vervielfältigt.
Gereinigte Zellen der TH-Zellsubpopulation können gewaschen, in zum Beispiel
gepufferter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und über intravenöse Verabreichung,
wieder in den Patienten eingebracht werden.
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Die
Zellen, die vervielfältigt
werden sollen, können
unter Verwendung gängiger
Verfahren in Gegenwart eines geeigneten Mittels zur Vervielfältigung
gezüchtet
werden, das die Vermehrung der gereinigten TH-Zell-subpopulation auslöst. Ein
solches Mittel zur Vervielfältigung
können
beispielsweise alle geeigneten Zytokine, Antigene oder Antikörper sein.
Bei TH2-Zellen kann das Mittel zur Vervielfältigung IL-4 sein, während das
Mittel zur Vervielfältigung
bei TH1-Zellen beispielsweise IL-12 sein kann.
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Bevor
sie wieder in einen Patienten eingebracht werden, können die
gereinigten Zellen beispielsweise durch Transformation mit Gensequenzen
verändert
werden, die interessierende Genprodukte verschlüsseln. Diese Genprodukte sollten
Produkte sein, die die Wirksamkeit der gereinigten TH-Zellsubpopulation
verstärken,
oder wahlweise Produkte sein, die die Wirksamkeit einer oder mehrerer
der anderen TH-Zellsubpopulationen unterdrücken. Zelltransformations-
und Genexpressionsverfahren sind dem Fachmann bekannt und können wie
die sein, die zuvor in Abschnitt 5.5 beschrieben sind.
-
Bekannte
Targetingverfahren können
außerdem
in Fällen
verwendet werden, in denen das Ziel darin besteht, die Anzahl der
Zellen zu verringern, die zu einer bestimmten TH-Zellsubpopulation
gehören.
Diese Targetingverfahren können
in vivo oder in vitro erfolgen und können das Einbringen von Targetingmitteln
in eine Zellpopulation umfassen, sodass die Targetingmittel eine
bestimmte Untergruppe der Zellen in der Population gezielt zerstören. Die
Verfahren zur in vivo-Verabreichung, die bei diesen Targetingmitteln
durchgeführt werden
können,
sind im Folgenden in Abschnitt 5.10 beschrieben.
-
Targetingmittel
umfassen im Allgemeinen erstens einen Targetinganteil, der im vorliegenden
Fall das Targetingmittel dazu veranlasst, sich gezielt mit einer
bestimmten TH-Zellsubpopulation zu verbinden. Die Targetingmittel
umfassen im Allgemeinen zweitens einen Anteil, der in der Lage ist,
eine Zelle zu zerstören,
mit der sich das Targetingmittel verbunden hat.
-
Targetinganteile
können
enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antikörper, die
auf Oberflächenmarker
gerichtet sind, die insbesondere auf der TH-Zellsub population zu
finden sind, auf die abgezielt wird, oder die wahlweise auf Liganden
wie Wachstumsfaktoren gerichtet sind, die rezeptorartige Moleküle binden, die
ausschließlich
auf der TH-Zellsubpopulation zu finden sind, auf die abgezielt wird.
-
Bei
TH1-Zellen kann ein solcher Targetinganteil zum Beispiel einen Antikörper darstellen,
der gegen den extrazellulären
Abschnitt des 200-Genprodukts gerichtet ist, das hier beschrieben
ist, oder kann wahlweise einen Liganden darstellen, der kennzeichnend
für dieses
rezeptorartige TH1-spezifische Molekül ist.
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Zerstörende Anteile
enthalten alle Anteile, die in der Lage sind, eine Zelle unwirksam
zu machen oder zu zerstören,
an die sich das Targetingmittel gebunden hat. Beispielsweise kann
ein zerstörender
Anteil enthalten, ist jedoch nicht beschränkt auf, Zellgifte oder radioaktive
Stoffe. Zellgifte enthalten beispielsweise Giftstoffe, die aus Pflanzen,
Pilzen oder Bakterien gewonnen wurden, wobei Giftstoffe mit deglykosylierter
Ricin-A-Kette im Allgemeinen wegen ihrer Wirksamkeit und sehr langen
Halbwertszeit bevorzugt sind.
-
5.10. PHARMAZEUTISCHE
PRÄPARATE
UND VERFAHREN ZU IHRER VERABREICHNUNG
-
Die
Verbindungen, Nukleinsäuresequenzen
und Zellen der TH-Zellsubpopulation, die hier beschrieben sind,
können
einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Dosis verabreicht
werden, um Immunstörungen,
z.B. Störungen,
die mit einer TH-Zellsubpopulation in Verbindung stehen, zu behandeln
oder zu bessern. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezeichnet die
Menge einer Verbindung oder TH-Zellsubpopulation, die ausreicht,
um zur Besserung der Symptome von Immunstörungen zu führen, oder wahlweise, die Menge einer
Nukleinsäuresequenz,
die ausreicht, um eine Konzentration eines Genprodukts zu exprimieren,
die zur Besserung der Störungen
führt,
die mit TH-Zellsubpopulationen in Zusammenhang stehen, oder anderer
Immunstörungen.
-
5.10.1. WIRKDOSIS
-
Die
Giftigkeit und therapeutische Wirksamkeit von Verbindungen können mittels
gängiger
pharmazeutischer Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren ermittelt
werden, z.B. zur Bestimmung von LD50 (die
Dosis, die für
50% des Bestands tödlich
ist) und ED50 (die Dosis, die bei 50% des
Bestands therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis zwischen
toxischer und therapeutischer Wirkung ist die therapeutische Breite
und kann als das Verhältnis
LD50/ED50 ausgedrückt werden.
Es werden Verbindungen bevorzugt, die eine große therapeutische Breite aufweisen.
Obwohl Verbindungen verwendet werden können, die giftige Nebenwirkungen
aufweisen, sollte darauf geachtet werden, dass ein Eingabesystem
ausgestaltet wird, das diese Verbindungen zur Stelle des betroffenen
Gewebes bringt, um eine mögliche
Beschädigung
nicht-infizierter Zellen auf ein Mindestmaß herabzusetzen und dadurch
die Nebenwirkungen zu verringern.
-
Die
Daten, die aus den Zellkultur-Assays und den Tierversuchen gewonnen
werden, können
bei der Formulierung eines Dosisbereichs zur Verwendung beim Menschen
verwendet werden. Die Dosierung dieser Verbindungen liegt vorzugsweise
in einem Bereich der zirkulierenden Konzentration, der die ED50 bei geringer oder ohne Giftigkeit umfasst.
Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs schwanken, je nach
verwendeter Darreichungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg.
Für jede
Verbindung, die im Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann
die therapeutisch wirksame Dosis zuerst aus Zellkultur-Assays abgeschätzt werden.
In Tiermodellen kann eine Dosis erstellt werden, um einen Bereich
der zirkulierenden Plasmakonzentration zu erreichen, der die IC50 umfasst (d.h. die Konzentration der Testverbindung,
bei der die halbmaximale Hemmung der Symptome erreicht ist), wie
sie in Zellkulturen bestimmt wurde. Diese Angaben können für die genauere
Ermittlung der nützlichen
Dosis beim Menschen verwendet werden. Der Gehalt im Plasma kann
beispielsweise mit der Hocheistungsflüssigkeitschromatographie gemessen
werden.
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5.10.2. ZUBEREITUNGEN
UND VERWENDUNG
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen zur Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung
können
auf herkömmliche
Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch akzeptabler Träger oder
Hilfsstoffe zubereitet werden.
-
Damit
können
die Verbindungen und ihre physiologisch akzeptablen Salze und Lösungsmittel
zur Verabreichung durch Einatmung oder Einblasen (entweder durch
den Mund oder die Nase) oder zur oralen, bukkalen, parenteralen
oder rektalen Verabreichung zubereitet werden.
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Zur
oralen Verabreichung können
die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form von zum Beispiel
Tabletten oder Kapseln erhalten, die mit herkömmlichen Mitteln mit pharmazeutisch
akzeptablen Hilfsstoffen wie Bindemitteln (z.B. vorverkleisterte
Maisstärke,
Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylzellulose); Füllstoffen
(z.B. Laktose, mikrokristalline Zellulose oder Kalziumhydrogenphosphat),
Gleitmitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talkum oder Siliciumdioxid);
Sprengmittel (z.B. Kartoffelstärke
oder Natriumstärkeglykolat);
oder Netzmitteln (z.B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden.
Die Tabletten können
durch Verfahren beschichtet werden, die im Fachgebiet bekannt sind.
Flüssige
Zubereitungen zur oralen Verabreichung können die Form von zum Beispiel
Lösungen,
Sirups oder Suspensionen erhalten oder können als Trockenprodukt angeboten werden,
das vor Gebrauch mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger gemischt
wird. Diese flüssigen Zubereitungen
können
mit herkömmlichen
Mitteln mit pharmazeutisch akzeptablen Zusatzstoffen wie Suspensionsmitteln
(z.B. Sorbitolsirup, Zelluloseabkömmlinge oder gehärtete Speisefette);
Emulgatoren (z.B. Lecithin oder Gummi arabicum); nichtwässrigen
Trägern
(z.B. Mandelöl, Ölester,
Ethylalkohol oder fraktionierte pflanzliche Öle) und Konservierungsstoffen
(z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure) hergestellt
werden. Die Zubereitungen können
gegebenenfalls auch Puffersalze, Geschmacks-, Farb- und Süßstoffe enthalten.
-
Zubereitungen
zur oralen Verabreichung können
entsprechend derart zubereitet sein, dass die die wirksame Verbindung
kontrolliert abgeben.
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Zur
bukkalen Verabreichung können
die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen erhalten,
die auf herkömmliche
Weise zubereitet werden.
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Es
ist günstig,
wenn die Verbindungen, die zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung
bestimmt sind, zur Verabreichung durch Einatmen in Form von Aerosolsprays
aus unter Druck stehenden Verpackungen oder einem Zerstäuber geliefert
werden, wobei ein geeignetes Treibgas z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan,
Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes
Gas verwendet wird. Bei einem unter Druck stehenden Aerosol kann
die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils bestimmt
werden, mit dem eine gemessene Menge abgegeben wird. Es können Kapseln
und Patronen aus z.B. Gelatine, zur Verwendung in einem Inhalator
oder Insufflator so zubereitet werden, dass sie ein Pulvergemisch aus
der Verbindung und einer geeigneten Pulvergrundlage wie Laktose
oder Stärke
enthalten.
-
Die
Verbindungen können
zur parenteralen Verabreichung (d.h. intravenös oder intramuskulär) durch Einspritzen
zum Beispiel über
Bolusinjektion oder Dauerinfusion zubereitet werden. Zubereitungen
zum Einspritzen können
in Form einer Einzeldosis angeboten werden, z.B. in Ampullen oder
in Behältern
für mehrere Dosen,
mit Zugabe eines Konservierungsmittels. Die Zusammensetzungen können Formen
wie Suspensionen, Lösungen
oder Emulsionen in öligen
oder wässrigen
Trägerstoffen
erhalten und können
Hilfsmittel wie Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel
enthalten. Wahlweise kann der Wirkstoff in Pulverform vorliegen,
der vor Gebrauch mit einem geeigneten Träger, z.B. sterilem pyrogenfreiem
Wasser, gemischt wird. Es wird bevorzugt, dass die Zellen der TH-Zellsubpopulation
intravenös
in Patienten eingebracht werden.
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Die
Verbindungen können
auch als Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung wie Zäpfchen oder
Retentionseinläufen
zubereitet werden, die z.B. herkömmliche
Zäpfchengrundbestandteile
wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
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Zusätzlich zu
den Zubereitungen, die zuvor beschrieben sind, können die Verbindungen auch
als Depotpräparat
zubereitet werden. Diese Langzeitpräparate können durch Einpflanzung (beispielsweise
subkutan oder intramuskulär)
oder durch intramuskuläre
Einspritzung verabreicht werden. Damit können die Verbindungen zum Beispiel
mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Stoffen (beispielsweise
als Emulsion in einem akzeptablen Öl) oder Ionenaustauschharzen
zubereitet werden, oder als schwerlösliche Abkömmlinge, zum Beispiel als schwerlösliches
Salz.
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Die
Zusammensetzungen können,
wenn es erwünscht
ist, in einer Verpackung oder einem Spender angeboten werden, die
bzw. der eine oder mehrere Einzeldosen enthalten können, die
den Wirkstoff enthalten. Die Verpackung kann zum Beispiel eine Metall-
oder Kunststofffolie aufweisen, beispielsweise eine Durchdrückverpackung.
Der Verpackung oder dem Spender können Hinweise zur Verabreichung
beigelegt sein.
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5.11 DIAGNOSE- UND ÜBERWACHUNGSTECHNIKEN
-
Verschiedene
Verfahren können
zur Diagnose von Immunstörungen,
zum Beispiel Störungen,
die die TH-Zellensubpopulation betreffen, und die Veranlagung zu
solchen Immunstörungen,
zum Überwachen
der Wirksamkeit von Verbindungen für anti-immunologische Störungen während zum
Beispiel klinischer Versuche und zum Überwachen von Patienten, die
sich zur Behandlung solcher Störungen
einer klinische Beurteilung unterziehen, angewendet werden. Ferner
können
mehrere Verfahren zur Erkennung aktivierter Immunzellen, zum Beispiel
aktivierter Glieder der TH-Zellensubpopulationen, benutzt werden.
-
Diese
Verfahren können
zum Beispiel Reagenzien wie die Fingerabdruck-200-Gen-Nukleotidsequenzen
benutzen, die in Abschnitt 5.1 beschrieben worden sind, und Antikörper, die
gegen differentiell ausgeprägte
200-Genpeptide gerichtet
sind und in Abschnitt 5.5 (Peptide) und 5.6 (Antikörper) beschrieben
worden sind. Insbesondere wenn das Zielgen das 200-Gen ist, können diese
Reagenzien benutzt werden, zum Beispiel für: 1) die Erkennung der Gegenwart
einer Zielgenausprägung,
Zielgenmutationen, die Erkennung von Über- oder Unterausprägung einer
Zielgen-mRNA bezüglich
des nicht immunologischen Störungszustands
oder bezüglich
einer nicht aktivierten TH-Zellensubpopulation; 2) die Erkennung
von entweder einer übermäßigen oder
zu geringen Häufigkeit
eines Zielgenprodukts bezüglich
des nicht immunologischen Störungszustandes
oder bezüglich
des Zustands der nicht aktivierten TH-Zellenpopulation; und 3) die
Identifizierung von spezifischen Zellen der TH-Zellensubpopulation
(zum Beispiel TH-Zellen, die an einer immunologischen Störung beteiligt
sind oder aktivierte TH-Zellen) innerhalb einer gemischten Zellpopulation.
-
Die
hier beschriebenen Verfahren können
zum Beispiel durch Benutzung von fertig verpackten Diagnosesätzen durchgeführt werden,
die mindestens eine spezifische Fingerabdruck-200-Gen-Nukleinsäure oder eine
hier beschriebene Anti-Fingerabdruck-200-Gen-Antikörperreagenz
umfassen und die zweckmäßig zum Beispiel
in klinischen Umgebungen verwendet werden können, um bei Patienten eine
Diagnose zu stellen, die TH1- oder TH2-bezogene Abnormalitäten zeigen.
-
Jeder
Zelltyp oder jedes Zellgewebe, vorzugsweise TH-Zellen, in denen das Fingerabdruck-200-Gen ausgeprägt ist,
kann in den unten beschriebenen Diagnoseverfahren verwendet werden.
-
Unter
den Verfahren, die hier benutzt werden können, befinden sich Verfahren
zum Überwachen
der Wirksamkeit von Verbindungen in klinischen Untersuchungen zur
Behandlung von Immunstörungen.
Solche Verbindungen können
zum Beispiel Verbindungen wie die oben in Abschnitt 5.9 beschriebenen
sein. Solch ein Verfahren umfasst in einer Patientenprobe das Erkennen
einer 200-Gen-Transkription
oder eines 200-Genprodukts, das in einer TH-Zellensubpopulation
in einem immunologischen Störungszustand
bezüglich
seiner Ausprägung
in der TH-Zellensubpopulation
differentiell ausgeprägt
ist, wenn sich die Zellensubpopulation in einem normalen Zustand
oder nicht immunologischen Störungszustand
befindet.
-
Alle
der unten in Abschnitt 5.11.1 beschriebenen Nukleinsäure-Erkennungstechniken
oder alle der unten in Abschnitt 5.11.2 beschriebenen Peptid-Erkennungstechniken
können
zur Erkennung der Gentranskription oder des Genprodukts benutzt
werden, das in der immunologisch gestörten TH-Zellensubpopulation
bezüglich
seiner Ausprägung
im Normalzustand oder im nicht immunologischen Störungszustand
differentiell ausgeprägt
ist.
-
Während klinischer
Untersuchungen können
zum Beispiel die Ausprägung
eines einzigen Fingerabdruck-Gens oder alternativ das Fingerabdruckmuster
einer TH-Zellensubpopulation für
die TH-Zellensubpopulation in Gegenwart oder Abwesenheit der zu
testenden Verbindung bestimmt werden. Die Wirksamkeit der Verbindung
kann durch Vergleichen der Ausprägungsdaten
nachvollzogen werden, die für
die entsprechenden bekannten Ausprägungsmuster für die TH-Zellensubpopulation
in einem normalen, nicht immunologisch gestörten Zustand erhalten werden.
Verbindungen, die eine Wirksamkeit zeigen, sind diejenigen, die
die einzige Fingerabdruck-200-Genausprägung und/oder
das Fingerabdruckmuster der immunologisch gestörten TH-Zellensubpopulation
derart verändern,
dass sie mehr derjenigen der normalen, nicht immunologisch gestörten TH-Zellensubpopulation ähneln.
-
Die
Erkennung des Produkts oder der Produkte von Genen, die in einer
TH-Zellensubpopulation in einem immunologischen Störungszustand
bezüglich
ihrer Ausprägung
in der TH-Zellensubpopulation differentiell ausgeprägt sind,
wenn sich die Zellsubpopulation in einem normalen, nicht immunologisch
gestörten
Zustand befindet, kann während
klinischer Untersuchungen auch zum Überwachen der Wirksamkeit von
potentiellen Anti-Immunstörungs-Verbindungen
benutzt werden. Während
klinischer Testuntersuchungen können zum
Beispiel der Pegel und/oder die Aktivität der Produkte eines oder mehrerer
solcher differentiell ausgeprägten
Gene für
die TH-Zellenpopulation in Gegenwart oder Abwesenheit der zu testenden
Verbindung bestimmt werden. Die Wirksamkeit der Verbindung kann
durch Vergleichen der Daten bezüglich
Proteinpegel und/oder -aktivitäten
nachvollzogen werden, die für
die entsprechenden bekannten Pegel/Aktivitäten für die TH-Zellensubpopulation
in einem normalen, nicht immunologisch gestörten Zustand erhalten werden.
Wirksame Verbindungen sind solche, die das Muster der immunologisch
gestörten
TH-Zellensubpopulation derart verändern, dass sie mehr demjenigen
der normalen, nicht immunologisch gestörten TH-Zellensubpopulation ähneln.
-
Die
Ausprägungsmuster
des 200-Gens in TH1-Zellensubpopulationen bezüglich TH2-Zellensubpopulationen
kann die Erkennung von Transkriptionen und/oder Produkten dieser
Gene zur Überwachung
der Wirksamkeit von Verbindungen in klinischen Testuntersuchungen
für die
Behandlung von Immunstörungen
besonders geeignet machen, die die TH1-Zellensubpopulation betreffen,
wie zum Beispiel Multiple Sklerose, Psoriasis oder insulin-abhängige Diabetes.
-
Unter
den zusätzlichen
Verfahren, die hier benutzt werden können, befinden sich Verfahren
zum Erkennen der TH-Zellenreaktionsfähigkeit, zum Beispiel der Reaktionsfähigkeit
auf Antigene, und zum Erkennen von aktivierten Immunzellen, zum
Beispiel aktivierten Gliedern der TH-Zellensubpopulation. Diese
Erkennungsverfahren sind insofern bedeutend, als viele Immunstörungen mit
unangemessenen, eher als mit unzureichenden Immunreaktionen in Verbindung
stehen. Solche Erkennungsverfahren können zum Beispiel zum Erkennen
einer Veranlagung zu einer Immunstörung angewendet werden.
-
Verfahren
zum Erkennen von TH-Zellenreaktionsfähigkeit und/oder -aktivierung
können
zum Beispiel das Erkennen einer Gentranskription oder eines Produkts
in einer TH-Zellenprobe
umfassen, das in der TH-Zellensubpopulation differentiell ausgeprägt ist,
die sich bezüglich
einer TH-Zellensubpopulation, die sich in einem nicht aktivierten
oder nicht reaktionsfähigen
Zustand befindet, in einem aktivierten oder reaktionsfähigen Zustand
befindet (zum Beispiel einem Zustand, in dem die TH-Zellensubpopulation
einem Antigen ausgesetzt worden ist).
-
Alle
unten in Abschnitt 5.11.1 beschriebenen Nukleinsäure-Erkennungstechniken oder
alle unten in Abschnitt 5.11.2 beschriebenen Peptid-Erkennungstechniken
können
verwendet werden, um solch eine differentiell ausgeprägte Gentranskription
oder Genprodukt zu erkennen.
-
Die
Erkennung der Gentranskriptionen und/oder Produkte, die zum Erkennen
der Aktivierung und/oder der TH1-spezifischen
Wesensart des 200-Gens besonders geeignet sind, kann die Erkennung
von Transkriptionen und/oder Produkten dieses Gens besonders geeignet
machen, um die TH1-Aktivierung und/oder -Reaktionsfähigkeit
zu erkennen.
-
5.11.1 ERKENNUNG VON FINGERABDRUCK-GEN-NUKLEINSÄUREN
-
DNA
oder RNA aus dem zu analysierenden Zelltyp oder -gewebe kann leicht
unter Verwendung von Verfahrensweisen isoliert werden, die dem Fachmann
gut bekannt sind. Diagnoseverfahren können ebenfalls „in situ" direkt auf zum Beispiel
Gewebesektionen (fixierte und/oder gefrorene) von Patientengewebe
ausgeführt
werden, das aus Biopsien oder Resektionen erhalten worden ist, so
dass keine Nukleinsäurereinigung notwendig
ist. Nukleinsäurereagenzien
wie die in Abschnitt 5.4 beschriebenen können als Sonden und/oder Primer
für solche
In-Situ-Verfahrensweisen
benutzt werden (siehe zum Beispiel Nuovo, G. J., 1992, „PCR In Siut
Hybridization: Protocols and Applications", Raven Press, NY). Die Ausprägung von
spezifischen Zellen innerhalb einer Zellenpopulation kann ebenfalls
durch zum Beispiel die oben beschriebenen In-Situ-Techniken oder
durch standardmäßige flusszytometrische
Techniken bestimmt werden.
-
Fingerabdruck-200-Gen-Nukleotidsequenzen,
entweder RNA oder DNA, können
zum Beispiel in Hybridisierungs- oder Amplifikationsuntersuchungen
von biologischen Proben benutzt werden, um die Störungsgenstrukturen
und die Ausprägung
zu erkennen, die mit der TH-Zellensubpopulation in Verbindung stehen. Solche
Untersuchungen können
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Southern- oder Northern-Analysen, einsträngige Konformationspolymorphismusanalysen,
In-Situ-Hybridisierungsuntersuchungen und Polymerasekettenreaktionsanalysen.
Solche Analysen können
sowohl quantitative Aspekte von Ausprägungsmustern des Fingerabdruck-200-Gens
als auch qualitative Aspekte der Fingerabdruck-Genausprägung und/oder
Genzusammensetzung enthüllen.
Das heißt,
solche Techniken können
nicht nur die Gegenwart der 200-Gen-Ausprägung, sondern auch die Ausprägungsmenge
erkennen und insbesondere erkennen, welche spezifischen Zellen das
200-Gen ausprägen
und ferner zum Beispiel Punktmutationen, Insertionen, Deletionen,
Chromosom-Neuanordnungen und/oder die Aktivierung oder Deaktivierung
der 200-Gen-Ausprägung
erkennen können.
-
Diagnoseverfahren
zur Erkennung von Fingerabdruck-Gen-spezifischen Nukleinsäuremolekülen können zum
Beispiel das Kontaktieren und Inkubieren von Nukleinsäuren, die
aus dem analysierten Zelltyp oder -gewebe abgeleitet werden, mit
einer oder mehreren markierten Nukleinsäurereagenzien, die in Abschnitt
5.4 beschrieben sind, betreffen, und zwar unter Bedingungen, die
das spezifische Annealing dieser Reagenzien an ihre komplementären Sequenzen
innerhalb des betreffenden Nukleinsäuremoleküls begünstigen. Vorzugsweise betragen
die Längen
dieser Nukleinsäurereagenzien
mindestens 15 bis 30 Nukleotide. Nach der Inkubation werden alle
nicht durch Annealing hybridisierten Säuren aus der Nukleinsäure entfernt:
Fingerabdruckmolekülhybrid.
Die Gegenwart von Nukleinsäuren
aus dem Zelltyp oder -gewebe, das hybridisiert worden ist, wenn
solche Moleküle
existieren, wird dann erkannt. Unter Benutzung dieses Erkennungsschemas
kann die Nukleinsäure
aus dem betreffenden Gewebe oder Zelltyp zum Beispiel an einem festen
Träger
wie einer Membran oder einer Kunststoff fläche wie der auf einer Microtiter-Platte
oder Polystyrolkugeln immobilisiert werden. In diesem Fall werden
die nicht durch Annealing hybridisierten, markierten Nukleinsäurereagenzien
des in Abschnitt 5.4 beschriebenen Typs nach der Inkubation leicht
entfernt. Die Erkennung der verbleibenden, durch Annealing hybridisierten,
markierten Fingerabdruck-Nukleinsäurereagenzien wird durch Anwenden
von Standardtechniken erreicht, die dem Fachmann gut bekannt sind.
-
Alternative
Diagnoseverfahren zur Erkennung von Fingerabdruck-Gen-spezifischen
Nukleinsäuremolekülen können ihre
Amplifikation umfassen, zum Beispiel durch PCR (die experimentelle
Ausführungsform
ist in Mullis, K. B., 1987, US-Patentschrift Nr. 4,683,202 dargelegt),
Ligasekettenreaktion (Barany, F., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88: 189–193),
selbst erhaltende Sequenzreplikation (Guatelli, J. C. et al., 1990,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878), Transkriptionsamplifikationssystem
(Kwoh, D. Y et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177),
Q-Beta-Replikase (Lizardi, P. M. et al., 1988, Bio/Technology 6:
1197), oder durch jedes andere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren,
gefolgt von der Erkennung der erweiterten Moleküle unter Benutzung von Techniken,
die dem Fachmann gut bekannt sind. Diese Erkennungsschemata sind
insbesondere für
die Erkennung von Nukleinsäuremolekülen nützlich,
wenn solche Moleküle
in einer sehr geringen Anzahl vorliegen.
-
In
einer Ausführungsform
eines solchen Erkennungsschemas wird ein cDNA-Molekül aus einem
bestimmten RNA-Molekül erhalten
(zum Beispiel durch die umgekehrte Transkription des RNA-Moleküls in cDNA).
Zelltypen oder Gewebe, aus denen solch eine RNA isoliert werden
kann, umfassen alle Gewebe, in denen das Wildtyp-Fingerabdruck-200-Gen
ausgeprägt
sein kann, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf TH0-, TH1- und/oder TH2-Zelltyp
enthaltende Gewebe. Eine Sequenz innerhalb der cDNA wird dann als
Schablone für
eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion
wie einer PCR-Amplifikationsreakion oder dergleichen benutzt. Die
Nukleinsäurereagenzien,
die in den Schritten der umgekehrten Transkription und Nukleinsäure-Amplifikation
dieses Verfahrens als Synthese-Initiationsreagenzien (zum Beispiel
Primer) benutzt werden, werden aus den Fingerabdruck-200-Gen-Nukleinsäurereagenzien
ausgewählt,
die in Abschnitt 5.4 beschrieben sind. Die bevorzugten Längen solcher
Nukleinsäurereagenzien
betragen mindestens 9 bis 30 Nukleotide. Zur Erkennung des amplifizierten
Produkts kann die Nukleinsäure-Amplifikation unter
Verwendung von radioaktiv oder nicht radioaktiv markierten Nukleotiden
ausgeführt
werden. Alternativ kann genug amplifiziertes Produkt hergestellt
werden, so dass das Produkt durch eine standardmäßige Ethidiumbromidfärbung oder
durch Anwendung irgendeines anderen Nukleinsäure-Färbeverfahrens sichtbar gemacht
werden kann.
-
Außer Verfahren,
die den Schwerpunkt primär
auf die Erkennung einer Fingerabdruck-Nukleinsäuresequenz legen, können Fingerabdruckmuster
in solchen Erkennungsschemata auch bewertet werden. Fingerabdruckmuster
enthalten in diesem Kontext das Muster der mRNA-Ausprägung einer
Serie (das heißt,
mindestens zwei) Fingerabdruck-Gene, die für ein gegebenes Gewebe oder
einen Zelltyp unter gegebenen Bedingungen erhalten werden. Solche
Bedingungen können
zum Beispiel Störungen
umfassen, die die TH-Zellensubpopulation betreffen, und Bedingungen,
die für
Prozesse relevant sind, die mit der Differenzierung, Beibehaltung
und der Effektorfunktion der TH-Zellensubpopulation in Verbindung
stehen.
-
TH1-bezogene
Störungen
können
zum Beispiel chronische Entzündungskrankheiten
und -störungen umfassen
wie die Crohn-Krankheit, reaktive Arthritis umfassend die Lyme-Krankheit, insulinabhängige Diabetes,
organspezifische Autoimmunität
umfassend Multiple Sklerose, Hashimoto-Thyreoiditis und die Basedow-Krankheit,
Kontaktdermatitis, Psoriasis, Abstoßung, Graft-versushost-Krankheit
und Sarkoidose. TH2-bezogene Störungen
können
zum Beispiel atopische Zustände
wie Asthma und Allergie umfassen, allergische Rhinitis, gastrointestinale
Allergien umfassend Lebensmittelallergien, Eosinophilie, Konjunktivitis,
glomeruläre Nephritis,
bestimmte pathogene Disponiertheiten wie Helminth-Infektionen (zum
Beispiel Leishmaniase) und bestimmte Virusinfektionen einschließlich HIV,
und bakterielle Infektionen einschließlich Tuberkulose und lepromatöse Lepra.
-
Fingerabdruckmuster
können
zum Beispiel durch Anwenden eines differentiellen Anzeigeverfahrens wie
die oben in Abschnitt 5.1.1.2 beschriebene Northern-Analyse und/oder
RT-PCR erzeugt werden. Alle der oben in Abschnitt 3.2.1 beschriebenen
200-Gen-Sequenzen können
als Sonden und/oder RT-PCR-Primer für die Erzeugung und Bekräftigung
solcher Fingerabdruckmuster benutzt werden.
-
5.11.2 ERKENNUNG VON ZIELGENPEPTIDEN
-
Antikörper, die
gegen Wildtyp- oder mutierte Fingerabdruck-Genpeptide gerichtet
und oben in Abschnitt 5.6 beschrieben sind, können ebenfalls als TH-Zellensubpopulation-bezogene
Störungsdiagnoseverfahren
und Prognoseverfahren benutzt werden, wie zum Beispiel hier beschrieben
ist. Solche Diagnoseverfahren können
benutzt werden, um das Fingerabdruck-Gen-Produkt, Abnormalitäten im Niveau
der Fingerabdruck-Genproteinausprägung oder
Abnormalitäten
in der Struktur und/oder der temporären, das Gewebe betreffenden,
zellulären
oder subzellulären
Position des Fingerabdruck-Genproteins zu erkennen. Strukturelle Unterschiede
können
zum Beispiel die Unterschiede in der Größe, Elektronegativität oder Antigenizität des mutierten
Fingerabdruck-200-Gensproteins bezüglich des normalen Fingerabdruck-200-Genproteins
umfassen.
-
Ein
aus dem Gewebe oder Zelltyp zu analysierendes Protein kann unter
Anwendung von Verfahren leicht isoliert werden, die dem Fachmann
gut bekannt sind. Die hier angewendeten Proteinisolierungsverfahren
können
zum Beispiel diejenigen sein, die in Harlow und Lane (Harlow, E.
und Lane, D., 1988, „Antibodies: A
Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)
beschrieben sind.
-
Bevorzugte
Diagnoseverfahren zur Erkennung von Wildtyp- oder mutierten Fingerabdruck-Genpeptidmolekülen können zum
Beispiel Immunassays umfassen, wobei Fingerabdruck-Genpeptide durch
ihre Interaktion mit einem Anti-Fingerabdruck-Genprodukt-spezifischen
Antikörper
erkannt werden.
-
Zum
Beispiel können
Antikörper
oder Fragmente von Antikörpern
benutzt werden, wie solche, die in Abschnitt 5.6 beschrieben und
in der vorliegenden Erfindung nützlich
sind, um die Gegenwart von Wildtyp- oder mutierten Fingerabdruck-200-Genpeptiden
quantitativ oder qualitativ zu erkennen. Dies kann zum Beispiel
durch Immunofluoreszenztechniken unter Verwendung eines fluoreszent
markierten Antikörpers
(siehe unten in diesem Abschnitt) in Verbindung mit einer lichtmikroskopischen,
flusszytometrischen oder fluormetrischen Erkennung erreicht werden.
Solche Techniken werden besonders bevorzugt, wenn die Fingerabdruck-Genpeptide
auf der Zelloberfläche
ausgeprägt
sind, wie es zum Beispiel der Fall bei dem 200-Genprodukt ist. Folglich
können
die hier beschriebenen Techniken benutzt werden, um spezifische
Zellen innerhalb einer Zellenpopulation zu erkennen, die das betreffende
Fingerabdruck-200-Genprodukt
ausprägen.
-
Die
Antikörper
(oder Fragmente davon), die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
können
zur In-Situ-Erkennung
von Fingerabdruck-Genpeptiden außerdem histologisch, wie in
der Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie verwendet
werden. Die In-Situ-Erkennung
kann durch Entfernen einer histologischen Probe aus einem Patienten
und durch Aufbringen eines markierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung
darauf erreicht werden. Der Antikörper (oder das Fragment) wird
vorzugsweise durch Überdecken des
markierten Antikörpers
(oder Fragments) auf eine biologische Probe aufgebracht. Durch die
Anwendung dieser Verfahrensweise ist es möglich, nicht nur die Gegenwart
der Fingerabdruck-200-Genpeptide zu bestimmen, sondern auch ihre
Aufteilung in dem untersuchten Gewebe. Durch die Benutzung der vorliegenden
Erfindung wird der Durchschnittsfachmann leicht erkennen, dass alle
der zahlreichen histologischen Verfahren (wie das Färbungsverfahren)
modifiziert werden können,
um solche eine In-Situ-Erkennung
zu erreichen.
-
Immunassays
für Wildtyp-
oder mutierte Fingerabdruck-Genpeptide
umfassen typischerweise das Inkubieren einer biologischen Probe
wie eines biologischen Fluids, eines Gewebeauszugs, frisch geernteter
Zellen oder Zellen, die in einer Gewebekultur inkubiert worden sind,
in Gegenwart eines erkennbar markierten Antikörpers, der in der Lage ist,
Fingerabdruck-200-Genpeptide zu identifizieren, und das Erkennen
des gebundenen Antikörpers
durch irgendeine der zahlreichen, auf dem Fachgebiet gut bekannten
Techniken.
-
Die
biologische Probe kann mit einem Festphasenhalter oder -träger wie
Nitrozellulose oder einem anderen Festträger, der dazu fähig ist,
Zellen, Zellpartikel oder lösliche
Proteine zu immobilisieren, in Kontakt gebracht und darauf immobilisiert
werden. Der Träger
kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen und danach mit dem erkennbar
markierten genspezifischen Fingerab druck-Antikörper behandelt werden. Der
Festphasenträger
kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um den
ungebundenen Antikörper
zu entfernen. Die Menge der gebundenen Markierung auf dem Festträger kann
dann durch herkömmliche
Mittel erkannt werden.
-
Mit „Festphasenhalter
oder -träger" ist jeglicher Träger gemeint,
der ein Antigen oder einen Antikörper binden
kann. Gut bekannte Halter oder Träger enthalten Glas, Polystyrol,
Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und
modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit. Die
Art des Trägers
kann entweder bis zu einem gewissen Maße löslich oder zum Zwecke der vorliegenden
Erfindung nicht löslich
sein. Das Trägermaterial
kann praktisch jede mögliche
strukturelle Konfiguration aufweisen, solange das verbundene Molekül dazu in
der Lage ist, sich an ein Antigen oder einen Antikörper zu
binden. Somit kann die Trägerkonfiguration
kugelförmig
wie bei einer Kugel oder zylindrisch wie die Innenfläche eines
Reagenzglases oder die Außenfläche einer
Stange sein. Alternativ kann die Oberfläche flach wie ein Blatt, Teststreifen
usw. sein. Bevorzugte Träger
umfassen Polystyrolkugeln. Der Fachmann kennt viele andere geeignete Träger zum
Binden eines Antikörpers
oder Antigens oder ermittelt diese durch Routineexperimente.
-
Die
Bindeaktivität
einer gegebenen Gruppe von Anti-Wildtyp-
oder mutierten Fingerabdruck-Genprodukt-Antikörpern kann gemäß gut bekannten
Verfahren bestimmt werden. Der Fachmann kann die betrieblichen und
optimalen Untersuchungsbedingungen für jede Bestimmung durch routinemäßiges Experimentieren bestimmen.
-
Eine
Art und Weise, auf die der Fingerabdruck-200-Genpeptid-spezifische Antikörper erkennbar
markiert werden kann, ist durch das Binden desselben an ein Enzym
und durch die Benutzung in einem Enzymimmunassay (EIA) (Voller,
A., "The Enzyme
Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2: 1–7, Microbiolgical
Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller, A.
et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31: 507–520; Butler, J. E., 1981,
Meth. Enzymol. 73: 482–523;
Maggio, E. (ed.), 1980, ENZYME IMMUNOASSAY, CRC Press, Boca Raton,
FL; Ishikawa, E. et al., (eds.), 1981, ENZYME IMMUNOASSAY, Kgaku
Shoin, Tokyo). Das Enzym, das an den Antikörper gebunden ist, reagiert
mit einem geeigneten Substrat, vorzugsweise einem chromogenen Substrat
derart, dass es einen chemischen Anteil herstellt, der zum Beispiel
durch spektrometrische, fluorimetrische oder visuelle Mittel erkannt
werden kann. Enzyme, die benutzt werden können, um den Antikörper erkennbar
zu markieren, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf Malatdehydrogenase,
Staphylococcalnuklease, Delta-5-Steroidisomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase,
Alpha-Glycerophosphat, Dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase,
Alkalinphosphatase, Asparaginase, Glukoseoxidase, Beta-Galactosidase,
Ribonuklease, Urease, Katalase, Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, Glukoamylase
und Acetylcholinesterase. Die Erkennung kann durch colorimetrische
Verfahren erreicht werden, die ein chromogenes Substrat für das Enzym
benutzen. Die Erkennung kann auch durch den visuellen Vergleich
des Ausmaßes
der Enzymreaktion eines Substrats im Vergleich zu ähnlich hergestellten
Maßstäben erreicht
werden.
-
Die
Erkennung kann auch durch eines von vielen anderen Immunassays erreicht
werden. Zum Beispiel ist es durch die radioaktive Markierung der
Antikörper
oder Antikörperfragmente
möglich,
die Fingerabdruck-200-Gen-Wildtyp-
oder -mutierten Peptide durch die Verwendung eines Radioimmunassays
(RIA) zu erkennen (siehe zum Beispiel Weintraub, B., Principles
of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay
Techniques, The Endocrine Society, März, 1986). Das radioaktive
Isotop kann durch diese Mittel wie die Benutzung eines Gammazählers oder
eines Szintillationszählers
oder durch Autoradiographie erkannt werden.
-
Es
ist ebenfalls möglich,
den Antikörper
mit einer fluoreszenten Verbindung zu markieren. Wenn der fluoreszent
markierte Antikörper
Licht mit einer geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine
Gegenwart aufgrund der Fluoreszenz erkannt werden. Unter den am
meisten verwendeten fluoreszent markierten Verbindungen befinden
sich Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin,
Allophycocyanin, o-Phthaladehyd und Fluorescamin.
-
Der
Antikörper
kann auch mit Hilfe von Fluoreszenz ausstrahlenden Metallen wie 152Eu oder anderen Metallen aus der Lanthanid-Serie
erkennbar markiert werden. Diese Metalle können an dem Antikörper mit
Hilfe solcher Metall-Komplexbildner-Gruppen wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)
oder Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA) befestigt werden.
-
Der
Antikörper
kann ebenfalls durch Verbinden mit einer chemilumineszenten Verbindung
erkennbar markiert werden. Die Gegenwart des chemilumineszent markierten
Antikörpers
wird dann durch Erkennen der Gegenwart von Lumineszenz erkannt,
die im Laufe einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele von besonders
nützlichen
chemilumineszent markierten Verbindungen sind Luminol, Isoluminol,
theromatisches Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
-
Gleichermaßen kann
eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der
vorliegenden Erfindung zu markieren. Die Biolumineszenz ist eine
Art Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen auftritt, in
denen ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten
Reaktion erhöht.
Die Gegenwart eines biolumineszenten Proteins wird durch Erkennen
der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszente
Verbindungen für
Markierungszwecke sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
-
6. BEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG
UND CHARAKTERISIERUNG EINES GENS, DAS IN TH1- und TH2-ZELLEN DIFFERENTIELL
AUSGEPRÄGT
IST
-
Die
Nützlichkeit
des Paradigmenansatzes der Erfindung zur Identifizierung von Genen,
die in TH-Zellensubpopulationen differentiell ausgeprägt sind,
wird nachgewiesen.
-
6.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
-
Transgene Mäuse:
-
Naive
CD4'-Zellen wurden
aus Milz und/oder Lymphknoten von nicht initiierten transgenen Mausstämmen erhalten,
die einen T-Zellenrezeptor (TCR) beherbergen, der Ovalbumin (Murphy
et al., 1990, Science 250: 1720) erkennt.
-
OVA-spezifische transgene
T-Zellen:
-
Suspensionen
von OVA-spezifischen T-Zellen wurden mit einem stimulierenden Peptidantigen
und Zellen, die ein Antigen aufweisen, im Wesentlichen wie in Murphy
et al. (Murphy et al., 1990, Science 250: 1720) beschrieben zusammen
kultiviert. Die T-Zellen mit 2–4 × 106 wurden mit etwa zweimal soviel TA3-Zellen, die
ein Antigen aufweisen, zusammen mit 0,3 μM OVA-Peptid inkubiert. TH1-Kulturen
enthielten etwa 10 ng/ml rekombinantes mIL-12. Umgekehrt erhielten
die TH2-Zellen IL-4 (1.000 μ/ml).
Die Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Initiierung
der Kultur geerntet. Die T-Zellen wurden von den TA3-Zellen unter Verwendung
von anti-CD4 beschichteten magnetischen Kugeln (Dynal, Inc.) gereinigt.
Die T-Zellen wurden durch sanftes Zentrifugieren pelletiert und
in das geeignete RNAzolTM-Volumen (Tel-Test, Friendswood,
TX) lysiert.
-
Gewebesammlung und RNA-Isolierung:
-
Die
Zellen wurden auf Trockeneis schnell gefroren. Die Proben wurden
dann zusammen mit einem Mörser
und Stößel unter
flüssigem
Nitrogen homogenisiert.
-
Die
gesamte zelluläre
RNA wurde aus dem Gewebe entweder mit RNAzolTM oder
RNAzolBTM (Tel-Test, Friendswood, TX) gemäß den Anweisungen
des Herstellers extrahiert. Das Gewebe wurde kurz in einer angemessenen
Menge RNAzolTM oder RNAzolETM löslich gemacht
und RNA wurde durch Zugabe von 1/10 v/v Chloroform zu der löslich gemachten
Probe extrahiert, die danach etwa 15 Sekunden lang kräftig geschüttelt wurde.
Die Mischung wurde dann 15 Minuten bei 12.000 g zentrifugiert und
die wässrige
Phase wurde in ein anderes Reagenzglas entfernt. Die RNA wurde mit
Isopropanol gefällt.
Das resultierende RNA-Granulat wurde in Wasser aufgelöst und mit
einem gleichen Chloroformvolumen reextrahiert, um jegliche Phenolreste
zu entfernen. Das extrahierte Volumen wurde mit 2 Ethanolvolumina
zusammen mit 150 mM Natriumacetat gefällt. Die gefällte RNA
wurde in Wasser aufgelöst
und die Konzentration wurde spektroskopisch bestimmt (A260).
-
Differentielle Anzeige:
-
Die
gesamte zelluläre
RNA (10 bis 50 μg)
wurde mit 20 Einheiten DNase I (Boehringer Mannheim, Deutschland)
zusammen mit 40 Einheiten Ribonuklease-Inhibitor (Boehringer Mannheim,
Deutschland) behandelt. Nach der Extraktion mit einer Phenol-/Chloroform-
und Ethanolfällung
wurde die RNA in mit DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandeltem Wasser
aufgelöst.
-
Die
differentielle mRNA-Anzeige wurde wie oben in Abschnitt 5.1.1.2
beschrieben ausgeführt.
Die RNA (0,4 bis 2 μg)
wurde unter Anwendung der Superscript Reverse Transcriptase (GIBCO/BRL)
umgekehrt transkribiert. Die cDNA wurden dann durch PCR auf einem
Thermocycler 9600 von Perkin-Elmer erweitert. Die Reaktionsmischungen
(20 μl)
enthielten willkürliche
Decanukleotide und eine von zwölf
möglichen
T11VN-Sequenzen, wobei V entweder dG, dC
oder dA darstellt und N entweder dG, dT, dA oder dC darstellt. Die
Parameter für
die 40-Zyklen-PCR waren wie folgt: Halten 94°C für 2 Minuten; Zyklus 94°C für 15 Sekunden,
40°C für 2 Minuten;
Rampe bis 72°C
für 30
Sekunden; Halten 72°C
für 5 Minuten;
Halten 4°C.
-
Die
radiomarkierten PCR-Amplifikationsprodukte wurden durch Elektrophorese
auf 6% denaturierende Polyacrylamidgele analysiert.
-
Reamplifikation und Subklonierung:
-
Die
betreffenden PCR-Bänder
wurden aus Sequenzgelen wiederhergestellt und reamplifiziert.
-
Die
Autoradiogramme wurden mit dem getrockneten Gel gebildet und der
Bereich, der die betreffenden Bänder
enthält,
wurde mit einem Skalpell ausgeschnitten. Das ausgeschnittene Gelfragment
wurde durch Einweichen in einem TE- (Tris-EDTA) Puffer von 100 μl bei etwa
100°C 15
Minuten lang eluiert. Die Gelscheibe wurde dann durch kurzes Zentrifugieren
pelletiert und der Überstand
wurde in ein neues Mikrozentrifugen-Reagenzglas gegeben. Die DNA
wurde zusammen mit 100 mM Natriumacetat und 30 μg Glycogen (Boehringer Mannheim,
Deutschland) mit Ethanol kombiniert und etwa 10 Minuten auf Trockeneis
gefällt.
Die Proben wurden 10 Minuten zentrifugiert und das Granulat wurde
mit 80% Ethanol gewaschen. Das Granulat wurde in 10 μl destillierten
Wassers erneut löslich
gemacht.
-
5 μl der eluierten
DNA wurden in einer 100-μl-Reaktion
reamplifiziert, die enthält:
einen standardmäßigen Cetus-Taq-Polymerasepuffer,
20 μM dNTPs,
1 μM jedes
der Oligonukleotidprimer, die in der anfänglichen Generation der amplifizierten
DNA benutzt wurden. Die verwendeten Durchlaufbedingungen waren die gleichen
wie die anfänglichen
Bedingungen, die benutzt wurden, um das amplifizierte Band wie oben
beschrieben zu erzeugen. Die eine Hälfte der Amplifikationsreaktion
wurde auf einem Agarosegel von 2% gefahren und unter Verwendung
von DE-81-Papier (Whatman Paper, Ltd., England) eluiert, wie in
Sambrook et al., supra, beschrieben. Wiederhergestellte Fragmente
wurden in den Klonierungsvektor pCRTMII
(Invitrogen, Inc., San Diego CA) gebunden und in den kompetenten
E. coli-Stamm DH5α (Gibco/BRL,
Gaitherburg, MD) transformiert. Die Kolonien wurden auf LB-Agarplatten
gezüchtet,
die Ampicillin (100 μg/ml)
und X-Gal (40 μg/ml)
enthielten, um die Auswahl blau/weiß zu ermöglichen.
-
Sequenzanalyse:
-
Nach
der Subklonierung wurden die reamplifizierten cDNA-Fragmente auf
einem automatischen Sequenzierer von Applied Biosystems (Applied
Biosystems, Inc. Seattle, WA) sequentialisiert. Eine Sequenz wurde
von vier oder mehr unabhängigen
Transformanten erhalten, die den gleichen Einsatz enthielten. Die
hier gezeigte Nukleotidsequenz stellt entweder den Konsens der Information
dar, die aus den vier Sequenzen erhalten wurde, oder die Sequenz,
die, wie angegeben, aus einem repräsentativen Klon erhalten wurde.
Diese primären
Sequenzdaten wurden bezüglich
Vektorsequenzen und sich oft wiederholenden Sequenzen bearbeitet
und getrimmt, und zum Durchsuchen der Genbank-Datenbanken unter
Verwendung des BLAST- (Altschul, S.
F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–410) Programms benutzt.
-
Northern-Analyse:
-
RNA-Proben
wurden in einem denaturierenden Agarosegel elektrophoretisch bearbeitet,
das 1 bis 1,5% Agarose enthielt (SeaKem LE, FMC BioProducts, Rockland,
ME) und 6,3% Formaldehyd enthielt. Die Proben, die 5 bis 20 μg der gesamten
RNA enthielten, wurden mit einer denaturierenden Ladungslösung (72% entionisiertes
Formamid und Bromphenolblau) vermischt und 5 Minuten auf 70°C erwärmt. Die
Proben wurden auf Eis angeordnet und sofort auf Gele geladen. Die
Gele wurden in einem 1 × MOPS-Puffer
gefahren (100 mM MOPS, 25 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA). Nach der
Elektrophorese wurden die Gele mit Ethidiumbromid gefärbt und
mit UV-Licht sichtbar gemacht.
-
Nach
der Vollendung der Elektrophorese wurden die Gele in 50 mM Natriumhydroxid
unter sanftem Schütteln
etwa 30 Minuten getränkt,
um die RNA leicht zu spalten. Die Gele wurden zweimal in Wasser
gespült und
dann durch Tränken
in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) für
etwa 30 Minuten neutralisiert. Die Gele wurden kurz mit 20 × SSC (3
M Natriumchlorid, 0,3 M Natriumzitrat) ausgeglichen und dann über Nacht
in 20 × SSC
zu Nylonmembranen wie HybondTM, -N, (Amersham,
Inc., Arlington Heights, IL) oder Zeta-Probe (Bio-Rad, Inc., Hercules,
CA) transferiert. Die Membranen, die transferierte RNA enthielten,
wurden 2 Stunden bei 80°C
gebacken, um die RNA zu immobilisieren.
-
Die
DNA-Fragmente, die als Sonden benutzt werden sollten, wiesen unterschiedliche
Größen auf
und wurden mit Hilfe einer Random-Hexamer-Markierungstechnik markiert.
Zusammenfassend wurden 25 ng eines gereinigten DNA-Fragments benutzt,
um jede Sonde zu erzeugen. Die Fragmente wurden zu einer Markierungsreaktion
von 20 μl
zufälliger
Hexanukleotide (Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) hinzugefügt, die
zufällige
Hexamere und ein Gemisch der Nukleotide dCTP, dGTP und dTTP (bei
einer Endkonzentration von jeweils 25 μM) enthielten. Das Reaktionsgemisch
wurde 10 Minuten bei 100°C
durch Wärme
denaturiert und dann auf Eis abgekühlt. 5 μl α-32P-dATP
(50 μ [unleserlich];
Amersham, Inc., Arlington Heights, IL) und Klenow-DNA-Polymerase
(2 Einheiten; Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) wurden
hinzugegeben. Die Reaktionen wurden 30 Minuten bei 37° inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 30 μl
Wasser zu der Markierungsreaktion hinzugegeben und nicht aufgenommene
Nukleotide wurden durch Passieren der Reaktionen durch eine BioSpin-6TM-Chromatographiespalte
(Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) entfernt. Die spezifische Aufnahme
wurde mit Hilfe eines Szillationszählers bestimmt. 1–5 × 106 cpm wurden pro ml Hybridisierungsmischung
benutzt.
-
Die
Nylonmembranen, die die immobilisierte RNA enthalten, wurden gemäß den Anweisungen
des Herstellers prehybridisiert. Die radiomarkierten Sonden wurden
unter Wärme
10 Minuten bei 70°C
in 50% entionisiertem Formamid denaturiert und dann zu der Hybridisierungsmischung
(enthaltend 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 0,1% SDS, 100 μg/ml gescherte
Lachssperma-DNA, 5 × SSC,
5 × Denhardt-Lösung, 30
mM Tris-HCl (pH 8,5), 50 mM NaPO4 (pH 6,5))
hinzugegeben. Die Hybridisierungen wurden bei 42°C über Nacht ausgeführt. Die
Nylonmembranen wurden dann 2 Minuten in einer Waschlösung aus
0,2 × SSC
und 0,1% SDS bei Raumtemperatur gebadet, um das meiste der verbleibenden
Hybridisierungslösung
zu entfernen. Die Membran wurden dann zweimal 20 Minuten in einer
frischen, auf 42°C
vorgewärmten
Waschlösung
gebadet. Die Filter wurden in einer Kunststoffumhüllung abgedeckt
und einem autoradiografischen Film ausgesetzt, um die Ergebnisse
sichtbar zu machen.
-
6.2 ERGEBNISSE
-
Ein
transgenes T-Zellenparadigma (wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben)
wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die zwischen TH1- und
TH2-Zellen differentiell ausgeprägt
sind.
-
RNA-Proben
wurden von TH1- und TH2-Zellenpopulationen nach entweder einer sekundären oder tertiären Antigenstimulierung
isoliert. Die Proben wurden dann durch differentielle Anzeigetechniken
analysiert. 1 zeigt die amplifizierten
Fragmente, die aus diesen Proben erhalten wurden, wobei der Pfeil
einen PCR anzeigt, bei dem angenommen wird, dass er eine cDNA repräsentiert,
die aus einer RNA abgeleitet ist, die durch ein Gen hergestellt
wurde, das in den TH2-Zellensubpopulationen bezüglich den TH1-Zellensubpopulationen
auf einer höheren
Ebene ausgeprägt
ist.
-
7. BEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG
UND CHARAKTERISIERUNG EINES GENS, DAS IN TH2-ZELLEN DIFFERENTIELL
AUSGEPRÄGT
IST
-
In
dem Beispiel, das in diesem Abschnitt vorgestellt wird, wurde das
transgene T-Zellenparadigma, das oben in Abschnitt 5.1.1.1 und 6
beschrieben worden ist, verwendet, um ein Gen zu identifizieren,
dass in TH2-Zellen
differentiell ausgeprägt
ist.
-
7.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
-
RT-PCR-Analyse:
-
Die
quantitative RT-PCR wurde wie folgt ausgeführt. 1 bis 2 μg der gesamten
RNA, die wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben hergestellt wurde,
wurde mit oligo-dT Primern und der SuperscriptTM-RNAase-H-Reverse-Transkriptase
(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) umgekehrt transkribiert. Die RNA wurde
mit 1 μl
oligo-dT (500 μg/ml) in
einem Gesamtvolumen von 11 μl
kombiniert. Die Mischung wurde 10 Minuten auf 70°C erwärmt und auf Eis abgekühlt. Nach
kurzem Zentrifugieren wurde die RNA 1 Stunde umgekehrt transkribiert.
Die Aliquoten des ersten Strangs cDNA wurden bis kurz vor der Benutzung
bei –20°C gelagert.
-
Die
Ausprägungsstufen
wurden durch die PCR-Amplifikation
der seriellen Verdünnungen
des ersten Stranges cDNA bestimmt. In diesem Verfahren wird die
cDNA seriell in Wasser verdünnt.
Die Verdünnungen werden
dann durch PCR mit Hilfe von sequenzspezifischen Primern mengenmäßig amplifiziert.
Alle PCR-Reaktionen werden unter identischen Bedingungen amplifiziert.
Aus diesem Grund sollte die Menge des erzeugten Produkts die Menge
der Sequenzvorlage reflektieren, die anfangs gegenwärtig war.
5- bis 10-fache cDNA-Verdünnungen
und genug Verdünnungen
wurden benutzt, so dass die Menge des nacheinander hergestellten
Produkts durch UV-Illumination
von Ethidiumbromid gefärbten
Gelen von klar sichtbar bis unter Erkennungsstufen reichte. Das
hier beschriebene Verfahren kann 10-fache Unterschiede in den Ausprägungsstufen unterscheiden.
-
Die
Primer wurden für
die Amplifikation der sequentialisierten amplifizierten Bänder entwickelt,
die unter Benutzung des Programms OLIGO (National Biosciences, Plymouth,
MN) gewählt
wurden.
-
Alle
quantitativen PCR-Reaktionen wurden in einer 9600-Perkin-Elmer-PCR-Maschine
(Perkin-Elmer) ausgeführt.
Im Allgemeinen waren die Amplifikationsbedingungen wie folgt: 30
bis 40 Zyklen bestehend aus 30 Sekunden bei 95°C Denaturierung, 30 Sekunden
Annealing bei 50 bis 60°C
und 1 Minute Ausdehnung bei 72°C.
Nach dem Durchlaufen wurden die Reaktionen für 10 Minuten bei 72°C verlängert.
-
RNase Schutzprüfungen:
-
Die
RNAse-Schutzprüfungen
wurden gemäß den Anweisungen
des Herstellers unter Benutzung eines bei Ambion, Inc. erworbenen
Sets ausgeführt.
Die RNA-Sonden, die von der GenBank Zugangsnr. Y07519 abgeleitet
wurden, wurden in den RNAse Schutzprüfungen benutzt. Diese Sonden
wurden ebenfalls gemäß den Anweisungen
des Herstellers unter Benutzung eines bei Ambion, Inc. erworbenen
Sets erzeugt. Die Sequenz dieser RNA-Sonden entspricht dem 5'-Ende des Gens und
weist sowohl die Kodierung als auch die 5'-unübersetzten
Sequenzen auf.
-
Anti-CD-3-Stimulierung:
-
Die
Bedingungen waren wie unten in Abschnitt 8.1 beschrieben.
-
Andere Verfahrensweisen:
-
Alle
anderen Zellprobensammlungen, RNA-Isolierung, differentielle Anzeige, Sequenzanalyse
und Northern-Verfahren, die in den in diesem Beispiel beschriebenen
Experimenten angewendet werden, waren wie oben in Abschnitt 6.1
beschrieben.
-
7.2 ERGEBNISSE
-
Eine
differentielle Anzeigenanalyse von RNA, die aus TH1- und TH2-Zellenproben
isoliert worden ist, wurde aus einer transgenen T-Zellenparadigmenstudie
wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben erhalten. Insbesondere wurden
von den transgenen Mäusen
TH-Zellen erhalten, die einen T-Zellenrezeptor beherbergen, der Ovalbumin
erkennt (Murphy et al., 1990, Science 250: 1720), wurden drei Mal
stimuliert, wobei RNA aus den TH1- und TH2-Zellen erhalten wurde.
Die differentielle Anzeigenanalyse der RNA-Proben führte zu
der Identifizierung von Bands, die in den TH1- und TH2-Zellen differentiell
ausgedrückt
sind.
-
8. BEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG
VON NEUARTIGEN GENEN, DIE IN EINER TH-ZELLENSUBPOPULATION DIFFERENTIELL
AUSGEPRÄGT
SIND
-
In
dem Beispiel, das in diesem Abschnitt vorgestellt wird, werden neuartige
Gensequenzen beschrieben, die Gene repräsentieren, die in den TH-Zellensubpopulationen
und/oder während
der Differenzierung dieser Subpopulationen differentiell ausgeprägt sind.
-
8.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
-
T-Zellenklonparadigma:
-
T-Zellenklonparadigmasuchen
wurden durchgeführt,
die oben in Abschnitt 5.1.1.1 beschrieben worden sind. Insbesondere
wählten
die TH-Zellenklonparadigmen
drei verschiedene Klone: D10.G4 (TH2), AE7 (TH1) und D1.1 (TH1).
Vor der Stimulierung wurden die Zellkulturen durch Zentrifugieren
durch einen Ficoll-Gradient mit lebenden Zellen angereichert. Wiederhergestellte
Zellen wurden gezählt
und ihre Lebensfähigkeit
wurde mit Hilfe der Trypanblauexklusion untersucht. Die Zellen wurden
jeweils bei etwa 5 × 106 Zellen in 5 mls oder bei 1,5 × 106 Zellen in 10 mls Kulturmedium entweder
in ihre T25- oder T75-Flaschen erneut ausplattiert.
-
Die
Beschichtung wurde im Allgemeinen gemäß der Current Protocols in
Immunology, 1992, Coligan, J. E. et al., John Wiley & Sons, NY, pp.
3.12.4–3.12.6)
durchgeführt.
Insbesondere wurden die Flaschen vor dem Ausplattieren mit Anti-CD3-E
Antikörpern
(Hybridoma-Überstand
von dem 145-C11-Hybridoma; Parmingen, Inc., San Diego CA) beschichtet.
Zum Beschichten wurden die Antikörper
in PBS bei 1 bis 2 μg/ml
bei einem Volumen resuspendiert, das ausreicht, um den Boden der
Flaschen zu beschichten. Die Beschichtungslösung wurde mindestens eine
Stunde bei 37°C
auf den Flaschen inkubiert.
-
Nach
der Inkubation wurde die Antikörperbeschichtungslösung durch
Absaugen entfernt und die Zellen wurden sofort hinzugegeben. Die
Flaschen wurden 6 Stunden in einem 37-°C-Inkubator angeordnet. Die Zellen
wurden zum Beispiel durch Entfernung von Überstand aus der Kultur geerntet,
wonach die Zellen durch Zugabe einer RNAzolTM-Lösung direkt lysiert wurden.
Die cDNA wurde wie unten beschrieben hergestellt.
-
cDNA-Isolierung:
-
Die
RNA wurde aus Zellen unter Verwendung von Techniken geerntet, die
oben in Abschnitt 6.1 beschrieben sind. Die mRNA wurde unter Benutzung
eines QuickPepTM-mRNA-Reinigungssets (Pharmacia)
gemäß den Anweisungen
des Herstellers direkt gereinigt.
-
Die
TH1-cDNA-Genbank wurde unter Benutzung eines SuperScriptTM-Lambda-System-Sets von Gibco BRL gemäß den Anweisungen
des Herstellers konstruiert. 4,5 μg
gereinigter mRNA wurden als Startmaterial für die Synthese einer poly-A-iniziierten
Erst-Strang-cDNA, die eine Not-1-Klonierungsstelle enthält. Eine Zweit-Strang-cDNA-Synthese wurde
mit einer RNAse-H-Behandlung durch geführt, gefolgt von einem beliebigen
Priming. Sal-1-Adapter
wurden an das 5'-Ende
der resultierenden doppelsträngigen
cDNA gebunden. Die gebundene cDNA wurde mit Not-1 zersetzt und bezüglich der
Größe fraktioniert.
Die Fraktionen, die cDNA in einem Größenbereich von 0,5 bis 8,0
kb Länge
enthielten, wurden in Sal-1/Not-1-λZipLoxTM-Arme
geklont. Die rekombinante Phage wurde dann unter Benutzung des Stratagene
GigpackTM II Extraktverpackungssets gemäß den Anweisungen
des Herstellers verpackt. Die Zellen des E. coli-Stamms Y 1090 (ZL)TM (Gibco
BRL) wurden mit der verpackten, rekombinanten Phage transformiert
und bei einer Dichte von 50.000 pfu pro 150 mm Schale ausplattiert.
Die Plaques wurden durch Hybridisierung zu einer radiomarkierten
Sonde gescreent, die aus einem subklonierten Band-200-cDNA-Fragment
erzeugt wurde. Die Exzision der cDNA-Einsätze aus den Lambdaklonen und
die Einführung
der rekombinanten Plasmid-DNA in E. coli DH10B(ZIP)TM (Gibco
BRL) wurde gemäß den Anweisungen
des Herstellers ausgeführt.
-
Zur
Isolierung von 200-Gen-cDNA wurde die cDNA-Genbank mit einer Sonde
gescreent, die durch Markieren der gesamten Sequenz des Band-200-Subklons
O erzeugt wurde, der unter Benutzung amplifizierter DNA konstruiert
wurde, die aus der differentiellen Anzeigenanalyse erhalten wurde.
Die Band-200-Sequenz wurde aus dem Klonierungsvektor pCRII Cloning
VectorTM (Invitrogen) durch Zersetzung mit
EcoRI herausgeschnitten. Mehrere Klone, einschließlich 200-P
und 200AF, wurden für
weitere Analysen ausgewählt.
-
Weitere Verfahrensweisen:
-
Alle
Verfahrenweisen der transgenen T-Zellenmanipulationen, Zellenprobensammlung,
zusätzlichen RNA-Isolierung,
differentiellen Anzeige, Sequenzanalyse und Northern-Analyse, die
in den in diesem Beispiel beschriebenen Experimenten angewendet
werden, waren wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben.
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8.2 ERGEBNISSE
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Transgene
T-Zellenparadigma- und T-Zellen-Klonparadigmasuchen
wurden durchgeführt,
um die Gensequenzen zu identifizieren, die Gene repräsentieren,
die innerhalb und/oder unter den TH-Zellensubpopulationen und/oder
während
der Differenzierung solcher Subpopulationen differentiell ausgeprägt sind.
Hier wird eines der mehreren neuartigen Gene beschrieben, die durch
diese Paradigmasuchen identifiziert worden sind. Insbesondere ist
das hier beschriebene Gen als das 200-Gen bezeichnet worden. Eine
Zusammenfassung der differentiellen Ausprägungseigenschaften der hier
beschriebenen, neuartigen Gensequenz ist oben in Tabelle 1 dargestellt.
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Wie
oben in Tabelle 1 dargestellt, ist das 200-Gen auf einer höheren Stufe
innerhalb der TH1-Zellensubpopulation ausgeprägt, wie durch die differentielle
TH1-Erscheinung
des amplifizierten Bandes 200 offenbart wird. Wie weiter unten analysiert
werden wird, wird die Sequenz des murinen 200-Gens in 17A bis 17D (SEQ
ID NO: 8) dargestellt, erscheint jedoch nicht in den veröffentlichten
Datenbanken. Aufgrund des TH1-spezifischen
Ausprägungsmusters
zeigt jede dieser Sequenzen das 200-Gen und seine Genprodukte können potentiell
als Behandlungen für
TH1-bezogene Störungen,
als Diagnoseverfahren für
solche Störungen
und/oder als Verfahrensteil zur Identifizierung von Verbindungen,
die TH1-bezogene Störungen
lindern können,
benutzt werden.
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Das
Band 200 wurde als eine Sonde benutzt, um die murinen 200-Gen-cDNA-Klone
zu identifizieren und zu isolieren, einschließlich der Klone, die als 200-P,
200-AF und 200-O bezeichnet werden und mit der NRRL abgeschieden
worden sind, wie in Abschnitt 10 unten zusammengefasst wird. Die
cDNA-Klone wurden charakteri siert und zeigten die Nukleotidsequenz
(SEQ ID NO: 8) des murinen 200-Gen-Kodierungsbereichs in voller
Länge,
wie in 17A bis 17D dargestellt. 17A bis 17D stellen
das murine 200-Genprodukt ebenfalls dar, das aus einer Aminosäurensequenz
(SEQ ID NO: 10) abgeleitet ist.
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Datenbanksuchen
zeigen, dass das 200-Genprodukt ein neuer Rezeptor ist, der eine
extrazelluläre Ig-Domäne enthält und somit
innerhalb der Ig-Rezeptorsuperfamilie angeordnet werden kann. Die
Klonierung und die Charakterisierung des 200-Genhumanhomologs werden
in dem unten in Abschnitt 9 vorgestellten Beispiel beschrieben.
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Die
Ergebnisse einer murinen 200-Gen-mRNA-Northern-Blotting-Analyse sind in 18 dargestellt. Die in 18 dargestellten
Daten zeigen erstens, dass das 200-Gen eine Transkribierung von
etwa 1,2 kb Länge
erzeugt und veranschaulichen zweitens die TH1-Spezifizität der 200-Genausprägung.
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Für die Studie
wurden drei TH1-Klone (D1.1, Dorris, AE7) und drei TH2-Klone (D10G.4,
DAX, CDC25) benutzt und RNA-Proben wurden von entweder nicht stimulierten
Zellen (–)
oder von Zellen isoliert, die für
6 Stunden mit einem plattengebundenen Anti-CD3-Antikörper (+)
stimuliert worden waren. Die Proben wurden mit 200-Gensequenzen getestet
und, wie in 18 dargestellt, die RNA
aus sowohl den stimulierten als auch den nicht stimulierten TH1-Zellen
enthielt 200-Gen-mRNA, während
keine der aus den TH2-Zellen erhaltenen Proben 200-Gen-mRNA enthielt. Es
sollte auch darauf hingewiesen werden, dass die 200-Genausprägung in jeder
der stimulierten TH1-Zellen bezüglich
der entsprechenden nicht stimulierten TH1-Zellen höher war.
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9. BEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG
UND CHARAKTERISIERUNG DES HUMANEN 200-GENS
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In
dem hier vorgestellten Beispiel wird die Klonierung, Identifizierung
und Charakterisierung des humanen 200-Gens entsprechend des humanen Homologs
des murinen 200-Gens
beschrieben.
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9.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
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Murine 200-Gen-Sonde:
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Ein
etwa 800 pb EcoRI-Einsatz, der etwa 90% der murinen 200-Gen-cDNA
(femt200) ORF enthielt, wurde mit Gel gereinigt, 32p-markiert
und benutzt, um die λgt11
humane Lymphozyten-cDNA-Genbank wie unten beschrieben zu sondieren.
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Humane 200-Gensonde:
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Der
etwa 500-bp-Einsatz des humanen 200-Gens feht200a-cDNA-Klon wurde mit 32p markiert und benutzt, um die unten beschriebene,
humane, fetale Milz-cDNA-Genbank zu sondieren.
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Screening-Verfahren:
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Etwa
106 Plaques einer λgt11 humanen Lymphozyten-cDNA-Genbank
(Katalog Nr. HL 1031B); Clontech) wurden mit der oben beschriebenen
murinen 200-Gensonde doppelt gescreent. Die Filter wurden über Nacht
bei 65°C
in einem Church-Puffer (7% DSD, 250 mM NaHPO4,
2 μM EDTA,
1% BSA) mit der Sonde hybridisiert. Am nächsten Tag wurden die Filter
30 Minuten in 2 × SSC/1%
SDS bei 50°C
gewaschen. Die Filter wurden dann bei –80°C einem Kodak-Film ausgesetzt.
Positive Plaques wurden unter den gleichen Bedingungen erneut gescreent.
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Eine
humane fetale Milz-cDNA-Genbank wurde mit Hilfe des Klonierungssystems
Stratagene Uni-Zap cloning System unter Verwendung der oben beschriebenen
humanen feht200a-Gensonde gescreent. Etwa 10 Plaques wurden über Nacht
bei 65°C
in einem Church-Puffer doppelt hybridisiert. Die Filter wurden dann
30 Minuten bei 65°C
in 0.1 × SSC,0,1%
SDS ausgewaschen und einem Film ausgesetzt. Positive Plaques wurden durch
ein sekundäres
Screening unter den gleichen Bedingungen bestätigt.
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Subklonieren/Sequenzierungsverfahren:
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DNA
aus den positiven Klonen, die aus der λgt11 cDNA-Genbank erhalten wurden, wurde durch
ein Plattenlysierungsverfahren erzeugt. Die gereinigte DNA wurde
zersetzt, um cDNA-Einsätze
zu erhalten, die in das pBluescript-Plasmid (Stratagene) subkloniert
wurden.
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Positive
Klone, die aus der humanen fetalen Milz-cDNA-Genbank erhalten wurden, wurden mit
einer ExAssist-Helferphage,
XL1-Blue-Zellen und SOLR-Zellen, wie von Stratagene beschrieben,
herausgeschnitten. Die Exzisionsprodukte wurden dann auf LB/Amp-Platten
ausplattiert und über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Weiße
Kolonien wurden ausgewählt
und DNA wurde zur Sequenzierung präpariert.
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Die
DNA-Sequenzierung wurde gemäß Standardtechniken
durchgeführt.
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Northern-Blotting-Analyse
der humanen Gen-200-Ausprägung:
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Das
Northern-Blotting wurde wie oben in Abschnitt 6.1 beschrieben durchgeführt. 15 μg einer vollständigen RNA
aus mehreren menschlichen Organen wurden analysiert (Clontech, CA).
Die benutzte, mit 32p markierte Sonde war
der oben beschriebene feht200a-Klon, der das 5'-ORF des humanen Gens 200 enthält.
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9.2 ERGEBNISSE
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Die
Sequenz des humanen 200-Gens wurde in voller Länge erfolgreich geklont und
charakterisiert, wie hier beschrieben.
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Um
das humane 200-Gen zu klonen, wurde ein 800-pb-EcoRI-Einsatz, der etwa 90% der murinen 200-Gen-cDNA
(femt200) ORF enthält,
mit Gel gereinigt, mit 32p markiert und
verwendet, um eine λgt11
humane Lymphozyten-cDNA-Genbank
zu sondieren. Etwa 106 Plaques wurden doppelt
gescreent, wie oben in Abschnitt 9.1 beschrieben ist. Ein positiver
Plaque wurde erhalten und unter den gleichen Bedingungen erneut gescreent.
Nachdem er gereinigt worden ist, wurde dieser Klon benutzt, um durch
ein Plattenlysierungsverfahren eine Lambda-DNA zu erzeugen, und
die Lambda-DNa wurde zersetzt, um einen 500-bp-Einsatz (feht200a) zu
erhalten, wobei nach der Sequenzierung herausgefunden wurde, dass
dieser ein humanes Homolog des murinen 200-Gens ist.
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Um
einen Klon zu erhalten, der den gesamten ORF des humanen 200-Gens
verschlüsselt,
wurde eine humane 200-Gensonde
benutzt, um eine humane fetale Milz-cDNA-Genbank zu screenen, wie oben in Abschnitt
9.1 beschrieben. Drei positive Klone wurden erhalten, von denen
zwei nach einem sekundären
Screening unter den gleichen Bedingungen positiv waren. Die zwei
positiven Klone wurden subkloniert und ihre cDNA-Einsätz wurden
einer Sequenzierung unterzogen. Diese zwei Klone, die mit feht200b
und feht200c markiert waren, wiesen jeweils eine Länge von
etwa 1,56 kb und 2,0 kb auf, wobei feht200c die gesamte Kodierungssequenz
enthielt. Der Klon feht200c wurde mit der in Abschnitt 12 beschriebenen
ATCC abgeschieden.
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Die
Nukleotidsequenz, die den gesamten humanen 200-Gen-ORF (Open Reading
Frame) enthält,
ist in 24 (SEQ ID NO: 23) dargestellt.
Die abgeleitete Aminosäurensequenz
des humanen 200-Genprodukts ist ebenfalls in 24 (SEQ
ID NO: 24) dargestellt.
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Die
301-Aminosäuren-Restsequenz
des humanen 200-Genprodukts offenbart, dass sie ein Zelloberflächenrezeptor
ist, der verschiedene Domänen
zeigt, die eine Signalsequenz von Aminosäurerest 1 bis etwa 20, eine
extrazelluläre
Domäne
von etwa Aminosäurerest
21 bis 200 und eine transmembrane Domäne von etwa Aminosäurerest
201 bis 224 und eine cytoplasmatische Domäne von etwa Aminosäure 225
bis 301 aufweist. Die extrazelluläre Domäne enthält eine Ig-artige, variable
Satzdomäne
von etwa Aminosäurerest
30 bis etwa Aminosäurerest
128, so dass das 200-Genprodukt innerhalb der Ig-Rezeptorsuperfamilie
angeordnet wird.
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Eine
Northern-Analyse der Gewebeverteilung von 200-Gen-Transkriptionen wurde
durchgeführt.
15 μg RNA
aus Gehirn, Niere, Leber, Lunge, Muskel, Prostata, Milz, Thymus
und Trachea wurden isoliert und auf eine humane 200-Genausprägung untersucht.
Diese Analyse offenbarte in Geweben wie Gehirn, Lunge, Trachea,
Milz und Thymus humane 200-Gentranskriptionen von etwa 2,2 kb.
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Zusammenfassend
ist das hier beschriebene humane 200-Gen entsprechend dem humanen Analog des
murinen 200-Gens
erfolgreich geklont und charakterisiert worden. Wie durch seine
Aminosäuresequenzen offenbart,
ist das humane 200-Genprodukt ein Rezeptor der Ig-Superfamilie-Molekülklasse.
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10. BEISPIEL: KONSTRUKTION
UND AUSPRÄGUNG
VON IgG1-FUSIONSPROTEINEN
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In
diesem Beispiel wird die Konstruktion und Ausprägung von IgG1-Fusionsproteinen
beschrieben. Insbesondere wird die Konstruktion des humanen und
murinen 200-Gen-IgG1-Fusionsproteins
untersucht.
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10.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
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Rekombinante Plasmide,
die IgG1-Fusionsproteine verschlüsseln:
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Generation des Vektors,
der das murine 200-Gen-hIgG1-Fusionsprotein
verschlüsselt:
-
Das
Fragment, das die Signalsequenz und die extrazelluläre Domäne des murinen
200-Gens verschlüsselt,
wurde von einem cDNA-Klon amplifiziert, der den ORF des murinen
200-Gens unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide enthält:
Vorwärts-Oligo:
5'-AAA-TTT-ATT-CTC-GAG-GAC-CCA-CGC-GTC-CGG-ATT-TCC-C-3' (SEQ ID NO: 25);
Umgekehrt-Oligo:
5'-TTA-ATT-TGG-ATC-CCC-AGT-TCT-GAT-CGT-TTC-TCC-AGA-GTC-3' (SEQ ID NO: 26).
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Die
Oligonukleotid-Primer führen
auch XhoI- und BamHI-Restriktionsstellen
an den jeweiligen 5'-
und 3'-Enden der
PCR-Produkte ein, um die nachfolgende Insertion in die IgG1-Ausprägungsvektoren (pCD5-CD44-IgG1;
siehe Aruffo, A. et al., 1991, Cell 61: 1303–1313) zu ermöglichen.
Der pCD5-CD44-IgG1-Vektor verschlüsselt ein Protein, das eine
CD5-Signalsequenz, eine extrazelluläre CD44-Domäne und einen Fc-Bereich einer
humanen IgG1 schweren Ketten enthält. Zur Konstruktion des murinen
200-Gen-hIgG1-Fusionsproteinvektors wurden die CD5- und CD44-Abschnitte
von pCD5-CD44-IgG1 durch Sequenzen ersetzt, die die murine 200 Genprodukt-Signalfrequenz und
extrazelluläre
Domäne
verschlüsseln.
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Die
PCR-Reaktionen bestanden aus 25 Amplifikationszyklen bei einer Annealing-Temperatur
von 60°C.
Die VentTM thermostabile DNA-Polymerase
(New England BioLabs, Inc.; Beverly, Massachusetts) wurde in der
Amplifikation benutzt. Das PCR-Produkt (etwa 600 bp) wurde mit XhoI
und BamHI zersetzt und in pCD5-CD44-IgG1 eingesetzt, das vorher
mit XhoI und BamHI zersetzt worden ist, um die Sequenzen zu entfernen,
die die CD5-Signalsequenz
und die CD44-Ectodomäne
verschlüsseln.
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Generation des Vektors,
der das humane 200-Gen-hIgG1-Fusionsprotein
verschlüsselt:
-
Das
Fragment, das die Signalsequenz und die extrazelluläre Domäne des humanen
200-Gens verschlüsselt,
wird von einem cDNA-Klon amplifiziert, der den ORF des humanen 200-Gens
enthält,
unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide:
Vorwärts-Oligo:
5'-AAA-TTT-ATT-CTC-GAG-CGC-TAA-CAG-AGG-TGT-CC-3' (SEQ ID NO: 27);
Umgekehrt-Oligo:
5'-TTA-ATT-TGG-ATC-CCC-TCT-GAT-GGT-TGC-TCC-AGA-GTC-CCG-3' (SEQ ID NO: 28).
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Die
Amplifikation und die pCD5-CD44-IgG1-Subklonierungsverfahren sind für das murine 200-Gen-hIgG1-Fusionsprotein
wie oben beschrieben.
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Metabolische Markierung
von rekombinanten Fusionsproteinen:
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36
Stunden nach der transienten Transfektion von COS-7-Kulturen wurden
die Zellen mit Ersatzwachstumsmedium [DMEM-Methionin und Cystein
abgereichert (ICN, Inc., CA)] gespült. Nach dem Spülen wurden
150 μCI/ml
Medium einer Mischung aus 35S-Cystein und 35S-Methion
(Express 35S35STM Dupont, MA) zu dem Ersatzmedium hinzugegeben
und die Zellen wurden über
Nacht gezüchtet.
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Analyse der rekombinanten
Proteine durch SDS-PAGE:
-
hIgG1-Fusionsproteine
wurden durch eine LipfectAMINETM (Gibco,
Inc., MD) -vermittelte transiente Transfektion von COS-7-Zellen
gemäß den Vorschlägen des
Herstellers für
200-Gen-hIgG1-Fusionsproteine erzeugt, 1 ml eines 5-tägigen Überstandes
wurde über
Nacht mit 20 μl
Protein-A-Trisacryl-Perlen (Pierce, Inc., IL) in Gegenwart von 20
mM HEPES (pH 7,0) bei 4°C
und bei konstantem Schütteln
gemischt. Die Perlen wurden dann vor der Zugabe zu dem Ladepuffer
3 Mal mit PBS gewaschen. Die Perlen wurden entweder mit reduzierenden
oder nicht reduzierenden Ladepuffern (beschrieben in Molecular Cloning,
Sambrook, Fritsch und Maniatis, 2. Ausgabe, 1989, mit der Ausnahme,
dass DTT durch 2,5% β-Mercaptoethanol
ersetzt wurde) gemischt.
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10.2 ERGEBNISSE
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Die
Konstruktion und Ausprägung
der rekombinanten IgG-Fusionsproteine
wird hier beschrieben. Insbesondere werden die 200-Genprodukt-IgG1-Fusionsproteine
beschrieben. Das murine und humane 200-Genprodukt-IgG1-Fusionsprotein enthält eine
200-Genprodukt-Signalsequenz und extrazelluläre Domänenfusion mit einem Fc-Bereich einer humanen
IgG1 schweren Kette.
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200-Gen-hIgG1-Fusionsproteine
wurden durch die transiente Transfektion von COS-7-Zellen hergestellt,
wie oben in Abschnitt 10.1 beschrieben worden ist. Die Protein-A-Immunfällung der
COS-7-Überstände und
ihre Analyse durch SDS-PAGE zeigten erstens, dass das korrekte IgG-1-Peptid
als Teil der Fusion hergestellt worden war (wie durch die Protein-A-Immunfällung nachgewiesen),
und zeigten zweitens eine wesentliche Ausprägung des 200-Gen-IgG1-Fusionsproteins
bei einer Konzentration von etwa 1 μg pro ml des Kulturüberstands.
Wenn ferner die immungefällten Überstände analysiert
und unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen verglichen
werden, ist klar, dass das 200-Gen-IgG1-Fusionsprotein, wie erwartet,
aufgrund der in dem Fusionsprotein gegenwärtigen Peptidsequenz der humanen
IgG1 schweren Kette eine Oligomerisierung durchmacht. Ferner zeigen
die Größe (das
heißt,
größer als
von der Aminosäuresequenz
allein erwartet) und die Erscheinung der Fusionsproteine bei der
Wanderung durch die Gele (das heißt, diffuse eher als feste
Bänder)
an, dass die Fusionsproteine wie erwartet glykosyliert worden sind.
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12. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
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Die
folgenden Mikroorganismen wurden am 19. Januar 1995 (200-O), am
2. März
1995 (E. coli DH10B(Zip)
TM enthaltend 200-P)
und am 1. Juni 1995 (200-AF) bei der Agricultural Research Service
Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, hinterlegt, wobei ihnen
die folgenden Zugangsnummern zugewiesen wurden:
Mikroorganismus | NRRL-Zugangsnr. |
200-O | B-21395 |
E.
coli DH10B(Zip)TM enthaltend 200-P cDNA | B-21415 |
200-AF | B-21457 |
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Die
folgenden Mikroorganismen wurden am 12. Dezember 1995 bei der American
Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, hinterlegt,
wobei ihnen die folgenden Zugangsnummern zugewiesen wurden:
Mikroorganismus | ATCC-Zugangsnr. |
E.
coli, feht 200C | 69967 |
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Die
hier beschriebenen, spezifischen Ausführungsformen sind für einzelne
Erläuterungen
individueller Aspekte innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung
bestimmt.
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