JP2002502251A - ＰＧＣ−１、新規な褐色脂肪ＰＰＡＲ▲下γ▼コアクチベーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、例えば、脂肪細胞、例えば褐色脂肪細胞における熱発生及び脂肪細胞化を初めとする様々な脂肪細胞関連活性を調節できるタンパク質をコードする、ＰＧＣ−１核酸分子と称する、単離された核酸分子を提供する。また、本発明はアンチセンス核酸分子、ＰＧＣ−１核酸分子を含有する組み換え発現ベクター、発現ベクターが導入されている宿主細胞及びＰＧＣ−１遺伝子が導入されるかまたは破壊されているヒト以外のトランスジェニック動物も提供する。本発明はなおさらに単離されたＰＧＣ−１タンパク質、融合タンパク質、抗原性ペプチド及び抗−ＰＧＣ−１抗体を提供する。本発明の組成物を利用する診断、スクリーニング及び治療方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＰＧＣ−１、新規な褐色脂肪ＰＰＡＲ_γコアクチベーター発明の背景 脊椎動物は２つの異なる型の脂肪組織：白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪 組織（ＢＡＴ）を保有する。ＷＡＴは動物の栄養補給要求により脂肪を貯蔵し、 そして放出する。ＢＡＴは脂肪を燃焼させ、熱（すなわち、ふるえのない熱（ｎ ｏｎｓｈｉｖｅｒｉｎｇ ｈｅａｔ））としてエネルギーを放出する。ＢＡＴの 独特な熱発生特性は褐色脂肪細胞特異的遺伝子産物の脱共役タンパク質（ＵＣＰ ）を含有する特殊化したミトコンドリアの活性を反映する。Ｓｅａｒｓ、Ｉ．Ｂ ．等（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（７）：３４１０−３４１ ９。ＵＣＰはＡＴＰ合成を伴わずに脂肪酸酸化から形成されたプロトン勾配を消 滅させることにより酸化的リン酸化から呼吸を切り離すミトコンドリアのプロト ン輸送体である（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ、Ｄ．及びＬｏｃｋｅ、Ｒ．（１９８４）Ｐ ｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ ．６４：１−６４）。 ＵＣＰ発現は、低温露出及び過剰のカロリー摂取のような生理的シグナルに応 答して、主に交感神経系により厳しく調節される（Ｇｉｒａｒｄｉｅｒ、Ｌ．及 びＳｅｙｄｏｕｘ、Ｊ．（１９８６）「Ｎｅｕｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｂｒｏｗｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ」Ｐ．Ｔｒａｙｈｕｒｎ及びＤ．Ｎ ｉｃｈｏｌｓ（編集）Ｂｒｏｗｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ（Ａｒｎｏｌ ｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８６）中、ｐｐ．１２２−１５１）。局所ニューロンか ら放出されたノルエピネフリンは褐色脂肪細胞細胞膜上のβ−アドレナリン受容 体と相互作用し、細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベルの増加を引き起 こす （Ｓｅａｒｓ、Ｉ．Ｂ．等（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（７ ）：３４１０−３４１９）。増加したｃＡＭＰに応答して高められたＢＡＴ熱発 生を引き起こす事象のカスケードにおいて、ＵＣＰ遺伝子の増加したレベルの転 写は重要な要素である（Ｋｏｐｅｃｋｙ、Ｊ．等（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ ．２６５：２２２０４−２２２０９；Ｒｅｈｎｍａｒｋ、Ｓ．Ｍ．等（１ ９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６４６４−１６４７１；Ｒｉｃｑ ｕｉｒｅｒ、Ｄ．Ｆ．等（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３９ ０５−１３９１０）。ＢＡＴ熱発生は（１）低温に応答して熱発生を増やすこと により恒温動物を維持すること、ならびに（２）カロリー摂取の増加に応答して エネルギー消費を増やすことによりエネルギーバランスを保つことの両方に用い られる（Ｓｅａｒｓ、Ｉ．Ｂ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６ （７）：３４１０−３４１９）。肥満症のほとんど全ての実験齧歯類モデルには 、通常、肥満症の進行における最初の症状として減少したまたは欠陥のあるＢＡ Ｔ機能が伴う（Ｈｉｍｍｓ−Ｈａｇｅｎ、Ｊ．（１９８９）Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉ ｄ Ｒｅｓ ．２８：６７−１１５；Ｈｉｍｍｓ−Ｈａｇｅｎ、Ｊ．（１９９０）ＦＡＳＥＢＪ ．４：２８９０−２８９８）。さらに、毒素遺伝子の選択的発現に よるトランスジェニックマウスにおけるＢＡＴの除去は肥満症をもたらす（Ｌｏ ｗｅｌｌ、Ｂ．等（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７４０−７４２）。従っ て、褐色脂肪細胞の増殖及び分化はエネルギーバランスを保ち、そして肥満を防 ぐ動物の能力における重要な決定因である（Ｓｅａｒｓ、Ｉ．Ｂ．等（１９９６ ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（７）：３４１０−３４１９）。 最近、脂肪細胞化を促進するいくつかの転写因子が同定されている。これらの 転写因子はＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）α、β及び δ並びにペルオキシソーム増殖薬活性化受容体（ＰＰＡＲ）_γを含む。概説には Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、Ｂ．Ｍ．及びＦｌｉｅｒ、Ｊ．Ｓ．（１９９６）Ｃｅｌ ｌ ８７：３７７−３８９を参照。Ｃ／ＥＢＰα、β及びδのようなＣ／ＥＢＰ ファミリーメンバーは脂肪細胞特異的遺伝子発現の調節において重要な役割を果 たす。例えば、Ｃ／ＥＢＰαは成熟した脂肪細胞において発現されるいくつかの 遺伝子のプロモーターをトランス活性化することができる（Ｈｅｒｒｅｒａ、Ｒ ．等（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：５３３１−５３３９；Ｍｉ ｌｌｅｒ、Ｓ．Ｇ．等（１９９６）ＰＮＡＳ ９３：５５０７−５５１；Ｃｈｒ ｉｓｔｙ、Ｒ．Ｊ．等（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：１３２３−１３３ ５；Ｕｍｅｋ、Ｒ．Ｍ．等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：２８８−２９ １；Ｋａｅｓｔｎｅｒ、Ｋ．Ｈ．等（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：２５１−２５ ５；Ｄｅｌａｂｒｏｕｓｓｅ、Ｆ．Ｃ．等（１９９６）ＰＮＡＳ ９３：４０９ ６−４１０１；Ｈｗａｎｇ、Ｃ．Ｓ．等（１９９６）ＰＮＡＳ ９３：８７３− ８７７）。Ｃ／ＥＢＰαの過剰発現は繊維芽細胞において脂肪細胞分化を誘導す ることができ（Ｆｒｅｙｔａｇ、Ｓ．Ｏ．等（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８：１６５４−１６６３）、一方、アンチセンスＣ／ＥＢＰαの発現は前脂肪細 胞の最終分化を妨げる（Ｌｉｎ、Ｆ．Ｔ．及びＬａｎｅ、Ｍ．Ｄ．（１９９２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ．６：５３３−５４４）。Ｃ／ＥＢＰαの生理的重要性はト ランスジェニックＣ／ＥＢＰα−ノックアウトマウスの作製によりさらに示され た。これらの動物では脂肪細胞 はなお存在するが、それらはかなり少ない脂質を蓄積し、そして減少した脂肪細 胞特異的遺伝子発現を示す（Ｗａｎｇ、Ｎ．等（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ６９：１１０８−１１１２）。Ｃ／ＥＢＰαは脂肪細胞分化を促進することにお いて別の転写因子ＰＰＡＲ_γと相乗作用を生み出す関係があることが見いだされ た（概説にはＢｕｒｎ、Ｒ．Ｐ．等（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．８：８２６−８３２を参照）。ＰＰＡＲ_γは選択的スプライシング により形成される２つのアイソフォーム（γ１及びγ２）として存在し（Ｚｈｕ ．．Ｙ．等（１９９５）ＰＮＡＳ ９２：７９２１−７９２５）、そして多数の 脂肪特異的遺伝子の直接のレギュレーター及び脂肪細胞化の全プログラムを引き 起こすことができる「マスター」レギュレーターの両方として機能するようであ る（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、Ｂ．Ｍ．及びＦｌｉｅｒ、Ｊ．Ｓ．（１９９６）Ｃ ｅｌｌ ８７：３７７−３８９）核ホルモン受容体である。ＰＰＡＲ_γはＲＸＲ αとヘテロダイマーを形成し、そして脂肪細胞Ｐ２（ａＰ２：Ｔｏｎｔｏｎｏｚ 、Ｐ．（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８：１２２４−１２３４）及びホスホ エノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子（Ｔｏｎｔｏｎｏ ｚ、Ｐ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３５１−３５７）か らのよく特性化された脂肪特異的エンハンサーに直接結合することが示されてい る。 ＵＣＰ遺伝子プロモーターはＣ／ＥＢＰの結合部位（Ｙｕｂｅｒｏ、Ｐ．等（ １９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８： ６５３−６５９）及びＰＰＡＲ_γ応答配列（Ｓｅａｒｓ、Ｉ．Ｂ．等（１９９６ ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（７） ：３４１０−３４１９）を含むが、Ｃ／ＥＢＰ及びＰＰＡＲ_γはＵＣＰ発現を誘 導するために十分ではないようである（Ｓｅａｒｓ、Ｉ．Ｂ．等（１９９６）Ｍ ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ．１６（７）：３４１０−３４１９）。それ故、ＵＣ Ｐ発現を活性化するため、従って、ＢＡＴ熱発生を促進するためにＣ／ＥＢＰま たはＰＰＡＲ_γのいずれかと組み合わせて働く可能性があるさらなる因子を同定 することが極めて望ましいであろう。発明の要約 本発明は少なくとも一つにはＢＡＴにおけるＵＣＰ発現のコアクチベーターと してＰＰＡＲ_γと組み合わせて働くことができる新規な分子の発見に基づく。本 明細書ではこれらの分子をＰＰＡＲ _γコアクチベータ−１（「ＰＧＣ−１」）タ ンパク質と呼ぶ。本明細書ではＰＧＣ−１タンパク質をコードする核酸分子をＰ ＧＣ−１核酸分子と呼ぶ。本発明のＰＧＣ−１分子は例えば脂肪細胞化、例えば 褐色脂肪細胞化、及びＰＧＣ−１を発現する組織、例えばＢＡＴまたは筋肉の熱 発生を調節することができる。本発明のＰＧＣ−１分子の他の機能は本明細書の 全体にわたって記述される。 従って、本発明の一つの態様はＰＧＣ−１タンパク質またはその一部（例えば 、生物学的に活性があるかまたは抗原性部分）をコードするヌクレオチド配列を 含んでなる単離された核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ）及びＰＧＣ−１をコードす る核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼー ションプローブとして適当な核酸フラグメントに関する。特に好ましい態様とし て、単離された核酸分子は配列番号：１のヌクレオチド配列または配列番号：１ のヌクレオチド配 列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少な くとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましく は少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ 以上相同なヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかのコ ーディング領域もしくは相補物を含んでなる。 別の特に好ましい態様として、本発明の単離された核酸分子は配列番号：１に 示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部（例えば、４００ 、４５０、５００もしくはそれ以上のヌクレオチド）にハイブリダイズするかま たは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少な くとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましく は少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ 以上相同なヌクレオチド配列を含んでなる。 別の好ましい態様として、単離された核酸分子は配列番号：２のアミノ酸配列 または配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくと も約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくと も約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは ９５％もしくはそれ以上相同なアミノ酸配列をコードする。また、本発明の好ま しいＰＧＣ−１タンパク質は好ましくは本明細書に記述されるＰＧＣ−１生物学 的活性の少なくとも１つも保有する。 別の態様として、単離された核酸分子はタンパク質またはその一部をコードし 、ここにおいて、タンパク質またはその一部は配列番号：２の アミノ酸配列に十分に相同な、例えば、タンパク質またはその一部がＰＧＣ−１ 活性を保持するように配列番号：２のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列 を含む。好ましくは核酸分子によりコードされるタンパク質またはその一部は以 下の生物学的活性：１）ＰＰＡＲ_γと相互作用する（例えば、結合する）ことが できる；２）ＰＰＡＲ_γ活性を調節することができる；３）ＵＣＰ発現を調節す ることができる；４）脂肪細胞における熱発生、例えば褐色脂肪細胞または筋肉 における熱発生を調節することができる；５）脂肪細胞または筋肉における酸素 消費を調節することができる；６）脂肪細胞化、例えば、褐色脂肪細胞への白色 脂肪細胞の分化を調節することができる；７）細胞のインシュリン感受性、例え ば、筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞のインシュリン感受性を調節することができる ；８）核ホルモン受容体、例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体 、レチノイン酸受容体と相互作用する（例えば、結合する）ことができる；９） 核ホルモン受容体の活性を調節することができる；そして１０）転写因子Ｃ／Ｅ ＢＰαと相互作用する（例えば、結合する）ことができるの１つまたはそれ以上 を保持する。一つの態様として、核酸分子によりコードされるタンパク質は配列 番号：２のアミノ酸配列（例えば、配列番号：２の全アミノ酸配列）に少なくと も約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０ ％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも 約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％またはそれ以上相同である 。 さらに別の態様として、単離された核酸分子はヒトから得られ、そして以下の ドメインまたはモチーフ：チロシンリン酸化部位、ｃＡＭＰリ ン酸化部位、セリン−アルギニン（ＳＲ）に富んだドメイン、ＲＮＡ結合モチー フ、及び核受容体との相互作用をもたらすＬＸＸＬＬ（配列番号：３）モチーフ の１つまたはそれ以上を含むタンパク質の部分をコードする。別の好ましい態様 として、単離された核酸分子はヒトから得られ、そして本明細書に記述されるド メイン／モチーフの１つまたはそれ以上を含み且つ以下の生物学的活性：１）Ｐ ＰＡＲ_γと相互作用する（例えば、結合する）ことができる；２）ＰＰＡＲ_γ活 性を調節することができる；３）ＵＣＰ発現を調節することができる；４）脂肪 細胞における熱発生、例えば、褐色脂肪細胞または筋肉における熱発生を調節す ることができる；５）脂肪細胞または筋肉における酸素消費を調節することがで きる；６）脂肪細胞化、例えば、褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分化を調節す ることができる；７）細胞のインシュリン感受性、例えば、筋肉細胞、肝細胞、 脂肪細胞のインシュリン感受性を調節することができる；８）核ホルモン受容体 、例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン酸受容体と 相互作用する（例えば、結合する）ことができる；９）核ホルモン受容体の活性 を調節することができる；そして１０）転写因子Ｃ／ＥＢＰαと相互作用する（ 例えば、結合する）ことができるの１つまたはそれ以上を有するタンパク質（例 えば、ＰＧＣ−１融合タンパク質）をコードする。 別の態様として、単離された核酸分子は少なくとも１５ヌクレオチドの長さで あり、そして配列番号：１のヌクレオチド配列または配列番号：１に示されるヌ クレオチド配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好 ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらに より好ましくは少なくとも約９０％、 最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ以上相同なヌクレオチド配列を 含んでなる核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。好まし くは、単離された核酸分子は天然に存在する核酸分子に相当する。より好ましく は、単離された核酸分子は天然に存在するヒトＰＧＣ−１またはその生物学的に 活性のある部分をコードする。さらに、ＰＧＣ−１をコードするｃＤＮＡ配列（ 例えば、配列番号：１）の本明細書における開示が与えられると、アンチセンス 核酸分子（すなわち、ＰＧＣ−１ ｃＤＮＡ配列のコーディング鎖に相補的な分 子）も本発明により与えられる。 本発明の別の態様は本発明の核酸分子を含有するベクター、例えば、組み換え 発現ベクター及びそのようなベクターが導入されている宿主細胞に関する。一つ の態様として、適当な培地中で宿主細胞を培養することによりＰＧＣ−１タンパ ク質を製造するためにそのような宿主細胞を用いる。必要な場合、次に、培地ま たは宿主細胞からＰＧＣ−１タンパク質を単離することができる。 本発明のさらに別の態様はＰＧＣ−１遺伝子が導入されているかまたは改変さ れているヒト以外のトランスジェニック動物に関する。一つの態様として、導入 遺伝子としてＰＧＣ−１をコードする本発明の核酸分子の導入によりヒト以外の 動物のゲノムが改変されている。別の態様として、ヒト以外の動物のゲノム内の 内在性ＰＧＣ−１遺伝子が相同的組み換えにより改変されており、例えば、機能 的に破壊されている。 本発明のさらに別の態様は単離されたＰＧＣ−１タンパク質またはその一部、 例えば、生物学的に活性のある部分に関する。好ましい態様として、単離された ＰＧＣ−１タンパク質またはその一部はＢＡＴにおけ る熱発生を調節することができる。別の好ましい態様として、単離されたＰＧＣ −１タンパク質またはその一部はタンパク質またはその一部が以下の生物学的活 性：１）ＰＰＡＲ_γと相互作用する（例えば、結合する）ことができる；２）Ｐ ＰＡＲ_γ活性を調節することができる：３）ＵＣＰ発現を調節することができる ；４）脂肪細胞における熱発生、例えば、褐色脂肪細胞または筋肉における熱発 生を調節することができる；５）脂肪細胞または筋肉における酸素消費を調節す ることができる；６）脂肪細胞化、例えば、褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分 化を調節することができる；７）細胞のインシュリン感受性、例えば、筋肉細胞 、肝細胞、脂肪細胞のインシュリン感受性を調節することができる；８）核ホル モン受容体、例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン 酸受容体と相互作用する（例えば、結合する）ことができる；９）核ホルモン受 容体の活性を調節することができる；そして１０）転写因子Ｃ／ＥＢＰαと相互 作用する（例えば、結合する）ことができるの１つまたはそれ以上を保持するよ うに配列番号：２のアミノ酸配列に十分に相同である。 一つの態様として、ＰＧＣ−１タンパク質の生物学的に活性のある部分はドメ インまたはモチーフ、好ましくはＰＧＣ−１生物学的活性を有するドメインまた はモチーフを含む。ドメインまたはモチーフはチロシンリン酸化部位、ｃＡＭＰ リン酸化部位、セリン−アルギニン（ＳＲ）に富んだドメイン、ＲＮＡ結合モチ ーフ、及び核受容体との相互作用をもたらすＬＸＸＬＬ（配列番号：３）モチー フまたはこれらのドメインまたはモチーフの１つまたはそれ以上の組み合わせで あってもよい。好ましくは、これらのドメインまたはモチーフの１つまたはそれ 以上を含 むＰＧＣ−１タンパク質の生物学的に活性のある部分は以下の生物学的活性：１ ）ＰＰＡＲ_γと相互作用する（例えば、結合する）ことができる；２）ＰＰＡＲ_γ 活性を調節することができる：３）ＵＣＰ発現を調節することができる；４） 脂肪細胞における熱発生、例えば、褐色脂肪細胞または筋肉における熱発生を調 節することができる；５）脂肪細胞または筋肉における酸素消費を調節すること ができる；６）脂肪細胞化、例えば、褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分化を調 節することができる；７）細胞のィンシュリン感受性、例えば、筋肉細胞、肝細 胞、脂肪細胞のインシュリン感受性を調節することができる；８）核ホルモン受 容体、例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン酸受容 体と相互作用する（例えば、結合する）ことができる；９）核ホルモン受容体の 活性を調節することができる；そして１０）転写因子Ｃ／ＥＢＰαと相互作用す る（例えば、結合する）ことができるのいずれかを有する。 また、本発明はＰＧＣ−１タンパク質の単離された調製物も提供する。好まし い態様として、ＰＧＣ−１タンパク質は配列番号：２のアミノ酸配列または配列 番号：２のアミノ酸配列、例えば、配列番号：２の全アミノ酸配列に少なくとも 約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％ 、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約 ９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ以上相同なアミ ノ酸配列を含んでなる。別の態様として、単離されたＰＧＣ−１タンパク質は配 列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０ ％、より好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約 ８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少な くとも約９５％またはそれ以上相同なアミノ酸配列を含んでなり、そして本明細 書に記述されるＰＧＣ−１生物学的活性の１つまたはそれ以上を有する。あるい はまた、単離されたＰＧＣ−１タンパク質は、配列番号：１のヌクレオチド配列 にハイブリダイズするか、例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ するか、または少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ま しくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらによ り好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％も しくはそれ以上相同なヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含ん でなることができる。また、ＰＧＣ−１の好ましい形態が本明細書に記述される ＰＧＣ−１生物学的活性の１つまたはそれ以上も有することも好ましい。 融合タンパク質を形成するためにＰＧＣ−１タンパク質（もしくはポリペプチ ド）またはその生物学的に活性のある部分をＰＧＣ−１以外のポリペプチドに機 能的に連結することができる。さらに、タンパク質及び製薬学的に許容しうる担 体を含んでなる製薬学的組成物中にＰＧＣ−１タンパク質またはその生物学的に 活性のある部分を混和することができる。 抗−ＰＧＣ−１抗体を製造するために本発明のＰＧＣ−１タンパク質またはそ の一部もしくはフラグメントを用いることができる。従って、本発明は配列番号 ：２に示されるアミノ酸配列（または配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも 約５０％相同なアミノ酸配列）の少なくとも８アミノ酸残基を含んでなり、そし てペプチドに対して作製される抗体 がＰＧＣ−１と特異的免疫複合体を形成するようにＰＧＣ−１のエピトープを包 含するＰＧＣ−１の抗原性ペプチドも提供する。好ましくは、抗原性ペプチドは 少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、さ らにより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なく とも３０アミノ酸残基を含んでなる。本発明はＰＧＣ−１に特異的に結合する抗 体をさらに提供する。一つの態様として、抗体はモノクローナルである。別の態 様として、抗体を検出可能な物質に連結する。さらに別の態様として、抗体及び 製薬学的に許容しうる担体を含んでなる製薬学的組成物中に抗体を組み入れる。 本発明の別の態様は細胞関連活性、例えば、増殖、分化、生存、熱発生、酸素 消費を調節するための方法に関する。そのような方法は、細胞関連活性が薬剤の 非存在下での細胞の細胞関連活性（例えば、同じ細胞関連活性）に対して改変さ れるようにＰＧＣ−１タンパク質活性またはＰＧＣ−１核酸発現を調節する薬剤 と細胞を接触させることを含む。好ましい態様として、細胞関連活性は熱発生で あり、そして細胞は褐色脂肪細胞である。ＰＧＣ−１活性を調節する薬剤はＰＧ Ｃ−１タンパク質活性またはＰＧＣ−１核酸発現を刺激する薬剤であってもよい 。ＰＧＣ−１タンパク質活性またはＰＧＣ−１核酸発現を刺激する薬剤の例は、 小分子、活性のあるＰＧＣ−１タンパク質及び細胞中に導入されているＰＧＣ− １をコードする核酸を含む。ＰＧＣ−１活性または発現を妨げる薬剤の例は、小 分子、アンチセンスＰＧＣ−１核酸分子及びＰＧＣ−１に特異的に結合する抗体 を含む。好ましい態様として、細胞は患者内に存在し、そして薬剤が患者に投与 される。 また、本発明は様々な疾患にかかっている患者の処置方法にも関する。 例えば、本発明は体重疾患、例えば、肥満症、食欲不振、悪液質、または不十分 なインシュリン活性と関係する疾患、例えば糖尿病のような異常なＰＧＣ−１タ ンパク質活性または核酸発現を特徴とする疾患にかかっている患者の処置方法に 関する。これらの方法は患者の処置が起こるようにＰＧＣ−１モジュレーター（ 例えば、小分子）を患者に投与することを含む。 一つの態様として、本発明は患者にＰＧＣ−１アクチベーター、例えば、ＰＧ Ｃ−１タンパク質もしくはその一部または化合物または薬剤を投与し、それによ り疾病の処置が起こるようにＰＧＣ−１の発現または活性を上げることを含んで なる、体重疾患、例えば肥満症、または不十分なインシュリン活性と関係する疾 患、例えば糖尿病にかかっている患者の処置方法に関する。また、処置が起こる ようにＰＧＣ−１アクチベーター、例えば、ＰＧＣ−１タンパク質またはその一 部をコードする核酸を疾患にかかっている患者に投与することによっても体重疾 患、例えば肥満症、または不十分なインシュリン活性と関係する疾患を本発明に 従って処置することができる。 また、本発明はＰＧＣ−１遺伝子中の遺伝子損傷を検出し、それにより損傷を 受けた遺伝子を有する患者が変種のまたは異常なＰＧＣ−１核酸発現またはＰＧ Ｃ−１タンパク質活性を特徴とする疾患、例えば、体重疾患または不十分なイン シュリン活性と関係する疾患の危険にさらされている（またはかかりやすい）か どうかを決定するための方法にも関する。好ましい態様として、それらの方法は 、患者からの細胞のサンプルにおいて、ＰＧＣ−１タンパク質をコードする遺伝 子の完全な状態に影響を与える改変またはＰＧＣ−１遺伝子の不適当な発現を特 徴とする 遺伝子損傷の有無を検出することを含む。 本発明の別の態様は生物学的サンプル中のＰＧＣ−１の存在の検出方法に関す る。好ましい態様として、それらの方法はＰＧＣ−１の存在が生物学的サンプル 中に検出されるようにＰＧＣ−１タンパク質またはＰＧＣ−１ ｍＲＮＡを検出 することができる化合物または薬剤と生物学的サンプル（例えば、心筋細胞、肝 細胞、神経細胞、褐色脂肪細胞または筋肉サンプル）を接触させることを含む。 化合物または薬剤は、例えば、ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡにハイブリダイズすること ができる標識されたもしくは標識可能な核酸プローブまたはＰＧＣ−１タンパク 質に結合することができる標識されたもしくは標識可能な抗体であってもよい。 本発明はさらにＰＧＣ−１タンパク質またはｍＲＮＡの検出に基づく、例えば 、体重疾患または不十分なインシュリン活性と関係する疾患にかかっている患者 の診断方法を提供する。一つの態様として、本発明はＰＧＣ−１タンパク質また はｍＲＮＡを検出することができる薬剤と患者からの細胞または組織サンプル（ 例えば、褐色脂肪細胞サンプル）を接触させ、細胞または組織サンプルにおいて 発現されたＰＧＣ−１タンパク質またはｍＲＮＡの量を決定し、細胞または組織 サンプルにおいて発現されたＰＧＣ−１タンパク質またはｍＲＮＡの量をコント ロールサンプルに比較し、コントロールサンプルに比較した場合の細胞または組 織サンプルにおいて発現されたＰＧＣ−１タンパク質またはｍＲＮＡの量に基づ いて診断を下すことを含む。好ましくは、細胞サンプルは褐色脂肪細胞サンプル である。生物学的サンプル中のＰＧＣ−１を検出するためのキットも本発明の範 囲内である。 本発明のさらに別の態様は異常なＰＧＣ−１核酸発現またはタンパク 質活性を特徴とする疾患、例えば体重疾患または不十分なインシュリン活性と関 係する疾患を処置するための化合物を同定するための方法、例えばスクリーニン グアッセイに関する。これらの方法は典型的には、ＰＧＣ−１遺伝子の発現また はＰＧＣ−１タンパク質の活性を調節する化合物または薬剤の能力をアッセイし 、それにより異常なＰＧＣ−１核酸発現またはタンパク質活性を特徴とする疾患 を処置するための化合物を同定することを含む。好ましい態様として、その方法 は疾患にかかっている患者から得られた生物学的サンプル、例えば細胞または組 織サンプル、例えば褐色脂肪細胞サンプルを化合物または薬剤と接触させ、生物 学的サンプルにおいて発現されたＰＧＣ−１タンパク質の量を決定し、そして／ またはＰＧＣ−１タンパク質の活性を測定し、生物学的サンプルにおいて発現さ れたＰＧＣ−１タンパク質の量及び／または細胞中の測定可能なＰＧＣ−１生物 学的活性をコントロールサンプルのものに比較することを含む。コントロールに 比較して化合物または薬剤にさらした細胞におけるＰＧＣ−１核酸発現の量また はＰＧＣ−１タンパク質活性の変化は、ＰＧＣ−１核酸発現及び／またはＰＧＣ −１タンパク質活性の調節を表す。 また、本発明はＰＧＣ−１タンパク質と相互作用する（例えば、結合する）化 合物または薬剤の同定方法にも関する。これらの方法は複合体を形成するように ＰＧＣ−１タンパク質に化合物を結合させる条件下で化合物または薬剤とＰＧＣ −１タンパク質を接触させ、そしてＰＧＣ−１タンパク質と化合物の複合体の形 成を検出する工程を含み、ここにおいて、ＰＧＣ−１タンパク質に結合する化合 物の能力は複合体中の化合物の存在により示される。 本発明はさらに標的分子、例えば、ＰＰＡＲ_γ、Ｃ／ＥＢＰα、核ホルモン受 容体、例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン酸受容 体とＰＧＣ−１タンパク質の相互作用を調節する、例えば、刺激するかまたは妨 げる化合物または薬剤の同定方法に関する。これらの方法では、複合体を形成す るようにＰＧＣ−１タンパク質に標的分子を結合させる条件下で、化合物または 薬剤の存在下で標的分子とＰＧＣ−１タンパク質を接触させる。化合物または薬 剤の非存在下で形成される複合体の量に比較した場合のＰＧＣ−１タンパク質と 標的分子間の複合体形成の変化、例えば、増加または減少は、その化合物または 薬剤が標的分子とＰＧＣ−１タンパク質の相互作用を調節できることを表す。図面の簡単な説明 図１Ａ、図１Ａ−１及び１Ａ−２はマウスＰＧＣ−１ヌクレオチド（配列番号 ：１）及びアミノ酸（配列番号：２）配列を示す。 図２Ａ−２ＢはマウスＰＧＣ−１配列の分析を示す。図２Ａにおいて以下のド メイン：ＳＲドメイン（アミノ酸５６５−５９８及び６１７−６３１）、ＲＮＡ 結合ドメイン（アミノ酸６７７−７０９）、プロテインキナーゼＡリン酸化の３ つの共通部位（アミノ酸２３８−２４１、３７３−３７６及び６５５−６６８） 並びにＬＸＸＬＬ（配列番号：３）モチーフ（アミノ酸１４２−１４６）に下線 をひく。 図２ＢはマウスＰＧＣ−１の構造の概念図である。矢印は共通配列（Ｒ、Ｋ） ２ｘ（ＳＴ）を有する推定上のプロテインキナーゼＡリン酸化部位を示す。灰色 の箱はＳＲに富んだ領域ドメインを示し、そして黒色の箱はＲＮＡ結合ドメイン を示す。図３Ａ−３ＢはＰＰＡＲ_γ及び甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）によるＵＣＰ− １プロモーターのトランス活性化を刺激することにおけるマウスＰＧＣ−１の影 響を示す棒グラフである。図３ＡはＲＡＴ１ ＩＲ細胞において示されるリガン ド／ホルモンに関してＵＣＰ−１プロモーターの制御下のＣＡＴレポーター遺伝 子の増加した転写活性化を示す。図３ＢはＧＡＬ４ ＤＢＤに連結したマウスＰ ＧＣ−１を用いるＵＡＳ配列（５コピー）の制御下のレポーターＣＡＴ遺伝子の 増加した転写活性化を示すグラフである。 図４はＰＰＡＲ_γと相互作用するＰＧＣ−１のドメインを同定するための異な るマウスＰＧＣ−１欠失の図である。図に示されるものはＰＰＡＲ_γに結合した 投入物質の対応するパーセンテージを有するＰＧＣ−１欠失の概念図である。Ｌ ＸＸＬＬ（配列番号：３）モチーフはアミノ酸残基１４２−１４６に位置する。 黒色の箱はＰＧＣ−１のＰＰＡＲ_γ結合ドメインに対応する（アミノ酸２９２− ３３８）。 図５はＰＧＣ−１と相互作用するＰＰＡＲ_γのドメインを同定するための異な るマウスＰＰＡＲ_γ欠失の図である。図に示されるものはＰＧＣ−１に結合する 投入量の対応するパーセンテージを有するＰＰＡＲ_γ欠失の概念図である。 図６はｃＡＭＰ及びレチノイン酸（ＲＡ）でのＰＧＣ−１感染及びコントロー ル細胞の長期間処置の酸素消費における影響を示す棒グラフである。発明の詳細な説明 本発明は、脂肪細胞関連活性において役割を果たすかまたは機能する、本明細 書においてＰＧＣ−１核酸及びタンパク質分子と呼ばれる新規な 分子の発見に基づく。一つの態様として、ＰＧＣ−１分子は脂肪細胞化、例えば 、褐色脂肪細胞及び筋肉細胞の脂肪細胞化を調節することができる。別の態様と して、ＰＧＣ−１分子は褐色脂肪細胞における熱発生を調節することができる。 例えば、本発明のＰＧＣ−１分子は個体の脂肪細胞における熱発生を増加するこ とができ、それにより個体における体重減少を促進する。従って、肥満症を処置 するために本発明のＰＧＣ−１分子を用いることができる。さらに、ＰＧＣ−１ 分子により引き起こされる熱発生活性の増加は、脂肪細胞並びに筋肉細胞及び肝 細胞のインシュリン感受性を増すこともできる。従って、糖尿病のような不十分 なインシュリン活性を特徴とする疾患を処置するためにも本発明のＰＧＣ−１分 子を用いることができる。あるいはまた、本発明のＰＧＣ−１分子の活性の阻害 は個体の脂肪細胞における熱発生を減少することができ、それにより個体におけ る体重減少を抑える。従って、望ましくない体重減少、例えば、悪液質、食欲不 振を処置するために本発明のＰＧＣ−１分子のモジュレーターを用いることがで きる。さらに、ＰＧＣ−１活性を調節することができる分子、例えば小分子をス クリーニングするために標的としても本発明のＰＧＣ−１分子を用いることがで きる。また、体重疾患、例えば、悪液質、食欲不振、肥満症、または不十分なイ ンシュリン活性を特徴とする疾患を処置するためにもＰＧＣ−１モジュレーター を用いることができる。 （実施例１において記述される）酵母２ハイブリッドアッセイを用いて決定し た場合にＰＰＡＲ_γに結合する能力に基づいてマウス褐色脂肪細胞からＰＧＣ− １核酸分子を同定した。上に記述したように、ＰＰＡＲ_γは多数の脂肪特異的遺 伝子の直接のレギュレーター及び脂肪細胞化 の全プログラムを引き起こすことができる「マスター」レギュレーターの両方と して機能する核ホルモン受容体である。さらに、ＵＣＰ遺伝子プロモーターはＰ ＰＡＲ_γ応答配列を含むので、ＰＰＡＲ_γのモジュレーターは脂肪細胞化及びＵ ＣＰ発現を調節することができる。ＵＣＰ発現は熱発生をもたらすことができる 。 マウスＰＧＣ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びマウスＰＧＣ−１タンパ ク質の予測されるアミノ酸配列をそれぞれ図１Ａ、１Ａ−１、１Ａ−２及び２Ａ 並びに配列番号：１及び２に示す。ヒト筋肉、心臓、腎臓または脳細胞系のよう なヒト細胞系からのｃＤＮＡライブラリーを調べるためにマウスヌクレオチド配 列の全部または一部（例えば、配列番号：１の５’部分、例えば、配列番号：１ のヌクレオチド１−５０）を用いて、実施例IIにおいて記述されるような日常的 な実験を用いてヒトＰＧＣ−１ヌクレオチド配列を得ることができる。約３０６ ６ヌクレオチドの長さであるマウスＰＧＣ−１遺伝子は、約１２０ｋＤの分子量 を有し、約７９７アミノ酸残基の長さである全長タンパク質をコードする。ＰＧ Ｃ−１タンパク質はいくつかのドメイン／モチーフを含む。これらのドメイン／ モチーフは：２つの推定上のチロシンリン酸化部位（配列番号：２のアミノ酸残 基２０４−２１２及び３７８−３８５）、３つの推定上のｃＡＭＰリン酸化部位 （配列番号：２のアミノ酸残基２３８−２４１、３７３−３７６及び６５５−６ ５８）、セリン−アルギニン（ＳＲ）に富んだドメイン（配列番号：２のアミノ 酸残基５６２−６００）、ＲＮＡ結合モチーフ（配列番号：２のアミノ酸残基６ ５６−７０９）並びに核受容体との相互作用をもたらすＬＸＸＬＬモチーフ（配 列番号：２のアミノ酸１４２−１４６；配列番号：３）を含む。本明細書 に用いられる場合、チロシンリン酸化部位はチロシンプロテインキナーゼにより リン酸化することができる少なくとも１個のチロシン残基を含むアミノ酸配列で ある。典型的には、チロシンリン酸化部位はリン酸化されるチロシンの約７残基 Ｎ末端側のリシンまたはアルギニンを特徴とする。チロシンの３または４残基Ｎ 末端側にしばしば酸性残基（アスパラギンまたはグルタミン）が見られる（Ｐａ ｔｓｃｈｉｎｓｋｙ、Ｔ．等（１９８２）ＰＮＡＳ ７９：９７３−９７７）； Ｈｕｎｔｅｒ、Ｔ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：４８４３− ４８４８；Ｃｏｏｐｅｒ、Ｊ．Ａ．等（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ５９：７８３５−７８４１）。本明細書に用いられる場合、ｃＡＭＰリン酸化部 位はｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによりリン酸化することができるセリン またはトレオニン残基を含むアミノ酸配列である。典型的には、ｃＡＭＰリン酸 化部位はセリンまたはトレオニンのＮ末端側に少なくとも２個の連続した塩基性 残基を特徴とする（Ｆｒｅｍｉｓｃｏ、Ｊ．Ｒ．等（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ．２５５：４２４０−４２４５；Ｇｌａｓｓ、Ｄ．Ｂ．及びＳｍｉｔｈ 、Ｓ．Ｂ．（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１４７９７−１４８ ０３；Ｇｌａｓｓ、Ｄ．Ｂ．等（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１： ２９８７−２９９３）。本明細書に用いられる場合、セリン−アルギニンに富ん だドメインはセリン及びアルギニン残基が多いアミノ酸配列である。典型的に、 ＳＲに富んだドメインはＲＮＡポリメラーゼIIのＣＴＤドメインと相互作用する かまたはスプライシング機能に関与するドメインである。本明細書に用いられる 場合、ＲＮＡ結合モチーフはＲＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子に結合すること ができるアミノ酸配列である。Ｒ ＮＡ結合モチーフはＬｏｄｉｓｈ、Ｈ．、Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｊ．及びＢａｌｔｉ ｍｏｒｅ、Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５）中に記述されている。本明細書に用いられる場合、ＬＸＸ ＬＬ（配列番号：３）はＸがあらゆるアミノ酸であってもよく、そして核受容体 とコアクチベーター間の相互作用をもたらすモチーフをさす（Ｈｅｅｒｙ等（１ ９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：７３３−７３６；Ｔｏｒｃｈｉａ等（１９９７ ）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：６７７−６８４）。 ＰＧＣ−１タンパク質は筋肉、心臓、腎臓、脳及び褐色脂肪組織において発現 されるが、白色脂肪組織では発現されない。低温順化動物からの組織では、褐色 脂肪組織においてＰＧＣ−１発現が非常に誘導された。さらに、低温順化動物か らの組織において、ＰＧＣ−１発現は褐色脂肪組織特異的であった。低温順化動 物からの組織におけるＰＧＣ−１発現は、褐色脂肪組織の熱発生活性を招く褐色 脂肪組織マーカーＵＣＰの発現と一致する。 本発明のＰＧＣ−１タンパク質または生物学的に活性のある部分もしくはフラ グメントは以下の活性：１）ＰＰＡＲ_γと相互作用する（例えば、結合する）こ とができる；２）ＰＰＡＲ_γ活性を調節することができる；３）ＵＣＰ発現を調 節することができる；４）脂肪細胞における熱発生、例えば、褐色脂肪細胞また は筋肉における熱発生を調節することができる；５）脂肪細胞または筋肉におけ る酸素消費を調節することができる；６）脂肪細胞化、例えば、褐色脂肪細胞へ の白色脂肪細胞の分化を調節することができる；７）細胞のインシュリン感受性 、例えば、 筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞のインシュリン感受性を調節することができる；８ ）核ホルモン受容体、例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レ チノイン酸受容体と相互作用する（例えば、結合する）ことができる；９）核ホ ルモン受容体の活性を調節することができる；そして１０）転写因子Ｃ／ＥＢＰ αと相互作用する（例えば、結合する）ことができるの１つまたはそれ以上を有 することができる。 本発明の様々な態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記述する：Ｉ．単離された核酸分子 本発明の１つの態様はＰＧＣ−１またはその生物学的に活性のある部分をコー ドする単離された核酸分子、及びＰＧＣ−１をコードする核酸（例えば、ＰＧＣ −１ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使 用のために十分な核酸フラグメントに関する。本明細書に用いられる場合、「核 酸分子」という用語はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）及び ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）及びヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤ ＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むと考えられる。核酸分子は一本鎖または二本鎖 であってもよいが、好ましくは二本鎖のＤＮＡである。「単離された」核酸分子 は核酸の天然供給源において存在する他の核酸分子から分離されているものであ る。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡに おいて核酸に本来隣接する配列（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する 配列）を含まない。例えば、様々な態様として、単離されたＰＧＣ−１核酸分子 は、核酸が由来する細胞（例えば、褐色脂肪細胞）のゲノムＤＮＡにおいて核酸 分子に本来隣接するヌクレオチ ド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ ｋｂ未満を含むことができる。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核 酸分子は、組み換え技術により製造された場合には他の細胞物質もしくは培養培 地を、または化学的に合成された場合には化学前駆物質もしくは他の化学製品を 実質的に含まないことができる。 標準的な分子生物学技術及び本明細書に与えられる配列情報を用いて本発明の 核酸分子、例えば、配列番号：１のヌクレオチド配列または配列番号：１に示さ れるヌクレオチド配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、 より好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、 さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約 ９５％もしくはそれ以上相同なヌクレオチド配列またはそれらの一部（例えば、 ４００、４５０、５００もしくはそれ以上のヌクレオチド）を有する核酸分子を 単離することができる。例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして配列番 号：１の全部または一部及び（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ 、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ、ＮＹ、１９８９中に記述されたような）標準的なハイブリダイゼーション技 術を用いて（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡまたはＣｌｏｎｔｅ ｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡからの）ヒト心臓、腎臓または脳細胞系からヒ トＰＧＣ−１ ｃＤＮＡを単離別することができる。さらに、配列番号： １の配列またはその相同なヌクレオチド配列に基づいて設計されたオリゴヌクレ オチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により配列番号：１または配列 番号：１に示されるヌクレオチド配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なく とも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なく とも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましく は少なくとも約９５％もしくはそれ以上相同なヌクレオチド配列の全部もしくは 一部を包含する核酸分子を単離することができる。例えば、心臓細胞、腎臓細胞 、脳細胞または褐色脂肪細胞から（例えば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等（１９７９）Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−５２９９のグアニジニウムーチオシ アネート抽出法により）ｍＲＮＡを単離することができ、そして逆転写酵素（例 えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから入手できるモロニーＭ ＬＶ逆転写酵素；またはＳｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬから入手できるＡＭＶ逆転写酵素）を用いてｃＤ ＮＡを調製することができる。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプラ イマーを配列番号：１に示されるヌクレオチド配列またはその相同なヌクレオチ ド配列に基づいて設計することができる。標準的なＰＣＲ増幅技術に従って鋳型 としてｃＤＮＡあるいはまたゲノムＤＮＡ及び適切なオリゴヌクレオチドプライ マーを用いて本発明の核酸を増幅することができる。そのように増幅された核酸 を適切なベクター中にクローン化し、ＤＮＡ配列分析により特性化することがで きる。さらに、標準的な合成技術により、例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いてＰ ＧＣ−１ヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドを調製することができ る。 好ましい態様として、本発明の単離された核酸分子は配列番号：１に示されるヌ クレオチド配列または配列番号：１に示されるヌクレオチド配列に少なくとも約 ５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、 なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９ ０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ以上相同なヌクレ オチド配列を含んでなる。配列番号：１の配列はマウスＰＧＣ−１ ｃＤＮＡに 相当する。このｃＤＮＡはＰＧＣ−１タンパク質をコードする配列（すなわち、 「コーディング領域」、ヌクレオチド９２から２４８２まで）並びに５’非翻訳 配列（ヌクレオチド１ないし９１）及び３’非翻訳配列（ヌクレオチド２４８３ ないし３０６６）を含んでなる。あるいはまた、核酸分子は配列番号：１のコー ディング領域のみ（例えば、ヌクレオチド９２ないし２４８２）または相同なヌ クレオチド配列を含んでなることができる。 別の好ましい態様として、本発明の単離された核酸分子は配列番号：１に示さ れるヌクレオチド配列または配列番号：１に示されるヌクレオチド配列に少なく とも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７ ０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくと も約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ以上相同な ヌクレオチド配列の相補物である核酸分子を含んでなる。配列番号：１に示され るヌクレオチド配列または配列番号：１に示されるヌクレオチド配列に少なくと も約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０ ％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも 約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％もしくは それ以上相同なヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、配列番号：１に示され るヌクレオチド配列または相同な配列にハイブリダイズすることができ、それに より安定な二本鎖を形成するように配列番号：１に示されるヌクレオチド配列ま たは相同な配列に十分に相補的なものである。 さらに別の好ましい態様として、本発明の単離された核酸分子は配列番号：１ に示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部に少なくとも約 ５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、 なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９ ０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ以上相同なヌクレ オチド配列を含んでなる。さらに好ましい態様として、本発明の単離された核酸 分子は配列番号：１に示されるヌクレオチド配列または配列番号：１に示される ヌクレオチド配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より 好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さら により好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５ ％もしくはそれ以上相同なヌクレオチド配列にハイブリダイズする、例えば、ス トリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる。 さらに、本発明の核酸分子は配列番号：１のコーディング領域または配列番号 ：１に示されるヌクレオチド配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも 約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも 約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少 なくとも約９５％もしくはそれ以上相同なヌクレオチド配列のコーディング領域 の一部のみ、例えば、プロ ーブもしくはプライマーとして用いることができるフラグメントまたはＰＧＣ− １の生物学的に活性のある部分をコードするフラグメントを含んでなることがで きる。 マウスからのＰＧＣ−１遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配 列により、例えば他の組織からの、他の細胞型におけるＰＧＣ−１相同物及びヒ トのような他の哺乳類からのＰＧＣ−１相同物の同定及び／またはクローニング に用いるために設計されるプローブ及びプライマーを作製することができる。典 型的には、プローブ／プライマーは実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含 んでなる。典型的に、オリゴヌクレオチドは配列番号：１のセンス、配列番号： １のアンチセンス配列またはそれらの天然に存在する突然変異体の少なくとも約 １２、好ましくは少なくとも約２５、より好ましくは約４０、５０または７５の 連続したヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレ オチド配列の領域を含んでなる。ＰＧＣ−１相同物をクローン化するために配列 番号：１のヌクレオチド配列に基づくプライマーをＰＣＲ反応において用いるこ とができる。ＰＧＣ−１ヌクレオチド配列に基づくプローブを同じまたは相同な タンパク質をコードする転写産物またはゲノム配列を検出するために用いること ができる。好ましい態様として、プローブはそれに結合した標識基をさらに含ん でなり、例えば、標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子で あってもよい。患者からの細胞のサンプル中のＰＧＣ−１をコードする核酸のレ ベルを測定する、例えば、ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡレベルを検出するかまたはゲノ ムのＰＧＣ−１遺伝子が突然変異を受けるかもしくは欠失しているかどうかを決 定することによるような、ＰＧＣ−１タンパク質を不 適当に発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部としてそ のようなプローブを用いることができる。 一つの態様として、本発明の核酸分子はタンパク質またはその一部が以下の生 物学的活性：１）ＰＰＡＲ_γと相互作用する（例えば、結合する）ことができる ；２）ＰＰＡＲ_γ活性を調節することができる；３）ＵＣＰ発現を調節すること ができる；４）脂肪細胞における熱発生、例えば、褐色脂肪細胞または筋肉にお ける熱発生を調節することができる；５）脂肪細胞または筋肉における酸素消費 を調節することができる；６）脂肪細胞化、例えば、褐色脂肪細胞への白色脂肪 細胞の分化を調節することができる；７）細胞のインシュリン感受性、例えば、 筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞のインシュリン感受性を調節することができる；８ ）核ホルモン受容体、例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レ チノイン酸受容体と相互作用する（例えば、結合する）ことができる；９）核ホ ルモン受容体の活性を調節することができる；そして１０）転写因子Ｃ／ＥＢＰ αと相互作用する（例えば、結合する）ことができるの１つまたはそれ以上を保 持するように配列番号：２のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を含むタ ンパク質またはその一部をコードする。 本明細書に用いられる場合、「十分に相同な」という用語はタンパク質または その一部が以下の生物学的活性：１）ＰＰＡＲ_γと相互作用する（例えば、結合 する）ことができる；２）ＰＰＡＲ_γ活性を調節することができる；３）ＵＣＰ 発現を調節することができる；４）脂肪細胞における熱発生、例えば、褐色脂肪 細胞または筋肉における熱発生を調節することができる；５）脂肪細胞または筋 肉における酸素消費を調節 することができる；６）脂肪細胞化、例えば、褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の 分化を調節することができる；７）細胞のインシュリン感受性、例えば、筋肉細 胞、肝臓細胞、脂肪細胞のインシュリン感受性を調節することができる；８）核 ホルモン受容体、例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノ イン酸受容体と相互作用する（例えば、結合する）ことができる；９）核ホルモ ン受容体の活性を調節することができる；そして１０）転写因子Ｃ／ＥＢＰαと 相互作用する（例えば、結合する）ことができるの１つまたはそれ以上を保持す るように配列番号：２のアミノ酸配列に同一のまたは同等な（例えば、配列番号 ：２のアミノ酸残基と類似した側鎖を有するアミノ酸残基）アミノ酸残基の最少 数を含むアミノ酸配列を有するタンパク質またはその一部をさす。別の態様とし て、タンパク質は配列番号：２の全アミノ酸配列に少なくとも約５０％、好まし くは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、なおより好まし くは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最 も好ましくは少なくとも約９５％またはそれ以上相同である。 本発明のＰＧＣ−１核酸分子によりコードされるタンパク質の一部は好ましく はＰＧＣ−１タンパク質の生物学的に活性のある部分である。本明細書に用いら れる場合、「ＰＧＣ−１の生物学的に活性のある部分」という用語は以下の活性 ：１）ＰＰＡＲ_γと相互作用する（例えば、結合する）ことができる；２）ＰＰ ＡＲ_γ活性を調節することができる；３）ＵＣＰ発現を調節することができる； ４）脂肪細胞における熱発生、例えば、褐色脂肪細胞または筋肉における熱発生 を調節することができる；５）脂肪細胞または筋肉における酸素消費を調節する ことができる ；６）脂肪細胞化、例えば、褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分化を調節するこ とができる；７）細胞のインシュリン感受性、例えば、筋肉細胞、肝細胞、脂肪 細胞のインシュリン感受性を調節することができる；８）核ホルモン受容体、例 えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン酸受容体と相互 作用する（例えば、結合する）ことができる；９）核ホルモン受容体の活性を調 節することができる；そして１０）転写因子Ｃ／ＥＢＰαと相互作用する（例え ば、結合する）ことができるの１つまたはそれ以上を有するＰＧＣ−１の部分、 例えば、ドメイン／モチーフを含むと考えられる。 ＰＰＡＲ_γ、Ｃ／ＥＢＰα及び核ホルモン受容体と相互作用する（例えば、結 合する）ＰＧＣ−１タンパク質またはその生物学的に活性のある部分の能力を決 定するために標準的な結合アッセイ、例えば、免疫沈降法及び本明細書に記述さ れるような酵母２−ハイブリッドアッセイを実施することができる。ＰＧＣ−１ 分子がＰＰＡＲ_γ、Ｃ／ＥＢＰα及び／または核ホルモン受容体と相互作用する ことが認められる場合、それらはＰＰＡＲ_γ、Ｃ／ＥＢＰα及び核ホルモン受容 体の活性のモジュレーターでもあると思われる。 本発明のＰＧＣ−１分子がＵＣＰ発現を調節するかどうかを決定するために、 インビトロ転写アッセイを実施することができる。そのようなアッセイを実施す るために、ＵＣＰの全長プロモーター及びエンハンサーをクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のようなレポーター遺伝子に連結し、宿 主細胞中に導入することができる。次に、その宿主細胞にＰＰＡＲ_γ／ＲＸＲα 及びＰＧＣ−１分子をコードする核酸をトランスフェクトすることができる。Ｃ ＡＴ活性を試験し、 ＰＧＣ−１分子をコードする核酸を含まない細胞におけるＣＡＴ活性にそれを比 較することによりＰＧＣ−１分子の影響を測定することができる。ＣＡＴ活性の 増加または減少はＵＣＰ発現の調節を表し、ＵＣＰ発現は高められた熱発生を引 き起こす事象のカスケードにおける重要な要素であることが知られているので、 このアッセイは脂肪細胞における熱発生を調節するＰＧＣ−１分子の能力も測定 することができる。 また、ＵＣＰ発現は褐色脂肪組織に特異的であるので、ＵＣＰ発現を調節する ＰＧＣ−１分子の能力を試験するための上記のアッセイを脂肪細胞化、例えば、 褐色脂肪組織への白色脂肪組織の分化を調節するＰＧＣ−１分子の能力を試験す るためにも用いることができる。ＰＧＣ−１分子がＵＣＰ発現を調節できる場合 、それはおそらく褐色脂肪組織への白色脂肪組織の分化を調節できる。あるいは また、ＰＧＣ−１分子を細胞、例えば白色脂肪細胞中に導入し、そしてＰＧＣ− １分子を含まないコントロール細胞中のミトコンドリアの数に比較した場合の細 胞中のミトコンドリアの数を測定することにより褐色脂肪組織への白色脂肪組織 の分化を調節するＰＧＣ−１分子の能力を測定することができる。褐色脂肪細胞 は白色脂肪細胞より実質的に多数のミトコンドリアを含有することが知られてい るので、コントロール細胞に比較した場合の試験細胞中のミトコンドリアの数（ またはシトクロムｃオキシダーゼのようなミトコンドリアマーカー）の増加また は減少は、ＰＧＣ−１分子が褐色脂肪組織への白色脂肪組織の分化を調節できる ことを表す。 ＰＧＣ−１タンパク質を発現するように細胞、例えば、筋肉細胞、肝細胞また は脂肪細胞を形質転換し、放射性標識したグルコース（¹⁴Ｃグルコース）とイン キュベートし、インシュリンで処理するアッセイを実 施することにより、細胞のインシュリン感受性を調節するＰＧＣ−１分子の能力 を決定することができる。コントロール細胞に比較した場合のＰＧＣ−１を含有 する細胞におけるグルコースの増加または減少は、ＰＧＣ−１が細胞のインシュ リン感受性を調節できることを表す。あるいはまた、ＰＧＣ−１を含有する細胞 を放射性標識したリン酸源（例えば、［³²Ｐ］ＡＴＰ）とインキュベートし、イ ンシュリンで処理することができる。次に、インシュリン経路のタンパク質、例 えば、インシュリン受容体のリン酸化を測定することができる。コントロール細 胞に比較した場合のＰＧＣ−１を含有する細胞におけるインシュリン経路のタン パク質のリン酸化の増加または減少は、ＰＧＣ−１が細胞のインシュリン感受性 を調節できることを表す。 一つの態様として、ＰＧＣ−１の生物学的に活性のある部分はドメインまたは モチーフを含んでなる。そのようなドメイン／モチーフの例はチロシンリン酸化 部位、ｃＡＭＰリン酸化部位、セリン−アルギニン（ＳＲ）に富んだドメイン、 ＲＮＡ結合モチーフ及び核受容体との相互作用をもたらすＬＸＸＬＬ（配列番号 ：３）モチーフを含む。好ましい態様として、ドメインまたはモチーフを含むタ ンパク質の生物学的に活性のある部分は褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分化及 び／または褐色脂肪細胞における熱発生を調節することができる。これらのドメ インは本明細書において詳細に記述されている。配列番号：１または相同なヌク レオチド配列の一部を単離し、（例えば、インビトロでの組み換え発現により） ＰＧＣ−１タンパク質またはペプチドのコードされる部分を発現させ、そしてＰ ＧＣ−１タンパク質またはペプチドのコードされる部分の活性を評価することに より、ＰＧＣ−１の生物学的に活性のある部分 をコードするさらなる核酸フラグメントを調製することができる。 本発明はさらに遺伝暗号の縮重のために配列番号：１に示されるヌクレオチド 配列（及びその一部）と異なり、従って、配列番号：１に示されるヌクレオチド 配列によりコードされるものと同じＰＧＣ−１タンパク質をコードする核酸分子 を包含する。別の態様として、本発明の単離された核酸分子は配列番号：２に示 されるアミノ酸配列を有するタンパク質または配列番号：２のアミノ酸配列に少 なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも 約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少な くとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ以上相 同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。 配列番号：１に示されるマウスＰＧＣ−１ヌクレオチド配列に加えて、ＰＧＣ −１のアミノ酸配列の変異をもたらすＤＮＡ配列多型が集団（例えば哺乳類集団 、例えばヒト集団）内に存在する可能性があることを当業者は認識する。ＰＧＣ −１遺伝子中のそのような遺伝子多型は天然の対立遺伝子変異のために集団内の 個体間に存在する可能性がある。本明細書に用いられる場合、「遺伝子」及び「 組み換え遺伝子」という用語はＰＧＣ−１タンパク質、好ましくは哺乳類、例え ばヒトＰＧＣ−１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含ん でなる核酸分子をさす。そのような天然の対立遺伝子変異は典型的にＰＧＣ−１ 遺伝子のヌクレオチド配列の１−５％の相違をもたらす傾向がある。天然の対立 遺伝子変異の結果であり、そしてＰＧＣ−１の機能的活性に影響を与えないＰＧ Ｃ−１中の全てのそのようなヌクレオチド変異及び得ら れるアミノ酸多型は本発明の範囲内であると考えられる。さらに、他の種からの ＰＧＣ−１タンパク質をコードし、従って、配列番号：１のマウス配列と異なる ヌクレオチド配列を有する核酸分子は本発明の範囲内であると考えられる。スト リンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーショ ン技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとしてマウスｃＤＮＡまたはそ の一部を用いて、本発明のマウスＰＧＣ−１ ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異 体及びヒト相同物に相当する核酸分子を本明細書に開示されるマウスＰＧＣ−１ 核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる（実施例II参照） 。 従って、別の態様として、本発明の単離された核酸分子は少なくとも１５ヌク レオチドの長さであり、そしてストリンジェントな条件下で配列番号：１のヌク レオチド配列または配列番号：１のヌクレオチド配列に約６０％、好ましくは少 なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは 少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ以上相同 なヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にハイブリダイズする。別の態様とし て、核酸は少なくとも３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドの 長さである。本明細書に用いられる場合、「ストリンジェントな条件下でハイブ リダイズする」という用語は、典型的に相互に少なくとも６０％相同なヌクレオ チド配列が相互にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション及び洗 浄の条件を表すと考えられる。好ましくは、その条件は典型的に相互に少なくと も約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なく とも約７５％またはそれ以上相同な配列が相互にハイブリダイズしたままである ようにである。そのような ストリンジェントな条件は当業者に知られており、そしてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｊｏｈｎ Ｗｉ ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６中に見い だすことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい 限定しない例は、約４５℃で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ ）中でのハイブリダイゼーション及びそれに続く５０−６５℃で０．２Ｘ ＳＳ Ｃ、０．１％ ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄である。好ましくは、ス トリンジェントな条件下で配列番号：１の配列にハイブリダイズする本発明の単 離された核酸分子は天然に存在する核酸分子に相当する。本明細書に用いられる 場合、「天然に存在する」核酸分子は天然に存在するヌクレオチド配列を有する （例えば、天然のタンパク質をコードする）ＲＮＡまたはＤＮＡ分子をさす。一 つの態様として、核酸は天然のヒトＰＧＣ−１をコードする。 集団中に存在する可能性があるＰＧＣ−１配列の天然に存在する対立遺伝子変 異体に加えて、配列番号：１のヌクレオチド配列中に突然変異により変異を導入 することができ、それにより、ＰＧＣ−１タンパク質の機能的能力を変えずに、 コードされるＰＧＣ−１タンパク質のアミノ酸配列中に変異をもたらすことを当 業者はさらに認識する。例えば、「必須でない」アミノ酸残基でアミノ酸置換を もたらすヌクレオチド置換を配列番号：１の配列中に作製することができる。「 必須でない」アミノ酸残基はＰＧＣ−１の活性を変えずにＰＧＣ−１の野生型配 列（例えば、配列番号：２の配列）から改変することができる残基であり、一方 、「必須の」アミノ酸残基はＰＧＣ−１活性のために必要とされる。例えば、 ＰＰＡＲ_γへのＰＧＣ−１の相互作用に関与するアミノ酸残基はおそらくＰＧＣ −１の必須の残基である。しかしながら、他のアミノ酸残基（例えば、マウスと ヒトの間で保存されていないかまたは半保存的でしかないもの）は活性のために 必須でない可能性があり、従って、ＰＧＣ−１活性を変えずに容易に改変できる と思われる。 従って、本発明の別の態様はＰＧＣ−１活性に必須でないアミノ酸残基に変異 を含むＰＧＣ−１タンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなＰＧＣ −１タンパク質は配列番号：２とアミノ酸配列が異なるが、なお、本明細書に記 述されるＰＧＣ−１活性の少なくとも１つを保持する。一つの態様として、単離 された核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、その 場合、タンパク質は配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも約６０％相同なア ミノ酸配列を含んでなり、そして褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分化及び／ま たは褐色脂肪細胞の熱発生を調節することができる。好ましくは、核酸分子によ りコードされるタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも約７０ ％相同であり、好ましくは少なくとも約８０−８５％相同であり、さらにより好 ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％相同で ある。 本明細書に用いられる場合、「配列同一性または相同性」は２つのポリペプチ ド分子間または２つの核酸分子間の配列類似性をさす。２つの比較される配列の 両方のある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットにより占められ る場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンにより占められ る場合、その位置でそれらの分子は相同であるかまたは配列が同一である。２つ の配列間の相同性または配 列同一性のパーセントは、比較する位置の数で割った２つの配列により共有され る一致するかまたは相同な同一位置の数ｘ１００の関数である。例えば、２つの 配列の１０のうち６の位置が同じである場合、それら２つの配列は６０％相同で あるかまたは６０％の配列同一性を有する。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ とＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性または配列同一性を共有する。通例、最大の相 同性を与えるように２つの配列を整列して比較を実施する。他に特定されないか ぎり、「ループアウト領域」、例えば、配列のいずれか中の欠失または挿入から 生じるものをミスマッチとして数える。 ２つの配列間の配列の比較及び相同性パーセントの決定を数学的アルゴリズム を用いて成し遂げることができる。好ましくは、Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いて整列 を実施することができる。複数の整列パラメーターはＧＡＰペナルティー＝１０ 、ＧＡＰ長ペナルティー＝１０を含む。ＤＮＡ整列では、対毎の整列パラメータ ーはＨｔｕｐｌｅ＝２、Ｇａｐペナルティー＝５、Ｗｉｎｄｏｗ＝４及びＤｉａ ｇｏｎａｌ Ｓａｖｅｄ＝４であってもよい。タンパク質整列では、対毎の整列 パラメーターはＫｔｕｐｌｅ＝１、Ｇａｐペナルティー＝３、Ｗｉｎｄｏｗ＝５ 及びＤｉａｇｏｎａｌｓ Ｓａｖｅｄ＝５であってもよい。 配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムのさらなる限定しない例は 、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ １９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７７中のように改変されたＫａｒｌｉｎ 及びＡｌｔｓｃｈｕｌ １９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは Ａｌｔｓｃｈｕｌ等 １９９ ０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡ ＳＴプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれている。本発明の核酸分子 に相同なヌクレオチド配列を得るためにＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１０ ０、ワードレングス（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２でＢＬＡＳＴヌクレオチド 検索を実施することができる。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を 得るためにＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３でＢＬ ＡＳＴタンパク質検索を実施することができる。比較目的のためにギャップを調 整した整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（１７）：３３８９−３４０２中に記述され たようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧ ａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例 えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメーターを用いるこ とができる。ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照 。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい限定しない 例はＭｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ １９８９のアルゴリズムであ る。そのようなアルゴリズムはＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部で あるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれている。アミノ 酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重 量残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペ ナルティー及び４のギャップペナルティーを用いることができる。 １つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされる タンパク質中に導入されるように１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加 または欠失を配列番号：１のヌクレオチド配列または相同なヌクレオチド配列中 に導入することにより、配列番号：２のタンパク質に相同なＰＧＣ−１タンパク 質をコードする単離された核酸分子を作製することができる。部位特異的突然変 異誘発及びＰＣＲによる突然変異誘発のような標準技術により配列番号：１また は相同なヌクレオチド配列中に突然変異を導入することができる。好ましくは、 １つまたはそれ以上の予測される必須でないアミノ酸残基で保存的アミノ酸置換 を作製する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有する アミノ酸残基で置換されるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のグ ループは当該技術分野で特定されている。これらのグループは塩基性側鎖（例え ば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、 グルタミン酸）、無荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミ ン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラ ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオ ニン、トリプトファン）、β−分枝した側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イ ソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプト ファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、ＰＧＣ−１中の予測さ れる必須でないアミノ酸残基は好ましくは同じ側鎖グループからの別のアミノ酸 残基で置換される。あるいはまた、別の態様として、飽和突然変異誘発によるよ うに、ＰＧＣ−１コーディング配列の全部または一部に沿って無作為に突然変異 を導入することができ、そしてＰＧＣ−１活性を保持する突然変異体を同定する ために本明細書に記述されるＰ ＧＣ−１活性に関して得られた突然変異体をスクリーニングすることができる。 配列番号：１の突然変異誘発後に、コードされるタンパク質を（例えば、実施例 IVにおいて記述されるように）組み換えで発現させることができ、そして例えば 本明細書に記述されるアッセイを用いてタンパク質の活性を決定することができ る。 上記のＰＧＣ−１タンパク質をコードする核酸分子に加えて、本発明の別の態 様はそれにアンチセンスである単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」 核酸はタンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤ ＮＡ分子のコーディング鎖に相補的なまたはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチ ド配列を含んでなる。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合するこ とができる。アンチセンス核酸は全ＰＧＣ−１コーディング鎖またはその一部の みに相補的であってもよい。一つの態様として、アンチセンス核酸分子はＰＧＣ −１をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」に アンチセンスである。「コーディング領域」という用語はアミノ酸残基に翻訳さ れるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域をさす（例えば、配列番号：１ の全コーディング領域はヌクレオチド９２ないし２４８２を含んでなる）。別の 態様として、アンチセンス核酸分子はＰＧＣ−１をコードするヌクレオチド配列 のコーディング鎖の「非コーディング領域」にアンチセンスである。「非コーデ ィング領域」という用語はアミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する ５’及び３’配列をさす（すなわち、５’及び３’非翻訳領域とも呼ばれる）。 本明細書に開示されるＰＧＣ−１をコードするコーディング鎖配列（例えば、 配列番号：１）が与えられると、ワトソン・クリック塩基対合の 規則に従って本発明のアンチセンス核酸を設計することができる。アンチセンス 核酸分子はＰＧＣ−１ ｍＲＮＡの全コーディング領域に相補的であってもよい が、より好ましくは、ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディン グ領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドはＰＧＣ−１ ｍＲＮＡの翻訳開始部位付近の領 域に相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば約５、１ ０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドの長さ であってもよい。当該技術分野において知られている方法を用いて化学合成及び 酵素的連結反応を用いて本発明のアンチセンス核酸を構築することができる。例 えば、天然に存在するヌクレオチドを用いてアンチセンス核酸（例えば、アンチ センスオリゴヌクレオチド）を化学的に合成することができ、または分子の生物 学的安定性を増すためもしくはアンチセンスとセンスの核酸の間で形成される二 本鎖の物理的安定性を増すために考案された様々に改変されたヌクレオチド、例 えばモノチオリン酸誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチドを用いること ができる。アンチセンス核酸を作製するために用いることができる改変されたヌ クレオチドの例は５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラ シル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシ ン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミ ノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジ ヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ ｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メ チルグアニン、１−メチルイノシ ン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３ −メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン 、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラ シル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓ ｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、 ２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キ ューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウ ラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル −５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチ ル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル） ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンを含む。あるいはまた、 核酸がアンチセンスの向きにサブクローン化されている（すなわち、挿入された 核酸から転写されるＲＮＡが目的の標的核酸にアンチセンスの向きのものである 、以下のサブセクションにおいてさらに記述される）発現ベクターを用いてアン チセンス核酸を生物学的に製造することができる。 本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的に、それらがＰＧＣ−１タンパク質 をコードする細胞のｍＲＮＡ及び／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか または結合し、それにより例えば、転写及び／または翻訳を妨げることにより、 タンパク質の発現を制えるように患者に投与されるかまたはインサイチューで作 製される。ハイブリダイゼーションは安定な二本鎖を形成するための通常のヌク レオチド相補性によるか、 または例えばＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には二重らせ んの主溝における特異的相互作用によってもよい。本発明のアンチセンス核酸分 子の投与の経路の例は組織部位での直接注入を含む。あるいはまた、選択した細 胞を標的とするようにアンチセンス核酸分子を改変し、次に、全身的に投与する ことができる。例えば、全身投与のために、選択した細胞表面上に発現される受 容体または抗原にアンチセンス分子が特異的に結合するように、例えば、細胞表 面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連 結することにより、それを改変することができる。また、本明細書に記述される ベクターを用いてアンチセンス核酸分子を細胞に送達することもできる。アンチ センス分子の十分な細胞内濃度を得るために、アンチセンス核酸分子が強いｐｏ ｌIIまたはｐｏｌIIIプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好まし い。 さらに別の態様として、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマーの核酸 分子である。α−アノマーの核酸分子は相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッ ドを形成し、その場合、通常のβ−単位に反してそれらの鎖は相互に平行して伸 びている（Ｇａｕｌｔｉｅｒ等（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ ｓ ．１５：６６２５−６６４１）。また、アンチセンス核酸分子は２’−ｏ−メ チルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ等（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ．Ｒｅｓ ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラのＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（ Ｉｎｏｕｅ等（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）も含 んでなることができる。 さらに別の態様として、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムであ る。リボザイムは、それらが相補的な領域を有する、ｍＲＮＡのような一本鎖の 核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子であ る。従って、ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断し、それによりＰＧ Ｃ−１ ｍＲＮＡの翻訳を妨げるためにリボザイム（例えば、（Ｈａｓｅｌｈｏ ｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１中 に記述された）ハンマーヘッド型リボザイム）を用いることができる。本明細書 に開示されるＰＧＣ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１ ）に基づいてＰＧＣ−１をコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムを 設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＰＧＣ−１をコ ードするｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラ ヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築する ことができる。例えば、Ｃｅｃｈ等、米国特許第４，９８７，０７１号及びＣｅ ｃｈ等、米国特許第５，１１６，７４２号を参照。あるいはまた、ＲＮＡ分子の プールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するためにＰ ＧＣ−１ ｍＲＮＡを用いることができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ、Ｄ．及びＳ ｚｏｓｔａｋ、Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４ １８を参照。 あるいはまた、標的細胞においてＰＧＣ−１遺伝子の転写を妨げる三重らせん 構造を形成するようにＰＧＣ−１の調節領域（例えば、ＰＧＣ−１プロモーター 及び／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることによ りＰＧＣ−１遺伝子発現を抑えることができる。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ、Ｃ ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅ ｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ、Ｃ．等（１９ ９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；及びＭａｈｅ ｒ、Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−１５を 参照。II ．組み換え発現ベクター及び宿主細胞 本発明の別の態様はＰＧＣ−１（またはその一部）をコードする核酸を含有す るベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書に用いられる場合、「 ベクター」という用語は連結されている別の核酸を運ぶことができる核酸分子を さす。ベクターの一つの型は「プラスミド」であり、それはさらなるＤＮＡセグ メントを中に連結することができる環状の二本鎖ＤＮＡループをさす。別の型の ベクターはウイルスベクターであり、その場合、ウイルスゲノム中にさらなるＤ ＮＡセグメントを連結することができる。ある種のベクターは導入される宿主細 胞において自律複製することができる（例えば、バクテリアの複製起点を有する バクテリアベクター及びエピソーム型哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば 、非エピソーム型哺乳類ベクター）は宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム 中に組込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベ クターは機能的に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのような ベクターは本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。通例、組み換えＤＮ Ａ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。プラス ミドはベクターの最も一般的に用いられる形態であるので、本明細書において「 プラスミド」と「ベクター」を互換的に用いることができる。しかしながら、本 発明は同等な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損性レト ロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターの 他の形態を含むと考えられる。 本発明の組み換え発現ベクターは宿主細胞における核酸の発現のために適当な 形態の本発明の核酸を含んでなり、それは発現される核酸配列に機能的に連結さ れている、発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択される１つまたはそ れ以上の調節配列を組み換え発現ベクターが含むことを意味する。組み換え発現 ベクター内で、「機能的に連結された」は目的のヌクレオチド配列が（例えば、 インビトロ転写／翻訳系においてまたは宿主細胞中にベクターが導入される場合 には宿主細胞において）ヌクレオチド配列を発現させるように調節配列に連結さ れることを意味すると考えられる。「調節配列」という用語はプロモーター、エ ンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むと 考えられる。そのような調節配列は例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（ １９９０）中に記述されている。調節配列は多数の型の宿主細胞においてヌクレ オチド配列の構成的発現を導くもの及びある種の宿主細胞においてのみヌクレオ チド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクタ ーの設計は形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベ ル等のような因子により決まる傾向があることを当業者は認識する。本発明の発 現ベクターを宿主細胞中に導入することができ、それにより本明細書に記述され るような核酸によりコードされる、融合タンパク質またはペプチドを初めとする タンパク質またはペプチドを製造することが できる（例えば、ＰＧＣ−１タンパク質、ＰＧＣ−１の突然変異体、融合タンパ ク質等）。 本発明の組み換え発現ベクターを原核または真核細胞におけるＰＧＣ−１の発 現のために設計することができる。例えば、ＰＧＣ−１をエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ ）のようなバクテリア細胞、（バキュロウイルス発現ベクターを用 いる）昆虫細胞、酵母細胞または哺乳類細胞において発現させることができる。 適当な宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａ ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）中にさらに説 明されている。あるいはまた、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメ ラーゼを用いて、インビトロで組み換え発現ベクターを転写し、翻訳することが できる。 原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれ かの発現を導く構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いてエ シェリキア・コリにおいて最も頻繁に実施される。融合ベクターはその中にコー ドされるタンパク質に、通常、組み換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ 酸を付加する。そのような融合ベクターは典型的に３つの目的：１）組み換えタ ンパク質の発現を上げるため；２）組み換えタンパク質の可溶性を上げるため； そして３）アフィニティー精製におけるリガンドとして働くことにより組み換え タンパク質の精製を促進するために役立つ。しばしば、融合発現ベクターでは、 融合タンパク質の精製の後に融合部分から組み換えタンパク質を分離できるよう に、タンパク質分解切断部位を融合部分と組み換えタンパク質 の連結部に導入する。そのような酵素及びそれらの対応する認識配列は第Ｘａ因 子、トロンビン及びエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターはｐＧ ＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｂ．及 びＪｏｈｎｓｏｎ、Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭ ＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ｍＡ）及び ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含み、それ らは標的組み換えタンパク質にそれぞれグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを融合させる。一 つの態様として、ＰＧＣ−１のコーディング配列をｐＧＥＸ発現ベクター中にク ローン化してＮ末端からＣ末端にＧＳＴ−トロンビン開裂部位−ＰＧＣ−１を含 んでなる融合タンパク質をコードするベクターを作製する。グルタチオン−アガ ロース樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより融合タンパク質を 精製することができる。トロンビンでの融合タンパク質の切断によりＧＳＴに融 合していない組み換えＰＧＣ−１を回収することができる。 適当な誘導性の非融合エシェリキア・コリ発現ベクターの例はｐＴｒｃ（Ａｍ ａｎｎ等（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ１１ｄ（Ｓ ｔｕｄｉｅｒ等、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ ｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９） を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現はハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ 融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写による。ｐＥＴ１１ｄベク ターから の標的遺伝子発現は共発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎｌ）に よりもたらされるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写による。 このウイルスポリメラーゼはｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７ ｇ ｎｌ遺伝子を保有する内在するλプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）ま たはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により与えられる。 エシェリキア・コリにおける組み換えタンパク質発現を最大にする一つの方法 は、組み換えタンパク質をタンパク質分解で切断する能力が損なわれている宿主 バクテリアにおいてタンパク質を発現させることである（Ｃｏｔｔｅｓｍａｎ、 Ｓ．、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄ ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓ ａｎ Ｄｅｉｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。別の 方法は、各アミノ酸の個々のコドンがエシェリキア・コリにおいて優先的に利用 されるものであるように発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を改変する ことである（Ｗａｄａ等（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２ ０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような改変を標準的なＤＮ Ａ合成技術により実施することができる。 別の態様として、ＰＧＣ−１発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サ ッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現のためのベ クターの例はｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ等（１９８７）Ｅｍｂｏ Ｊ． ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（ １９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ 等、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｅｉｇｏ、ＣＡ）を含む。 あるいはまた、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞においてＰＧ Ｃ−１を発現させることができる。培養した昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）に おけるタンパク質の発現のために利用できるバキュロウイルスベクターはｐＡｃ シリーズ（Ｓｍｉｔｈ等（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５ ６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ（１９ ８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）を含む。 さらに別の態様として、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞において本発 明の核酸を発現させる。哺乳類発現ベクターの例はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｂ． （１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａ ｎ等（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）を含む。哺乳類細胞にお いて用いられる場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルス調節要素によ り与えられる。例えば、一般に用いられるプロモーターはポリオーマ、アデノウ イルス２、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス４０から得られる。原核 及び真核細胞の両方のために適当な他の発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆ ｒｉｔｓｈ、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕａｌ ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９の１６及び１７章を参照。 別の態様として、組み換え哺乳類発現ベクターは特定の細胞型において選択的 に核酸の発現を導くことができる（例えば、核酸を発現させるために組織特異的 調節要素を用いる）。組織特異的調節要素は当該技術分野において知られている 。適当な組織特異的プロモーターの限定しない例はアルブミンプロモーター（肝 臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ等（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２ ７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ及びＥａｔｏｎ（１９８８ ）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロ モーター（Ｗｉｎｏｔｏ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８ ：７２９−７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ等（１９８３）Ｃｅｌ ｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃ ｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニ ューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ及びＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐ ＮＡＳ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ 等（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）及び乳腺特異的プロ モーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号及び欧 州出願公開第２６４，１６６号）を含む。また、発生的に調節されるプロモータ ー、例えば、マウスホックスプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ及びＧｒｕｓｓ（１９ ９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）及びα−フェトプロティンプ ロモーター（Ｃａｍｐｅｓ及びＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅ ｖ ．３：５３７−５４６）も含まれる。 本発明はさらにアンチセンスの向きに発現ベクターにクローン化された本発明 のＤＮＡ分子を含んでなる組み換え発現ベクターを提供する。 すなわち、ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡ分子を（ＤＮＡ分 子の転写により）発現させるようにＤＮＡ分子を調節配列に機能的に連結する。 様々な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を導く、アンチセンス の向きにクローン化された核酸に機能的に連結される調節配列、例えばウイルス プロモーター及び／またはエンハンサーを選択することができ、またはアンチセ ンスＲＮＡの構成的な組織特異的もしくは細胞型特異的発現を導く調節配列を選 択することができる。アンチセンス発現ベクターは組み換えプラスミド、ファー ジミドまたは弱毒ウイルスの形態であってもよく、その場合、アンチセンス核酸 は高効率調節領域の制御下で生産され、その活性をベクターが導入される細胞型 により決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の 説明は、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｈ．等、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ 、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１） １９８６を参照。 本発明の別の態様は本発明の組み換え発現ベクターが導入されている宿主細胞 に関する。「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」という用語は本明細書におい て互換的に用いられる。そのような用語は特定の該細胞だけでなくそのような細 胞の子孫または潜在的子孫もさすと理解される。突然変異または環境の影響のい ずれかによりある種の改変が次の世代に起こる可能性があるので、実際、そのよ うな子孫は親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書に用いられる用語の範 囲内にやはり含まれる。 宿主細胞はあらゆる原核または真核細胞であってもよい。例えば、エ シェリキア・コリのようなバクテリア細胞、昆虫細胞、酵母または（チャイニー ズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞のような）哺乳類細胞にお いてＰＧＣ−１タンパク質を発現させることができる。他の適当な宿主細胞は当 業者に知られている。 通常の形質転換またはトランスフェクション技術によりベクターＤＮＡを原核 または真核細胞中に導入することができる。本明細書に用いられる場合、「形質 転換」及び「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは 塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランが媒介するトランスフェクショ ン、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを初めとする、宿主細胞中 に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための様々な当該技術分野で認められ た技術をさすと考えられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするた めに適当な方法をＳａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ 、ＮＹ、１９８９）及び他の実験マニュアル中に見いだすことができる。 哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのために、用いられる発現ベクター 及びトランスフェクション技術により、わずかな割合の細胞のみがそれらのゲノ ム中に外来ＤＮＡを組込むことができることが知られている。これらの組込み体 を同定し、選択するために、通例、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐 性）をコードする遺伝子が目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に導入される。好ま しい選択マーカーはＧ４１ ８、ハィグロマィシン及びメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を与える ものを含む。選択マーカーをコードする核酸をＰＧＣ−１をコードするものと同 じベクター上で宿主細胞中に導入することができ、または別のベクター上で導入 することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞を薬剤 選択により同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を含んでいる細 胞は生存し、一方、他の細胞は死ぬ）。 ＰＧＣ−１タンパク質を生産する（すなわち、発現させる）ために培養中の原 核または真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞を用いることができる。従って 、本発明はさらに本発明の宿主細胞を用いるＰＧＣ−１タンパク質の製造方法を 提供する。一つの態様として、その方法はＰＧＣ−１が生産されるまで適当な培 地中で（ＰＧＣ−１をコードする組み換え発現ベクターが導入されている）本発 明の宿主細胞を培養することを含んでなる。別の態様として、その方法はさらに 培地または宿主細胞からＰＧＣ−１を単離することを含んでなる。 また、ヒト以外のトランスジェニック動物を製造するためにも本発明の宿主細 胞を用いることができる。体重疾患または不十分なインシュリン活性と関係する 疾患のような選択した疾患の有害な症状を改善することができる薬剤または化合 物、例えば、薬剤、医薬品等を同定するために考案されたスクリーニングアッセ イにおいてヒト以外のトランスジェニック動物を用いることができる。例えば、 一つの態様として、本発明の宿主細胞はＰＧＣ−１をコードする配列が導入され ている受精した卵母細胞または胚幹細胞である。次に、外来ＰＧＣ−１配列がゲ ノム中に導入されているヒト以外のトランスジェニック動物または内在性ＰＧＣ −１配列が改変されている相同的組み換え動物を作製するためにそのような宿主 細胞を用いることができる。そのような動物はＰＧＣ−１の機能及び／または活 性を研究するため並びにＰＧＣ−１活性のモジュレーターの同定及び／または評 価のために有用である。本明細書に用いられる場合、「トランスジェニック動物 」は動物の１つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含むヒト以外の動物、好ま しくは哺乳類、より好ましくはラットまたはマウスのような齧歯類である。トラ ンスジェニック動物の他の例はヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、 ニワトリ、両生類等を含む。導入遺伝子は細胞のゲノム中に組込まれる外来ＤＮ Ａであり、それからトランスジェニック動物は発生し、そしてそれは成熟した動 物のゲノム中にとどまり、それによりトランスジェニック動物の１つまたはそれ 以上の細胞型または組織においてコードされる遺伝子産物の発現を導く。本明細 書に用いられる場合、「相同的組み換え動物」は動物の発生前に内在性遺伝子と 動物の細胞、例えば動物の胚細胞中に導入された外来ＤＮＡ分子の間の相同的組 み換えにより内在性ＰＧＣ−１遺伝子が改変されているヒト以外の動物、好まし くは哺乳類、より好ましくはマウスである。 例えば、微量注入、レトロウイルス感染により、受精した卵母細胞の雄性前核 中にＰＧＣ−１をコードする核酸を導入し、そして偽妊娠メス仮親動物において 卵母細胞を発生させることにより本発明のトランスジェニック動物を作ることが できる。ヒトＰＧＣ−１ ｃＤＮＡ配列を導入遺伝子としてヒト以外の動物のゲ ノム中に導入することができる。あるいはまた、マウスＰＧＣ−１遺伝子（配列 番号：１）のようなヒトＰＧＣ−１遺伝子のヒト以外の相同物を導入遺伝子とし て用いることができ る。また、導入遺伝子の発現の効率を上げるためにイントロン配列及びポリアデ ニル化シグナルも導入遺伝子中に含むことができる。特定の細胞にＰＧＣ−１タ ンパク質の発現を導くために組織特異的調節配列をＰＧＣ−１導入遺伝子に機能 的に連結することができる。胚操作及び微量注入によるトランスジェニック動物 、特にマウスのような動物の作製方法は当該技術分野において一般的になってき ており、例えば、両方ともＬｅｄｅｒ等による米国特許第４，７３６，８６６号 及び４，８７０，００９号、Ｗａｇｎｅｒ等による米国特許第４，８３７，１９ １号中並びにＨｏｇａｎ、Ｂ．、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓ ｅ Ｅｍｂｒｙｏ 、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９ ８６）中に記述されている。他のトランスジェニック動物の製造のために類似し た方法を用いる。ゲノム中のＰＧＣ−１導入遺伝子の存在及び／または動物の組 織もしくは細胞におけるＰＧＣ−１ ｍＲＮＡの発現に基づいてトランスジェニ ック創始動物（ｆｏｕｎｄｅｒ ａｎｉｍａｌ）を同定することができる。次に 、導入遺伝子を保有するさらなる動物をつくるためにトランスジェニック創始動 物を用いることができる。さらに、ＰＧＣ−１コードする導入遺伝子を保有する トランスジェニック動物を他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動 物にさらに交配させることができる。 相同的組み換え動物を作製するために、欠失、付加または置換が導入されてお り、それによりＰＧＣ−１遺伝子を改変する、例えば機能的に破壊するＰＧＣ− １遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ＰＧＣ−１遺伝子は（例 えば、配列番号：１のｃＤＮＡでスクリーニン グされたヒトゲノムライブラリーから単離されたヒトゲノムクローンからの）ヒ ト遺伝子であってもよいが、より好ましくは、ヒトＰＧＣ−１遺伝子のヒト以外 の相同物である。例えば、マウスゲノム中の内在性ＰＧＣ−１遺伝子を改変する ために適当な相同的組み換えベクターを構築するためにマウスＰＧＣ−１遺伝子 を用いることができる。好ましい態様として、相同的組み換え時に、内在性ＰＧ Ｃ−１遺伝子が機能的に破壊されるようにベクターを設計する（すなわち、もは や機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる） 。あるいはまた、相同的組み換え時に、内在性ＰＧＣ−１遺伝子が突然変異され るかまたはそうでなければ改変されるが、なお機能的タンパク質をコードするよ うにベクターを設計することができる（例えば、上流調節領域を改変し、それに より内在性ＰＧＣ−１タンパク質の発現を変えることができる）。相同的組み換 えベクターでは、ベクターにより保有される外来ＰＧＣ−１遺伝子と胚幹細胞中 の内在性ＰＧＣ−１遺伝子の間で相同的組み換えを起こさせるために、ＰＧＣ− １遺伝子の改変される部分にはその５’及び３’末端でＰＧＣ−１遺伝子のさら なる核酸が隣接する。さらに隣接するＰＧＣ−１核酸は内在性遺伝子との成功し た相同的組み換えのために十分な長さのものである。典型的に、（５’及び３’ 末端の両方で）数キロ塩基の隣接するＤＮＡがベクター中に含まれる（相同的組 み換えベクターの説明には例えば、Ｔｈｏｍａｓ、Ｋ．Ｒ．及びＣａｐｅｃｃｈ ｉ、Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照）。（例えば、エレク トロポレーションにより）ベクターを胚幹細胞系中に導入し、そして導入したＰ ＧＣ−１遺伝子が内在性ＰＧＣ−１と相同的に組み換わっている細胞を選択する （例えば、Ｌｉ、Ｅ．等（１ ９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照）。次に、選択した細胞を動物（例えば 、マウス）の胚盤胞中に注入して集合キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅ ｙ、Ａ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓ ｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ 中、Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編集（ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８７）ｐｐ．１１３−１ ５２を参照）。次に、キメラ胚を適当な偽妊娠メス仮親動物中に移植し、胚を出 産させることができる。導入遺伝子の生殖系列伝達により動物の全ての細胞が相 同的に組み換えられたＤＮＡを含む動物をつくるために生殖細胞中に相同的に組 み換えられたＤＮＡを保有する子孫を用いることができる。相同的組み換えベク ター及び相同的組み換え動物を構築するための方法はＢｒａｄｌｅｙ、Ａ．（１ ９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：８２３−８２９中及びＰＣＴ国際公開：Ｌｅ Ｍｏｕｅｌｌｅｃ等による ＷＯ第９０／１１３５４号；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ等によるＷＯ第９１／０１１４０ 号；Ｚｉｊｌｓｔｒａ等によるＷＯ第９２／０９６８号；及びＢｅｒｎｓ等によ るＷＯ第９３／０４１６９号中にさらに記述されている。 別の態様として、導入遺伝子の調節発現を与える選択系を含有するヒト以外の トランスジェニック動物を製造することができる。そのような系の一つの例はバ クテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰ組み換え酵素系である。ｃｒｅ／ｌｏ ｘＰ 組み換え酵素系の説明には、例えば、Ｌａｋｓｏ等（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６を参照。組み換え酵素系の別の例はサッカロミセス・ セレビシエのＦＬＰ組み換え酵素系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ等（１９９１）Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２ ５１：１３５１−１３５５）。導入遺伝子の発現を調節するためにｃｒｅ／ｌｏ ｘＰ 組み換え酵素系が用いられる場合、Ｃｒｅ組み換え酵素及び選択したタンパ ク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要とされる。例えば、選 択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有するものと組み換え酵素をコー ドする導入遺伝子を含有するものの２匹のトランスジェニック動物を交配させる ことによる、「二重」トランスジェニック動物の構築によりそのような動物を与 えることができる。 また、Ｗｉｌｍｕｔ、Ｉ．等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８ １３及びＰＣＴ国際公開ＷＯ第９７／０７６６８号及びＷＯ第９７／０７６６９ 号中に記述された方法に従って、本明細書に記述されるヒト以外のトランスジェ ニック動物のクローンを製造することもできる。簡潔に言えば、トランスジェニ ック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、増殖周期を出てＧ₀期に入るよう に誘導することができる。次に、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞が 単離された同じ種の動物からの脱核した卵母細胞に静止細胞を融合させることが できる。次に、再生した卵母細胞が桑実胚または胚盤胞に発生するようにそれを 培養し、次に、偽妊娠メス仮親動物に移す。このメス仮親動物に生まれた子孫は 細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンである。III ．単離されたＰＧＣ−１タンパク質及び抗−ＰＧＣ−１抗体 本発明の別の態様は抗−ＰＧＣ−１抗体を作製するための免疫原としての使用 のために適当な単離されたＰＧＣ−１タンパク質及びその生物学的に活性のある 部分並びにペプチドフラグメントに関する。「単離された」または「精製された 」タンパク質またはその生物学的に活性のある部分は、組み換えＤＮＡ技術によ り製造される場合には細胞物質また は化学的に合成される場合には化学前駆物質もしくは他の化学製品を実質的に含 まない。「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、天然でまたは組み換え で生産される細胞の細胞成分からタンパク質が分離されているＰＧＣ−１タンパ ク質の調製物を含む。一つの態様として、「細胞物質を実質的に含まない」とい う用語は、（乾量で）約３０％未満の（本明細書において「混入するタンパク質 」とも呼ばれる）ＰＧＣ−１以外のタンパク質、より好ましくは約２０％未満の ＰＧＣ−１以外のタンパク質、さらにより好ましくは約１０％未満のＰＧＣ−１ 以外のタンパク質、最も好ましくは約５％未満のＰＧＣ−１以外のタンパク質を 含むＰＧＣ−１タンパク質の調製物を含む。ＰＧＣ−１タンパク質またはその生 物学的に活性のある部分が組み換えで製造される場合、それは好ましく培養培地 も実質的に含まず、すなわち、培養培地はタンパク質調製物の容量の約２０％未 満、より好ましくは約１０％、最も好ましくは約５％未満に相当する。「化学前 駆物質または他の化学製品を実質的に含まない」という用語は、タンパク質の合 成に関係する化学前駆物質または他の化学製品からタンパク質が分離されている ＰＧＣ−１タンパク質の調製物を含む。一つの態様として、「化学前駆物質また は他の化学製品を実質的に含まない」という用語は、（乾量で）約３０％未満の 化学前駆物質またはＰＧＣ−１以外の化学薬品、より好ましくは約２０％未満の 化学前駆物質またはＰＧＣ−１以外の化学薬品、さらにより好ましくは約１０％ 未満の化学前駆物質またはＰＧＣ−１以外の化学薬品、最も好ましくは約５％未 満の化学前駆物質またはＰＧＣ−１以外の化学薬品を含むＰＧＣ−１タンパク質 の調製物を含む。好ましい態様として、単離されたタンパク質またはその生物学 的に活性のあるタンパク質は、 ＰＧＣ−１タンパク質が得られた同じ動物からの混入するタンパク質がない。典 型的に、そのようなタンパク質は、例えば、ヒト以外の細胞におけるヒトＰＧＣ −１タンパク質の組み換え発現により製造される。 本発明の単離されたＰＧＣ−１タンパク質またはその一部は以下の生物学的活 性：１）ＰＰＡＲ_γと相互作用する（例えば、結合する）ことができる；２）Ｐ ＰＡＲ_γ活性を調節することができる；３）ＵＣＰ発現を調節することができる ；４）脂肪細胞における熱発生、例えば、褐色脂肪細胞または筋肉における熱発 生を調節することができる；５）脂肪細胞または筋肉における酸素消費を調節す ることができる；６）脂肪細胞化、例えば、褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分 化を調節することができる；７）細胞のインシュリン感受性、例えば、筋肉細胞 、肝細胞、脂肪細胞のインシュリン感受性を調節することができる；８）核ホル モン受容体、例えば、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、レチノイン 酸受容体と相互作用する（例えば、結合する）ことができる；９）核ホルモン受 容体の活性を調節することができる；そして１０）転写因子Ｃ／ＥＢＰαと相互 作用する（例えば、結合する）ことができるの１つまたはそれ以上を有する。好 ましい態様として、ＰＧＣ−１タンパク質は褐色脂肪細胞への白色脂肪細胞の分 化及び／または褐色脂肪細胞もしくは筋肉細胞における熱発生を調節することが できる。 好ましい態様として、タンパク質またはその一部は、タンパク質またはその一 部が脂肪細胞の分化及び／または褐色脂肪細胞における熱発生を調節する能力を 保持するように配列番号：２のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を含ん でなる。タンパク質の一部は好ましくは本明細書に記述されるような生物学的に 活性のある部分である。別の好まし い態様として、ＰＧＣ−１タンパク質（すなわち、アミノ酸残基１−７９７）は 配列番号：２に示されるアミノ酸配列または配列番号：２に示されるアミノ酸配 列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少な くとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましく は少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはそれ 以上相同なアミノ酸配列を有する。さらに別の好ましい態様として、ＰＧＣ−１ タンパク質は配列番号：１のヌクレオチド配列または配列番号：１に示されるヌ クレオチド配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好 ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらに より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％ もしくはそれ以上相同なヌクレオチド配列にハイブリダイズする、例えば、スト リンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされ るアミノ酸配列を有する。また、本発明の好ましいＰＧＣ−１タンパク質は好ま しくは本明細書に記述されるＰＧＣ−１の生物学的活性の少なくとも１つも保有 する。例えば、本発明の好ましいＰＧＣ−１タンパク質は、配列番号：１のヌク レオチド配列にハイブリダイズする、例えば、ストリンジェントな条件下でハイ ブリダイズするヌクレオチド配列よりコードされ且つ褐色脂肪細胞への白色脂肪 細胞の分化及び／または褐色脂肪細胞の熱発生を調節することができるアミノ酸 配列を含む。別の態様として、上のサブセクションＩにおいて詳細に記述された ように、ＰＧＣ−１タンパク質は配列番号：２のアミノ酸配列に実質的に相同で あり、そして配列番号：２のタンパク質の機能的活性を保持するが、天然の対立 遺伝子変異または突然変異 誘発によりアミノ酸配列が異なる。従って、別の態様として、ＰＧＣ−１タンパ ク質は配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくと も約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくと も約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは 少なくとも約９５％もしくはそれ以上相同なアミノ酸配列を含んでなるタンパク 質である。 ＰＧＣ−１タンパク質の生物学的に活性のある部分はＰＧＣ−１タンパク質の アミノ酸配列、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列またはＰＧＣ−１ タンパク質に相同なタンパク質のアミノ酸配列から得られるアミノ酸配列を含ん でなるペプチドを含み、それは全長ＰＧＣ−１タンパク質またはＰＧＣ−１タン パク質に相同な全長タンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＰＧＣ−１タ ンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的に、生物学的に活性のある部分 （ペプチド、例えば、５、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、 ３９、４０、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸の長さであるペプチド）は 、ＰＧＣ−１タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチー フ、例えば、チロシンリン酸化部位、ｃＡＭＰリン酸化部位、セリン−アルギニ ン（ＳＲ）に富んだドメイン及び／またはＲＮＡ結合モチーフを含んでなる。好 ましい態様として、本明細書に記述されるドメイン／モチーフの１つまたはそれ 以上を含むタンパク質の生物学的に活性のある部分は、脂肪細胞の分化及び／ま たは褐色脂肪細胞における熱発生を調節することができる。さらに、組み換え技 術によりタンパク質の他の領域が除かれている他の生物学的に活性のある部分を 調製し、本明細書に記述される１つまたはそれ以上の活性に関して評価すること が できる。好ましくは、ＰＧＣ−１タンパク質の生物学的に活性のある部分は生物 学的活性を有する１つまたはそれ以上の選択したドメイン／モチーフまたはその 一部を含む。 好ましくはＰＧＣ−１タンパク質を組み換えＤＮＡ技術により製造する。例え ば、タンパク質をコードする核酸分子を（上記のような）発現ベクター中にクロ ーン化し、発現ベクターを（上記のような）宿主細胞中に導入し、宿主細胞にお いてＰＧＣ−１タンパク質を発現させる。次に、標準的なタンパク質精製技術を 用いて適切な精製スキームにより細胞からＰＧＣ−１タンパク質を単離すること ができる。組み換え発現の代わりに、標準的なペプチド合成技術を用いてＰＧＣ −１タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを化学的に合成することができる 。さらに、例えば抗−ＰＧＣ−１抗体（以下にさらに記述される）を用いて、細 胞（例えば、褐色脂肪細胞）から天然のＰＧＣ−１タンパク質を単離することが できる。 また、本発明はＰＧＣ−１キメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書 に用いられる場合、ＰＧＣ−１「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」 はＰＧＣ−１以外のポリペプチドに機能的に連結されたＰＧＣ−１ポリペプチド を含んでなる。「ＰＧＣ−１ポリペプチド」はＰＧＣ−１に相当するアミノ酸配 列を有するポリペプチドをさし、一方、「ＰＧＣ−１以外のポリペプチド」はＰ ＧＣ−１タンパク質に実質的に相同でないタンパク質、例えば、ＰＧＣ−１タン パク質と異なり、そして同じまたは異なる生物から得られるタンパク質に相当す るアミノ酸配列を有するポリペプチドをさす。融合タンパク質内の、「機能的に 連結された」という用語は、ＰＧＣ−１ポリペプチドとＰＧＣ−１以外のポ リペプチドが相互にイン−フレームで融合されることを示すと考えられる。ＰＧ Ｃ−１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にＰＧＣ−１以外のポリペプチドを融 合させることができる。例えば、一つの態様として融合タンパク質は、ＰＧＣ− １配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されているＧＳＴ−ＰＧＣ−１融合タンパク 質である（実施例IV参照）。そのような融合タンパク質は組み換えＰＧＣ−１の 精製を容易にすることができる。別の態様として、融合タンパク質はそのＮ末端 に異種起源のシグナル配列を含有するＰＧＣ−１タンパク質である。ある種の宿 主細胞（例えば、哺乳類の宿主細胞）では、異種起源のシグナル配列の使用によ りＰＧＣ−１の発現及び／または分泌を増やすことができる。 好ましくは、標準的な組み換えＤＮＡ技術により本発明のＰＧＣ−１キメラま たは融合タンパク質を製造する。例えば、通常の技術に従って、例えば、ライゲ ーションのために平滑末端または付着末端を用い、適切な末端を与えるための制 限酵素消化、必要な場合付着末端の充填、望ましくない連結を防ぐためのアルカ リホスファターゼ処理及び酵素的連結により、異なるポリペプチド配列をコード するＤＮＡフラグメントをインフレームで一緒に連結する。別の態様として、自 動ＤＮＡ合成機を含む通常の技術により融合遺伝子を合成することができる。あ るいはまた、２つの連続した遺伝子フラグメント間で相補的突出を生じるアンカ ープライマを用いて遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施することができ、続 いて、それらをアニーリングさせ、再増幅してキメラ遺伝子配列を作製すること ができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ａｕｓｕｂｅｌ等編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ ｏｎｓ：１９９２を参照）。さらに、融合 部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードする多数の発現ベクターが 市販されている。融合部分がＰＧＣ−１タンパク質にインフレームで連結される ように、ＰＧＣ−１をコードする核酸をそのようなベクター中にクローン化する ことができる。 また、本発明はＰＧＣ−１アゴニスト（模倣物）またはＰＧＣ−１アンタゴニ ストのいずれかとして機能するＰＧＣ−１タンパク質の相同物にも関する。好ま しい態様として、ＰＧＣ−１アゴニスト及びアンタゴニストはＰＧＣ−１タンパ ク質の天然に存在する形態の生物学的活性の一組をそれぞれ刺激または抑制する 。従って、限られた機能の相同物での処置により特定の生物学的作用を引き出す ことができる。一つの態様として、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的 活性の一組を有する相同物での患者の処置は、ＰＧＣ−１タンパク質の天然に存 在する形態での処置に比べて患者において少ない副作用を有する。 ＰＧＣ−１タンパク質の相同物を突然変異誘発、例えば、ＰＧＣ−１タンパク 質の別個の点突然変異または欠失により作製することができる。本明細書に用い られる場合、「相同物」という用語はＰＧＣ−１タンパク質の活性のアゴニスト またはアンタゴニストとして働くＰＧＣ−１タンパク質の変異形態をさす。ＰＧ Ｃ−１タンパク質のアゴニストはＰＧＣ−１タンパク質の生物学的活性の実質的 に同じものまたは一組を保持することができる。ＰＧＣ−１タンパク質のアンタ ゴニストは、例えば、ＰＧＣ−１タンパク質を含むＰＧＣ−１カスケードの下流 または上流のメンバーに競合的に結合することにより、ＰＧＣ−１タンパク質の 天然に存在する形態の活性の１つまたはそれ以上を妨げることができる。従って 、本発明の哺乳類ＰＧＣ−１タンパク質及びその相同物は、例えば、 脂肪細胞分化及び／または褐色脂肪細胞における熱発生の正または負のいずれか のレギュレーターであってもよい。 別の態様として、ＰＧＣ−１タンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性 に関してＰＧＣ−１タンパク質の突然変異体、例えば欠失突然変異体の組み合わ せライブラリーをスクリーニングすることによりＰＧＣ−１タンパク質の相同物 を同定することができる。一つの態様として、ＰＧＣ−１変異体の様々なライブ ラリーは核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発により作製され、そして様々な 遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、可能性があるＰＧＣ−１配列 の縮重組が個々のポリペプチドとして、あるいはまたＰＧＣ−１配列の組を中に 含有する（例えば、ファージ展示のための）一組のより大きい融合タンパク質と して発現できるように合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に 連結することによりＰＧＣ−１変異体の様々なライブラリーを製造することがで きる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性があるＰＧＣ−１相同物のライブ ラリーを製造するために用いることができる様々な方法がある。自動ＤＮＡ合成 機で縮重遺伝子配列の化学合成を実施することができ、次に、合成遺伝子を適切 な発現ベクター中に連結することができる。遺伝子の縮重組の使用により、可能 性があるＰＧＣ−１配列の適切な組をコードする配列の全てを一つの混合物中に 与えることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該技術分野におい て知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ、Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ等（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ等（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９ ８：１０５６；Ｉｋｅ等（１９８３）Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ．１１：４７７を参照）。 さらに、ＰＧＣ−１タンパク質の相同物のスクリーニング及びその後の選択の ためのＰＧＣ−１フラグメントの様々な集団を作製するためにＰＧＣ−１タンパ ク質コーディングのフラグメントのライブラリーを用いることができる。一つの 態様として、ニックが分子当たり約１回のみ起こる条件下でＰＧＣ−１コーディ ング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを 変成させ、異なるニック生成物からのセンス／アンチセンス対を含むことができ る二本鎖ＤＮＡを形成するようにＤＮＡを再生させ、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理 により再形成された二本鎖から一本鎖部分を取り除き、そして得られたフラグメ ントライブラリーを発現ベクター中に連結することによりコーディング配列フラ グメントのライブラリーを作製することができる。この方法により、ＰＧＣ−１ タンパク質の様々な大きさのＮ末端、Ｃ末端及び内部フラグメントをコードする 発現ライブラリーを得ることができる。 点突然変異または欠失により作られた組み合わせライブラリーの遺伝子産物を スクリーニングするため及び選択した特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該技術分野におい て知られている。そのような技術はＰＧＣ−１相同物の組み合わせ突然変異誘発 により作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適応でき る。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高処理量分析を容 易にできる最も一般に用いられる技術は、典型的に、複製可能なクター中に遺伝 子ライブラリーをクローニングし、ベクターの得られたライブラリーで適切な細 胞を形質転換し、そして適切な活性の検出により、産物が検出された遺 伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で組み合わせ遺伝子を発現 させることを含む。ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を高める新し い技術のリクルシブ・アンサンブル突然変異誘発（Ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ ｅｎｓ ｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＲＥＭ））をＰＧＣ−１相同物を同定す るためにスクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる（Ａｒｋｉ ｎ及びＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅ ｌｇｒａｖｅ等（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３ ）：３２７６−３３１）。 ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準技術を用いてＰＧＣ −１に結合する抗体を作製するために免疫原として単離されたＰＧＣ−１タンパ ク質またはその一部もしくはフラグメントを用いることができる。全長ＰＧＣ− １タンパク質を用いることができ、あるいはまた本発明は免疫原としての使用の ためにＰＧＣ−１の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＰＧＣ−１の抗原 性ペプチドは配列番号：２に示されるアミノ酸配列または本明細書に記述される ような相同なアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含んでなり、そしてペ プチドに対して作製された抗体がＰＧＣ−１と特異的免疫複合体を形成するよう にＰＧＣ−１のエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは少なくとも１ ０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、さらにより好ま しくは少なくとも２０アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残 基を含んでなる。抗原性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープはタンパク 質の表面上に位置するＰＧＣ−１の領域、例えば親水性領域である。 典型的にＰＧＣ−１免疫原は免疫原で適当な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マ ウスまたは他の哺乳類）を免疫することにより抗体を製造するために用いられる 。適切な免疫原調製物は、例えば、組み換えで発現されたＰＧＣ−１タンパク質 または化学的に合成されたＰＧＣ−１ペプチドを含むことができる。調製物はさ らにフロイント完全もしくは不完全アジュバントのようなアジュバントまたは類 似した免疫刺激剤を含むことができる。免疫原性ＰＧＣ−１調製物での適当な対 象の免疫はポリクローナル抗−ＰＧＣ−１抗体反応を誘導する。 従って、本発明の別の態様は抗−ＰＧＣ−１抗体に関する。本明細書に用いら れる場合、「抗体」という用語は免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の 免疫学的に活性のある部分、すなわち、ＰＧＣ−１のような抗原に特異的に結合 する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子をさす。免疫グロブリン分子 の免疫学的に活性のある部分の例は、ペプシンのような酵素で抗体を処理するこ とにより作製することができるＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）₂フラグメントを含 む。本発明はＰＧＣ−１に結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を提 供する。本明細書に用いられる場合、「モノクローナル抗体」または「モノクロ ーナル抗体組成物」という用語は、ＰＧＣ−１の特定のエピトープと免疫反応す ることができる１種のみの抗原結合部位を含む抗体分子の集団をさす。従って、 モノクローナル抗体組成物は典型的にそれが免疫反応する特定のＰＧＣ−１タン パク質に対して単一の結合親和性を示す。 ＰＧＣ−１免疫原で適当な対象を免疫することにより上記のようにポリクロー ナル抗−ＰＧＣ−１抗体を調製することができる。固定したＰＧＣ−１を用いる 固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）でのような標準技 術により、免疫した対象における抗−ＰＧＣ−１抗体力価を時間にわたって調べ ることができる。必要な場合、哺乳類から（例えば、血液から）ＰＧＣ−１に対 して誘導された抗体分子を単離することができ、そしてＩｇＧ画分を得るための プロテインＡクロマトグラフィーのようなよく知られている技術によりさらに精 製することができる。免疫後の適切な時間で、例えば、抗−ＰＧＣ−１抗体力価 が最も高い時に、対象から抗体産生細胞を得ることができ、そしてＫｏｈｌｅｒ 及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７） により最初に記述されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎ等（１９８１）Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎ等（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈ等（１９７６）ＰＮＡＳ ７６： ２９２７−３１；及びＹｅｈ等（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９： ２６９−７５も参照）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏ ｒ等（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリ ドーマ技術（Ｃｏｌｅ等（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ 、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉ ｎｃ．、ｐｐ．７７−９６）またはトリオーマ技術のような標準技術によりモノ クローナル抗体を製造するために用いることができる。モノクローナル抗体ハイ ブリドーマを製造するための技術はよく知られている（一般的にＲ．Ｈ．Ｋｅｎ ｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍ ｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ 中、Ｐｌｅｎｕ ｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎ ｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；Ｍ ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒ等（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３ ：２３１−３６を参照）。簡潔に言えば、上記のようにＰＧＣ−１免疫原で免疫 した哺乳類からのリンパ球（典型的に脾臓細胞）に不死化細胞系（典型的には骨 髄腫）を融合させ、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニ ングしてＰＧＣ−１に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを 同定する。 リンパ球と不死化細胞系を融合させるために用いられる多数のよく知られてい るプロトコルのいずれも抗−ＰＧＣ−１モノクローナル抗体を作製する目的のた めに用いることができる（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ等（１９７７）Ｎａｔｕｒ ｅ ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒ等、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎ ｅｔ ．上記引用；Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．上記引用； Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、上記引用を参 照）。さらに、同様に有用であるそのような方法の多数の変形があることを当業 者は認識する。典型的に、不死化細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）をリンパ球と 同じ哺乳類種から得る。例えば、本発明の免疫原性調製物で免疫したマウスから のリンパ球を不死化したマウス細胞系と融合させることによりマウスハイブリド ーマを作ることができる。好ましい不死化細胞系はヒポキサンチン、アミノプテ リン及びチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ」培地）に感受性であるマウス 骨髄腫細胞系である。標準技術による融合相手として多数の骨髄腫細胞系のいず れも、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３ またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇｌ４骨髄腫系を用いることができる。これらの骨髄腫系 はＡＴＣ Ｃから入手できる。典型的には、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用い てＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞をマウス脾臓細胞に融合させる。次に、融合 していない及び非生産的に融合した骨髄腫細胞を殺す（融合していない脾臓細胞 はトランスフォームされていないので数日後に死ぬ）ＨＡＴ培地を用いて融合か ら生じるハイブリドーマ細胞を選択する。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイを用 いて、ＰＧＣ−１に結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニ ングすることにより本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞 を検出する。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造する代わりに 、組み換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージ展示 ライブラリー）をＰＧＣ−１でスクリーニングし、それによりＰＧＣ−１に結合 する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、モノクローナ ル抗−ＰＧＣ−１抗体を同定し、単離することができる。ファージ展示ライブラ リーを作製し、スクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ 、カタログ番号２７−９４００−０１：及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ ^TM（商標）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ、カタログ番 号２４０６１２）。さらに、抗体展示ライブラリーの作製及びスクリーニングに 特に容易に使用できる方法及び試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒ等、米国特許 第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ等、ＰＣＴ国際公開ＷＯ第９２／１８６１９ 号；Ｄｏｗｅｒ等、ＰＣＴ国際公開ＷＯ第９１／１７２７１：Ｗｉｎｔｅｒ等、 ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ等、ＰＣＴ国際公開 ＷＯ第９２／１５６７９号；Ｂ ｒｅｉｔｌｉｎｇ等、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅ ｒｔｙ等、ＰＣＴ国際公開ＷＯ第９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｎｄ等、ＰＣ Ｔ国際公開ＷＯ第９２／０９６９０号；Ｌａｄｎｅｒ等、ＰＣＴ国際公開ＷＯ第 ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ等（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈ ｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ等（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ ｌ ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ等（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６− ３５８０；Ｇａｒｒａｄ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１ ３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓ等（１９９１）ＰＮＡＳ ８ ８：７９７８−７９８２；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９９ ０）３４８：５５２−５５４中に見いだすことができる。 さらに、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる、ヒト及び ヒト以外の両方の部分を含んでなるキメラ及びヒト化モノクローナル抗体のよう な組み換え抗−ＰＧＣ−１抗体は本発明の範囲内である。例えば、Ｒｏｂｉｎｓ ｏｎ等、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａ等、欧州特許 出願１８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｍ．、欧州特許出願１７１，４９６ ；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、欧州特許出願１７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、 ＰＣＴ国際公開第 ＷＯ ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙ等、米国特許第４，８１６，５６７号 ；Ｃａｂｉｌｌｙ等、欧州特許出願１２５，０２３：Ｂｅｔｔｅｒ等（１９８８ ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ等（１９８７）ＰＮＡ Ｓ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ等（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ等（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４−２ １８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１ ００５；Ｗｏｏｄ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；及び Ｓｈａｗ等（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５ ３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ等（１９８６）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ米国特許５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ等（１９ ８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５：Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ等（１９８ ８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；及びＢｅｉｄｌｅｒ等（１９８８）Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１４１：４０５３−４０６０中に記述された方法を用いて、 当該技術分野で知られている組み換えＤＮＡ技術によりそのようなキメラ及びヒ ト化モノクローナル抗体を製造することができる。 アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法のような標準技術により ＰＧＣ−１を単離するために抗−ＰＧＣ−１抗体（例えば、モノクローナル抗体 ）を用いることができる。抗−ＰＧＣ−１抗体は細胞からの天然のＰＧＣ−１及 び宿主細胞において発現された組み換えで製造されたＰＧＣ−１の精製を容易に することができる。さらに、ＰＧＣ−１タンパク質の発現の量及びパターンを評 価するために抗−ＰＧＣ− １抗体を用いて（例えば、細胞ライセートまたは細胞上清中の）ＰＧＣ−１タン パク質を検出することができる。臨床試験方法の一部として組織中のタンパク質 レベルを調べるため、例えば、与えられた処置投薬計画の効能を決定するために 、抗−ＰＧＣ−１抗体を診断的に用いることができる。抗体を検出可能な物質に 連結する（すなわち、物理的に連結する）ことにより検出を容易にすることがで きる。検出可能な物質の例は様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生 物発光物質及び放射性物質を含む。適当な酵素の例は西洋ワサビペルオキシダー ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエス テラーゼを含み；適当な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチン 及びアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン（ｕｍ ｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート 、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド またはフィコエリトリンを含み；発光物質の例はルミノールを含み；生物発光物 質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み、そして適当な放 射性物質の例は¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓまたは³Ｈを含む。IV ．製薬学的組成物 本発明のＰＧＣ−１核酸分子、ＰＧＣ−１タンパク質、ＰＧＣ−１モジュレー ター及び抗−ＰＧＣ−１抗体（本明細書において「活性化合物」とも呼ばれる） を患者、例えばヒトへの投与のために適当な製薬学的組成物に混和することがで きる。そのような組成物は典型的に核酸分子、タンパク質、モジュレーターまた は抗体及び製薬学的に許容しうる担体を含んでなる。本明細書に用いられる場合 、「製薬学的に許容しうる担 体」という用語は、製薬学的投与と適合した全ての溶媒、分散媒質、被覆、抗菌 及び抗真菌剤、等張化及び吸収遅延剤等を含むと考えられる。製薬学的に活性の ある物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は当該技術分野においてよく知 られている。あらゆる通常の媒質または薬剤が活性化合物と適合している限り、 そのような媒質を本発明の組成物に用いることができる。また、補助活性化合物 も組成物中に混和することができる。 本発明の製薬学的組成物をその意図される投与の経路と適合するように調合す る。投与の経路の例は非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸 入）、経皮（局所的）、経粘膜及び直腸投与を含む。非経口、皮内または皮下施 用のために用いられる溶液または懸濁液は以下の成分：注入用の水、食塩水溶液 、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールま たは他の合成溶媒のような滅菌した希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパ ラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような抗酸 化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩また はリン酸塩のようなバッファー；及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのよ うな張性の調整のための薬剤を含むことができる。塩酸または水酸化ナトリウム のような酸または塩基でｐＨを調整することができる。非経口製剤をガラスまた はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数投与量バイアル中に入 れることができる。 注入用途のために適当な製薬学的組成物は（水溶性の）滅菌水溶液または分散 液及び滅菌した注入可能な溶液または分散液の必要に応じた調製のための滅菌し た粉末を含む。静脈内投与のために適当な担体は生理 食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ^TM（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉ ｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合にお いて、組成物は無菌でなけらばならず、そして容易に注入できる程度に流動的で あるべきである。それは製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして バクテリア及び真菌のような微生物の混入作用から保護されなけらばならない。 担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン グリコール及び液状ポリエチレングリコール等）及びそれらの適当な混合物を含 有する溶媒または分散媒質であってもよい。例えば、ルシチンのような被覆の使 用により、分散液の場合には必要とされる粒度の維持により、そして界面活性剤 の使用により、適切な流動性を保つことができる。様々な抗菌及び抗真菌剤、例 えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサー ル等により微生物の作用を防止することができる。多くの場合において、等張化 剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化 ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えば、ア ルミニウムモノステアレート及びゼラチンを組成物中に含むことにより注入可能 な組成物の持続性吸収をもたらすことができる。 必要な場合、上に列挙した成分の一つまたは組み合わせと適切な溶媒中で必要 量の活性化合物（例えば、ＰＧＣ−１タンパク質または抗−ＰＧＣ−１抗体）を 混和し、続いて濾過滅菌することにより滅菌した注入可能溶液を調製することが できる。通例、基本分散媒質及び上に列挙したものからの必要とされる他の成分 含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を混和することにより分散液を調製する。滅菌 した注入可能溶液の調製の ための滅菌した粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、 それは先に滅菌濾過したその溶液から有効成分とあらゆるさらなる適切な成分の 粉末をもたらす。 通例、経口組成物は不活性希釈剤または食用担体を含む。それらをゼラチンカ プセル中に入れるかまたは錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的に は、活性化合物を賦形剤と混和し、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で 用いることができる。また、口内洗浄剤としての使用のために流体担体を用いて 経口組成物を調製することもでき、その場合、流体担体中の化合物は経口的に施 用され、切り取られ（ｓｗｉｓｈｅｄ）、そして吐き出されるかまたは燕下され る。製薬学的に適合した結合剤及び／または添加剤物質を組成物の一部として含 むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は以下の成分または類 似した性質の成分：微晶質セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンのよ うな結合剤；澱粉もしくはラクトースのような賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏ ｇｅｌもしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもし くはＳｔｅｒｏｔｅｓのような滑剤；コロイド二酸化ケイ素のような減摩剤（ｇ ｌｉｄａｎｔ）；ショ糖もしくはサッカリンのような甘味料；またはペパーミン ト、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバーのような香料のいずれも含有 することができる。 吸入による投与のために、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のような気体を含 有する加圧した容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアゾールスプレ ーの形態で化合物を送達する。 全身投与は経粘膜または経皮手段によってもよい。経粘膜または経皮投与には 、透過される防壁に適切な浸透剤を配合物中に用いる。そのよ うな浸透剤は当該技術分野において一般に知られており、例えば、経粘膜投与に は洗剤、胆汁塩及びフシジン酸誘導体を含む。鼻スプレーまたは座薬の使用によ り経粘膜投与を成し遂げることができる。経皮投与には、当該技術分野において 一般に知られているような軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム中に活性化合物を調 製する。 また、直腸送達のために化合物を座薬（例えば、ココアバター及び他のグリセ リドのような通常の座薬ベースと）または停留（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸剤の 形態でも調製することができる。 一つの態様として、移植及びマイクロカプセル化送達系を初めとする制御放出 製剤のような、体からの迅速な除去から化合物を保護する担体と活性化合物を調 製する。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲ ン、ポリオルトエステル及びポリ酢酸のような生物分解性の生体適合性ポリマー を用いることができる。そのような製剤の製造方法は当業者に明らかである。ま た、材料をＡｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅ ｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。（ウイルス抗原 に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを初めとする） リポソーム懸濁液も製薬学的に許容しうる担体として用いることができる。例え ば、米国特許第４，５２２，８１１号中に記述されたように、当業者に知られて いる方法によりこれらを調製することができる。 投与の容易さ及び投薬量の均一性のために単位剤形で経口または非経口組成物 を調合することが特に有益である。本明細書に用いられる場合、単位剤形は処置 される患者に単位投薬量として適当な物理的に分離した単位をさし；各単位は必 要とされる製薬学的担体と会合して適切な治療 効果をもたらすように計算された活性化合物の前以て決定された量を含有する。 本発明の単位剤形の指定は活性化合物の固有の特性及び得られる特定の治療効果 並びに個体の処置のためにそのような活性化合物を調合する当該技術分野に固有 の制限により決定され、そしてそれらに直接依存する。 本発明の核酸分子をベクター中に挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いるこ とができる。例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許５，３２８，４７０を参 照）によるかまたは定位固定注入により（例えば、Ｃｈｅｎ等（１９９４）ＰＮ ＡＳ ９１：３０５４−３０５７）遺伝子治療ベクターを患者に送達することが できる。遺伝子治療ベクターの製薬学的調製物は許容しうる希釈剤中に遺伝子治 療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達ビヒクルが中に包埋される徐放 性マトリックスを含んでなることができる。あるいはまた、組み換え細胞から損 なわれずに完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを製造で きる場合、製薬学的調製物は遺伝子送達系を製造する１つまたはそれ以上の細胞 を含むことができる。 製薬学的組成物を投与のための説明書と一緒に容器、パックまたはディスペン サー中に入れることができる。Ｖ．本発明の用途及び方法 本明細書に記述される核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチド相同物、モジュ レーター及び抗体を以下の方法：１）薬剤スクリーニングアッセイ；２）診断ア ッセイ；及び３）処置の方法の１つまたはそれ以上に用いることができる。本発 明のＰＧＣ−１タンパク質は本明細書に記述される活性の１つまたはそれ以上を 有し、従って、例えば、脂肪細胞分化、 褐色脂肪細胞における熱発生並びに様々な細胞、例えば、筋肉細胞、肝細胞及び 脂肪細胞におけるインシュリン感受性を調節するために用いることができる。以 下にさらに記述するように、（例えば、遺伝子治療用途で宿主細胞において組み 換え発現ベクターにより）ＰＧＣ−１タンパク質を発現させるため、（例えば、 生物学的サンプル中の）ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡまたはＰＧＣ−１遺伝子中の遺伝 子損傷を検出するため及びＰＧＣ−１活性を調節するために本発明の単離された 核酸分子を用いることができる。さらに、ＰＧＣ−１タンパク質活性を調節する 薬剤または化合物をスクリーニングするため及びＰＧＣ−１タンパク質の不十分 な生産または野生型ＰＧＣ−１に比較して減少した活性を有するＰＧＣ−１タン パク質型の生産を特徴とする疾患を処置するためにＰＧＣ−１タンパク質を用い ることができる。さらに、ＰＧＣ−１タンパク質の検出及び単離並びにＰＧＣ− １タンパク質活性の調節のために本発明の抗−ＰＧＣ−１抗体を用いることがで きる。 ａ． 薬剤スクリーニングアッセイ： 本発明は変種のまたは異常なＰＧＣ−１核酸発現及び／またはＰＧＣ−１ポリ ペプチド活性を特徴とする（または関係する）疾患を処置するために用いること ができる化合物または薬剤の同定方法に関する。また、これらの方法は本明細書 において薬剤スクリーニングアッセイとも呼ばれ、典型的に、ＰＧＣ−１タンパ ク質と相互作用する（例えば、結合する）、ＰＧＣ−１タンパク質と標的分子の 相互作用を調節する、そして／またはＰＧＣ−１核酸発現及び／もしくはＰＧＣ −１タンパク質活性を調節する能力に関して候補／試験化合物または薬剤をスク リーニングする工程を含む。これらの能力の１つまたはそれ以上を有する候補／ 試 験化合物または薬剤を、変種のまたは異常なＰＧＣ−１核酸発現及び／またはＰ ＧＣ−１タンパク質活性を特徴とする疾患を処置するための薬剤として用いるこ とができる。候補／試験化合物は、例えば、１）Ｉｇを末端につないだ融合ペプ チド並びにランダムペプチドライブラリー（例えば、Ｌａｍ、Ｋ．Ｓ．等（１９ ９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｒ．等（１９９ １）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６を参照）及びＤ−及び／またはＬ−配置 アミノ酸で作製された組み合わせ化学により得られる分子ライブラリーのメンバ ーを初めとする可溶性ペプチドのようなペプチド；２）ホスホペプチド（例えば 、無作為及び部分的に縮重した選択的ホスホペプチドライブラリーのメンバー、 例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ、Ｚ．等（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７ ８を参照）；３）抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗 −イディオタイプ、キメラ及び単鎖抗体並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ 発現ライブラリーフラグメント及び抗体のエピトープ結合フラグメント）；並び に４）小さい有機及び無機分子（例えば、組み合わせ及び天然生成物ライブラリ ーから得られた分子）を含む。 一つの態様として、本発明はＰＧＣ−１タンパク質と相互作用する（例えば、 結合する）候補／試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。 典型的に、アッセイは、例えば、複合体を形成するようにＰＧＣ−１タンパク質 またはその一部に候補／試験化合物を相互作用（例えば、結合）させる条件下で 、ＰＧＣ−１タンパク質またはその生物学的に活性のある部分と候補／試験化合 物を合わせ、そして複合体の形成を検出する工程を含む無細胞アッセイであり、 その場合、ＰＧＣ− １ポリペプチドまたはそのフラグメントと相互作用する（例えば、結合する）候 補化合物の能力は複合体中の候補化合物の存在により示される。ＰＧＣ−１タン パク質と候補化合物の間の複合体の形成を例えば標準的な免疫アッセイを用いて 定量することができる。 別の態様として、本発明はＰＧＣ−１タンパク質とＰＧＣ−１タンパク質が通 常相互作用する分子（標的分子）の間の相互作用（及びおそらくＰＧＣ−１活性 も同様に）調節する（例えば、刺激するかまたは妨げる）候補／試験化合物を同 定するためのスクリーニングアッセイを提供する。そのような標的分子の例はＰ ＧＣ−１タンパク質と同じシグナル伝達経路のタンパク質、例えば、体重の調節 に関与する経路において、例えば、ＰＰＡＲ_γ、Ｃ／ＥＢＰα、甲状腺ホルモン 受容体、エストロゲン受容体及びレチノイン酸受容体のような核ホルモン受容体 、またはインシュリン感受性に関与する経路において、例えばＰＰＡＲ_γ、ＰＧ Ｃ−１タンパク質の上流（活性の刺激剤及びインヒビターの両方を含む）または 下流で機能する可能性があるタンパク質を含む。典型的に、アッセイは、例えば 、候補化合物の存在なしにＰＧＣ−１タンパク質またはその生物学的に活性のあ る部分が標的分子と相互作用する（例えば、結合する）条件下で、ＰＧＣ−１タ ンパク質またはその生物学的に活性のある部分、ＰＧＣ−１標的分子及び候補／ 試験化合物を合わせ、そしてＰＧＣ−１タンパク質と標的分子を含む複合体の形 成を検出するかまたはＰＧＣ−１タンパク質と標的分子の相互作用／反応を検出 する工程を含む無細胞アッセイである。複合体形成の検出は、例えば、ＰＧＣ− １タンパク質の誘導作用を測定することによる複合体の直接定量を含むことがで きる。（候補化合物の非存在下で検出されるものに対して）候補 化合物の存在下でのＰＧＣ−１と標的分子の相互作用（例えば、ＰＧＣ−１と標 的分子間の複合体の形成）の減少のような統計的に有意な変化は、ＰＧＣ−１タ ンパク質と標的分子の間の相互作用の調節（例えば、刺激または抑制）を表す。 ＰＧＣ−１タンパク質と標的分子の間の複合体の形成の調節を例えば免疫アッセ イを用いて定量することができる。 上記の薬剤スクリーニングアッセイを実施するために、ＰＧＣ−１またはその 標的分子のいずれかを固定してタンパク質の一方または両方の非複合体形態から の複合体の分離を容易にすること及びアッセイの自動化に対応することが望まし い。反応物を含有するために適当なあらゆる容器中で候補化合物の存在下及び非 存在下で標的分子へのＰＧＣ−１の相互作用（例えば、結合）を成し遂げること ができる。そのような容器の例はマイクロタイタープレート、試験管及び微量遠 心管を含む。一つの態様として、ポリペプチドをマトリックスに結合させるドメ インを付加する融合ポリペプチドを与えることができる。例えば、グルタチオン −Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＧＣ−１融合ポリペプチドをグルタチオンセファ ロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）また はグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次 に、それを（例えば、³⁵Ｓで標識した）細胞ライセート及び候補化合物と合わせ 、複合体形成を導く条件下で（例えば、塩及びｐＨに関して生理的条件で）混合 物をインキュベートする。インキュベーション後に、あらゆる結合していない標 識を除くためにビーズを洗浄し、マトリックスを固定し、放射性標識をすぐにま たは複合体を解離させた後上清で測定する。あるいはまた、マトリックスから複 合体を解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ビーズ画分中に見い だされるＰＧＣ−１結合ポリペプチドのレベルを標準的な電気泳動技術を用いて ゲルから定量することができる。 また、マトリックス上にポリペプチドを固定するための他の技術も本発明の薬 剤スクリーニングアッセイにおいて用いることができる。例えば、ビオチン及び ストレプトアビジンの結合を利用してＰＧＣ−１またはその標的分子のいずれか を固定することができる。当該技術分野でよく知られている技術（例えば、ビオ チン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ） を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）からビオチン化 されたＰＧＣ−１分子を調製し、ストレプトアビジンで被覆された９６ウェルプ レート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定することができる 。あるいはまた、ＰＧＣ−１と反応性であるが、その標的分子へのポリペプチド の結合を妨げない抗体をプレートのウェルに誘導化することができ、抗体結合に よりＰＧＣ−１をウェルに取り付けることができる。上記のように、ＰＧＣ−１ 結合ポリペプチド及び候補化合物の調製物をプレートのＰＧＣ−１提示ウェル中 でインキュベートし、そしてウェル中に取り込まれた複合体の量を定量すること ができる。ＧＳＴ固定化複合体に対して上に記述したものに加えて、そのような 複合体の検出方法はＰＧＣ−１標的分子と反応性であるかまたはＰＧＣ−１ポリ ペプチドと反応性であり標的分子と競合する抗体を用いる複合体の免疫検出；並 びに標的分子と関係する酵素活性を検出することによる固相酵素アッセイを含む 。 さらに別の態様として、本発明は変種のまたは異常なＰＧＣ−１核酸発現また はＰＧＣ−１ポリペプチド活性を特徴とする（または関係する） 疾患の処置において用いることができる化合物を同定するための方法（例えば、 スクリーニングアッセイ）を提供する。この方法は典型的にＰＧＣ−１核酸の発 現またはＰＧＣ−１タンパク質の活性を調節する化合物または薬剤の能力をアッ セイし、それにより変種のまたは異常なＰＧＣ−１核酸発現またはＰＧＣ−１ポ リペプチド活性を特徴とする疾患を処置するための化合物を同定する工程を含む 。変種のまたは異常なＰＧＣ−１核酸発現またはＰＧＣ−１ポリペプチド活性を 特徴とする疾患は本明細書に記述されている。ＰＧＣ−１核酸の発現またはＰＧ Ｃ−１タンパク質の活性を調節する化合物または薬剤の能力のアッセイ方法は典 型的に細胞に基づくアッセイである。例えば、ＰＧＣ−１を含む経路によりシグ ナルを伝達するリガンドに感受性である細胞を候補化合物の存在下及び非存在下 でＰＧＣ−１タンパク質を過剰発現するように誘導することができる。ＰＧＣ− １依存的応答の統計的に有意な変化（刺激または抑制のいずれか）をもたらす候 補化合物を同定することができる。一つの態様として、ＰＧＣ−１核酸の発現ま たはＰＧＣ−１タンパク質の活性を細胞において調節し、（細胞増殖の速度また は分化のような）目的の情報に対する候補化合物の影響を測定する。例えば、Ｐ ＧＣ−１タンパク質依存的シグナルカスケードに応答してアップまたはダウンレ ギュレートされる遺伝子の発現をアッセイすることができる。好ましい態様とし て、そのような遺伝子の調節領域、例えば、５’隣接プロモーター及びエンハン サー領域を容易に検出することができる遺伝子産物をコードする（ルシフェラー ゼのような）検出可能なマーカーに機能的に連結する。また、例えば免疫ブロッ ティングにより、ＰＧＣ−１またはＰＧＣ−１標的分子のリン酸化を測定するこ ともできる。 あるいはまた、細胞を候補化合物と接触させ、細胞のＰＧＣ−１ ｍＲＮＡま たはタンパク質の発現を測定する方法においてＰＧＣ−１核酸発現のモジュレー ター（例えば、変種のまたは異常なＰＧＣ−１核酸発現またはＰＧＣ−１タンパ ク質活性を特徴とする疾患を処置するために用いることができる化合物）を同定 することができる。候補化合物の存在下でのＰＧＣ−１ ｍＲＮＡまたはタンパ ク質の発現のレベルを候補化合物の非存在下でのＰＧＣ−１ ｍＲＮＡまたはタ ンパク質の発現のレベルに比較する。次に、この比較に基づいてＰＧＣ−１核酸 発現のモジュレーターとして候補化合物を同定し、そして異常なＰＧＣ−１核酸 発現を特徴とする疾患を処置するために用いることができる。例えば、ＰＧＣ− １ ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が候補化合物の存在下でその非存在下で より多い（統計的に有意に多い）場合、候補化合物をＰＧＣ−１核酸発現の刺激 剤として同定する。あるいはまた、ＰＧＣ−１核酸発現が候補化合物の存在下で その非存在下でより少ない（統計的に有意に少ない）場合、候補化合物をＰＧＣ −１核酸発現のインヒビターとして同定する。ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡまたはタン パク質を検出するために本明細書に記述される方法により細胞におけるＰＧＣ− １核酸発現のレベルを決定することができる。 本発明のさらに別の態様として、ＰＧＣ−１に結合するかまたはそれと相互作 用し（「ＰＧＣ−１結合タンパク質」または「ＰＧＣ−１−ｂｐ」）、そしてＰ ＧＣ−１タンパク質活性を調節する他のタンパク質を同定するために、２−ハイ ブリッドアッセイにおける「餌タンパク質」としてＰＧＣ−１タンパク質を用い ることができる（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ等（ １９９３）Ｃｅｌｌ ７２ ：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ等（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６ ８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ等（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ １４：９２０−９２４：Ｉｗａｂｕｃｈｉ等（１９９３）Ｏｎｃｏｇ ｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；及びＢｒｅｎｔ ＷＯ ９４／１０３００を 参照）。また、そのようなＰＧＣ−１結合タンパク質は例えばＰＧＣ−１経路の 上流または下流成分としてＰＧＣ−１タンパク質によるシグナルの伝達に関与し ているとも思われる。 ２−ハイブリッド系は別個のＤＮＡ結合及び活性化ドメインからなる大部分の 転写因子のモジュール特質に基づく。Ｂａｒｔｅｌ、Ｐ．等「Ｕｓｉｎｇ ｔｈ ｅ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉ ｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅ ｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ中、Ｈａｒｔｌｅｙ、Ｄ．Ａ．編集（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９３）ｐｐ．１５３−１７９。 簡潔に言えば、アッセィは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物 では、ＰＧＣ−１をコードする遺伝子を既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４） のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合させる。もう一方の構築物では 、同定されていないポリペプチド（「獲物」または「サンプル」）をコードする 、ＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列を既知の転写因子の活性化ドメイ ンをコードする遺伝子に融合させる。「餌」及び「獲物」タンパク質がインビボ で相互作用することができ、ＰＧＣ−１依存的複合体を形成する場合、転写因子 のＤＮＡ結合及び活 性化ドメインはごく接近する。この接近により、転写因子に応答する転写調節部 位に機能的に連結されているレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）が転写され る。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、機能的な転写因子を含有す る細胞コロニーを単離し、それを用いてＰＧＣ−１と相互作用するポリペプチド をコードするクローン化された遺伝子を得ることができる。 これらの薬剤スクリーニングアッセイにより同定されたＰＧＣ−１タンパク質 活性及び／またはＰＧＣ−１核酸発現のモジュレーターを例えば、体重疾患、例 えば肥満症及び不十分なインシュリン活性と関係する疾患、例えば糖尿病を処置 するために用いることができる。これらの処置方法はそのような処置を必要とす る患者、例えば本明細書に記述される疾患にかかっている患者に、例えば、上の サブセクションIVにおいて記述したような製薬学的組成物中で、ＰＧＣ−１タン パク質活性及び／または核酸発現のモジュレーターを投与する工程を含む。 Ｄ． 診断アッセイ： 本発明はさらに生物学的サンプル中のＰＧＣ−１の存在の検出方法を提供する 。その方法は生物学的サンプルにおいてＰＧＣ−１の存在が検出されるようにＰ ＧＣ−１ポリペプチドまたはｍＲＮＡを検出することができる化合物または薬剤 と生物学的サンプルを接触させることを含む。ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡを検出する ために好ましい薬剤はＰＧＣ−１ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる 標識されたまたは標識可能な核酸プローブである。核酸プローブは少なくとも１ ５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドの長さで且つＰＧＣ −１ ｍＲＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするため に十 分なオリゴヌクレオチドのような、例えば、配列番号：１の全長ＰＧＣ−１ ｃ ＤＮＡまたはその一部であってもよい。ＰＧＣ−１タンパク質を検出するために 好ましい薬剤はＰＧＣ−１タンパク質に結合することができる標識されたまたは 標識可能な抗体である。抗体はポリクローナルまたはより好ましくはモノクロー ナルであってもよい。完全な抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂもし くはＦ（ａｂ’）₂）を用いることができる。プローブまたは抗体に関して「標 識されたまたは標識可能な」という用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物 質を連結する（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブまたは抗体の 直接標識及び直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間 接標識を含むと考えられる。間接標識の例は蛍光的に標識された二次抗体を用い る一次抗体の検出及び蛍光的に標識されたストレプトアビジンで検出することが できるようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を含む。「生物学的サンプ ル」という用語は患者から単離された組織、細胞及び生物学的流体並びに患者内 に存在する組織、細胞及び流体を含むと考えられる。すなわち、インビトロ及び インビボで生物学的サンプル中のＰＧＣ−１ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出 するために本発明の検出方法を用いることができる。例えば、ＰＧＣ−１ ｍＲ ＮＡの検出のためのインビトロ技術はノーザンハイブリダイゼーション及びイン サイチューハイブリダイゼーションを含む。ＰＧＣ−１タンパク質の検出のため のインビトロ技術は固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、 免疫沈降法及び免疫蛍光を含む。あるいはまた、標識された抗−ＰＧＣ−１抗体 を患者に導入することにより、患者においてインビボでＰＧＣ−１タンパク質を 検出することができる。例えば、 放射性マーカーで抗体を標識することができ、患者におけるその存在及び位置を 標準的な画像形成技術により検出することができる。 また、本発明は生物学的サンプル中のＰＧＣ−１の存在を検出するためのキッ トも含む。例えば、キットは生物学的サンプル中のＰＧＣ−１タンパク質または ｍＲＮＡを検出することができる標識されたまたは標識可能な化合物または薬剤 ；サンプル中のＰＧＣ−１の量を決定するための手段；及びサンプル中のＰＧＣ −１の量を基準と比較するための手段を含んでなることができる。化合物または 薬剤を適当な容器中に入れることができる。キットはさらにＰＧＣ−１ ｍＲＮ Ａまたはタンパク質を検出するためにキットを用いるための説明書を含んでなる ことができる。 また、ＰＧＣ−１遺伝子中の遺伝子損傷を検出し、それにより損傷を受けた遺 伝子を有する患者が本明細書に定義されるような変種のまたは異常なＰＧＣ−１ 核酸発現またはＰＧＣ−１タンパク質活性を特徴とする疾患の危険にされされて いるかどうかを決定するためにも本発明の方法を用いることができる。好ましい 態様として、その方法はＰＧＣ−１タンパク質をコードする遺伝子の完全な状態 に影響を与える少なくとも１つの改変またはＰＧＣ−１遺伝子の不適当な発現を 特徴とする遺伝子損傷の有無を患者からの細胞のサンプルにおいて検出すること を含む。例えば、１）ＰＧＣ−１遺伝子からの１個またはそれ以上のヌクレオチ ドの欠失；２）ＰＧＣ−１遺伝子への１個またはそれ以上のヌクレオチドの付加 ；３）ＰＧＣ−１遺伝子の１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）ＰＧ Ｃ−１遺伝子の染色体再編成；５）ＰＧＣ−１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転 写産物のレベルの変化；６）ゲノムＤＮＡの メチル化パターンのようなＰＧＣ−１遺伝子の異常な修飾；７）ＰＧＣ−１遺伝 子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物の非野生型スプライシングパターンの存在； ８）ＰＧＣ−１タンパク質の非野生型レベル；９）ＰＧＣ−１遺伝子の対立遺伝 子欠損；及び１０）ＰＧＣ−１タンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも１ つの存在を確かめることによりそのような遺伝子損傷を検出することができる。 本明細書に記述されるように、ＰＧＣ−１遺伝子中の損傷を検出するために用い ることができる当該技分野で知られている多数のアッセイ技術がある。 ある種の態様として、損傷の検出はアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲの ようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９ ５号及び４，６８３，２０２号を参照）あるいはまたライゲーション連鎖反応（ ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１ ：１０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａ等（１９９４）ＰＮＡＳ ９１： ３６０−３６４を参照）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、それらの 後者はＰＧＣ−１遺伝子中の点突然変異を検出するために特に有用である可能性 がある（Ａｂｒａｖａｙａ等（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．２３：６７５−６８２を参照）。この方法は患者から細胞のサンプルを集め、 サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離し、（ 存在する場合）ＰＧＣ−１遺伝子のハイブリダイゼーション及び増幅が起こるよ うな条件下でＰＧＣ−１遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つまたはそれ以 上のプライマーと核酸サンプルを接触させ、そして増幅産物の有無を検出するか または増幅産物の大きさを検出し、その長さをコントロールサンプルに比較する 工程を含むことができ る。 別の態様として、制限酵素切断パターンの変化によりサンプル細胞からのＰＧ Ｃ−１遺伝子中の突然変異を同定することができる。例えば、サンプル及びコン トロールＤＮＡを単離し、（場合により）増幅させ、１つまたはそれ以上の制限 エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動によりフラグメント長の大きさを決 定し、比較する。サンプルとコントロールＤＮＡ間のフラグメント長の大きさの 違いはサンプルＤＮＡ中の突然変異を表す。さらに、リボザイム切断部位の発生 または喪失により特定の突然変異の存在を評点するために配列特異的リボザイム （例えば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照）を用いることができる。 さらに別の態様として、ＰＧＣ−１遺伝子を直接シークエンスし、サンプルＰ ＧＣ−１の配列を対応する野生型（コントロール）配列と比較することにより突 然変異を検出するために当該技術分野で知られている様々なシークエンシング反 応のいずれを用いてもよい。シークエンシング反応の例はＭａｘｉｍ及びＧｉｌ ｂｅｒｔ（（１９７７）ＰＮＡＳ ７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（（１９ ７７）ＰＮＡＳ ７４：５４６３）により開発された技術に基づくものを含む。 診断アッセイ（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）を実 施する場合、質量分析法によるシークエンシング（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ 第９４／１６１０１号；Ｃｏｈｅｎ等（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ ｒ ．３６：１２７−１６２；及びＧｒｉｆｆｉｎ等（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ．３８：１４７−１５９を参照）を初めとす る、様々な自動シークエンシング方法を利用することができる。 ＰＧＣ−１遺伝子中の突然変異を検出するための他の方法は、ＲＮＡ／ＲＮＡま たはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖中のミスマッチ塩基を検出するために切断薬剤からの 保護を用いる（Ｍｙｅｒｓ等（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２） ；Ｃｏｔｔｏｎ等（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａ等（ １９９２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５）、突然変異体 と野生型核酸の電気泳動移動度を比較する（Ｏｒｉｔａ等、（１９８９）ＰＮＡ Ｓ ８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ２８５： １２５−１４４；及びＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ Ｔｅ ｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３−７９）、変性勾配ゲル電気泳動を用いて変性剤の勾 配を含有するポリアクリルアミドゲルにおける突然変異体または野生型フラグメ ントの移動をアッセイする（Ｍｙｅｒｓ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ４９５）方法を含む。点突然変異を検出するための他の技術の例は選択的オリゴ ヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択性増幅及び選択的プライマー伸長を 含む。 ｃ． 処置の方法 本発明の別の態様は変種のまたは異常なＰＧＣ−１核酸発現及び／またはＰＧ Ｃ−１タンパク質活性を特徴とする（または関係する）疾病または疾患にかかっ ている患者、例えばヒトを処置するための方法に関する。これらの方法は処置が 起こるように患者にＰＧＣ−１モジュレーターを投与する工程を含む。「変種の または異常なＰＧＣ−１発現」という用語は非野生型ＰＧＣ−１タンパク質の発 現またはＰＧＣ−１タンパク質の発現の非野生型レベルをさす。変種のまたは異 常なＰＧＣ−１タンパク質活性は非野生型ＰＧＣ−１タンパク質活性またはＰＧ Ｃ−１タ ンパク質活性の非野生型レベルをさす。ＰＧＣ−１タンパク質は例えば脂肪細胞 分化に関与する経路、褐色脂肪細胞における熱発生及びインシュリン感受性に関 係するので、変種のまたは異常なＰＧＣ−１タンパク質活性または核酸発現は正 常な体重制御及び代謝機能を妨げる。異種のまたは異常なＰＧＣ−１タンパク質 活性または核酸発現を特徴とするかまたは関係する疾病または疾患の限定しない 例は、体重疾患、例えば、肥満症、悪液質、食欲不振及び不十分なインシュリン 活性と関係する疾患、例えば糖尿病を含む。体重と関係する疾患は異常な体重ま たは体重の異常な制御と関係する疾患である。本明細書に用いられる場合、「不 十分なインシュリン活性と関係するかまたは特徴とする疾病」という用語は、異 常なインシュリン機能によるグルコースの異常な利用がある疾患または疾病を含 む。異常なインシュリン機能はインシュリン生産、例えば、ＩＤＤＭ（Ｉ型糖尿 病）におけるようなβ細胞の喪失に起因するインシュリンの欠乏のような細胞小 器官による発現及び／または輸送、ＮＩＤＤＭ（II型糖尿病）におけるようなイ ンシュリン分泌反応の損傷のような分泌、インシュリン分子自体の形態、例えば 、一次、二次または三次構造、標的細胞に対するインシュリンの作用、例えば、 体の組織、例えば末梢組織におけるインシュリン抵抗性及びインシュリンに対す る標的細胞の反応におけるあらゆる異常または損傷を含む。ＩＤＤＭ及びＮＩＤ ＤＭ及び他の型の糖尿病における異常なインシュリン活性のさらなる記述にはＢ ｒａｕｎｗａｌｄ、Ｅ．等編集、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１１版（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉ ｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８７）ｐｐ．１７ ７８−１７９７；Ｒｏｂｂｉｎｓ、 Ｓ．Ｌ．等、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、第３ 版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、 １９８４）ｐ．９７２を参照。本明細書に用いられる場合、「処置する」または 「処置」という用語は疾患または疾病、例えば、異常なまたは変種のＰＧＣ−１ タンパク質活性またはＰＧＣ−１核酸発現を特徴とするかまたは関係する疾患ま たは疾病の少なくとも１つの不都合な影響または症状の減少または緩和をさす。 本明細書に用いられる場合、ＰＧＣ−１モジュレーターはＰＧＣ−１核酸発現 及び／またはＰＧＣ−１タンパク質活性を調節することができる分子である。例 えば、ＰＧＣ−１モジュレーターはＰＧＣ−１核酸発現を調節、例えば、アップ レギュレート（活性化）またはダウンレギュレート（抑制）することができる。 別の例として、ＰＧＣ−１モジュレーターはＰＧＣ−１タンパク質活性を調節（ 例えば、刺激または抑制）することができる。ＰＧＣ−１核酸発現を抑制するこ とにより変種のまたは異常な（非野生型）ＰＧＣ−１核酸発現及び／またはＰＧ Ｃ−１タンパク質活性を特徴とする（関係する）疾患または疾病を処置すること が望ましい場合、ＰＧＣ−１モジュレーターは本明細書に記述されるようなアン チセンス分子、例えばリボザイムであってもよい。ＰＧＣ−１核酸発現を抑制す るために用いることができるアンチセンス分子の例は、開始コドンも含む配列番 号：１の５’非翻訳領域の一部に相補的なアンチセンス分子及び配列番号：１の ３’非翻訳領域の一部に相補的なアンチセンス分子を含む。ＰＧＣ−１核酸発現 を抑制するＰＧＣ−１モジュレーターはＰＧＣ−１核酸発現を抑制する小分子ま たは他の薬剤、例えば、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイを用いて 同定される 小分子または薬剤であってもよい。ＰＧＣ−１核酸発現を刺激することにより変 種のまたは異常な（非野生型）ＰＧＣ−１核酸発現及び／またはＰＧＣ−１タン パク質活性を特徴とする（関係する）疾患または疾病を処置することが望ましい 場合、ＰＧＣ−１モジュレーターは、例えば、ＰＧＣ−１核酸発現を刺激する、 ＰＧＣ−１をコードする核酸分子（例えば、配列番号：１のヌクレオチド配列に 相同なヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子）または小分子もしくは他の薬剤 、例えば、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイを用いて同定される小 分子（ペプチド）もしくは薬剤であってもよい。 あるいはまた、ＰＧＣ−１タンパク質活性を抑制することにより変種のまたは 異常な（非野生型）ＰＧＣ−１核酸発現及び／またはＰＧＣ−１タンパク質活性 を特徴とする（関係する）疾患または疾病を処置することが望ましい場合、ＰＧ Ｃ−１モジュレーターはＰＧＣ−１タンパク質活性を抑制する、抗−ＰＧＣ−１ 抗体または小分子もしくは他の薬剤、例えば、本明細書に記述されるスクリーニ ングアッセイを用いて同定される小分子もしくは薬剤であってもよい。ＰＧＣ− １タンパク質活性を刺激することにより変種のまたは異常な（非野生型）ＰＧＣ −１核酸発現及び／またはＰＧＣ−１タンパク質活性を特徴とする（関係する） 疾患または疾病を処置することが望ましい場合、ＰＧＣ−１モジュレーターはＰ ＧＣ−１タンパク質活性を刺激する、活性のあるＰＧＣ−１タンパク質またはそ の一部（例えば、配列番号：２のアミノ酸配列またはその一部に相同なアミノ酸 配列を有するＰＧＣ−１タンパク質またはその一部）または小分子もしくは他の 薬剤、例えば、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイを用いて同定され る小分子もしくは薬剤であっ てもよい。 さらに、処置が起こるようにＰＧＣ−１タンパク質もしくはその一部またはＰ ＧＣ−１タンパク質もしくはその一部をコードする核酸を患者に投与することに より体重疾患、例えば肥満症にかかっている患者を本発明に従って処置すること ができる。同様に、処置が起こるようにＰＧＣ−１タンパク質もしくはその一部 またはＰＧＣ−１タンパク質もしくはその一部をコードする核酸を患者に投与す ることにより不十分なインキュリン活性と関係する疾患にかかっている患者を本 発明に従って処置することができる。 本発明の別の態様は細胞関連活性を調節するための方法に関する。これらの方 法は薬剤の非存在下での細胞の細胞関連活性に対して細胞関連活性が改変される ようにＰＧＣ−１タンパク質活性またはＰＧＣ−１核酸発現を調節する薬剤（ま たは有効量の薬剤を含む組成物）と細胞を接触させることを含む。本明細書に用 いられる場合、「細胞関連活性」は細胞の正常なまたは異常な活性または機能を さす。細胞関連活性の例は増殖、移動、分化、タンパク質のような分子の生産ま たは分泌、細胞生存及び熱発生を含む。好ましい態様として、細胞関連活性は熱 発生であり、そして細胞は褐色脂肪細胞である。本明細書に用いられる場合、「 改変される」という用語は細胞関連活性の変化、例えば、増加または減少をさす 。一つの態様として、薬剤はＰＧＣ−１タンパク質活性またはＰＧＣ−１核酸発 現を刺激する。そのような剌激剤の例は活性のあるＰＧＣ−１タンパク質、細胞 中に導入されているＰＧＣ−１をコードする核酸分子、及びＰＧＣ−１タンパク 質活性またはＰＧＣ−１核酸発現を刺激し、本明細書に記述される薬剤スクリー ニングアッセイを用いて同定 される調節剤を含む。別の態様として、薬剤はＰＧＣ−１タンパク質活性または ＰＧＣ−１核酸発現を抑制する。そのような抑制剤の例はアンチセンスＰＧＣ− １核酸分子、抗−ＰＧＣ−１抗体、及びＰＧＣ−１タンパク質活性またはＰＧＣ −１核酸発現を抑制し、本明細書に記述される薬剤スクリーニングアッセイを用 いて同定される調節剤を含む。これらの調節方法をインビトロで（例えば、薬剤 と細胞を培養することにより）あるいはまたインビボで（例えば、薬剤を患者に 投与することにより）実施することができる。好ましい態様として、調節方法を インビボで実施し、すなわち、細胞は患者、例えば哺乳類、例えばヒト内に存在 し、そして患者は異常なまたは変種のＰＧＣ−１タンパク質活性または核酸発現 を特徴とする疾患または疾病にかかっている。 処置方法に用いられる核酸分子、タンパク質、ＰＧＣ−１モジュレーター、化 合物等を本明細書に記述される適切な製薬学的組成物中に混和し、分子、タンパ ク質、モジュレーターまたは化合物等にその意図される機能を遂行させる経路に より患者に投与することができる。投与の経路の例は本明細書においてサブセク ションIVにも記述されている。 本発明は以下の実施例によりさらに具体的に示され、それらは限定すると解釈 されるべきではない。本願の全体にわたって引用される全ての参考文献、特許出 願、特許及び公開特許出願の内容は引用することにより本明細書に組み込まれる 。 実施例 実施例Ｉ： マウスＰＧＣ−１の同定及び特性化 ＵＣＰを発現する褐色脂肪細胞細胞系のマウスＨＩＢ １Ｂ細胞系（Ｒｏｓｓ 、Ｒ．等（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７５６１−７５６５）を 分化させ、ＵＣＰ発現を誘導するためにイソプロテレノールで処理した。餌とし てＰＰＡＲ_γ及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）試薬を用いて 酵母２ハイブリッド系においてマウスＨＩＢ １Ｂ細胞系からのｃＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングした。簡潔に言えば、マウスＰＰＡＲ_γのアミノ酸１８ ３−５０５をＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインプラスミドｐＡＳ２中にインフレー ムでクローン化した。ＧＡＬ４活性化ドメインプラスミドｐＡＣＴII中にＨＩＢ １Ｂ ｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築した。酵母２ハイブリッド系プロトコル はＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ２ハイブリッド系プロトコルに記述 されたとおりであった。酢酸リチウム法によりｐＡＳ−ＰＰＡＲ_γをＹ１９０酵 母細胞中に形質転換し、そしてロイシン−プレートにおける選択により維持した 。ｐＡＣＴ−ＨＩＢ １Ｂ ｃＤＮＡライブラリーをＹ１９０−ＰＰＡＲ_γ酵母細 胞中に形質転換し、ＣＬＯＮＴＥＣＨプロトコルに記述されたようにフィルター アッセイにおいてβ−ガラクトシダーゼ活性に関して陽性クローンをアッセイし た。全長ＰＧＣ−１を得るためにｐＡＳ１ラミンｃＤＮＡを用い、ＨＩＢ １Ｂ 細胞からのオリゴｄＴ λＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた めのプローブとして陽性の酵母ｃＤＮＡクローンを用いた。 ＨＩＢ １Ｂ褐色脂肪細胞から調製したｃＤＮＡを用いた１ｘ１０⁶一次形質転 換体のスクリーニングにより約１３０クローンを得た。陽性ファージクローンの ｃＤＮＡインサートをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に切り出し、標準法により両方 の鎖をシークエンスした。次に、ＲＮＡブロットで白色脂肪に対する褐色脂肪に おける選択的発現に関してこれらを分析した。この酵母２ハイブリッド系を用い て得られたクローンのうちの １つは配列番号：１のヌクレオチド６１０ないし３０６６を含んでなる部分ＰＧ Ｃ−１クローンであった。λＺＡＰ−ＨＩＢ １Ｂライブラリーをスクリーニン グするために配列番号：１のヌクレオチド６５０ないし３０６６を含んでなる部 分ＰＧＣ−１クローンを用いることにより全長クローンを得た。 次に、ＰＧＣ−１をＰＢＳプラスミドからＰＳＶ．ｓｐｏｒｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にサブクローン化し、そしてＴｎＴ Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてイ ンビトロ翻訳した。約１２０ｋＤ及び７０ｋＤの分子量に相当する２つのバンド がインビトロ翻訳されたＰＳＶ．ｓｐｏｒｔ ＰＧＣ−１で見られた。これらの バンドはおそらくＰＧＣ−１の異なるアイソフォームに相当する。おそらく１２ ０ｋＤ型が配列番号：２のタンパク質に相当する。 （図１Ａ、１Ａ−１及び１Ａ−２並びに配列番号：１に示される）マウスＰＧ Ｃ−１のヌクレオチド配列は９２ｋＤａの予測される分子量で７９７アミノ酸残 基を含有するタンパク質をコードする３０６６ヌクレオチドを含む（図２Ａ）。 （図１Ａ、１Ａ−１、１Ａ−２及び２Ａ並びに配列番号：２に示される）マウス ＰＧＣ−１タンパク質配列はいくつかのドメイン／モチーフを含み、データバン ク（Ｄａｔａｂａｎｋ）検索によりＰＧＣ−１が発現配列標識（ＥＳＴ）データ ベースを除いていかなるデータベースにおいても近い相同物がない新規なタンパ ク質であることが示される。しかしながら、それは：推定上のＲＮＡ結合モチー フ（アミノ酸６７７−７０９）並びにセリン及びアルギニン残基が多い領域のい わゆるＳＲドメイン２つ（アミノ酸５６５−５９８及び６１７ −６３１）を初めとする認識できるペプチドモチーフを含む。対になったＲＮＡ 結合モチーフ及びＳＲドメインを含有するタンパク質はＲＮＡポリメラーゼIIの Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）と相互作用することが示されている（Ｙｕｒｙｅｖ等 （１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６９７５ −６９８０）。しかしながら、これら２つの領域を除いて、ＰＧＣ−１はこれら のドメインを含有する他のタンパク質と他の配列類似性を共有しない。これらの ドメインに加えて、ＰＧＣ−１はプロテインキナーゼＡによるリン酸化の共通部 位３つも含有する。しかしながら、ＰＧＣ−１と核受容体のあらゆる既知のコア クチベーターの間で著しい相同性は見いだされなかった。しかしながら、ＰＧＣ −１は核受容体−コアクチベーター相互作用をもたらすことができる成分として 最近同定された（Ｈｅｅｒｙ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：７３３−７ ３６；Ｔｏｒｃｈｉａ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：６７７−６８４） １つのＬＸＸＬＬモチーフ（アミノ酸１４２−１４６）を含有する。 これらの実験から、ＰＧＣ−１が脂肪細胞化転写因子ＰＰＡＲ_γと相互作用す る新規な因子であることは明らかである。さらに、ＰＰＡＲ_γのリガンドは特異 的褐色脂肪組織マーカーＵＣＰを誘導できることが知られているので、ＰＰＡＲ_γ は褐色脂肪組織分化において重要な役割を果たすと考えられる。従って、ＰＰ ＡＲ_γ活性のＰＧＣ−１調節は褐色脂肪組織分化において役割を果たし、例えば 、それは白色脂肪細胞よりむしろ褐色脂肪細胞に分化するように細胞を促進する ことができる。 実施例II： ヒトＰＧＣ−１の同定 ヒトＰＧＣ−１核酸分子を得るために、ＰＧＣ−１が非常に発現され る組織からのｃＤＮＡライブラリーを（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒ ｉｔｓｈ、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ ａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９中に記述されたように）低いストリンジェンシー条 件下でスクリーニングすることができる。マウス全長ｃＤＮＡプローブ（例えば 、配列番号：１に示される配列を有するプローブ）でスクリーニングしたヒトポ リＡ ＲＮＡのノーザンブロット分析により、ヒト筋肉、心臓、脳、腎臓及び膵 臓において高レベルのＰＧＣ−１の発現が示され、ヒト筋肉及び心臓において最 も高レベルの発現が検出された。従って、配列番号：１のヌクレオチド配列また はその一部（例えば、配列番号：１の５’領域からのヌクレオチド、例えば、配 列番号：１のヌクレオチド１−５０）を含んでなるプローブを用いてヒト筋肉ラ イブラリー、例えば、オリゴｄＴヒト筋肉ライブラリーをスクリーニングするこ とができる。ＰＧＣ−１の５’領域でクローンを選択することにより、全長クロ ーンを得る可能性を増す。このスクリーニングから得られたクローンをシークエ ンスし、それらがヒトＰＧＣ−１分子であるかどうかを決定するために配列番号 ：１に示されるマウス配列に比較することができる。クローンが部分クローンで あると分かった場合、ｃＤＮＡライブラリーを部分ヒトクローンで再スクリーニ ングして全長ヒトクローンを得る。 実施例III： マウスＰＧＣ−１の組織分布及び褐色脂肪組織におけるＰＧＣ− １の低温誘導 配列番号：１のヌクレオチド１５０ないし３０６６を含んでなるプローブを用 いて２４℃で順応させた４週齢マウスからの肺、筋肉、肝臓、心臓、腎臓、白色 脂肪組織（ＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、脳、精巣及び脾臓組織からのｍ ＲＮＡのノーザン分析を実施した。簡潔に言えば、グアニジンイソチオシアネー ト抽出によりマウスの培養した細胞及び組織から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡサ ンプルを以前に記述されたように処理した（Ｔｏｎｔｏｎｏｚ等（１９９４）Ｇ ｅｎｅｓ Ｄｅｖ ．８：１２２４−１２３４）。２８Ｓ（５０００−６０００ｂ ｐ）マーカーより大きい３本のバンドがノーザンブロット上に生じた。これらの バンドはおそらくＰＧＣ−１の異なるアイソフォームに相当する。ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡは主として脳、心臓、腎臓及びＢＡＴにおいて検出された。さらに、こ れらの組織の全てにおいて約８ｋｂの少ない種も見られる。それに反して、白色 脂肪、肺、骨格筋、肝臓、精巣または脾臓からはいかなるＰＧＣ−１ ｍＲＮＡ 発現もみられない。 低温への露出は特に褐色脂肪及び骨格筋における適応熱発生の古典的インデュー サーである（Ｈｉｍｍｓ−Ｈａｇｅｎ（１９８９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ ．６７：３９４−４０１）。最初のノーザン分析と同じプロ ーブを用いて３から１２時間まで４℃で順応させた４週齢マウスからのＷＡＴ、 ＢＡＴ及び肝臓組織からのｍＲＮＡの２回目のノーザン分析を実施した。このノ ーザン分析から、特にＢＡＴにおいて低温露出中にＰＧＣ−１が非常に誘導され る（約３０ないし５０倍）こと及びＰＧＣ−１発現がＷＡＴでは発現されずにＢ ＡＴ特異的であることが明らかであった。ＰＧＣ−１ ｍＲＮＡは周囲温度で飼 育したマウスからの骨格筋において検出できないが、マウスを低温に １２時間露出することにより、この組織においてＰＧＣ−１遺伝子の発現が誘導 される。室温でＰＧＣ−１ ｍＲＮＡを発現する心臓及び腎臓は低温露出時にこ の発現を高めない。低温露出中のＰＧＣ−１誘導は、ＢＡＴの熱発生活性を招く 褐色脂肪特異的マーカーのＵＣＰのものと一致する。 これらの実験は、ＰＧＣ−１が２４℃に順応させた動物からのＢＡＴと初めと するいくつかの組織において発現されるが、ＷＡＴでは発現されないことを示す 。本明細書に記述される動物研究を以下のように実施した。４週齢のオスＣ５７ ＢＬ／６Ｊマウスを用いた。動物に随意に餌を与え、檻当たり１０匹の動物に分 けた。コントロール群を２４℃で飼育し、一方、実験群を４℃で３または１２時 間飼育した。動物を屠殺し、組織を切断し、すぐに集めた。 ＷＡＴ及びＢＡＴは、ＢＡＴが最終分化時に熱発生機能を持つようになるこ とを除いて脂肪細胞化に関して同じ遺伝学的及び生化学的機構を共有する。従っ て、ＰＧＣ−１はＢＡＴの熱発生機能に役割を果たす。４℃で順応させた動物か らの組織においてＰＧＣ−１が本質的にＢＡＴのみで発現されることが２回目の ノーザン分析により示された時にこの機能が確かめられた。従って、ＰＧＣ−１ はエネルギー貯蔵及び消費の間の平衡に役割を果たす。 低温露出後の異なるマウス組織（腎臓、心臓、ＢＡＴ及びＷＡＴ）におけるＰ ＧＣ−１及びミトコンドリア機能の遺伝子のノーザンブロットｍＲＮＡ分析によ り、これらのマウスの褐色脂肪におけるＰＧＣ−１の低温誘導発現がＡＴＰ−シ ンテターゼ（βサブユニット）及びシトクロムｃ−オキシダーゼサブユニット（ＣＯＸII 及びＣＯＸIV）を初めとす る他の重要なミトコンドリアタンパク質の誘導発現と相関することが示された。 長期間の低温露出は骨格筋におけるこれらのミトコンドリアタンパク質の高めら れた活性をもたらすことが報告されているが（Ｂｏｕｒｈｉｍ等（１９９０）Ａ ｍ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ．２５８：Ｒ１２９１−Ｒ１２９８）、比較的短い低温 露出では筋肉においてＡＴＰ−シンテターゼ、ＣＯＸIIまたはＣＯＸIVのｍＲＮ Ａの誘導は見られなかった。これらの実験を実施するために、動物を４℃で３ま たは１２時間保ち、屠殺し、ＲＮＡの調製のために組織（腎臓、心臓、ＷＡＴ及 びＢＡＴ）を切断した。各サンプルに１０マウスをプールした。ハイブリダイゼ ーションに用いたプローブはＰＧＣ−１、ＵＣＴ−１、ＡＣＴシンテターゼ（β サブユニット）、シトクロムｃ−オキシダーゼII（ＣＯＸ−II）及びシトクロム ｃ−オキシダーゼIV（ＣＯＸ−IV）であった。 低温は中枢神経系において探知され、筋肉及び褐色脂肪を初めとする末梢組織 に増加した交感神経アウトプットをもたらす（Ｈｉｍｍｓ−Ｈａｇｅｎ（１９８ ９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７：３９４−４０１ ）。培養した褐色脂肪細胞をβ−アドレナリンアゴニストにさらすことにより、 褐色脂肪細胞前駆体細胞増殖及びＵＣＰ−１の誘導の点で低温露出にまねること ができる（Ｒｅｈｎｍａｒｋ等（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５：１ ６４６４−１６４７１）。ＰＧＣ−１遺伝子発現がβ−アドレナリンアゴニスト にも感受性であるかどうかを決定するために、ＨＩＢ １Ｂ褐色脂肪細胞を非サ ブタイプ選択的βアゴニストのイソプロテレノール（１μＭ）で１０時間処理し た。全細胞ＲＮＡを単離し、ＰＧＣ−１及びＵＣＰ−１ ｃＤＮＡプローブを用 いて分析した。 これらの薬剤でのＨＩＢ １Ｂ褐色脂肪細胞の処理はＰＧＣ−１ ｍＲＮＡ及びＵＣＰ−１ ｍＲＮＡの両方の急激な増加をもたらした。簡潔に言えば、本明細 書において記述したようにＨＩＢ １Ｂ褐色脂肪前脂肪細胞を分化させた。６日 後に、細胞は約８０％分化された。９−シスレチノイン酸への褐色細胞の露出は ＵＣＰ−１発現を誘導するβアゴニストの作用を高めることが以前に示されてい る（Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ等（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１７：８２７ −８３３）。ＨＩＢ １Ｂ細胞へのこの（ＲＸＲ及びＲＡＲの両方を活性化する ）レチノイド及びイソプロテレノールの添加はＰＧＣ−１及びＵＣＰ−１発現の 両方のわずかなさらなる増加をもたらした。これらの結果はβ−アドレナリンア ゴニストがＵＣＰ−１及びＰＧＣ−１の両方の誘導に対する低温の影響をもたら すことに重要な役割を果たす可能性があることを示す。 実施例IV： ＰＧＣ−１の組み換え発現並びに他の転写因子及び核ホルモン受容 体へのＰＧＣ−１の結合 まず、ＰＧＣ−１ヌクレオチド配列の一部（配列番号：１のヌクレオチド６１ ０ないし３０６６）をｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）中にサブクローン化することにより ＧＳＴ−ＰＧＣ−１融合タンパク質を作製した。簡潔に言えば、ＰＧＣ−１（ｐ ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント）をｐＧＥＸ ５Ｘ３のＳｍａＩ部位にクローン化した。特定のオリゴヌクレオチドを用いてＰ ＣＲを実施することによりＰＰＡＲ_γ欠失を作製し、ｐＧＥＸ ５Ｘ２にインフ レームでクローン化した。これらの融合タンパク質を発現させ、約１μｇのタン パク質（いずれかのＧＳＴ、または単独もしくはＰＧＣ−１に融合した） を含有するビーズ上でエシェリキア・コリから精製し、３０μｌを結合バッファ ー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．７］、７５ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤ ＴＡ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．０５％ ＮＰ４０、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％グ リセロール）中に再懸濁した。 ＣＯＳ細胞において融合タンパク質を発現させた後、ＰＰＡＲ_γ、ＰＰＡＲα 及びＰＰＡＲδのような他のＰＰＡＲアイソフォーム、Ｃ／ＥＢＰα及びＲＸＲ αのような他の転写因子並びに甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体及び レチノイン酸受容体のような他の核ホルモン受容体とＰＧＣ−１の相互作用を調 べるためにＴａｋｅｓｈｉｔａ、Ａ．等（（１９９６）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ ｇｙ １３７：３５９４−３５９７中に記述されたようなインビトロ結合アッセ イを実施した。それらのアッセイを以下のように実施した。コントロールＧＳＴ タンパク質のみまたはＧＳＴに融合したＰＧＣ−１（ａａ３６−７９７）をグル タチオンアガロースビーズ上に固定し、異なるインビトロ翻訳された（［³⁵Ｓ］ メチオニン標識された）核受容体及び適切なリガンドまたはビヒクルとインキュ ベートした。［³⁵Ｓ］メチオニン（Ｐｒｏｍｅｇａ ＴＮＴ網状赤血球ライセー ト系キット）を用いてインビトロ網状赤血球翻訳反応で製造された５μｌの異な る核受容体と融合タンパク質を混合した。特定の核受容体リガンドまたはビヒク ル（５μｌ）を添加した。結合を室温で６０分間実施した。次に、リガンドを含 むかまたは含まない結合バッファーでビーズを洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプ ルバッファー中に再懸濁した。電気泳動、固定及び増強後、オートラジオグラフ ィーにより放射性標識されたタンパク質を可視化した。 これらのアッセイから、ＰＧＣ−１がＰＰＡＲ_γと相互作用したこと が示される。１０μＭのＢＲＬ４９６５３（ＰＰＡＲ_γのチアゾリジンジオンリ ガンド）の添加はこの結合に顕著に影響を与えないので、この相互作用はリガン ド依存的ではなかった。バクテリアで発現されたＰＰＡＲ_γをビーズ上に固定し 、網状赤血球で翻訳されたＰＧＣ−１と共に用いた場合にこの相互作用のリガン ド依存性の同様な欠如が見られた。また、これらのアッセイから、ＰＧＣ−１が ａ）ＰＰＡＲαと相互作用し、ロイコトリエン−４（１μＭ）を用いてわずかな リガンド依存性を示し；ｂ）ＰＰＡＲδと相互作用し、カルボプロスタサイクリ ン（１μＭ）を用いてわずかなリガンド依存性を示し；ｃ）甲状腺ホルモン（１ μＭ）を用いてわずかなリガンド依存性で甲状腺ホルモン受容体と相互作用し； ｄ）エストラジオール（１μＭ）を用いてわずかなリガンド依存性でエストロゲ ン受容体と相互作用し；そしてｅ）全てトランスのレチノイン酸（１μＭ）を用 いて強いリガンド依存性でレチノイン酸受容体と相互作用することが示された。 また、ＴＲβもＰＧＣ−１に特異的に結合するが、この場合、リガンド（Ｔ₃） 添加は結合の２ないし３倍の増加を引き起こす。ＰＧＣ−１とレチノイン酸（Ｒ Ａ）受容体間及びＰＧＣ−１とエストロゲン受容体（ＥＲα）間で強いリガンド 依存的結合が見られる。それに反して、リガンドを添加してまたはせずに、ＰＧ Ｃ−１とレチノイド−Ｘ受容体（ＲＸＲα）の間ではほとんどまたは全く結合が 見られない。これらのデータはＰＧＣ−１がＰＰＡＲ_γ及びいくつかの他の核受 容体とインビトロで特異的に相互作用することを示す。リガンド依存性なし（Ｐ ＰＡＲ_γ）からリガンド添加に対する強い依存性（ＲＡＲα）まで、これらの相 互作用にはリガンドに対する広範囲の依存性がある。 哺乳類細胞においてもＰＰＡＲ_γとＰＧＣ−１の間の相互作用を見ることがで きる。添加されるリガンドなしでさえ、免疫沈降アッセイにおいてこれら２つの タンパク質の間で会合が見られる。ＨＡのついたＰＧＣ−１及びＰＰＡＲ_γを発 現するベクターとをＣＯＳ細胞中にトランスフェクトした。簡潔に言えば、ＨＡ のついたＮ末端を有する全長ＰＧＣ−１をＰＣＲにより作製し、ｐＳＶ−ＳＰＯ ＲＴのＳｍａＩにつないだ。リガンドのピオグリタゾン（５μＭ）、９−シスＲ Ａ（１μＭ）及び８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（１ｎｍ）を添加し、３時間後に細胞を集 めた。Ｌａｓｓｅｒ等（（１９９１）Ｃｅｌｌ ６６：３０５−３１５）のよう にトランスフェクト細胞からの細胞抽出及び免疫沈降を実施した。ウサギ抗−マ ウスＰＰＡＲ_γ（Ｈｕ等（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：２１００−２１ ０３）を免疫沈降に１：５００希釈物として用いた。ウェスタンブロットのため の抗−ＨＡマウス希釈物をＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて発色させた。細 胞をピオグリタゾン（ＰＰＡＲ_γリガンド）で処理した場合、会合の非常に適度 な増加が見られる。 ＰＧＣ−１が実際に細胞核に存在するかどうかを検討するために、ＰＧＣ−１ とグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）間の融合タンパク質を構築した。これを完 了ことにより全長ＰＧＣ−１に融合したＧＦＰを作製した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） 。Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｒａ ２００顕微鏡を用いてトランスフェクション の２４時間に細胞配置を視覚化した。ＧＦＰ−ＰＧＣ−１がＣＯＳ細胞において 発現される場合、それは完全に細胞核中に見られる。 これらの結果はＰＧＣ−１がＰＰＡＲ_γだけでなく他の核受容体にも結合し、 従って、これらのさらなる核ホルモン受容体の機能を調節する ためにこの分子を使用できることを示す。これらの核ホルモン受容体の機能を調 節する分子をスクリーニングするための標的としてＰＧＣ−１を用いることがで きる。さらに、ＰＧＣ−１が甲状腺ホルモン受容体及びレチノイン酸受容体と相 互作用することは、これらの受容体は両方ともＵＣＰ発現を転写的に調節できる ので褐色脂肪細胞機能において重要である。 実施例Ｖ： ＵＣＰ調節要素の制御下の遺伝子の発現を誘導するためにＰＧＣ− １はＰＰＡＲ_γ／ＲＸＲα及びＴＲとのコアクチベーターとして働く。 ＰＧＣ−１の転写活性を評価するために、インビトロ転写アッセイを実施した 。ＵＣＰ−１プロモーターはＰＰＡＲ_γ及びＴＲの両方の結合部位を有すること が示されている（Ｃａｓｓａｒｄ−Ｄｏｕｌｃｉｅｒ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ ．２６９：２４３３５−２４３４２；Ｓｅａｒｓ等（１９９６）Ｍ ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ．１６：３４１０−３４１９）。このアッセイでは、 ＵＣＰの全長プロモーター及びエンハンサーをＣＡＴレポーター遺伝子に連結し た。ＲＡＴ ＩＲ（ヒトインシュリン受容体を発現するように形質転換されたラ ット繊維芽細胞系）細胞をリン酸カルシウム法を用いてＰＳＶ−ｓｐｏｒｔのみ （コントロール）、ＰＰＡＲ_γ／ＲＸＲα、ＰＧＣ−１及びＰＰＡＲ_γ／ＲＸＲ α／ＰＧＣ−１で一過性トランスフェクトした。ＣＭＶプロモーターの制御下の β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の共トランスフェクションによりトラン スフェクション効率に関してＣＡＴアッセイからの結果を調整した。各場合で、 細胞をジメチルスルホキシドまたは９−シスレチノイン酸、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ 及び合成ＰＰＡＲ_γリガンドピ オグリタゾン（ＰＩＯ）の組み合わせのいずれかで処理した。９−シスレチノィ ン酸、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ及びＰＩＯの組み合わせで処理し、そしてＰＧＣ−１ のみを含有する細胞、ＰＰＡＲ_γ／ＲＸＲαを含有する細胞及びＰＰＡＲ_γ／Ｒ ＸＲα／ＰＧＣ−１を含有する細胞において転写活性が見られた。９−シスレチ ノイン酸、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ及びＰＩＯの組み合わせで処理し、そしてＰＰＡ Ｒ_γ／ＲＸＲα／ＰＧＣ−１を含有する細胞において最大の活性が見られた。こ れらの結果はＰＧＣ−１がＰＰＡＲ_γ／ＲＸＲαの正の転写コアクチベーターと して働くことを示す。 どの誘導物質がＰＧＣ−１の転写活性化に関与するかを決定するために、細胞 を異なる誘導物質で個々に（ＰＩＯ、合成ＰＰＡＲ_γリガンドトログリタゾン（ ＴＲＯ）、９−シスレチノイン酸、８−Ｂｒ ｃＡＭＰ）、そして組み合わせて （８−Ｂｒ ｃＡＭＰと組み合わせた９−シスレチノイン酸）処理した。個々の 誘導物質で処理された細胞に関して、誘導物質の効能は以下とおりであることが 見いだされた（最も高いものから最も低いものへ）：９−シスレチノイン酸、８ −Ｂｒ ｃＡＭＰ、ＴＲＯ、そして次にＰＩＯ。９−シスレチノイン酸と８−Ｂ ｒ ｃＡＭＰの組み合わせは個々の誘導物質のいずれよりも転写活性を高めるこ とに効力があった。 同様に、ＴＲβ／ＲＸＲαの組み合わせのみは、Ｔ₃（１μＭ）を含むリガン ドカクテルで刺激した場合でさえほとんど転写活性を誘導しなかった。しかしな がら、ＴＲβ／ＲＸＲα対とＰＧＣ−１の組み合わせは、再びリガンド依存的に 強力なトランス活性化を誘導した。これらの結果はＰＧＣ−１がＰＰＡＲ_γ及び ＴＲの強力な転写コアクチベーター として機能できることを明らかに示す。ＰＧＣ−１とＰＰＡＲ_γの結合はリガン ド依存的でないことにもかかわらず、ＰＰＡＲ_γリガンドを添加して最高の転写 応答が見られることは興味深い。これはＳＲＣ−１、ＣＢＰ等のような別のコア クチベーターの同時のリガンド依存的連結に起因すると思われる。 ＰＰＡＲ_γ及びＰＧＣ−１で最大の転写活性化を得るために用いられる異なる ホルモン及びリガンドの役割を図３Ａにおいて分析する。個々の成分−トログリ タゾン（ｔｒｏｇ．）、９シス−レチノイン酸（９ｃＲＡ）及び８−ブロモサイ クリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）−は各々転写活性の２ないし４倍の増加を刺激する 。活性化倍数は同じベクターでトランスフェクトしたがリガンドで処理しなかっ た細胞で見られた値に比較された。しかしながら、それらを組み合わせて用いた 場合に最も強い応答が見られる。９−シスレチノイン酸と８−ブロモサイクリッ クＡＭＰの相乗作用は特に顕著であり（１４倍）、一方、３つ全ての薬剤一緒で は未処理のコントロールより１８倍の増加を引き起こす。 上記の転写アッセイはＰＧＣ−１のみ及び／またはＰＰＡＲ_γ／ＲＸＲαと組 み合わせたＰＧＣ−１の機能を調節する、例えば、刺激するかまたは抑制する化 合物または薬剤をスクリーニングするための有用なアッセイである。本実施例に 報告された結果に基づくと、ＵＣＰ発現、従ってＢＡＴにおける熱発生を調節す ると思われる薬剤はＰＧＣ−１分子、ＰＰＡＲ_γリガンド（例えば、チアゾリジ ンジオン、例えばＰＩＯ及びＴＲＯ）、レチノイド及びアドレナリンアゴニスト を含む。 実施例VI： ＰＧＣ−１−ＰＰＡＲァ相互作用を調節するドメインの同定 核受容体とＳＲＣ−１またはＣＢＰのようなある種のコアクチベーターの間の 相互作用はリガンド依存的であり（Ｋａｍａｉ等（１９９６）Ｃｅｌｌ ８４： ４０３−４１４）、コアクチベーター中のＬＸＸＬＬ（配列番号：３）及び受容 体中のＣ末端ＡＦ−２ドメインを伴う（Ｈｅｅｒｙ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７３３−７３６：Ｔｏｒｃｈｉａ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８ ７：６７７−６８４）。ＰＧＣ−１−ＰＰＡＲγ相互作用を招くドメインを同定 するために、ＰＧＣ−１の異なるＣ末端欠失を網状赤血球翻訳産物として作製し 、ＦＳＴ−ＰＰＡＲ_γ融合タンパク質と混合した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにつ ながれたＰＧＣ−１ ｃＤＮＡ中の特定の制限部位を用いてＰＧＣ−１の欠失を 作製した。これらの欠失のために以下の制限酵素を用いた：全長ＸｈｏＩ（ａａ １−７９７）、ＨａｅII（ａａ １−６７５）、ＮｃｏＩ（ａａ １−５０３）、 ＸｂａＩ（ａａ １−４０３）、ＫｐｎＩ（ａａ １−３３８）及びＳｔｕＩ（ａ ａ １−２９２）。次に、これらを［³⁵Ｓ］メチオニンで標識してインビトロで 翻訳した。各インビトロ翻訳反応の１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オ ートラジオグラフィーを行った。 図４に固定したＰＡＧＥ_γに結合する全長ＰＧＣ−１（１−７９７）及び１− ６７５欠失の両方のデータを要約する。ＳＲ及びＲＮＡ結合ドメインを欠いてい るＰＧＣ−１ １−５０３の結合は１８％まであまり大きくなく減少した。同様 なレベルの結合をＰＧＣ−１ １−４０３及び１−３３８で見ることができる。 しかしながら、ＬＸＸＬＬ（配列番号：３）モチーフをなお含有するＰＧＣ−１ １−２９２はＰＰＡＲ_γと相互作用する能力を完全に失う。図２Ａに示される ように、残基２９２ −３３８はプロリン残基が非常に多いが、タンパク質−タンパク質相互作用をも たらすことが知られているいかなる明確なドメインも含有しない。 現在まで同定された核ホルモン受容体アクチベーターの大部分は、リガンド依 存的転写活性化を招くＣ末端ＡＦ−２ドメインと相互作用する。ＰＧＣ−１もＰ ＰＡＲ_γのこの部分と相互作用するかどうかを決定するために、ＧＳＴ融合タン パク質として製造されるＰＰＡＲ_γのいくつか欠失を用い、インビトロ翻訳され たＰＧＣ−１と合わせた。図５はＰＰＡＲ_γのアミノ酸１８１−５０５（酵母２ ハイブリッドスクリーニングにおいて用いられた最初のフラグメント）がＰＧＣ −１と強く相互作用し、投入量の２３％に下げることを示す。一方、４５アミノ 酸のさらなる欠失（２２８−５０５）は全長ＰＧＣ−１に結合できない。これら のＰＰＡＲ_γ欠失は両方ともＳＲＣ−１に結合することができ、それらが他のタ ンパク質と相互作用する一般的能力を失っていないことを示す。これらのデータ はＰＰＧＲ_γがＰＧＣ−１と結合するためにそのＤＮＡ結合及びヒンジドメイン の部分を利用することを示す。それは明らかにＳＲＣ−１及びＣＢＰのような他 のコアクチベーターを連結するＣ末端ＡＦ−２ドメインにより相互作用しない。 実施例VII： ＰＧＣ−１の転写活性及び欠失分析 ＰＧＣ−１がそれ自体の転写活性化ドメインを有するかまたは核受容体の転写 アクチベーター特性を現すかまたは増大する可能性があるなんらかの活性を含有 するかどうかを検討するために、全長または一部のＰＧＣ−１とＧＡＬ４のＤＮ Ａ結合ドメイン（ＤＢＤ）の間の多数の融合タンパク質を調製し、ＧＡＬ４ Ｄ ＮＡ結合標的配列、ＵＡＳによる転 写をアッセィした。ＣＡＴに連結した５コピーのＵＡＳを含有するレポータープ ラスミドで転写をアッセイした。より具体的には以下のように転写活性化アッセ イを実施した。まず、全３ｋｂのｃＤＮＡをＳｍａII（ＳｍａＩ？）−ＸｈｏＩ フラグメントとしてｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）のＳｍａＩ−Ｓ ａｌＩ部位に連結することにより全長ＰＧＣ−１を含有する発現プラスミドを構 築した。ＧＡＬ４ ＤＢＤと全長マウスＳＲＣ１間のコントロール融合と一緒に 、これを−ＣＭＸベクターと細胞中で発現させた。４．５μｇのＤＢＤ−ＰＧＣ −１により刺激された活性を１００％と設定した。−３７４０／＋１１０ｂｐ ＵＣＰ プロモーターは以前に記述された（Ｋｏｚａｋ等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ．１４：５９−６７）。１０％コズミック（ｃｏｓｍｉｃ）仔 ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中でＲａｔ１ ＩＲ繊維芽細胞を培養し、リン酸カ ルシウム法により８０％−９０％融合でトランスフェクトした。０．１％ ＤＭ ＳＯを含有するビヒクル（９−シスレチノイン酸及びトログリタゾン）または水 （８−ブロモｃＡＭＰ）にリガンドを溶解した。トランスフェクションを二重に 実施し、少なくとも３回繰り返した。Ｋｉｍ及びＳｐｉｅｇｅｌｍａｎ（（１９ ９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０：１０９６−１１０７）中に記述されたように ＣＡＴ活性をアッセイした。 ＧＡＬ４融合構築物では、ＰＣＲにより作製された全長ＰＧＣ−１をｐＣＭＸ −ＧＡＬ４プラスミドのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＶ部位中にインフレームでクローン 化した。マウス全長ＳＲＣ−１をＲＳＶ．ＧＡＬ４のＳｍａＩ部位にクローン化 した。ＣＯＳ細胞をＲａｔ１ ＩＲ繊維芽細胞と同様にトランスフェクトし、レ ポーターは５ｘＵＡＳｇ−ＣＡＴで あった。 図３Ｂに示されるように、ＰＧＣ−１はＧＡＬ４ ＤＢＤによりＤＮＡにつな がれると容易に転写を活性化できる。比較のために、核受容体の別のコアクチベ ーター、ＳＲＣ−１とＧＡＬ４ ＤＢＤの融合により得られた結果を示す。従っ て、ＰＧＣ−１は転写活性化機能を示すために核受容体への連結を全く必要とせ ず；これらの受容体とその相互作用は主としてＰＧＣ−１を適切なＤＮＡ部位に 導くように働くと思われる。 ＰＧＣ−１の転写活性化ドメインの位置をさらに決定するために、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに連結した多数の欠失突然変異体を上記のようにルシフェラ ーゼレポーター遺伝子の誘導に関して試験した。以下の構築物：コントロールの ＧＡＬ−４のみ、ＧＡＬ４−ＰＧＣ−１、ＧＡＬ４−ＰＧＣ−１のアミノ酸１− ６５、ＧＡＬ４−ＰＧＣ−１のアミノ酸１−１２５、ＧＡＬ４−ＰＧＣ−１のア ミノ酸１−１７０、ＧＡＬ４−ＰＧＣ−１のアミノ酸１−３５０、ＧＡＬ４−Ｐ ＧＣ−１のアミノ酸１−５５０、ＧＡＬ４−ＰＧＣ−１のアミノ酸１−６５０及 びＧＡＬ４−ＰＧＣ−１のアミノ酸１７０−７９７を試験した。結果を以下の表 １に要約する。 表１：ＰＧＣ−１−ＧＡＬ−４構築物の転写活性 表１に示されるように、分子のＮ末端領域を含有するＧＡＬ４−ＰＧＣ−１構 築物は全長分子より高い転写活性を示す。構築物ＧＡＬ４ １７０−７９７は検 出可能な転写活性を示さなかった。これらの結果はＰＧＣ−１の転写活性化ドメ インが分子のＮ末端領域、特に、ＰＧＣ−１のアミノ酸１−１７０に位置するこ とを示す。Ｃ末端アミノ酸残基が含まれる場合に見られる転写活性の減少（例え ば、ＧＡＬ４ １−１２５と全長分子の転写活性を比較せよ）は、これらのＣ末 端残基がＮ末端ドメインの転写活性を、例えばこのドメインを遮蔽することによ るかまたはこのドメインを遮蔽するかそうでなければその活性を相殺することが できる他のタンパク質と相互作用することにより、妨げる可能性があることを示 唆する。 上記のアッセイ及び構築物はＰＧＣ−１の機能を調節する、例えば、刺激する かまたは抑制することができる化合物または薬剤をスクリーニ ングするための有用なアッセイを提供する。特に、好ましい化合物または薬剤は ＰＧＣ−１のアクチベーター、例えば、分子のＣ末端部分の阻害作用を相殺する 薬剤を含む。これらの化合物または薬剤は熱発生を調節することに有用である可 能性がある。 実施例VIII： ＰＧＣ−１活性の調節におけるプロテインキナーゼＡの役割 ＵＣＰ遺伝子の発現はｃＡＭＰに非常に感受性である。ＰＧＣ−１配列の分析 により、プロテインキナーゼＡによるリン酸化の３つの共通部位が示された（図 ２Ａ及び２Ｂ）。この結果はＰＧＣ−１の活性の調節におけるこのキナーゼの潜 在的役割を示唆し、それは次にＵＣＰ遺伝子発現を改変する。この可能性を検討 するために、部位特異的突然変異誘発を実施してこれらのリン酸化部位を除去す ることができる。例えば、標準プロトコルを用いて配列番号：２のアミノ酸３７ ３−３７６を突然変異させることができる。得られた突然変異体の転写活性をＵ ＣＰプロモーターの制御下のレポーター遺伝子、例えばＣＡＴ遺伝子を保有する 例えばＣＯＳ細胞またはＨｅＬａ細胞において試験することができる。 実施例IX： ＰＧＣ−１の異所発現は適応熱発生の分子成分を誘導する 適応熱発生の遺伝子を調節するＰＧＣ−１の能力を直接調べるために、レトロ ウイルスベクターを用いてこのタンパク質を白色脂肪前駆体細胞において発現さ せ、次に、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ前脂肪細胞を刺激して分化させた。簡潔に言えば 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＰＧＣ−１プラスミドからのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ フラグメントをｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位に連結するこ とによりＰＧＣ−１ウイルス発現ベクター（ｐＢａｂｅ−ＰＧＣ−１）を構築し た。薬剤選択後に、 ウイルス感染した３Ｔ３Ｆ４４２Ａ−ＰＧＣ−１及び３Ｔ３Ｆ４４１Ａ−ベクタ ー細胞系を１０％ ＢＣＳを含むＤＭＥＭ中で融合するまで増殖させた。これら の細胞をＤＭＥＭインシュリン中で培養することによりそれらの分化を開始させ た。細胞にこの培地を２日毎に再供給した。１０％ ＣＣＳを含むＤＭＥＭ中で 特定の細胞を融合するまで増殖させた。次に、分化を誘導するためにこれらの細 胞を１μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭのメチル−イソブチル−キサンチン、１ ２５μＭインドメタシン、１７ｎＭインシュリン及び１ｎＭ Ｔ₃で４８時間処理 した。続いて、１０％ ＣＣＳ、１７ｎＭインシュリン及び１ｎＭ Ｔ₃を含有す るＤＭＥＭ中で細胞を維持し、２日毎に補給した。これらの処理後に、全ＲＮＡ を単離し、分析した。ＵＣＰ−１発現を誘導するために、１μＭ ８−ブロモ−ｃＡＭＰ及び１ｍＭ ９−シス−レチノイン酸を培地に添加し、６時間後に細胞から全ＲＮＡを抽出し た。ＰＧＣ−１プローブでのノーザンブロット分析により、ＰＧＣ−１ ｍＲＮ Ａが空のベクターに感染したこれらの白色脂肪細胞ではほとんど検出できないが 、ＰＧＣ−１ ｃＤＮＡを含有するウイルスに感染した細胞ではより多く発現さ れることが示された。培養細胞におけるこのｍＲＮＡの発現は低温露出したマウ スの褐色脂肪においてみられるものの約６％であった。細胞核においてコードさ れる褐色脂肪の古典的マーカーのＵＣＰ−１のｍＲＮＡはコントロールの３Ｔ３ −Ｆ４４２Ａ細胞ではほとんで検出できないが、ＰＧＣ−１を発現する細胞では 著しく誘導される。核において同様にコードされる酸化的リン酸化に関与する重 要なミトコンドリアタンパク質のＡＴＰシンテターゼのｍＲＮＡは同様にＰＧＣ −１を発現する細胞において増加される。 ミトコンドリアの呼吸酵素シトクロムｃ−オキシダーゼサブユニットＣＯＸII及 びIVはそれぞれミトコンドリア及び核ゲノムにおいてコードされる。これらのｍ ＲＮＡは両方ともＰＧＣ−１を異所的に発現する細胞において２ないし３倍増加 する。熱発生に関連しない白色及び褐色脂肪細胞遺伝子ａＰ２及びリボソームタ ンパク質の３６Ｂ４の発現を投入コントロールとして示す。これらの結果はＰＧ Ｃ−１が低温露出した動物においてみられるものよりはるかに下のレベルで発現 される場合にでもミトコンドリアの機能及び適応熱発生のいくつかの重要な遺伝 子の発現を刺激できることを示す。 ミトコンドリアゲノムにおいてコードされるタンパク質（ＣＯＸ−II）のｍＲ ＮＡの発現に影響を与えるＰＧＣ−１の能力は、ＰＧＣ−１がミトコンドリアの 生合成自体に影響を与えることができる可能性があることを示唆する。ミトコン ドリアＤＮＡの細胞含有量の変化はミトコンドリア増殖の簡単な生化学アッセイ として用いられている（Ｍａｒｔｉｎ等（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０ ８：７４９−７５２；Ｋｌｉｎｇｅｎｓｐｏｒ等（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ ．３１６：６０７−６１３）。この可能性を検討するために、ミトコンドリア ＤＮＡのサザンブロット分析を実施した。Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８９）Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２版 （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）中に記述されたように ゲノムＤＮＡを単離し、処理することにより３Ｔ３−Ｆ４４２Ａサザンブロット を実施した。３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞を上記のように分化させた。全細胞ＤＮＡ を単離し、ＮｃｏＩで消化した。 １０μｇのＤＮＡを電気泳動し、ミトコンドリアＤＮＡのプローブとしてＣＯＸ −II ｃＤＮＡを用いてサザンブロットをハイブリダイズした。 ミトコンドリアゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により、ＰＧＣ−１を発現 する細胞がコントロール細胞に比較して２倍のミトコンドリアＤＮＡ含有量があ ることが示された。また、同じブロットを核においてコードされるリボソームタ ンパク質の３６Ｂ４のｃＤＮＡでも調べた。次に、ブロットをはがし、核遺伝子 ３６６４でハイブリダイズした。これらの結果は異所ＰＧＣ−１発現がミトコン ドリアＤＮＡの増加を刺激できることを示し、ミトコンドリアの増加した生合成 を示す。 実施例Ｘ： ＰＧＣ−１感染細胞の長期間処置は酸素消費を増加する 熱発生をもたらすＰＧＣ−１の生理的役割を決定するために、上記のようなＰ ＧＣ−１を発現するレトロウイルスベクターに感染した３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ前脂 肪細胞を用いて酸素消費アッセイを実施した。感染の効率を細胞の２５％−３０ ％であると概算する。Ｌｕｄｗｉｋ、Ｊ．等（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ２５６（２４）：１２８４０−１２８４８及びＨｅｒｍｅｓｈ、Ｏ． （１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３（７）：３９３７−３９４ ２中に記述されたように酸素消費アッセイを実施した。１μＭ８−ブロモ−ｃＡ ＭＰ及び１ｍＭ ９−シス−レチノイン酸でのこれらの細胞の６時間の処置は、 これらの細胞による酸素消費の１００％の増加をもたらした（図６）。これらの 細胞において検出された酸素消費の増加は、ミトコンドリアの脱共役タンパク質 （ＵＣＰ）またはプロトン輸送を促進することができる類似したタンパク質の活 性及び／または発現の増加により引き起こされると思われる。 これらの実験はＰＧＣ−１がインビボで熱発生応答をもたらすことができるこ とを示し、従って、ミトコンドリアＤＮＡ及び遺伝子発現の誘導を生理的応答に 直接連結する。ＰＧＣ−１の生理的機能を筋肉のような高レベルのこの分子を発 現することが知られている組織においてさらに特性化することができる。例えば 、Ｃ２−Ｃ１２細胞のような筋管に分化するように誘導できるマウス筋芽細胞に ＰＧＣ−１を発現するレトロウイルスを感染させ、上記の条件下で試験すること ができる。 実施例XI： ＰＧＣ−１は独特な核受容体コアクチベーターである 本明細書に示される結果は、ＰＧＣ−１の発現が組織選択性及び動物の生理的 状態の両方に関して劇的に調節される点で既知の核受容体コアクチベーターの中 で独特である。ＷＡＴではなくＢＡＴにおけるＰＧＣ−１の発現によりそれはこ れらの組織における大部分の既知の転写成分から区別され、そして低温によるそ の誘導はＵＣＰ−１で見られるものよりさらにより劇的である。また、ＰＧＣ− １はそれが受容体−コアクチベーター対の両側でタンパク質−タンパク質連結の ために異なる配列モチーフを用いるようである点でも既知のコアクチベーターと 異なる。既知のコアクチベーター及びコリプレッサーのほとんど全てはカルボキ シ末端ＡＦ−２ドメイン中のリガンドにより調節されるヘリックス１２で結合す るためにＬＸＸＬＬ配列を利用する（Ｈｅｅｒｙ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７３３−７３６；Ｔｏｒｃｈｉａ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７ ：６７７−６８４）。それに反して、ＰＧＣ−１はＰＰＡＲ_γのＤＮＡ結合及び ヒンジ領域と重なる領域に結合するためにプロリン残基に富んだドメインを利用 する。ＰＰＡＲ_γでは、これはＰＧＣ−１が１つまたはそれ以上のリガンドによ り制御されるコアクチ ベーターの代わりのコアクチベーターではなく、むしろこれらのタンパク質と同 時に結合してより大きい巨大分子複合体を与えることができる可能性を開く。一 方、リガンド依存的連結はレチノイン酸受容体、エストロゲン受容体及びある程 度で甲状腺受容体のようないくつかの他の受容体で見られる。リガンド依存的受 容体連結のために必要且つ十分であることがいくつかの状況において示されたモ チーフのＬＸＸＬＬ（配列番号：３）配列がＰＧＣ−１には１つあるので、それ らの受容体へのＰＧＣ−１の結合がこの配列及び受容体ＡＦ−２ドメインに依る ことは全く可能である。 ＡＦ−２ドメインで受容体に結合するコアクチベーターまたはコリプレッサー の大部分はヒストンアセチルトランスフェラーゼまたはヒスチンデアセチラーゼ 活性のいずれかを保有することが現在分かっている（Ｐａｚｉｎ及びＫａｄｏｎ ａｇａ（１９９７）Ｃｅｌｌ ８９：３２５−３２８）。これらの活性はＣＢＰ 及びＳＲＣ−１のようなある種のコアクチベーターに内在してもよく（Ｂａｎｎ ｉｓｔｅｒ及びＫｏｕｚａｒｉｄｅｓ、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：６ ４１−６４３；Ｓｐｅｎｃｅｒ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：１９４− １９８）、またはＳＭＲＴと哺乳類ヒストンデアセチラーゼ間の複合体により示 されるように、コリプレッサーと複合体を形成するタンパク質中に存在してもよ い（Ｎａｇｙ等（１９９７）Ｃｅｌｌ ８９：３７３−３８０；Ｔｏｒｃｈｉａ 等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：６７７−６８４）。一次配列データに基 づくと、ＰＧＣ−１はヒストンアセチラーゼまたはデアセチラーゼ活性を示唆す るいかなるモチーフも含有しない。また、それは既知の核受容体コアクチベータ ーまたはコリプレッサーのいずれ とも著しい配列相同性がない。ＰＧＣ−１が、ＲＮＡポリメラーゼの調節カルボ キシ末端ドメイン（ＣＴＤ）に結合する数個を初めとする多数のタンパク質にお いて同定されている対になったＳＲ及びＲＮＡ結合ドメインを有することは注目 に値する可能性がある（Ｙｕｒｙｅｖ等（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６９７５−６９８０）。また、本明細書に示され る結果を遺伝子抑制機構を取り除くＰＧＣ−１により説明することもできる可能 性がある。少なくとも１つの核受容体（ＴＲ）のヒンジ領域はコリプレッサーの 結合に関与することが示されている（Ｎ−ＣｏＲ；Ｈｏｒｌｅｉｎ等（１９９５ ）Ｎａｔｕｒｅ ３７７：３９４−４０４）。従って、ＰＧＣ−１の作用はコリ プレッサー結合を妨げることにより転写を活性化することである可能性がある。 実施例XII： 適応熱発生におけるＰＧＣ−１の役割 適応熱発生はエネルギー消費の成分をさし、それは身体的活動から分離し、そ して環境条件を変えること、最も顕著には低温露出及び過食に応答してそれを高 めることができる（Ｈｉｍｍｓ−Ｈａｇｅｎ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅ ｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ ．２０８：１５９−１６９）。ヒト肥満症の病因及び治 療の両方における潜在的役割のためにこの主題にかなりの関心がある。 適応熱発生におけるＰＧＣ−１の役割は、まず、このプロセスに関係する主要 な組織及びホルモンにそれが関連することにより示される。本明細書に示される 結果は、骨格筋及び褐色脂肪に対する特に重要な役割を示唆する。ＰＧＣ−１は 筋肉及び褐色脂肪の両方において低温露出により誘導されるが、他の組織ではそ うではない。褐色脂肪の熱発生及び 抗肥満特性は齧歯類において決定的に立証されているが（Ｈｉｍｍｓ−Ｈａｇｅ ｎ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０８：１５９ −１６９）、成人ヒト及び他の大きい哺乳類には明確に特定された褐色脂肪貯蔵 物がないことによりＢＡＴの役割はヒトにおいてあまり明らかではない。成人の 白色脂肪貯蔵物におけるＵＣＰ−１の発現は、褐色脂肪細胞が白色に見える貯蔵 物中に含まれている可能性があり、そしてアドレナリン刺激時にそれを召集でき ることを示唆する（Ｇａｒｒｕｔｉ及びＲｉｃｑｕｉｅｒ（１９９２）Ｉｎｔ． Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ ．１６：３８３−３９０ ）。 ホルモンに関しては、甲状腺ホルモン及びβ−アドレナニンアゴニストが筋肉 及び褐色脂肪における低温及び食事により誘導される熱発生の両方において最も 重要な役割を果たすと思われる（Ｈｉｍｍｓ−Ｈａｇｅｎ（１９８９）Ｐｒｏｃ ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ ．２０８：２５９−２６９；Ｃａｎｎｏｎ 及びＮｅｄｅｒｇａａｄ（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２ ４：４０７−４１２）。β−アドレナリンアゴニストは少なくとも２つの異なる 方法でＰＧＣ−１機能に影響を与えると思われる。第一に、それらはＰＧＣ−１ 発現を誘導することができる。第二に、図３Ｂに示されるように、サイクリック ＡＭＰ（β−アドレナリン受容体活性の細胞内メディエーター）は発現が異所的 に導かれる場合にＰＧＣ−１によりもたらされる転写活性を上げる。この分子的 根拠は分からないが、プロテインキナーゼＡの３つの共通リン酸化部位の存在は 、そのタンパク質がこの経路により翻訳後に活性化される可能性があることを示 唆する。甲状腺ホルモン及びその受容体の熱発生作用はよく知られている。甲状 腺ホルモンレベルを上げるこ との最も明らかな作用の一つは骨格筋、褐色脂肪、心臓及び腎臓におけるミトコ ンドリア呼吸速度の刺激である。甲状腺ホルモンレベルを上げることにより甲状 腺機能低下状態の特徴である異常に低い呼吸速度を上げることができる（Ｐｉｌ ｌａｒ及びＳｅｉｔｚ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３５ ：２３１−２３９）。ＰＧＣ−１が発現される組織及びＴＲを共活性化するその 能力に基づき、ＰＧＣ−１はこれらの作用のいくつかをもたらす非常に妥当な候 補であると思われる。 また、最近の証拠は熱発生におけるＴＺＤの興味深い作用も示唆している。こ れらのＰＰＡＲγリガンドは、おそらく褐色脂肪の増加した形成及びＵｃｐ−１ 遺伝子発現の増加のために、齧歯類に体系的に与えるとエネルギー消費を上げる ことができる。また、これらの作用は培養した細胞においても見られている（Ｆ ｏｅｌｌｍｉ−Ａｄａｍｓ等（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ．５２：６９３−７０１；Ｔａｉ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９９ ０９−２９９１４（１９９６））。ＵＣＰ−１プロモーター及びおそらく熱発生 経路の他のプロモーターに対するＰＰＡＲ_γの機能を共活性化するＰＧＣ−１の 能力はこれらの作用にいくつかの説明を与えることができる。 上記のこれらの関連に加えて、本明細書に示される異所発現実験はＰＧＣ−１ が熱発生の成分を調節できることをより直接的に示す。細胞及び分子レベルで、 適応熱発生は少なくとも３つの区別できる工程：ミトコンドリアの生合成、呼吸 鎖のミトコンドリア酵素の発現及び特定の脱共役タンパク質の発現からなる。現 在、ＵＣＰ遺伝子ファミリーの３つの既知のメンバー：褐色脂肪においてのみ発 現されるＵＣＰ−１；広く 発現されるＵｃｐ−２並びに主に骨格筋及び褐色脂肪において発現されるＵｃｐ −３ がある。与えられる生理的攻撃の時間の長さ及び激しさにより、筋肉、ＢＡ Ｔまたは他の組織において熱発生のこれらの特徴の１つまたはそれ以上に影響を 与えることができる。 本明細書に記述されるＰＧＣ−１のレトロウイルス発現は白色脂肪細胞を用い ている。この細胞型は内在性ＰＧＣ−１発現がほとんどなく、そして比較的少数 のミトコンドリア及びＵＣＰ−１またはＵＣＰ−３のわずかな発現を有すること が知られているのでそれを選択した。比較的低いレベルのＰＧＣ−１ ｍＲＮＡ 発現（低温で誘導したＢＡＴにおいて見られるものの６％）しか得ることができ なかったが、適応熱発生系のいくつかの分子成分が改変されることは明らかであ る。第一に、これらの白色細胞に特徴的なほとんど検出できないレベルからＵｃ ｐ−１ 遺伝子の発現を導く。第二に、ＡＴＰシンテターゼ、Ｃｏｘ−II及びＣｏ ｘ−IV のような、これらの細胞において通常発現される呼吸鎖のいくつかのミト コンドリア遺伝子を著しく増加する。最後に、全細胞ＤＮＡの単位当たりのミト コンドリアＤＮＡの増加により明白に示されるように、ミトコンドリア含有量を 倍にする。 ＰＧＣ−１が適応熱発生に連結するミトコンドリアの工程を調節できる機構は 以下のとおりである可能性がある。核においてコードされ、ＰＰＡＲ、ＴＲまた は他の核受容体に応答するＵＣＰ−１のような遺伝子では、ＰＧＣ−１は転写速 度を上げるコアクチベーターとして直接働くことができる可能性がある。（Ｃｏ ｘ−II のような）ミトコンドリアゲノムにおいてコードされる遺伝子では、ＰＧ Ｃ−１は直接的または間接的に働いている可能性がある。ミトコンドリア内のあ る種の遺伝子は機 能的甲状腺応答配列を有することが示されている（ＴＲＥｓ；Ｐｉｌｌａｒ及び Ｓｅｉｔｚ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３５：２３１− ２３９）。ＰＧＣ−１は主に核において見られるが、ＴＲ及びＰＧＣ−１のわず かな割合はミトコンドリア中に輸送され、これらの部位で直接機能する。同様に 、ミトコンドリアＤＮＡ複製に関して、ミトコンドリアゲノムのＤループは激し い鎖複製の部位であり、ＴＲＥ−ＤＲ２配列を含み（Ｗｒｕｔｎｉａｋ等（１９ ９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１６３４７−１６３５４）、ＴＲ及び ＰＧＣ−１がここで直接作用できる可能性があることを示唆する。一方、ＰＧＣ −１及び核受容体は、遺伝子転写及び／またはＤＮＡ複製を刺激するようにミト コンドリアにおいて機能することが示されている（Ｐｉｌｌａｒ及びＳｅｉｔｚ 、（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３５：２３１−２３９） ＮＲＦまたはミトコンドリア因子Ａのような他の核因子の発現を調節できる可能 性がある。 （背景のセクションを初めとする）本願の全体にわたって引用される（文献参 考文献、発行された特許、公開された特許出願及び同時係属中の特許出願を初め とする）全ての引用された参考文献の内容は引用することにより明白に本明細書 に組み込まれる。「適応熱発生に関連する核受容体の低温誘導性コアクチベータ ー」という表題をつけた(その中に示される図面を含む)付録Ａの全内容も引用す ることにより組み込まれる。 同等物 当業者は本明細書に記述される本発明の特定の態様に対する多数の同等物を日 常的実験のみを用いて認識するかまたは確認することができる。そのような同等 物は以下の請求の範囲により含まれると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 31/7088 33/566 39/395 // Ａ６１Ｋ 31/7088 Ａ６１Ｐ 3/00 38/00 3/04 39/395 3/10 Ａ６１Ｐ 3/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 3/04 5/00 Ａ 3/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ウ，ジダン アメリカ合衆国マサチユセツツ州02120ボ ストン・トレモントストリート1575・アパ ートメント407

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＰＧＣ−１またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含んでなる 単離された核酸分子。 ２． タンパク質またはその一部をコードするヌクレオチドを含んでなる単離 された核酸分子であって、ここにおいて、タンパク質またはその一部が以下の生 物学的活性：ＵＣＰ発現、脂肪細胞における熱発生、脂肪細胞の分化及び脂肪細 胞のインシュリン感受性の１つまたはそれ以上を調節する能力を保つように配列 番号：２のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を含んでなる単離された核 酸分子。 ３． タンパク質が配列番号：２の全アミノ酸配列に少なくとも約６０％相同 なアミノ酸配列を含んでなる請求の範囲２の単離された核酸分子。 ４． タンパク質の一部が以下のドメインまたはモチーフ： ａ）ｃＡＭＰリン酸化部位； ｂ）チロシンリン酸化部位； ｃ）ＲＮＡ結合モチーフ； ｄ）セリン−アルギニンに富んだドメイン；及び ｅ）ＬＸＸＬＬモチーフ の１つまたはそれ以上を含んでなる、請求の範囲２の単離された核酸分子。 ５． 配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子にハイブリダイ ズする少なくとも１５ヌクレオチドの長さの単離された核酸分子。 ６． 配列番号：１のヌクレオチド配列または配列番号：１のヌクレ オチド配列に少なくとも約６０％相同なヌクレオチド配列を含んでなる単離され た核酸分子。 ７． 配列番号：２のアミノ酸配列または配列番号：２のアミノ酸配列に少な くとも約６０％相同なアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子。 ８． ＰＧＣ−１融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。 ９． 請求の範囲１の核酸分子にアンチセンスである単離された核酸分子。 １０． ＰＧＣ−１をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクター。 １１． 請求の範囲１０のベクターを含有する宿主細胞。 １２． ＰＧＣ−１が生産されるまで適当な培地中で請求の範囲１１の宿主細 胞を培養することを含んでなるＰＧＣ−１の製造方法。 １３． 以下の生物学的活性：ＵＣＰ発現、脂肪細胞における熱発生、脂肪細 胞の分化及び脂肪細胞のインシュリン感受性の１つまたはそれ以上を調節するこ とができる単離されたＰＧＣ−１タンパク質またはその一部。 １４． タンパク質またはその一部が以下の生物学的活性：ＵＣＰ発現、脂肪 細胞における熱発生、脂肪細胞の分化及び脂肪細胞のインシュリン感受性の１つ またはそれ以上を調節する能力を維持するように配列番号：２のアミノ酸配列に 十分に相同なアミノ酸配列を含んでなる単離されたタンパク質またはその一部。 １５． タンパク質の一部が以下のドメインまたはモチーフ： ａ）ｃＡＭＰリン酸化部位； ｂ）チロシンリン酸化部位 ｃ）ＲＮＡ結合モチーフ； ｄ）セリン−アルギニンに富んだドメイン；及び ｅ）ＬＸＸＬＬモチーフ の１つまたはそれ以上を含んでなる、請求の範囲１４の単離されたタンパク質ま たはその一部。 １６． 配列番号：２のアミノ酸配列または配列番号：２のアミノ酸配列に少 なくとも約６０％相同なアミノ酸配列を含んでなる単離されたタンパク質。 １７． ＰＧＣ−１以外のポリペプチドに機能的に連結されたＰＧＣ−１ポリ ペプチドを含んでなる融合タンパク質。 １８． ペプチドに対して作製される抗体がＰＧＣ−１と特異的免疫複合体を 形成するようにペプチドがＰＧＣ−１のエピトープを含んでなる、配列番号：２ に示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含んでなるＰＧＣ−１の 抗原性ペプチド。 １９． ＰＧＣ−１に特異的に結合する抗体。 ２０． ＰＧＣ−１タンパク質またはｍＲＮＡを検出することができる薬剤と 生物学的サンプルを接触させることを含んでなる生物学的サンプル中のＰＧＣ− １の存在の検出方法。 ２１． 生物学的サンプル中のＰＧＣ−１タンパク質またはｍＲＮＡを検出す ることができる標識されたまたは標識可能な薬剤；サンプル中のＰＧＣ−１の量 を決定するための手段；及びサンプル中のＰＧＣ−１の量を基準と比較するため の手段を含んでなる生物学的サンプル中のＰＧＣ−１の存在を検出するためのキ ット。 ２２． ＰＧＣ−１核酸の発現またはＰＧＣ−１タンパク質の活性を調節する 化合物または薬剤の能力をアッセイし、それにより異常なＰＧＣ−１核酸発現ま たはＰＧＣ−１タンパク質活性を特徴とする疾患を処置することができる化合物 を同定することを含んでなる、異常なＰＧＣ−１核酸発現またはＰＧＣ−１タン パク質活性を特徴とする疾患を処置することができる化合物の同定方法。 ２３． 複合体を形成するようにＰＧＣ−１タンパク質に化合物を結合させる 条件下で化合物とＰＧＣ−１タンパク質を接触させ；そしてＰＧＣ−１タンパク 質と化合物の複合体形成を検出することを含んでなり、その場合、ＰＧＣ−１タ ンパク質に結合する化合物の能力が複合体中の化合物の存在により示される、Ｐ ＧＣ−１タンパク質に結合する化合物の同定方法。 ２４． 複合体を形成するようにＰＧＣ−１タンパク質に標的分子を結合させ る条件下で化合物の存在下でＰＧＣ−１タンパク質と標的分子接触させ；そして ＰＧＣ−１タンパク質と標的分子の複合体の形成を検出することを含んでなり、 ここにおいて、ＰＧＣ−１タンパク質と標的分子間の相互作用を妨げる化合物の 能力が、化合物の非存在下で形成される複合体の量に比較した場合の複合体形成 の減少により示される、標的分子とＰＧＣ−１タンパク質の相互作用を妨げる化 合物の同定方法。