DE69836963T2

DE69836963T2 - PGC-1, EIN NEUARTIGER PPAR-gamma-KOAKTIVATOR AUS BRAUNEM FETTGEWEBE

Info

Publication number: DE69836963T2
Application number: DE69836963T
Authority: DE
Inventors: M. Bruce Waban SPIEGELMAN; Pere Brookline PUIGSERVER; Zhidan Boston WU
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2018-05-30
Also published as: WO1998054220A1; JP2002502251A; JP2009050265A; EP1003777B1; ATE352561T1; CA2290944C; US6166192A; JP4759605B2; JP4495787B2; EP1003777A1; CA2290944A1; DE69836963D1

Description

Vertebraten weisen zwei verschiedene Arten von Fettgewebe bzw. adiposem Gewebe auf: Weißes Fettgewebe (WAT) und braunes Fettgewebe (BAT). Gemäß den Ernährungsbedürfnissen des Tieres wird Fett in WAT gelagert und freigesetzt. BAT verbrennt Fett und setzt die Energie als Hitze frei (d. h. nicht schaudernde (shivering) Hitze). Die einzigartigen Thermogeneseeigenschaften von BAT spiegeln die Aktivitäten von spezialisierten Mitochondrien wieder, welche das spezifische Genprodukt für braune Fettzellen bzw. Adipozyten nicht-bindendes (Uncoupling) Protein (UCP) umfassen. Sears, I.B. et al., Mol. Cell. Biol. 16(7) (1996) 3410-3419. UCP ist ein mitochondrialer Protonenträger, welcher durch Kollabieren des Protonengradienten, der durch Fettsäureoxidation ohne begleitende ATP Synthese (Nicholls, D. und Locke, R., Physiol. Rev., 64 (1984) 1-64) aufgebaut ist, Atmung von oxidativer Phosphorylierung entkoppelt.
Eine UCP Expression ist hauptsächlich durch sympathetische Nervensysteme in Reaktion auf physiologische Signale, wie beispielsweise Kälteaussetzung und übermäßiger Kalorienaufnahme, straff reguliert (Girardier, L. und Seydoux, J., "Neural Control of Brown Adipose Tissue" in P. Trayhurn und D. Nichols (Eds.) Brown Adipose Tissue (Arnold, London, 1986) 122-151). Von den lokalen Neuronen freigesetztes Norepinephrin wechselwirkt mit β-adrenergen Rezeptoren auf der Zellmembran brauner Fettzellen, wodurch ein Ansteigen an intrazellulärem cyklischen AMP (cAMP) Niveaus verursacht wird (Sears, I.B. et al., Mol. Cell. Biol. 16(7) (1996) 3410-3419). Ein angestiegenes Transkriptionsniveau des UCP-Gens ist ein kritischer Bestandteil in der Ereigniskaskade, welche zu einer erhöhten BAT Thermogenese in Reaktion auf angestiegenes cAMP führt (Kopecky, J. et al., J. Biol. Chem., 265 (1990), 22204-22209; Rehnmark, S.M. et al., J. Biol. Chem., 265 (1990) 16469-16471; Ricquirer, D.F. et al., J. Biol. Chem., 261 (1986) 13905-13910). Eine BAT Thermogenese wird sowohl (1) zum Aufrechterhalten der Homeothermie durch erhöhte Thermogenese in Reaktion auf geringere Temperaturen als auch (2) zum Aufrechterhalten eines Energiegleichgewichts durch erhöhten Energieaufwand in Reaktion auf Zunahmen bei einer Kalorienaufnahme verwendet (Sears, I.B. et al., Mol. Cell. Biol. (1996) 16(7) 3410-3419). Beinahe alle experimentellen Nagermodelle für Fettsucht werden von einer verringerten oder gestörten BAT-Funktion begleitet, für gewöhnlich als das erste Symptom in dem Voranschreiten von Fettsucht (Himms-Hagen, J. Prog. Lipid Res. 28 (1989) 67-115; Himms-Hagen, J. FASEB J.; 4 (1990) 2890-2898). Darüber hinaus führt eine Ablation von BAT in transgenen Mäusen durch gezielte Expression eines Toxin-Gens zu Fettsucht (Lowell, B. et al.; Nature 366 (1993) 740-742). Das Wachstum und die Differenzierung von braunen Fettzellen sind daher Schlüsseldeterminanten bei einer Befähigung eines Tieres ein energetisches Gleichgewicht aufrecht zu erhalten und Fettsucht zu verhindern (Sears, I.B. et al.; Mol. Cell. Biol.; 16(7) (1996) 3410-3419).
Neuerdings wurden mehrere Transkriptionsfaktoren identifiziert, welche eine Adipogenese fördern. Diese Transkriptionsfaktoren umfassen CCAAT/Verstärker Bindeprotein (C/EBP) α, β and δ und Peroxisomen-Proliferator aktivierten Rezeptor (PPAR) γ. Siehe Spiegelman, B.M. and Flier, J.S.; Cell; 87 (1996) 377-389 als eine Übersicht. C/EBP Familienmitglieder, wie beispielsweise C/EBP α, β and δ, spielen wichtige Rollen bei der Regulation einer Fettzellenspezifischen Genexpression. C/EBPα kann beispielsweise die Promotoren von verschiedenen Genen transaktivieren, die in dem reifen Fettzellen exprimiert werden (Herrera, R. et al.; Mol. Cell. Biol.; 9 (1989) 5331-5339; Miller, S.G. et al.; PNAS; 93 (1996) 5507-551; Christy, R.J. et al.; Genes Dev.; 3 (1989) 1323-1335; Umek, R.M. petal; Science; 251 (1991) 288-291; Kaestner, K.H. et al.; PNAS; 87 (1990) 251-255; Delabrousse, F.C. et al.; PNAS; 93 (1996) 4096-4101; Hwang, C.S. et al.; PNAS; 93 (1996) 873-877). Eine Überexpression von C/EBP α kann eine Fettzellendifferenzierung in Fibroblasten induzieren (Freytag, S.O. et al.; Genes Dev.; 8 (1994) 1654-1663), wohingegen eine Expression von Antisense C/EBP α eine terminale Differenzierung von Präfettzellen inhibiert (Lin, F.T and Lane, M.D.; Genes Dev.; 6 (1992) 533-544). Die physiologische Bedeutung von C/EBP α wurde weiterhin durch die Erzeugung von Transgenen, C/EBP α Knockout-Mäusen gezeigt. Obgleich Fettzellen immer noch in diesen Tieren vorliegen, häufen sie viel weniger Lipide an und weisen eine abgenommene fettzellenspezifische Genexpression auf (Wang, N. et al.; Science; 269 (1995) 1108-1112). Von C/EBP α wurde gefunden eine synergistische Beziehung mit einem anderen Transkriptionsfaktor, PPARγ, bei einem Fördern einer Fettzellendifferenzierung aufzuweisen (siehe Brun, R.P. et al.; Curr. Opin. Cell Biol.; 8 (1996) 826-832 als eine Übersicht). PPARγ ist ein nuklearer Hormonrezeptor, der in zwei Isoformen (γ1 und γ2) vorliegt, die durch alternatives Splicing (Zhu, Y. et al.; PNAS; 92 (1995) 7921-7925) gebildet werden und welche scheinen für sowohl einen direkten Regulator von vielen fettspezifischen Genen als auch als ein "Master" Regulator zu fungieren, der das gesamte Adipogeneseprogramm auslösen kann (Spiegelman, B.M. and Flier, J.S.; Cell; 87 (1996)377-389). PPARγ bildet mit RXRα ein Heterodimer und wurde gezeigt direkt an gut charakterisierte fettspezifische Verstärker von dem Fettzellen P2 (aP2: Tontonoz, P.; Genes Dev.; 8 (1994) 1224-1234) und Phosphoenolpyruvat Carboxykinase (PEPCK) Gene (Tontonoz, P.; Mol. Cell. Biol.; 15 (1994)351-357) zu binden.
Obgleich der UCP Genpromoter Bindestellen für C/EBP (Yubero, P. et al.; Biochem. Biophys. Res. Commun.; 198 (1994) 653-659) und ein PPARγ-reagierendes bzw. reaktives Element (Sears, I.B. et al.; Mol. Cell. Biol.; 16(7) (1996) 3410-3419) umfasst, scheinen C/EBP und PPARγ nicht ausreichend zu sein, um eine UCP Expression zu induzieren (Sears, I.B. et al.; Mol. Cell. Biol.; 16(7) (1996) 3410-3419). Es würde daher äußerst wünschens wert sein, einen möglichen zusätzlichen Faktor zu identifizieren, der in Zusammenwirkung mit entweder C/EBP oder PPARγ wirkt, um eine UCP Expression zu aktivieren und folglich eine BAT Thermogenese zu fördern.
Diese Erfindung beruht zumindest zu Teilen auf der Entdeckung von neuen Molekülen, welche in Kombination mit PPARγ als ein Co-Aktivator einer UCP Expression in BAT wirken können. Diese Moleküle werden hierin als PPARγ Co-Aktivator 1 ("PGC-1") Proteine bezeichnet. PGC-1 Proteine codierende Nukleinsäuremoleküle werden hierin als PGC-1 Nukleinsäuremoleküle bezeichnet. Die erfindungsgemäßen PGC-1 Moleküle können beispielsweise Adipogenese, beispielsweise braune Adipogenese, und Thermogenese eines PGC-1 exprimierenden Gewebes, wie beispielsweise BAT oder Muskels, modellieren. Andere Funktionen der PGC-1 Moleküle der vorliegenden Erfindung werden durch die vorliegende Anmeldung hinweg beschrieben.
Demgemäß betrifft eine erfindungsgemäße Ausführungsform isolierte Nukleinsäuremoleküle (beispielsweise cDNAs), welche eine Nukleotidsequenz umfassen, welche ein PGC-1 Protein oder Abschnitte davon (beispielsweise biologisch aktive oder antigene Abschnitte), ebenso wie Nukleinsäurefragmente, die als Primer oder Hybridisierungssonden für den Nachweis einer PGC-1-codierenden Nukleinsäure (beispielsweise mRNA) geeignet sind. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder eine Nukleotidsequenz, welche zumindest zu 60%, mehr bevorzugt zu mindestens ungefähr 70%, immer noch mehr bevorzugt zu mindestens ungefähr 80%, immer noch mehr bevorzugt zu mindestens ungefähr 90% und am meisten bevorzugt zu mindestens ungefähr 95% oder mehr zu der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 identisch ist, wobei das Nukleinsäuremolekül ein Protein codiert, welches die Fähigkeit beibehält, eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten zu modellieren: UCP Expression, Thermogenese in Fettzellen, Differenzierung von Fettzellen und Insulinsensitivität von Fettzellen, oder den codierenden Bereich oder ein Komplement von einer von diesen Nukleotidsequenzen.
In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäuremolekül mindestens 500 kontinuierliche Nukleotide in der Länge auf und umfasst eine Nukleotidsequenz, welche in 6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ungefähr 45°C hybridisiert, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 50-65°C bis zu oder ist zumindest 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90% und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz identisch, wobei das Nukleinsäuremolekül ein Protein codiert, das die Befähigung zur Modulation einer oder mehreren der folgenden biologischen Aktivitäten beibehält: UCP Expression, Thermogenese in Fettzellen, Differenzierung von Fettzellen und Insulinsensitivität von Fettzellen.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder eine Aminosäuresequenz, welche zumindest zu 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90% und am meisten bevorzugt 95% oder mehr zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 identisch ist. Die bevorzugten PGC-1 Proteine der vorliegenden Erfindung weisen vorzugsweise ebenso zumindest eine der PGC-1 biologischen Aktivitäten auf, welche hierin beschrieben sind.
In einer anderen Ausführungsform codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon, wobei das Protein oder der Abschnitt davon eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 ist, beispielsweise ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, derart dass das Protein oder der Abschnitt davon eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten beibehält: 1) Es kann UCP Expression modulieren; 2) Es kann Thermogenese in Fettzellen modulieren, beispielsweise Thermogenese in braunen Fettzellen oder Muskel; 3) Es kann Adipogenese modulieren, beispielsweise Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen; 4) Es kann Insulinsensitivität von Zellen modulieren, beispielsweise Insulinsensitivität von Muskelzellen, Leberzellen und Fettzellen. In einer Ausführungsform ist das durch das Nukleinsäuremolekül codierte Protein zumindest zu 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90% und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 (beispielsweise die gesamte Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2) homolog.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Nukleinsäuremolekül von einem Menschen abgeleitet und codiert einen Abschnitt eines Proteins, welches eine oder mehrere der folgenden Domänen oder Motive umfasst: Eine Tyrosinphosphorylierungsstelle, eine cAMP-Phosphorylierungsstelle, eine Serin-Arginin (SR) reiche Domäne, ein RNA Bindemotiv und ein LXXLL (SEQ ID Nr. 3) Motiv, welches eine Wechselwirkung mit einem Nuklearen Rezeptor mediiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte Nukleinsäuremolekül von einem Menschen abgeleitet und codiert ein Protein (beispielsweise ein PGC-1 Fusionsprotein), welches eines oder mehrere der hierin beschriebenen Domänen/Motive umfasst und welches eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten aufweist: 1) Es kann UCP Expression modulieren; 2) es kann Thermogenese in Fettzellen modulieren, beispielsweise Thermogenese in braunen Fettzellen oder Muskel; 3) es kann Adipogenese modulieren, beispielsweise Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen; 4) es kann Insulinsensitivität von Zellen modulieren, beispielsweise Insulinsensitivität von Muskelzellen, Leberzellen und Fettzellen.
In einer anderen Ausführungsform beträgt die Länge des isolierten Nukleinsäuremoleküls mindestens 500 Nukleotide und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 umfasst. Das isolierte Nukleinsäuremolekül entspricht vorzugsweise einem natürlich aufdrehenden Nukleinsäuremolekül. Die isolierte Nukleinsäure codiert mehr bevorzugt natürlich auftretendes menschliches PGC-1 oder einen biologisch aktiven Abschnitt davon. Angesichts der hierin gegebenen Offenbarung einer PGC-1 codierenden cDNA Sequenz (beispielsweise SEQ ID Nr. 1), werden darüber hinaus ebenso antisense Nukleinsäuremoleküle (d. h. Moleküle, welche zu dem codierenden Strang der PGC-1 cDNA Sequenz komplementär sind) durch die Erfindung bereitgestellt.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft Vektoren, beispielsweise rekombinante Expressionsvektoren, welche die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung umfassen und Wirtszellen, in welche derartige Vektoren eingefügt wurden. In einer Ausführungsform wird eine derartige Wirtszelle verwendet, um ein PGC-1 Protein durch Kultivieren der Wirtszelle in einem geeigneten Medium zu erzeugen. Das PGC-1 Protein kann, falls gewünscht, anschließend von dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden.
Transgene nicht menschliche Tiere, in welchen ein PGC-1 Gen eingefügt oder geändert wurde, können nützlich sein. In einer Ausführungsform wurde das Genom des nicht menschlichen Tieres durch Einfügen eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung geändert, welches PGC-1 als ein Transgen codiert. In einer anderen Ausführungsform wurde ein endogenes PGC-1 Gen in dem Genom des nicht menschlichen Tieres, beispielsweise durch homologe Rekombination funktionell unterbrochen, geändert.
Eine noch andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein isoliertes PGC-1 Protein oder einen Abschnitt, beispielsweise einen biologisch aktiven Abschnitt davon. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das isolierte PGC-1 Protein oder Abschnitt davon Thermogenese in BAT modulieren. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte PGC-1 Protein oder Abschnitt davon ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, derartig dass das Protein oder Abschnitt davon eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten beibehält: 1) Es kann UCP Expression modulieren; 2) Es kann Thermogenese in Fettzellen modulieren, beispielsweise Thermogenese in braunen Fettzellen oder Muskel; 3) Es kann Adipogenese modulieren, beispielsweise Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen; 4) Es kann Insulinsensitivität von Zellen modulieren, beispielsweise Insulinsensitivität von Muskelzellen, Leberzellen und Fettzellen.
In einer Ausführungsform umfasst der biologisch aktive Abschnitt des PGC-1 Proteins eine Domäne oder Motiv, vorzugsweise eine Domäne oder ein Motiv, welche(s) eine PGC-1 biologische Aktivität aufweist. Die Domäne oder das Motiv kann eine Tyrosin Phosphorylierungsstelle sein, eine cAMP Phosphorylierungsstelle, eine Serin-Arginin (SR) reiche Domäne, ein RNA Bindemotiv und ein LXXLL (SEQ ID Nr. 3) Motiv, welches eine Wechselwirkung mit einem nuklearen Rezeptor moduliert, oder eine Kombination von einem oder mehreren von diesen Domänen oder Motiven. Der biologisch aktive Abschnitt des PGC-1 Proteins, welches eines oder auch mehrere von diesen Domänen oder Motiven umfasst, weist vorzugsweise eine der folgenden biologischen Aktivitäten auf: 1) Es kann UCP Expression modulieren; 2) Es kann Thermogenese in Fettzellen modulieren, beispielsweise Thermogenese in braunen Fettzellen oder Muskel; 3) Es kann Adipogenese modulieren, beispielsweise Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen; 4) Es kann Insulinsensitivität von Zellen modulieren, beispielsweise Insulinsensitivität von Muskelzellen, Leberzellen und Fettzellen.
Die Erfindung stellt ebenso eine isolierte Präparation eines PGC-1 Proteins bereit. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das PGC-1 Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder eine Aminosäuresequenz, welche zumindest zu 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt von zumindest um 90% und am meisten bevorzugt von mindestens um 95% oder mehr zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 homolog ist (beispielsweise die gesamte Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2). In anderen Ausführungsformen umfasst das isolierte PGC-1 Protein eine Aminosäuresequenz, welche zumindest zu 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt von zumindest um 90% und am meisten bevorzugt von mindestens um 95% oder mehr zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 homolog ist und eine oder mehrere der PGC-1 biologischen Aktivitäten aufweist, welche hierin beschrieben sind. Das isolierte PGC-1 Protein kann alternativ eine Aminosäuresequenz umfassen, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche hybridisiert, beispielsweise unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder zu mindestens 60%, mehr bevorzugt von mindestens um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt von mindestens um 90% und am meisten bevorzugt von mindestens um 95% oder mehr zu der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 homolog ist. Es ist ebenso bevorzugt, dass die bevorzugten Formen von PGC-1 ebenso eine oder mehrere der PGC-1 biologischen Aktivitäten aufweisen, welche hierin beschrieben sind.
Das PGC-1 Protein (oder Polypeptid) oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon kann an ein nicht PGC-1 Polypeptid wirksam verbunden sein, um ein Fusionsprotein zu bilden. Das PGC-1 oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon kann darüber hinaus in eine pharmazeutische Zusammensetzung eingefügt werden, welche das Protein und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Das erfindungsgemäße PGC-1 Protein oder Abschnitte oder Fragmente davon können zur Herstellung von Anti-PGC-1-Antikörpern verwendet werden. Die Erfindung stellt demgemäß ebenso ein antigenes Peptid von PGC-1 bereit, welches mindestens 8 Aminosäurereste der Aminosäuresequenz umfasst, welche in SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, und umfasst ein Epitop von PGC-1 derart, dass ein gegen das Peptid gerichteter Antikörper einen spezifischen Immunkomplex mit PGC-1 bildet. Das antigene Peptid umfasst vorzugsweise mindestens 10 Aminosäurereste, mehr bevorzugt mindestens 15 Aminosäurereste, sogar noch mehr bevorzugt 20 Aminosäurereste und am meisten bevorzugt mindestens 30 Aminosäurereste. Die Erfindung stellt weiterhin einen Antikörper bereit, der spezifisch PGC-1 bindet. Der Antikörper ist in einer Ausführungsform monoklonal. In einer anderen Ausführungsform ist der Antikörper mit einer nachweisbaren Substanz verbunden. In noch einer anderen Ausführungsform ist der Antikörper in eine pharmazeutische Zusammensetzung aufgenommen, welche den Antikörper und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft In vitro Verfahren zum Modulieren einer mit einer Zelle zusammenhängenden Aktivität, beispielsweise Proliferation, Differentiation, Überleben, Thermogenese und Sauerstoffverbrauch. Derartige Verfahren umfassen in Kontakt bringen der Zelle mit einem Agens, welches PGC-1 Proteinaktivität oder PGC-1 Nukleinsäureexpression derartig moduliert, dass eine mit einer Zelle zusammenhängende Aktivität relativ zu einer mit einer Zelle zusammenhängenden Aktivität (beispielsweise die gleiche mit einer Zelle zusammenhängenden Aktivität) der Zelle in der Abwesenheit des Agens geändert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mit einer Zelle zusammenhängenden Aktivität Thermogenese und die Zelle ist eine braune Fettzelle. Das Agens, welches die PGC-1 Aktivität moduliert, kann ein Agens sein, welches PGC-1 Aktivität oder PGC-1 Nukleinsäureexpression stimuliert. Beispiele von Agenzien, welche PGC-1 Proteinaktivität oder PGC-1 Nukleinsäureexpression stimulieren, umfassen kleine Moleküle, aktive PGC-1 Proteine und Nukleinsäuren, welche PGC-1 codieren, welche in die Zelle eingefügt werden. Beispiele von Agenzien, welche eine PGC-1 Aktivität oder Expression inhibieren, umfassen kleine Moleküle, antisense PGC-1 Nukleinsäuremoleküle und Antikörper, welche spezifisch an PGC-1 binden. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Zelle in einem Subjekt vor und das Agens wird dem Subjekt verabreicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung der Nukleotide und Proteine bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Subjekten mit verschiedenen Erkrankungen. Die Erfindung betrifft beispielsweise Verfahren zur Behandlung eines Subjekts mit einer Erkrankung, welche durch eine anormale bzw. abweichende PGC-1 Proteinaktivität oder Nukleinsäureexpression charakterisiert ist, wie beispielsweise eine Gewichtserkrankung, beispielsweise Fettsucht, Anorexie, Cachexie bzw. Auszehrung oder eine Erkrankung, welche mit einer unzureichenden Insulinaktivität, wie beispielsweise Diabetes, zusammenhängt. Diese Verfahren umfassen ein Verabreichen eines PGC-1 Modulators (beispielsweise eines kleinen Moleküls) derart an ein Subjekt, dass eine Behandlung des Subjets auftritt.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung bei der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung eines Subjekts mit einer Gewichtserkrankung, beispielsweise Fettsucht, oder einer Erkrankung, welche mit einer unzureichenden Insulinaktivität zusammenhängt, beispielsweise Diabetes, umfassend Verabreichen eines PGC-1 Aktivators, beispielsweise eines PGC-1 Proteins oder eines Abschnitts davon, oder einer Verbindung oder eines Agens an das Subjekt, wodurch ein Ansteigen der Expression oder Aktivität von PGC-1 derart auftritt, dass eine Behandlung der Erkrankung auftritt. Gewichtserkrankungen, wie beispielsweise Fettsucht, und Erkrankungen, welche mit einer unzureichenden Insulinaktivität zusammenhängen, können ebenso gemäß der Erfindung durch Verabreichung eines PGC-1 Aktivators, beispielsweise einer ein PGC-1 codierenden Nukleinsäure oder Abschnitt davon, an das Subjekt mit der Erkrankung behandelt werden, derart dass eine Behandlung auftritt.
Die Erfindung kann ebenso bei Verfahren zum Nachweis genetischer Läsionen in einem PGC-1 Gen verwendet werden, wodurch bestimmt wird, ob ein Subjekt mit dem Läsionsgen ein Risiko für (oder prädisponiert ist aufzuweisen) eine Erkrankung aufweist, welche durch eine anormale oder abnormale PGC-1 Nukleinsäureexpression oder PGC-1 Proteinaktivität gekennzeichnet ist, beispielsweise eine Gewichtserkrankung oder eine Erkrankung, welche mit einer unzureichenden Insulinaktivität zusammenhängt. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Verfahren Nachweisen, in einer Probe von Zellen von dem Subjekt, der Anwesenheit oder Abwesenheit einer genetischen Läsion, welche durch eine Änderung gekennzeichnet ist, welche die Integrität eines Gens beeinträchtigt, welches ein PGC-1 Protein codiert, oder die fehlerhafte Expression des PGC-1 Gens.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft In vitro Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von PGC-1 in einer biologischen Probe. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Verfahren In Kontakt bringen einer biologischen Probe (beispielsweise eines Cardiomyocyten, Hepatocyten, einer neuronalen Zelle, braunen Fettzelle oder Muskelprobe) mit einer Verbindung oder einem Agens, welche(s) PGC-1 Protein oder PGC-1 mRNA derart Nachweisen kann, dass die Anwesenheit PGC-1 in der biologischen Probe nachgewiesen wird. Die Verbindung oder das Agens kann beispielsweise eine markierte oder markierbare Nukleinsäuresonde sein, welche an PGC-1 oder mRNA hybridisieren kann, oder ein markierter oder markierbarer Antikörper, welcher an das PGC-1 Protein Binden kann. Die Erfindung kann weiterhin bei der Diagnose eines Subjekts mit beispielsweise einer Gewichtserkrankung oder einer Erkrankung verwendet werden, die mit einer unzureichenden Insulinaktivität zusammenhängt, basierend auf einem Nachweis von PGC-1 Proteins oder mRNA. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren In Kontakt bringen einer Zelle oder Gewebeprobe (beispielsweise einer braunen Fettzellenprobe) von dem Subjekt mit einem Agens, welches PGC-1 Protein oder mRNA Nachweisen kann, Bestimmen der Menge an PGC-1 Protein oder mRNA, welche in der Zelle oder Gewebeprobe exprimiert ist, Vergleichen der Menge an PGC-1 Protein oder mRNA, welche in der Zelle oder Gewebeprobe exprimiert ist, mit einer Kontrollprobe und Bilden einer Diagnose basierend auf der Menge an PGC-1 Protein oder mRNA, welche in der Zelle oder Gewebeprobe im Vergleich zu der Kontrollprobe exprimiert wurde. Die Zellprobe ist vorzugsweise eine braune Fettzellenprobe. Kits zum Nachweis von PGC-1 in einer biologischen Probe liegen ebenso im Bereich der Erfindung.
Eine noch andere Ausführungsform der Erfindung betrifft In vitro Verfahren, beispielsweise Durchmusterungsassays, zum Identifizieren einer Verbindung zum Behandeln einer Erkrankung, welche durch eine anormale PGC-1 Nukleinsäureexpression oder Proteinaktivität gekennzeichnet ist, beispielsweise eine Gewichtserkrankung oder eine Erkrankung, welche mit einer unzureichenden Insulinaktitvität zusammenhängt. Diese Verfahren umfassen für gewöhnlich Prüfen der Befähigung der Verbindung oder des Agens die Expression des PGC-1 Gens oder die Aktivität des PGC-1 Proteins zu modulieren, und dadurch Identifizieren einer Verbindung zum Behandeln einer Erkrankung, welche durch eine anormale PGC-1 Nukleinsäureexpression oder Proteinaktivität gekennzeichnet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren In Kontakt bringen einer biologischen Probe, beispielsweise einer Zelle oder einer Gewebeprobe, beispielsweise einer braunen Fettzellenprobe, welche von einem Subjekt mit der Erkrankung erhalten wurde mit der Verbindung oder dem Agens, Bestimmen der Menge an PGC-1 Protein, welche exprimiert wurde und/oder Erfassen der Aktivität des PGC-1 Proteins in der biologischen Probe, Vergleichen der Menge an PGC-1 Protein, welches in der biologischen Probe exprimiert wurde und/oder der erfassbaren PGC-1 biologischen Aktivität in der Zelle mit jener einer Kontrollprobe. Eine Änderung in der Menge an PGC-1 Nukleinsäureexpression oder PGC-1 Proteinaktivität in der Zelle, welche der Verbindung oder dem Agens ausgesetzt wurde, im Vergleich zu der Kontrolle zeigt eine Modulation der PGC-1 Nukleinsäureexpression und/oder PGC-1 Proteinaktivität an.
Die Erfindung betrifft ebenso In vitro Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung oder eines Agens, welche(s) mit (beispielsweise Binden an) einem PGC-1 Protein wechselwirkt. Diese Verfahren umfassen die Schritte von In Kontakt bringen des PGC-1 Proteins mit der Verbindung oder dem Agens unter Bedingungen, welche ein Binden der Verbindung an das PGC-1 Protein ermöglichen, um einen Komplex zu bilden, und Nachweisen der Bildung als Komplexes des PGC-1 Proteins und der Verbindung, in welcher die Befähigung der Verbindung an das PGC-1 Protein zu Binden durch die Anwesenheit der Verbindung in dem Komplex angezeigt wird.
Die Erfindung betrifft ferner In vitro Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung oder eines Agens, welche(s) die Wechselwirkung des PGC-1 Proteins mit einem Zielmolekül moduliert, beispielsweise stimuliert oder inhibiert, beispielsweise PPARγ, C/EBPα, einem nuklearen Hormonrezeptor, beispielsweise dem Thyroidhormonrezeptor, dem Östrogenrezeptor und dem Retinolsäure-Rezeptor. Bei diesen Verfahren wird das PGC-1 Protein in der Anwesenheit der Verbindung oder Agens mit dem Zielmolekül unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche ein Binden des Zielmoleküls an das PGC-1 Protein zur Bildung eines Komplexes erlauben. Eine Änderung, beispielsweise ein Ansteigen oder ein Absenken, bei einer Komplexbildung zwischen dem PGC-1 Protein und dem Zielmolekül im Vergleich zu der Menge an gebildetem Komplex in der Abwesenheit der Verbindung oder des Agens zeigt die Befähigung der Verbindung oder des Agens an die Wechselwirkung des PGC-1 Proteins mit einem Zielmolekül zu modulieren.
1A, 1A-1 und 1A-2 zeigen das Maus PGC-1 Nukleotid (SEQ ID Nr. 1) und Aminosäure (SEQ ID Nr. 2) Sequenz.
Die 2A-2B zeigen eine Analyse der Maus PGC-1 Sequenz. Die folgenden Domänen sind in 2A unterstrichen: SR Domäne (Aminosäuren 565-598 und 617-631), eine RNA Bindedomäne (Aminosäure 677-709) drei Konsensusstellen für phosphorylierende Proteinkinase A (Aminosäuren 238-241, 373-376 und 655-668) und ein LXXLL (SEQ ID Nr. 3) Motiv (Aminosäuren 142-146).
Die 2B ist eine schematische Darstellung der Struktur des Maus PGC-1. Pfeile zeigen wahrscheinliche Proteinkinase A Phosphorylierungsstellen mit der Konsensussequenz (R, K)2x(ST) an. Der graue Kasten zeigt die SR reiche Bereichsdomäne und der schwarze Kasten zeigt die RNA Bindedomäne an.
Die 3A-3B sind Balkendiagramme, welche die Wirkung von Maus PGC-1 bei einem Stimulieren der Transaktivation des UCP-1 Promotors durch PPARγ und Thyroidhormonrezeptor (TR) zeigen. 3A zeigt die angestiegene Transkriptionsaktivation des CAT Reportergens unter der Kontrolle des UCP-1 Promotors hinsichtlich der angezeigten Liganden/Hormone in RAT1 IR Zellen. Die 3B ist eine Grafik, welche die angestiegene Transkriptionsaktivation eines Reporter CAT Gens unter der Kontrolle von UAS Sequenzen (fünf Kopien) unter Verwendung von Maus PGC-1 verbunden mit GAL4 DBD, anzeigt.
Die 4 ist ein Diagramm von verschiedenen Maus PGC-1 Deletionen, um die Domäne von PGC-1 zu identifizieren, welche mit PPARγ wechselwirkt. In der Figur sind schematische Darstellungen der PGC-1 Deletionen mit der entsprechenden Prozentzahl von Eingangsmaterial dargestellt, welches an PPARγ gebunden ist. Das LXXLL (SEQ ID Nr. 3) Motiv befindet sich bei den Aminosäurenresten 142-146. Der schwarze Kasten entspricht der PPARγ Bindedomäne von PGC-1 (Aminosäure 292-338).
Die 5 ist ein Diagramm von verschiedenen Maus PPARγ Deletionen, um die Domäne von PPARγ zu identifizieren, welche mit PGC-1 wechselwirkt. In der Figur sind schematische Darstellungen der PPARγ Deletionen mit der entsprechenden Prozentzahl einer Eingangsbindung an PGC-1 dargestellt.
Die 6 ist ein Balkendiagramm, welches die Wirkung bei Sauerstoffverbrauch einer chronischen Behandlung von PGC-1 infizierten und Kontroll-Zellen mit cAMP und Retinolsäure (RA) zeigt.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung neuer Moleküle, welche hierin als PGC-1 Nukleinsäure und Proteinmoleküle bezeichnet werden, welche eine Rolle spielen bei oder fungieren in mit Fettzellen zusammenhängenden Aktivitäten. In einer Ausführungsform können die PGC-1 Moleküle Adipogenese, beispielsweise Adipogenese von braunen Fettzellen und Muskelzellen, modulieren. In einer anderen Ausführungsform können die PGC-1 Moleküle Thermogenese in braunen Fettzellen modulieren. Die erfindungsgemäßen PGC-1 Moleküle können beispielsweise Thermogenese in Fettzellen eines Individuums erhöhen, wodurch Gewichtsverlust in dem Individuum gefördert wird. Die erfindungsgemäßen PGC-1 Moleküle können daher verwendet werden, um Fettsucht zu behandeln. Darüber hinaus kann durch die PGC-1 Moleküle verursachte Erhöhung bei thermogenetischer Aktivität ebenso Insulinsensitivität der Fettzellen genauso wie von Muskelzellen und Leberzellen erhöhen. Die erfindungsgemäßen PGC-1 Moleküle können daher ebenso verwendet werden, um Erkrankungen zu behandeln, welche durch eine unzureichende Insulinaktivität, wie beispielsweise Diabetes, gekennzeichnet sind. Alternativ kann keine Inhibierung der Aktivität der PGC-1 Moleküle der Erfindung Thermogenese in Fettzellen eines Individuums erniedrigen, wodurch ein Gewichtsverlust in dem Individuum inhibiert wird. Die Modulatoren der erfindungsgemäßen PGC-1 Moleküle können daher ebenso verwendet werden, um unerwünschten Gewichtsverlust, wie beispielsweise Cachexie, Anorexie, zu behandeln. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen PGC-1 Moleküle ebenso als Ziel zum Durchmustern von Molekülen, wie beispielsweise kleinen Molekülen, verwendet werden, welche eine PGC-1 Aktivität modulieren können. PGC-1 Modulatoren können ebenso verwendet werden, um Gewichtserkrankungen, wie beispielsweise Cachexie, Anorexie, Fettsucht, oder Erkrankungen, welche durch eine unzureichende Insulinaktivität gekennzeichnet sind, zu behandeln.
PGC-1 Nukleinsäuremoleküle wurden von braunen Fettzellen der Maus basierend auf ihrer Befähigung identifiziert, wie unter Verwendung eines Hefe Zweihybrid Assays (beschrieben in Beispiel 1) bestimmt wird, um PPARγ zu binden. Wie vorstehend beschrieben ist PPARγ ein nuklearer Hormonrezeptor, welcher sowohl als direkter Regulator von vielen fettspezifischen Genen als auch als ein "Master" Regulator fungiert, welcher das gesamte Programm der Adipogenese auslösen kann. Da der UCP Genpromoter ein PPARγ reaktives Element umfasst, kann darüber hinaus ein Modulator von PPARγ Adipogenese und UCP Expression modulieren. UCP Expression kann zu Thermogenese führen.
Die Nukleotidsequenz der Maus PGC-1 cDNA und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des Maus PGC-1 Proteins werden in 1A, 1A-1, 1A-2 und 2A und in SEQ ID Nr. 1 und 2 jeweils gezeigt. Unter Verwendung der gesamten oder eines Anteils der Maus Nukleotidsequenz (beispielsweise eines 5' Abschnitts von SEQ ID Nr. 1, beispielsweise die Nukleotide 1-50 von SEQ ID Nr. 1), um eine cDNA Bibliothek einer menschlichen Zelllinie, beispielsweise einer menschlichen Muskel, Herz, Niere, oder Gehirnzellenlinie zu sondieren, kann die menschliche PGC-1 Nukleotidsequenz unter Verwendung herkömmlichen Experimentierens, wie in Beispiel II beschrieben, erhalten werden. Das Maus PGC-1 Gen, welches näherungsweise 3066 Nukleotide in Länge umfasst, codiert ein Volllängenprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 120 kD und welches ungefähr 797 Aminosäurenreste in der Länge umfasst. Das PGC-1 Protein umfasst mehrere Domänen/Motive. Diese Domänen/Motive umfassen: zwei wahrscheinliche Tyrosinphosphorylierungsstellen (Aminosäurereste 204-212 und 378-385 von SEQ ID Nr. 2), drei wahrscheinliche cAMP Phosphorylierungsstellen (Aminosäurereste 238-241, 373-376, und 655-658 von SEQ ID Nr. 2), eine Serin-Arginin (SR) reiche Domäne (Aminosäurereste 562-600 von SEQ ID Nr. 2), ein RNA Bindemotiv (Aminosäurereste 656-709 von SEQ ID Nr. 2) und ein LXXLL Motiv (Aminosäuren 142-146 von SEQ ID Nr. 2; SEQ ID Nr. 3), welches eine Wechselwirkung mit einem nuklearen Rezeptor mediiert. Wie hierin verwendet ist eine Tyrosinphosphorylierungsstelle eine Aminosäuresequenz, welche zumindest einen Tyrosinrest umfasst, der durch eine Tyrosinproteinkinase phosphoryliert werden kann. Eine Tyrosinphosphorylierungsstelle ist für gewöhnlich durch ein Lysin oder ein Arginin etwa sieben Reste zu der N-terminalen Stelle des phosphorylierten Tyrosins gekennzeichnet. Ein saurer Rest (Asparagin oder Glutamin) wird häufig bei entweder drei oder vier Resten zu der N-terminalen Stelle des Tyrosins gefunden (Patschinsky, T. et al.; PNAS; 79 (1982) 973-977); Hunter, T.; J. Biol. Chem.; 257 (1982) 4843-4848; Cooper, J.A. et al.; J. Biol. Chem.; 259 (1984) 7835-7841). Wie hierin verwendet ist eine cAMP Phosphorylierungsstelle eine Aminosäuresequenz, welche einen Serin oder Threoninrest umfasst, welcher durch eine cAMP abhängige Proteinkinase phosphoryliert werden kann. Für gewöhnlich ist die cAMP Phosphorylierungsstelle durch zumindest zwei aufeinander folgende basische Reste zu der N-terminalen Stelle des Serins oder Threonins gekennzeichnet (Fremisco, J.R. et al.; J. Biol. Chem.; 255 (1980) 4240-4245; Glass, D. B. and Smith, S.B.; J. Biol. Chem.; 258 (1983) 14797-14803; Glass, D.B. et al.; J. Biol. Chem.; 261 (1986) 2987-2993). Wie hierin verwendet ist eine Serin-Arginin reiche Domäne eine Aminosäuresequenz, welche an Serin- und Argininresten reich ist. Für gewöhnlich sind SR reiche Domänen Domänen, welche mit der CTD Domäne der RNA Polymerase II wechselwirken oder in Splicingfunktionen einbezogen sind. Wie hierin verwendet ist ein RNA Bindemotiv eine Aminosäuresequenz, welche an ein RNA Molekül oder ein einzelsträngiges DNA-Molekül binden kann. RNA-Bindemotive werden in Lodish, H., Darnell, J., und Baltimore, D. Molecular Cell Biology, 3. rd. ed. (W.H. Freeman and Company, New York, New York, 1995) beschrieben. Wie hierin verwendet bezieht sich ein LXXLL (SEQ ID Nr. 3) auf ein Motiv, worin X irgendeine Aminosäure sein kann und welches eine Wechselwirkung zwischen einem nuklearen Rezeptor und einem Co-Aktivator mediiert (Heery et al.; Nature; 397 (1997) 733-736; Torchia et al.; Nature; 387 (1997) 677-684).
Das PGC-1 Protein wird in Muskel, Herz, Niere, Gehirn und braunem Fettgewebe exprimiert aber nicht in weißem Fettgewebe. In Gewebe von kalt akklimatisierten Tieren war eine PGC-1 Expression in braunem Fettgewebe hoch induziert. Darüber hinaus war im Gewebe von kalt akklimatisierten Tieren, eine PGC-1 Expression für braunes Fettgewebe spezifisch. Eine PGC-1 Expression in Geweben von kalt akklimatisierten Tieren ist parallel bzw. entspricht zu einer Expression von UCP, wobei der braune Fettgewebemarker für die thermogenetische Aktivität dieses Gewebes verantwortlich ist.
Das PGC-1 Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt oder Fragment der Erfindung kann eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten aufweisen: 1) Es kann UCP Expression modulieren; 2) Es kann Thermogenese in Fettzellen, beispielsweise Thermogenese in braunen Fettzellen oder Muskel modulieren; 3) Es kann Adipogenese modulieren, beispielsweise Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen; 4) Es kann eine Insulinsensitivität von Zellen modulieren, beispielsweise eine Insulinsensitivität von Muskelzellen, Leberzellen und Fettzellen.
Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung werden ausführlicher in den folgenden Abschnitten beschrieben werden:
1. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche PGC-1 oder biologisch aktive Abschnitte davon codieren, ebenso wie Nukleinsäurefragmente, welche für eine Verwendung als Hybridisierungssonden ausreichend sind, um eine PGC-1 codierende Nukleinsäure (beispielsweise PGC-1 mRNA) zu identifizieren. Wie hierin verwendet ist der Ausdruck "Nukleinsäuremolekül" beabsichtigt DNA-Moleküle (beispielsweise cDNA oder genomische DNA) und RNA Moleküle (beispielsweise mRNA) und Analoge der DNA oder RNA zu umfassen, welche unter Verwendung von Nukleotidanalogen erzeugt wurden. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist allerdings vorzugsweise doppelsträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist eines, welches von anderen Nukleinsäuremolekülen getrennt wird, welche in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorliegen. Eine "isolierte" Nukleinsäure ist vorzugsweise frei von Sequenzen, welche naturgemäß die Nukleinsäure (d. h. Sequenzen, welche sich an den 5' und 3' Enden der Nukleinsäure befinden) in der genomischen DNA des Organismus flankieren, von welchem die Nukleinsäure abgeleitet ist. In verschiedenen Ausführungsformen kann beispielsweise das isolierte PGC-1 Nukleinsäuremolekül weniger als um 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb von Nukleotidsequenzen enthalten, welche naturgemäß das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle flankieren von welcher die Nukleinsäure abgeleitet ist (beispielsweise einer braunen Fettzelle). Darüber hinaus kann ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen von anderen zellularem Material oder Kulturmedium frei sein, falls durch rekombinante Techniken hergestellt, oder chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, falls chemisch synthetisiert.
Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder einer Nukleotidsequenz, welche zumindest 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt von zumindest um 90% und am meisten bevorzugt von zumindest um 95% oder mehr zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder eines Abschnitts davon (beispielsweise 400, 450, 500 oder mehr Nukleotide) homolog ist, kann unter Verwendung von herkömmlichen molekularbiologischen Techniken und der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Eine menschliche PGC-1 cDNA kann beispielsweise von einem menschlichen Herzen, Niere, oder Gehirnzellenlinie (von Stratagene, LaJolla, CA, oder Clontech, Palo Alto, CA) unter Verwendung der gesamten oder eines Abschnitts von SEQ ID Nr. 1 als eine Hybridisierungssonde und herkömmlichen Hybridisierungstechniken isoliert werden (beispielsweise wie beschrieben in Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Darüber hinaus kann ein Nukleinsäuremolekül, welches die gesamte oder einen Abschnitt von SEQ ID Nr. 1 oder eine Nukleotidsequenz umfasst, welche zumindest 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90% und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz homolog ist, durch die Polymerase Kettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, welche basierend auf der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder der homologen Nukleotidsequenz erzeugt wurden. MRNA kann beispielsweise von Herzzellen, Nierenzellen, Gehirnzellen oder braunen Fettzellen (beispielsweise durch das Guanidin-Thiocyanat Extraktionsverfahren von Chirgwin et al.; Biochemistry; 18 (1979) 5294-5299) isoliert werden und cDNA kann durch Verwendung reverser Transkriptase (beispielsweise Moloney MLV Reverse Transkriptase, verfügbar bei Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV Reverser Transkriptase, verfügbar bei Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) hergestellt werden. Synthetische Oligonukleotidprimer für eine PCR Amplifikation können basierend auf der Nukleotidsequenz, welche in SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, oder der homologen Nukleotidsequenz erzeugt werden. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ dazu genomische DNA, als ein Templat und geeigneter Oligonukleotidprimer gemäß herkömmlichen PCR Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die derart amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Darüber hinaus können Oligonukleotide, welche einer PGC-1 Nukleotidsequenz entsprechen, durch herkömmliche Synthesetechniken hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Nukleotidsequenz oder eine Nukleotidsequenz, welche zumindest zu 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90%, und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz homolog ist. Die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 entspricht der Maus PGC-1 cDNA. Diese cDNA umfasst Sequenzen, welche das PGC-1 Protein codieren (d. h. "der codierende Bereich" der Nukleotide 92 bis 2482), ebenso wie 5' nicht übersetzte bzw. nicht translatierte Sequenzen (Nukleotide 1 bis 91) und 3' nicht übersetzte Sequenzen (Nukleotide 2483 bis 3066). Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül ausschließlich dem codierenden Bereich von SEQ ID Nr. 1 umfassen (beispielsweise Nukleotide 92 bis 2482) oder die homologe Nukleotidsequenz.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Komplement der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder einer Nukleotidsequenz ist, welche zu mindestens 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90%, und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz homolog ist. Ein Nukleinsäuremolekül, welche zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder zu einer Nukleotidsequenz komplementär ist, welche zumindest 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90%, und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der in der SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz homolog ist, ist eine welche zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder zu der homologen Sequenz ausreichend komplementär ist, derart dass sie an die in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder der homologen Sequenz hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex gebildet wird.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Nukleotidsequenz, welche zumindest 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90%, und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder eines Abschnitts dieser Nukleotidsequenz homolog ist. In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung mindestens 500 zusammenhängende Nukleotide in Länge auf und umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz hybridisiert, d. h. unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ausschließlich einen Abschnitt des codierenden Bereichs von SEQ ID Nr. 1 und des codierenden Bereichs einer Nukleotidsequenz umfassen, welche zumindest von 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest von 90% und am meisten bevorzugt von mindestens um 95% oder mehr zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Nukleotidsequenz homolog ist, beispielsweise ein Fragment, welches als eine Sonde oder ein Primer oder als ein Fragment verwendet werden kann, welches einen biologisch aktiven Abschnitt von PGC-1 codiert. Die Nukleotidsequenz, welche durch das Klonieren des PGC-1 Gens von einer Maus bestimmt wurde, ermöglicht die Erzeugung von Sonden und Primern, welche für eine Verwendung bei einem in Identifizieren und/oder Klonieren von PGC-1 Homologen in anderen Zellarten, beispielsweise von anderen Geweben, ebenso wie PGC-1 Homologe von anderen Säugern, wie beispielsweise Menschen, erzeugt wurden. Die Sonde/Primer umfasst für gewöhnlich im Wesentlichen gereinigtes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst für gewöhnlich einen Bereich einer Nukleotidsequenz, welche unter stringenten Bedingungen zu zumindest um 12, vorzugsweise zumindest um 25, mehr bevorzugt um 40, 50 oder 75 aufeinander folgenden Nukleotide von SEQ ID Nr. 1 sense, einer antisense Sequenz von SEQ ID Nr. 1, oder natürlich auftretenden Mutanten davon hybridisiert. Auf der Nukleotidsequenz in SEQ ID Nr. 1 basierende Primer können in PCR Reaktionen verwendet werden, um PGC-1 Homologe zu klonieren. Auf den PGC-1 Nukleotidsequenzen basierende Sonden können verwendet werden, um Transkripte oder genomische Sequenzen nachzuweisen, welche die gleichen oder homologe Proteine codieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde weiterhin eine daran angebrachte Markergruppe, beispielsweise kann die Markergruppe ein Radioisotop eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym, oder ein Enzymkofaktor sein. Derartige Sonden können als ein Teil eines diagnostischen Testkits zum Identifizieren von Zellen oder Gewebe verwendet werden, welches ein PGC-1 Protein falsch exprimiert, wie beispielsweise durch Erfassen bzw. Bestimmen eines Niveaus einer PGC-1 codierenden Nukleinsäure in einer Probe von Zellen von einem Subjekt, beispielsweise Nachweisen von PGC-1 mRNA Niveaus oder Bestimmen, ob ein genomisches PGC-1 Gen mutiert oder deletiert wurde.
In einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein Protein oder Abschnitt davon, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 ist, derart dass das Protein oder der Abschnitt davon eine oder mehr der folgenden biologischen Aktivitäten beibehält: 1) Es kann UCP Expression modulieren; 2) Es kann Thermogenese in Fettzellen modulieren, beispielsweise Thermogenese in braunen Fettzellen oder Muskel; 3) Es kann Adipogenese modulieren, beispielsweise Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen; 4) Es kann Insulinsensitivität von Zellen modulieren, beispielsweise Insulinsensitivität von Muskelzellen, Leberzellen und Fettzellen.
Wie hierin verwendet betrifft die Ausdrucksweise "ausreichend homolog" Proteine und Abschnitte davon, welche Aminosäuresequenzen aufweisen, welche eine Mindestanzahl von identischen oder äquivalenten (beispielsweise ein Aminosäurerest, welcher eine ähnliche Seitenkette wie ein Aminosäurerest in SEQ ID Nr. 2 aufweist) Aminosäurereste zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst, derart dass das Protein oder Abschnitt davon eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten beibehält: 1) Es kann UCP Expression modulieren; 2) Es kann Thermogenese in Fettzellen modulieren, beispielsweise Thermogenese in braunen Fettzellen oder Muskel; 3) Es kann Adipogenese modulieren, beispielsweise Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen; 4) Es kann eine Insulinsensitivität von Zellen modulieren, beispielsweise eine Insulinsensitivität von Muskelzellen, Leberzellen und Fettzellen. In einer anderen Ausführungsform ist das Protein zumindest zu 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90% und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der gesamten Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 homolog.
Abschnitte von Proteinen, welche durch das PGC-1 Nukleinsäuremolekül der Erfindung codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte des PGC-1 Proteins. Wie hierin verwendet ist der Ausdruck "biologisch aktiver Abschnitt von PGC-1" beabsichtigt einen Abschnitt, beispielsweise eine Domäne/Motiv von PGC-1, zu umfassen, welche(s) eines oder mehrere der folgenden Aktivitäten aufweist: 1) Es kann UCP Expression modulieren; 2) Es kann Thermogenese in Fettzellen modulieren, beispielweise Thermogenese in braunen Fettzellen oder Muskel; 3) Es kann Adipogenese modulieren, beispielsweise Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen; 4) Es kann eine Insulinsensitivität von Zellen modulieren, beispielsweise eine Insulinsensitivität von Muskelzellen, Leberzellen und Fettzellen.
Herkömmliche Bindeassays, beispielsweise Immunopräzipitationen und Hefe Zwei hybrid Assays, wie hierin beschrieben, können durchgeführt werden, um die Befähigung eines PGC-1 Proteins oder eines biologisch aktiven Abschnitts davon mit (beispielsweise daran zu binden) PPARγ, C/EBPα und nuklearen Hormonrezeptoren wechselzuwirken zu bestimmen. Falls von den PGC-1 Molekülen gefunden wird mit PPARγ, C/EBPα und/oder nuklearen Hormonrezeptoren wechselzuwirken, sind sie ebenfalls wahrscheinlich Modulatoren der Aktivität von PPARγ, C/EBPα und nuklearen Hormonrezeptoren.
Um zu bestimmen, ob die erfindungsgemäßen PGC-1 Moleküle eine UCP Expression modulieren, können in vitro transkriptionelle Assays durchgeführt werden. Um einen derartigen Assay durchzuführen, kann der Volllängenpromoter und Verstärker von UCP an ein Reportergen verknüpft werden, wie beispielsweise eine Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT), und in Wirtszellen eingefügt werden. Die gleichen Wirtszellen können anschließend mit PPARγ/RXRα und einer das PGC-1 Molekül codierende Nukleinsäure transfiziert werden. Die Wirkung des PGC-1 Moleküls kann durch Testen der CAT-Aktivität erfasst werden, und Vergleichen von ihr mit einer CAT-Aktivität in Zellen, welche keine das PGC-1 Molekül codierenden Nukleinsäure enthalten. Eine Zunahme oder Abnahme in einer CAT-Aktivität zeigt eine Modulierung einer UCP Expression an und da von einer UCP Expression bekannt ist ein kritischer Bestandteil in der Ereigniskaskade zu sein, welche zu einer erhöhten Thermogenese führt, kann dieser Assay ebenso die Befähigung des PGC-1 Moleküls, eine Thermogenese in Fettzellen zu modulieren, bestimmen.
Der vorstehend beschriebene Assay zum Testen der Befähigung eines PGC-1 Moleküls eine UCP Expression zu modulieren, kann ebenso verwendet werden, um die Befähigung des PGC-1 Moleküls zu testen, Adipogenese, beispielsweise Differenzierung von weißem Fettgewebe zu braunem Fettgewebe, zu modulieren, da eine UCP Expression spezifisch für braunes Fettgewebe ist. Falls ein PGC-1 Molekül eine UCP Expression modulieren kann, kann es überaus wahrscheinlich die Differenzierung von weißem Fettgewebe zu braunem Fettgewebe modulieren. Alternativ kann die Befähigung eines PGC-1 Moleküls die Differenzierung von weißem Fettgewebe zu braunem Fettgewebe erfasst werden, indem ein PGC-1 Molekül in eine Zelle eingefügt wird, beispielsweise ein weißer Fettzell, und Bestimmen der Anzahl von Mitochondrien in der Zelle im Vergleich zur Anzahl von Mitochondrien in einer Kontrollzelle, welche das PGC-1 Molekül nicht enthält. Da von braunen Fettzellen bekannt ist im Wesentlichen größere Anzahlen zu Mitochondrien als weiße Fettzellen zu enthalten, zeigt eine Zunahme oder Abnahme bei der Anzahl von Mitochondrien (oder einem Mitochondrien Marker, wie beispielsweise einer Cytochrom C Oxidase) in der Testzelle im Vergleich zu der Kontrollzelle an, dass das PGC-1 Molekül eine Differenzierung von weißem Fettgewebe zu braunem Fettgewebe modulieren kann.
Die Befähigung eines PGC-1 Moleküls eine Insulinsensivität einer Zelle zu modulieren kann durch Durchführen eines Assays bestimmt werden, in welchem Zellen, beispielsweise Muskelzellen, Leberzellen oder Fettzellen, zur Exprimierung des PGC-1 Proteins transformiert werden, mit radioaktiv markierter Glucose (¹⁴C Glucose) inkubiert und mit Insulin behandelt werden. Eine Zunahme oder Abnahme in der Glucose in den Zellen, welche PGC-1 im Vergleich zu den Kontrollzellen enthalten, zeigt an, dass das PGC-1 eine Insulinsensitivität der Zellen modulieren kann. Alternativ können die Zellen, welche PGC-1 enthalten, mit einer radioaktiv markierten Phosphatquelle (beispielsweise [³²P]ATP) inkubiert werden und mit Insulin behandelt werden. Eine Phosphorylierung von Proteinen in dem Insulinweg, beispielsweise Insulinrezeptor, kann anschließend erfasst werden. Eine Zunahme oder Abnahme bei der Phosphorylierung eines Proteins in dem Insulinweg in Zellen, welche PGC-1 im Vergleich zu den Kontrollzellen enthalten, zeigt an, dass das PGC-1 eine Insulinsensitivität der Zellen modulieren kann.
In einer Ausführungsform umfasst der biologisch aktive Abschnitt von PGC-1 eine Domäne oder ein Motiv. Beispiele derartiger Domänen/Motive umfassen eine Tyrosinphosphorylierungsstelle, eine cAMP Phosphorylierungsstelle, eine Serin-Arginin (SR) reiche Domäne, ein RNA Bindemotiv und ein LXXLL (SEQ ID Nr. 3) Motiv, welches eine Wechselwirkung mit einem nuklearen Rezeptor moduliert. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der biologisch aktive Abschnitt des Proteins, welches die Domäne oder das Motiv umfasst, eine Differenzierung von weißen Fettzellen zu braunen Fettzellen und/oder Thermogenese in braunen Fettzellen modulieren. Diese Domänen werden detailliert hierin beschreiben. Zusätzliche Nukleinsäurefragmente, welche biologisch aktive Abschnitte von PGC-1 codieren, können durch Isolieren eines Abschnitts von SEQ ID Nr. 1 oder einer homologen Nukleotidsequenz hergestellt werden, Exprimieren des codierenden Abschnitts eines PGC-1 Proteins oder Peptids (beispielsweise durch eine rekombinante Expression in vitro) und Bewerten der Aktivität des codierenden Abschnitts eines PGC-1 Proteins oder Peptids.
Die Erfindung umfasst weiterhin Nukleinsäuremoleküle, welche sich von der Nukleotidsequenz, welche in SEQ ID Nr. 1 (und Abschnitten davon) gezeigt werden, aufgrund einer Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und daher das gleiche PGC-1 Protein wie das codieren, welches durch die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Nukleotidsequenz codiert wird. In einer anderen Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz auf, welche ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz oder ein Protein codiert, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, welche zu mindestens 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90% und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 homolog ist.
Zusätzlich zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Maus PGC-1 Nukleotidsequenz wird es dem Fachmann klar sein, dass DNA Sequenzpolymorphismen, welche zu Änderungen in der Aminosäuresequenzen von PGC-1 führen, in einer Population (beispielsweise einer Säugerpopulation, beispielsweise einer menschlichen Population) vorliegen können. Derartige genetische Polymorphismen in dem PGC-1 Gen können unter Individuen in einer Population aufgrund einer natürlichen allelischen Variation vorliegen. Wie hierin verwendet betreffen die Ausdrücke "Gen" und "rekombinantes Gen" Nukleinsäuremoleküle, welche ein offenes Leseraster umfassen, welcher ein PGC-1 Protein, vorzugsweise ein Säuger, beispielsweise ein menschliches PGC-1 Protein, codiert. Derartige natürliche allelische Variationen können für gewöhnlich in einer 1-5% Varianz in der Nukleotidsequenz des PGC-1 Gens führen. Irgendwelche und alle derartigen Nukleotidvariationen und resultierenden Aminosäure Polymorphismen in PGC-1, welche das Ergebnis einer natürlichen allelischen Variation sind und welche die funktionelle Aktivität von PGC-1 nicht ändern, sind beabsichtigt in dem Bereich der Erfindung zu liegen. Darüber hinaus sind Nukleinsäuremoleküle, welche PGC-1 Proteine von anderen Spezies codieren, und welche daher eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche von der Maussequenz von SEQ ID Nr. 1 unterscheiden, beabsichtigt in dem Bereich der Erfindung zu liegen. Nukleinsäuremoleküle, welche natürlichen allelischen Varianten entsprechen, und menschliche Homologe der Maus PGC-1 cDNA der Erfindung können basierend auf ihrer Homologie zu der hierin offenbarten Maus PGC-1 Nukleinsäure unter Verwendung der Maus cDNA oder eines Abschnitts davon isoliert werden, wie beispielsweise einer Hybridisierungssonde gemäß herkömmlichen Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (siehe Beispiel II).
Demgemäß umfasst in einer anderen Ausführungsform ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung zumindest 15 Nukleotide in Länge und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder einer Nukleotidsequenz umfasst, welche um 60%, vorzugsweise zumindest um 70%, bevorzugter zumindest um 80%, immer noch bevorzugter zumindest um 90% und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr zu der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 homolog ist. In anderen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäure zumindest 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotide in Länge. Wie hierin verwendet, beabsichtigt der Ausdruck "Hybridisierung unter stringenten Bedingungen" Bedingungen für Hybridisierung und Waschen zu beschreiben unter welchen Nukleotidsequenzen von zumindest 60% Homologie zueinander für gewöhnlich aneinander hybridisiert verbleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen derart, dass Sequenzen von zumindest um 65%, bevorzugter zumindest um 70% und sogar noch bevorzugter von zumindest um 75% oder mehr Homologie zueinander für gewöhnlich aneinander hybridisiert verbleiben. Derartige stringente Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 gefunden werden. Ein bevorzugtes nicht begrenzendes Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen sind eine Hybridisierung in 6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt durch einen oder mehrere Waschschritte in 0,2 X SSC, 0,1% SDS bei 50-65°C. Vorzugsweise entspricht ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches unter stringenten Bedingungen an die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, einem natürlich auftretenden Nukleinsäuremolekül. Wie hierin verwendet betrifft ein "natürlich auftretendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA oder DNA Molekül mit einer Nukleotidsequenz, welches in der Natur auftritt (beispielsweise ein natürliches Protein codiert). In einer Ausführungsform codiert die Nukleinsäure ein natürliches menschliches PGC-1.
Zusätzlich zu natürlich auftretenden allelischen Varianten der PGC-1 Sequenz, welche in der Population vorliegen kann, wird dem Fachmann weiterhin klar sein, dass durch Mutationen Änderungen in die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 eingefügt werden können, was zu Änderungen in der Aminosäuresequenz des codierten PGC-1 Proteins führt, ohne die funktionelle Befähigung des PGC-1 Proteins zu ändern. Beispielsweise können Nukleotidsubstitutionen, welche zu Aminosäuresubstitutionen bei "nicht wesentlichen" Aminosäureresten führen, in der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 vorgenommen werden. Ein "nicht wesentlicher" Aminosäurerest ist ein Rest, welcher von der Wildtypsequenz von PGC-1 (beispielsweise der Sequenz von SEQ ID Nr. 2) ohne Ändern der Aktivität von PGC-1 geändert werden kann, wohingegen ein "wesentlicher" Aminosäurerest für PGC-1 Aktivität benötigt wird. Aminosäurereste, welche in die Wechselwirkung von PGC-1 zu PPARγ einbezogen sind, sind beispielsweise überaus wahrscheinlich wesentliche Reste von PGC-1. Andere Aminosäurereste allerdings (beispielsweise jene, welche nicht konserviert sind oder nur halb konserviert zwischen Maus und Mensch sind) dürften nicht für Aktivität wesentlich sein und sind daher wahrscheinlich einer Änderung ohne Ändern der PGC-1 Aktivität zugänglich.
Demgemäß betrifft eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform Nukleinsäuremoleküle, welche PGC-1 Proteine codieren, welche Änderungen in Aminosäureresten umfassen, welche für eine PGC-1 Aktivität nicht wesentlich sind. Derartige PGC-1 Proteine unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, behalten dennoch zumindest eine von diesen PGC-1 Aktivitäten bei, welche hierin beschrieben sind. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, welche ein Protein codiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz von zumindest um 60% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst und eine Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen und/oder Thermogenese von braunen Fettzellen modulieren kann. Vorzugsweise weist das durch das Nukleinsäuremolekül codierte Protein zumindest um 70% Homologie, vorzugsweise zumindest um 80-85% Homologie, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90% und am meisten bevorzugt zumindest um 95% Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 auf.
"Sequenzidentität oder Homologie", wie hierin verwendet, betrifft die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidmolekülen oder zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen. Falls eine Stelle in beiden der zwei verglichenen Sequenzen durch die gleiche Base oder gleiche Aminosäuremonomer-Untereinheit besetzt wird, beispielsweise falls eine Positionen in jeder von zwei DNA-Molekülen durch ein Adenin besetzt ist, sind die Moleküle an dieser Stelle homolog oder sequenzidentisch. Der Prozentsatz an Homologie oder Sequenzidentität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von passenden oder homologen identischen Stellen, welche von beiden Sequenzen geteilt werden, geteilt durch die Anzahl von Stellen verglichen bzw. gegenüber X 100. Falls beispielsweise 6 von 10 der Positionen in zwei Sequenzen die gleichen sind, sind die beiden Sequenzen zu 60% homolog oder weisen 60% Sequenzidentität auf. Als Beispiel teilen die DNA Sequenzen ATTGCC und TATGGC 50% Homologie oder Sequenzidentität. Im Allgemeinen wird ein Vergleich vorgenommen, falls zwei Sequenzen ausgerichtet werden, um eine maximale Homologie zu erzielen. Falls nicht anders spezifiziert sind "Schleifen aus Bereiche" ("loop out regions"), beispielsweise jene, welche von Deletionen oder Insertionen in eine der Sequenzen entstehen und als Fehler gezählt werden.
Der Vergleich von Sequenzen und eine Bestimmung einer prozentualen Homologie zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Vorzugsweise kann die Ausrichtung unter Verwendung des Clustal Verfahrens durchgeführt werden. Die Vielzahl an Ausrichtungsparametern umfassen eine Lückenstrafe = 10, eine Lückenlängenstrafe = 10. Für DNA Ausrichtungen können die paarweise Ausrichtungsparameter Htuple = 2, Lückenstrafe = 5, Fenster = 4 und gerettete Diagonale = 4 sein. Für Proteinausrichtungen können die paarweise Ausrichtungsparameter Ktuple = 1, Lückenstrafe = 3, Fenster = 5 und gerettete Diagonalen = 5 sein.
Ein zusätzliches nicht begrenzendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, welcher für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 87 (1990) 2264-68, modifiziert wie in Karlin und Altschul; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1993) 90837-77. Ein derartiger Algorithmus wird in die NBLAST und XBLAST Programme (Version 2.0) von Altschul et al. eingefügt, J. Mol. Biol.; 215 (1990) 403-10. BLAST Nukleotidsuchen können mit dem NBLAST Programm durchgeführt werden, Punktzahl = 100, Wortlänge = 12, um Nukleotidsequenzen homolog zu Nukleinsäuremolekülen der Erfindung zu erhalten. BLAST Proteinsuchen können mit dem XBLAST Programm durchgeführt werden, Punktzahl = 50, Wortlänge = 3, um Aminosäuresequenzen homolog zu Proteinmolekülen der Erfindung zu erhalten. Um Ausrichtungen mit Lücken für Vergleichszwecke zu erhalten, kann ein Lücken BLAST wie in Altschul et al.; Nuleic Acids Research; 25(17) (1997) 3389-3402 verwendet werden. Falls BLAST und Lücken BLAST Programme verwendet werden, können die Standardparameter der jeweiligen Programme (beispielsweise XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Ein anderes bevorzugtes nicht begrenzendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, welcher für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller, CABIOS, 1989. Ein derartiger Algorithmus wird in das ALIGN Programm (Version 2.0) eingefügt, welches ein Teil des GCG Sequenz Ausrichtungssoftwarepakets ist. Falls das ALIGN Programm zum Vergleich von Aminosäurensequenzen verwendet wird, kann eine PAM120 Restwertungstabelle, eine Lückenlängenstrafe von 12 und eine Lückenstrafe von 4 verwendet werden.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein PGC-1 Protein homolog zu dem Protein von SEQ ID Nr. 2 codiert, kann durch Einfügen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, Additionen oder Deletionen in die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder einer homologen Nukleotidsequenz derart erzeugt werden, dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Additionen und Deletionen in das codierte Protein eingefügt werden. Mutationen können in SEQ ID Nr. 1 oder die homologe Nukleotidsequenz durch Standardtechniken, wie beispielsweise Stellen-gerichtete-Mutagenese und PCR-mediierte Mutagenese, eingefügt werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren vorhergesagten nicht wesentlichen Aminosäureresten vorgenommen. Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, in welcher der Aminosäurerest mit einem Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten wurden im Stand der Technik festgelegt. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (beispielsweise Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (beispielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure), nicht geladene polare Seitenketten (beispielsweise Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht polare Seitenketten (beispielsweise Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), betaverzweigte Seitenketten (beispielsweise Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatische Seitenketten (beispielsweise Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Daher wird ein vorhergesagter nicht wesentlicher Aminosäurerest im PGC-1 vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest von der gleichen Seitenkettenfamilie ersetzt. Alternativ können in einer anderen Ausführungsform Mutationen zufällig in der gesamten oder einen Teil einer PGC-1 codierenden Sequenz eingefügt werden, wie beispielsweise durch Sättigungsmutagenese, und die erhaltenen Mutanten können auf eine hierin beschriebene PGC-1 Aktivität durchmustert werden, um Mutanten zu identifizieren, welche eine PGC-1 Aktivität beibehalten. Folgend einer Mutagenese von SEQ ID Nr. 1 kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden (beispielsweise wie in Beispiel IV beschrieben) und die Aktivität des Proteins kann unter Verwendung, beispielsweise eines hierin beschriebenen Assays, bestimmt werden.
Zusätzlich zu den Nukleinsäuremolekülen, welche die vorstehend beschriebenen PGC-1 Proteine codieren, betrifft eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche antisense hierzu vorliegen. Eine "antisense" Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer "sense" Nukleinsäure komplementär ist, welche ein Protein, beispielsweise komplementär zu dem codierenden Strang einer doppelsträngigen cDNA Moleküls oder komplementär zu einer mRNA Sequenz, codiert. Demgemäß kann eine Antisensenukleinsäure über Wasserstoffbrücken an eine Sensenukleinsäure gebunden sein. Die Antisensenukleinsäure kann zu einem gesamten PGC-1 codierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon komplementär sein. In einer Ausführungsform ist ein Antisensenukleinsäuremolekül antisene zu einem "codierenden Bereich" des codierenden Stranges einer PGC-1 codierenden Nukleotidsequenz. Der Ausdruck "codierender Bereich" betrifft den Bereich der Nukleotidsequenz, welcher Codons umfasst, welche in Aminosäurereste übersetzt werden (beispielsweise der gesamte codierende Bereich von SEQ ID Nr. 1 umfasst Nukleotide 92-2482). In einer anderen Ausführungsform ist das Antisensenukleinsäuremolekül zu einem "nicht codierenden Bereich" des codierenden Stranges einer Nukleotidsequenz, welche PGC-1 codiert, antisense. Der Ausdruck "nicht codierender Bereich" betrifft 5' und 3' Sequenzen, welche den codierenden Bereich flankieren, und welche nicht in Aminosäuren übersetzt werden (d. h. ebenso bezogen als 5' und 3' nicht übersetzte Bereiche).
Gegeben die codierenden Strangsequenzen, welche hierin offenbartes PGC-1 codieren (beispielsweise SEQ ID Nr. 1), können Antisensenukleinsäuren der Erfindung gemäß den Regeln von Watson und Crick Basenpaarung erzeugt werden. Das Antisensenukleinsäuremolekül kann komplementär zu dem gesamten codierenden Bereich von PGC-1 mRNA sein, ist allerdings vorzugsweise ein Oligonukleotid, welches antisense zu nur einem Abschnitt bzw. Bereich des codierenden oder nicht codierenden Bereichs von PGC-1 mRNA ist. Beispielsweise kann das Antisensenukleotid komplementär zu dem Bereich sein, welche die Translation Startstelle von PGC-1 mRNA umgibt. Ein Antisenseoligonukleotid kann beispielsweise um 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, oder 50 Nukleotide in Länge umfassen. Eine erfindungsgemäße Antisensenukleinsäure kann unter Verwendung chemischer Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann eine Antisensenukleinsäure (beispielsweise ein Antisenseoligonukleotid) unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide oder einer Vielzahl modifizierter Nukleotide chemisch synthetisiert werden, die vorgesehen sind die biologische Stabilität der Moleküle zu erhöhen oder die physische Stabilität des Duplex zu erhöhen, der zwischen den Antisense- und Sensenukleinsäuren gebildet ist, beispielsweise können Phosphorthioatderivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche verwendet werden können, um die Antisensenukleinsäure zu erzeugen, umfassen 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5-Iodouracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl) Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-Thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-Isopentenyladenin, Uracil-5-Oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-Oxyessigsäure Methylester, Uracil-5-Oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-Thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-Carboxypropyl) Uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Alternativ kann die Antisensenukleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchem eine Nukleinsäure in eine Antisenseorientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, welche von der eingefügten Nukleinsäure transkribiert wird, wird in einer Antisenseorientierung zu einer Ziel-Nukleinsäure von Interesse vorliegen, was in dem folgenden Abschnitt weiter beschrieben wird).
Die Antisensenukleinsäuremoleküle der Erfindung werden für gewöhnlich einem Subjekt verabreicht oder in situ derart erzeugt, dass sie eine zellulare mRNA und/oder genomische DNA hybridisieren oder binden, welche ein PGC-1 Protein codiert, um dadurch eine Expression des Proteins zu inhibieren, beispielsweise durch Inhibierung einer Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann von herkömmlicher Nukleotidkomplementarität sein, um ein stabiles Duplex zu bilden, oder beispielsweise im Fall eines Antisensenukleinsäuremoleküls, welches an DNA Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der Hauptrille bzw. major groove der Doppelhelix. Ein Beispiel für einen Verabreichungsweg eines erfindungsgemäßen Antisensenukleinsäuremoleküls umfasst direkte Injektion an eine Gewebestelle. Alternativ kann ein Antisensenukleinsäuremolekül modifiziert werden, um ausgewählte Zellen zu zielen, und anschließend systemisch verabreicht werden. Ein Antisensemolekül kann beispielsweise für eine systemische Verabreichung derart modifiziert werden, dass es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein Antigen bindet, welche auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert sind, beispielsweise durch Vernetzen des Antisensenukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, welcher an einen Zelloberflächenrezeptor oder Antigen bindet. Das Antisensenukleinsäuremolekül kann ebenso an Zellen unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren geliefert werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen der Antisensemoleküle zu erhalten, werden Vectorkonstrukte bevorzugt, in welchen das Antisensenukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken Pol II oder Pol III Promotors platziert wird.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Antisensenukleinsäuremolekül ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welcher, im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Grundeinheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al.; Nucleic Acids. Res.; 15 (1987) 6625-6641). Das Antisensenukleinsäuremolekül kann ebenso ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al.; Nucleic Acids Res.; 15 (1987) 6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA Analog umfassen (Inoue et al.; FEBS Lett.; 215 (1987) 327-330).
In noch einer anderen Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Antisensenukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonucleaseaktivität, welche eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie beispielsweise eine mRNA, schneiden können, zu welcher sie einen komplementären Bereich aufweisen. Daher können Ribozyme (beispielsweise Hammerkopfribozyme (beschrieben in Haselhoff and Gerlach; Nature; 334 (1988) 585-591) verwendet werden, um PGC-1 mRNA Transkripte katalytisch zu schneiden, um dadurch eine Translation von PGC-1 mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym mit Spezifizität für eine PGC-1 codierende Nukleinsäure kann basierend auf der Nukleotidsequenz einer PGC-1 cDNA, wie hierin offenbart, vorgesehen werden (beispielsweise SEQ ID Nr. 1). Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS RNA hergestellt werden, in welcher die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, welche in einer PGC-1 codierenden mRNA geschnitten werden soll. Siehe beispielsweise Cech et al. US-P-4987,071 und Cech et al. US-P-5,116,742. Alternativ kann PGC-1 mRNA verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität von einem Pool von RNA Molekülen auszuwählen. Siehe beispielsweise Bartel, D. and Szostak, J.W.; Science; 261 (1993) 1411-1418.
Alternativ kann eine PGC-1 Genexpression durch Zielen von Nukleotidsequenzen komplementär zu dem Regulatorbereich des PGC-1 (beispielsweise dem PGC-1 Promoter und/oder Verstärkern) inhibiert werden, um Dreifachhelixstrukturen zu bilden, welche eine Transkription des PGC-1 Gens in Zielzellen verhindern. Siehe im Allgemeinen Helene, C.; Anticancer Drug Des.; 6(6) (1991) 569-84; Helene, C. et al.; Ann. N.Y. Acad. Sci.; 660 (1992) 27-36; and Maher, L.J.; Bioassays; 14(12) (1992) 807-15.
II.Recombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, welche eine PGC-1 (oder einen Abschnitt davon) codierende Nukleinsäure umfassen. Wie hierin verwendet betrifft der Ausdruck "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann mit welcher es verknüpft wurde. Eine Art von Vektor ist ein "Plasmid", welches eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife betrifft, in welche zusätzliche DNA Segmente ligiert werden können. Eine andere Art von Vektor ist ein viraler Vektor, worin zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können autonom in einer Wirtszelle replizieren, in welche sie eingefügt werden (beispielsweise bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (beispielsweise nicht episomale Säugervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle bei Einfügen in die Wirtszelle integriert, und werden dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus können bestimmte Vektoren die Expression von Genen richten mit welchen sie operativ verbunden sind. Solche Vektoren werden hierin als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen für rekombinante DNA-Techniken nützliche Expressionsvektoren häufig in der Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" wechselseitig verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Art von Vektor darstellt. Die Erfindung beabsichtigt allerdings derartige andere Arten von Expressionsvektoren zu umfassen, wie beispielsweise virale Vektoren (beispielsweise Retroviren mit fehlerhafter Replikation, Adenoviren und Adeno-zusammenhängende Viren), welche äquivalenten Funktionen dienen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer geeigneten Form zur Expressionen der Nukleinsäure in einer Wirtszelle, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen umfassen, welche basierend auf den Wirtszellen, welche für eine Expression verwendet werden, ausgewählt werden, welche wirksam mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verbunden ist. In einem rekombinanten Expressionsvektor ist "wirksam verbunden" beabsichtigt zu bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse an die regulatorische Sequenz(en) in einer Art verbunden ist, welche eine Expression der Nukleotidsequenz ermöglicht (beispielsweise in ein in vitro Transkriptions-/Translations-System oder in eine Wirtszelle, falls der Vektor in die Wirtszelle eingefügt wird). Der Ausdruck "Regulatorsequenz" ist beabsichtigt Promotoren, Verstärker und anderer Expressionssteuerelemente (beispielsweise Polyadenylierungssignale) zu umfassen. Derartige Regulatorsequenzen werden beispielsweise in Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben. Regulatorsequenzen umfassen jene, welche eine konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in viele Arten von Wirtszellen richten und jene, welche eine Expression der Nukleotidsequenz ausschließlich in bestimmte Wirtszellen richten (beispielsweise gewebespezifische Regulatorsequenzen). Es wird dem Fachmann klar sein, dass die Ausführung des Expressionsvektors von derartigen Faktoren, wie der Wahl der Wirtszelle, die transformiert werden soll, dem Niveau einer gewünschten Proteinexpression, usw. abhängig sein kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die Wirtszellen eingefügt werden, um dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich von Fusions proteinen oder Peptiden, zu erzeugen, welche durch hierin beschriebene Nukleinsäuren codiert werden (beispielsweise PGC-1 Proteine, Mutantformen von PGC-1, Fusionsproteine, usw.).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können für eine Expression von PGC-1 in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen vorgesehen sein. Beispielsweise kann PGC-1 in Bakterienzellen, wie beispielsweise E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirusexpressionssystemen), Hefezellen oder Säugerzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiterhin in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) erörtert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor transkribiert und in vitro translatiert werden, beispielsweise unter Verwendung von T7 Promoter Regulatorsequenzen und T7 Polymerase.
Eine Expression von Proteinen in Prokaryoten wird zumeist in E. coli mit Vektoren durchgeführt, welche konstitutiv oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression von entweder Fusions- oder nicht-Fusionsproteinen richten. Fusionsvektoren addieren eine Anzahl von Aminosäuren zu einem darin codierten Protein, für gewöhnlich bei dem Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Derartige Fusionsvektoren dienen gewöhnlich drei Zwecken: 1) Eine Expression rekombinanten Proteins zu erhöhen; 2) Die Löslichkeit des rekombinanten Proteins zu erhöhen; und 3) Bei der Aufreinigung des rekombinanten Proteins durch Wirken als ein Ligand bei einer Affinitätsreinigung zu unterstützen. In Fusionsexpressionsvektoren ist häufig eine proteolytische Schnittstelle bei der Verbindungsstelle des Fusionsrestes und des rekombinanten Proteins eingefügt, um eine Trennung des rekombinanten Proteins von dem Fusionsrest nachfolgend einer Aufreinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Derartige Enzyme und ihre verwandten Erkennungsstellen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Gewöhnliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S.;Gene; 67 (1988) 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), welche jeweils an Glutathion S-Transferase (GST), Maltose E Bindeprotein oder Protein A fusionieren, um das rekombinante Protein zu zielen. In einer Ausführungsform ist die codierende Sequenz des PGC-1 in einen pGEX Expressionsvektor kloniert, um einen Vektor zu erzeugen, welcher ein Fusionsprotein codiert, umfassend von dem N-Terminus bis zu dem C-Terminus GST-Thrombinschnittstelle-PGC-1. Das Fusionsprotein kann mittels Affinitätschromatography unter Verwendung eines Glutathion-Agaroseharzes gereinigt werden. Recombinantes PGC-1, welches nicht an GST fusioniert hat, kann durch Schneiden des Fusionsproteins mit Thrombin wieder erhalten werden.
Beispiele von geeigneten induzierbaren nicht Fusions E. coli Expressionsvektoren umfassen pTrc (Amann et al., Gene; 69 (1988) 301-315) und pET 11 d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Gerichtete Genexpression von dem pTrc Vektor beruht auf einer Wirts RNA Polymerasetranskription von einem Hybrid trp-lac Fusionspromoter. Einrichten einer Genexpression von dem pET 11 d Vektor beruht auf einer Transkription von einem T7 gn10-lac Fusionspromoter, welcher durch eine coexprimierte virale RNA Polymerase (T7 gn1) mediiert wird. Diese virale Polymerase wird durch Wirtsstämme BL21 (DE3) oder HMS174(DE3) von einem residenten λ Prophagen bereitgestellt, welcher ein T7 gn1 Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des lacUV 5 Promoters enthält.
Eine Strategie, um eine rekombinante Proteinexpression in E. coli zu maximieren, beruht auf einer Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium mit einer eingeschränkten Befähigung, das rekombinante Protein proteolytisch zu spalten (Gottesman, S. Gene Expresion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, Sand Diego, California (1990) 119-128). Eine andere Strategie beruht darin, die Nukleinsäuresequenz der in einem Expressionsvektor einzufügenden Nukleinsäure derart zu verändern, dass die jeweiligen Codons für jede Aminosäure jene sind, welche vorzugsweise in E. coli verwendet werden (Wada et al.; Nucleic Acids Res.; 20 (1992) 2111-2118). Eine derartige Änderung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kann mittels herkömmlichen DNA Synthesetechniken durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der PGC-1 Expressionsvektor ein Hefeexpressionsvektor. Beispiele von Vektoren für eine Expression in der Hefe S. cerivisae umfassen pYepSec1 (Baldari, et al., Embo J.; 6 (1987) 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, Cell; 30 (1982) 933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene; 54 (1987) 113-123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, Sand Diego, CA).
Alternativ dazu kann PGC-1 in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirusvektoren, welche für eine Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (beispielsweise in Sf 9 Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc Serie (Smith et al.; Mol. Cell Biol.; 3 (1983) 2156-2165) und die pVL Serie (Lucklow and Summers; Virology; 170 (1989) 31-39).
In noch einer weiteren Ausführungsform wird eine Nukleinsäure der Erfindung in Säuerzellen unter Verwendung eines Säugerexpressionsvektors exprimiert. Beispiele für Säugerexpressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al.; EMBO J.; 6 (1987) 187-195). Falls in Säugerzellen verwendet, werden die Steuerungsfunktionen des Expressionsvektors dann häufig durch virale Regulatorelemente bereitgestellt. Beispielsweise sind häufig verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simianvirus 40 abgeleitet. Für andere geeignete Expressionssysteme für sowohl prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, I. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
In einer anderen Ausführungsform kann der rekombinante Säugerexpressionsvektor eine Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in eine bestimmte Zellart richten (beispielsweise werden gewebespezifische Regulatorelemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebespezifische Regulatorelemente sind im Stand der Technik bekannt. Nicht limitierende Bespiele von geeigneten gewebespezifischen Promotoren umfassen den Albuminpromoter (leberspezifisch; Pinkert et al.; Genes Dev. J.; (1987) 268-277), lymphoidspezifische Promotoren (Calame and Eaton; Adv. Immunol.; 43 (1988) 235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellen Rezeptoren (Winoto and Baltimore; EMBO J.; 8 (1989) 729-733) und Immunglobuline (Banerji et al.; Cell; 33 (1983) 729-740; Queen and Baltimore; Cell; 33 (1983) 741-748), neuronspezifische Promotoren (beispielsweise den Neurofilamentpromotor, Byrne and Ruddle; PNAS; 86 (1989) 5473-5477), pancreasspezifische Promotoren (Edlund et al.; Science; 230 (1985) 912-916), und für die Milchdrüse spezifische Promotoren (beispielsweise Milch-Molkenpromotor; US-P-4,873,316 und EP-A-264,166). Entwicklungsgemäß regulierte Promotoren sind ebenfalls umfasst, beispielsweise die Hoxpromotoren der Maus (Kessel and Gruss; Science; 249 (1990) 374-379) und den α-Fetoproteinpromotor (Campes and Tilghman; Genes Dev.; 3 (1989) 537-546).
Die Erfindung stellt ferner einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, welcher ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül umfasst, welches in den Expressionsvektor in einer Antisenseorientierung kloniert ist. D. h., dass das DNA-Molekül mit einer Regulatorsequenz in einer Art wirksam verbunden ist, welche eine Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA Moleküls ermöglicht, welches antisense zu PGC-1 mRNA vorliegt. Regulatorsequenzen, welche wirksam mit einer in der Antisenseorientierung klonierten Nukleinsäure verbunden sind, können ausgewählt werden, welche die fortdauernde Expression des antisense RNA Moleküls in einer Vielzahl von Zellarten, beispielsweise virale Promotoren und/oder Verstärker, richten, oder Regulatorsequenzen können ausgewählt werden, welche eine konstitutive, gewebespezifische oder zellartspezifische Expression von antisense RNA richten. Der Antisenseexpressionsvektor kann in der Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus vorliegen, in welchem Antisensenukleinsäuren unter der Steuerung eines Regulatorbereichs hoher Effizienz erzeugt werden, wobei deren Aktivität durch die Zellart, in welche der Vektor eingefügt ist, bestimmt werden kann. Für eine Erörterung der Regulation von Genexpression unter Verwendung von Antisensegenen siehe Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft Wirtszellen, in welche ein rekombinanter Expressionsvektor der Erfindung eingefügt wurde. Die Ausdrücke "Wirts zelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden wechselweise hierin verwendet. Es ist klar, dass derartige Ausdrücke nicht nur auf die bestimmte Subjektzelle beziehen, sondern die Progenität bzw. Nachkommen oder mögliche Progenität einer derartigen Zelle. Da bestimmte Modifikationen in nachfolgenden Generationen aufgrund entweder Mutation oder Umwelteinflüssen auftreten können, kann eine derartige Progeniät in der Tat nicht zu der Elternzelle identisch sein, liegen aber immer noch im Bereich des wie hierin verwendeten Ausdrucks.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Beispielsweise kann PGC-1 Protein in Bakterienzellen, wie beispielsweise E. coli, Insektenzellen, Hefe- oder Säugerzellen (wie beispielsweise Ovariumzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Vektoren DNA kann mittels herkömmlicher Transformation oder Transfektionstechniken in prokaryotische oder eukaryotische Zellen eingefügt werden. Wie hierin verwendet sind die Ausdrücke "Transformation" und "Transfektion" beabsichtigt, eine Vielzahl von im Stand der Technik anerkannten Techniken zum Einfügen einer fremden Nukleinsäure (beispielsweise DNA) in eine Wirtszelle zu betreffen, umfassend eine Calciumphosphat oder Calciumchloridkopräzipitation, DEAE-Dextran-mediierte-Transfektion, Lipofection oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfektion von Wirtszellen können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern gefunden werden.
Für eine stabile Transfektion von Säugerzellen ist es bekannt, dass in Abhängigkeit von dem verwendeten Expressionsvektor und Transfektionstechnik, nur eine kleine Fraktion von Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren können. Um diese Integranten zu Identifizieren und auszuwählen, wird ein Gen, welches einen selektierbaren Marker (beispielsweise Resistenz auf Antibiotika) codiert, im Allgemeinen in die Wirtszellen zusammen mit dem Gen von Interesse eingefügt. Bevorzugte auswählbare Marker umfassen jene, welche eine Resistenz für Arzneimittel, wie beispielsweise G418, Hygromycin und Methotrexat, bereitstellen. Eine einen selektierbaren Marker codierende Nukleinsäure kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingefügt werden wie jener, welcher PGC-1 codiert, oder kann auf einem anderen Vektor eingefügt werden. Zellen, welche mit der eingefügten Nukleinsäure stabil transfektiert sind, können mittels Arzneimittelselektion identifiziert werden (beispielsweise werden Zellen überleben, welche das auswählbare Markergen aufgenommen haben, wohingegen andere Zellen sterben werden).
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie beispielsweise eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann verwendet werden, um ein PGC-1 Protein herzustellen (d. h. zu exprimieren). Demgemäß stellt die Erfindung weiterhin Verfahren zum Herstellen von PGC-1 Protein unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ein Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung (in welcher ein rekombinanter Expressionsvektor eingefügt wurde, welcher PGC-1 codiert) in einem geeigneten Medium bis PGC-1 hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin ein Isolieren von PGC-1 von dem Medium oder der Wirtszelle.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen können ebenso verwendet werden, um nicht menschliche transgene Tiere herzustellen. Die nicht menschlichen transgenen Tiere können in Durchmusterungsassays verwendet werden, welche für eine Identifikation von Agenzien oder Verbindungen, beispielsweise Arzneimittel, Pharmazeutika usw., gestaltet sind, welche schädliche Symptome von ausgewählten Erkrankungen verbessern können, wie beispielsweise Gewichtserkrankungen oder Erkrankungen, welche mit einer unzureichenden Insulinaktivität zusammenhängen. In einer Ausführungsform ist beispielsweise eine Wirtszelle der Erfindung eine fertilisierte Oocyte oder eine embryonale Stammzelle, in welche PGC-1 codierende Sequenzen eingefügt wurden. Derartige Wirtszellen können anschließend verwendet werden, um nicht menschliche transgene Tiere zu erzeugen, in welche exogene PGC-1 Sequenzen in ihr Genom eingefügt wurden, oder homolog rekombinante Tiere, in welchen endogene PGC-1 Sequenzen geändert wurden. Derartige Tiere sind für ein Untersuchen der Funktion und/oder Aktivität von PGC-1 von Nutzen und für ein Identifizieren und/oder Bewerten von Modulatoren von PGC-1 Aktivität. Wie hierin verwendet ist ein "transgenes Tier" ein nicht menschliches Tier, vorzugsweise ein Säuger, mehr bevorzugt ein Nager, wie beispielsweise eine Ratte oder Maus, in welchen eines oder mehrere der Zellen des Tieres ein Transgen umfassen. Andere Beispiele für transgene Tiere umfassen nicht menschliche Primaten, Schafe, Hunde, Rinder, Ziegen, Hühner, Amphibien, usw. Ein Transgen ist eine exogene DNA, welche in das Genom einer Zelle integriert ist, aus welcher sich ein transgenes Tier entwickelt, und welche in dem Genom des gereiften Tieres verbleibt, wodurch die Expression eines codierten Genprodukts in eine oder mehrere Zellarten oder Gewebe des transgenen Tieres gerichtet wird. Wie hierin verwendet ist ein "homologes rekombinantes Tier" ein nicht menschliches Tier, vorzugsweise ein Säuger, mehr bevorzugt eine Maus, in welche ein endogenes PGC-1 Gen durch homologe Rekombination zwischen dem endogenen Gen und einem exogenen DNA-Molekül geändert wurde, welches in eine Zelle des Tieres vor Entwicklung des Tieres eingefügt wurde, beispielsweise in eine embryonale Zelle des Tieres.
Ein erfindungsgemäßes transgenes Tier kann durch Einfügen von PGC-1 codierender Nukleinsäure in die männlichen Pronuclei eines fertilisierten Oocyten erzeugt werden, beispielsweise durch Mikroinjektion, retrovirale Infektion und es der Oocyte zu ermöglichen, sich in ein pseudoschwangeres weibliches Zuchttier (foster animal) zu entwickeln. Die menschliche PGC-1 cDNA Sequenz kann als ein Transgen in das Genom eines nicht menschlichen Tieres eingefügt werden. Alternativ kann ein nicht menschliches Homolog des menschlichen PGC-1 Gens, wie beispielsweise ein Maus PGC-1 Gen (SEQ ID Nr. 1), als ein Transgen verwendet werden. Intronische Sequenzen und Polyadenylierungssignale können ebenso in das Transgen eingefügt werden, um die Wirksamkeit einer Expression des Transgens zu erhöhen. Eine gewebespezifische Regulatorsequenz(en) kann mit dem PGC-1 Transgen wirksam verbunden sein, um eine Expression von PGC-1 Protein auf bestimmte Zellen zu richten. Verfahren zum Erzeugen von transgenen Tieren mittels embroyonaler Manipulation und Mikroinjektion, insbesondere von Tieren wie beispielsweise Mäusen, sind im Stand der Technik herkömmlich geworden und werden beispielsweise in US-P 4,736,866 und 4,870,009 beschrieben, beide von Leder et al., US-P 4,873,191 von Wagner et al. und in Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Ähnliche Verfahren werden für die Erzeugung von anderen transgenen Tieren verwendet. Ein transgenes Gründertier kann basieren auf der Anwesenheit PGC-1 Transgens in seinem Genom und/oder Expression von PGC-1 mRNA in Geweben oder Zellen der Tiere identifiziert werden. Ein transgenes Gründertier kann anschließend verwendet werden, um zusätzliche das Transgen tragende Tiere zu züchten. Darüber hinaus können transgene Tiere, welche ein PGC-1 codierendes Transgen tragen, weiterhin für eine Züchtung anderer transgener Tiere gezüchtet werden, welche andere Transgene tragen.
Um ein homologes rekombinantes Tier zu erzeugen, wurde ein Vektor hergestellt, welcher zumindest einen Abschnitt eines PGC-1 Gens enthält, in welches eine Deletion, Addition oder Substitution eingefügt wurde, um dadurch das PGC-1 Gen zu ändern, beispielsweise funktionell zu unterbrechen. Das PGC-1 Gen kann ein menschliches Gen sein (beispielsweise von einem menschlichen genomischen Klon, welcher von einer menschlichen genomischen Bibliothek isoliert wurde, welche mit der cDNA von SEQ ID Nr. 1 durchmustert wurde), ist aber mehr bevorzugt ein nicht menschliches Homolog eines menschlichen PGC-1 Gens. Beispielsweise kann ein Maus PGC-1 verwendet werden, um einen homologen Rekombinationsvektor zu erzeugen, der für ein Ändern eines endogenen PGC-1 Gens in dem Mausgenom geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor derart vorgesehen, dass bei einer homologen Rekombination das endogene PGC-1 Gen funktionell unterbrochen wird (d. h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert; was ebenso als ein "Knockout" Vektor bezeichnet wird). Alternativ kann der Vektor derart ausgestaltet sein, dass bei einer homologen Rekombination das endogene PGC-1 Gen mutiert oder anderweitig geändert wird, aber immer noch ein funktionelles Protein codiert (beispielsweise der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich kann geändert werden, um dadurch die Expression des endogenen PGC-1 Proteins zu ändern). In dem homologen Rekombinationsvektor wird der geänderte Abschnitt des PGC-1 Gens bei seinen 5' und 3' Enden durch eine zusätzliche Nukleinsäure des PGC-1 Gens flankiert, um ein Auftreten einer homologen Rekombination zwischen dem exogenen PGC-1 Gen, welches durch den Vektor getragen wird, und einem endogenen PGC-1 Gen in einer embryonalen Stammzelle zu ermöglichen. Die zusätzliche PGC-1 flankierende Nukleinsäure weist eine ausreichende Länge für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen auf. Für gewöhnlich werden mehrere Kilobasen flankierender DNA (sowohl an den 5' als auch 3' Enden) in dem Vektor eingefügt (siehe beispielsweise Thomas, K. R. und Capecchi, M. R.; Cell; 51 (1987) 503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie (beispielsweise durch Elektroporation) eingefügt und Zellen werden ausgewählt (siehe beispielsweise Li, E. et al.; Cell; 69 (1992) 915), in welchen das eingefügte PGC-1 Gen mit dem endogenen PGC-1 Gen homolog rekombiniert hat. Die ausgewählten Zellen werden anschließend in eine Blastocyste eines Tieres (beispielsweise einer Maus) injiziert, um Aggregationschimäre zu bilden (siehe beispielsweise Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) 113-152). Ein chimärer Embryo kann anschließend in ein geeignetes pseudoschwangeres weibliches Zuchttier implantiert werden und der Embryo zur Reife gebracht werden. Progenität, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Samenzellen enthält, kann verwendet werden, um Tiere zu züchten, in welchen alle Zellen des Tieres die homolog rekombinierte DNA durch Samenlinien Übertragung des Transgens umfassen. Verfahren zur Erzeugung von homologen Rekombinationsvektoren und homologen rekombinanten Tieren werden weiterhin in Bradley, A.; Current Opinion in Biotechnology; 2 (1991) 823-829 und in PCT internationalen Veröffentlichung mit den Nummern WO 90/11354 von Le Mouellece et al.; WO 91/01140 von Smithies et al.; WO 92/0968 von Zijlstra et al; und WO 93/04169 von Berns et al. beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform können Transgene nicht menschliche Tiere erzeugt werden, welche ausgewählte Systeme umfassen, die eine regulierte Expression des Transgens ermöglichen. Ein Beispiel für ein derartiges System ist das cre/loxP Recombinasesystem des bacteriophagen P1. Für eine Beschreibung des cre/loxP Recombinasesystems, siehe beispielsweise Lakso et al.; PNAS; 89 (1992) 6232-6236. Ein anderes Beispiel eines Recombinasesystems ist das FLP Recombinasesystem von Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al.; Science; 251 (1991) 1351-1355). Falls ein cre/loxP Recombinasesystem verwendet wird, um eine Expression des Transgens zu regulieren, werden Tiere benötigt, welche Transgene enthalten, die sowohl die Cre Rekombinase als auch ein ausgewähltes Protein codieren. Derartige Tiere können durch die Erzeugung von "doppelten" Transgenen Tieren bereitgestellt werden, beispielsweise durch Paaren bzw. Zusammenbringen zweier transgener Tiere, wobei eines ein Transgen enthält, welches ein ausgewähltes Protein codiert, und das andere ein Transgen enthält, welches eine Recombinase codiert.
Klone der hierin beschriebenen nicht menschlichen transgenen Tiere, können ebenso gemäß im Verfahren hergestellt werden, welche in Wilmut, I. et al.; Nature; 385 (1997) 810-5 813 und PCT internationalen Anmeldungen mit den Nummern WO 97/07668 und WO 97/07669 beschrieben werden. In Kürze kann eine Zelle, beispielsweise eine somatische Zelle, von dem transgenen Tier isoliert und induziert werden, um aus dem Wachstumszyklus auszutreten und in die G₀ Phase einzutreten. Die ruhende Zelle kann anschließend, beispielsweise durch Verwendung von elektrischen Pulsen, an eine enucleierte Oocyte eines Tieres der gleichen Spezies fusioniert werden von welcher die ruhende Zelle isoliert wurde. Die wiederhergestellte Oocyte wird anschließend derart kultiviert, dass sie sich zur Murola oder Blastocyste entwickelt und wird anschließend zu einem pseudoschwangeren weiblichen Zuchttier transferiert. Die Progenie von diesem weiblichen Zuchttier wird ein Klon des Tieres sein, von welchem die Zelle, beispielsweise die somatische Zelle, isoliert wird.
III. Isolierte PGC-1 Proteine und Anti-PGC-1 Antikörper
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft isolierte PGC-1 Proteine und biologisch aktive Abschnitte davon, ebenso wie Peptidfragmente, welche für eine Verwendung als Immunogene geeignet sind, um Anti-PGC-1 Antikörper zu erzeugen. Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Protein oder biologisch aktiver Abschnitt davon ist im Wesentlichen frei von zellularem Material, falls mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt, oder chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, falls chemisch synthetisiert. Der Ausdruck "im Wesentlichen frei von zellularem Material" umfasst Präparationen von PGC-1 Protein, in welchem das Protein von zellularen Bestandteilen der Zellen abgetrennt wird, in welchen es natürlich oder rekombinant hergestellt wird. In einer Ausführungsform umfasst der Ausdruck "im Wesentlichen frei von zellularem Material" Präparationen von PGC-1 Protein mit weniger als um 30% (als Trockengewicht) von Nicht-PGC-1 Protein (was ebenso als ein "verunreinigtes Protein" hierin bezeichnet wird), vorzugsweise weniger als um 20% von Nicht-PGC-1 Protein, immer noch mehr bevorzugt weniger als um 10% von Nicht-PGC-1 Protein und am meisten bevorzugt weniger als um 5% Nicht-PGC-1 Protein. Falls das PGC-1 Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon rekombinant hergestellt wird, ist es ebenso vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h. Kulturmedium stellt weniger als um 20%, mehr bevorzugt weniger als um 10% und am meisten bevorzugt weniger als um 5% des Volumens der Proteinpräparation dar. Der Ausdruck "im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" umfasst Präparationen von PGC-1 Protein, in welchen das Protein von anderen chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien getrennt wird, welche in die Synthese des Proteins einbezogen sind. In einer Ausführungsform umfasst der Ausdruck "im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" Präparationen für PGC-1 Proteine mit weniger als um 30% (als Trockengewicht) von chemischen Vorläufern oder Nicht-PGC-1-Chemikalien, mehr bevorzugt weniger als um 20% chemische Vorläufer oder Nicht-PGC-1-Chemikalien, immer noch mehr bevorzugt weniger als um 10% chemischer Vorläufer oder Nicht-PGC-1-Chemikalien und am meisten bevorzugt weniger als um 5% chemische Vorläufer oder Nicht-PGC-1-Chemikalien. In bevorzugten Ausführungsformen weisen isolierte Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon verunreinigende Proteine von dem gleichen Tier, von welchem das PGC-1 Protein abgeleitet wurde, nicht auf. Für gewöhnlich werden derartige Proteine durch rekombinante Expressionen von z.B. einem menschlichen PGC-1 Protein in einer nicht menschlichen Zelle hergestellt.
Ein isoliertes PGC-1 Protein oder ein Abschnitt davon der Erfindung weist eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten auf: 1) Es kann UCP Expression modulieren; 2) Es kann eine Thermogenese in Fettzellen modulieren, beispielsweise eine Thermogenese in braunen Fettzellen oder Muskel; 3) Es kann Adipogenese modulieren, beispielsweise eine Differenzierung von weißen Fettzellen in braune Fettzellen; 4) Es kann eine Insulinsensitivität von Zellen modulieren, beispielsweise eine Insulinsensitivität von Muskelzellen, Leberzellen, Fettzellen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das PGC-1 Protein eine Differenzierung von weißen Fettzellen zu braunen Fettzellen und/oder Thermogenese brauner Fettzellen oder Muskelzellen modulieren.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Protein oder der Abschnitt davon eine Aminosäuresequenz, welche ausreichend zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 derart homolog ist, dass das Protein oder der Abschnitt davon die Befähigung beibehält, eine Differenzierung von Fettzellen und/oder Thermogenese in braunen Fettzellen zu modulieren. Der Abschnitt des Proteins ist vorzugsweise ein biologisch aktiver Abschnitt wie hierin beschrieben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das PGC-1 Protein (d. h. die Aminosäurereste 1-797) eine wie in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz auf, welche zumindest zu 60% mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90% und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr Homologie zu der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz auf. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das PGC-1 Protein eine Aminosäuresequenz auf, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche beispielsweise unter stringenten Bedingungen an die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert. Die bevorzugten PGC-1 Proteine der vorliegenden Erfindung weisen vorzugsweise ebenso zumindest eine der hierin beschriebenen PGC-1 biologischen Aktivitäten auf. Beispielsweise umfasst ein bevorzugtes erfindungsgemäße PGC-1 Protein eine Aminosäuresequenz, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert wird, welche an die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, beispielsweise unter stringenten Bedingungen hybridisiert, und welche eine Differenzierung von weißen Fettzellen zu braunen Fettzellen und/oder Thermogenese von braunen Fettzellen modulieren kann.
In anderen Ausführungsformen ist das PGC-1 Protein im Wesentlichen homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 und behält die funktionelle Aktivität des Proteins von SEQ ID Nr. 2 bei, unterscheidet sich allerdings in der Aminosäuresequenz aufgrund einer natürlichen allelischen Variation oder Mutagenese, wie detailliert in Abschnitt I vorstehend beschrieben wurde. Demgemäß ist in einer anderen Ausführungsform das PGC-1 Protein ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, welche zu zumindest 60%, mehr bevorzugt zumindest um 70%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 80%, immer noch mehr bevorzugt zumindest um 90% und am meisten bevorzugt zumindest um 95% oder mehr Homologie mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Biologisch aktive Abschnitte des PGC-1 Proteins umfassen Peptide, welche Aminosäuresequenzen umfassen, welche von der Aminosäuresequenz des PGC-1 Proteins, beispielsweise der Aminosäuresequenz, welche in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, oder der Aminosäuresequenz eines Proteins, welches mit dem PGC-1 Protein homolog ist, welches weniger Aminosäuren als das Volllängen PGC-1 Protein umfasst oder das Volllängenprotein, welches homolog zu dem PGC-1 Protein ist und zumindest eine Aktivität des PGC-1 Proteins aufweist. Für gewöhnlich umfassen biologisch aktive Abschnitte (Peptide, beispielsweise Peptide, welche beispielsweise 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren in Länge aufweist) eine Domäne oder ein Motiv, beispielsweise eine Tyrosinphosphorylierungsstelle, eine cAMP Phosphorylierungsstelle, eine Serin-Arginin (SR) reiche Domäne und/oder ein RNA Bindemotiv, mit zumindest einer Aktivität des PGC-1 Proteins. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der biologisch aktive Abschnitt des Proteins, welches eine oder mehrere der hierin beschriebenen Domänen/Motive umfasst, eine Differenzierung von Fettzellen und/oder Thermogenese in braune Fettzellen modulieren. Darüber hinaus können andere biologische aktive Abschnitte, in welche andere Bereiche des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt werden und auf eine oder mehrere der hierin beschriebenen Aktivitäten bewertet werden. Die biologisch aktiven Abschnitte des PGC-1 Proteins umfassen vorzugsweise ein oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Abschnitte davon mit biologischer Aktivität.
PGC-1 Proteine werden vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Beispielsweise wird ein Nukleinsäuremolekül, welches das Protein codiert, in einen Expressionsvektor (wie vorstehend beschrieben) kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle (wie vorstehend beschrieben) eingefügt und das PGC-1 Protein wird in der Wirtszelle exprimiert. Das PGC-1 Protein kann anschließend von den Zellen durch ein geeignetes Aufreinigungsschema unter Verwendung von herkömmlichen Proteinreinigungstechniken isoliert werden. Alternativ zu einer rekombinanten Expression kann ein PGC-1 Protein, Polypeptid oder Peptid unter Verwendung von herkömmlichen Peptidsynthesetechniken synthetisiert werden. Darüber hinaus kann natives PGC-1 Protein von den Zellen isoliert werden (beispielsweise braune Fettzellen), beispielsweise durch Verwendung eines Anti-PGC-1-Antikörpers (weiterhin nachstehend beschrieben).
Die Erfindung stellt ebenso PGC-1 Chimäre- oder Fusionsproteine bereit. Wie hierin verwendet umfasst ein PGC-1 "chimäres Protein" oder "Fusionsprotein" ein PGC-1 Polypeptid, welches wirksam an ein Nicht-PGC-1-Polypeptid verbunden ist. Ein "PGC-1 Polypeptid" betrifft ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche PGC-1 entspricht, wobei ein "Nicht-PGC-1-Polypeptid" ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz betrifft, welche einem Protein entspricht, welches nicht im Wesentlichen homolog zu dem PGC-1 Protein ist, beispielsweise ein Protein, welches von dem PGC-1 Protein verschieden ist und welches von dem gleichen oder einem verschiedenen Organismus abgeleitet ist. Innerhalb des Fusionsproteins ist der Ausdruck "wirksam verbunden" beabsichtigt anzuzeigen, dass das PGC-1 Polypeptid and das Nicht-PGC-1-Polypeptid in-frame bzw. im Rahmen aneinander fusioniert sind. Das Nicht-PGC-1-Polypeptid kann an den N-Terminus oder C-Terminus des PGC-1 Polypeptids fusioniert sein. In einer Ausführungsform ist das Fusionsprotein beispielsweise ein GST-PGC-1 Fusionsprotein, in welchem die PGC-1 Sequenzen an dem C-Terminus der GST Sequenzen fusioniert sind (siehe Beispiel IV). Derartige Fusionsproteine können die Aufreinigung von rekombinanten PGC-1 erleichtern. In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein PGC-1 Protein, welches eine heterologe Signalsequenz an seinem N-Terminus enthält. Die bestimmten Wirtszellen (beispielsweise Säugerwirtszellen) kann eine Expression und/oder Sekretion von PGC-1 durch Verwendung einer heterologen Signalsequenz erhöht werden.
Ein PGC-1 chimäres oder Fusionsprotein der Erfindung wird vorzugsweise durch herkömmliche rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Beispielsweise werden DNA-Fragmente, welche für die verschiedenen Polypeptidsequenzen codieren, in-frame gemäß herkömmlicher Techniken, beispielsweise durch Verwenden von Termini mit glatten Enden oder gestaffelten Enden für eine Ligation, Restriktionsenzym Verdauung, um geeignete Termini bereitzustellen, Auffüllen von cohäsiven Enden wie geeignet, eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um ein unerwünschtes Verbinden zu vermeiden und enzymatische Ligation, zusammenlegiert. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen mittels herkömmlicher Techniken einschließlich automatisierter DNA-Synthesizer synthetisiert werden. Alternativ kann eine PCR Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern durchgeführt werden, welche komplementäre Überhänge zwischen zwei aufeinander folgenden Genfragmenten erzeugen, welche anschließend angelagert und wieder amplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe besipielsweise Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Darüber hinaus sind viele Expressionsvektoren im Handel erhältlich, welche bereits einen Fusionsrest codieren (beispielsweise ein GST Polypeptid). Eine PGC-1 codierende Nukleinsäure kann in einen derartigen Expressionsvektor kloniert werden, so dass der Fusionsrest im Rahmen mit dem PGC-1 Protein verbunden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Homologe der PGC-1 Proteine, welche entweder als ein PGC-1 Agonist (mimetisch) oder als ein PGC-1 Antagonist fungieren. In einer bevorzugten Ausführungsform stimulieren oder inhibieren die PGC-1 Agonisten und Antagonisten jeweils eine Untereinheit der biologischen Aktivitäten der natürlich auftretenden Form des PGC-1 Proteins. Daher können spezifische biologische Effekte durch eine Behandlung mit einem Homologen einer begrenzten Funktion hervorgerufen werden. In einer Ausführungsform weist eine Behandlung eines Subjektes mit einem Homologen mit einer Teilmenge bzw. Untereinheit der biologischen Aktivitäten der natürlich auftretenden Form des Proteins weniger Nebenwirkungen in einem Subjekt relativ zu einer Behandlung mit der natürlich auftretenden Form des PGC-1 Proteins auf.
Homologe des PGC-1 Proteins können mittels Mutagenese erzeugt werden, beispielsweise durch gezielte Punktmutation oder Trunkation des PGC-1 Proteins. Wie hierin verwendet betrifft der Ausdruck "Homolog" eine verschiedene Form des PGC-1 Proteins, welche als ein Agonist oder Antagonist der Aktivität des PGC-1 Proteins wirkt. Ein Agonist des PGC-1 Proteins kann im Wesentlichen die gleiche beibehalten, oder eine Untereinheit, der biologischen Aktivitäten des PGC-1 Proteins. Ein Antagonist des PGC-1 Proteins kann eine oder mehrere der Aktivitäten der natürlich auftretenden Form des PGC-1 Proteins durch beispielsweise kompetitives Binden an ein stromabwärts oder stromaufwärts gelegenes Element der PGC-1 Kaskade inhibieren, welche das PGC-1 Protein umfasst. Daher können das Säuger PGC-1 Protein und Homologe davon der vorliegenden Erfindung beispielsweise entweder positive oder negative Regulatoren einer Fettzellendifferenzierung und/oder Thermogenese in braunen Fettzellen sein.
In einer alternativen Ausführungsform können Homologe des PGC-1 Proteins durch ein Durchmustern kombinatorischer Bibliotheken von Mutanten identifiziert werden, beispielsweise Trunkationsmutanten des PGC-1 Proteins für eine PGC-1 Proteinagonisten oder Antagonistenaktivität. In einer Ausführungsform wird eine variierte Bibliothek von PGC-1 Varianten mittels kombinatorischer Mutagenese auf dem Nukleinsäureniveau erzeugt und wird mittels einer variierten Genbibliothek codiert. Eine variierte Bibliothek von PGC-1 Varianten kann beispielsweise mittels enzymatischem Ligieren einer Mischung synthetischer Oligonukleotide in Gensequenzen hergestellt werden, so dass ein degenerierter Satz von möglichen PGC-1 Sequenzen als individuelle Polypeptide exprimierbar ist, oder alternativ als ein Satz von größeren Fusionsproteinen (beispielsweise für Phagendisplay), welche den Satz von PGC-1 Sequenzen darin enthalten. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, welche verwendet werden können, um Bibliotheken möglicher PGC-1 Homologe von einer degenerierten Oligonukleotidsequenz zu erzeugen. Chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem automatischen DNA-Synthesizer durchgeführt werden und das synthetische Gen anschließend in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Eine Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen ermöglicht die Bereitstellung, in einer Mischung, all der Sequenzen, welche den gewünschten Satz von möglichen PGC-1 Sequenzen codieren. Verfahren zum Synthetisieren degenerierter Oligonukleotide sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Narang, S.A.; Tetrahedron; 39 (1983) 3; Itakura et al.; Annu. Rev. Biochem.; 53 (1984) 323; Itakura et al.; Science; 198 (1984) 1056; Ike et al.; Nucleic Acid Res.; 11 (1983) 477).
Darüber hinaus können Bibliotheken von Fragmenten, welche das PGC-1 Proteins codieren, verwendet werden, um eine variierte Population von PGC-1 Fragmenten für ein Durchmustern und eine anschließende Auswahl von Homologen eines PGC-1 Proteins zu erzeugen. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek codierender Sequenzfragmente durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragments einer PGC-1 codierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen erzeugt werden, wobei ein Nicking bzw. Einkerbung nur einmal pro Molekül auftritt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA, um eine doppelsträngige DNA zu bilden, welche Sense-/Antisense-Paare von verschieden genickten Produkten umfasst, entfernen einzelsträngiger Abschnitte von wieder gebildeten Duplexen mittels Behandlung mit S1 Nuklease und Ligieren der erhaltenen Fragmentbibliothek in einem Expressionsvektor. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbibliothek abgeleitet werden, welche N-terminale, C-terminale und interne Fragmente verschiedener Größen des PGC-1 Proteins codiert.
Verschiedene Techniken sind im Stand der Technik zum Durchmustern von Genprodukten kombinatorischer Bibliotheken bekannt, welche mittels Punktmutationen oder Trunkation hergestellt wurden, und für ein Durchmustern von cDNA Bibliotheken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft. Derartige Techniken können für ein schnelles Durchmustern der Genbibliotheken angepasst werden, welche durch die kombinatorische Mutagenese von PGC-1 Homologen erzeugt werden. Die am meisten verwendeten Techniken, welche für eine Hochdurchsatzanalyse geeignet sind, um große Genbibliotheken zu durchmustern, umfassen für gewöhnlich Klonieren der Genbibliothek in replizierbaren Expressionsvektoren, Transformieren geeigneter Zellen mit der erhaltenen Bibliothek von Vektoren und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, in welcher ein Nachweis der gewünschten Aktivität eine Isolierung des Vektors erleichtert, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde. Recrusive Ensemble Mutagenese (REM), eine neue Technik, welche die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Verbindung mit den Durchmusterungsassays verwendet werden, um PGC-1 Homologe zu Identifizieren (Arkin and Yourvan; PNAS; 89 (1992) 7811-7815; Delgrave et al.; Protein Engineering; 6(3) (1993) 327-331).
Ein isoliertes PGC-1 Protein oder ein Abschnitt oder Fragment davon können als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, welche PGC-1 binden, unter Verwendung herkömmlicher Techniken für eine Präparation polyklonaler und monoklonaler Antikörper. Das Volllängen PGC-1 Protein kann verwendet oder alternativ stellt die Erfindung antigene Peptidfragmente von PGC-1 für eine Verwendung als Immunogene bereit. Das antigene Peptid von PGC-1 umfasst zumindest 8 Aminosäurereste der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz oder eine homologe Aminosäuresequenz wie hierin beschrieben und umfasst ein Epitop von PGC-1, so dass ein gegen das Peptid gerichteter Antikörper einen spezifischen Immunkomplex mit PGC-1 bildet. Vorzugsweise umfasst das antigene Peptid mindestens 10 Aminosäurereste, mehr bevorzugt mindestens 15 Aminosäurereste, immer noch mehr bevorzugt mindestens 20 Aminosäurereste und am meisten bevorzugt mindestens 30 Aminosäurereste. Bevorzugte Epitope, welche durch das antigene Peptid umfasst werden, sind Bereiche von PGC-1, welche sich auf der Oberfläche des Proteins befinden, beispielsweise hydrophile Bereiche.
Ein PGC-1 Immunogen wird für gewöhnlich verwendet, um Antikörper durch Immunisierung eines geeigneten Subjekts (beispielsweise Hase, Ziege, Maus oder einem anderen Säuger) mit dem Immunogen herzustellen. Eine geeignete immunogene Präparation kann beispielsweise rekombinant exprimiertes PGC-1 Protein oder ein chemisch synthetisiertes PGC-1 Peptid enthalten. Die Präparation kann weiterhin ein Adjuvans enthalten, wie beispielsweise Freund's vollständiges oder unvollständiges Adjuvans oder ein ähnliches immunostimulierendes Agens. Eine Immunisierung eines geeigneten Subjekts mit einer immunogenen PGC-1 Präparation induziert eine polyklonale Anti-PGC-1-Antikörperreaktion.
Demgemäß betrifft eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform Anti-PGC-1-Antikörper. Der Ausdruck "Antikörper" wie hierin verwendet betrifft Immunoglobulinmoleküle und immunologisch aktive Abschnitte von Immunoglobulinmolekülen, d. h. Moleküle, welche eine antigene Bindestelle enthalten, welche spezifisch an ein Antigen, wie beispielsweise PGC-1, bindet (damit eine Immunreaktion eingeht). Beispiele von immunologisch aktiven Abschnitten von Immunoglobulinmolekülen umfassen F(ab) und F(ab')₂ Fragmente, welche durch Behandeln des Antikörpers mit einem Enzym wie beispielsweise Pepsin erzeugt werden können. Die Erfindung stellt polyklonale und monoklonale Antikörper bereit, welche PGC-1 binden. Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" oder "monoklonale Antikörperzusammensetzung" wie hierin verwendet betrifft eine Population von Antikörpermolekülen, welche nur eine Spezies einer antigenen Bindestelle enthalten, welche mit einem bestimmten Epitop von PGC-1 eine Immunreaktion eingehen kann. Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung zeigt daher gewöhnlicher weise eine einzelne Bindeaffinität für ein bestimmtes PGC-1 Protein mit welchem es eine Immunreaktion eingeht.
Polyklonale Anti-PGC-1-Antikörper können, wie vorstehend beschrieben, durch Immunisieren eines geeigneten Subjektes mit einem PGC-1-Immunogen hergestellt werden. Der Anti-PGC-1-Antikörpertiter in dem immunisierten Objekt kann über die Zeit durch herkömmliche Techniken, wie beispielsweise mit einem Enzym verknüpften Immunosorbenzassay (ELISA) unter Verwendung von immobilisierten PGC-1, beobachtet werden. Falls erwünscht, können die Antikörpermoleküle, welche gegen PGC-1 gerichtet sind, von dem Säuger (beispielsweise von dem Blut) isoliert werden und weiterhin durch gut bekannte Techniken gereinigt werden, wie beispielsweise Protein A Chromatographie, um die IgG Fraktion zu erhalten. Zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Immunisierung, beispielsweise wenn die Anti-PGC-1-Antikörpertiter am höchsten sind, können Antikörper erzeugende Zellen von dem Subjekt erhalten und verwendet werden, um monoklonale Antikörper mittels herkömmlichen Techniken herzustellen, wie beispielsweise die Hybridomatechnik, welche ursprünglich von Kohler and Milstein; Nature; 256 (1975) 495-497) (siehe ebenso, Brown et al.; J. Immunol.; 127 (1981) 539-46; Brown et al.; J. Biol. Chem.; 255 (1980) 4980-83; Yeh et al.; PNAS 76 (1976) 2927-31; und Yeh et al.; Int. J. Cancer; 29 (1982) 269-75), die aktuellere menschlichere B Zellen Hybridomatechnik (Kozbor et al.; Immunol. Today; 4 (1983) 72), die EBV-Hybridomatechnik (Cole et al. (1985), Monoklonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77-96) oder Triomatechniken. Die Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörperhybridoma ist gut bekannt (siehe im Allgemeinen R. H. Kenneth, in Monoklonal Antibodies. A New Dimension In Biological Analyses, Plenum PublishingCorp., New York, New York (1980); E. A. Lerner; Yale I Biol. Med., 54 (1981) 387-402; M. L. Gefter et al.; Somatic Cell Genet.; 3 (1977) 23 1-36)). In Kürze wird eine unsterbliche Zelllinie (für gewöhnlich ein Myelom) an Lymphozyten (für gewöhnlich Splenocyten) von einem Säuger fusioniert, welcher mit einem PGC-1 Immunogen wie vorstehend beschrieben immunisiert wurde, und die Kulturüberstände der erhaltenen Hybridomazellen werden durchmustert, um eine einen monoklonalen Antiköper produzierende Hybridoma zu identifizieren, welcher PGC-1 bindet.
Irgendeines der vielen gut bekannten Protokolle, welche für ein Fusionieren von Lymphozyten und immortalisierten Zelllinien verwendet werden, können für den Zweck eines Erzeugens einer Anti-PGC-1-monoklonalen Antikörpers angewendet werden (siehe besipielsweise G. Galfre et al.; Nature; 266 (1977) 55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., vorstehend aufgeführt; Lerner, Yale J. Biol. Med., vorstehend aufgeführt; Kenneth, Monoklonal Antibodies, vorstehend aufgeführt). Darüber hinaus wird es dem Fachmann klar sein, dass es viele Abänderungen derartiger Verfahren gibt, welche ebenso von Nutzen sein würden. Für gewöhnlich ist die unsterbliche Zelllinie (beispielsweise eine Myelomzelllinie) von den gleichen Säugerspezies wie die Lymphozyten abgeleitet. Beispielsweise können Hybridoma der Maus durch Fusionieren von Lymphozyten von einer Maus hergestellt werden, welche mit einer immunogenen Präparation der vorliegenden Erfindung mit einer immortalisierten Mauszelllinie immunisiert wird. Bevorzugte unsterbliche Zelllinien sind Mausmyelomzelllinien, welche sensitiv auf Kulturmedien sind, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT Medium") umfasst. Irgendeine einer Anzahl von Myelomzelllinien kann als ein Fusionspartner gemäß herkömmlichen Techniken verwendet werden, beispielsweise die P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14 Myelomlinien. Diese Myelomlinien sind von ATCC erhältlich. Für gewöhnlich sind HAT-sensitive Mausmyelomzellen an Maussplenocyten unter Verwendung von Polyethylenglycol ("PEG") fusioniert. Von der Fusion erhaltene Hybridomzellen werden anschließend unter Verwendung von HAT Medium ausgewählt, welches nicht fusionierte und unproduktiv fusionierte Myelomzellen abtötet (nicht fusionierte Splenocyten sterben nach mehreren Tagen, da sie nicht transformiert sind). Einen erfindungsgemäßen Antikörper herstellende Hybridomzellen werden durch Durchmustern der Hybridomakulturüberstände auf Antikörper nachgewiesen, welche PGC-1 binden, beispielsweise unter Verwendung eines herkömmlichen ELISA-Assays.
Alternativ zu einem Herstellen monoklonaler Antikörper-sekretierender Hybridoma kann ein monoklonaler Anti-PGC-1-Antikörper durch Durchmustern einer rekombinanten kombinatorischen Immunoglobulinbibliothek identifiziert und isoliert werden (beispielsweise eine Antiköperphagendisplaybibliothek) mit PGC-1, um dadurch Immunoglobulinbibliothekselemente zu isolieren, welche PGC-1 binden. Kits zum Erzeugen und Durchmustern von Phagendisplaybibliotheken sind im Handel verfügbar (beispielsweise das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog Nr. 27-9400-01; und der SurfZAP^TM Phage Display Kit von Stratagene, Katalog Nr. 240612). Darüber hinaus können Beispiele von Verfahren und Reagenzien, die insbesondere für eine Verwendung beim Erzeugen und Durchmustern von Antikörperdisplaybibliotheken geeignet sind, gefunden werden in beispielsweise Ladner et al. US-P. 5,223,409; Kang et al. PCT internationale Veröffentlichung WO 92/18619; Dower et al. PCT internationale Veröffentlichung WO 91/17271; Winter et al. PCT internationale Veröffentlichung WO 92/20791; Markland et al. PCZ internationale Veröffentlichung WO 92/15679; Breitling et al. PCT internationale Veröffentlichung WO 93/01288; McCafferty et al. PCT internationale Veröffentlichung WO 92/01047; Garrard et al. PCT internationale Veröffentlichung WO 92/09690; Ladner et al. PCT internationale Veröffentlichung WO 90/02809; Fuchs et al.; Bio/Technology; 9 (1991) 1370-1372; Hay et al.; Hum. Antibod. Hybridomas; 3 (1992) 81-85; Huse et al.; Science; 246 (1989) 1275-1281; Griffiths et al.; EMBO J.; 12 (1993)725-734; Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226 (1992) 889-896; Clarkson et al., Nature, 352 (1991) 624-628; Gram et al., PNAS, 89 (1992) 3576-3580; Garrad et al., Bio/Technology, 9 (1991) 1373-1377; Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res., 19 (1991) 4133-4137; Barbas et al., PNAS, 88 (1991) 7978-7982; und McCafferty et al., Nature, (1990) 348:552-554.
Darüber hinaus liegen rekombinante Anti-PGC-1-Antikörper im Bereich der Erfindung, wie beispielsweise chimäre und humanisierten monoklonale Antikörper, welche sowohl menschliche als auch nicht menschliche Abschnitte umfassen, welche mittels herkömmlich rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden können. Derartige chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper können mittels im Stand der Technik bekannter rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren, welche in Robinson et al. internationale Anmeldung PCT/US86/02269; Akira, et al. EP-A-184,187; Taniguchi, M., EP-A-171,496; Morrison et al. EP-A-173,494; Neuberger et al. PCT international Veröffentlichung WO 86/01533; Cabilly et al. US-P-4,816,567; Cabilly et al. EP-A-125,023; Better et al., Science, 240 (1988) 1041-1043; Liu et al., PNAS, 84 (1987) 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; und Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter US-P-5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; und Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060 beschrieben sind.
Ein Anti-PGC-1-Antikörper (beispielsweise ein monoklonaler Antikörper) kann verwendet werden, um PGC-1 mittels herkömmlichen Techniken zu isolieren, wie beispielsweise Affinitätschromatographie oder Immunopräzipitation. Ein Anti-PGC-1-Antikörper kann die Reinigung natürlichen PGC-1 von Zellen und von rekombinant hergestellten PGC-1, welches in Wirtszellen exprimiert wird, erleichtern. Darüber hinaus kann ein Anti-PGC-1-Antikörper verwendet werden, um PGC-1 Protein nachzuweisen (beispielsweise in Zelllysat oder in Zellüberstand), um das Vorkommen und Muster einer Expression des PCT-1-Proteins zu bewerten. Anti-PGC-1-Antikörper können diagnostisch verwendet werden, um Proteinniveaus in Gewebe als ein Teil einer klinischen Testprozedur zu beobachten, beispielsweise um die Effizienz einer gegebenen Behandlungsregimen zu bestimmen. Ein Nachweis kann durch Verbinden (d. h. physisches Vernetzen des Antikörpers) mit einer nachweisbaren Substanz vereinfacht werden. Beispiele nachweisbarer Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszente Materialien, bioluminescente Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele geeigneter Enzyme umfassen Meerrettichperoxydase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, oder Acetylcholoinesterase; Beispiele geeigneter prosthetischer Gruppenkomplexe umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele von geeigneten fluoreszierenden Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluorescein Isothiocyanat, Rhodamin, Dichlorotriazinylamin Fluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein luminescierendes Material umfasst Luminol; Beispiele von bioluminescentem Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Aequorin und Beispiele für ein geeignetes radioaktives Material umfassen ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S oder ³H.
IV. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die PGC-1 Nukleinsäuremoleküle, PGC-1 Proteine, PGC-1 Modulatoren und Anti-PGC-1-Antikörper (welche hierin ebenso als "aktive Verbindungen" bezeichnet werden) der Erfindung können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingefügt werden, welche für eine Verabreichung an ein Subjekt, beispielsweise einen Menschen, geeignet sind. Derartige Zusammensetzungen umfassen für gewöhnlich das Nukleinsäuremolekül, Protein, Modulator oder Antikörper und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Wie hierin verwendet ist der Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger" beabsichtigt, irgendeines oder alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und Antipilz-Agenzien, isotonische und absorptionsverzögernde Agenzien und ähnliches zu umfassen, welche mit einer pharmazeutischen Verabreichung verträglich sind. Die Verwendung derartiger Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik gut bekannt. Mit Ausnahme insoweit, dass irgendein herkömmliches Medium oder Agens mit der aktiven Verbindung nicht verträglich ist, kann ein derartiges Medium in den Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden. Unterstützende aktive Verbindungen können ebenso in die Zusammensetzungen eingefügt werden.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird formuliert, um mit dem beabsichtigten Verabreichungsweg kompatibel zu sein. Beispiele für Verabreichungswege umfassen Parenteral, beispielsweise intravenös, intradermal, subkutan, oral (beispielsweise Inhalation), transdermal (topisch), transmukosal und rektale Verabreichung. Lösungen oder Suspensionen, welche für eine parenterale, intradermale oder subkutane Anwendung verwendet werden, können die folgenden Bestandteile umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Wasser für Injektion, Salzlösung, Fettöle, Polyethylenglycole, Glycerine, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Agenzien, wie beispielsweise Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie beispielsweise Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; chelatbildenede Agenzien, wie beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie beispielsweise Acetate, Zitrate oder Phosphate und Agenzien, um die Tonizität einzustellen, wie beispielsweise Natriumchlorid oder Dextrose. pH kann mit Säuren oder Basen eingestellt werden, wie beispielsweise Salzsäure oder Natriumhydroxid. Die parenterale Präparation kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Behältnissen für mehrere Dosierungen, welche aus Glas oder Kunststoff hergestellt sind, eingeschlossen sein.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für eine injizierbare Verwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen (falls wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Präparation steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. Für eine intravenöse Verabreichung umfassen geeignete Träger physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ) oder Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS). In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und sollte zu dem Ausmaß flüssig sein, dass sie leicht mit Spritzen handelbar ist. Sie muss unter den Herstellungsbedingungen und Lagerbedingungen stabil sein und muss gegenüber der verunreinigenden Wirkung von Mikroorganismen geschützt sein, wie beispielsweise Bakterien und Pilze. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, welches beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und ähnliches) und geeignete Mischungen davon umfasst. Die geeignete Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung beibehalten werden, wie beispielsweise Lecithin, durch Beibehaltung der benötigten Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen. Eine Verhinderung des Wirkens von Mikroorganismen kann mittels verschiedener antibakterieller und Antipilz-Agenzien erzielt werden, beispielsweise mit Parabenen, Chlorobutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und ähnliches. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein isotonische Agenzien, wie beispielsweise Zucker, Polyalkohole, wie beispielsweise Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid in die Zusammensetzung aufzunehmen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzung kann durch Einfügen eines Agens in die Zusammensetzung erreicht werden, welches eine Absorption verzögert, wie beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einfügen der aktiven Verbindung (beispielsweise eines PGC-1 Proteins oder eines Anti-PGC-1-Antikörpers) in der benötigten Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination der vorstehend aufgezählten Bestandteile, wie benötigt, gefolgt durch Filtersterilisation, hergestellt werden. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einfügen der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel hergestellt, welches ein grundlegendes bzw. basisches Dispersionsmedium ohne die benötigten anderen Bestandteile von den vorstehend aufgezählten enthält. Im Falle von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen, sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, welches ein Pulver des aktiven Bestandteils plus irgendeines zusätzlich erwünschten Bestandteils von einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergibt.
Orale Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen sein oder zu Tabletten komprimiert sein. Für den Zweck einer oralen therapeutischen Verabreichung, kann die aktive Verbindung mit Excipienten eingefügt sein und in der Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können ebenso unter Verwendung eines flüssigen Trägers zur Verwendung als ein Mundspülmittel hergestellt werden, wobei die Verbindung in dem flüssigen Träger oral angewendet wird und gespült (swished) und ausgespieen oder geschluckt werden. Pharmazeutisch verträgliche Bindeagentien und/oder Adjuvansmaterialien können als Teil der Zusammensetzung eingefügt werden. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und ähnliches können irgendeinen der folgenden Bestandteile umfassen oder Verbindungen in einer ähnlichen Beschaffenheit: Ein Bindemittel, wie beispielsweise mikrocrystalline Zellulose, Gummitragacanth oder Gelatine, einen Excipienten, wie beispielsweise Stärke oder Laktose, ein abbauendes Agens, wie beispielsweise Alginsäure, Primogel, oder Kornstärke; ein Schmiermittel, wie beispielsweise Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel, wie beispielsweise colloidales Siliziumdioxid; ein Süßungsagens, wie beispielsweise Sucrose oder Saccharin; oder ein Geschmacksagens, wie beispielsweise Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangengeschmacksstoff.
Für eine Verabreichung mittels Inhalation können die Verbindungen in der Form eines Aerosolsprays von einem unter Druck stehenden Behälter oder Verteiler geliefert werden, welcher ein geeignetes Antriebsmittel enthält, wie beispielsweise ein Gas, wie beispielsweise Kohlenstoffdioxid, oder einen Vernebler.
Eine systemische Verabreichung kann ebenso mittels transmucosaler oder transdermaler Mittel erfolgen. Für eine transmucosale oder transdermale Verabreichung werden Durchdringungsmittel in der Formulierung verwendet, welche zum Durchdringen der Barriere geeignet sind. Derartige Durchdringungsmittel sind allgemein im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise für eine transmucosale Verabreichung Detergentien, Gallensalze und Fusidinsäurederivate. Eine transmucosale Verabreichung kann durch die Verwendung von Nasensprays oder Suppositorien erreicht werden. Für eine transdermale Verabreichung werden die aktiven Verbindungen in Salben, Heilsalben, Gele oder Cremes, wie im allgemeinen Stand der Technik bekannt, formuliert.
Die Verbindungen können ebenso in der Form von Suppositorien hergestellt sein (beispielsweise mit herkömmlichen Basen für Suppositorien wie beispielsweise Kakaobutter und andere Glyceriden) oder Retentionseinläufe für eine rektale Verabreichung.
In einer Ausführungsform sind die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, welche die Verbindung gegenüber einer schnellen Ausscheidung von dem Körper schützen werden, wie beispielsweise eine gesteuerte Freisetzungsformulierung, einschließlich von Implantaten und mikroverkapselten Verabreichesystemen. Biozersetzbare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie beispielsweise ein Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung derartiger Formulierungen werden dem Fachmann offensichtlich sein. Die Materialien können ebenso im Handel von der Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. erhalten werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich von Liposomen, die gezielt sind, Zellen mit monoklonalen Antikörpern auf virale Antigene zu infizieren) können ebenso als pharmazeutisch verträgliche Träger verwendet werden. Diese können gemäß den Verfahren, welche im Stand der Technik, beispielsweise in US-P-4,522,811 beschrieben, bekannt sind, hergestellt werden.
Es ist insbesondere von Vorteil, orale oder parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsform für eine einfachere Verabreichung und Gleichmäßigkeit einer Dosierung zu formulieren. Eine Dosierungseinheitsform wie hierin verwendet betrifft physikalisch verschiedene Einheiten, welche als Einzeldosen für das behandelnde Subjekt geeignet sind, wobei jede Einheit eine bestimmte Menge der aktiven Verbindung enthält, welche berechnet wird, den erwünschten therapeutischen Effekt im Zusammenhang mit dem benötigten pharmazeutischen Träger zu erzielen. Die Ausführung für die Dosierungseinheitsformen der Erfindung werden von den einzigartigen Charakteristika der aktiven Verbindung und dem zu erzielenden besonderen therapeutischen Effekt vorgeschrieben und sind direkt davon abhängig, und den Beschränkungen, die inhärent im Stand der Technik einer Verbindungsherstellung vorliegen, wie beispielsweise einer aktiven Verbindung für die Behandlung von Individuen.
Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können in Vektoren eingefügt werden und können als Gentherapievektoren verwendet werden. Gentherapievektoren können an ein Subjekt mittels beispielsweise intravenöser Injektion, lokaler Verabreichung (siehe US-P-5,328,470) oder durch stereotaktische Injektion (siehe beispielsweise Chen et al., PNAS, 91 (1994) 3054-3057) verabreicht werden. Die pharmazeutische Herstellung des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem geeigneten Verdünnungsmittel umfassen oder kann eine Matrix zur langsamen Freisetzung umfassen, in welcher das Genliefervehikel eingebettet ist. Alternativ, in Fällen wo der vollständige Genliefervektor von rekombinanten Zellen intakt hergestellt werden kann, beispielsweise retrovirale Vektoren, kann die pharmazeutische Präparation eine oder mehrere Zellen umfassen, welche das Genliefersystem herstellen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung können in einen Container, Packung oder Verteiler zusammen mit Verabreichungsanleitungen eingefügt sein.
V. Verwendung und Verfahren der Erfindung
Die Nukleinsäuremoleküle, Polypeptide, Polypeptidhomologe, Modulatoren und Antikörper, welche hierin beschrieben sind, können in einem oder mehreren der folgenden Verfahren verwendet werden: 1) Arzneimitteldurchmusterungsassays; 2) In vitro diagnostische Assays; 3) Verwendung bei Verfahren zur Herstellung und bei einer Behandlung von bestimmten Zuständen. Ein PGC-1 Protein der Erfindung weist eine oder mehrere der hierin beschriebenen Aktivitäten auf und kann daher beispielsweise zur Modulierung einer Fettzellendifferenzierung, Thermogenese in braunen Fettzellen und Insulinsensitivität in verschiedenen Zellen verwendet werden, wie beispielsweise Muskelzellen, Leberzellen und Fettzellen. Die isolierten Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können verwendet werden, um PGC-1 Protein zu exprimieren (beispielsweise mittels eines rekombinanten Expressionsvektors in einer Wirtszelle in Gentherapieanwendungen), um PGC-1 mRNA nachzuweisen (beispielsweise in einer biologischen Probe) oder einer genetischen Läsion in einem PGC-1 Gen und um PGC-1 Aktivität zu modulieren, wie weiter nachstehend beschrieben wird. Darüber hinaus können die PGC-1 Proteine verwendet werden, um Arzneimittel oder Verbindungen zu durchmustern, welche eine PGC-1 Proteinaktivität modulieren, ebenso um Erkrankungen zu behandeln, welche durch eine unzureichende Erzeugung von PGC-1 Proteinen gekennzeichnet sind oder Erzeugung von PGC-1 Proteinformen, welcher eine erniedrigte Aktivität im Vergleich zur Wildtyp PGC-1 aufweisen. Darüber hinaus können die Anti-PGC-1-Antikörper der Erfindung verwendet werden, um PGC-1 Protein nachzuweisen und zu Isolieren und eine PGC-1 Proteinaktivität zu modulieren.
a) Arzneimittel Durchmusterungsassays:
Die Erfindung stellt Verfahren zur Identifikation von Verbindungen oder Agenzien bereit, welche verwendet werden können, um Erkrankungen zu behandeln, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Nukleinsäureexpression und/oder PGC-1 Polypeptid Aktivität gekennzeichnet sind (oder zusammenhängen). Diese Verfahren werden ebenso hierin als Arzneimittel Durchmusterungsassays bezeichnet und umfassen für gewöhnlich den Schritt von Durchmustern einer Kandidaten/Testverbindung oder eines Agens auf die Befähigung mit (beispielsweise daran Binden) einem PGC-1 Protein wechselzuwirken, die Wechselwirkung eines PGC-1 Proteins und eines Zielmolekül zu modellieren und/oder PGC-1 Nukleinsäureexpression und/oder PGC-1 Protein Aktivität zu modellieren. Kandidaten/Testverbindungen oder Agenzien, welche ein oder mehr diese Befähigung aufweisen, können als Arzneimittel verwendet werden, um Erkrankungen zu behandeln, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Nukleinsäureexpression und/oder PGC-1 Protein Aktivität gekennzeichnet sind. Die Kandidaten/Testverbindungen umfassen beispielsweise 1) Peptide, wie beispielsweise lösliche Peptide, einschließlich von Fusions-Peptiden mit Ig Ende und Elemente von Zufallspeptidbibliotheken (siehe beispielsweise Lam, K.S. et al., Nature, 354 (1991) 82-84, Houghten, R. et al., Nature, 354 (1991) 84-86) und von kombinatorischer Chemie abgeleitete molekulare Bibliotheken, welche aus Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfigurationen hergestellt sind; 2) Phosphopeptide (beispielsweise Elemente von zufälligen und teilweise degenerierten, gerichteten Phosphopeptid-Bibliotheken, siehe beispielsweise Songyang, Z. et al., Cell, 72 (1993) 767-778) 3) Antikörper (beispielsweise polyklonale, monoklonale, humanisierte, antiidiotypische, chimäre und einzelkettige Antikörper ebenso wie Fab, F(ab')₂, Fab Expressions-Bibliotheksfragmente und Epitop-Bindefragmente von Antikörpern); und 4) kleine organische und anorganische Moleküle (beispielsweise Moleküle, welche von kombinatorischen und natürlich vorkommenden Produktbibliotheken erhalten wurden).
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Assays zum Durchmustern von Kandidaten/Testverbindungen bereit, welche mit PGC-1 Protein wechselwirken (beispielsweise daran binden). Die Assays sind für gewöhnlich zellfreie Assays die die Schritte umfassen von Kombinieren eines PGC-1 Proteins oder eines biologisch aktiven Abschnitts davon und einer Kandidaten/Testverbindung, beispielsweise unter Bedingungen, welche eine Wechselwirkung (beispielsweise Binden von) der Kandidaten/Testverbindung mit dem PGC-1 Protein oder Abschnitts davon ermöglichen, um ein Komplex zu bilden, und Nachweisen der Bildung eines Komplexes, in welchem die Befähigung der Kandidatenverbindung mit dem PGC-1 Polypeptid oder Fragments davon wechselzuwirken (beispielsweise daran zu binden) durch die Anwesenheit der Kandidatenverbindung in dem Komplex angezeigt wird. Bildung von Komplexen zwischen dem PGC-1 Protein und der Kandidatenverbindung können beispielsweise durch Verwendung von herkömmlichen Immunoassays quantifiziert werden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Durchmusterungsassays für eine Identifikation von Kandidaten/Testverbindungen bereit, welche die Wechselwirkung (und sehr wahrscheinlich die PGC-1 Aktivität ebenso) zwischen einem PGC-1 Protein und einem Molekül (Zielmolekül), mit welchem das PGC-1 Protein für gewöhnlich wechselwirkt, moduliert (beispielsweise stimuliert oder inhibiert). Beispiele derartige Zielmoleküle umfassen Proteine in dem gleichen Signalweg wie das PGC-1 Protein, beispielsweise Proteine, welche stromaufwärts (einschließlich sowohl von Stimulatoren als auch Inhibitoren einer Aktivität) oder stromabwärts des PGC-1 Proteins in einem Weg fungieren, welcher eine Regulation des Körpergewichts, beispielsweise PPARγ, C/EBPα, Nukleare Hormonrezeptoren, wie beispielsweise den Thyriod Hormonrezeptor, den Östrogenrezeptor und den Retinolsäure-Rezeptor, einschließt oder einen Weg, welcher eine Insulinsensivität, beispielsweise PPARγ, einschließt. Die Assays sind für gewöhnlich zellfreie Assays, welche die Schritte umfassen von Kombinieren eines PGC-1-Proteins oder eines biologisch aktiven Abschnitts davon, eines PGC-1 Zielmoleküls und einer Kandidaten/Testverbindungen, beispielsweise unter Verbindung, worin außer der Anwesenheit der Kandidatenverbindung, das PGC-1 Protein oder der biologisch aktive Abschnitt davon mit dem Zielmolekül wechselwirkt (beispielsweise daran bindet), und Nachweisen der Bildung eines Komplexes, welcher das PGC-1 Protein und das Zielmolekül umfasst, oder Nachweisen der Wechselwirkung/Reaktion des PGC-1 Peroteins und des Zielmoleküls. Ein Nachweisen der Komplexbildung kann ein direktes Quantifizieren des Komplexes, durch beispielsweise Bestimmen induktiver Effekte des PGC-1 Proteins, umfassen. Eine statistisch signifikante Veränderung, wie beispielsweise eine Abnahme, bei der Wechselwirkung des PGC-1 und Zielmolekül (beispielsweise bei der Bildung eines Komplexes zwischen dem PGC-1 und dem Zielmolekül) in der Anwesenheit einer Kandidatenverbindung (relativ zu dem, was in der Abwesenheit der Kandidatenverbindung nachgewiesen wird) zeigt eine Modulierung (beispielsweise Stimulierung oder Inhibition) der Wechselwirkung zwischen dem PGC-1 Protein und dem Zielmolekül an. Eine Modulierung einer Bildung von Komplexen zwischen dem PGC-1 Proteins und dem Zielmolekül kann beispielsweise unter Verwendung eines Immunoassays quantifiziert werden.
Um die vorstehenden Arzneimittel Durchmusterungsassays durchzuführen ist es wünschenswert, entweder das PGC-1 oder sein Zielmolekül zu immobilisieren, um eine Trennung von Komplexen von nicht komplexierten Formen von einem oder beiden der Proteine zu erleichtern, ebenso wie eine Automatisierung des Assays zu ermöglichen. Eine Wechselwirkung (beispielsweise Binden von) eines PGC-1 an ein Zielmolekül, in der Anwesenheit und Abwesenheit einer Kandidatenverbindung kann in irgendeinem Behältnis durchgeführt werden, welches für ein Enthalten der Reaktanten geeignet ist. Beispiele derartiger Behältnisse umfassen Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen. In einer Ausführungsform kann ein Fusionspolypepetid bereitgestellt werden, welches eine Domäne hinzufügt, welches dem Polypeptid ein Binden an eine Matrix ermöglicht. Beispielsweise können Glutathion-S-Transferase/PGC-1 Fusions-Polypeptide auf Glutathion Sepharose Kügelchen (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder Gluthation derivatisierten Mikrotiterplatten adsorbiert werden, welche anschließend mit den Zelllysaten (beispielsweise ³⁵S-markiert) und der Kandidatenverbindung kombiniert werden, und die Mischung unter Bedingungen inkubiert wird, welche für eine Komplexbildung förderlich sind (beispielsweise unter physiologischen Bedingungen für Salz und pH). Anschließend einer Inkubation werden die Kügelchen gewaschen, um nicht gebundenen Marker zu entfernen, die Matrix wird immobilisiert und direkt mit Radiomarker bestimmt, oder in dem Überstand nachdem die Komplexe dissoziiert sind. Alternativ können die Komplexe von der Matrix dissoziiert werden, durch SDS-PAGE getrennt werden, und das Niveau von PGC-1 Binde-Polypeptid, welches in der Fraktion mit Kügelchen gefunden wird, wird unter Verwendung herkömmlicher elektrophoretischer Techniken von dem Gel quantifiziert.
Andere Techniken für ein Immobilisieren von Polypeptiden auf Matrizen können ebenso in den Arzneimittelnachweisassays der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann entweder PGC-1 oder sein Zielmolekül unter Verwendung von Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotynilierte PGC-1 Moleküle können von Biotin-NHS (N-Hydroxy-succinimid) unter Verwendung im Stand der Technik bekannter Techniken hergestellt werden (beispielsweise Biotynilierungskit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) und in den Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten Platte mit 96 Vertiefungen (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ dazu können Antikörper, welche mit PGC-1 reagieren aber welche nicht mit einem Binden des Polypeptids an sein Zielmolekül interferieren, auf die Vertiefungen der Platte derivatisiert werden und das PGC-1 in den Vertiefungen durch Antikörperkonjugation eingefangen werden. Wie vorstehend beschrieben werden Präparationen eines PGC-1 Binde-Polypeptids und einer Kandidatenverbindung in den PGC-1 aufweisenden Vertiefungen der Platte inkubiert und die Menge an in der Vertiefung eingefangenen Komplexes kann quantifiziert werden. Verfahren zum Nachweis derartiger Komplexe, zusätzlich zu jenen die vorstehend für die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden, umfassen Immunonachweis von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, welche mit dem PGC-1 Zielmolekül reagieren, oder welche mit PGC-1 Polypeptid reagieren und mit dem Zielmolekül kompetitieren, ebenso wie Enzym verknüpfte Assays, welche auf einem Nachweis einer enzymatischen Aktivität basieren, welche mit dem Zielmolekül zusammenhängt.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung (beispielsweise einen Durchmusterungsassay) bereit, welche bei der Behandlung einer Erkrankung verwendet werden kann, und durch (oder zusammenhängend mit) eine fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Nukleinsäureexpression oder PGC-1 Polypeptid Aktivität gekennzeichnet ist (oder zusammenhängt). Dieses Verfahren umfasst für gewöhnlich den Schritt eines Prüfens der Befähigung der Verbindung oder Agens die Expression der PGC-1 Nukleinsäure oder die Aktivität des PGC-1 Proteins zu modulieren und dadurch eine Verbindung zum Behandeln einer Erkrankung zu identifizieren, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Nukleinsäureexpression oder PGC-1 Polypeptid Aktivität gekennzeichnet ist. Erkrankungen, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Nukleinsäureexpression oder PGC-1 Protein Aktivität gekennzeichnet sind, werden hierin beschrieben. Verfahren zur Prüfung oder Befähigung der Verbindung oder Agens die Expression der PGC-1 Nukleinsäure oder Aktivität des PGC-1 Proteins zu modulieren, sind für gewöhnlich Zellbasierende Assays. Beispielsweise können Zellen, welche auf Liganden sensitiv sind, welche Signale über einen PGC-1 einbeziehenden Weg übertragen, zur Überexpression eines PGC-1 Proteins in der Anwesenheit und Abwesenheit einer Kandidatenverbindung induziert werden. Kandidatenverbindungen können identifiziert werden, welche eine statistisch signifikante Änderung in PGC-1 abhängigen Reaktionen (sowohl Stimulation als auch Inhibition) hervorrufen. In einer Ausführungsform wird eine Expression der PGC-1 Nukleinsäure oder Aktivität eines PGC-1 Proteins in Zellen moduliert und die Wirkungen der Kandidatenverbindungen auf der Auslesung von Interesse (wie beispielsweise die Rate einer Zellproliferation oder Differentzierung) werden bestimmt. Beispielsweise kann die Expression von Genen geprüft werden, welche in Reaktion auf eine PGC-1 Protein abhängige Signalkaskade hoch oder herunterreguliert werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Regulatorbereiche derartiger Gene, beispielsweise der 5' flankierende Promoter und Verstärkerbereiche, mit einem nachweisbaren Marker (wie beispielsweise Luciferase) wirksam verbunden, welche ein Genprodukt codiert, das einfach nachgewiesen werden kann. Eine Phosphorylierung von PGC-1 oder PGC-1 Zielmolekülen kann ebenfalls durch beispielsweise Immunoblotten bestimmt werden.
Alternativ können Modulatoren einer PGC-1 Nukleinsäureexpression (beispielsweise Verbindungen, welche zur Behandlung einer Erkrankung verwendet werden können, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Nukleinsäurexpression oder PGC-1 Proteinaktivität gekennzeichnet ist) in einem Verfahren identifiziert werden, worin eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wird und die Expression von PGC-1 mRNA oder Protein in der Zelle bestimmt wird. Das Expressionsniveau von PGC-1 mRNA oder Protein in der Anwesenheit der Kandidatenverbindung wird mit dem Expressionsniveau von PGC-1 mRNA oder Protein in der Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen. Die Kandidatenverbindung kann anschließend als ein Modulator einer PGC-1 Nukleinsäureexpression basierend auf diesem Vergleich identifiziert werden und kann verwendet werden, um einer Erkrankung zu behandeln, welche durch eine fehlerhafte PGC-1 Nukleinsäureexpression gekennzeichnet ist. Falls beispielsweise eine Expression einer PGC-1 mRNA oder eines Polypeptids in der Anwesenheit der Kandidatenverbindung größer ist (statistisch signifikant größer) als in ihrer Abwesenheit, wird die Kandidatenverbindung als ein Stimulator einer PGC-1 Nukleinsäureexpression identifiziert. Falls alternativ eine PGC-1 Nukleinsäureexpression in der Anwesenheit der Kandidatenverbindung geringer ist (statistisch signifikant geringer) als in ihrer Abwesenheit, wird die Kandidatenverbindung als ein Inhibitor einer PGC-1 Nukleinsäureexpression identifiziert. Das Niveau einer PGC-1 Nukleinsäureexpression in den Zellen kann durch hierin beschriebene Verfahren zum Nachweisen von PGC-1 mRNA oder Protein bestimmt werden.
In noch einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform können die PGC-1 Proteine als "Köderproteine" in einem zwei-Hybrid Assay verwendet werden (siehe beispielsweise US-P 5,283,317, Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; und Brent WO 94/10300), um andere Proteine zu identifizieren, welche mit PGC-1 ("PGC-1 Binde-Proteine oder "PGC-1 bp") Binden oder wechselwirken und eine PGC-1 Protein Aktivität modulieren. Derartige PGC-1 Binde-Proteine sind ebenso wahrscheinlich in die Propagierung von Signalen durch die PGC-1 Proteine, wie beispielsweise durch stromaufwärts oder stromabwärts vorliegende Elemente des PGC-1 Wegs, einbezogen.
Das zwei-Hybridsystem basiert auf der modularen Beschaffenheit der meisten Transkriptionsfaktoren, welche aus getrennten DNA-Binde und Aktivierungsdomänen bestehen. Bartel, P. et al. "Using the Two-Hybrid-System to Detect Protein-Protein Interactions" in Cellular Interactions in Development: A practical Approach, Hartley D.A. ed. (Oxford University Press, Oxford, 1993) 153-179. In Kürze werden in dem Assay zwei verschiedene DNA-Konstrukte verwendet. In einem Konstrukt wird das PGC-1 codierende Gen an ein Gen fusioniert, welches die DNA-Binde Domäne eines bekannten Transkriptionsfaktors codiert (beispielsweise GAL-4). In dem anderen Konstrukt ist eine DNA Sequenz von einer Bibliothek von DNA-Sequenzen, welche ein nicht identifiziertes Polypeptid ("Opfer" oder "Probe") codiert, an ein Gen fusioniert, welches für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors codiert. Falls die "Köder" und die "Opfer" Proteine in vivo unter Bildung eine PGC-1 abhängigen Komplexes wechselwirken können, werden die DNA-Binde und Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors in unmittelbare Nähe gebracht. Diese Nähe ermöglicht eine Transkription eines Reportergens (beispielsweise LacZ), welches mit einer transkriptionellen Regulatorstelle wirksam verbunden ist, welche auf den Transkriptionsfaktor reagiert. Expression des Reportergens kann nachgewiesen werden und Zellkolonien, welche den funktionellen Transkriptionsfaktor umfassen, können isoliert und verwendet werden, um das klonierte Gen zu erhalten, welches das Polypeptid codiert, welches mit PGC-1 wechselwirkt.
Modulatoren einer PGC-1 Protein Aktiviät und/oder PGC-1 Nukleinsäureexpression, welche gemäß dieser Arzneimitteldurchmusterungsassays identifiziert wurden, können für eine Behandlung von beispielsweise Gewichtserkrankungen verwendet werden, wie beispielsweise Fettsucht und Erkrankungen, welche mit einer unzureichenden Insulinaktivität zusammenhängen, wie beispielsweise Diabetes. Diese Verfahren einer Behandlung umfassen die Schritte von Verabreichen der Modulatoren einer PGC-1 Protein Aktivität und/oder Nukleinsäureexpression, beispielsweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie in Abschnitt IV vorstehend beschrieben vor einem Subjekt benötigen einer derartigen Behandlung, beispielsweise einem Subjekt mit einer hierin beschriebenen Erkrankung.
b. Diagnostische Assays:
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von PGC-1 in einer biologischen Probe bereit. Das Verfahren umfasst in Kontakt bringen der biologischen Probe mit einer Verbindung oder einem Agens, welches PGC-1 Polypeptid oder mRNA derart Nachweisen kann, das die Anwesenheit von PGC-1 in der biologischen Probe nachgewiesen ist. Ein bevorzugtes Agens zum Nachweisen von PGC-1 mRNA ist eine markierte oder markierbare Nukleinsäuresonde, welche an PGC-1 mRNA hybridisieren kann. Die Nukleinsäuresonde kann beispielsweise die Volllängen PGC-1 cDNA von SEQ ID Nr:1 oder einem Abschnitt davon sein, wie beispielsweise ein Oligonukleotid von zumindest 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotiden in Länge und ausreichend um unter stringenten Bedingungen an PGC-1 mRNA spezifisch zu hybridisieren. Ein bevorzugtes Agens zum Nachweisen von PGC-1 Protein ist ein markierter oder markierbarer Antikörper, welcher an ein PGC-1 Protein Binden kann. Antikörper können polyklonal oder vorzugsweise monoklonal sein. Ein intakter Antikörper oder ein Fragment davon (beispielsweise Fab oder F(ab')₂) können verwendet werden. Der Ausdruck "markierter oder markierbar" hinsichtlich der Sonde oder des Antikörpers, ist beabsichtigt ein direktes Markieren der Sonde oder Antikörpers durch Verbinden (d.h. physisches Verknüpfen) einer nachweisbaren Substanz mit der Sonde oder Antikörper zu umfassen, ebenso wie ein indirektes Markieren der Sonde oder des Antikörpers mittels einer Reaktivität mit einem anderen Reagens, welches direkt markiert ist. Beispiele für ein indirektes Markieren umfassen Nachweisen eines primären Antikörpers unter Verwendung eines Fluoreszenz markierten sekundären Antikörpers und Markieren einer DNA Sonde am Ende mit Biotin, so dass sie mit Fluoreszenz markiertem Streptavidin nachgewiesen werden kann. Der Ausdruck "biologische Probe" ist beabsichtigt Gewebe, Zellen und biologische Flüssigkeiten zu umfassen, welche von einem Subjekt, ebenso wie von Geweben, Zellen, Flüssigkeiten isoliert wurden, welche in einem Subjekt vorliegen. Das heißt die erfindungsgemäße Nachweismethode kann zum Nachweisen von PGC-1 mRNA oder Proteinen in einer biologischen Probe in vitro ebenso wie in vivo verwendet werden. In vitro Techniken zum Nachweis von PGC-1 mRNA umfassen beispielsweise Northern Hybridisierungen und in situ Hybridisierungen. In vitro Techniken zum Nachweis von PGC-1 Protein umfassen Enzym verknüpfte Immunosorbensassays (ELISAs), Westernblots, Immunopräzipitationen und Immunofluoreszenz. Alternativ kann PGC-1 Protein in vivo in einem Subjekt durch Einfügen eines markierten anti-PGC-1 Antikörpers in das Subjekt nachgewiesen werden. Der Antikörper kann beispielsweise mit einem radioaktiven Marker markiert werden, dessen Anwesenheit und Platzierung in einem Subjekt mittels herkömmlicher Bildgebungstechniken nachgewiesen werden kann.
Die Erfindung umfasst ebenso Kits zum Nachweisen der Anwesenheit von PGC-1 in einer biologischen Probe. Der Kit kann beispielsweise eine markierte oder markierbare Verbindung oder Agens umfassen, welche PGC-1 Protein oder mRNA in einer biologischen Probe nacheisen können; Mittel zum Bestimmen der Menge an PGC-1 in der Probe; und Mittel zum Vergleichen der Menge von PGC-1 in der Probe mit einem Standard. Die Verbindung oder das Agens kann in einem geeigneten Behälter verpackt sein. Der Kit kann ferner Anleitungen zum Verwenden des Kits umfassen, um PGC-1 mRNA oder Protein nachzuweisen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können ebenso verwendet werden, um genetische Läsionen in einem PGC-1 Gen nachzuweisen, und damit nachzuweisen, ob für ein Subjekt mit dem beschädigten Gen ein Risiko für eine Erkrankung besteht, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Nukleinsäureexpression oder PGC-1 Proteinaktivität, wie hierin festgelegt, gekennzeichnet ist. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Verfahren Nachweisen, in einer Probe von Zellen von dem Subjekt, der Anwesenheit oder Abwesenheit einer genetischen Läsion, welche durch zumindest eines einer Änderung gekennzeichnet ist, welche die Integrität eines PGC-1 Protein codierenden Gens beeinträchtigt oder die fehlerhafte Expression des PGC-1 Gens. Derartige genetische Läsionen können beispielsweise nachgewiesen werden durch Bestimmen des Vorliegens von zumindest einem von 1) eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden von einem PGC-1 Gen; 2) einer Addition von einem oder mehreren Nukleotiden zu einem PGC-1 Gen; 3) einer Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden von einem PGC-1 Gen; 4) einer chromosomalen Wiederanordnung eins PGC-1 Gens; 5) einer Änderung in dem Niveau eines Messenger RNA Transkripts eines PGC-1 Gens; 6) einer fehlerhaften Modifikation eins PGC-1 Gens, wie beispielsweise das Methylierungsmuster der genomischen DNA; 7) die Anwesenheit eines nicht Wildtyp Splicing-Musters eines Messenger RNA Transkripts auf einem PGC-1 Gen; 8) ein nicht Wildtyp Niveau eines PGC-1 Proteins; 9) allelischer Verlust eines PGC-1 Gens; und 10) ungeeignete posttranslationale Modifikation eines PGC-1 Proteins. Wie hierin beschrieben gibt es eine große Anzahl von im Stand der Technik bekannten Assay Techniken, welche für einen Nachweis von Läsionen in einem PGC-1 Gen verwendet werden können.
Bei bestimmten Ausführungsformen bezieht ein Nachweis der Läsion die Verwendung einer/eines Sonde/Primers in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) ein (siehe beispielsweise US-P-4,683,195 und 4,683,202), wie beispielsweise Anker PCR oder RACE PCR oder alternativ in einer Ligations-Kettenreaktion (LCR) (siehe beispielsweise Landegran et al., Science, 241 (1988) 1077-1080; und Nakazawa et al., PNAS, 91 (1994) 360-364), wobei die letztere davon insbesondere für einen Nachweis von Punktmutationen in dem PGC-1 Gen sein kann (siehe Abravaya et al., Nucleic Acids Res., 23 (1995) 675-682). Dieses Verfahren kann die Schritte umfassen von Sammeln einer Probe von Zellen von einem Patienten, Isolieren von Nukleinsäure (beispielsweise genomischer mRNA, oder von beidem) von den Zellen der Probe, in Kontakt bringen der Nukleinsäureprobe mit einem oder mehreren Primern, welche an ein PGC-1 Gen unter Bedingungen spezifisch hybridisieren, so dass eine Hybridisierung und Amplifikation des PGC-1 Gens (falls vorliegend) auftritt, und Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts, oder Nachweisen der Größe des Amplifikationsprodukts und Vergleichen der Länge mit einer Kontrollprobe.
In einer alternativen Ausführungsform können Mutationen in einem PGC-1 Gen von einer Zellprobe durch Änderungen in Reaktionsenzym-Schnittmustern identifiziert werden. Beispielsweise wird eine Probe und Kontroll-DNA isoliert, amplifiziert (optional), mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen verdaut und die Größen von einer Fragmentlänge werden mittels Gelelektrophorese bestimmt und verglichen. Unterschiede bei Größen einer Fragmentlänge zwischen Probe und Kontroll DNA zeigt Mutationen in der Proben DNA an. Darüber hinaus kann die Verwendung von Sequenz spezifischen Ribozymen (siehe beispielsweise US-P 5,498,531) verwendet werden, um die Anwesenheit spezifischer Mutationen durch Entwicklung oder Verlust einer Ribozym-Schnittstelle zu bewerten.
In noch einer anderen Ausführungsform kann irgendeine einer Vielzahl im Stand der Technik bekannten Sequenzierungs-Reaktionen verwendet werden, um das PGC-1 Gen direkt zu Sequenzieren und Mutationen durch Vergleichen der Sequenz der Proben PGC-1 mit der entsprechenden Wildtyp (Kontroll) Sequenz nachzuweisen. Beispiele von Sequenzierungs-Reaktionen umfassen jene, welche auf Techniken basieren, die von Maxim und Gilbert entwickelt wurden (PNAS, 74 (1977) 560) oder Sanger (PNAS, 74 (1977) 5463). Eine Vielzahl von automatisierten Sequenzierungs-Verfahren kann verwendet werden, wenn die diagnostischen Assays durchgeführt werden (Biotechniques, 19 (1995) 448), einschließlich einer Sequenzierung mittels Massenspektrometrie (siehe beispielsweise PCT internationale Anmeldung WO 94/16101; Cohen et al., Adv. Chromatogr., 36 (1996) 127-162; and Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 38 (1993) 147-159).
Andere Verfahren für ein Nachweisen von Mutationen in dem PGC-1 Gen umfassen Verfahren, bei denen ein Schutz von Schnittagenzien verwendet wird, um nicht paarende Basen in RNA/RNA oder RNA/DNA Duplexen nachzuweisen (Myers et al., Science 230 (1985) 1242); Cotton et al., PNAS 85 (1988) 4397; Saleeba et al. Meth. Enzymol. 217(1988) 286-295); elektrophoretische Mobilität von Mutanten und Wildtyp Nukleinsäure wird verglichen (Orita et al. PNAS 86 (1989) 2766; Cotton, Mutat Res 285 (1993) 125-144; und Hayashi, Genet. Anal. Tech. Appl. 9 (1992) 73-79) und Bewegung von Mutanten- oder Wildtyp-Fragmenten in Polyacrylamid Gelen, welche einen Gradienten eines Denaturierungsmittels enthalten, werden unter Verwendung denaturierender Gradientengelelektrophorese überprüft (Myers et al., Nature 313 (1985) 495). Beispiele anderer Techniken zum Nachweis von Punktmutationen umfassen selektive Oligonukleotidhybridisierung, selektive Amplifikationen und selektive Primerverlängerung.
c. Verwendung bei Verfahren zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von medizinischen Zuständen.
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Verwendung bei Verfahren zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung eines Subjekts, beispielsweise eines Menschen, mit einer Erkrankung oder Krankheit, die durch eine fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Nukleinsäureexpression und/oder PGC-1 Proteinaktivität gekennzeichnet ist (oder zusammenhängt mit). Ein PGC-1 Modulator kann derart dem Subjekt verabreicht werden, dass eine Behandlung eintritt. Der Ausdruck "fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Expression" betrifft eine Expression eines nicht-Wildtyp PGC-1 Proteins oder eines nicht-Wildtyp Expressionsniveaus eines PGC-1 Proteins. Fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Proteinaktivität betrifft eine nicht Wildtyp PGC-1 Proteinaktivität oder ein nicht-Wildtyp Niveau einer PGC-1 Proteinaktivität. Da das PGC-1 Protein beispielsweise in einen Weg einbezogen ist, welcher eine Differenzierung von Fettzellen, Thermogenese in braunen Fettzellen und Insulinsensivität einbezieht, beeinträchtigt eine fehlerhafte oder abnormale PGC-1 Proteininaktivität oder Nukleinsäureexpression die gewöhnliche Gewichtssteuerung und metabolischen Funktionen. Nicht beschränkende Beispiele von Erkrankungen oder Krankheiten, welche durch eine abnormale oder fehlerhafte PGC-1 Proteinaktivität oder Nukleinsäureexpression gekennzeichnet sind oder zusammenhängen, umfassen Gewichtserkrankungen, wie beispielsweise Fettsucht, Cachexie, Anorexie, und Erkrankungen, welche mit einer unzureichenden Insulinaktivität zusammenhängen, wie beispielsweise Diabetes. Erkrankungen, welche mit dem Körpergewicht zusammenhängen, sind Erkrankungen, welche mit einem abnormalen Körpergewicht oder abnormalen Steuerung des Körpergewichts zusammenhängen. Wie hierin verwendet umfasst der Ausdruck "Erkrankungen, welche mit oder durch eine unzureichende Insulinaktivität zusammenhängen oder gekennzeichnet sind" Erkrankungen oder Krankheiten, bei denen eine abnormale Verwendung von Glucose aufgrund einer abnormalen Insulinfunktion vorliegt. Eine abnormale Insulinfunktion umfasst irgendeine Abnormalität oder Störung bei Insulinproduktion, beispielsweise Expression und/oder Transport durch zelluläre Organellen, wie beispielsweise Insulinmangel resultierend von beispielsweise Verlust von β Zellen wie in IDDM (Typ I Diabetes), Sekretion, wie beispielsweise Störung von Insulinsekretions-Reaktionen wie in NIDDM (Typ II Diabetes), der Form des Insulinmoleküls selbst, beispielsweise primäre, sekundäre oder tertiäre Struktur, Wirkungen von Insulin auf Zielzellen, beispielsweise Insulin Widerstand in Körpergeweben, beispielsweise peripheren Geweben, und Reaktionen auf Zielzellen auf Insulin. Siehe Braunwald, E. et al. Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, Eleventh Edition (McGraw-Hill Book Company, New York, 1987) 1778-1797; Robbins, S.L. et al. Pathologic Basis of Disease, 3^rd Edition (W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1984) 972 für weitere Beschreibungen einer abnormalen Insulinaktivität in IDDM und NIDDM und andere Formen von Diabetes. Die Ausdrücke "Behandeln" oder "Behandlung", wie hierin verwendet, betreffen eine Verringerung oder Verbesserung von zumindest einem nachteiligen Effekt oder Symptom einer Erkrankung oder Krankheit, beispielsweise eine Erkrankung oder Krankheit, welche durch eine abnormalen oder fehlerhaften PGC-1 Proteinaktivität oder PGC-1 Nukleinsäureexpression gekennzeichnet ist oder zusammenhängt.
Wie hierin verwendet ist ein PGC-1 Modulator ein Molekül, welches eine PGC-1 Nukleinsäureexpression und/oder PGC-1 Proteinaktivität modulieren kann. Ein PGC-1 Modulator kann beispielsweise modulieren, beispielsweise PGC-1 Nukleinsäureexpression hochregulieren (aktivieren) oder herunterregulieren (unterdrücken). In einem anderen Beispiel kann ein PGC-1 Modulator eine PGC-1 Proteinaktivität modulieren (beispielsweise stimulieren oder inhibieren). Falls es wünschenswert ist, eine Erkrankung oder Krankheit zu behandeln, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale (nicht Wildtyp) PGC-1 Nukleinsäureexpression und/oder PGC-1 Proteinaktivität gekennzeichnet ist (oder damit zusammenhängt), durch inhibieren einer PGC-1 Nukleinsäureexpression, kann ein PGC-1 Modulator ein Antisense Molekül sein, beispielsweise ein Ribozym, wie hierin beschrieben. Beispiel für antisense Moleküle, welche für eine Inhibierung einer PGC-1 Nukleinsäureexpression verwendet werden können, umfassen antisense Moleküle, welche zu einem Abschnitt des 5' nicht übersetzten Bereichs von SEQ ID Nr:1 komplementär sind, welche ebenso das Startcodon umfasst, und antisense Moleküle, welche zu einem Abschnitt des 3' nicht übersetzten Bereichs von SEQ ID Nr:1 komplementär sind. Ein PGC-1 Modulator, der eine PGC-1 Nukleinsäureexpression inhibiert, kann ebenso ein kleines Molekül oder ein anderes Arzneimittel sein, beispielsweise ein kleines Molekül oder Arzneimittel, welches unter Verwendung der hierin beschriebenen Durchmusterungsassays identifiziert wurde, welches eine PGC-1 Nukleinsäureexpression inhibiert. Falls es wünschenswert ist, eine Erkrankung oder Krankheit zu behandeln, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale (nicht Wildtyp) PGC-1 Nukleinsäureexpression gekennzeichnet ist (oder damit zusammenhängt) und/oder PGC-1 Proteinaktivität durch Stimulieren einer PGC-1 Nukleinsäureexpression, kann ein PGC-1 Modulator beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül sein, welches ein PGC-1 (beispielsweise ein Nukleinsäuremolekül, welches eine Nukleotidsequenz homolog zu der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr:1 umfasst) codiert oder ein kleines Molekül oder ein anderes Arzneimittel, beispielsweise ein kleines Molekül (Peptid) oder Arzneimittel sein, welches unter Verwendung der hierin beschriebenen Durchmusterungsassays identifiziert wurde, welches eine PGC-1 Nukleinsäureexpression stimuliert.
Falls es alternativ dazu wünschenswert ist eine Erkrankung oder Krankheit durch Inhibieren einer PGC-1 Proteinaktivität zu behandeln, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale (nicht Wildtyp) PGC-1 Nukleinsäureexpression und/oder PGC-1 Proteinaktivität gekennzeichnet ist (oder damit zusammenhängt), kann ein PGC-1 Modulator ein anti-PGC-1 Antikörper oder ein kleines Molekül oder ein anderes Arzneimittel sein, beispielsweise ein kleines Molekül oder Arzneimittel, welche unter Verwendung der hierin beschriebenen Durchmusterungsassays identifiziert wurden, welches eine PGC-1 Proteinaktivität inhibiert. Falls es wünschenswert ist eine Erkrankung oder Krankheit durch Stimulieren einer PGC-1 Proteinaktivität zu behandeln, welche durch eine fehlerhafte oder abnormale (nicht Wildtyp) PGC-1 Nukleinsäureexpression und/oder PGC-1 Proteinaktivität gekennzeichnet ist (oder damit zusammenhängt), kann ein PGC-1 Modulator ein aktives PGC-1 Protein oder Abschnitt davon sein (beispielsweise ein PGC-1 Protein oder Abschnitt davon mit einer Aminosäuresequenz, welche zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr:2 oder einem Abschnitt davon homolog ist) oder ein kleines Molekül oder ein anderes Arzneimittel, beispielsweise ein kleines Molekül oder Arzneimittel, welches unter der Verwendung der hierin beschriebenen Durchmusterungsassays identifiziert wurde, welches eine PGC-1 Proteinaktivität stimuliert.
Darüber hinaus kann ein Subjekt mit einer Gewichtserkrankung, beispielsweise Fettsucht, gemäß der vorliegenden Erfindung durch Verabreichung eines PGC-1 Proteins oder Abschnitts davon zu dem Subjekt oder einer Nukleinsäure behandelt werden, welche ein PGC-1 Protein oder Abschnitt davon derart codiert, das eine Behandlung eintritt. Ähnlich dazu kann ein Subjekt mit einer Erkrankung, welche mit einer unzureichenden Insulinaktivität zusammenhängt, gemäß der vorliegenden Erfindung durch Verabreichung des Subjekts eines PGC-1 Proteins oder Abschnitts davon oder einer Nukleinsäure behandelt werden, welche ein PGC-1 Protein oder Abschnitt davon derart codiert, das eine Behandlung eintritt.
Andere erfindungsgemäße Ausführungsformen betreffen Verfahren für eine Modulierung einer Zell zusammenhängenden Aktivität. Diese Verfahren umfassen in Kontakt bringen der Zelle mit einem Agens (oder einer Zusammensetzung, welche eine effektive Menge eines Agens umfasst), welches eine PGC-1 Proteinaktivität oder PGC-1 Nukleinsäureexpression derart moduliert, das eine Zell zusammenhängende Aktivität relativ zu einer Zell zusammenhängenden Aktivität der Zelle in der Abwesenheit des Agens geändert wird. Wie hierin verwendet betrifft "eine Zell zusammenhängende Aktivität" eine gewöhnliche oder abnormale Aktivität oder Funktion einer Zelle. Beispiele von Zell zusammenhängenden Aktivitäten umfassen Proliferation, Migration, Differenzierung, Produktion oder Sekretion von Molekülen, wie beispielsweise Proteinen, Zellüberleben und Thermogenese. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zellzusammenhängende Aktivität Thermogenese und die Zelle ist eine braune Fettzelle. Der Ausdruck "geändert" wie hierin verwendet betrifft eine Änderung, beispielsweise eine Zunahme oder Abnahme einer Zellzusammenhängenden Aktivität. In einer Ausführungsform stimuliert das Agens PGC-1 Protein Aktivität oder PGC-1 Nukleinsäureexpression. Beispiele für derartige stimulatorische Agenzien umfassen ein aktives PGC-1 Protein, ein Nukleinsäuremolekül, welches PGC-1 codiert, das in die Zelle eingefügt wurde, und ein Modulator Agens, welches eine PGC-1 Protein Aktivität oder PGC-1 Nukleinsäureexpression stimuliert und welches unter Verwendung der hierin beschriebenen Arzneimittel Durchmusterungsassays identifiziert wird. In einer anderen Ausführungsform inhibiert das Agens eine PGC-1 Protein Aktivität oder eine PGC-1 Nukleinsäureexpression. Beispiele derartiger inhibitorischer Agenzien umfassen ein antisense PGC-1 Nukleinsäuremolekül, ein anti-PGC-1 Antikörper und ein Modulatoragens, welches eine PGC-1 Proteinaktivität oder PGC-1 Nukleinsäureexpression inhibiert und welches unter Verwendung der hierin beschriebenen Arzneimittel Durchmusterungsassays identifiziert wird. Diese Modulartorverfahren können in vitro (beispielsweise durch Kultivieren der Zelle mit dem Agens) oder alternativ in vivo (beispielsweise durch Verabreichung des Agens an ein Subjekt) durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Modulatorverfahren in vivo durchgeführt, d.h. die Zelle liegt innerhalb eines Subjekts vor, beispielsweise einem Säuger, beispielsweise einem Menschen, und das Subjekt weist eine Erkrankung oder Krankheit auf, welche durch eine abnormale oder fehlerhafte PGC-1 Protein Aktivität oder PGC-1 Nukleinsäureexpression gekennzeichnet ist oder zusammenhängt.
Ein Nukleinsäuremolekül, ein Protein, ein PGC-1 Modulator, eine Verbindung, usw., welche in den Verfahren zur Behandlung verwendet werden, können in eine hierin beschriebene geeignete pharmazeutische Zusammensetzung eingefügt werden und dem Subjekt durch eine Route verabreicht werden, welche dem Molekül, Protein, Modulator oder Verbindung, usw., erlaubt, seine beabsichtigte Funktion auszuüben. Beispiele von Verabreichungs-Routen werden ebenso hierin unter Abschnitt IV beschrieben.
Die Erfindung wird ferner durch die nachstehenden Beispiele beschrieben.
Beispiele
Beispiel 1: Identifikation und Charakterisierung von Maus PGC-1
Die Maus HIB 1B Zelllinie (Ross, R. et al., (1992) PNAS 89:7561-7565), eine braune Fettzellen Zelllinie, welche UCP exprimiert, wurde differenziert und mit Isoproterenol behandelt, um eine UCP Expression zu induzieren. Eine cDNA Bibliothek von der Maus HIB 1B Zelllinie wurde in einem Hefe Zwei-Hybridsystem unter Verwendung von PPARγ als Köder und Clontech (Palo Alto, CA) Reagenzien durchmustert. In Kürze wurden die Aminosäuren 183-505 des PPARγ der Maus in das GAL4 DNA Bindedomänen Plasmid pAS2 im Rahmen kloniert. Eine HIB 1B cDNA Expressionsbibliothek wurde in dem GAL4 Aktivierungsdomänen Plasmid pACT II konstruiert. Hefe zwei Hybridsystem Protokoll wurde beschrieben wie in dem CLONTECH Matchmaker zwei Hybridsystem Protokoll beschrieben. pAS-PPARγ wurde in Y190 Hefezellen mittels des Lithiumacetats Verfahrens transformiert und durch Selektion in Leucinplatten beibehalten. Eine pACT-HIB 1B cDNA Bibliothek wurde in Y190-PPARγ Hefezellen transformiert und positive Klone wurden auf β-Galactosidase Aktivität in einem Filterassay geprüft, wie in dem CLONTECH Protokoll beschrieben. pAS1 Lamin cDNA wurde verwendet, um Volllängen PGC-1 zu erhalten, wobei der positive Hefe cDNA Klon als Sonde verwendet wurde, um eine Oligo dT λZAP cDNA Bibliothek von HIB 1B Zellen zu durchmustern.
Eine Durchmusterung von 1 × 10⁶ primären Transformanten unter Verwendung von cDNAs, welche von HIB 1B braunen Fettzellen hergestellt wurden, ergab ungefähr 31 Klone. Die cDNA Inserts von positiven Phagen Klonen wurde in pBluescript ausgeschnitten und beide Stränge wurden mittels herkömmlicher Verfahren sequenziert. Diese wurden anschließend für eine bevorzugte Expression in braunen gegenüber weißem Fett mit RNA Blots analysiert. Einer der Klone, welcher unter Verwendung des Hefe Zwei-Hybridsystems erhalten wurde, war ein partieller PGC-1 Klon, welcher die Nukleotide 610 bis 3066 von SEQ ID Nr:1 umfasste. Der Volllängen Klon wurde unter Verwendung eines partiellen PGC-1 Klons erhalten, der die Nukleotide 650 bis 3006 von SEQ ID Nr:1 umfasste, um eine λZAP-HIB 1B Bibliothek zu durchmustern.
PGC-1 wurde anschließend von einem PBS Plasmid zu einem PSV.sport (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) subkloniert und unter Verwendung des TnT Promega Kits (Promega, Madison, WI) in vitro translatiert. Zwei Banden wurden in dem in vitro translatierten PSV.sport PGC-1 beobachtet, welche den Molekulargewichten von ungefähr 120 kD und 70 kD entsprechen. Diese Banden stellen am wahrscheinlichsten verschiedene Isoformen von PGC-1 dar. Die 120 kD Form stellt sehr wahrscheinlich das Protein von SEQ ID Nr:2 dar.
Die Nukleotidsequenz von PGC-1 der Maus (gezeigt in 1A, 1A-1 und 1A-2 und SEQ ID Nr:1) umfasst 3066 Nukleotide, welche ein Protein codieren, welches 797 Aminosäurereste umfasst mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 92 kDa ( 2A). Die PGC-1 Proteinsequenz der Maus (gezeigt in 1A, 1A-1, 1A-2 und 2A und SEQ ID Nr:2) weist verschiedene Domänen/Motive einschließlich Datenbankrecherchen auf, welche anzeigen, dass PGC-1 ein neues Protein darstellt mit keinen nahen Homologen in irgendwelchen Datenbanken mit Ausnahme von exprimierte Sequenz Tags (EST) Datenbanken. Sie enthält allerdings beträchtliche Peptidmotive einschließlich: einem wahrscheinlichen RNA-Bindemotiv (Aminosäuren 677-709) und zwei so genannte SR Domänen, Bereiche welche reich an Serin- und Argininresten sind (Aminosäuren 565-598 und 617-631). Proteine, welche gepaarte RNA-Bindemotive und SR Domänen enthalten, wurden gezeigt mit der C-terminalen Domäne (CTD) von RNA Polymerase II wechselzuwirken (Yurvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 6975-6980). Mit Ausnahme dieser beiden Regionen teilt PGC-1 allerdings keine andere Sequenzähnlichkeit mit anderen Proteinen, welche diese Domänen enthalten. Zusätzlich zu diesen Domänen enthält PGC-1 ebenso drei Consensusstellen für eine Phosphorilierung durch Proteinkinase A. Allerdings wurde keine signifikante Homologie zwischen PGC-1 und irgendeinem bekannten Co-Aktivator von Nuklearen Rezeptoren entdeckt. PGC-1 enthält allerdings ein LXXLL Motiv (Aminosäuren 142-146), was neuerdings als ein Element entdeckt wurde, welches Nuklearen Rezeptor Co-Aktivator Wechselwirkungen mediieren kann (Heery et al. Nature 397 (1997) 733-736; Torchia et al., Nature 387 (1997) 677-684).
Aus diesen Experimenten ist es klar, das PGC-1 ein neuer Faktor ist, welcher mit dem adipogenen Transkriptionsfaktor PPARγ wechselwirkt. Darüber hinaus wird angenommen, dass PPARγ eine wichtige Rolle bei einer Differenzierung von braunem Fettgewebe spielt, da es bekannt ist, dass Liganden von PPARγ den spezifischen braunen Fettgewebe Marker UCP induzieren können. Daher spielt PGC-1 Modulation von PPARγ eine Rolle bei einer Differenzierung von braunem Fettgewebe, beispielsweise kann es Zellen dazu bringen, in braune adipose Zellen eher als in weiße adipose Zellen zu differenzieren.
Beispiel II: Identifikation von menschlichem PGC-1
Um das menschliche PGC-1 Nukleinsäuremolekül zu erhalten, kann eine cDNA Bibliothek von einem Gewebe, in welchem PGC-1 hoch exprimiert ist, unter Bedingungen geringer Stringenz durchmustert werden (beispielsweise wie in Sambrook, J., Fritsh, E.F., und Maniatis, T. beschrieben, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989) Northernblot Analyse von menschlicher Poly A RNA, welche mit einer Maus Volllängen Längen cDNA Sonde durchmustert wurde (beispielsweise einer Sonde mit der in SEQ ID Nr:1 gezeigten Sequenz), zeigte hohe Expressionsniveaus an PGC-1 in menschlichem Muskel, Herz, Gehirn, Niere und Pancreas, wobei die höchsten Expressionsniveaus in menschlichem Muskel und Herz nachgewiesen wurden. Demgemäß kann eine menschliche Muskel Bibliothek, beispielsweise eine Oligo dT menschliche Muskelbibliothek, unter Verwendung einer Sonde durchmustert werden, welche die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr:1 oder einen Abschnitt davon umfasst (beispielsweise Nukleotide von dem 5' Bereich von SEQ ID Nr:1, beispielsweise Nukleotid 1 bis 50 von SEQ ID Nr:1). Durch Auswahl von Klonen an dem 5' Bereich von PGC-1 wird die Wahrscheinlichkeit zum Erhalten von Volllängen Klonen erhöht. Klone welche von dieser Durchmusterung erhalten wurden, können sequenziert und mit der in SEQ ID Nr:1 gezeigten Maussequenz verglichen werden, um zu bestimmen, ob sie das menschliche PGC-1 Molekül darstellen. Wenn von den Klonen gefunden wird partielle Klone zu sein, wird die cDNA Bibliothek mit dem partiellen menschlichen Klon wiederum durchmustert, um den Volllängen menschlichen Klon zu erhalten.
Beispiel III: Gewebeverteilung von Maus PGC-1 und kalte Induktion von PGC-1 in braunem Fettgewebe
Eine Northern Analyse von mRNA von Lungen, Muskel, Leber, Herz, Niere, weißem Fettgewebe (WAT), braunem Fettgewebe (BAT), Gehirn, Hoden und Milzgewebe von 4 Wochen alten Mäusen, welche bei 24°C akklimatisiert sind, wurde unter Verwendung einer Sonde durchgeführt, welche die Nukleotide 150 bis 3066 von SEQ ID Nr:1 umfasst. In Kürze wurde Gesamt-RNA von kultivierten Zellen und Geweben der Maus mit Guanidin Isothiocyanat Extraktion isoliert. RNA Proben wurden wie vorstehend beschrieben weiter verarbeitet (Tontonoz et al., Genes Dev. 8 (1994) 1224-1234). Drei Banden erschienen auf den Northernblots, welche größer als der 28S (5000-6000 bp) Marker waren. Diese Banden stellen sehr wahrscheinlich verschiedene Isoformen von PGC-1 dar. PGC-1 mRNA wurde hauptsächlich in Gehirn, Herz, Niere und BAT nachgewiesen. Darüber hinaus wird eine kleine Spezies von ungefähr 8kb ebenso in all diesen Geweben beobachtet. Im Gegensatz dazu wird eine PGC-1 mRNA Expression in weißem Fett, Lunge, Skelettmuskel, Leber, Hoden oder Milz nicht beobachtet.
Aussetzung gegenüber Kälte ist ein klassisches Induktionsmittel adaptiver Thermogenese, insbesondere in braunem Fett und Skelettmuskel, (Himms-Hagen, Can. J. Physiol. Pharmcol. 67 (1989) 394-401). Eine zweite Northern Analyse von mRNA von WAT, BAT und Lebergewebe von 4 Wochen alten Mäusen, welche bei 4°C für 3-12 Stunden akklimatisiert waren, wurde unter Verwendung der gleichen Sonde wie in der ersten Northern Analyse durchgeführt. Von dieser Northern Analyse war es ersichtlich, das PGC-1 hoch induziert war (um 30- bis 50-fach) während einer Aussetzung gegenüber Kälte insbesondere in BAT und dass eine PGC-1 Expression BAT spezifisch mit keiner Expression in WAT war. Obgleich PGC-1 mRNA Expression nicht in Skelettmuskel von Mäusen nachweisbar ist, welche bei Raumtemperatur gehalten wurden, induziert ein Aussetzen von Mäusen gegenüber Kälte für 12 Stunden eine Expression des PGC-1 Gens in diesem Gewebe. Herz und Niere, welche PGC-1 mRNA bei Raumtemperatur exprimieren, erhöhen diese Expression bei Aussetzung gegenüber Kälte nicht. Eine PGC-1 Induktion während einer Aussetzung gegenüber Kälte ist parallel zu jener von UCP, einem braunen Fett spezifischem Marker, welcher für die thermogenetische Aktivität von BAT verantwortlich ist.
Diese Experimente zeigen, dass obgleich PGC-1 in mehreren Geweben exprimiert ist, einschließlich BAT, von Tieren welche bei 24°C akklimatisiert sind, es nicht in WAT exprimiert ist. Die hierin beschriebenen Tierstudien wurden wie nachstehend durchgeführt. Vier Wochen alte männliche C57BL/6J Mäuse wurden verwendet. Tiere wurden ad libitum gefüttert und 10 Tiere wurden pro Käfig gruppiert. Eine Kontrollgruppe wurde bei 24°C gehalten, während Versuchsgruppen bei 4°C für 3 oder 12 Stunden gehalten wurden. Tiere wurden geopfert, Gewebe wurden dissektiert und unverzüglich gesammelt.
WAT und BAT teilen die gleiche genetische und biochemische Maschinerie für Adipogenese mit Ausnahme, dass BAT eine thermogenetische Funktion bei terminaler Differenzierung entwickelt. PGC-1 spielt daher eine Rolle bei der thermogenetischen Funktion von BAT. Diese Funktion wurde bestätigt, wenn die zweite Northern Analyse zeigte, das in Geweben von Tieren, welche bei 4°C akklimatisiert sind, PGC-1 im Wesentlichen nur in BAT exprimiert war. PGC-1 spielt daher eine Rolle bei dem Gleichgewicht zwischen Energie-Lagerung und Aufwand. Northernblot mRNA Analyse von PGC-1 und Genen von mitochondrieller Funktion in verschiedenen Maus Geweben (Niere, Herz, BAT und WAT) nach Aussetzen gegenüber Kälte zeigte, das eine Kälte induzierte Expression von PGC-1 in dem braunen Fett von diesen Mäusen mit der induzierten Expression von anderen mitochondriellen Schlüsselproteinen, einschließlich ATP-Synthetase (β Untereinheit) und Cytochrom C-Oxidase Untereinheiten (COX II und COX IV) korrelierte. Obgleich eine chronische Aussetzung gegenüber Kälte berichtet wurde, zu erhöhten Aktivitäten von diesen mitochondriellen Proteinen im Skelettmuskel zu führen (Bourhim et al., Am. J. Physiol. 258 (1990) R1291-R1298), wurde keine Induktion von mRNA für ATP-Synthetase, COX II oder COX IV im Muskel mit dem verhältnismäßig kurzen Aussetzen gegenüber Kälte beobachtet. Um diese Versuche durchzuführen wurden Tiere bei 4°C für 3 oder 12 Stunden gehalten, geopfert und Gewebe (Niere, Herz, WAT und BAT) wurden für die Präparation von RNA dissektiert. Zehn Mäuse wurden für jede Probe gepoolt. Für eine Hybridisierung verwendete Sonden waren PGC-1, UCT-1, ACT Sythetase (β Untereinheit), Cytochrom C-Oxidase II (COX-II) und Cytochrom C-Oxidase IV (COX-IV).
Kälte wird im zentralen Nervensystem gefühlt und führt zu einer erhöhten sympathetischen Ausgabe zu peripheren Geweben, einschließlich von Muskel und braunem Fett (Himms-Hagen (1989) Can. J. Physiol. Pharmcol. 67:394-401). Hinsichtlich dem Zellwachstum von braunen Fettzellen Vorläufern und der Induktion von UCP-1 kann eine Aussetzung gegenüber Kälte durch Aussetzen von kultivierten braunen Fettzellen gegenüber β-adrenergen Agonisten nachgestellt werden (Rehnmark et al. (1990) J. Biol. Chem. 25:16464-16471). Um zu bestimmen, ob eine PGC-1 Genexpression ebenso gegenüber β-adrenergen Agonisten sensitiv ist, wurden HIB 1B braune Fettzellen für 10 Stunden mit Isoproterenol (1 μm) behandelt, einem nicht Untereinheit bzw. nicht Unterart selektiven β Agonisten. Gesamtzelluläre RNA wurde isoliert und unter Verwendung von PGC-1 und UCP-1 cDNA Sonden analysiert.
Eine Behandlung von HIB 1B braunen Fettzellen mit diesen Agenzien führte zu einer deutlichen Zunahme bei sowohl PGC-1 mRNA als auch UCP-1 mRNA. In Kürze wurden HIB 1B braune Fett Präfettzellen wie hierin beschrieben differenziert. Nach 6 Tagen waren die Zellen zu näherungsweise 80% differenziert. Eine Aussetzung von braunen Fettzellen gegenüber 9-cis Retinolsäure wurde bereits gezeigt die Wirkungen von β Agonisten eine Induktion von UCP-1 Expression zu verstärken (Puigserver et al., Biochem. J. 317 (1996) 827-833). Eine Zugabe von diesem Retinoid (welches sowohl RXR als auch RAR aktiviert) und Isoproterenol zu den HIB 1B Zellen führte zu einer kleinen weiteren Zunahme sowohl in einer PGC-1 als auch in UCP-1 Expression. Diese Ergebnisse zeigen, dass β-adrenerge Agonisten eine wichtige Rolle bei einem Mediieren der Wirkungen von Kälte auf die Induktion von UCP-1 als auch PGC-1 spielen können.
Beispiel IV: Rekombinante Expression von PGC-1 und Binden von PGC-1 an andere Transkriptionsfaktoren und Nukleare Hormonrezeptoren
GST-PGC-1 Fusionsproteine wurden zuerst durch Subklonieren eines Abschnitts der PGC-1 Nukleotidsequenz (Nukleotide 610 bis 3066 von SEQ ID Nr:1) in einen pGEX Vektor erzeugt (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ). In Kürze wurde PGC-1 (EcoRI-XhoI Fragment von pBluescript) in die SmaI Stelle von pGEX 5X3 kloniert. Die PPARγ Deletionen wurden durch Durchführen von PCR unter Verwendung von spezifischen Oligo-Nukleotiden erzeugt und sie wurden im Rahmen in pGEX 5X2 kloniert. Diese Fusionsproteine wurden exprimiert und von E. coli auf Kügelchen gereinigt, welche ungefähr 1 μg Protein enthielten (entweder GST, oder alleine, oder an PGC-1 fusioniert), 30 μl wurden in dem Bindepuffer resuspendiert (20 mM Hepes (pH 7,7), 75mM KCL, 0,1 mM EDTA, 2,5 mM MgCl₂, 0,05% NP 40,2 mM DTT, 10% Glycerol).
Nach Expression der Fusionsproteine in COS Zellen wurden in vitro Bindeassays, wie in Takeshita, A. et al. (Endocrinology 137 (1996) 3594-3597) beschrieben, durchgeführt, um die Wechselwirkung von PGC-1 mit PPARγ, anderen PPAR Isoformen, wie beispielsweise PPARα und PPARδ, anderen Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise C/EBPα und RXRα, und anderen nuklearen Hormonrezeptoren, wie beispielsweise dem Thyroid Hormonrezeptor, dem Östrogen Rezeptor und dem Retinolsäure Rezeptor, zu untersuchen. Die Assays wurden wie nachstehend beschrieben durchgeführt. Kontroll GST Protein alleine oder PGC-1 (AA 36-797), welches an GST fusioniert war, wurden auf Glutathion Agarose Kügelchen immobilisiert und mit verschiedenen in vitro translatierten (³⁵S) Methionin markierten Nuklearen Rezeptoren und geeigneten Liganden oder einem Vehikel inkubiert. Die Fusionsproteine wurden mit 5 μl verschiedenen nuklearen Rezeptoren gemischt, welche in einer in vitro Reticulocyt Translationsreaktion unter Verwendung von (³⁵S) methionin (Promega TNT Reticulocyt Lysat-System Kit) hergestellt wurden. Spezifische Nukleare Rezeptor-Liganden oder Vehikel (5 μl) wurden hinzugegeben. Ein Binden wurde für 60 Min. bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Kügelchen wurden anschließend vier Mal mit dem Bindepuffer mit oder ohne Liganden gewaschen und in SDS-PAGE Probenpuffer resuspendiert. Nach Elektrophorese, Fixieren und Verstärken, wurden die radiomarkierten Proteine mittels Autoradiographie visualisiert.
Diese Assays zeigen, dass PGC-1 mit PPARγ wechselwirkte. Diese Wechselwirkung war nicht Liganden abhängig, so dass eine Zugabe von BRL49653 (einem Thiazolidinedion Ligand für PPARγ) bei 10 μm dieses Binden nicht signifikant ändert. Ein ähnliches Fehlen einer Ligandenabhängigkeit für diese Wechselwirkung wurde beobachtet, falls bakteriell exprimiertes PPARγ auf Kügelchen immobilisiert wurde und mit Reticulocyt translatiertem PGC-1 verwendet wurde. Diese Assays zeigten ebenso, dasd PGC-1 Wechselwirkt mit: a) PPARα und zeigt eine geringe Ligandenabhängigkeit unter Verwendung von Leukotrien-4 (1 μm); b)PPARδ und zeigt eine geringe Ligandenabhängigkeit unter Verwendung von carboprostacyclin (1 μm); c) der Thyorid Hormonrezeptor mit einer geringen Ligandenabhänigkeit unter Verwendung von Thyroid Hormon (1 μm); d) der Östrogenrezeptor mit einer geringen Ligandenabhängigkeit unter Verwendung von Östradiol (1 μm); und 3.) der Retinolsäure-Rezeptor mit einer starken Ligandenabhängigkeit unter Verwendung all-trans Retinolsäure (1 μm). Das TRβ bindet ebenso spezifisch an PGC-1, obgleich in diesem Fall eine Liganden (T₃) Zugabe eine 2- bis 3-fache Zunahme in einer Bindung verursacht. Eine starke Liganden abhängige Bindung wird zwischen PGC-1 und dem Retinolsäure (RA) Rezeptor beobachtet und zwischen PGC-1 und dem Östrogenrezeptor (ERα). Im Gegensatz dazu wird eine geringe oder gar keine Bindung zwischen PGC-1 und dem Retinoid X Rezeptor (RXRα) gesehen, mit oder ohne Liganden Zugabe. Diese Daten zeigen, das PGC-1 mit PPARγ und mehreren anderen Nuklearen Rezeptoren in vitro spezifisch wechselwirkt. Es gibt einen breiten Bereich einer Abhängigkeit von einem Liganden für diese Wechselwirkungen, von keiner Ligandenabhängigkeit (PPARγ) bis zu einer starken Abhängigkeit von einer Ligandenzugabe (RARα)
Die Wechselwirkung zwischen PPARγ und PGC-1 kann ebenso in Säugerzellen beobachtet werden. Sogar in der Abwesenheit von zugegebenen Liganden wird eine Assoziierung zwischen diesen beiden Proteinen in Immunopräzipiationsassays beobachtet. Vektoren, welche PGC-1 mit HA Ende bzw. Tag und PPARγ exprimieren, wurden in COS Zellen transfiziert. In Kürze wurde Volllängen PGC-1 mit einem N-Terminus mit HA Ende durch PCR erzeugt und in SmaI von pSV-SPORT kloniert. Liganden Pioglitazon (5 μm), 9-cis RA (1 μm) und 8-Br-cAMP (1 nm) wurden 3 Stunden hinzugegeben bevor die Zellen geerntet wurden. Zellextrakte und Immunopräzipitation von transfizierten Zellen wurden wie in Lasser et al. beschrieben durchgeführt (Cell 66 (1991) 305-315). Anti-Maus PPARγ von Hasen (Hu et al., Science 274 (1996) 2100-2103) wurde als eine 1:500 Verdünnung für eine Immunopräzipitation verwendet. Eine anti-HA Mausverdünnung für einen Western Blot wurde unter Verwendung von ECL (Amersham) entwickelt. Falls die Zellen mit Pioglitazon (einen PPARγ Liganden) behandelt wurden, wurde eine äußerst moderate Zunahme bei einer Assoziierung beobachtet.
Um zu behandeln, ob PGC-1 in der Tat in dem Zellnucleus vorliegt, wurde ein Fusionsprotein zwischen PGC-1 und grünem fluoreszierenden Protein (GFP) konstruiert. Eine GFP Fusion an das Volllängen PGC-1 wurde durch dessen Klonierung erzeugt (Clontech). Eine zellulare Lokalisierung wurde 24 Stunden nach Transfektion unter Verwendung eines Nikon Diaphora 200 Mikroskops visualisiert. Falls GFP-PGC-1 in COS Zellen exprimiert wird, wird es gänzlich in dem Zellnukleus beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigen, dass PGC-1 nicht nur an PPARγ bindet, sondern ebenso an andere Nukleare Hormonrezeptoren, und daher kann dieses Molekül verwendet werden, um die Funktion dieser zusätzlichen nuklearen Hormonrezeptoren zu modulieren. PGC-1 kann als ein Ziel für ein Durchmustern von Molekülen verwendet werden, welche die Funktion dieser nuklearen Hormonrezeptoren modulieren. Darüber hinaus ist die Tatsache, dass PGC-1 dem Thyroid Hormonrezeptor und dem Retinolsäure-Rezeptor wechselwirkt, bei einer braunen Fettzellen Funktion wichtig, da beide dieser Rezeptoren eine UCP-Expression trankriptional regulieren können.
Beispiel V: PGC-1 wirkt als ein Co-Aktivator mit PPARγ/RXRα und TR, um eine Expression eines Gens unter der Kontrolle von UCP Regulatorelementen zu induzieren.
Um die Transkriptionsaktivität von PGC-1 zu bewerten, wurde ein in vitro transkriptioneller Assay durchgeführt. Von dem UCP-1 Promoter wurde gezeigt, Bindestellen für sowohl PPARγ als auch das TR aufzuweisen (Cassard-Doulcier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:24335-24342; Sears et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16:3410-3419). In diesem Assay wurde der Volllängen Promoter und Verstärker von UCP an das Cat Reportergen verknüpft. RAT IR (eine Rattenfibroblasten Zelllinie, welche für eine Expression des menschlichen Insolinrezeptors transformiert ist) Zellen wurden mit PSV-sport alleine (Kontrolle) transient transfiziert, PPARγ/RXRα, PGC-1 und PPARγ/RXRα/PGC-1 unter Verwendung des Calciumphosphat Verfahrens. Ergebnisse von CAT Assays wurden für eine Transfektionseffizienz durch Co-Transfektion eines β-Galactosidase Reportergens unter der Kontrolle des CMV Promoters kontrolliert. In jedem Fall wurden Zellen mit entweder Dimethylsulfoxid oder einer Kombination von 9-cis Retinolsäure, 8-Br-cAMP und dem synthetischem PPARγ Liganden Pioglitazon (PIO) behandelt. Eine transkriptionelle Aktivität wurde in den Zellen beobachtet, welche mit der Kombination von 9-cis Retinolsäure, 8-Br-cAMP und PIO behandelt wurden und PGC-1 alleine enthielten, Zellen welche PPARγ/RXRα enthielten und Zellen welche PPARγ/RXRα/PGC-1 enthielten. Eine maximale Aktivität wurde in Zellen beobachtet, welche mit der Kombination von 9-cis Retinolsäure, 8-Br-cAMP und PIO behandelt wurden, und PPARγ/RXRα/PGC-1 enthielten. Diese Ergebnisse zeigen, dass PGC-1 als ein positiver transkriptioneller Co-Aktivator von PPARγ/RXRα wirkt.
Um zu bestimmen, welche Induktionsmittel in die transkriptionelle Aktivierung von PGC-1 einbezogen waren, wurden die Zellen individuell behandlet (PIO, der synthetische PPARγ Ligand Troglitazon (TRO), 9-cis Retinolsäure, 8-Br-cAMP) und in Kombination (9-cis Retinolsäure in Kombination mit 8-Br-cAMP) mit verschiedenen Induktionsmitteln. Hinsichtlich der Zellen, welche mit verschiedenen Induktionsmitteln behandelt wurden, wurde gefunden, dass die Stärke der Induktionsmittel wie nachstehend war (von der höchsten zu der niedrigsten): 9-cis Retinolsäure, 8-Br-cAMP, TRO und dann PIO. Die Kombination von 9-cis Retinolsäure und 8-Br-cAMP war stärker bei einer Verstärkung einer transkriptionellen Aktiviät als irgendeiner der einzelnen Induktionsmittel.
Ähnlich dazu induzierte eine TRβ/RXRα Kombination alleine eine sehr geringe transkriptionelle Aktivität, sogar wenn mit einem Ligandencocktail einschließlich T₃ (1 μM) stimuliert wurde. Die Kombination von PGC-1 mit dem TRβ/RXRα Paar induzierte allerdings eine starke Transaktivation, wiederum in einer ligandenabhängigen Art. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, das PGC-1 als ein starker transkriptioneller Co-Aktivator für PPARγ und das TR fungieren kann. Es ist interessant, dass die beste transkriptionelle Reaktion beobachtet wird, falls PPARγ Ligand hinzugegeben wird, trotz der Tatsache, dass das Binden von PGC-1 und PPARγ nicht Liganden abhängig ist. Es ist wahrscheinlich, dass dies von einer gleichzeitigen, Liganden abhängigen Binden bzw. Kuppeln (docking) eines anderen Co-Aktivators, wie beispielsweise SRC-1, CBP oder anderen, herrührt.
Die Rolle verschiedener Hormone und Liganden, welche verwendet werden um eine maximale transkriptionelle Aktivierung mit PPARγ und PGC-1 zu erzielen, wird in 3 gezeigt. Die einzelnen Bestandteile – Troglitazon (trog.), 9-cis-Retinolsäure (9cRA) und 8-Bromo-cyclisches AMP (cAMP) – stimulieren jeweils ein 2- bis 4-fache Zunahme bei einer transkriptionellen Aktrivität. Die Fache Aktivierung wurde mit dem Wert verglichen, der in Zellen beobachtet wurde, welche mit den gleichen Vektoren transfiziert aber nicht mit Ligand behandelt wurden. Die stabilsten Reaktionen wurden allerdings gesehen, falls sie in Kombination verwendet wurden. Die synergistische Wirkung von 9 cis-Retinolsäure und 8-Bromo-cyclischem AMP ist insbesondere auffällig (14-fach), während alle drei Agenzien zusammen eine 18-fache Zunahme über der nicht behandelten Kontrolle verursachen.
Der vorstehend beschriebene transkriptionelle Assay stellt einen nützlichen Assay zum Durchmustern von Verbindungen oder Agenzien dar, welche die Funktion von PGC-1 alleine und/oder PGC-1 in Kombination mit PPARγ/RXRα modulieren können, beispielsweise Stimulieren oder Inhibieren. Basierend auf den in diesem Beispiel berichteten Ergebnissen, umfassen Agenzien, welche wahrscheinlich eine UCP Expression und daher Thermogenese in BAT modulieren, umfassend PGC-1 Moleküle, PPARγ Liganden (beispielsweise Thiazolidinedione, beispielsweise PIO und TRO), Retinoide und adrenerge Agonisten.
Beispiel VI: Identifikation der Domänen, welche die PGC-1-PPARγ Wechselwirkung mediieren
Die Wechselwirkung zwischen nuklearen Rezeptoren und bestimmten Co-Aktivatoren, wie beispielsweise SRC-1 oder CBP, ist ligandenabhängig (Kamai et al., Cell 84 (1996) 403-414) und bezieht ein LXXLL (SEQ ID Nr:3) Motiv in die Co-Aktivatoren und die C-terminale AF-2 Domäne in die Rezeptoren ein (Heery et al., Nature 387 (1997) 733-736; Torchia et al., Nature 387 (1997) 677-684). Um die Domänen zu Identifizieren welche für PGC-1-PPARγ Wechselwirkungen verantwortlich sind, wurden verschiedene C-terminale Deletionen von PGC-1 als Reticulocyt Restriktionsprodukte erzeugt und mit einem FST-PPARγ Fusionsprotein gemischt. Deletionen von PGC-1 wurden unter Verwendung spezifischer Restriktionsstellen in dem PGC-1 hergestellt, wurden unter Verwendung spezifischer Restriktionsstellen in der PGC-1 cDNA kloniert in pBluescript hergestellt. Die nachstehenden Restriktionsenzyme wurden für diese Deletion verwendet: Volllängen XhoI (44-1-797), HaeII (AA-1-675) NcoI (AA 1-503), XbaI (AA 1-403), KpnI (AA 1-338) und StuI (AA 1-292). Diese wurden anschließend in vitro mit einem (³⁵S) methionin Marker translatiert. Ein Mikroliter von jeder in vitro Translationsreaktion wurde mittels SDS-PAGE aufgelöst und autoradiographisch bestimmt.
4 stellt die Eingabe von sowohl dem Volllängen PGC-1 (1-197) als auch der 1-675 Deletion dar, welche an das immobilisierte PPARγ bindet. Das Binden von PGC-1 1-503, welches die SR und RNA Bindedomänen nicht aufweist, ist mäßig auf 18% gesenkt. Ein ähnliches Bindeniveau kann für PGC-1 1-403 und 1-338 gesehen werden, Allerdings verliert PGC-1 1-292, welches immer noch das LXXLL (SEQ ID Nr:3) Motiv enthält, vollständig die Befähigung mit PPARγ wechselzuwirken. Wie in 2A gezeigt enthalten die Reste 292-338 keine verschiedenen Domänen, von welchen bekannt ist eine Protein-Protein Wechselwirkung zu mediieren, obgleich sie sehr reich an Prolinresten ist.
Die meisten der bis heute identifizierten Nuklearen Hormonrezeptor-Co-Aktivatoren wechselwirken mit der C-terminalen AF-2 Domäne, welche für eine Liganden abhängige transkriptionelle Aktivierung verantwortlich ist. Um zu Bestimmen, ob PGC-1 ebenso mit diesem Anteil von PPARγ wechselwirkt wurden mehrere Deletionen von PPARγ als GST Fusionsprotein hergestellte verwendet und mit in vitro translatierten PGC-1 kombiniert. Die 5 zeigt, dass die Aminosäuren 181-505 von PPARγ (dem ursprünglichen in dem Hefe-Zwei-Hybriddurchmusterung verwendeten Fragment) stark mit PGC-1 wechselwirkt, und 23% der Eingabe verringern (pulling down). Andererseits ist eine weitere Deletion von 45 Aminosäuren (228-505) nicht in der Lage Volllängen PGC-1 zu binden. Beide dieser PPARγ Deletionen waren in der Lage SRC-1 zu binden, was anzeigt, dass sie nicht ihre allgemeine Befähigung zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen verloren haben. Diese Daten zeigen, dass PPARγ einen Teil seiner DNA Bindung und Gelenkdomänen für ein Binden von PGC-1 verwendet. Es wechselwirkt offensichtlich nicht durch die C-terminale AF-2 Domäne, welche andere Co-Aktivatoren, wie beispielsweise SRC-1 und CBP, bindet.
Beispiel VII: Transkriptionelle Aktivität und Deletionsanalyse von PGC-1
Um festzustellen, ob PGC-1 seine eigene transkriptionelle Aktivierungsdomäne aufweist oder irgendeine Aktivität umfasst, welche die transkriptionellen Aktivatoreigenschaften der nuklearen Rezeptoren freilegen oder verstärken könnte, wurden eine Anzahl von Fusionsproteinen zwischen Volllängen oder Abschnitten von PGC-1 und der DNA-Bindedomäne (DBD) von GAL4 hergestellt und mittels einer GAL4 Bindezielsequenz, der UAS, transkriptionell analysiert. Eine Transkritption wurde mit einem Reporter Plasmid analysiert, welches 5 Kopien des UAS enthielt, welche an CAT verbunden waren. Transkriptionelle Aktivierungsassays wurden insbesondere wie nachstehend beschrieben durchgeführt. Ein Expressionsplasmid, welches Volllängen PGC-1 enthielt, wurde konstruiert, in dem zuerst die gesamte 3kb cDNA als ein SmaII-XhoI Fragment in SmaI-SalI Stellen von pSV-SPORT (GIBCO-BRL) ligiert wurde. Dies wurde in Zellen mit –CMX Vektor exprimiert zusammen mit einer Kontrollfusion zwischen GAL4 DBD und Volllängen SRC1 der Maus. Die Aktivität, welche durch 4,5 μg des DBD-PGC-1 stimuliert wurde, wurde als 100% gesetzt. Der –3740/+110 bp UCP Promoter wurde bereits beschrieben (Kozak et al (1994) Mol. Cell. Biol. 14:59-67). Rat1 IR Fibroblasten wurden in DMEM kultiviert, welches 10% Cosmic Kälberserum enthielt und bei 80% bis 90% Konfluenz mittels der Calciumphosphat Methode transfiziert. Liganden wurden in einem Vehikel gelöst, welches 0,1% DMSO (9-cis Retinolsäure und Troglitazon) enthielt, oder Wasser (8-Bromo-cAMP). Transfektionen wurden doppelt durchgeführt und mindestens 3 Mal wiederholt. Eine CAT Aktivität wurde wie in Kim und Spiegelmann ((1996) Genes Dev. 10:1096-1107) beschrieben überprüft.
Für GAL4 Fusionskonstrukte wurde über PCR erzeugtes Volllängen PGC-1 im Rahmen in SalI-EcoRV Stellen von dem pCMX-GAL4 Plasmid kloniert. Volllängen SRC-1 der Maus wurde kloniert in die SmaI Stelle von RSV.GAL4.COS Zellen wurden auf die gleiche Art wie RatI IR Fibroblasten transfiziert und der Reporter war das 5xUASg-CAT.
Wie in 3B gezeigt, kann PGC-1 eine Transkription bereits aktivieren, falls an DNA durch den GAL4 DBD gebunden. Für Vergleichszwecke werden die Ergebnisse gezeigt, welche durch Fusion des GAL4 DBD mit einem anderen Co-Aktivator von nuklearen Rezeptoren erhalten wurden. Daher benötigt PGC-1 nicht absolut ein Binden an einen nuklearen Rezeptor, um eine transkriptionelle Aktivierungsfunktion zu zeigen; es ist wahrscheinlich, dass seine Wechselwirkung mit diesen Rezeptoren in erster Linie dazu dient, PGC-1 zu geeigneten DNA Stellen zu befördern.
Um weiterhin die Stelle der transkriptionellen Aktivierungsdomäne von PGC-1 zu bestimmen, wurde eine Anzahl von Deletionsmutanten, welche an eine GAL4 Bindedomäne fusioniert waren, auf die Induktion eines Luciferase Reportergens, wie vorstehend beschrieben, getestet. Die nachstehenden Konstrukte wurden getestet: Kontrolle GAL-4 alleine; GAL4-PGC-1, GAL4-Aminosäuren 1-65 von PGC-1; GAL4 Aminosäuren 1-125 von PGC-1, GAL4-Aminosäuren 1-170 von PGC-1, GAL4-Aminosäuren 1-350 von PGC-1, GAL4-Aminosäuren 1-550 von PGC-1, GAL4-Aminosäuren 1-650 von PGC-1, GAL4-Aminosäuren 1-650 von PGC-1 und GAL4 Aminosäuren 170-797 von PGC-1. Die Ergebnisse werden nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Transkriptionelle Aktivität von PGC-1-GAL-4 Konstrukten
Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigen GAL4-PGC-1 Konstrukte, welche den N-terminalen Bereich des Moleküls enthielten, eine höhere transkriptionelle Aktivität als das Volllängen Molekül. Das Konstrukt GAL4 170-797 zeigte keine nachweisbare transkriptionelle Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass die transkriptionelle Aktivierungsdomäne von PGC-1 sich an dem N-terminalen Bereich des Moleküls befindet und insbesondere, bei den Aminosäuren 1-170 von PGC-1. Die Abnahme bei einer transkriptionellen Aktivität, welche beobachtet wird, falls C-terminale Aminosäurereste eingefügt wurden (beispielsweise Vergleichen mit der transkriptionellen Aktivität von GAL4 1-125 und dem Volllängen Molekül) legt nahe, dass diese C-terminalen Reste die transkriptionelle Aktivität der N-terminalen Domäne durch beispielsweise Maskieren dieser Domäne oder durch wechselwirken mit anderen Proteinen inhibieren können, welche die Aktivität dieser Domäne maskieren oder anderweitig entgegenwirken können.
Der vorstehend beschrieben Assay und die Konstrukte stellen einen nützlichen Assay zum Durchmustern von Verbindungen oder Agenzien bereit, welche die Funktion von PGC-1 modulieren, beispielsweise stimulieren oder inhibieren, können. Insbesondere bevorzugte Verbindungen oder ein Agens umfassen Aktivatoren und PGC-1, beispielsweise Agenzien, welche den inhibitorischen Effekt des C-terminalen Abschnitts des Moleküls entgegenwirken. Diese Verbindungen oder Agenzien können bei einer Modulierung einer Thermogenese von Nutzen sein.
Beispiel VIII: Rolle der Proteinkinase A bei einer Modulierung einer PGC-1 Aktivität
Expression von UCP Genen ist hoch sensitiv gegenüber cAMP. Eine Analyse der PGC-1 Sequenz zeigte drei Konsensus Stellen für eine Phosphorylierung durch eine Proteinkinase A (2A und 2B). Dieses Ergebnis legt eine mögliche Rolle dieser Kinase bei einer Regulation der Aktivität von PGC-1 nahe, welche wiederum eine UCP Genexpression modifizieren würde. Um diese Möglichkeit anzusprechen, kann eine Stellen-gerichtete Mutagenese durchgeführt werden, um diese Phosphorylierungsstellen zu entfernen. Beispielsweise können die Aminosäuren 373-376 von SEQ ID Nr:2 mittels herkömmlicher Protokolle mutiert werden. Die transkriptionelle Aktivität der erhaltenen Mutanten kann beispielsweise in COS Zellen oder HeLa Zellen, welche ein Reportergen tragen, beispielsweise ein CAT Gen unter der Kontrolle eines UCP Promoters, getestet werden.
Beispiel IX: Ectopische Expression von PGC-1 induziert molekulare Bestandteile adaptiver Thermogenese
Um direkt die Befähigung von PGC-1 zu untersuchen, die Gene adoptiver Thermogenese zu regulieren, wurden retrovirale Vektoren verwendet, um dieses Protein in weißen Fett Vorläuferzellen zu exprimieren, und 3T3-F442A Präfettzellen wurden anschließend zur Differenzierung stimuliert. In Kürze wurde der PGC-1 virale Expressionsvektor (pBabe-PGC-1) durch Ligation des BamHI-XhoI Fragments von pBluescript-PGC-1 Plasmid in BamHI/SalI Stellen von pBabe-puro legiert. Nach einer Arzneimittelselektion wurden viral infizierte 3T3F442A-PGC-1 und 3T3F441-Vektorzellenlinien zur Konfluenz in DMEM mit 10% BCS wachsen gelassen. Eine Differenzierung dieser Zellen wurde durch ihre Kultivierung in DMEM Insulin initiiert. Zellen wurden alle 2 Tage mit diesem Medium wieder gefüttert. Spezifische Zellen wurden in DMEM mit 10% CCS zur Confluenz wachsen gelassen. Spezifische Zellen wurden anschließend in DMEM mit 10% CCS zur Konfluenz behandelt. Diese Zellen wurden anschließend mit 1 μM Dexamethason, 0,5 mM Methylisobutylxanthin, 125 μM Indomethacin, 17 nM Insulin und 1 nM T₃ für 48 Stunden behandelt um eine Differenzierung zu induzieren. Zellen wurden anschließend in DMEM gehalten, welches 10% CCS, 17 nM Insulin und 1 nM T₃ enthielt, und alle 2 Tage wieder aufgefüllt wurde. Nach diesen Behandlungsschritten wurde Gesamt-RNA isoliert und analysiert.
Um eine UCP-1 Expression zu induzieren, wurden 1 μM 8-Bromo-cAMP und 1 mM 9-cis-Retinolsäure zu dem Medium hinzugegeben und Gesamt-RNA wurde von den Zellen 6 Stunden später extrahiert. Northernblot Analyse mit einer PGC-1 Sonde zeigte, dass PGC-1 mRNA in diesem weißen Fettzellen gerade noch nachweisbar war, welche mit leeren Vektoren infiziert waren, allerdings höher exprimiert in Zellen war, welche mit den Viren infiziert waren, die PGC-1 cDNA enthielten. Die Expression dieser mRNA in den kultivierten Zellen betrug ungefähr 6% von dem, was in braunem Fett von Kälte ausgesetzten Mäusen beobachtet wurde. mRNA für UCP-1, dem klassischen Marker von braunen Fettzellen, welcher in dem Zellnucleus codiert ist, ist in den Kontroll 3T3-F442A Zellen kaum nachweisbar, und ist allerdings in den PGC-1 exprimierenden Zellen signifikant induziert. mRNA für ATP Synthesase, einem Schlüsselmitochondrien Protein, welches in eine oxidative Phosphorylierung einbezogen ist, und ebenso in dem Nucleus codiert ist, ist ebenso in den PGC-1 exprimierenden Zellen erhöht. Das mitochondrielle Atmungsenzym Cytochrom C-Oxidase Untereinheiten COX II und IV sind jeweils in dem mitochondriellen und nuklearen Genom codiert. Beide dieser mRNAs sind 2- bis 3-fach in den Zellen erhöht, welche ectopisch PGC-1 exprimieren. Eine Expression von aP2, einem nicht mit Thermogenese verbundenen weißen und braunen Fettzellengen, und 36B4, einem ribosomalen Protein, sind als Lastkontrolle (loading control) gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass PGC-1 die Expression von mehreren Schlüsselgenen mitochondrieller Funktion und adaptiver Thermogenese stimulieren kann selbst wenn bei Niveaus weit unterhalb jener exprimiert, welche in Kälte ausgesetzten Tieren beobachtet werden.
Die Befähigung von PGC-1 die Expression von mRNA für ein Protein (COX-II) zu bewirken, welches in dem mitochondriellen Genom codiert ist, legt nahe, dass PGC-1 die Biogenese von Mitochondrien an sich bewirken könnte. Änderungen in dem zellularen Gehalt von mitochondrieller DNA wurden als ein einfacher biochemischer Assay für eine mitochondrielle Prolifertaion verwendet (Martin et al., Biochem. J. 308 (1995) 749-742; Klingenspor et al., Biochem. J. 316 (1996) 607-613). Southern Blot Analyse mitochondrieller DNA wurde durchgeführt, um diese Möglichkeit zu untersuchen. 3T3-F442A Southernblots wurden durch Isolieren und Verarbeiten genomischer DNA wie in Maniatis et al. beschrieben durchgeführt ((1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press)). 3T3-F442A Zellen wurden wie vorstehend beschrieben differenziert. Gesamt Zell DNA wurde isoliert und mit NcoI verdaut. Zehn Mikrogramm DNA wurde elektrophoretisch untersucht und der Southernblot wurde unter Verwendung von COX-II cDNA in eine Sonde für mitochondrielle DNA hybridisiert.
Southernblot Analyse von mitochondrieller genomischer DNA zeigte, das PGC-1 exprimierende Zellen den doppelten mitochondriellen DNA Gehalt im Vergleich zu Kontrollzellen aufweisen. Die gleichen Blots wurden ebenso mit cDNA für 36B4, einem in dem Nucleus codierten ribosomalen Protein, untersucht. Der Blot wurde anschließend gestrippt und mit dem nuklearen Gen 3664 hybridisiert. Diese Ergebnisse zeigen, das eine ectopische PGC-1 Expression eine Zunahme bei mitochondrieller DNA simulieren kann, was eine erhöhte Biogenese von Mitochondrien anzeigt.
Beispiel X: Chronische Behandlung von PGC-1 infizierten Zellen erhöht Sauerstoffverbrauch
Um eine physiologische Rolle von PGC-1 bei einem Mediieren einer Thermogenese zu bestimmen, wurden unter Verwendung von 3T3-F442A Präfettzellen, welche mit PGC-1 exprimierenden retroviralen Vektoren wie vorstehend beschrieben infiziert waren, Sauerstoffverbrauchsassays durchgeführt. Die Wirksamkeit der Infektion ist auf 25% bis 30% der Zellen abgeschätzt. Sauerstoffverbrauchsassays wurden wie in Ludwik, J. et al., J. Biochemistry 256 (24) (1981) 12840-12848 und Hermesh, O., J. Biochemistry 273(7) (1998) 3937-3942 beschrieben durchgeführt. Eine Behandlung dieser Zellen mit 1 μM 8-Bromo-cAMP und 1 mM 9-cis-Retinolsäure für 6 Stunden führte zu einer 100% Zunahme bei einem Sauerstoffverbrauch durch diese Zellen (6). Die in diesen Zellen nachgewiesene Zunahme bei einem Sauerstoffverbrauch wird wahrscheinlich durch eine Zunahme bei der Aktivität und/oder Expression von mitochondriellen nicht bindenden (uncoupling) Proteinen (UCPs) oder ähnlichen Proteinen verursacht, welche einen Protonen Transport erleichtern können.
Diese Versuche zeigen, PGC-1 eine thermogenetische Antwort in vivo mediieren kann, wodurch die Induktion mitochondrieller DNA und Genexpression auf eine physiologische Reaktion direkt verknüpft wird. Die physiologische Funktion von PGC-1 kann weiterhin in Geweben charakterisiert werden, von welchen bekannt ist hohe Niveaus dieses Moleküls zu exprimieren, wie beispielsweise Muskel. Beispielsweise können Myoblastzellen der Maus, welche zu einer Differenzierung in Myotube, wie beispielsweise C2-C12 Zellen, induziert werden können, mit einem PGC-1 exprimierenden Retrovirus infiziert werden und unter den vorstehenden Bedingungen getestet werden.
Beispiel XI: PGC-1 ist ein einzigartiger Nuklearen Rezeptor Co-Aktivator
Die hierin gezeigten Ergebnisse zeigen, das PGC-1 unter anderen Nuklearen Rezeptor Co-Aktivatoren ungewöhnlich ist, so dass eine Expression hinsichtlich sowohl einer Gewebeselektivität als auch des physiologischen Zustands des Tieres drastisch reguliert ist. Die Expression in PGC-1 in BAT aber nicht in WAT unterscheidet es von den meisten bekannten transkriptionellen Bestandteilen in diesen Geweben und seine Induktion durch Kälte ist sogar drastischer als es für UCP-1 beobachtet wurde. PGC-1 ist ebenso von den bekannten Co-Aktivatoren verschieden, so dass es scheint, verschiedene Sequenzmotive für ein Protein-Protein Binden zu verwenden, auf beiden Seiten des Rezeptor Co-Aktivator Paares. Beinahe alle der bekannten Co-Aktivatoren und Corepressoren Verwenden LXXLL Sequenzen, um bei der Ligand regulierten Helix 12 in der Carboxyterminalen AF-2 Domäne zu Binden (Heery et al., Nature 387 (1997) 733-736; Torchia et al., Nature 387 (1997) 677-684). Im Gegensatz dazu wird in PGC-1 eine Domäne verwendet, welche reich an Prolin Resten zum Binden eines Bereichs ist, welcher den DNA Binde- und Gelenkbereich von PPARγ überlappt. Für PPARγ öffnet dies die Möglichkeit, dass PGC-1 nicht ein alternativer Co-Aktivator zu einem oder mehreren der Liganden gesteuerten Co-Aktivatoren ist, sondern eher zusammen mit diesen Proteinen binden kann, um einen größeren makromolekularen Komplex zu ergeben. Andererseits wird ein Liganden abhängiges Binden mit einigen anderen Rezeptoren, wie beispielsweise dem Retinolsäure Rezeptor, dem Östrogen Rezeptor ud zu einem gewissen Grad dem Thyroid Rezeptor, gesehen. Da PGC-1 eine LXXLL (SEQ ID Nr:3) Sequenz aufweist, ein Motiv von den in mehreren Zusammenhängen gezeigt wurde, sowohl notwendig als auch ausreichend für ein Ligand abhängiges Rezeptor Binden zu sein, ist es durchaus möglich, dass das Binden von PGC-1 an diese Rezeptoren von dieser Sequenz und den Rezeptor AF-2 Domänen abhängen wird.
Es ist nun klar, dass die meisten der Co-Aktivatoren oder Corepressoren, welche an Rezeptoren bei AF-2 Domänen binden, entweder Histon-Acetyltransferase oder Histondeacetylase Aktivitäten tragen (Pazin and Kadonaga, Cell 89 (1997) 325-328). Diese Aktivitäten können zu bestimmten Co-Aktivatoren, wie beispielsweise CBP und SRC-1, intrinsisch sein (Bannister and Kouzarides, Nature 384 (1996) 641-643; Spencer et al., Nature 389 (1997) 194-198) oder in Proteinen bestehen, welche mit Corepressoren Komplexe bilden, wie durch den Komplex zwischen SMRT und Histondeacetylase von Säugern gezeigt wird (Nagy et al., Cell 89 (1997) 373-380; Torchia et al., Nature 387 (1997) 677-684). Basierend auf primären Sequenzdaten enthält PGC-1 keine Motive, welche eine Histonacetylase oder Deacetylase Aktivität nahe legen würden. Es weist ebenso keine signifikanten Sequenzhomologien mit irgendeinem der bekannten Rezeptor Co-Aktivatoren oder Corepressoren auf. Es kann nennenswert sein, dass PGC-1 gepaarte SR und RNA-Bindedomänen aufweist, welche in einer Anzahl von Proteinen einschließlich mehreren identifiziert wurden, welche an die Regulator Carbody terminale Domäne (CTD) der RNA Polymerase II Binden (Yurvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 6975-6980). Diese hierin gezeigten Ergebnisse könnten ebenso durch ein PGC-1 erklärt werden, welches einen Genrepressionsmechanismus erleichtert. Von dem Gelenkbereich von zumindest einem nuklearen Rezeptor (TR) wurde gezeigt in ein Binden eines Corepressors einbezogen zu sein (N-CoR; Horlein et al., Nature 377 (1995) 397-404). Daher kann eine PGC-1 Wirkung darin liegen, Transkription durch Interferenz mit Corepressor Binden zu dereprimieren.
Beispiel XII: Rolle von PGC-1 in adaptiver Thermogenese
Adaptive Thermogenese betrifft eine Komponente eines Energieverbrauchs, welche von einer physischen Aktivität getrennt ist und welche als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen erhöht werden kann, am meisten zu bemerken sind hierbei Aussetzen gegenüber Kälte und Überfüttern (Himms-Hagen, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 208 (1989) 159-169). Es besteht ein beträchtliches Interesse an diesem Subjekt aufgrund seiner potenziellen Rollen bei sowohl der Pathogenese als auch Therapie von menschlicher Fettsucht.
Eine Rolle für PGC-1 bei adaptiver Thermogenese wird zuerst durch seine Verbindung mit den Schlüsselgeweben und Hormonen angezeigt, die in diesem Prozess impliziert sind. Die hierin gezeigten Ergebnisse legen eine insbesonders wichtige Rolle für Skelettmuskel und braunes Fett nahe. PGC-1 wird durch Kälteaussetzung in sowohl Muskel als auch braunem Fett aber nicht in anderen Geweben induziert. Die thermogenetischen und Anti-Fettsucht Eigenschaften von braunem Fett in Nagern sind schlüssig fundiert (Himms-Hagen, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 208 (1995) 159-169), wobei aber die Rolle von BAT in Menschen weniger klar ist, aufgrund der Tatsache, dass erwachsene Menschen und andere große Säuger nicht gut festgelegte braune Fettdepots aufweisen. Die Expression von UCP in den weißen Fett Depots von Erwachsenen legt nahe, dass braune Fettzellen in Depots eingefügt werden können, welche weiß erscheinen und bei adrenerger Stimulation ergänzt werden können (Garruti und Ricquier, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 16 (1992) 383-390).
Hinsichtlich Hormonen scheint Thyroid Hormon und β-adrenerge Agonisten die am wichtigsten Rollen bei sowohl Kälte als auch Diät induzierter Thermogenese in Muskel und braunem Fett zu spielen (Himms-Hagen, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 208 (1989) 259-269; Cannon and Nedergaard, Biochem. Soc. Trans. 24 (1996) 407-412). β-adrenerge Agonisten scheinen PGC-1 Funktion auf zumindest zwei verschiedenen Wegen zu bewirken. Zuerst können sie eine PGC-1 Expression induzieren. Zweitens, erhöht cyclisches AMP (der intrazelluläre Mediator einer β-adrenergen Rezeptor Aktivität) die transkriptionelle Aktiviät, welche durch PGC-1 mediiert wird, falls eine Expression ectopisch, wie in 3B gezeigt, getrieben ist. Während die molekulare Grundlage davon nicht bekannt ist, legt die Anwesenheit der drei Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase A nahe, dass das Protein durch diesen Weg posttranslational aktiviert werden kann. Die thermogenetischen Effekte von Thyroid Hormon und seinen Rezeptoren sind gut bekannt. Eine der deutlichsten Wirkungen von erhöhten Thyroid Hormon Niveaus liegt in der Stimulierung mitochondrieller Atmungsraten in Skelettmuskel, braunem Fett, Herzen und Niere. Abnormal geringe Atmungsraten, charakteristisch für ein hypothyroiden Zustand, können durch Erhöhen von Thyroid Hormonniveaus erhöht werden (Pillar und Seitz Eur. J. Endocrinol. 135 (1997) 231-239). Basierend auf diesen Geweben, wo es exprimiert ist und seiner Befähigung das TR zu coaktivieren, scheint PGC-1 ein sehr guter Kandidat zu sein, einige dieser Wirkungen zu mediieren.
Hinweise in jüngerer Zeit haben ebenso interessante Wirkungen der TZDs bei einer Thermogenese nahe gelegt. Diese PPARγ Liganden können Energieverbrauch erhöhen, falls sie systemisch an Nager verabreicht werden, wahrscheinlich aufgrund einer erhöhten Bildung von braunem Fett und einer Zunahme bei einer UCP-1 Genexpression. Diese Wirkungen wurden ebenso in kultivierten Zellen beobachtet (Foellmi-Adams et al., Biochem. Pharmacol. 52 (1996) 693-701; Tai et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 29909-29914. Die Befähigung von PGC-1 die Funktion von PPARγ auf den UCP-1 Promoter zu coaktivieren und mutmaßlich andere Promotoren in thermogenetischen Wegen, kann eine gewisse Erklärung für diese Wirkungen bereitstellen.
Zusätzlich zu diesen vorstehend beschriebenen Zusammenhängen, zeigen hierin beschriebene ectopische Expressionsversuch direkter, dass PGC-1 Bestandteile von Thermogenese regulieren kann. Auf einem zellularen und molekularen Niveau besteht adaptive Thermogenese aus zumindest drei getrennten Prozessen: der Biogenese von Mitochondrien, der Expression der mitochondriellen Enzyme der Atmungskette und der Expression von spezifischen nicht bindenden Proteinen. Es gibt nun drei bekannte Mitglieder der UCP Genfamilie; UCP-1, welches ausschließlich in braunem Fett exprimiert wird; UCP-2, welches breit exprimiert ist, und UCP-3, welches hauptsächlich im Skelettmuskel und braunem Fett exprimiert wird. In Abhängigkeit der Zeitdauer und schwere einer gegebenen physiologischen Herausforderung kann einer oder mehrere dieser Gesichtspunkte einer Thermogenese in Muskel, BAT oder anderen Geweben beeinflusst werden.
Die hierin beschriebene retrovirale Expression von PGC-1 wurde unter Verwendung weißer Fettzellen durchgeführt. Dieser Zelltyp wurde ausgewählt, da er eine geringe endogene PGC-1 Expression aufweist und bekannt ist, vergleichsweise geringe Anzahlen von Mitochondrien aufzuweisen und eine geringe Expression von UCP-1 oder UCP-3. Obgleich wir nur in der Lage waren, einen vergleichsweise geringes Niveau an PGC-1 mRNA Expression zu erzielen (6% von dem was in Kälte induzierten BAT beobachtet wurde), ist es klar, das mehrere molekulare Bestandteile des adaptiven Thermogenese-Systems geändert sind. Zuerst wurde eine Expression des UCP-1 Gens von dem beinahe nicht nachweisbaren Niveau angeschaltet, welches für diese weißen Zellen charakteristisch ist. Zweitens sind mehrere mitochondrielle Gene der Atmungskette signifikant erhöht, welche für gewöhnlich in diesen Zellen, wie beispielsweise ATP Synthetase, COX-II und COX-IV, für gewöhnlich exprimiert werden. Schließlich ist der mitochondrielle Gehalt verdoppelt, wie durch die Zunahme mitochondrieller DNA pro Einheit von Gesamt Zell DNA gezeigt wird.
Der Mechanismus durch welchen PGC-1 mitochondrielle Vorgänge regulieren kann, welche mit adaptiver Thermogenese verbunden sind, kann wie folgend sein. Für Gene, wie beispielsweise UCP-1, welche in dem Nucleus codiert sind und auf PPAR, TR oder andere Nukleare Rezeptoren reagieren, könnte PGC-1 direkt als ein Co-Aktivator wirken, um Transkriptionsraten zu erhöhen. Für Gene, welche in dem miochondriellen Genom (wie beispielsweise COX-II) codiert sind könnte PGC-1 direkt oder indirekt wirken. Von bestimmten Genen in den Mitochondrien wurde gezeigt, funktionelle Thyorid Reaktionselemente aufzuweisen (TREs; Pillar and Seitz (1997) Eur. J. Endocrinol. 135:231-239). Während PGC-1 hauptsächlich in dem Nucleus beobachtet wird, werden ein geringer Prozentsatz des TR und PGC-1 in die Mitochondrien transportiert und fungieren direkt an diesen Stellen. Ähnlich dazu, hinsichtlich einer mitochondriellen DNA Replikation, ist die D Schleife des mitochondriellen Genoms eine Stelle erheblicher Strang Replikation und enthält eine TRE-DR2 Sequenz (Wrutniak et al., (1995) J. Biol. Chem. 270:16347-16354), was nahe legt, dass das TR und PGC-1 hier direkt wirken könnten. Andererseits könnten PGC-1 und Nukleare Rezeptoren die Expression anderer Nuklearer Faktoren regulieren, wie beispielsweise NRF oder mitochondriellem Faktor A, von welchen gezeigt wurde in den Mitochondrien zu fungieren, um eine Gentranskription und/oder DNA Replikation zu stimulieren (Pillar and Seitz, (1997) Eur. J. Endocrinol. 135:231-239).
Äquivalente
Dem Fachmann werden viele Äquivalente der spezifischen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung ersichtlich sein oder er wird in der Lage sein unter Verwendung von nicht mehr als herkömmlichem Experimentierens sie festzustellen.
Sequenzliste

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nukleinsäuremolekül, welches die Nukleinsäuresequenz der SEQ.ID.NR:1 umfasst, (b) einem Nukleinsäuremolekül, welches eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Protein oder einen Teil davon codiert, worin das Protein oder der Teil davon eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 60% identisch ist zu der gesamten Aminosäuresequenz der SEQ.ID.NR.2, so dass das Protein oder der Teil davon die Fähigkeit beibehält, eine der folgenden biologischen Aktivitäten zu modulieren: UCP-Expression, Thermogenese in Fettzellen, Differenzierung von Fettzellen und Insulin-Sensitivität von Fettzellen, (c) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 500, in Länge zusammenhängenden Nukleotiden, welches in 6 X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45 °C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 X SSC, 0.1% SDS bei 50-65 °C an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das die Nukleotidsequenz der SEQ.ID.NR:1 umfasst, worin das Nukleinsäuremolekül ein Protein codiert, das die Fähigkeit beibehält, eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten zu modulieren: UCP-Expression, Thermogenese in Fettzellen, Differenzierung von Fettzellen und Insulin-Sensitivität von Fettzellen, (d) einem Nukleinsäuremolekül, welche eine Nukleotidsequenz umfasst, die zu mindestens 60% identisch ist zu der gesamten Nukleotidsequenz der SEQ.ID.NR:1, worin das Nukleinsäuremolekül ein Protein codiert, das die Fähigkeit beibehält, eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten zu modulieren: UCP-Expression, Thermogenese in Fettzellen, Differenzierung von Fettzellen und Insulin-Sensitivität von Fettzellen, (e) einem Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz der SEQ.ID.NR:2 umfasst, (f) einem Nukleinsäuremolekül, welches antisense zu SEQ.ID.NO.1 über die gesamte Länge der Sequenz ist, und (g) einem Nukleinsäuremolekül mit mindestens 500 in Länge zusammenhängenden Nukleotiden, welches antisense zu der Nukleotidsequenz der SEQ.ID.NR:1 ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin der Teil des Proteins eine oder mehrere der folgenden Domänen oder Motive aufweist: a) eine cAMP-Phosphorylierungs-Stelle, b) eine Tyrosin-Phosphorylierungs-Stelle, c) ein RNA-Bindungsmotiv, d) eine Serin-Arginin reiche Domäne, und e) ein LXXLL-Motiv.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, weiter umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein heterologes Polypeptid codiert.
Vektor, welcher ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-3 enthält.
Wirtszelle, welche einen Vektor nach Anspruch 4 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches die Aminosäuresequenz der SEQ.ID.NR:2 aufweist, umfassend, Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 5 in einem geeigneten Medium, bis das Protein hergestellt ist.
Isoliertes Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Protein, welches die Aminosäuresequenz der SEQ.ID.NR:2 umfasst oder einen Teil davon, welcher eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten modulieren kann: UCP-Expression, Thermogenese in Fettzellen, Differenzierung von Fettzellen und Insulin-Sensitivität von Fettzellen, (b) einem Protein oder einem Teil davon, welches/welcher eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zu mindestens 60% identisch ist zu der gesamten Länge der SEQ.ID.NR:2, so dass das Protein oder der Teil davon die Fähigkeit beibehält, eine oder mehrere der folgenden biologischen Aktivitäten zu modulieren: UCP-Expression, Thermogenese in Fettzellen, Differenzierung von Fettzellen und Insulin-Sensitivität von Fettzellen, (c) einem Protein, welches die Aminosäuresequenz der SEQ.ID.NR:2 umfasst, (d) einem Protein, welches zu mindestens 60% identisch ist zu der Aminosäuresequenz der SEQ.ID.NR:2, und (e) einem Protein, welches von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das die Nukleotidsequenz der SEQ.ID.NR:1 umfasst.
Isoliertes Protein oder Teil davon nach Anspruch 7, worin der Teil des Proteins eine oder mehrere der folgenden Domänen oder Motive umfasst: a) eine cAMP-Phosphorylierungs-Stelle, b) eine Tyrosin-Phosphorylierungs-Stelle, c) ein RNA-Bindungsmotiv, d) eine Serin-Arginin reiche Domäne, und e) ein LXXLL-Motiv.
Fusionsprotein, welches eine Aminosäuresequenz eines Proteins nach Anspruch 7 umfasst, das an ein heterologes Protein operativ gebunden ist.
Antigenes Peptid, welches mindestens 8 Aminosäurereste der in SEQ.ID.NR:2 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst, wobei das Peptid ein Epitop aufweist, so dass ein gegen das Peptid hergestellter Antikörper mit dem Protein der SEQ.ID.NR:2 einen spezifischen Immunkomplex bildet.
Antikörper, der spezifisch an ein Protein oder einen Teil davon, welches/welcher die Aminosäuresequenz der SEQ.ID.NR:2 umfasst, bindet.
In vitro Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit des in der SEQ.ID.NR:1 gezeigten Nukleinsäuremoleküls oder des in der SEQ.ID.NR:2 gezeigten Proteins in einer biologischen Probe, welches umfasst, Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit einem Mittel, mit dem das Protein oder das Nukleinsäuremolekül nachgewiesen werden kann, worin das Mittel ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-3, ist, ein Protein oder ein Teil davon nach einem der Ansprüche 7-9, oder ein Antikörper nach Anspruch 11.
Kit zum Nachweis der Anwesenheit des Nukleinsäuremoleküls in SEQ.ID.NR:1, oder des Proteins in SEQ.ID.NR:2, in einer biologischen Probe, welcher umfasst, ein markiertes oder markierbares Mittel, mir dem das Protein oder das Nukleinsäuremolekül in einer biologischen Probe nachgewiesen werden kann, worin das Mittel ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-3, ein Protein oder ein Teil davon nach einem der Ansprüche 7-9, oder ein Antikörper nach Anspruch 11 ist, Mittel zur Bestimmung der Menge des Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls in der Probe, und Mittel zum Vergleichen der Menge des Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls in der Probe mit einem Standard.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welches die Expression des Nukleinsäuremoleküls in SEQ.ID.NR:1 oder die Proteinaktivität des Proteins in SEQ.ID.NR:2 moduliert, welches umfasst, Untersuchen der Fähigkeit der Verbindung oder des Mittels die Expression der Nukleinsäure oder die Aktivität des Proteins zu modulieren, wodurch eine Verbindung identifiziert wird, welche die Expression des Nukleinsäuremolekül in SEQ.ID.NR:1 oder die Proteinaktivität des Proteins in SEQ.ID.NR:2 moduliert.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welches das Protein in SEQ.ID.NR:2 bindet, welches umfasst, Inkontaktbringen des Proteins mit der Verbindung unter Bedingungen, welche Bindung der Verbindung an das Protein unter Bildung eines Komplexes ermöglichen, und Nachweisen der Bildung eines Komplexes des Proteins und der Verbindung, wobei die Fähigkeit der Verbindung das Protein zu binden durch die Anwesenheit der Verbindung in dem Komplex angezeigt wird.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Interaktion des Proteins in SEQ.ID.NR:2 mit einem Zielmolekül inhibiert, welches umfasst, Inkontaktbringen, in der Anwesenheit der Verbindung, des Proteins mit dem Zielmolekül unter Bedingungen, welche Bindung des Zielmoleküls an das Protein unter Bildung eines Komplexes ermöglichen, und Nachweisen der Bildung eines Komplexes des Proteins mit dem Zielmolekül, wobei die Fähigkeit der Verbindung zur Inhibierung der Interaktion des Proteins mit dem Zielmolekül durch die Abnahme an Komplexbildung im Vergleich zu der Menge an in der Abwesenheit der Verbindung gebildetem Komplex angezeigt wird.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-3, Vektor nach Anspruch 4, Protein oder ein Teil davon nach einem der Ansprüche 7-9, Peptid nach Anspruch 10, oder Antikörper nach Anspruch 11 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1-3, eines Vektors nach Anspruch 4, eines Proteins oder Teils davon nach einem der Ansprüche 7-9, eines Peptids nach Anspruch 10, oder eines Antikörpers nach Anspruch 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Gewichtsstörung oder einer mit einer nicht-ausreichenden Insulin-Aktivität assoziierten Störung.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Gewichtsstörung ausgewählt ist aus der Gruppe: Fettsucht, Auszehrung oder Anorexie.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die mit nicht-ausreichender Insulin-Aktivität assoziierte Störung Diabetes ist.