JPH11507517A - 摂食行動の調節 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
摂食及び体重の調節におけるMCH及びそのアナログ。
Description
【発明の詳細な説明】
摂食行動の調節
発明の背景
この発明は、MCH、MCHアゴニスト及びアンタゴニスト、及び摂食行動を
調節するためのそれらの利用に関するものである。
肥満マウスモデル例えばob/obマウス、アグーチマウス及び褐色脂肪組織
欠乏マウスモデルの分子的分析によりゲッ歯類の肥満の我々の理解が有意に増加
したにもかかわらず、種々の分子的欠乏が変化した摂食行動へと導く機構は、大
部分、知られていない。一般に、過食症及び肥満の分子的原因は、ヒト及び動物
の両者において、僅かしか分かっていない(Bray(1989)Am.J.Clin.Nutr.891-902
)。最近、2つの肥満関連遺伝子が、ポジショナルクローニングを用いて同定さ
れた(Zhang 等(1994)Nature 372:425-432)。
神経伝達物質及びニューロペプチドは、摂食行動に影響を与えることが知られ
ている。神経伝達物質セロトニン及びノルエピネフリン(NE)は、食欲を阻害
するセロトニンアゴニストによる食欲の調節に関与する(一方、NEアゴニスト
は、摂食を誘導する)。神経伝達物質GABAに対する異常な応答も、報告され
ている(Tsuji 等(1991)Brain Research 48-54。更に、幾つかのニューロペプチ
ドが、摂食の調節に関係してきた。ニューロペプチドY(NPY)は、中枢神経
系におけるNEの作用を真似る。NPYの注射は、満腹のラットに摂食行動を誘
導し(Stanley 等(1989)Physiol and Behav.46:173-177)、NPY及びプレプ
ロNPYmRNAのレベルは、肥満ゲッ歯類において変化し得るが、別の研究者
から報告された結果は、一致していない。NPYの増大したレベルが、mRNA
レベルが変化してないにもかかわらず、食餌誘導により肥満させたウイスターラ
ットの視床下部に見られる(Wilding 等(1992)J.Endocrinol.132-299-404)。ツ
ッカーラットにおいては、視床下部NPY及びプレプロNPY mRNAの増大
したレベルが報告されている(Sanacor 等(1990)Endocrinology 127:730-736;P
esonen等(1992)255-260; 及びWilliams等(1991)Clinical
Science 80:419-426)。同じモデルにおいて、他の研究者は、基底状態では変化
しないが、食餌制限により増大するNPYレベルを見出している(Williams等(1
991)Clinical Science 80:419-426)。ob/obマウスにおいて、視床下部N
PY濃度は、変化しないが、食餌制限は、NPY遺伝子発現を活性化する(Wild
ing 等(1993)Endocrinology 132:1939-1943)。ガラニン、ベーターエンドルフ
ィン、ダイノルフィンを含む他の幾つかのペプチドは、室傍核又は前正中核に注
射したときに、満腹ラットにおける摂食を刺激するように作用する。胃腸管から
得られた因子も又、食欲の調節において重要であり得る。例えば、コレシストキ
ニン及びボンベシンは、ラットに注射したときに、摂食を阻害する(Baile 等(1
986)Physiol Reviews 66:172-234 及びMorley(1987)Endocrinol Rev.8:256-87)
。
魚の視床下部における環状ペプチド、メラニン細胞濃縮ホルモン(MCH)の
存在は、10年以上前に記載された。硬骨魚類におけるMCHの役割は、色の変
化の調節にあるようであり;MCHは、黒色素胞の凝集を誘導し、MSHは、黒
色素胞の分散を誘導する(Nahon 等(1993)Ann.NY Acad.Sci.680:111-129)。1
985年に、免疫反応性のMCHも、ゲッ歯動物の脳において見出され(Skofit
sch 等(1985)Brain Res.Bull.15:635-639)、ラット及びヒトにおけるその細胞
内の位置が数年後に記載された(Naito 等(1988)Cell Tissue Res.253:291-295
及びBresson 等(1987)CR Soc Biol.181:376-382)。哺乳動物においては、MC
H遺伝子の発現は、不確帯の腹側面及び外側視床下部に局在化している(Breton
等(1993)Molecular and Cellular Neurosciences 4:271-284)。この遺伝子は、
MCHペプチド並びに培養において視床下部細胞によりプロセスを受けて遊離さ
れる13アミノ酸をコードしている(Parkes等(1992)Endocrinology 131:1826-1
831)。MCH核周部は、哺乳動物の脳中に伝わり、MCHが複雑な行動を伴う
統合的プロセスに関与していることはありそうなことである(Skofitch等(1985)
Brain Res.Bull.15:635-639)(Zhang 等(1994)Nature 372:425-432)。
発明の要約
一般に、この発明は、患者において、摂食、食欲を促進し、又は体重を獲得し
若しくは維持する方法であって:有効量のMCH又はそのアゴニスト若しくは断
片を投与することを含む該方法を特徴とする。
好適具体例において:患者は、哺乳動物例えばヒトであり;患者は、体重不足
であり又は正常の摂食行動より少ない摂食行動を示し;患者は、免疫系の病気例
えばAIDSを患っており又はHIV陽性であり;患者は、神経性食欲不振であ
り又は腎臓病例えば慢性腎臓病若しくは透析を必要とする腎臓病を患っており;
患者は、減少した食欲若しくは摂食行動を生じる治療又は体重の損失を生じる治
療例えば化学療法、放射線療法又は透析を施与されたか、施与されており又は施
与される。
好適具体例において、この方法は、更に、MCH代謝に関連した病気若しくは
望ましくない状態;摂食、食欲若しくは体重に関係する病気の危険にあるかどう
か;正常の摂食より低下しているかどうか;消耗しているかどうか;又は体重不
足であるかどうか、患者を診断することを含む。
好適具体例において、この方法は、更に、MCH又はそのアゴニスト若しくは断
片の投与を反復することを含む。
好適具体例において、この方法は、更に、減少した摂食又は体重の損失を生じ
る治療例えば化学療法、放射線療法又は透析を施与することを含む。この治療を
、MCH又はMCHのアゴニスト若しくは断片の投与の前、後、又は投与中に施
与することができる。
好適具体例において:患者は、非ヒト動物例えば非ヒト哺乳動物例えば非ヒト
霊長類、イヌ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウスであり;患者は、魚
以外である。患者は、体重若しくは摂食行動を左右する遺伝子に関して野生型で
あってよく、又は患者は、体重若しくは摂食行動に影響を与える1つ以上の遺伝
的障害を有していてよい。例えば、患者は、ob遺伝子、MCH遺伝子又はob
レセプター遺伝子に変異を有していてよい。患者は、トランスジェニック動物例
えばobトランスジーン、MCHトランスジーン又はobレセプタートランスジ
ーンを誤発現するトランスジェニック動物であってよい。患者は又、褐色脂肪
組織が欠乏していてもよい。例えば、褐色脂肪組織「ノックアウト」マウスを、
ジフテリア毒素を褐色脂肪特異的プロモーターに融合することにより作成するこ
とができる。
MCH又はMCHのアゴニスト若しくは断片の投与は:レシピエントが体重の
10、20若しくは30%より多<の体重減少により明示される不十分な摂食、
食欲の消失若しくは体重の損失の徴候を示し始めたとき若しくは患者が正常体重
より10、20若しくは30%低下したとき;食欲の消失が診断されたとき;摂
食、食欲若しくは体重獲得若しくは維持を阻害する治療を開始した時点若しくは
その影響が作用し始めた時点に;又は一般に、健全な若しくは適当な体重レベル
を維持する必要がある場合に開始することができる。
薬剤を投与する期間(又は、臨床的に有効なレベルを患者において維持する期
間)は、長期間例えば6か月以上若しくは1年以上であってよく、又は短期間例
えば1年未満一層好ましくは6か月以下一層好ましくは1か月以下更に好ましく
は2週間以下であってよい。
他の面において、この発明は、更に、患者の摂食を阻害し、食欲を阻害し、又
は体重の喪失を促進させる方法であって、有効量のMCHのアンタゴニストをそ
の患者に投与することを含む方法を特徴とする。
好適具体例において:患者は、哺乳動物例えばヒトであり;患者は、体重過剰
であり若しくは強迫性その他の望ましくない摂食行動を示し;患者は、増大した
摂食行動を生じる治療例えばステロイド療法を施与されているか、施与されてき
ており又は施与される。
好適具体例において、この方法は、更に、MCH代謝に関連する病気若しくは
望ましくない状態;摂食若しくは体重に関係する病気;強迫性その他の望ましく
ない摂食行動、肥満;又は他の摂食若しくは体重に関係する病気の何れかの危険
にあるかどうか、患者を診断することを含む。
好適具体例において、この方法は、更に、MCHアンタゴニストの投与を反復
することを含む。
好適具体例において、この方法は、更に、増大した摂食行動又は体重の獲得を
生じる治療例えばステロイド療法を施与することを含む。この治療を、MCH
アンタゴニスト投与の前、後、又は投与中に施与することができる。
好適具体例において:患者は、非ヒト動物例えば非ヒト哺乳動物例えば非ヒト
霊長類、イヌ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウスであり;患者は、魚
以外である。患者は、体重若しくは摂食行動を左右する遺伝子に関して野生型で
あってよく、又は患者は、体重若しくは摂食行動に影響を与える1つ以上の遺伝
的障害を有していてよい。例えば、患者は、ob遺伝子、MCH遺伝子又はob
レセプター遺伝子に変異を有していてよい。患者は、トランスジェニック動物例
えばobトランスジーン、MCHトランスジーン又はobレセプタートランスジ
ーンを誤発現するトランスジェニック動物であってよい。患者は又、褐色脂肪組
織が欠乏していてもよい。例えば、褐色脂肪組織「ノックアウト」マウスを、ジ
フテリア毒素を褐色脂肪特異的プロモーターに融合することにより作成すること
ができる。
好適具体例において、アンタゴニストは、MCHと少なくとも50、60、7
0、80又は90%相同性を有するMCHのペプチドアナログである。
MCHアンタゴニストの投与を:レシピエントが、例えば体重の10、20若
しくは30%を超える増加により明示される望ましくない摂食行動若しくは体重
の獲得の徴候を示し始めたとき又は患者が10、20若しくは30%正常体重を
超えたときに;食欲の増加が診断されたときに;摂食、食欲、又は体重の獲得若
しくは維持を促進する治療を開始し又はその影響が作用し始めた時点に;又は一
般に、健康な若しくは許容し得る体重レベルを維持する必要がある場合に開始す
ることができる。
薬剤を投与する期間(又は、臨床的に有効なレベルを患者において維持する期
間)は、長期間例えば6か月以上若しくは1年以上であってよく、又は短期間例
えば1年未満一層好ましくは6か月以下一層好ましくは1か月以下更に好ましく
は2週間以下であってよい。
本願発明者は、MCHが摂食行動を誘導することを発見した。この発明は、M
CHアゴニスト又はアンタゴニスト活性に対する治療又は薬剤の評価のための幾
つかの方法を含む。幾つかの方法は、イン・ビトロアッセイを用い、他方、他の
方法は、細胞を用い、更に別の方法は、動物を用いる。ここで言及される
方法は、個々に用いて又は組合せて用いて、MCHアゴニスト又はアンタゴニス
ト活性に対する薬剤を評価することができる。例えば、比較的迅速なイン・ビト
ロの又は細胞ベースのアッセイを、初期スクリーニングとして用い、動物アッセ
イを第二次スクリーニングとして用いることができる。
この治療は、所望の効果を生じ得る任意の治療であってよいが、薬物若しくは
化学薬品等の薬剤の投与が好適である。好ましくは、この治療は、外科的介入例
えば外科的損傷の生成例えば電解質障害以外であり、例えば、この治療は、腹側
正中視床下部障害例えば電解質により生じる腹側正中視床下部障害以外である。
評価される薬剤は、例えば、多糖類、核酸、脂肪、ポリペプチド又はペプチド模
倣物であってよい。アミノ酸ベースの薬剤は、MCHと配列相同性を共有してよ
く、又は配列相同性により無関係であってもよい。例えば、この薬剤は、MCH
と50、60、70、80、90又は95%相同性を有してよい。この薬剤は、
直鎖状又は環状ペプチドであってよい。
従って、他の面において、この発明は、摂食行動、食欲又は体重の維持に対す
る効果に関して治療例えば薬剤の投与を評価する方法を特徴とする。この方法は
、治療剤をメラニン細胞ベースの系(例えば、ここに記載の1つ以上のカエル若
しくはトカゲの皮膚、魚のウロコ又は魚の皮膚アッセイ)に投与し、その系に変
化があるかどうかを測定することを含み、適宜、その治療剤を第2の試験系に投
与して、摂食行動、食欲、又は体重の獲得若しくは損失に関係するパラメーター
に対する治療剤の効果をその第2の系において測定することを含む。この第2の
系は、第1の系と同じでも異なってもよい。好適具体例において、第2の系は、
細胞ベースのアッセイ、例えば魚細胞;爬虫類細胞;両生類細胞;哺乳類細胞;
ゲッ歯類細胞例えばマウス若しくはラット細胞;霊長類細胞;又はヒト細胞を用
いるアッセイである。好適具体例において:細胞は、ニューロン細胞例えばGH
3細胞、PC12細胞又は一次視床下部培養細胞である。他の好適具体例におい
て、第2の系は、動物ベースの系であり、例えば、治療を動物に施与して、摂食
行動に関するパラメーター例えば摂食行動それ自体に対する効果を評価する。
他の面において、この発明は、摂食行動、食欲又は体重の維持に対する効果に
ついて治療例えば薬剤の投与を評価する方法を特徴とする。この方法は、MCH
のプロモーター領域に結合されたレポーター遺伝子を有する動物、細胞(動物、
植物又は細菌細胞)又は細胞培養調製物を用意し;治療を施与し;そしてレポー
ター遺伝子発現に対する効果があるかどうかを測定することを含む。レポーター
遺伝子発現に対する効果は、摂食行動、食欲又は体重維持に対する効果を示すも
のである。好適具体例において、細胞は、魚細胞;爬虫類細胞;両生類細胞;哺
乳類細胞;ゲッ歯類細胞例えばマウス若しくはラット細胞;霊長類細胞;又はヒ
ト細胞である。好適具体例において、細胞は、ニューロン細胞例えばGH3細胞
、PC12細胞又は一次視床下部培養細胞である。
他の面において、この発明は、摂食行動、食欲又は体重維持に対する効果につ
いて治療例えば薬剤の投与を評価する方法を特徴とする。この方法は、MCHが
結合するレセプター(例えば、MSHレセプター、MC3−R)を発現するか或
は、MCHを加えたときにリガンドに結合する能力が変化する動物、細胞(動物
、植物又は細菌細胞)又は細胞培養調製物を用意し;その動物、細胞又は細胞培
養に治療を施与し;そして、(1)レセプターに対するリガンド例えばMCHア
ゴニスト若しくはアンタゴニストの結合に関するパラメーターに変化があるか、
又は(2)摂食、食欲若しくは体重の損失若しくは獲得に関係するパラメーター
に対する効果があるかを測定する。好適具体例において、細胞は、異種のレセプ
ター例えばマウスレセプターでトランスフォームされたヒト細胞例えばHEK−
293系統又は類似細胞からの細胞である。好適具体例において、リガンド/レ
セプター結合に関連したパラメーターは:シグナル変換関連現象における変化;
相互作用例えば第2のリガンドとレセプターとの結合における変化、例えばレセ
プターに対するACTHリガンドの結合における変化を含む。他の好適具体例に
おいて、細胞は:魚細胞;爬虫類細胞;両生類細胞;哺乳類細胞;ゲッ歯類細胞
例えばマウス若しくはラット細胞;霊長類細胞;又はヒト細胞である。好適具体
例において、細胞は、ニューロン細胞例えばGH3細胞、PC12細胞又は一次
視床下部培養細胞である。
他の面において、この発明は、摂食行動、食欲又は体重維持に対する効果につ
いて治療例えば薬剤の投与を評価する方法を特徴とする。この方法は:MCHが
結合する基質(例えば、脊椎動物の脳例えば脳切片又はシナプトソーム調製物に
由来する基質)を用意し;その基質、MCH及び薬剤を接触させ;そして、MC
Hのその基質への結合を促進し又は阻害するその化合物の能力を評価することを
含む。その基質へのMCHの結合を阻害するその化合物の能力は、MCHアゴニ
スト又はアンタゴニスト活性を示すものであり得る。好適具体例において:薬剤
は、抗体以外であり;薬剤は、サケのMCHに対する抗体以外であり;薬剤は、
ウサギ抗体以外であり;薬剤は、ウサギポリクローナル抗体以外例えばウサギポ
リクローナル抗魚MCH抗体以外であり;薬剤は、完全長抗体以外であり、例え
ばそれは抗体断片例えばMCHに結合できる断片であり;MCHポリペプチドは
、粗脳調製物若しくは脳切片以外の形態であり;MCHは、天然に共存する少な
くとも1つの蛋白質を実質的に含まない。他の好適具体例において:薬剤は、モ
ノクローナル抗体であり;薬剤は、組換え又はヒト化抗体である。
他の面において、この発明は、摂食行動、食欲又は体重維持に対する効果につ
いて治療例えば薬剤の投与を評価する方法を特徴とする。この方法は:細胞若し
くは細胞培養調製物を用意し;治療を施与し;そして、細胞又は細胞培養調製物
におけるMCH RNA又は蛋白質のレベルに対する効果があるかどうかを測定
することを含む。好適具体例において、細胞は、魚細胞;爬虫類細胞;両生類細
胞;哺乳類細胞;ゲッ歯類細胞例えばマウス若しくはラット細胞;霊長類細胞;
又はヒト細胞である。好適具体例において、細胞は、ニューロン細胞例えばGH
3細胞、PC12細胞又は一次視床下部培養細胞である。
他の面において、この発明は、摂食行動、食欲又は体重維持に対する効果につ
いて治療例えば薬剤の投与を評価する方法を特徴とする。この方法は:患者の動
物を用意し;治療を施与し;そして、その動物におけるMCH RNA又は蛋白
質のレベルに対する効果があるかどうかを測定することを含む。この治療は、所
望の効果を生じる任意の治療であってよいが、薬物又は化学薬品等の薬剤の投与
が好適である。好ましくは、この治療は、外科的介入例えば外科的損傷例えば電
解質障害の生成以外であり、例えば、この治療は、腹側正中視床下部障害例えば
電解質により生じる腹側正中視床下部障害以外である。
好適具体例において、動物は、哺乳動物例えばゲッ歯類例えばラット若しくは
マウス、イヌ又は非ヒト霊長類である。他の具体例において、動物は、ラット又
はマウス以外である。
好適具体例において、治療は、薬剤を投与することを含み且つ薬剤は:抗体以
外であり;薬剤は、サケのMCHに対する抗体以外であり;薬剤は、ウサギ抗体
以外であり;薬剤は、ウサギポリクローナル抗体以外、例えばウサギポリクロー
ナル抗魚MCH抗体以外であり、薬剤は、完全長抗体以外であり、例えばそれは
抗体断片例えばMCHに結合できる断片であり;MCHポリペプチドは、粗脳調
製物又は脳切片以外の形態であり;MCHは、天然に共存している少なくとも1
つの蛋白質を実質的に含まない。他の好適具体例において:薬剤は、モノクロー
ナル抗体であり:薬剤は、組換え又はヒト化抗体である。
他の面において、この発明は、薬剤例えばポリペプチド又はペプチド模倣物を
摂食行動、食欲又は体重維持に対するその効果について評価する方法を特徴とす
る。この方法は:薬剤を動物例えば哺乳動物例えばゲッ歯類例えばラットに投与
して;摂食行動に関係するパラメーターに対する効果があるかどうかを測定する
ことを含む。好適具体例において、薬剤は、MCH又はそのアゴニスト若しくは
アンタゴニストである。例えば、アゴニスト又はアンタゴニストは、天然のMC
Hに対して40、50、60、70、80若しくは90%の相同性を有するMC
Hのペプチドアナログであり、又はそれは、MCHに結合するポリペプチド若し
くは天然のMCHのリガンド例えばMCHレセプター例えばMC3−Rである。
好適具体例において、この化合物は、水及びNaCl以外である。
好適具体例において:薬剤は、抗体以外であり;薬剤は、サケのMCHに対す
る抗体以外であり;薬剤は、ウサギ抗体以外であり;薬剤は、ウサギポリクロー
ナル抗体以外であり、例えばウサギポリクローナル抗魚MCH抗体以外であり;
薬剤は、完全長抗体以外であり、例えばそれは抗体断片例えばMCHに結合でき
る断片であり;MCHポリペプチドは、粗脳調製物又は脳切片以外の形態であり
;MCHは、天然に共存する少なくとも1つの蛋白質を実質的に含まない。他の
好適具体例において:薬剤は、モノクローナル抗体であり;薬剤は、組換え又は
ヒト化抗体である。他の面において、この発明は、薬剤をMCHポリペプチ
ドに結合する能力について評価する方法を特徴とする。この方法は:薬剤をMC
Hポリペプチド又はその精製標品と接触させ;そして、その化合物のMCHポリ
ペプチドと複合体を形成する能力を評価することを含む。この方法は、イン・ビ
トロで、又はイン・ビボで、例えば2ハイブリッド相互作用トラップアッセイに
おいて行なうことができる。好適具体例において;薬剤は、サケのMCHに対す
る抗体以外であり;薬剤は、ウサギ抗体以外であり;薬剤は、ウサギポリクロー
ナル抗体以外であり、例えばウサギポリクローナル抗魚MCH抗体以外であり;
薬剤は、完全長抗体以外であり、例えばそれは抗体断片例えばMCHに結合でき
る断片であり;MCHポリペプチドは、粗脳調製物又は脳切片以外の形態であり
;MCHは、天然に共存する少なくとも1つの蛋白質を実質的に含まない。他の
好適具体例において:薬剤は、モノクローナル抗体であり;薬剤は、組換え又は
ヒト化抗体である。
他の面において、この発明は、薬剤例えばMCHペプチド断片を、MCHの天
然のリガンド例えばMCHレセプター例えばMC3−Rに結合し又はそれを改変
する能力について評価する方法を特徴とする。改変には、例えば、レセプターを
立体的に改変すること、又はMCHポリペプチド若しくは他のリガンドに対する
レセプターの結合特性を改変することが含まれる。この方法は:薬剤をMCHリ
ガンドと接触させ;そして、その薬剤のMCHリガンドと複合体を形成する能力
例えばMCHペプチド/MCHリガンド相互作用を阻害する能力又はレセプター
を改変する能力を評価することを含む。この方法は、イン・ビトロで、又はイン
・ビボで、例えば、2ハイブリッド相互作用トラップアッセイにて行なうことが
できる。好適具体例において:レセプターは、マウスのMC3−R以外であり;
薬剤は、MCHと40、50、60、70、80、90%以上の相同性を有する
MCHのペプチドアナログであり;薬剤は、直鎖状又は環状ペプチドである。
更に別の面において、この発明は、薬剤を、例えばMCHペプチドの第2のポ
リペプチド例えば天然のMCHのリガンド例えばMCHレセプター(例えば、M
C3−R)との相互作用を調節する能力について評価する方法を特徴とする。こ
の方法は、(i)第2のポリペプチド(又は、好ましくは、その精製標品)、
MCHポリペプチド(又は、好ましくは、その精製標品)及び薬剤を、例えば薬
剤の不在において第2のポリペプチド及びMCHポリペプチドが相互作用して例
えば複合体を形成する条件下で合わせるステップ;及び(ii)その相互作用例え
ば第2のポリペプチド及びMCHペプチドを含む複合体の形成(又は分解)を検
出するステップを含む。薬剤の存在下での複合体の形成の変化(例えば、薬剤の
不在時に見られるものと比較しての減少又は増加)は、第2のポリペプチドとM
CHペプチドとの相互作用の調節(例えば、阻害又は促進)を示すものである。
好適具体例において:第2のポリペプチド及びMCHペプチドを無細胞系で合わ
せて、薬剤と接触させ;無細胞系を、細胞溶解物及び再構成した蛋白質混合物よ
りなる群から選択し;MCHペプチド及び第2のポリペプチドは、1つの細胞中
で同時に発現され且つその細胞を薬剤と接触させ、例えば、この方法は、相互作
用トラップアッセイ(例えば、2ハイブリッドアッセイ)を含む。好適具体例に
おいて:レセプターは、マウスのMC3−R以外であり;薬剤は、MCHと40
、50、60、70、80、90%以上相同性を有するMCHのペプチドアナロ
グであり;薬剤は、直鎖状又は環状ポリペプチドである。
好適具体例において;薬剤は、サケのMCHに対する抗体以外であり;薬剤は
、ウサギ抗体以外であり;薬剤は、ウサギポリクローナル抗体以外であり、例え
ばウサギポリクローナル抗魚MCH抗体以外であり;薬剤は、完全長抗体以外で
あり、例えばそれは抗体断片例えばMCHに結合できる断片であり;MCHポリ
ペプチドは、粗脳調製物又は脳切片以外の形態であり;MCHは、天然に共存す
る少なくとも1つの蛋白質を実質的に含まない。他の好適具体例において:薬剤
は、モノクローナル抗体であり;薬剤は、組換え又はヒト化抗体である。
更に別の面において、この発明は、例えば、MCHペプチドと天然のMCHの
リガンド例えばMCHレセプター(例えば、MC3−R)との相互作用を調節す
る(例えば、阻害し又は促進する)能力について、薬剤を評価するための2相法
(例えば、イン・ビトロとイン・ビボ相とを有する方法)を特徴とする。この方
法は、イン・ビトロで行なわれる直前に記載した方法のステップ(i)及び(ii
)を含み、更に、(iii)薬剤がイン・ビトロで相互作用を調節するかどうか
を測定すること、及びもしそうであるならば;(iv)薬剤を細胞又は動物に投与
すること;及び(v)MCHペプチドと第2のポリペプチドとの相互作用に対す
るその薬剤の効果(例えば、阻害)をイン・ビボで、例えば摂食行動に対する効
果により評価することを含む。
他の面において、この発明は、治療を評価するための2相法(例えば、第1の
イン・ビトロ相と第2のイン・ビボ相を有する方法)を特徴とする。この方法を
用いて、治療を、MCH媒介される現象(例えば、摂食行動、食欲又は体重維持
の面)を調節する能力(例えば、阻止し又は促進する能力)について評価し、又
は試験薬剤を、治療剤として用いることについて評価することができる。この方
法は、(i)試験薬剤を、MCH調節配列に機能的に結合されたレポーター遺伝
子を含む細胞又は無細胞系と接触させてレポーター遺伝子の発現の調節を検出す
るイン・ビトロ相、及び(ii)もしその試験薬剤が発現を調節すれば、その試験
化合物を動物に投与して、摂食行動の面例えばMCH発現のレベルに対するその
化合物の効果をイン・ビボで評価することを含む。
他の面において、この発明は、薬剤を、MCH調節配列をコードする核酸に結
合する能力についてを評価する方法を特徴とする。この方法は:薬剤をこの核酸
に接触させて;この化合物がこの核酸と複合体を形成する能力を評価することを
含む。
他の面において、この発明は、治療例えば望ましくない摂食行動により特徴付
けられる病気又は過少若しくは過剰体重の状態を処置する治療の効果を評価する
方法を特徴とする。この方法は、MCH遺伝子を誤発現する試験細胞又は生物を
用いる。この方法は:治療を試験細胞又は生物例えば培養細胞又は哺乳動物に施
与すること及びMCH代謝の面に対するその治療の効果を評価することを含む。
MCH代謝の面に対する効果は、その治療の効果を示す。好適具体例において:
MCH代謝の面に対する効果は、摂食行動又は体重の変化、MCHmRNAレベ
ルの変化、MCH蛋白質レベルの変化である。
好適具体例において細胞は:魚細胞であり;爬虫類細胞であり;両生類細胞で
あり;哺乳類細胞であり;ゲッ歯類細胞例えばマウス若しくはラット細胞であり
;霊長類細胞であり;又はヒト細胞である。好適具体例において、この細胞
は、ニューロン細胞例えばGH3細胞、PC12細胞又は一次視床下部培養細胞
である。
好適具体例において、治療は、薬剤の投与であり;薬剤は、サケのMCHに対
する抗体以外であり;薬剤は、ウサギ抗体であり;薬剤は、ウサギポリクローナ
ル抗体以外であり、例えばウサギポリクローナル抗魚MCH抗体であり;薬剤は
、完全長抗体以外であり、それは抗体断片例えばMCHに結合できる断片であり
;MCHポリペプチドは、粗脳調製物又は脳切片以外の形態であり;MCHは、
天然に共存する少なくとも1つの蛋白質を実質的に含まない。他の好適具体例に
おいて:薬剤は、モノクローナル抗体であり;薬剤は、組換え又はヒト化抗体で
ある。
他の面において、この発明は、治療例えば望ましくない摂食行動により特徴付
けられる病気又は過少若しくは過剰体重の状態を処置する治療を評価する方法を
特徴とする。この方法は、MCHトランスジーンを含む試験細胞又は生物を用い
る。この方法は:治療を試験細胞又は生物例えば培養細胞又は哺乳動物に施与す
ること及びその治療のMCH代謝の面に対する効果を評価することを含む。MC
H代謝の面に対する効果は、治療の効果を示す。好適具体例において:MCH代
謝の面に対する効果は、摂食行動又は体重の変化、MCHmRNAレベルの変化
、MCH蛋白質レベルの変化である。試験細胞又は生物は、この試験細胞又は生
物は、MCH以外の1つ以上の遺伝子座(例えば、ob又はobレセプター)に
おいて野生型であっても変異体であってもよい。患者は、褐色脂肪組織欠乏であ
ってもよい。例えば、褐色脂肪組織「ノックアウト」マウスを、ジフテリア毒素
を褐色脂肪特異的プロモーターに融合させることにより作成することができる。
好適具体例において細胞は:魚細胞であり;爬虫類細胞であり;両生類細胞で
あり;哺乳類細胞であり;ゲッ歯類細胞例えばマウス若しくはラット細胞であり
;霊長類細胞であり;又はヒト細胞である。好適具体例において、細胞は、ニュ
ーロン細胞例えばGH3細胞、PC12細胞又は一次視床下部培養細胞である。
好適具体例において、治療は、薬剤の投与であり;薬剤は、サケのMCHに
対する抗体以外であり;薬剤は、ウサギ抗体以外であり;薬剤は、ウサギポリク
ローナル抗体以外であり、例えばウサギポリクローナル抗魚MCH抗体以外であ
り;薬剤は、完全長抗体以外であり、例えばそれは抗体断片例えばMCHに結合
できる断片であり;MCHポリペプチドは、粗脳調製物又は脳切片以外の形態で
あり;MCHは、天然に共存する少なくとも1つの蛋白質を実質的に含まない。
他の好適具体例において:薬剤は、モノクローナル抗体であり;薬剤は、組換え
又はヒト化抗体である。
他の面において、この発明は、治療例えば望ましくない摂食行動により特徴付
けられる病気又は過少若しくは過剰体重の状態を処置する治療の効果を評価する
方法を特徴とする。この方法は、野生型MCH遺伝子を発現する試験細胞又は生
物を用いる。この方法は:試験細胞又は生物例えば培養細胞又は哺乳動物に治療
を施与すること及び、その治療のMCH代謝の面に対する効果を評価することを
含む。MCH代謝の面に対する効果は、治療の効果を示す。好適具体例において
:MCH代謝の面に対する効果は、摂食行動の変化、MCHmRNAレベルの変
化、MCH蛋白質レベルの変化である。この試験細胞又は生物は、MCH以外の
1つ以上の遺伝子座(例えば、ob又はobレセプター)において野生型であっ
ても変異体であってもよい。この患者は、褐色脂肪組織欠乏であってもよい。例
えば、ジフテリア毒素を褐色脂肪特異的プロモーターに融合させることにより「
ノックアウト」マウスを作成することができる。
好適具体例においてこの細胞は、魚細胞であり;爬虫類細胞であり;両生類細
胞であり;哺乳類細胞であり;ゲッ歯類細胞例えばマウス若しくはラット細胞で
あり;霊長類細胞であり;又はヒト細胞である。好適具体例において、この細胞
は、GH3細胞、PC12細胞又は一次視床下部細胞である。
好適具体例において、治療は、薬剤の投与であり;薬剤は、サケのMCHに対
する抗体以外であり;薬剤は、ウサギ抗体以外であり;薬剤は、ウサギポリクロ
ーナル抗体以外であり、例えばウサギポリクローナル抗魚MCH抗体以外であり
;薬剤は、完全長抗体以外であり、例えばそれは抗体断片例えばMCHに結合で
きる断片であり;MCHポリペプチドは、粗脳調製物又は脳切片以外の形態であ
り;MCHは、天然に共存する少なくとも1つの蛋白質を実質的に含まない
。他の好適具体例において:薬剤は、モノクローナル抗体であり;薬剤は、組換
え又はヒト化抗体である。
他の面において、この発明は、患者の哺乳動物例えば霊長類例えばヒトがMC
H関連疾患、体重に関係する病気又は摂食若しくは食欲の障害の危険にあるかど
うかを測定する方法を提供する。好適具体例において、この方法を用いて、患者
が遺伝的に決められる病気の危険にあるかどうかを評価する。摂食障害には、例
えば望ましくない摂食行動により特徴付けられる病気が含まれる。この方法は、
患者の組織において、MCH遺伝子の変異の存否を検出することを含む。好適具
体例において:この変異の検出は:MCH遺伝子からの1つ以上のヌクレオチド
の欠失;この遺伝子への1つ以上のヌクレオチドの挿入、この遺伝子の1つ以上
のヌクレオチドの点突然変異例えば置換、この遺伝子の大きい染色体再配置例え
ば転座、逆位又は欠失の少なくとも1つの存在を確認することを含む。
例えば、この遺伝的障害の検出は:(i)MCH遺伝子又は天然のその変異体
からのセンス若しくはアンチセンス配列に又はMCH遺伝子と天然において結合
している5’若しくは3’フランキング配列にハイブリダイズするヌクレオチド
配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ/プライマーを用意するこ
と;(ii)このプローブ/プライマーを組織の核酸にさらすこと;及び(iii)
このプローブ/プライマーの核酸へのハイブリダイゼーションにより、遺伝的障
害の存否を検出することを含む。
ここに記載の診断法において、循環白血球を、ゲノムDNAの源として用いる
ことができる。従来技術の方法例えば一本鎖コンホメーション多型(SSCP)
法を用いて、障害又は多型を検出することができる。ここで用いる診断方法を用
いて、過剰体重の患者例えば肥満又は病的に肥満の患者を、MCH遺伝子障害又
は多型についてスクリーニングすることができる。
好適具体例において、この方法は、更に、患者が過剰体重、肥満又は病的に肥
満であるかどうかを測定することを含む。好適具体例において、患者は、過剰体
重、肥満又は病的に肥満である。
他の面において、この発明は、患者の哺乳動物例えば霊長類例えばヒトが
MCH関連疾患、体重に関係する病気又は摂食障害の危険にあるかどうかを測定
する方法を提供する。好適具体例において、この方法を用いて、患者が遺伝的に
決められる病気の危険にあるかどうかを評価する。この方法は、患者の組織にお
いて、MCHRNA又は蛋白質の非野生型レベルを検出することを含む。好適具
体例において、この方法は、更に、患者が過剰体重、肥満又は病的に肥満である
かどうかを測定することを含む。好適具体例において、患者は、過剰体重、肥満
又は病的に肥満である。
他の面において、この発明は、患者の哺乳動物例えば霊長類例えばヒトがMC
H関連疾患、体重に関係する病気又は摂食障害の危険にあるかどうかを測定する
方法を提供する。好適具体例において、この方法を用いて、患者が遺伝的に決め
られる病気の危険にあるかどうかを評価する。この方法は、患者の組織において
、MCHペプチドをコードする遺伝子の誤発現を検出することを含む。好適具体
例において:この誤発現の検出は:この遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の
レベルの変化;この遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型スプライシ
ングパターンの存在;又はこの蛋白質の非野生型レベルの少なくとも1つの存在
を確認することを含む。好適具体例において、この方法は、更に、患者が過剰体
重、肥満又は病的に肥満であるかどうかを測定することを含む。好適具体例にお
いて、患者は、過剰体重、肥満又は病的に肥満である。
他の面において、この発明は、MCHポリペプチド例えば、非野生型活性を有
するMCHポリペプチド例えば天然のMCHのアンタゴニスト、アゴニスト又は
スーパーアゴニストを作成する方法を特徴とする。この方法は:MCHペプチド
好ましくは哺乳動物例えばヒト若しくはラットのペプチド又は魚、両生類若しく
は爬虫類のペプチド以外のペプチドの配列又は環構造を変えること、及び改変し
たペプチドを、例えばそれを動物に投与してMCHRNA若しくは蛋白質レベル
、摂食行動又は体重に対するその効果を測定することにより所望の活性について
試験することを含む。
他の面において、この発明は、MCHトランスジーンを含み又はMCH遺伝子
を誤発現する細胞又は細胞の精製調製物を特徴とする。この細胞調製物は、ヒト
又は非ヒト細胞例えばゲッ歯類細胞例えばマウス若しくはラット細胞、ウサギ細
胞、又はブタ細胞からなるものであってよい。好適具体例において、これらの細
胞は、MCHトランスジーン例えばMCH遺伝子の異質形態例えばヒト由来の遺
伝子を含む(非ヒト細胞の場合)。他の好適具体例において、これらの細胞は、
MCH遺伝子を誤発現する遺伝子例えば内因性MCH遺伝子を含む。好適具体例
において、MCHは、過剰発現又は過少発現される。かかる細胞は、変異した若
しくは誤発現されるMCH対立遺伝子に関係する病気を研究するための又は薬物
スクリーニングにおいて用いるためのモデルとして働くことができる。
他の面において、この発明は、トランスジェニックMCH非ヒト動物例えばゲ
ッ歯類例えばマウス若しくはラット、ウサギ、又はブタを特徴とする。好適具体
例において、トランスジェニック動物は、異質形態のMCH遺伝子例えばヒト由
来の遺伝子を含む(そして、好ましくは、発現する)。他の好適具体例において
、この動物は、MCH遺伝子例えば、誤発現される内因性MCH遺伝子例えばノ
ックアウト又は過剰発現されるMCH遺伝子を有する。かかるトランスジェニッ
ク動物は、変異した若しくは誤発現されるMCH対立遺伝子に関係した病気を研
究するための又は薬物スクリーニングにおいて用いるためのモデルとして働くこ
とができる。
例えば、この発明は、MCH遺伝子の発現又は誤発現の、摂食行動に関係する
パラメーターに対する効果を評価する方法を含む。この方法は:MCHトランス
ジーンを有するトランスジェニック動物を用意し;その動物を薬剤例えばMCH
のアナログに接触させ;そして、パラメーターに対するトランスジーンの効果を
(例えば、トランスジェニック動物についてのパラメーターを対照例えば野生型
動物についての値と比較することにより)評価することを含む。
本発明の実施は、別途示さない限り、当業者の技能の範囲内にある細胞生物学
、細胞培養法、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物額、組換えDN
A及び免疫学の慣用の技術を用いる。かかる技術は、文献に記載されている。例
えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版、Sambrook,
Fritsch 及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989);DNA C
loning, 第I 及びII巻(D.N.Glover 編、1985); Oligonucleotide Synthesis(M
.J.Gait 編、1984);Mullis等、米国特許第4,683,195号;Nucleic Acid
Hybridization(B.D.Hames及びS.J.Higgins 編、1984);Transcription And Tran
slation(B.D.Hames 及びS.J.Higgins 編、1984); Culture Of Animal Cells(R.I.
Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press
,1986);B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);学術論文
Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,ニューヨーク); Gene Transfer Vector
s For Mammalian Cells(J.H.Miller 及びM.P.Calos 編、1987,Cold Spring Harb
or Laboratory); Methods In Enzymology,第154及び155巻(Wu 等編)、Immunoche
mical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及びWalker編、Academic P
ress,London,1987); Handbook of Experimental Immunolo-gy,第I-IV巻(D.M.We
ir 及びC.C.Blackwell 編、1986); Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,ニューヨーク、1986)を参照された
い。
この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らか
となろう。
発明の詳細な説明
図面を簡単に説明する。
図面:
図1は、次の遺伝子型の給餌されたマウスと絶食したマウス(24時間の絶食
の後)におけるMCHレベルを描いた棒グラフである:C57/BL/6J(野
生型)、ob/+、及びob/ob。
図2は、5μgのMCHを脳室内注射されたラットにおいて1時間以内に消費
されるKca1の倍増を描いたグラフである。定義
MCHアンタゴニストは、ここで用いる場合、摂食行動の阻害を生じる薬剤を
いう。アンタゴニストには、MCHに対して有意のアミノ酸相同性を有する薬剤
並びにアミノ酸配列相同性に関しては無関係であり又はポリペプチドでない薬剤
が含まれる。アンタゴニストには、MCHレセプターに競争的に又は非競争的に
結合することにより作用する薬剤が含まれるが、レセプターより下流(例えば、
細胞内シグナリング)で作用する薬剤又はMCHレセプターと無関係の薬剤も又
含まれ得る。アンタゴニストには、「作用」アンタゴニスト例えば部分的に又は
完全に異なる経路によって作用して摂食行動に影響を及ぼす薬剤が含まれる。
誤発現は、ここで用いる場合は、非野生型パターンの遺伝子発現をいう。それ
には:非野生型レベルでの発現即ち過剰又は過少発現;遺伝子が発現される時間
又はステージに関して野生型と異なる発現パターン、例えば予め決められた発生
の期間又はステージにおける(野生型と比較して)増大した又は減少した発現;
予め決められた細胞型又は組織型における減少した発現(野生型と比較して)に
関して野生型と異なる発現パターン;スプライシングサイズ、アミノ酸配列、転
写後修飾又は発現されるポリペプチドの生物学的活性に関して野生型と異なる発
現パターン;遺伝子発現に対する環境刺激又は細胞外刺激の効果に関して野生型
と異なる発現パターン例えば刺激の強さの増大又は減少時における(野生型と比
較して)増大した又は減少した発現パターンが含まれる。
実質的に純粋な核酸例えば実質的に純粋なDNAは、次のものの一方又は両方
である核酸である:その核酸が由来した生物の天然のゲノム中で直接隣接するコ
ード配列(即ち、5’末端のもの及び3’末端のもの)の両者と直接隣接してな
いもの;又は、その核酸が由来した生物中にて共存する核酸配列を実質的に含ま
ないもの。この用語は、例えば、ベクター例えば自立的に複製するプラスミッド
若しくはウイルスに又は原核若しくは真核生物のゲノムDNA中に取り込まれた
、又は他のDNA配列と独立して分離した分子(例えば、PCR又は制限エンド
ヌクレアーゼ処理により生成されるcDNA又はゲノムDNA断片)として存在
する組換えDNAを含む。実質的に純粋なDNAは又、更なるMCH配列をコー
ドするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAをも含む。
ポリペプチドの精製調製物又は実質的に純粋な調製物は、ここで用いる場合、
天然に存在する他の蛋白質、脂質及び核酸から分離されたポリペプチドを意味す
る。好ましくは、このポリペプチドは又、それを精製するのに用いる物質例えば
抗体又はゲルマトリックス例えばポリアクリルアミドからも分離される。好まし
くは、このポリペプチドは、精製調製物の少なくとも10、20、50、70、
80又は95%乾重量%を構成する。好ましくは、この調製物は:蛋白質配列決
定を可能にするだけ十分なポリペプチド;このポリペプチドの少なくとも1、1
0又は100μg;このポリペプチドの少なくとも1、10又は100mgを含
む。MCHのペプチドアナログの調製
合成のMCH及びそのアナログを調製して、アゴニスト及びアンタゴニストを
同定することができ、MCHアゴニスト又はアンタゴニスト活性に対する構造的
必要物を決定することができる。MCHを幾つかの方法により、例えばアミノ若
しくはカルボキシ末端領域の何れか(若しくは両方)を短くすることにより、シ
スチン架橋環を短縮することにより、非環式アナログを形成することにより、又
はアミノ酸例えば環内の若しくは環外の残基を修飾し又は置換することにより改
変することができる。合成のMCH及びそのアナログを、ここに記載の1つ以上
のアッセイを用いてアッセイすることができる。
一般に、この合成計画は、Merrifield固相合成を用い、その後環化して、Lebl
等(1988)J.Med.Chem.31:949-954(参考として本明細書中に援用する)に記載の
ように精製する。簡単には、クロロメチル化樹脂を支持体として用いて、第1の
アミノ酸を自動化合成装置例えばDuPont2200に導入することができる
。無傷のペプチドを樹脂から開裂させてから洗浄する。洗浄物からの抽出後、ペ
プチドを凍結乾燥する。凍結乾燥した蛋白質を脱気した水に溶解させる。環化を
、フェリシアン化カリウム(K3Fe(CN)6)を滴下することにより達成する
。精製を、セファデックスG−25、カルボキシメチルセルロース上でのカラム
クロマトグラフィーにより及び逆相高性能クロマトグラフィー(HPLC)によ
り行なうことができる。
或は、切り詰められたMCHアナログを、天然の又は合成のMCHを酵素にさ
らすことにより調製することができる。天然のMCHを、アセトン抽出を用いて
下垂体から単離し、Kawauchi等(1988)Adv.in Pigment Cell Res.517-530(参考
として本明細書中に援用する)に記載のようにHPLCにて精製することができ
る。例えば、MCH1-14(カルボキシ末端を切り詰めたもの)を、カルボキシペ
プチダーゼYにさらすことによりMCHから生成することができる。
非環状アナログを、Cys5−Cys14架橋を擬等配電子(pseudoisosteric)
残基で置換することによって構築することができる。L−セリン(極性置換)又
はL−α−アミノブチレート(非極性置換)の何れかを用いることができる。こ
れらのペプチド(適宜、置換されている)を、上述のように及びMatsunaga 等Li
fe Sci.(1992)51:679-685(参考として本明細書中に援用する)に記載されたよ
うに固相合成により調製することができる。
環内のアミノ酸の修飾を、各残基に特異的な試薬を用いて行なうことができる
。修飾を、異なるアミノ酸を代用するか又は存在するアミノ酸を変化させること
によって達成することができる。例えば、11位のTyr残基を、MCHを10
%ニトロメタン−95%エタノールの溶液にさらすことによって−NO2基の追
加により修飾することができる。例えば、Kawauchi等(1988)Adv.in Pigment Cel
l Res.517-530(参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。MCHアゴニスト及びアンタゴニスト活性のアッセイ カエル/トカゲのメラニン細胞のアッセイ
化合物例えばMCH及び関連アナログ(例えば、MCHアゴニスト又はアンタ
ゴニスト)の活性を、カエル(R.pipiens)及びトカゲ(A.carolinensis)の皮
膚を用いるイン・ビトロアッセイにより測定することができる(例えば、Castru
cci 等(1989)Gen.Comp.Endocrinol.73:157-163及びHruby 等(1987)J.Med.Chem.3
0:2126-2130(参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。これらの
アッセイは、イン・ビトロでの皮膚の表面からの反射光の量に基づいている。こ
れらのアッセイにおいて、メラニン細胞中のメラニン顆粒(メラノソーム)は、
MCHに対する応答において、色素細胞の樹状プロセスへと外側へ移動する。こ
の遠心性の顆粒の移動は、皮膚の暗化を生じる。反射率の変化を、反射率計によ
り測定し、通常、最初の基礎(ゼロ時間)の値からの変化パーセントと
して表される。反射率の増加は、皮膚の明化を示し、他方、反射率の減少は、皮
膚の暗化を示す。インキュベーション培地からのMCHの除去(即ち、リンゲル
溶液ですすぐことによる除去)は、通常、元の基礎値まで戻る皮膚の明化へと導
くメラノソームの核周囲の凝集を生じる。
簡単には、カエル又はトカゲを断頭により犠牲にして脚及び腿の皮膚を取り、
生理的塩(リンゲル)溶液浴中で生存可能に維持する。次いで、皮膚を、PVC
環に張って、反射率計により基線の光の反射率を測定する。例えば、アンタゴニ
スト活性のアッセイのために、皮膚を、種々の濃度の潜在的アンタゴニスト中で
1時間にわたって予備インキュベートすることができる。この期間の後に、既知
の濃度のMCHを加えて、その活性を同じアッセイにて測定することができる。
従って、各潜在的MCHアゴニスト又はアンタゴニストについての投与量応答の
曲線が描かれ、MCHと比較しての相対的効能を計算することができる。魚のウロコのメラニン細胞のアッセイ
化合物例えばMCH及び関連アナログ(例えば、アゴニスト又はアンタゴニス
ト)の活性を、種々の魚のウロコに基づくメラニン細胞のアッセイにおいて評価
することもできる。このアッセイにおいて、魚のウロコを用いてMCH関連化合
物の作用を可視化する。種々の魚例えば一年魚テラピア(Oreochromis mossambi
cus)からのウロコを用いることができる。例えば、Hogben及びSlome(1931)Proc
.R.Soc.B108:10-53(参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。
簡単には、これらのウロコを、メラニンを分散させる溶液中でインキュベート
してウロコの暗化を引き起こす。未知のMCH活性の試料を加える。もしMCH
様活性があれば、メラニンが集中されて、ウロコの明化を引き起こす。或は、こ
れらのウロコをMCH及び推定上のアンタゴニストの組合せと共にインキュベー
トしてアンタゴニスト効能を評価することができる。これらのウロコを、顕微鏡
下で視覚的に評価する。例えば、Kawauchi等 Nature,305:321-323(1983)(参考
として本明細書中に援用する)を参照されたい。硬骨魚類の皮膚のメラニン細胞のバイオアッセイ
更に別の方法は、硬骨魚類Synbranchus marmoratusを利用してMCH、MCH
アナログ又は未知のMCH活性を含む試料のメラノソーム凝集活性を評価する。
このアッセイにおいて、「休止」(未刺激)状態の黒色素胞は、分散したメラノ
ソームにより特徴付けられ、即ち、皮膚は暗化している。それ故、このアッセイ
は、メラノソーム凝集剤例えばMCHの研究に特に適している。このアッセイは
、本質的に、Casstucci 等、Gen.Comp.Endocrin.,66:374-380(1987)(参考とし
て本明細書中に援用する)に開示されたようにして行なうことができる。
簡単には、魚の皮膚を約2.5×2.5cmの片に切り、2つの環(PVC又
は金属)の間に配置して、適当な緩衝溶液(好ましくは、タイロード又はリンゲ
ル)にて1時間平衡化させる。休止(未刺激)状態において、これらの皮膚は、
暗化される。MCHを浴に加え、これらの魚の皮膚と共に60分間インキュベー
トする。皮膚の色の変化を、反射率計により測定する。MCHは、皮膚の明化を
引き起こし、高い反射率値を生じるであろう。イン・ビボでのメラニン細胞のバイオアッセイ
アナログ又は試料のMCH様活性は又、無傷の生物においても評価することが
できる。ニジマスを黒い背景にさらすとそれらのウロコは、暗くなる。MCH、
そのアナログ又は未知のMCH活性の試料の暗化したマスへの腹腔内注射は、も
しMCH様活性があれば、ウロコの明化を生じるであろう。この効果は、もしM
CH様活性があるならば、迅速に始まり数時間にわたって続く。このアッセイは
、本質的に、Kawauchi等、Adv.in Pigment Cell Res.517-530(1988)(参考と
して本明細書中に援用する)に間示されたようにして行なうことができる。放射免疫アッセイ及び免疫組織化学:基質に結合するMCHのレベルを検出する 方法
個体又は組織試料中のMCHの濃度を、放射免疫アッセイによって測定するこ
とができる。未知のMCH濃度を含む試料を、既知濃度の標準と比較する。試料
が増大する量のMCHを含む場合は、放射性標識されたMCHと比べて一層多く
の未標識のMCH(抗MCH抗体に結合することができる)があり、一層少ない
放射性標識されたMCHが抗MCH抗体により結合される結果を生じる。これを
用いて、MCH又はそのアナログの基質への結合を、例えば他の化合物例えば推
定上のアンタゴニストの存在時又は不在時に測定することができる。一般に、患
者から試料を得て蛋白質試料を調製することができる。ウサギ抗MCHは、一次
抗体として働くことができ、放射標識されたMCHを加えた蛋白質試料とインキ
ュベートする。次いで、ヤギ抗ウサギを加えてMCH−ウサギ抗体複合体の沈殿
を助ける。インキュベーション期間後に、試料を遠心分離して生じたペレットを
計数する。試料中にMCHが多いほど、生じたペレット中に見出される放射能は
少ない。このアッセイは、本質的に、Zamir(前出)に間示されたようにして行
なうことができる。
MCHの位置測定は、蛍光免疫組織化学により達成することができる。例えば
、ラットの脳を20μMの厚さに切片化して、顕微鏡のスライド上に置くことが
できる。これらの切片をウサギ抗MCH抗体又は同等の抗体と共にインキュベー
トする。これらの切片を洗って過剰の抗体を除去する。蛍光標識したヤギ抗ウサ
ギ抗体とのインキュベーションは、MCH様物質の位置測定を可能にする。蛍光
を、蛍光顕微鏡で監視することができる。このアッセイは、本質的に、Zamir 等、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:1528-1531(1986)(参考として本明細書中に援用す
る)に開示されたようにして行なうことができる。シナプトソーム結合
天然のMCHレセプターと結合する化合物の能力例えば競争的にMCHと拮抗
するアナログの能力を、結合アッセイにおいて放射性標識したMCHを利用して
測定することができる。競争的アンタゴニストは、MCHがそのレセプターと相
互作用するのを阻害することができ、一層少ない放射能が結合するであろう。高
度にトリチウム化したMCHが合成されており、全細胞結合研究に利用すること
ができる。例えば、Drozdz及びEberle,J.Receptor & Signal Transduction Res.
15(1-4):487-502(1995)(参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。
MCHをヨウ素化する方法も又開発されている。Drozdz及びEberle,第23回欧州
ペプチドシンポジウム、ポルトガル、Braga(1994)(参考として本明細書中に援用
する)を参照されたい。
一般に、関心のある組織試料を、膜若しくはシナプトソームを調製する場合に
は、ホモジェナイズし、又は全細胞について酵素で消化する。全細胞、膜、又は
シナプトソームを、次いで、遠心分離によって単離することができる。例えば、
膜を、組織試料をホモジェナイズし、その結果生じた溶液を遠心分離することに
より調製することができる。その上清を集めて遠心分離する。ペレットを再懸濁
させ、小さいゲージの針を通過させる。この粗膜ペレットを適当な結合緩衝液に
再懸濁させる。膜を一定濃度の放射性標識したMCH及び変化する濃度の関心の
あるアナログにさらす。未結合の 3H−MCHを結合した 3H−MCHから繊維
ガラスフィルターでの迅速濾過により分離する。これらのフィルターを洗って、
計数する。例えば、Drozdz及びEberle,J.Receptor & Signal Transduction Res.
15(1-4):487-502(1995)(参考として本明細書中に援用する)を参照されたい。HEK−293アッセイ
ここで検討するように、MC3−Rを有するプラスミッドで安定にトランスフ
ェクトされた異質のヒト腎臓HEK−293細胞を用いて、MCH活性をアッセ
イすることができる。MC3−RレセプターとのMCHの相互作用が直接である
のか間接であるのかは明らかでないが、MCHの適用は、ACTHのMC3−R
レセプターへの結合の増加を生じる。スキャッチャード分析は、ACTH結合部
位の増加を示唆しており、それ故、MCHの効果は、レセプターにおける立体的
変化を誘導することであり得る。細胞を10−7M MCHに20分間又は一晩
さらすことは、ACTH結合における15〜100%の増加を生じる。イン・ビトロでのゲッ歯類の脳のアッセイ
ここで検討するように、ゲッ歯類例えばラットを用いて、MCH活性をイン・
ビボでアッセイすることができる。テフロンカテーテルをラットの第3脳室に挿
入してその部位に接着することができる。MCH又はそのアナログ(例えば、ア
ゴニスト又はアンタゴニスト)を種々の濃度でそのカテーテルにより導入して、
摂食行動に対するそれらの効果を測定することができる。ob/ob視床下部で優勢に発現される遺伝子のPCRディスプレーによる同定
PCRディスプレーを用いて、肥満ゲッ歯動物の視床下部における食欲の調節
に重要であり得るニューロペプチドの差異的発現を同定した。PCRディスプレ
ーは、比較的少量(100μg)のmRNAを用いて、差異的遺伝子発現のスク
リーニングを可能にする(Lian及びPardee,1992,Science 257:967-971)。
PCRディスプレーを、次のように行なった。7週齢の雄のC57b16J
ob/ob、ob/+ヘテロ接合体及び影響を受けてないC57b16Jマウス
をJackson Laboratories(メイン、Bar Harbor在)から得た。マウスを、輸送から回
復させるために、到着後少なくとも4日間屋内に収容した。給餌されたマウスを
、200mg/kgのアミタールナトリウムのIP注射で麻酔した後、朝に犠牲
にした。小さい実験では、食餌を、記載した時間間隔にて停止した。マウスを断
頭して脳を取り出し、視床下部を同定して切り出し、直ちにRNAzol(テキサス、
Houston在、Cinna/Biotex Laboratories)中で抽出した。10個の視床下部(約
100mg)を集め、次いで、手持ち式ホモジェナイザーを用いてホモジェナイ
ズした。
全RNAのアリコートをDNAアーゼI(インディアナ、Indianapolis在、Boehring
er Mannheim)で処理して、如何なる痕跡的DNAをも除去した。
RNAを9つのプールに分けて、MMTV逆転写酵素(Superscript RNAアー
ゼH、メリーランド、Gaithersburg 在、Gibco BRL)及び9つのアンカードプライマー
内の1つ(下記参照)を用いてcDNAを合成した。こうして生成したcDNA
を、PCRディスプレーにおいて用いた。
配列T12XY(ここに、X及びYは任意のヌクレオチドである)を有してアン
カードプライマーと呼ばれる12の可能な下流のプライマーを、約50の上流ラ
ンダムプライマー(PCRディスプレー用にデザインした勝手なプライマー)と
共に用いた。これらの勝手な上流のプライマーは、50%より多くのGCを含ま
ず且つ互いに内部相同性を有しなかった。これらの600プライマー対を用いて
、約30,000のmRNAの発現を評価することができた(各プライマー対
は、約50のcDNAバンドを生成した)。本研究において、9つのアンカード
プライマー内の1つの及び20の勝手なプライマーよりなる180のプライマー
対を用いて、肥満動物と非肥満動物の視床下部におけるmRNA発現をスクリー
ニングした。逆転写酵素反応から生成したcDNAを、AmplitaqDNA
ポリメラーゼ(コネチカット、Norwalk在、Perkin Elmer)を用いて増幅した。反応を35
S−ATP(マサチューセッツ、Boston 在、MEN)の存在下で行ない、生成物を配列決定用
ゲル上で分離した。乾燥したゲルをKodak X−OMAT ARフィルム(ニューヨーク、
Rochester在、Eastman Kodak)に24〜48時間露出させた。現像後、
ob/ob及びob/+視床下部からのDNA断片を比較した。ob/ob発現された遺伝子の分析
52のDNAバンドが、PCRディスプレー反応で差異的に発現されたようで
あった。これらの52のバンドの内の35をリボプローブを用いるノーザンブロ
ット分析を用いて評価した。これらの内で、9つのバンドについてはシグナルが
検出され得ず、20のバンドにおいては発現に差異が認められなかった。従って
、スクリーニングした約9,000のcDNAの内で、発現における差異は、6
つのバンドについてのみ確認された(又は、約0.7%)。これらの内で、2つ
が、Gene Bankにおいてマッチした:1つはメラニン集中ホルモン(M
CH)であり、他はマウスのオンコジーンfauであった。第3のバンドは、D
NA結合因子に対する相同性を有し、更なる3つの差異的に発現されたバンドは
、既知の相同性を有しなかった。差異的ディスプレーにおけるMCH発現の変化
は絶対的であるようであった(即ち、ob/+マウスではシグナルが検出されな
かったが、ob/obマウスでは明白なシグナルが検出された)が、リボヌクレ
アーゼ防護アッセイを用いるMCH発現の評価は、給餌されたob/ob及びo
b/+マウス間の差異が、ob/ob動物においてむしろ控え目の50〜80%
増加であることを示した。
差異的に発現されたバンドを次のようにして同定した。ob/ob又はob/
+の視床下部にユニークなバンドを乾燥ゲルから切り出し、100μLの煮沸T
E緩衝液により抽出して筋肉グリコーゲン(インディアナ、Indianapolis 在、
Boehringer Mannheim)の存在下でエタノールで沈殿させた。DNAを、更に、
この特定のバンドを生成させるのに用いた元々のプライマーのセットを用いて、
同じサーマルサイクリング条件下で増幅した。反応生成物を、1%アガロースゲ
ル上でランして、エチジウムブロミドで染色した。バンドをゲルから切り出し、
溶出してpCRプラスミッド(カリフォルニア、San Diego在、InVitrogen)中にライゲ
ートした。
pCRベクターに挿入したバンドを、配列と向きの両方を決定するために、ジ
デオキシ配列決定法を用いて配列決定した。向きに依存して、T4又はT7プロ
モーターを利用してリボプローブを生成した。リボプローブを用いて、ob/o
b又はob/+視床下部からのRNA(レーン当り20μg含有)のノーザンブ
ロットを検査した。ノーザンブロットをKodak X−OMATフィルムに露
出し又は Molecular Dynamics PhosphoImager を用いて分析した。MCHの発現
痩せたマウス及び肥満のマウスにおけるMCHの発現における差異を更に評価
し並びに差異が栄養状態の影響を受け易いという可能性を評価するために、対照
用のC57B16Jマウス、C57B16Job/+ヘテロ接合体及びC57B
16Job/ob動物を、給餌状態及び24時間の絶食後の両方において比較し
た。図1は、MCHをプローブとして、給餌されたマウス及び絶食したマウスに
おける視床下部mRNAブロットから得られた定量的データを示している。MC
H発現は、ob遺伝子を有しない痩せたマウスと比較した場合に、給餌されたo
b/obマウスにおいて233%増大している。痩せたヘテロ接合体は、これら
の2マウスの中間であり、MCHmRNAは、対照のレベルより156%増加し
ている。24時間の絶食は、3グループのマウスのすべてにおいてMCH発現を
増加させた。対照用マウスにおける発現は、絶食した動物に比べて233%まで
増加した。対照用、ob/+及びob/obマウスにおけるMCHmRNAレベ
ルの相対比は、同じままであったが、MCHmRNAの総量は、各グループにつ
いて倍増した。
NPYmRNAのレベルを、「対照」ニューロペプチドとして測定した。給餌
状態では、NPY発現は、対照用ホモ接合体又はob/+マウスと比較して、o
b/obマウスにおいて僅かに高かった(161%)。NPYmRNAのレベル
は、絶食と共に上昇し、NPY発現(絶食した対照は、給餌されたマウスの17
2%)は、絶食したob/obマウスにおいて、給餌されたob/obと比較し
て2倍高かった。
MCH発現の経時的変化も又、絶食したC57B16Jの痩せた動物において
評価した。MCH発現の上昇は、絶食の開始から6時間後に検出され、24時間
増加した。
他の研究者が視床下部以外での発現を報告しているので、30μgのRNAを
ロードしてリボプローブで検査したノーザンブロットを用いて、MCH発現につ
いて器官のパネルをスクリーニングした。視床下部以外では、MCHシグナルは
、検出し得なかった。MCHのイン・ビボ投与
MCHの食欲調節物質としての重要性を更に評価するために、テフロンカテー
テルを、ラットの第3脳室に挿入してその部位に接着し、その後、5μlのリン
酸緩衝塩溶液中の5μgのMCHの脳室内注射を行なった。対照用動物には、リ
ン酸緩衝塩溶液のみを与えた。MCHの投与は、1時間以内の消費Kcalの倍
増を超えて摂食行動を増大させた(図2)。MCH活性に対する構造的必要物
メラニン細胞アッセイ系におけるMCH様活性に対する構造的必要物の決定に
対して、サケのMCHペプチドアナログを用いて、かなりの量の仕事が為されて
きた。この仕事から導かれたアナログを、この発明の方法例えばイン・ビボラッ
トアッセイ若しくはイン・ビトロHEK−293レセプター結合アッセイを用い
て、MCH様活性について試験することができ、又は新規なMCHアナログ例え
ばヒトMCHアナログを、構造的必要物についての従来の技術知識に基づいて合
成し、ここに記載のイン・ビボ若しくはイン・ビトロアッセイの1つにおいて
活性について試験することができる。
多くの研究者が、サケのMCHのN末端及びC末端断片アナログを合成し、そ
れらをここに記載の硬骨魚類皮膚バイオアッセイ並びにカエル及びトカゲバイオ
アッセイにてMCH活性について試験した(例えば、Matsunaga 等(1989)Peptid
es 10:349-354; Hardley等(1987)Life Sci.40:1139-1145(参考として本明細書
中に援用する)を参照されたい)。これらの研究は、天然のMCHに等しい効力
の応答を誘出するのに必要な最小配列がMCH(5−15)(このペプチドのN
末端の1〜4残基及びC末端の16〜17残基を欠く構造)であるということを
結論した。Trp15の除去(断片MCH(5−14)の生成)は、天然のMCH
より100〜300倍低活性のアナログを生じ、これは、15位のTrpが完全
な(等しい効力の)MCHアゴニスト活性の維持に重要であること、及びTrp
残基のインドール環がMCHのそのレセプターポケットへの適合を助け、そうし
て結合を容易にするのに重要であり得ることを示している。N末端が欠失した断
片アナログ例えば1〜4残基を欠いたものが天然のMCHと等しい効力であるの
で、それらは、MCH活性に必要ではないようである。同じことが、このペプチ
ドのC末端の16〜17残基について結論された。
更に、他の研究者は、短縮した環構造を有するMCHアナログを合成し、それ
らを硬骨魚類皮膚バイオアッセイにおいて活性について試験した(例えば、Lebl
等(1988)J.Med.Chem.31:949-954; Lebl等(1989)Life Sci.44:451-457; Matsunag
a 等(1989)Peptides 10:349-354(参考として本明細書中に援用する)を参照さ
れたい)。次の環短縮アナログ(ジスルフィド結合を保持したもの)を合成した
:[Ala5、Cys10]MCH、[Ala5、Cys8]MCH、[Ala5、C
ys7]MCH、[Ala5、Cys10]MCH5-17、[Ala5、Cys8]MC
H5-17、[Ala5、Cys7]MCH5-17、[Cys10]MCH10-17、[Cy
s8]MCH8-17、及び[Cys7]MCH5-17。これらのアナログを用いる研究
は、環短縮がMCH様活性を除去し又は大いに減じたので、5位と14位の間の
ジスルフィド結合がMCH様活性に必須であることを結論した。10個の環残基
の構造、MCH(5−14)が最適の活性化に非常に重要であるらしい。驚いた
ことには、2つのアナログ
[Ala5、Cys8]MCH5-17及び[Cys10]MCH10-17は、完全なアゴ
ニストであるが非常に減少した効能を有することが見出され、これは、MCH様
活性を有する最短配列が残基10〜14(Val−Tyr−Arg−Pro−C
ys)(SEQ ID N0:1)から構成され得ること及び11〜14位の残基(Tyr
−Arg−Pro−Cys)(SEQ ID NO:2)が多分メッセージ変換に重要であ
ることを示している。
更に、環状アナログが合成され、MCH活性について硬骨魚類皮膚バイオアッ
セイにて試験された(例えば、Kawauchi及びKawazoe(1988)Advances in Pigment
Cell Res.517-527; Matsunaga 等(1992)Life Sci.51:679-685(参考として本明
細書中に援用する)を参照されたい)。これらのアナログは、それらが天然のM
CHと5位及び14位の側鎖基の極性においてのみ異なるように構築された。1
つのアナログでは、5位及び14位で極性のL−セリン(L−Ser5.14MCH
)をシステインの代用としたが、他のアナログでは、同じ位置において非極性L
α−アミノブチレート(Abu5.14MCH)を代用とした。他の非環状アナログ
を、ジスルフィド結合の還元とその後の5位及び14位のCys残基のカルボキ
シメチル化(CAM−Cys5.14MCH)により構築した。これらのアナログの
すべては、MCH様活性を示さず、これは、ジスルフィド架橋が、レセプター結
合及び膜貫通のシグナル変換のためのMCHの正しいコンホメーション及び形態
的特徴を維持するのに必要であることを示唆している。
修飾された残基を有するMCH誘導体も又合成され、魚ウロコ系にて活性につ
いて試験された(例えば、Kawauchi及びKawazoe(1988)Advances in Pigment Cel
l Res.517-527(参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。次の誘
導体を合成して、活性について試験した:NPS−Trp15MCH、DHCH−
Arg4.9.12MCH、NO2−Tyr11MCH及びS−O−Met3.6MCH。環
構造の外のアミノ酸残基の修飾は、MCH活性に影響を有しなかったが、環構造
内の残基の修飾例えばDHCH−Arg4.9.12MCH、NO2−Tyr11MCH
及びS−O−Met3.6MCHは、大いに減少したMCH活性を有するアナログ
を生じた。これらの結果は、MCH活性がこのペプチドの環状セグメント(MC
H5−14)から誘出されるという示唆を支持する
ものである。
メラニン細胞に基づくアッセイは、下記の構造のペプチドがMCH活性のアゴ
ニストとして有用であることを予言する:
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9-RI0-R11-R12-R13-R14-R15-R16-R17-R18-R19(SEQ
ID NO:3)
式中:
R1は、Asp、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意
のDアミノ酸であり、又は削除され;
R2は、Phe、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意
のDアミノ酸であり、又は削除され;
R3は、Asp、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意
のDアミノ酸であり、又は削除され;
R4は、Met若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換
、Thr若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意の
Dアミノ酸であり、又は削除され;
R5は、Leu若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換
、Met若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意の
Dアミノ酸であり、又は削除され;
R6は、Arg、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意
のDアミノ酸であり、削除され、又はCysであり;
R7は、Cys又は任意のアミノ酸であり;
R8は、Met、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、又は
Cysであり;
R9は、Leu若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換
、又はVal若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換であ
り;
R10は、Gly又は本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換で
あり;
R11は、Arg又は本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換で
あり;
R12は、Val又は本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換で
あり;
R13は、Tyr又は本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換で
あり;
R14は、Arg又は本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換で
あり;
R15は、Pro、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、又
はCysであり;
R16は、Cys又は任意のアミノ酸であり;
R17は、Trp、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、T
rpのアナログ例えばNPS−Trp、芳香族側鎖基を有するアミノ酸、又はC
ysであり;
R18は、Gln若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置
換、Glu若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、Tr
p若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、Trpのアナ
ログ例えばNPS−Trp、芳香族側鎖基を有するアミノ酸であり、又は削除さ
れ;
R19は、Val、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換であ
り、又は削除され;
但し、R6がCysであるならば、R15はCysであり、これら2つの間にジスル
フィド架橋が形成され且つ、R7、R8、R16及びR17はCysではなく;R7がCys
であるならば、R16はCysであり、これら2つの間にジスルフィド架橋が形成
され且つR6、R8、R15及びR17はCysではなく;R8がCysであるならば、R17
はCysであり、これら2つの間にジスルフィド架橋が形成され且つR6、R7、R1 5
及びR16はCysではなく、そしてR18は、Trp若しくは本明細書中に与えた
表からの保存されたアミノ酸置換、Trpのアナログ例えばNPS−Trp、又
は芳香族側鎖基を有するアミノ酸である。
好適具体例において:R12はVal、R13はTyr、R14はArg、R15はPro
、R16はCys、そしてR17はTrpであり;アゴニストは、残基R7とR16の間に
ジスルフィド架橋を有し;ジスルフィド環は、10個のアミノ酸を含み;アゴニ
ストは、残基R1〜R6の何れか又はすべてを削除され;アゴニストは、残基R18及
びR19の一方又は両方を削除され;アゴニストは、ヒト、ラット又はサケのMC
Hと少なくとも70、80又は90%相同性を有し;アゴニストは、1、2、3
、4、5個以上の残基を、修飾され又は本明細書中に与えた表からの保存された
アミノ酸で置換された環内に有する。
好適具体例において、アゴニストは:MCH(2−19)、MCH(3−19
)、MCH(4−19)、MCH(5−19)、MCH(6−19)、MCH(
7−19)、MCH(1−18)、MCH(2−18)、MCH(3−18)、
MCH(4−18)、MCH(5−18)、MCH(6−18)、MCH(7−
18)、MCH(1−17)、MCH(2−17)、MCH(3−17)、MC
H(4−17)、MCH(5−17)、MCH(6−17)、MCH(7−17
)及びNPS−Trp17MCHである。
メラニン細胞に基づくアッセイは、下記の構造のペプチドがMCH活性のアン
タゴニストとして有用であることを予言する:
R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-R9-R10-R11-R12-R13-R14-R15-R16-R17-R18-R19
式中:
R1は、Asp、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意
のDアミノ酸であり、又は削除され;
R2は、Phe、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意
のDアミノ酸であり、又は削除され;
R3は、Asp、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意
のDアミノ酸であり、又は削除され;
R4は、Met若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換
、Thr若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意の
Dアミノ酸であり、又は削除され;
R5は、Leu若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換
、Met若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意の
Dアミノ酸であり、又は削除され;
R6は、Arg、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、任意
のDアミノ酸であり、削除され、又はCysであり;
R7は、Cys又は任意のアミノ酸であり;
R8は、Met、本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、又は
Cysであり;
R9は、Leu若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換
、又はVal若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換であ
り;
R10は、Gly又は本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換で
あり;
R11は、Arg又は本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換で
あり;
R12は、Val以外の任意のアミノ酸であり、又は保存されたアミノ酸置換
以外であり;
R13は、Tyr以外の任意のアミノ酸であり、又は保存されたアミノ酸置換
以外であり;
R14は、Arg以外の任意のアミノ酸であり、又は保存されたアミノ酸置換
以外であり;
R15は、Pro以外の任意のアミノ酸であり、保存されたアミノ酸置換以外
であり、又はCysであり;
R15は、Cys又は任意のアミノ酸であり;
R17は、Trp若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置
換、Trpのアナログ例えばNPS−Trp、芳香族側鎖基を有するアミノ酸、
Trp以外の任意のアミノ酸、保存されたアミノ酸置換以外、芳香族側鎖基を欠
くアミノ酸であり、欠失され、又はCysであり;
R18は、Gln若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置
換、Glu若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、Tr
p若しくは本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換、Trpのアナ
ログ例えばNPS−Trp、芳香族側鎖基を有するアミノ酸、Trp以外の任意
のアミノ酸、保存されたアミノ酸置換以外、芳香族側鎖基を欠くアミノ酸であり
、又は削除され;
R19は、Val本明細書中に与えた表からの保存されたアミノ酸置換であり
、又は削除され;
但し、R6がCysであるならば、R15はCysであり、これら2つの間にジスル
フィド架橋が形成され且つ、R7、R8、R16及びR17はCysではなく;R7がCys
であるならば、R15はCysであり、これら2つの間にジスルフィド架橋が形成
され且つR6、R8、R15及びR17はCysではなく;R8がCysであるならば、R17
はCysであり、これら2つの間にジスルフィド架橋が形成され且つR6、R7、R1 5
及びR16はCysではなく、そしてR18は、Trp若しくは本明細書中に与えた
表からの保存されたアミノ酸置換、Trpのアナログ例えばNPS−Trp、芳
香族側鎖基を有するアミノ酸、Trp以外の任意のアミノ酸、保存されたアミノ
酸置換以外、芳香族側鎖基を欠くアミノ酸であり、又は削除される。
好適具体例において:
R12は、Val以外の任意のアミノ酸であり、又は保存されたアミノ酸置換以外
であり;
R13は、Tyr以外の任意のアミノ酸であり、又は保存されたアミノ酸置換以外
であり;
R14は、Arg以外の任意のアミノ酸であり、又は保存されたアミノ酸置換以外
であり;
R15は、Pro以外の任意のアミノ酸であり、又は保存されたアミノ酸置換以外
であり;
R16は、Cysであり;
R17は、Trp以外の任意のアミノ酸であり、又は保存されたアミノ酸置換以外
であり、芳香族側鎖基を欠くアミノ酸であり、又は削除される。
好適具体例において:アンタゴニストは、残基R7とR16の間にジスルフィド架
橋を有し;ジスルフィド環は、10個のアミノ酸を含み;アンタゴニストは、残
基R1〜R6の何れか又はすべてを削除され;アンタゴニストは、残基R18及びR19の
一方又は両方を削除され;アンタゴニストは、ヒト、ラット又はサケのMCHと
少なくとも70、80又は90%相同性を有し;アゴニストは、1、2、3、4
、5個以上の残基を、修飾され又は保存されてないアミノ酸で置換された環内に
有する。
好適具体例において、アンタゴニストは:MCH(1−16)、MCH(2−
16)、MCH(3−16)、MCH(4−16)、MCH(5−16)、MC
H(6−16)、MCH(7−16)、DHCH−Arg6.11.14MCH、及び
NO2−Tyr13MCHである。トランスジェニック動物
この発明は、MHCトランスジーンを含み且つ好ましくは内因性若しくは外因
性のMCHを動物の1つ以上の細胞中で発現する(又は誤発現する)(その動物
の)細胞を含むトランスジェニック動物を含む。MCHトランスジーンは、その
蛋白質の野生型をコードすることができ、又はアゴニスト及びアンタゴニストの
両者を含むその相同物並びにアンチセンス構築物をコードすることができる。好
適具体例において、トランスジーンの発現は、所望のパターンで発現を制御する
シスに作用する配列を利用する特異的な細胞のサブセット又は組織例えば視床下
部に限られる。組織特異的な調節配列及び条件付き調節配列を用いて、ある空間
的パターンでトランスジーンの発現を制御することができる。発現の時間的パタ
ーンを、例えば、条件付き組換えシステム又は原核生物の転写調節配列により与
えることができる。
位置特異的遺伝子操作によりイン・ビボで調節されるトランスジーンの発現を
可能にする遺伝学的技術は、当業者に公知である。例えば、標的配列の遺伝的組
換えを触媒するレコンビナーゼの調節された発現を可能にする遺伝的システムを
利用することができる。ここで用いる場合、熟語「標的配列」は、レコンビナー
ゼにより遺伝的に組み換えられるヌクレオチド配列をいう。標的配列は、レコン
ビナーセ認識配列により隣接され、一般に、レコンビナーゼ活性を発現する細胞
において切り出され又は逆転している。レコンビナーゼに触媒される組換え事象
を、標的配列の組換えが主題のMCHポリペプチドの発現の活性化又は抑制の何
れかを生じるようにデザインすることができる。例えば、組換えMCH遺伝子の
発現を邪魔する標的配列(例えばアンタゴニスト性相同物をコードするもの)の
切り出しをデザインして、その遺伝子の発現を活性化することができる。この蛋
白質の発現の邪魔は、種々の機構(例えば、MCH遺伝子のプロモーター要素か
らの空間的分離又は内部停止コドン)により生じ得る。その上、このトランスジ
ーンは、遺伝子のコード配列がレコンビナーゼ認識配列と隣接し、プロモーター
要素に関して3’から5’方向で最初に細胞にトランスフェクトされるように作
成されるかもしれない。かかる場合には、標的配列の逆転が、コード配列の5’
末端をプロモーター要素に関してプロモーター駆動される転写活性化を与える向
きに配置することにより、主題の遺伝子に新しい向きを与えるであろう。
例えば、the cre/loxP recombinase system of bacteriophage P1(Lakso等(1
992)PNAS 89:6232-6236;Orban 等(1992)PNAS 89:6861-6865)又はthe FLP recom
binase system of Saccharomyces cerevisiae(O'Gorman等(1991)Science 251:1
351-1355;PCT公開WO92/15694の記載を参照されたい。
標的配列の遺伝的組換えは、Creレコンビナーゼの発現に依存する。レコン
ビナーゼの発現は、調節制御に対する主体であるプロモーター要素(例えば、組
織特異的、発生ステージ特異的、外部から加えられた因子により誘導され又は抑
制され得るもの)により調節され得る。この調節された制御は、レコンビナーゼ
発現がプロモーター要素により媒介される細胞においてのみ標的配列の遺伝的組
換えを生じる。従って、組換えMCHの活性化発現を、レコンビナーゼ発現の制
御によって調節することができる。
類似の条件付トランスジーンを、トランスジーンの発現を促進するために同時
に発現される原核生物蛋白質を必要とする原核生物プロモーター配列を用いて供
給することができる。典型的プロモーター及び対応するトランスに活性化する原
核生物蛋白質は、米国特許第4,833,080号に与えられている。その上、
条件付トランスジーンの発現を、遺伝子治療様の方法により誘導することが
でき、該方法においては、トランスに活性化する蛋白質例えばレコンビナーゼ又
は原核生物蛋白質をコードする遺伝子が組織に送達され、細胞型特異的な様式で
発現が引き起こされる。この方法により、MCHトランスジーンを成体において
、トランスアクチベーターの導入により「入り」になるまでサイレントのままに
しておくことができよう。遺伝子治療
この発明の遺伝子構築物を遺伝子治療プロトコールの一部として用いて、MC
Hペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト形態をコードする核酸を送達するこ
ともできる。この発明は、MCHペプチドの機能をそのペプチドが誤発現される
細胞において再構成するか或は該機能に拮抗させるための、イン・ビボトランス
フェクション用の及び特定の細胞型におけるMCHペプチドの発現のための発現
ベクターを特徴とする。MCHペプチドの発現構築物は、任意の生物学的に許容
し得るキャリアー例えばMCH遺伝子を効果的にイン・ビボ細胞に送達すること
のできる任意の配合物又は組成物にて投与することができる。アプローチは、主
題遺伝子の組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び単
純ヘルペスウイルス1型を含むウイルスベクター又は組換えの細菌性の若しくは
真核生物プラスミッド中への挿入を含む。ウイルスベクターを細胞に直接トラン
スフェクトし;プラスミッドDNAを、例えばカチオン性リポソーム(リポフェ
クチン)又は、誘導体化(例えば、抗体結合体化)したポリリジン結合体、グラ
ミシジンS、人工ウイルスエンベロープ又はその他のかかる細胞内キャリアーの
助けにより送達することができ、並びに、遺伝子構築物の直接注射又はCaPO4
沈殿をイン・ビボで行なうことができる。
核酸の細胞へのイン・ビボ導入のための好適アプローチは、MCHポリペプチ
ドをコードする核酸例えばcDNAを含むウイルスベクターを用いるものである
。細胞へのウイルスベクターの感染は、標的細胞の大きい割合が核酸を受けるこ
とができるという利点を有する。更に、ウイルスベクター内にコードされた分子
例えばウイルスベクターに含まれるcDNAにコードされた分子は、ウイルスベ
クター核酸を取り込んだ細胞において効率的に発現される。
レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターを、外因性遺伝子の
イン・ビボの特にヒトへのトランスファーのための組換え遺伝子送達システムと
して用いることができる。これらのベクターは、遺伝子の細胞への効率的送達を
与え、トランスファーされた核酸は、宿主の染色体DNA中に安定にインテグレ
ートされる。複製欠損レトロウイルスのみを産生する特殊化した細胞系統(「パ
ッケージング細胞」と呼ばれる)の開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルス
の有用性を増大させたし、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的のための遺伝
子トランスファーにおける利用について特性決定されている(総説として、Mill
er,A.D.(1990)Blood 76:271を参照されたい)。複製欠損レトロウイルスを、標
準技術により、ヘルパーウイルスの利用により標的細胞に感染させるのに用いる
ことのできるビリオン中にパッケージすることができる。組換えレトロウイルス
を生成し、かかるウイルスを細胞にイン・ビトロ又はイン・ビボで感染させるプ
ロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等(編
)Greene Publishing Associates,(1989),第9.10-9.14節及び他の標準的実験室
マニュアルに見出すことができる。適当なレトロウイルスの例には、pLJ、p
ZIP、pWE及びpEM(これらは、当業者に公知である)が含まれる。環境
栄養性及び両栄養性レトロウイルス系の両者を調製するための適当なパッケージ
ングウイルス系統の例には、ψCrip、ψCre、ψ2及びψAmが含まれる
。レトロウイルスは、上皮細胞を含む種々の遺伝子を、イン・ビトロ及び/又は
イン・ビボで、多くの異なる細胞型に導入するために用いられてきた(例えば、
Eglitis 等(1985)Science 230:1395-1398; Danos 及びMulligan(1988)Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 85:6460-6464; Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:30
14-3018; Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6141-6145; Huber等(
1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8039-8043; Ferry 等(1991)Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 88:8377-8381; Chowdhury 等(1991)Science 254:1802-1805; van Beusec
hem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640-7644;Kay 等(1992)Human Gene Th
erapy 3:641-647; Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895; Hwu
等(1993)J.Immunol.150:4104-4115; 米国特許第4,868,116号;米国特
許第4,980,286号;PCT出願WO
89/07136号;PCT出願WO89/02468号;PCT出願WO89
/05345号;及びPCT出願WO92/07573号を参照されたい)。
本発明において有用な他のウイルス遺伝子送達システムは、アデノウイルス由
来のベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムを、関心のある遺伝子産物を
コードして発現するが、通常の溶解性ウイルス生活環において複製する能力に関
しては不活性化されるように操作することができる。例えば、Berkner 等(1988)
BioTechniques 6:616; Rosenfeld 等(1991)Science 252:431-434; 及びRosenfel
d 等(1992)Cell 68:143-155を参照されたい。アデノウイルスAd5型d132
4株又はアデノウイルスの他の株(例えば、Ad2、Ad3、Ad7等)に由来
する適当なアデノウイルスベクターは、当業者に公知である。組換えアデノウイ
ルスは、非分裂細胞に感染することができず、上皮細胞を含む広範囲の細胞型へ
の感染に用いることができる点において、ある種の環境において有利であり得る
(Rosenfeld 等(1992)前出)。更に、このウイルス粒子は、比較的安定であり、
精製及び濃縮し易く且つ、上記のように、感染スペクトルに影響を及ぼすように
修飾することができる。更に、導入したアデノウイルスDNA(及びその中に含
まれる外来DNA)は、宿主細胞のゲノム中にインテグレートされずにエピソー
ム状のままであり、それにより、導入したDNAが宿主ゲノム中にインテグレー
トされる状況において挿入突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的問題(例え
ば、レトロウイルスDNA)を回避する。その上、アデノウイルスゲノムの外来
DNAを運ぶ能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい(最大8キロベ
ース)(Berkner 等、前出;Haj-Ahmand及びGraham(1986)J.Virol.57:267)。
主題のMCH遺伝子の送達に有用な更に別のウイルスベクター系は、アデノ随
伴ウイルス(AAV)である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルス又はヘル
ペスウイルス等の他のウイルスを、効率的な複製及び生産的生活環のためのヘル
パーウイルスとして必要とする天然の欠損ウイルスである。(総説として、Muzy
czka等 Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)158:97-129を参照された
い)。それは、DNAを非分裂細胞にインテグレートさせ得る数少ないウイル
スの1つでもあり、高頻度の安定なインテグレーションを示す(例えば、Flotte
等(1992) Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356; Samulski等(1989)J.Virol.63
:3822-3828; 及びMcLaughlin等(1989)J.Virol.62:1963-1973 を参照されたい)
。僅か300塩基対のAAVを含むベクターをパッケージすることができ、イン
テグレートすることができる。外因性DNAのためのスペースは、約4.5kb
に限られる。Tratschin 等(1985) Mol.Cell.Biol.5:3251-3260に記載されたよう
なAAVベクターを用いて、DNAを細胞に導入することができる。様々な核酸
が、AAVベクターを用いて、種々の細胞型に導入されてきた(例えば、Hermon
at等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470; Tratschin 等(1985)Mol.Cel
l.Biol.4:2072-2081; Wondisford 等(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39; Tratschin
等(1984)J.Virol.51:611-619;及びFlotte等(1993)J.Biol.Chem.268:3781-3790
を参照されたい)。
上述したようなウイルス性のトランスファー方法に加えて、非ウイルス性の方
法を用いて、MCHペプチドの発現を動物の組織中に引き起こすこともできる。
殆どの非ウイルス性の遺伝子トランスファー方法は、哺乳動物細胞が大型の分子
の取込み及び細胞内輸送のために利用する通常の機構に依存している。好適具体
例において、本発明の非ウイルス性遺伝子送達システムは、標的細胞による主題
のMCH遺伝子の取込みのためにエンドサイトーシス経路に依存している。この
型の典型的な遺伝子送達システムには、リポソーム由来のシステム、ポリリジン
結合体及び人工ウイルスエンベロープが含まれる。
代表的具体例において、MCHポリペプチドをコードする遺伝子を、表面に陽
性電荷を有し、(適宜)標的組織の細胞表面抗原に対する抗体で標識されたリポ
ソーム(例えば、リポフェクチン)に捕捉させることができる(Mizuno等(1992)
No Shinkei Geka 20:547-551;PCT公開WO91/06309号;日本国特許
出願第1047381号;及び欧州特許公開EP−A−43075)。
臨床環境において、治療用MCH遺伝子のための遺伝子送達システムを、当分
野でよく知られた多くの方法の何れかによって患者に導入することができる。例
えば、遺伝子送達システムの製薬調製物を例えば静脈注射によって全身に導入す
ることができ、その蛋白質の標的細胞における特異的トランスダクション
が、遺伝子送達ビヒクルにより与えられたトランスフェクションの特異性、レセ
プター遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型若しくは組織型発現、
又はこれらの組合せにより優勢に生じる。他の具体例において、組換え遺伝子の
最初の送達は、極めて制限された動物への導入により一層限られている。例えば
、遺伝子送達ビヒクルを、カテーテルにより(米国特許第5,328,470号
参照)又は定位注射によって(例えば、Chen等(1994)PNAS 91:3054-3057)導入
することができる。
遺伝子治療構築物の製薬調製物は、本質的に、許容し得る希釈剤中の遺伝子送
達システムからなることができ、又は遺伝子送達ビヒクルを埋め込んだゆっくり
放出するマトリックスを含むことができる。或は、完全な遺伝子送達システムを
組換え細胞から無傷で生成することができるならば(例えば、レトロウイルスベ
クター)、製薬調製物は、遺伝子送達システムを生成する1つ以上の細胞を含む
ことができる。アンチセンス療法
この発明の他の面は、「アンチセンス」療法における単離した核酸の利用に関
係する。ここで用いる場合、「アンチセンス」療法は、細胞条件下で、MCHを
コードする細胞性mRNA及び/又はゲノムDNAと、そのコードする蛋白質の
発現を例えば転写及び/又は翻訳を阻止することによって阻止するように特異的
にハイブリダイズする(例えば、結合する)オリゴヌクレオチド又はそれらの誘
導体の投与又はイン・シトウー生成をいう。この結合は、伝統的な塩基対相補性
により、又は例えば、二本鎖DNAへの結合の場合は、二重らせんの大きい溝に
おける特異的相互作用によるものであり得る。一般に、「アンチセンス」療法は
、当分野で一般的に用いられている技術の範囲をいい、オリゴヌクレオチド配列
に対する特異的結合に依存する任意の療法を含む。
本発明のアンチセンス構築物を、例えば、細胞内で転写されたときに、MCH
をコードする細胞性mRNAの少なくとも1つのユニーク部分に相補的であるR
NAを生成する発現プラスミッドとして送達することができる。或は、アンチセ
ンス構築物は、エキソ・ビボに生成され、細胞に導入されたときに、MCH
遺伝子のmRNA及び/又はゲノム配列とハイブリダイズすることにより発現の
阻止を引き起こすオリゴヌクレオチドプローブである。かかるオリゴヌクレオチ
ドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ例えばエキソヌクレアーゼ及び
/又はエンドヌクレアーゼに耐性でありそれ故イン・ビボで安定な修飾されたオ
リゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての利用のため
の典型的核酸分子は、DNAのホスホルアミデート、ホスホチオエート及びメチ
ルホスホネートアナログである(米国特許第5,176,996号;5,264
,564号;及び5,256,775号)。更に、アンチセンス療法において有
用なオリゴマーを構築するための一般的アプローチは、例えば、Vander Krol等(
1988)Biotechniques 6:958-976; 及びStein 等(1988)Cancer Res 48:2659-2668
に総説されている。
従って、この発明の修飾されたオリゴマーは、治療、診断及び研究関係におい
て有用である。治療応用において、これらのオリゴマーを、一般にアンチセンス
療法に適した様式で利用する。かかる療法のために、この発明のオリゴマーを、
全身投与及び局所又は局部的投与を含む種々の投与用の使用量を処方することが
できる。全身投与のためには、注射(筋肉注射、静脈注射、腹腔内注射及び皮下
注射を含む)が好適であり、この発明のオリゴマーを、液体溶液好ましくは生理
的に適合性の緩衝液例えばハンクス溶液又はリンゲル溶液中で処方することがで
きる。更に、これらのオリゴマーを、固体形態で処方して使用前に再溶解又は懸
濁させることができる。凍結乾燥形態も又、この発明に含まれる。
これらの化合物は、経口投与することができ、又は経粘膜若しくは経皮的手段
によって投与してもよい。経粘膜又は経皮的投与のためには、透過されるべきバ
リヤーに適した浸透剤を配合に用いる。かかる浸透剤は、当分野で公知であり、
例えば、経粘膜投与のために、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体並びにデタージェ
ントを含む。経粘膜投与は、鼻スプレーによるか、坐薬を用いることができる。
経口投与のためには、これらのオリゴマーを伝統的な経口投与形態例えばカプセ
ル、錠剤及びトニックに配合することができる。局所的投与のためには、この発
明のオリゴマーを、当分野で公知の軟膏、膏薬、ゲル又はクリーム中に配合する
ことができる。
治療における利用に加えて、この発明のオリゴマーを、診断用試薬として用い
て、それらが特異的に結合する標的DNA又はRNA配列の存否を検出すること
ができる。断片及びアナログの生成
本発明者は、MCHが摂食行動を調節することを発見した。MCHの構造は公
知であるので、当分野の熟練者は、例えば断片又はアナログを生成することによ
りMCH構造を変えて、新たに生成された構造を活性について試験することがで
きる。断片及びアナログの生成及び試験を可能にする従来技術の方法の例は、こ
こで検討される。これらの又は類似の方法を用いて、天然のMCHリガンド例え
ばMCHレセプター(例えばMC3−R)に結合するMCHの断片及びアナログ
を作成してスクリーニングすることができる。同様にして、それらを用いて、M
CHに結合する断片及びアナログを作成することができる。断片の生成
蛋白質断片を、幾つかの方法で、例えば組換えにより、蛋白質分解消化、又は
化学合成によって生成することができる。ポリペプチドの内部又は末端断片を、
1つ以上のヌクレオチドを、そのポリペプチドをコードする核酸の一端から(末
端断片の場合)又は両端から(内部断片の場合)除去することにより生成するこ
とができる。この突然変異誘発されたDNAの発現は、ポリペプチド断片を生成
する。従って、「末端をかじり取る」エンドヌクレアーゼでの消化は、断片の整
列をコードするDNAを生成する。蛋白質の断片をコードするDNAは又、ラン
ダムな剪断、制限酵素消化又は上記の方法の組合せによっても生成することがで
きる。
断片は又、当分野で公知の技術例えば伝統的なMerrifield固相f−Moc又は
t−Boc化学を用いて化学合成することもできる。例えば、本発明のペプチド
を勝手に分割して、重複を有しない所望の長さの断片、又は重複する所望の長さ
の断片とすることができる。
変化したDNA及びペプチド配列の生成:ランダム法
蛋白質のアミノ酸配列変異体を、蛋白質をコードし又は蛋白質の特定のドメイ
ン若しくは領域をコードするDNAのランダム突然変異誘発により調製すること
ができる。有用な方法には、PCR突然変異誘発及び飽和突然変異誘発が含まれ
る。ランダムなアミノ酸配列変異体のライブラリーを、縮重オリゴヌクレオチド
配列のセットの合成により生成することもできる。(変異体のライブラリー中の
蛋白質をスクリーニングする方法は、本明細書の他所にある。)
PCR突然変異誘発
PCR突然変異誘発においては、減少したTaqポリメラーゼ忠実度を用いて
、ランダムな突然変異を、クローン化したDNA断片中に導入することができる
(Leung 等、1989、Technique 1:11-15)。これは、非常に強力であり、比較的迅
速にランダム突然変異を導入する方法である。突然変異を誘発すべきDNA領域
を、TaqDNAポリメラーゼによるDNA合成の忠実度を低下させる条件下で
、例えば5のdGTP/dATP比を用い且つMn2+をPCR反応に加えること
により、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅する。増幅したDNA断
片のプールを適当なクローニングベクターに挿入してランダム変異体ライブラリ
ーを与える。
飽和突然変異誘発
飽和突然変異誘発は、多数の単一塩基置換のクローン化DNA断片中への迅速
な導入を可能にする(Mayers等、1985、Science 229:242)。この技術には、例え
ばイン・ビトロでの一本鎖DNAの化学処理又は照射による突然変異の生成及び
相補的DNA鎖の合成が含まれる。突然変異頻度を、処理の強さを調節すること
により調節することができ、本質的に、すべての可能な塩基置換を得ることがで
きる。この手順は突然変異についての遺伝的選択を含まないので、中立的置換と
機能を変化させるものの両方の断片が得られる。点突然変異の分布は、保存され
た配列要素に対して偏向されてない。
縮退オリゴヌクレオチド
相同物のライブラリーを、縮退したオリゴヌクレオチド配列のセットから生成
することもできる。縮退配列の化学合成を、自動DNA合成装置にて行なうこと
ができ、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクター中にライゲートすることがで
きる。縮退オリゴヌクレオチドの合成は、当分野で公知である(例えば、Narang,
SA(1983)Tetrahedron 39:3; Itakura等(1981)Recombinant DNA,Proc 3rd Cleve
land Sympos.Macromolecules,AG Walton 編、Amsterdam:Elsevier273-289頁; I
takura 等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323; Itakura 等(1984)Science 198:1056
; Ike 等(1983)Nucleic Acid Res.11:477を参照されたい)。かかる技術は、他
の蛋白質の有向進化において用いられてきた(例えば、scott 等(1990)Science
249:386-390; Roberts 等(1992)PNAS 89:2429-2433; Devlin 等(1990)Science 2
49:404-406; Cwirla等(1990)PNAS 87:6378-6382; 並びに米国特許第5,223
,409、5,198,346及び5,096,815号を参照されたい)。
変化したDNA及びペプチド配列の生成:指定突然変異誘発方法
ランダムでない又は指定された突然変異誘発技術を用いて、特異的領域内に特
異的配列又は突然変異を与えることができる。これらの技術を用いて、例えば既
知の蛋白質のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入又は置換を含む突然変異体を造る
ことができる。突然変異のための部位を、例えば、(1)最初に保存されたアミ
ノ酸で置換してから達成される結果に依って一層激しい選択物で置換すること、
(2)標的残基を削除すること、又は(3)選定部位に隣接する同じ若しくは異
なるクラスの残基を挿入することによって、個々に又は連続的に修飾することが
できる。
アラニンスキャニング突然変異誘発
アラニンスキャニング突然変異誘発は、突然変異誘発に好適な位置又はドメイ
ンである所望の蛋白質のある種の残基又は領域の同定のための有用な方法である
、Cunningham及びWells(Science 244:1081-1085,1989)。アラニンスキャニン
グにおいて、標的残基の残基又は基は、同定され(例えば、帯電したアミノ酸例
えばArg、Asp、His、Lys及びGlu)、中性又は負に帯電したアミ
ノ酸(最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン)により置換される。アミノ
酸の置換は、それらのアミノ酸と細胞内外の周囲水性環境との相互作用に影響を
及ぼし得る。これらの置換に対して機能的感受性を示すドメインを、次いで、更
なる又は別の変異体を置換部位に導入することにより更に正確にする。従って、
アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決められるが、突然変異それ自体
の性質は、予め決められている必要はない。例えば、所定部位における突然変異
の性能を最適化するために、アラニンスキャニング又はランダムな突然変異誘発
を、標的コドン又は領域にて行なうことができ、発現された所望の蛋白質サブユ
ニット変異体を、所望の活性の最適の組合せについてスクリーニングする。
オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発
オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発は、DNAの置換、欠失及び挿入変異
体を調製するのに有用な方法である。例えば、Adelman 等(DNA 2:183,1983)を
参照されたい。簡単には、所望のDNAを、突然変異をコードするオリゴヌクレ
オチドをDNAテンプレートにハイブリダイズさせることにより変化させ、この
テンプレートは、所望の蛋白質の未変化の又は自然のままのDNAを含む一本鎖
形態のプラスミッド又はバクテリオファージである。ハイブリダイゼーション後
に、DNAポリメラーセを用いて、テンプレートの完全な第2の相補鎖を合成し
、該テンプレートは、こうして、オリゴヌクレオチドプライマーを取込み、所望
の蛋白質DNA中に選択された変化をコードする。一般に、少なくとも25ヌク
レオチド長のオリゴヌクレオチドを用いる。最適なオリゴヌクレオチドは、突然
変異をコードするヌクレオチドの何れかの末端にてテンプレートに完全に
相補的である12〜15ヌクレオチドを有する。これは、オリゴヌクレオチドが
一本鎖DNAテンプレート分子に、適当に、ハイブリダイズすることを確実にす
る。これらのオリゴヌクレオチドは、Crea等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:5765
[1978])により記載されたような当分野で公知の技術を用いて、迅速に合成され
る。
カセット突然変異誘発
変異体を調製するための他の方法であるカセット突然変異誘発は、Wells 等(
Gene,34:315[1985])により記載された技術に基づいている。出発物質は、変異
されるべき蛋白質サブユニットDNAを含むプラスミッド(又は、他のベクター
)である。この変異されるべき蛋白質サブユニットDNA中のコドンを同定する
。同定された突然変異部位の各側面にはユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位
があるに違いない。もしかかる制限部位が存在しないならば、それらを、上述の
オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発法を用いて生成させて、所望の蛋白質サ
ブユニットDNA中の適当な位置に導入することができる。制限部位がプラスミ
ッドに導入された後に、そのプラスミッドをそれらの部位で切断して線状化する
。制限部位間のDNAの配列をコードするが所望の突然変異を含む二本鎖オリゴ
ヌクレオチドを、標準的手順を用いて合成する。これらの二本鎖を別々に合成し
てから、標準的技術を用いて一緒にハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌ
クレオチドを、カセットとして言及する。このカセットを、線状化プラスミッド
の両端に匹敵する3’及び5’末端を有するようにデザインしてそのプラスミッ
ドに直接ライゲートすることができるようにする。このプラスミッドは、今や、
変異した所望の蛋白質サブユニットDNA配列を含む。
組合せ突然変異誘発
組合せ突然変異誘発を用いて、突然変異を生成することもできる(Ladner等、
WO/06630)。この方法において、相同物又は他の関連蛋白質の群につい
てのアミノ酸配列を整列させて、好ましくは、可能な最高の相同性を促進する。
整列させた配列の所定位置に現われるアミノ酸のすべてを選択して組合せ配列の
縮退したセットを造ることができる。多彩なライブラリーの変異体が、核酸レベ
ルでの組合せ突然変異誘発により生成され、多彩な遺伝子ライブラリーによりコ
ードされる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、酵素的に、遺伝子配
列中にライゲートして、潜在的配列の縮退したセットが個々のペプチドとして発
現し得るようにすることができ、或は、縮退した配列のセットを含む大きい融合
蛋白質のセットとして発現し得るようにすることができる。
ペプチド断片又は相同物のライブラリーをスクリーニングするための第一次の 高スループット方法
生成された突然変異体遺伝子をスクリーニングするための様々な技術が当分野
で知られている。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための技術に
は、しばしば、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローン化し
、生成したベクターのライブラリーで適当な細胞をトランスフォームし、そして
、所望の活性(例えば、この場合は、MCH又は天然のMCHリガンド例えばM
CHレセプター例えばMC3−R)の検出が産物の検出された遺伝子をコードす
るベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で遺伝子を発現させることが含
まれる。下記の技術の各々は、例えばランダムな突然変異誘発技術により造られ
た多くの配列についての高スループット分析に従順である。
2ハイブリッドシステム
2ハイブリッドアッセイ(ここに記載の他のスクリーニング法を伴う)を用い
て、天然のMCHリガンド例えばMCHレセプター(例えば、MC3−R)に結
合するMCHポリペプチドの断片又はアナログを同定することができる。これら
には、アゴニスト、スーパーアゴニスト及びアンタゴニストが含まれ得る。(こ
のMCHリガンドを餌蛋白質として用いて、変異体のライブラリーを魚融合蛋白
質として発現させる。)類似の様式にて、2ハイブリッドアッセイ(ここに記載
の他のスクリーニング法を伴う)を用いて、MCHに結合する断片及びアナログ
を見出すことができる。
ディスプレーライブラリー
スクリーニングアッセイへの1つのアプローチにおいて、候補のペプチドを細
胞又はウイルス粒子の表面にディスプレーし、特定の細胞又はウイルス粒子のデ
ィスプレーされた生成物を介して適当なレセプター蛋白質に結合する能力を、「
パニングアッセイ」にて検出する。例えば、遺伝子ライブラリーを、細菌細胞の
表面膜蛋白質の遺伝子中にクローン化して、生じた融合蛋白質をパニングにより
検出することができる(Ladner等、WO88/06630;Fuchs 等(1991)Bio/
Technology 9:1370-1371; 及びGoward等(1992)TIBS 18:136-140)。類似の様式
において、検出可能に標識されたリガンドを用いて、潜在的に機能的なペプチド
相同物を評価することができる。蛍光標識したリガンド例えばレセプターを用い
て、リガンド結合活性を保持している相同物を検出することができる。蛍光標識
したリガンドの利用は、細胞を視覚的に調べ、蛍光顕微鏡下で分離することを可
能にし、又は細胞の形態が許す場合には、蛍光活性化セルソーターにより分離す
ることを可能にする。
遺伝子ライブラリーを、ウイルス粒子の表面上の融合蛋白質として発現させる
ことができる。例えば、繊維状ファージシステムにおいて、外来ペプチド配列を
感染性ファージの表面上で発現させ、それにより、2つの有意の利益を与えるこ
とができる。第1に、これらのファージは、1ミリリットル当たり1013ファー
ジよりずっと高濃度でアフィニティーマトリックスに適用することができ、多数
のファージを一度にスクリーニングすることができる。第2に、各感染性ファー
ジは、その表面に遺伝子産物をディスプレーし、もし特定のファージがアフィニ
ティーマトリックスから低収率で回収されたならば、そのファージを感染の別の
ラウンドにより増幅することができる。殆ど同じ大腸菌繊維状ファージM13、
fd及びf1のグループは、最もしばしばファージディスプレーライブラリーに
用いられる。ファージgIII又はgVIIIコート蛋白質の何れかを用いて、
ウイルス粒子の最終的パッケージングを混乱させることなく融合蛋白質を生成す
ることができる。外来エピトープをpIIIのNH2末端に発現させることがで
き、かかるエピトープを有するファージをこのエピトープを欠く大過剰のファー
ジから回収することができる(Ladner等、PCT公開WO90/02909号;
Garrard 等、PCT公開WO92/09690;Marks 等(1992)J.Biol.Chem.26
7:16007-16010; Griffiths等(1993)EMBO J 12:725-734; Clackson 等(1991)Natu
re 352:624-628; 及びBarbas等(1992)PNAS 89:4457-4461)。
共通のアプローチは、大腸菌のマルトースレセプター(外膜蛋白質LamB)
を、ペプチド融合パートナーとして利用する(Charbit 等(1986)EMBO 5,3029-3
037)。オリゴヌクレオチドが、LamB遺伝子をコードするプラスミッドに挿
入されて、この蛋白質の細胞外ループの1つに融合されたペプチドが生成された
。これらのペプチドは、リガンド例えば抗体に結合するために利用可能であり、
これらの細胞を動物に投与した場合には、免疫応答を誘出することができる。他
の細胞表面蛋白質例えばOmpA(Schorr等(1991)Vaccines 91,387-392頁)、
PhoE(Agterberg 等(1990)Gene 88,37-45)及びPAL(Fuchs 等(1991)Bio
/Tech 9,1369-1372)並びに大きい細菌表面構造は、ペプチドディスプレーのた
めのビヒクルとして働いた。ペプチドを、重合して細菌間の遺伝情報交換のため
の導管である繊毛を形成する蛋白質であるピリンに融合させることができる(Th
iry 等(1989)Appl.Environ.Microbiol.55,984-993)。他の細胞との相互作用に
おけるその役割の故に、繊毛は、細胞外環境へのペプチドの提示に有用な支持を
与える。ペプチドディスプレーに用いられる他の大きい表面構造は、細菌起動器
官である鞭毛である。ペプチドのサブユニット蛋白質フラジェリンへの融合は、
宿主細胞における多くのペプチドコピーの密な整列を与える(Kuwajima等(1988)
Bio/Tech.6,1080-1083)。他の細菌種の表面蛋白質も又、ペプチド融合パートナ
ーとして働いた。例には、StaphylococcusのプロテインA及びNeisseriaの外膜
プロテアーゼIgAが含まれる(Hansson 等(1992)J.Bacteriol.174,4239-4245
及びKlauser 等(1990)EMBO J.9,1991-1999)。
上記の繊維状ファージシステム及びLamBシステムにおいて、ペプチドとそ
のコードDNAとの間の物理的結合は、そのペプチドを表面に有する粒子(細胞
又はファージ)中のDNAの包含により生じる。ペプチドを捕らえることは、粒
子及びその中のDNAを捕らえる。別の計画は、DNA結合蛋白質LacIを用
いて、ペプチドとDNAの間の結合を形成する(Cull等(1992)PNAS USA 89:18
65-1869)。このシステムは、3’末端にオリゴヌクレオチドクローニング部
位を有するLacI遺伝子を含むプラスミッドを用いる。アラビノースによる制
御された誘導下で、LacI−ペプチド融合蛋白質が生成される。この融合物は
、LacOオペレーター(LacO)として知られる短いDNA配列に結合する
LacIの自然の能力を保持する。LacOの2コピーを発現プラスミッドに設
置することにより、LacI−ペプチド融合物は、それをコードしたプラスミッ
ドにきつく結合する。各細胞中のこれらのプラスミッドは単一のオリゴヌクレオ
チド配列のみを含み、各細胞は単一ペプチド配列のみを発現するので、これらの
ペプチドは、その合成を指示したDNA配列と特異的且つ安定に結合する。この
ライブラリーの細胞を穏やかに溶解させ、ペプチド−DNA複合体を、固定化し
たレセプターのマトリックスにさらして、活性なペプチドを含む複合体を回収す
る。結合したプラスミッドDNAを、次いで、増幅及びDNA配列決定のために
細胞に再導入してペプチドリガンドの正体を決定する。この方法の実際的有用性
を示すために、12量体ペプチドの大きいランダムライブラリーを作製して、オ
ピオイドペプチドダイノルフィンBに対して高めたモノクローナル抗体にて選択
した。ペプチドの一団が回収され、すべては、ダイノルフィンBの6残基部分に
対応するコンセンサス配列により関連した。(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.89-1869)
この計画(しばしば、プラスミッド上のペプチドと呼ばれる)は、2つの重要
な点で、ファージディスプレー法と異なっている。第1に、ペプチドは、融合蛋
白質のC末端に付着され、遊離のカルボキシ末端を有するペプチドとしてライブ
ラリーメンバーのディスプレーを生じる。繊維状ファージコート蛋白質pIII
及びpVIIIの両者を、それらのC末端によってファージに固定し、ゲストペ
プチドは、外側に伸びるN末端ドメイン中に位置される。幾つかのデザインにお
いて、ファージディスプレーされたペプチドは、融合蛋白質のアミノ末端に権利
を与えられる。(Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,6378-6382)第
2の差異は、ライブラリー中に現実に存在するペプチドの集団に影響する生物学
的偏向のセットである。LacI融合分子は、宿主細胞の細胞質中に閉じ込めら
れる。ファージコート融合物は、移動中短時間細胞質にさらされるが、C末端疎
水性ドメインにより膜中に固定されたまま、内膜を通して迅速に
ペリプラスム区画に分泌され、N末端は、ペプチドを含み(ペリプラスム中に突
き出している)、ファージ粒子中へのアセンブリを待つ。LacI及びファージ
ライブラリー中のペプチドは、それらの種々の蛋白質分解活性への露出の結果と
して有意に異なり得る。ファージコート蛋白質は、内膜を横切る輸送及びファー
ジ中への取り込みの前奏曲としてのシグナルペプチダーゼによるプロセスを必要
とする。ある種のペプチドは、これらのプロセスに有害な影響を発揮し、ライブ
ラリーにおいて十分表示されない(Gallop等(1994)J.Med.Chem.37(9):1233-1251
)。これらの特定の偏向は、LacIディスプレーシステムでは、因子ではない
。
組換えランダムライブラリーで利用可能な小さいペプチドの数は、莫大である
。107〜109の独立のクローンのライブラリーが、常例的に調製される。1011
程の大きいライブラリーが造られているが、このサイズは、クローンライブラ
リーに関しての実際上の限界に近い。このライブラリーサイズの限界は、無作為
化されたセグメントを含むDNAを宿主の細菌細胞中にトランスフォームするス
テップに生じる。この限界を回避するために、発生期のペプチドのポリソーム複
合体におけるディスプレーに基づくイン・ビトロシステムが、最近、開発された
。このディスプレーライブラリー法は、現在利用可能なファージ/ファージミド
又はプラスミッドライブラリーより3〜6桁大規模のライブラリーを生成する可
能性を有している。更に、これらのライブラリーの構築、ペプチドの発現及びス
クリーニングは、完全に無細胞形式で行なわれる。
この方法の1つの適用において(Gallop等(1994)J.Med.Chem.37(9):1233-125
1)、1012の10量体ペプチドをコードする分子DNAライブラリーを構築し
て、大腸菌S30イン・ビトロでカップルされた転写/翻訳システムにおいてそ
のライブラリーを発現させた。リボソームがmRNA上に立往生するように条件
を選択して、かなりの割合のRNAのポリソーム中への集積を引き起こし、未だ
自分たちをコードするRNAと結合している発生期のポリペプチドを含む複合体
を産生した。これらのポリソームは、もっと伝統的な組換えペプチドのディスプ
レーライブラリーをスクリーニングするのと殆ど同じ方法で固定化したレセプタ
ーにてアフィニティー精製するのに十分に丈夫である。結合した複合体
からのRNAを回収して、cDNAに変換し、PCRにより増幅して次のラウン
ドの合成及びスクリーニング用のテンプレートを生成する。このポリソームディ
スプレー法は、ファージディスプレーシステムと結合することができる。数ラウ
ンドのスクリーニングの後に、ポリソームの富化プールからのcDNAをファー
ジミドベクター中にクローン化した。このベクターは、コート蛋白質に融合した
ペプチドをディスプレーするペプチド発現ベクターとして、及びペプチド同定の
ためのDNA配列決定用ベクターとしての両者の働きをする。ポリソーム由来の
ペプチドのファージ上での発現により、この形式のアフィニティー選択手順を継
続することができ、又は個々のクローン上のペプチドを、ファージELISAに
おける結合活性につき若しくは完了ファージELISAにおける結合特異性につ
いてアッセイすることができる(Barret等(1992)Anal.Biochem 204,357-364)。
活性なペプチドの配列を同定するために、ファージミド宿主により生成されたD
NAを配列決定する。
第2のスクリーニング
上記の高スループットアッセイの後に、更に生物学的活性を同定するために、
例えば当業者がアゴニストをアンタゴニストから区別することを可能にする第2
のスクリーニングを行なうことができる。使用する第2のスクリーニングの型は
、試験する必要のある所望の活性に依る(特異的なMCH活性を試験するアッセ
イの幾つかは、上述してある)。例えば、関心のある蛋白質とその各リガンドと
の間の相互作用を阻止する能力を用いて、上記の第1次スクリーニングの1つに
よって単離されたペプチド断片の一群からアンタゴニストを同定することのでき
るアッセイを開発することができる。
それ故、断片及びアナログを生成するための方法及びそれらを活性について試
験する方法は、当分野で公知である。一度関心のあるコア配列が同定されれば、
アナログ及び断片を得ることは、当業者には、常例的なことである。
ペプチド模倣物
この発明は又、MCHペプチドの蛋白質結合ドメインの還元を与えて、この場
合、MCHと天然のMCHリガンド例えばMCHレセプター(例えば、MC3−
R)との結合を破壊することのできる模倣物例えばペプチド因子又は非ペプチド
因子を生成する。MCHリガンドの分子的認識に関与するMCHペプチドの決定
的に重大な残基を決定して、MCHとMCHリガンドとの結合を競争的に又は非
競争的に阻害するMCH由来のペプチド模倣物を生成するために利用することが
できる(例えば、「Peptide inhibitors of human papillomavirus protein bin
ding to retinoblastoma gene protein」欧州特許出願EP−412,762A
及びEP−B31,080Aを参照されたい)。例えば、MCHリガンドの結合
に関与する特定のMCHペプチドのアミノ酸残基をマップするためにスキャニン
グ突然変異誘発を用いることによって、MCHリガンドへの結合においてそれら
の残基を真似し、それ故、MCHのリガンドへの結合を阻止することができ、そ
れによりMCHの機能を邪魔することのできるペプチド模倣化合物(例えば、ジ
アセピン又はイソキノリン誘導体)を生成することができる。例えば、かかる残
基の加水分解不能なペプチドアナログを、ベンゾジアゼピン(例えば、Freiding
er等、Peptides: Chemistry and Biology,G.R.Marshall編、ESCOM 出版: Leide
n,オランダ、1988 参照)、アゼピン(例えば、Huffman 等、Peptides:Chemistry an
d Biology,G.R.Marshall 編、ESCOM 出版: Leiden,オランダ、1988 参照)、置換さ
れたガンマーラクタム環(Garvey等、Peptides: Chemistry and Biology,G.R.M
arshall 編、ESCOM 出版: Leiden,オランダ、1988)、ケト−メチレン擬ペプチド(
Ewenson 等(1986)J Med Chem 29:295;及びEwenson 等、Peptides:Structure and
Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce Che
mical Co.Rockland,イリノイ、1985)、β−ターンジペプチドコア(Nagai 等(
1985)Tetrahedron Lett 26:647; 及びSato等(1986)J Chem Soc Perkin Trans 1:
1231)、及びβ−アミノアルコール(Gordon等(1985)Biochem Biophys Res Comm
un 126:419; 及びDann等(1986)Biochem Biophys Res Commun 134:71)を用いて
生成することができる。投与
この発明の化合物を、イン・ビボでの適当な分布を確実にするように処方する
ことができる。例えば、血液−脳関門(BBB)は、多くの高度に親水性の化合
物を排除する。この発明の治療用化合物がBBBを超えることを確実にするため
に、それらを、例えば、リポソーム中に処方することができる。リポソーム製造
方法に関しては、例えば、米国特許第4,522,811;5,374,548
及び5,399,331号を参照されたい。これらのリポソームは、選択的に特
異的細胞又は器官に輸送される1つ以上の部分(「ターゲッティング部分」)を
含むことができ、従って、狙いを定めた薬物送達を与えることができる(例えば
、V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685を参照されたい)。典型的なター
ゲッティング部分には、フォレート又はビオチン(例えば、Low 等の米国特許第
5,416,016号参照);マンノシド(Umezawa 等(1988)Biochem.Biophys.
Res.Commun.153:1038);抗体(P.G.Bloeman 等(1995)FEBS Lett.357:140; M.Ow
ais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180);界面活性剤プロテイン
Aレセプター(Briscoe 等(1995)Am.J.Physio1.1233:134);gp120(Schre
ier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090)が含まれる。K.Keinanen M.L.Laukkanen(19
94)FEBS Lett.346:123; J.J.Killion; I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273も
参照されたい。好適具体例において、この発明の治療用化合物をリポソーム中に
処方し;一層好適な具体例において、これらのリポソームは、ターゲッティング
部分を含む。
非経口以外の投与によって治療用化合物を投与するためには、その化合物をそ
の不活性化を防ぐ物質で被覆するか、又はその化合物を該物質と同時に投与する
ことが必要であり得る。例えば、この治療用化合物を、適当なキャリアー例えば
リポソーム又は希釈剤にて患者に投与することができる。製薬上許容し得る希釈
剤には、塩溶液及び水性緩衝溶液が含まれる。リポソームには、水中油中水CG
Fエマルジョン並びに伝統的なリポソームが含まれる(Strejan 等(1984)J.Neur
oimmunol.7:27)。
この治療用化合物は又、非経口投与、腹腔内投与、髄腔内投与、又は脳内投与
により投与することもできる。分散を、グリセロール、液体ポリエチレングリコ
ール及びこれらの混合物中及び油中で調製することができる。通常の貯蔵及び使
用条件下において、これらの調製物は、防腐剤を含有して微生物の増殖を
防ぐことができる。
注射用途に適した製薬組成物には、無菌の水溶液(水溶性の場合)又は分散及
び、無菌の注射用溶液又は分散の即座の調製のための無菌粉末が含まれる。すべ
ての場合に、この化合物は、無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流
動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず
、微生物例えば細菌及びカビの汚染作用に対して保護されていなければならない
。このビヒクルは、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール
、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等)、これらの適当な
混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒であってよい。適当な流動性を、例え
ば、レシチン等のコーティングの利用により、分散の場合の必要な粒子サイズの
維持により及び界面活性剤の利用によって維持することができる。微生物の作用
の予防は、種々の抗菌剤及び抗カビ剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェ
ノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの
場合に、等張剤例えば糖類、塩化ナトリウム、又はポリアルコール類例えばマン
ニトール及びソルビトールを組成物中に含むことは好適であろう。これらの注射
用組成物の延長された吸収を、吸収を遅らせる薬剤例えばアルミニウムモノステ
アレート又はゼラチンをその組成物中に含有することにより引き起こすことがで
きる。
無菌の注射用溶液を、必要量の治療用化合物を適当な溶媒中に、必要ならば上
述の成分の1つ又は1組と共に取り込ませ、その後、濾過滅菌することにより調
製することができる。一般に、分散は、治療用化合物を、基本的分散媒及び上記
のものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に取り込むことにより調製さ
れる。無菌の注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、好ましい調製方法
は、真空乾燥及び、活性成分(即ち、治療用化合物)に前述の滅菌濾過した溶液
からの任意の追加の所望成分を加えたものの粉末を生成する凍結乾燥である。
適当な投与量は、従来技術の方法により決定することができるが、体重1kg
当たり0.001〜100mg又は0.1〜10mgの範囲内にあってよい。
その他の具体例
アナログは、アミノ酸配列において又は配列に関係しない点で、或はその両方
において、天然のMCHと異なってよい。配列以外の改変には、イン・ビポ又は
イン・ビトロでのMCHの化学的誘導体化が含まれる。配列以外の改変には、ア
セチル化、メチル化、ホスホリル化、カルボキシル化、又はグリコシル化におけ
る変化が含まれる。
好適なアナログには、配列が野生型配列と、MCHの生物学的活性を破壊しな
い1つ以上の保存的アミノ酸置換により又は1つ以上の非保存的アミノ酸置換、
欠失若しくは挿入により異なるMCH(又は、生物学的に活性なその断片)が含
まれる。保存的置換は、典型的には、1つのアミノ酸の類似の特性の他のアミノ
酸での置換を含み、例えば、次のグループ内での置換を含む:バリン、グリシン
;グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グ
ルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リジン、アルギ
ニン;及びフェニルアラニン、チロシン。他の保存的置換は、下記の表から取り
出すことができる。
この発明の内の他のアナログは、ペプチド安定性を増大させる改変を有するも
のであり;かかるアナログは、例えば、ペプチド配列中に、1つ以上の非ペプチ
ド結合(ペプチド結合を置換)を含むことができる。天然のL−アミノ酸以外の
残基例えばD−アミノ酸又は天然産でないアミノ酸又は合成のアミノ酸例えばβ
又はγアミノ酸を含むアナログ;及び環状アナログも含まれる。
MCHポリペプチドを得るためには、MCHをコードするDNAを発現ベクタ
ーに導入し、そのベクターを所望の蛋白質の発現に適した細胞に導入し、そして
そのぺぷちどを従来法により回収して精製することができる。これらのペプチド
に対する抗体(蛋白質)を、動物例えばウサギ又はマウスを免疫して、抗MCH
抗体を従来技術により回収することによって作製することができる。
他の具体例は、後記の請求の範囲内にある。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C12N 5/10 A61K 37/02 AEE
C12Q 1/68 C12N 5/00 B
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CZ,
DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,HU,I
S,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK,LR
,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,
MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,S
D,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TR,TT
,UA,UG,US,UZ,VN
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.患者において、食欲を増進し、又は体重の獲得若しくは維持を促進する方法 であって、有効量のMCH又はそのアゴニスト若しくは断片を該患者に投与する ことを含む、該方法。 2.前記の患者が、過少体重であり又は正常の摂食行動より低下した摂食行動を 示す、請求項1に記載の方法。 3.前記の患者が神経性食欲不振である、請求項1に記載の方法。 4.前記の患者が、減少した摂食行動を生じる治療を、現在施与されているか又 は施与されてきた、請求項1に記載の方法。 5.前記の患者を、正常の摂食行動より低下した摂食行動、消耗、又は体重不足 の何れかの危険にあるかについて診断することを更に含む、請求項1に記載の方 法。 6.前記の患者がヒトである、請求項1に記載の方法。 7.前記の患者に、MCH又はそのアゴニスト若しくは断片の第2の投与量を投 与する、請求項1に記載の方法。 8.患者における食欲又は体重の獲得を阻止する方法であって、有効量のMCH のアンタゴニストを該患者に投与することを含む、該方法。 9.前記の患者が過剰体重であるか又は強迫性摂食行動を示す、請求項8に記載 の方法。 10.前記の患者を、強迫性摂食行動、肥満又は摂食障害の何れかの危険にある かについて診断することを更に含む、請求項8に記載の方法。 11.前記の患者がヒトである、請求項8に記載の方法。 12.前記の患者に、MCHのアンタゴニストの第2の投与量を投与する、請求 項8に記載の方法。 13.前記のアンタゴニストが、MCHと少なくとも70%の相同性を有するM CHのペプチドアナログである、請求項6に記載の方法。 14.摂食行動に対する効果に関して治療を評価する方法であって、その治療を メラニン細胞ベースのアッセイ系に施与し、該系に変化があるかどうかを測定 し、そしてその治療を第2の試験系に施与して、摂食行動又は体重の獲得若しく は損失に関係するパラメーターに対するその治療の効果をその第2の系において 測定することを含む、上記の方法。 15.前記の治療が、薬剤の投与であり且つ該薬剤が多糖類、核酸、脂肪、ポリ ペプチド又はペプチド模倣物の何れかである、請求項14に記載の方法。 16.前記の薬剤が、MCHと少なくとも50%の相同性を有するポリペプチド である、請求項14に記載の方法。 17.前記の治療を前記の第2の試験系に施与することが、該治療を動物に施与 することを含む、請求項14に記載の方法。 18.摂食行動に対する効果について治療を評価する方法であって、MCHのプ ロモーター領域に結合されたレポーター遺伝子を有する動物、細胞又は細胞培養 調製物を用意し;該治療を施与し;そしてレポーター遺伝子発現に対する効果が あるかどうかを測定することを含む、上記の方法。 19.前記の治療が、薬剤の投与であり且つ該薬剤が多糖類、核酸、脂肪、ポリ ペプチド又はペプチド模倣物の何れかである、請求項18に記載の方法。 20.前記の薬剤が、MCHと少なくとも50%の相同性を有するポリペプチド である、請求項18に記載の方法。 21.摂食行動、食欲又は体重維持に対する効果について薬剤を評価する方法で あって、MC3−Rを発現する動物、細胞又は細胞培養調製物を用意し;その動 物、細胞又は細胞培養物に治療を施与し;そして、MC3−Rに対するリガンド の結合に関するパラメーターに変化があるかどうかを測定することを含む、上記 の方法。 22.摂食行動、食欲又は体重維持に対する効果について薬剤を評価する方法で あって、MCHが結合する基質を用意し;その基質、MCH及び薬剤を接触させ ;そして、MCHのその基質への結合を促進し又は阻害するその化合物の能力を 評価することを含む、上記の方法。 23.摂食行動、食欲又は体重維持に対する効果について治療を評価する方法で あって、患者動物を用意し;治療を施与し;そして、その動物におけるMCH RNA若しくは蛋白質のレベル又は摂食行動に対する効果があるかどうかを測定 することを含み、但し、この治療は、外科的介入又は塩水の経口投与以外である 、上記の方法。 24.薬剤をMCHポリペプチドに結合する能力について評価する方法であって 、薬剤をMCHポリペプチド又はその精製標品と接触させ;そして、その化合物 のMCHポリペプチドと複合体を形成する能力を評価することを含み、但し、薬 剤は、ウサギポリクローナル抗体以外以外である、上記の方法。 25.薬剤を、MCHペプチドの第2のポリペプチドとの相互作用を調節する能 力について評価する方法であって、(i)第2のポリペプチド(又は、好ましく は、その精製標品)、MCHポリペプチド(又は、好ましくは、その精製標品) 及び薬剤を、その薬剤の不在において第2のポリペプチド及びMCHポリペプチ ドが相互作用して例えば複合体を形成する条件下で合わせ;そして(ii)その相 互作用を検出する例えば第2のポリペプチド及びMCHペプチドを含む複合体の 形成(又は分解)を検出するステップを含む、上記の方法。 26.望ましくない摂食行動により特徴付けられる病気又は過少若しくは過剰体 重を処置する治療の効果を評価する方法であって、MCHトランスジーンを有す るか又はMCH遺伝子を誤発現する試験細胞又は生物に治療を施与してMCH代 謝の面に対するその治療の効果を評価することを含む、上記の方法。 27.患者の哺乳動物が、MCH関連疾患、体重に関係する病気又は摂食若しく は食欲障害の危険にあるかどうかを測定する方法であって、患者の組織における MCH遺伝子の変異の存否又はMCH RNA若しくは蛋白質の非野生型レベル の存否を検出することを含む、上記の方法。 28.MCHポリペプチドを作成する方法であって、MCHペプチドの配列又は 環構造を変えること、及び改変したペプチドを、それを動物に投与して摂食行動 又は体重に対するその効果を測定することにより、所望の活性について試験する ことを含む、上記の方法。 29.トランスジェニックMCH細胞又はトランスジェニックMCH非ヒト動物 。
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