JP2002504357A - Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子 - Google Patents

Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子

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JP2002504357A
JP2002504357A JP2000533017A JP2000533017A JP2002504357A JP 2002504357 A JP2002504357 A JP 2002504357A JP 2000533017 A JP2000533017 A JP 2000533017A JP 2000533017 A JP2000533017 A JP 2000533017A JP 2002504357 A JP2002504357 A JP 2002504357A
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エイ．モーガン ブルース
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    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

(57)【要約】 この発明は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 この発明は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド、Ｈｅｌｉｏｓ
ホモダイマー、Ｈｅｌｉｏｓ／Ｉｋａｒｏｓヘテロダイマー、Ｈｅｌｉｏｓ／Ａ
ｉｏｌｏｓヘテロダイマー及びＨｅｌｉｏｓ核酸及びポリペプチドの利用方法に
関するものである。
【０００２】発明の要約 一般に、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド例えばSEQ ID NO:２、SEQ ID
NO:４又はSEQ ID NO:６に示した配列の全部又は部分を含むポリペプチドを特徴
とする。この発明は又、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの断片及び類似体(好ましく は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を有するもの) をも特徴とする。
【０００３】 好適具体例において、このポリペプチドは、組換えの又は実施的に純粋なＨｅ
ｌｉｏｓポリペプチドの調製物である。
【０００４】 好適具体例において、このポリペプチドは、脊椎動物例えば哺乳動物例えばヒ
トのポリペプチドである。
【０００５】 好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、SEQ ID NO:２、SEQ
ID NO:４又はSEQ ID NO:６のコード配列の５’側に更なるＨｅｌｉｏｓコード配
列を含む。
【０００６】 好適具体例において：このポリペプチドは、少なくとも１つの生物学的活性を
有し(例えば、それは、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドに特異的な抗体又は抗体断片 と反応する)；このポリペプチドは、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO
:６からのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７４％、８０％、９０％、９５％ 、９８％又は９９％相同なアミノ酸配列を含み；このポリペプチドは、SEQ ID N
O:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO:６のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配
列を含み；このポリペプチドは、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１
５０、２００又は２５０アミノ酸長であり；このポリペプチドは、少なくとも５
の、好ましくは少なくとも１０の、一層好ましくは少なくとも２０の、最も好ま
しくは少なくとも５０、１００、１５０、２００又は２５０のSEQ ID NO:２、SE
Q ID NO:４又はSEQ ID NO:６由来の隣接するアミノ酸を含み；このポリペプチド
は、好ましくは１０以上１００未満のアミノ酸長であり；このＨｅｌｉｏｓポリ
ペプチドは、天然のＨｅｌｉｏｓポリペプチドの生物学的活性のアゴニスト又は
アンタゴニストである。
【０００７】 好適具体例において：このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、SEQ ID NO:１、SEQ
ID NO:３若しくはSEQ ID NO:６の核酸配列によりコードされ、又はSEQ ID NO:１
、SEQ ID NO:３若しくはSEQ ID NO:６の核酸と少なくとも６０％、７０％、８０
％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の相同性を有する核酸によりコード
される。例えば、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、遺伝コードの縮重のために
SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:３又はSEQ ID NO:６の核酸配列とことなる核酸配列に
よりコードされ得る。
【０００８】 好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、SEQ ID NO:２のアミ
ノ酸残基１〜５２６、SEQ ID NO:４の残基１〜５００若しくはSEQ ID NO:６の残
基１〜５２６又は他の脊椎動物若しくは哺乳動物例えばサルのＨｅｌｉｏｓ配列
中の機能的に同等の残基をコードする。
【０００９】 好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、天然の変異型又は野
生型のＨｅｌｉｏｓポリペプチド(例えば、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ
ID NO:６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアゴニストである。他
の好適具体例において、このポリペプチドは、例えば、天然のＨｅｌｉｏｓポリ
ペプチド(例えば、変異型ポリペプチド)の望ましくない活性を阻害するアンタゴ
ニストである。
【００１０】 好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、SEQ ID NO:２、SEQ
ID NO:４又はSEQ ID NO:６の配列とアミノ酸配列が１、２、３、５、１０残基以
上で異なるが、好ましくは、１５残基以上は異ならない。しかしながら、これら
の差異は、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドが少なくとも１つのＨｅｌｉｏｓポリ
ペプチドの生物学的活性を示す(例えば、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、天 然のＨｅｌｉｏｓポリペプチドの一生物学的活性を保持している)ようなもので ある。他の好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、最大で１、
２、３、５、１０アミノ酸残基において、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ
ID NO:６の配列と異なる。
【００１１】 好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、ここに記載のＨｅｌ
ｉｏｓポリペプチド配列並びに他のＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸配列を含む
。
【００１２】 好適具体例において、このポリペプチドは、更なるアミノ酸残基に、好ましく
は、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO:６由来の配列をコードするゲノ
ムＤＮＡの５’側のゲノムＤＮＡによりコードされる残基に読み枠で融合された
SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO:６由来のアミノ酸配列の全部又は断
片を含む。
【００１３】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの断片を特徴とする
。一具体例において、この断片は、末端断片例えばＮ若しくはＣ末端欠失(例え ば、ジンクフィンガー)又は内部欠失(例えば、ジンクフィンガー又は転写活性化
ドメイン)である。他の具体例において、この断片は、少なくとも１つのＮ末端 ジンクフィンガー例えばＮ−ジンクフィンガー１(ＺＦ１)、Ｎ−ジンクフィンガ
ー２(ＺＦ２)、Ｎ−ジンクフィンガー３(ＺＦ３)、Ｎ−ジンクフィンガー４(Ｚ Ｆ４)、転写活性化ドメイン、又はＣ末端ジンクフィンガー例えばＣ−ジンクフ ィンガー１(ＺＦ５)、Ｃ−ジンクフィンガー２(ＺＦ６)を有する。他の具体例に
おいて、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、少なくとも１つのＮ末端ジンクフィ
ンガー例えばＮ−ジンクフィンガー１(ＺＦ１)、Ｎ−ジンクフィンガー２(ＺＦ ２)、Ｎ−ジンクフィンガー３(ＺＦ３)、Ｎ−ジンクフィンガー４(ＺＦ４)、転 写活性化ドメイン、又はＣ末端ジンクフィンガー例えばＣ−ジンクフィンガー１
(ＺＦ５)又はＣ−ジンクフィンガー２(ＺＦ６)の欠失を含む。他の具体例におい
て、この断片は、少なくとも２０、４０、６０又は８０アミノ酸長である。
【００１４】 更に別の好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、第１のＨｅ
ｌｉｏｓポリペプチド部分と、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドと無関係のアミノ酸配
列を有する第２のポリペプチド部分とを有する組換え融合蛋白質である。この第
２のポリペプチド部分は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、Ｄ
ＮＡ結合ドメイン又はポリメラーゼ活性化ドメインの何れであってもよい。好適
具体例において、この融合蛋白質は、２ハイブリッドアッセイにおいて用いるこ
とができる。
【００１５】 好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、天然のＨｅｌｉｏｓ
ポリペプチドに特異的な抗体又はＦ(ab')2断片との反応性を阻害する天然のＨｅ
ｌｉｏｓポリペプチドの断片又は類似体である。
【００１６】 好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、成熟蛋白質中に存在
しない配列を含む。
【００１７】 この発明のポリペプチドは、多重遺伝子、選択的転写事象、選択的ＲＮＡスプ
ライシング事象並びに選択的翻訳及び翻訳後事象の存在の結果として生じるもの
を含む。
【００１８】 好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、下記の特性の少なく
とも１つを有する： (ａ)それは、Ｈｅｌｉｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ又はＩｋａｒｏｓポリペプチドとダ
イマーを形成することができ； (ｂ)それは、造血幹細胞において発現され； (ｃ)それは、約６４ｋＤａ又は６８ｋＤａの分子量を有し； (ｄ)それは、少なくとも１つのジンクフィンガードメインを有し；又は (ｅ)それは、リンパ球系遺伝子の転写アクチベーターである。
【００１９】 この発明は、活性な若しくは不活性なＨｅｌｉｏｓポリペプチド又はそれらの
類似体若しくは断片を免疫原調製物中に含む免疫原を含み、その免疫原は、Ｈｅ
ｌｉｏｓポリペプチドに特異的な免疫応答例えば液性応答、抗体応答又は細胞性
応答を誘出することができる。好適具体例において、この免疫原は、SEQ ID NO:
２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO:６により表される蛋白質由来の抗原決定基例え
ばユニークな決定基を含む。
【００２０】 この発明は又、Ｈｅｌｉｏｓ免疫原の又は一般にＨｅｌｉｏｓポリペプチドの
エピトープと特異的に反応性の抗体調製物好ましくはモノクローナル抗体調製物
をも包含する。
【００２１】 他の面において、この発明は、アミノ酸配列がＨｅｌｉｏｓポリペプチド又は
その類似体若しくは断片の配列を含み又は該配列であるポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を有し又は含む実質的に純粋な核酸を提供する。
【００２２】 好適具体例において、この核酸は、脊椎動物例えば哺乳動物例えばヒトのポリ
ペプチドをコードする。
【００２３】 好適具体例において、この核酸は、更なるＨｅｌｉｏｓコード配列をSEQ ID N
O:２、４又は６の５’側に含むＨｅｌｉｏｓポリペプチドをコードする。
【００２４】 好適具体例において、この核酸は、次の特性の少なくとも１つを有するポリペ
プチドをコードする：Ｈｅｌｉｏｓの少なくとも１つの生物学的活性例えばＨｅ
ｌｉｏｓポリペプチドに対する抗体又は抗体断片と特異的に反応性のポリペプチ
ド；SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO:６由来のアミノ酸配列と少なく
とも６０％、７４％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同なアミノ
酸配列；SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO:６のアミノ酸配列と本質的
に同じアミノ酸配列(そのポリペプチドは、少なくとも５、１０、２０、５０、 １００、１５０、２００又は２５０アミノ酸長である)；SEQ ID NO:２、SEQ ID
NO:４又はSEQ ID NO:６由来の少なくとも５の、好ましくは少なくとも１０の、 一層好ましくは少なくとも２０の、最も好ましくは少なくとも５０、１００、１
５０、２００又は２５０の隣接するアミノ酸；好ましくは少なくとも１０アミノ
酸長であるが１００アミノ酸長以下のアミノ酸配列；天然のＨｅｌｉｏｓポリペ
プチドの生物学的活性のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する能力。
【００２５】 好適具体例において：この核酸は、SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:３又はSEQ ID N
O:６のヌクレオチド配列であるか又は該配列を含み；この核酸は、SEQ ID NO:１
、SEQ ID NO:３又はSEQ ID NO:６の核酸配列と少なくとも６０％、７０％、７４
％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同であり；この核酸は、少な
くとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００又は１，０００塩
基長であるSEQ ID NO:１、SEQ ID NO:３又はSEQ ID NO:６の断片を含み；この核
酸は、遺伝コードの縮重のために、SEQ ID NO:１のヌクレオチド配列と異なる。
【００２６】 好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓをコードする核酸配列は、SEQ ID NO:
２のアミノ酸残基１〜５２６、SEQ ID NO:４の残基１〜５００、SEQ ID NO:６の
残基１〜５２６又は他の脊椎動物又は哺乳動物例えばサルのＨｅｌｉｏｓ配列中
の機能的に同等な残基をコードする。
【００２７】 好適具体例において、この核酸によりコードされるポリペプチドは、例えば、
天然の変異型又は野生型のＨｅｌｉｏｓポリペプチドの活性を増大させることの
できるアゴニストである。他の好適具体例において、コードされたポリペプチド
は、例えば、天然のＨｅｌｉｏｓポリペプチド(例えば、SEQ ID NO:２、SEQ ID
NO:４又はSEQ ID NO:６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド)の望ましく
ない活性を阻止するアンタゴニストである。
【００２８】 好適具体例において、このコードされたＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、アミノ
酸配列において、少なくとも１、２、３、５、１０残基(好ましくは、１５残基 未満)においてSEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO:６の配列と異なる。 しかしながら、これらの差異は、コードされたＨｅｌｉｏｓポリペプチドが天然
のＨｅｌｉｏｓポリペプチド(例えば、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID
NO:６のＨｅｌｉｏｓポリペプチド)の少なくとも１つの生物学的活性を示すよう
なものである。
【００２９】 好適具体例において、この核酸は、ここに記載のＨｅｌｉｏｓポリペプチド配
列並びに他のＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸配列を含むＨｅｌｉｏｓポリペプ
チドをコードする。
【００３０】 好適具体例において、この核酸は、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID N
O:６に示したアミノ酸配列の全部又は一部を、更なるアミノ酸残基に(好ましく は、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO:６からの配列をコードするゲノ
ムＤＮＡの５’側のゲノムＤＮＡによりコードされる残基に)読み枠で融合して 含むポリペプチドをコードする。
【００３１】 好適具体例において、このコードされたポリペプチドは、第１のＨｅｌｉｏｓ
ポリペプチド部分及び、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドに無関係のアミノ酸配列を有
する第２のポリペプチド部分を有する組換え融合蛋白質である。この第２のポリ
ペプチド部分は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；ＤＮＡ結合
ドメイン；又はポリメラーゼ活性化ドメインの何れであってもよい。好適具体例
において、この融合蛋白質を２ハイブリッドアッセイで用いることができる。
【００３２】 好適具体例において、このコードされたポリペプチドは、天然のＨｅｌｉｏｓ
ポリペプチドに特異的な抗体又はＦ(ab')2断片との反応性を阻害する天然のＨｅ
ｌｉｏｓポリペプチドの断片又は類似体である。
【００３３】 好適具体例において、この核酸は、転写調節用配列例えば転写プロモーター又
は転写エンハンサーの少なくとも一方(Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子配列に操作可能に結 合され、例えば、発現ベクターとしての利用に適したＨｅｌｉｏｓ遺伝子配列を
与える)を含む。
【００３４】 更に別の好適具体例において、この発明の核酸は、緊縮条件下で、SEQ ID NO:
１、SEQ ID NO:３又はSEQ ID NO:６からの少なくとも１２の連続するヌクレオチ
ドに、一層好ましくは、SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:３又はSEQ ID NO:６からの少
なくとも２０の連続するヌクレオチドに、一層好ましくは、SEQ ID NO:１、SEQ
ID NO:３又はSEQ ID NO:６からの少なくとも４０の連続するヌクレオチドに対応
する核酸プローブとハイブリダイズする。
【００３５】 好適具体例において、この核酸は、成熟蛋白質中に存在しない配列を含むＨｅ
ｌｉｏｓポリペプチドをコードする。
【００３６】 好適具体例において、この核酸は、下記の特性の少なくとも１つを有するＨｅ
ｌｉｏｓポリペプチドをコードする： (ａ)それは、Ｈｅｌｉｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ又はＩｋａｒｏｓポリペプチドとダ
イマーを形成し； (ｂ)それは、造血幹細胞で発現され； (ｃ)それは、約６４ｋＤａ又は６８ｋＤａの分子量を有し； (ｄ)それは、少なくとも１つのジンクフィンガードメインを有し；又は (ｅ)それは、リンパ球系遺伝子の転写アクチベーターである。
【００３７】 他の面において、この発明は：Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドをコードする核酸を
含むベクター；そのベクターでトランスフェクトされた宿主；及びその細胞を例
えば細胞培養培地中で培養してＨｅｌｉｏｓポリペプチドを例えばその細胞から
又は細胞培養培地から単離することを含む組換えＨｅｌｉｏｓポリペプチドの製
造方法を含む。
【００３８】 他の面において、この発明は、SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:３又はSEQ ID NO:６
に示したヌクレオチド配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７４％、８０
％、９０％、９５％、９８％又は９９％の相同性を有する精製された組換え核酸
を特徴とする。
【００３９】 この発明は又、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ又はプ
ライマーをも提供する。このオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:１、SEQ ID NO:
３若しくはSEQ ID NO:６又はこれらの天然の変異物からのセンス又はアンチセン
ス配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリダイズ
するヌクレオチド配列の領域を含む。好適具体例において、このプローブ又はプ
ライマーは、更に、それらに結合した標識基を含む。この標識基は、放射性同位
体、蛍光化合物、酵素及び／又は酵素補因子であってよい。好ましくは、このオ
リゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド長であり且つ２０、３０、５
０、１００又は１５０ヌクレオチド長未満である。
【００４０】 この発明は、この発明のポリペプチドをコードする核酸例えばＲＮＡ又はＤＮ
Ａを含む。これは、二本鎖核酸並びにコード鎖及びアンチセンス一本鎖を含む。
【００４１】 この発明は、脊椎動物例えば哺乳動物例えばゲッ歯動物例えばマウス若しくは
ラット、又はヒトのＨｅｌｉｏｓポリペプチドを包含する。
【００４２】 他の面において、この発明は、化合物を、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド例えばＨ
ｅｌｉｏｓモノマー又はＨｅｌｉｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓダイマー、Ｈｅｌｉｏｓ−
Ａｉｏｌｏｓダイマー若しくはＨｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓダイマーの活性と相
互作用する例えば結合し又は調節する(例えば、阻害し又は促進する)能力につい
て評価する方法を特徴とする。この方法は、化合物をＨｅｌｉｏｓポリペプチド
と接触させ、その化合物のＨｅｌｉｏｓポリペプチドと相互作用し又は複合体を
形成する能力を評価することを含む。この方法は、イン・ビトロで例えば無細胞
系で又はイン・ビボで例えば２ハイブリッド相互作用トラップアッセイで実施す
ることができる。この方法を用いて、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドと相互作用する
天然の分子を同定することができる。それを用いて、変異型又は野生型のＨｅｌ
ｉｏｓポリペプチドの天然の又は合成の阻害剤を見出すこともできる。この化合
物は、ペプチドであっても非ペプチド分子(例えば、好ましくは分子量５００〜 ５，０００の一層好ましくは分子量５００〜１，０００の種々の官能基で修飾さ
れた芳香族骨格例えばビス−アミドフェノールを有する小分子)であってもよい 。
【００４３】 簡単にいえば、２ハイブリッドアッセイ系(例えば、Bartel等(1993)Cellular
Interaction in Development: A practical Approach, D.A.Hartley編, Oxford
University Press, Oxford, p.153-179参照)は、酵母細胞における蛋白質−蛋白
質相互作用の検出を可能にする。公知の蛋白質(例えば、Ｈｅｌｉｏｓポリペプ チド)は、しばしば、「餌」蛋白質と呼ばれる。この餌蛋白質に対する結合につ いて試験される蛋白質は、しばしば、「魚」蛋白質と呼ばれる。この「餌」蛋白
質例えばＨｅｌｉｏｓポリペプチドは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合され
る。潜在的「魚」蛋白質は、ＧＡＬ４活性化ドメインに融合される。もし「餌」
蛋白質と「魚」蛋白質が相互作用するならば、これらの２つのＧＡＬ４ドメイン
が近位に運ばれて、それ故、宿主酵母細胞が特定の生育選択に生き残ることを可
能にする。
【００４４】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの活性な断片又は類
似体を同定する方法を特徴とする。この方法は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドと相
互作用する化合物例えばＩｋａｒｏｓペプチドを先ず同定し、候補の断片又は類
似体と結合するこの化合物の能力を測定することを含む。上記の２ハイブリッド
アッセイを用いて、断片結合性化合物を得ることができる。次いで、これらの化
合物を、魚に対する「餌」として用いて、これらの化合物と相互作用し、結合し
又は複合体を形成するＨｅｌｉｏｓポリペプチドの断片を同定することができる
。
【００４５】 他の面において、この発明は、非野生型活性を有するＨｅｌｉｏｓポリペプチ
ド(例えば、天然のＨｅｌｉｏｓポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニスト又 はスーパーアゴニスト)の製造方法を特徴とする。この方法は、Ｈｅｌｉｏｓポ リペプチド(例えば、SEQ ID NO:２、SEQ ID NO:４又はSEQ ID NO:６)の配列を例
えば非保存領域の少なくとも１つの残基の置換又は欠失によって変え、その変化
させたポリペプチドを所望の活性について試験することを含む
【００４６】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの断片又は類似体例
えば天然のＨｅｌｉｏｓポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を有する
Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの製造方法を特徴とする。この方法は、配列を例えば
少なくとも１つの残基(好ましくは、非保存的残基)の置換又は欠失により変化さ
せ、その変化させたポリペプチドを所望の活性について試験することを含む。
【００４７】 他の面において、この発明は、化合物を、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子調節配列をコー
ドする核酸と結合する能力について評価する方法を特徴とする。この方法は：化
合物をその核酸と接触させ；その化合物のその核酸と複合体を形成する能力を評
価することを含む。好適具体例において、このＨｅｌｉｏｓ遺伝子調節配列は、
異種遺伝子例えばレポーター遺伝子に機能的に結合される。
【００４８】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドをコードする核酸で
トランスフォームされたヒトの細胞例えば造血幹細胞又はリンパ球例えばＴ若し
くはＢ細胞を特徴とする。
【００４９】 他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック
動物又は病気例えば免疫系の病気例えばＢ若しくはＴ細胞に関係する病気のモデ
ル動物(例えば、ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス)の治療方法であって、治療上
有効な量のＨｅｌｉｏｓポリペプチドを動物に投与することを含む当該治療方法
を特徴とする。
【００５０】 他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック
動物又は免疫系の病気例えばＢ若しくはＴ細胞に関係する病気のモデル動物(例 えば、ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス) の治療方法を特徴とする。この方法は
、動物に、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の産物の発現について選択した細胞(例えば、イ ン・ビトロで選択した) 細胞例えば造血幹細胞例えばＨｅｌｉｏｓペプチドをコ
ードするＤＮＡでトランスフォームした細胞例えばＨｅｌｉｏｓペプチドをコー
ドするＤＮＡでトランスフォームした造血幹細胞を投与することを含む。
【００５１】 好適具体例において：これらの細胞は、それらを投与する動物から採取し；こ
れらの細胞は、それらを投与する動物とＭＨＣマッチの動物から採取し；これら
の細胞は、それらを投与する動物と同系の動物から採取し；これらの細胞は、そ
れらを投与する動物と同種の動物から採取する。
【００５２】 他の面において、この発明は、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トラン
スジェニック動物又は免疫系の病気例えばＢ若しくはＴ細胞に関係する病気のモ
デル動物(例えば、ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス) の治療方法を特徴とする 。この方法は、Ｈｅｌｉｏｓペプチドをコードする核酸を動物に投与して、その
核酸を発現させることを含む。
【００５３】 他の面において、この発明は、治療例えば造血を促進し又は阻害するようにデ
ザインされた治療の効果を評価する方法であって、その治療を実施してその治療
のＨｅｌｉｏｓ遺伝子の発現に対する効果を評価すること含む当該方法を特徴と
する。
【００５４】 好適具体例において、この治療を：動物例えばヒト、マウス、トランスジェニ
ック動物、又は免疫系の病気例えばＴ若しくはＢ細胞に関係する病気のモデル動
物(例えば、ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス)、又は細胞例えば培養幹細胞に施
与する。
【００５５】 他の面において、この発明は、患者(例えば、ヒト)がＨｅｌｉｏｓ遺伝子の誤
発現と関係する病気又は免疫系の病気例えば免疫不全又はＴ若しくはＢ細胞関連
疾患例えばＴ若しくはＢ細胞の不足を特徴とする病気の危険にあるかどうかを測
定する方法を特徴とする。この方法は、患者を、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の発現につ
いて調べることを含み、非野生型の発現又は誤発現は危険を示す。
【００５６】 他の面において、この発明は、患者(例えば、ヒト)がＨｅｌｉｏｓ遺伝子の誤
発現と関係する病気又は免疫系の病気例えば免疫不全又はＴ若しくはＢ細胞関連
疾患例えばＴ若しくはＢ細胞の不足を特徴とする病気の危険にあるかどうかを測
定する方法を特徴とする。この方法は、患者から核酸試料を準備して、その患者
のＨｅｌｉｏｓ遺伝子の対立遺伝子の構造が野生型と異なるかどうかを測定する
ことを含む。
【００５７】 好適具体例において：この測定は、患者のＨｅｌｉｏｓ遺伝子の対立遺伝子が
大きい染色体再配列を有するかどうかを測定することを含み；この測定は、患者
のＨｅｌｉｏｓ遺伝子を配列決定することを含む。
【００５８】 他の面において、この発明は、増殖性疾患例えば白血病、ホジキンリンパ腫、
皮膚細胞リンパ腫例えば皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又は免疫疾患例えばＴ細胞に関連
する病気例えばＴ若しくはＢ細胞の不足を特徴とする病気のモデル動物又は細胞
を評価する方法を特徴とする。この方法は、このモデル動物又は細胞中のＨｅｌ
ｉｏｓ遺伝子が予め決められたレベルで発現されるかどうか又はＨｅｌｉｏｓ遺
伝子が誤発現されるかどうかを測定することを含む。好適具体例において：この
予め決められたレベルは、野生型又は正常動物におけるレベルより低く；この予
め決められたレベルは、野生型又は正常動物におけるレベルより高く；又はイソ
型の発現パターンは、野生型から変化している。
【００５９】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンを有するトランス
ジェニック動物例えば哺乳動物例えばマウス又は非ヒト霊長類を特徴とする。
【００６０】 好適具体例において、この動物は、変異したＨｅｌｉｏｓトランスジーンを有
するトランスジェニック動物である(この変異は、例えば、ここに記載のＨｅｌ ｉｏｓ遺伝子の１つのドメインに生じ又はそれを変化させる)。
【００６１】 好適具体例において、このトランスジェニック動物例えばトランスジェニック
マウスは、ヌル突然変異についてホモ接合であり、例えば、それは、Ｈｅｌｉｏ
ｓ遺伝子座においてその蛋白質のＣ末端の欠失についてホモ接合である。
【００６２】 好適具体例において、このトランスジェニック動物例えばトランスジェニック
マウスは、ヌル突然変異についてホモ接合であり、例えば、それは、Ｈｅｌｉｏ
ｓ遺伝子座においてその蛋白質のＣ末端の欠失についてホモ接合であり且つＩｋ
ａｒｏｓ又はＡｉｏｌｏｓに突然変異(例えば、Ｉｋａｒｏｓ又はＡｉｏｌｏｓ における優性ネガティブ突然変異)を含む。好ましくは、このＩｋａｒｏｓ突然 変異は、ヘテロ接合である。
【００６３】 他の好適具体例において、このトランスジェニック動物又は細胞は：Ｈｅｌｉ
ｏｓトランスジーンについてヘテロ接合であり；Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンに
ついてホモ接合であり；第１のＨｅｌｉｏｓトランスジーン及び第２のＨｅｌｉ
ｏｓトランスジーンを含み；Ｈｅｌｉｏｓトランスジーン及びＨｅｌｉｏｓトラ
ンスジーン以外の第２のトランスジーン例えばＩｋａｒｏｓ又はＡｉｏｌｏｓト
ランスジーンを含む。
【００６４】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンを有するトランス
ジェニック細胞又は動物に対する治療の効果(例えば、免疫系の発達に対する治 療の効果)を評価する方法を特徴とする。この方法は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジ ーンを有する細胞又は動物に治療を施与して、その治療のその細胞又は動物に対
する効果を評価することを含む。この効果は、例えば、Ｈｅｌｉｏｓ又はＩｋａ
ｒｏｓの発現又は誤発現に対する；免疫系又はその構成要素に対する；又は細胞
周期に対する治療の効果であってよい。免疫系の効果は、例えば、Ｔ細胞活性化
、Ｔ細胞発生、免疫応答を開始する能力、免疫系の構成要素を生じさせる能力、
Ｂ細胞発生、ＮＫ細胞発生又は比ＣＤ４+／ＣＤ８+、ＣＤ４+／ＣＤ８-及びＣＤ
４-／ＣＤ８+を含む。
【００６５】 好適具体例において、この治療は：薬物、化学物質又は他の物質の投与；電離
放射線の施与；抗体例えば免疫系の分子又は細胞に対する抗体の投与；免疫系を
抑制する物質又は他の治療の施与；又は免疫系の機能を活性化し又は後援する物
質又は他の治療の施与；核酸例えば遺伝子産物例えば免疫系の構成要素をコード
し又は発現する核酸の導入；蛋白質例えば免疫系の構成要素である蛋白質の導入
を含んでよい。
【００６６】 他の面において、この発明は、免疫系構成要素に対する治療の効果を評価する
方法を特徴とする。この方法は：(１)Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンを有するトラ
ンスジェニック細胞又は動物を用意し；(２)免疫系構成要素を用意し；(３)治療
を施与し；そして(４)その治療の免疫系構成要素に対する効果を評価することを
含む。
【００６７】 更に別の面において、この発明は、第１の免疫系構成要素と第２の免疫系構成
要素との相互作用を評価する方法を特徴とする。この方法は：(１)Ｈｅｌｉｏｓ
トランスジーンを有するトランスジェニック細胞又は動物(例えば、哺乳動物)を
用意し；(２)第１及び第２の免疫系構成要素をトランスジェニック細胞又は哺乳
動物に導入し；そして(３)第１と第２の免疫系構成要素との間の相互作用を評価
することを含む。
【００６８】 他の面において、この方法は、免疫系の病気例えば新生物疾患、白血病又はリ
ンパ腫、Ｔ細胞関連リンパ腫に対する治療の効果を評価する方法であって、Ｈｅ
ｌｉｏｓトランスジーンを有する細胞又は動物に治療を施し、その細胞又は動物
に対する治療の効果を評価することを含む当該方法を特徴とする。この効果は、
例えば：Ｈｅｌｉｏｓ又はＩｋａｒｏｓの発現又は誤発現に対する；免疫系又は
その構成要素に対する；又は細胞周期に対する治療の効果であってよい。免疫系
の効果は、例えば、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞発生、免疫応答を開始する能力、免疫
系構成要素を生じさせる能力、Ｂ細胞発生、ＮＫ細胞発生、又は比ＣＤ４+／Ｃ Ｄ８+、ＣＤ４+／ＣＤ８-及びＣＤ４-／ＣＤ８+を含む。
【００６９】 これらの発明は又、Ｉｋａｒｏｓ及びＨｅｌｉｏｓが他のポリペプチドとダイ
マー(ヘテロダイマー)を形成することができるということをも発見した。例えば
、Ｉｋａｒｏｓポリペプチドは、Ｉｋａｒｏｓポリペプチドとだけでなく、その
Ｃ末端領域に結合する他のポリペプチド例えばジンクフィンガー領域を有する他
のポリペプチド(例えば、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド)ともダイマーを形成するこ
とができる。同様に、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドは、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド
とだけでなく、そのＣ末端領域に結合する他のポリペプチド例えばジンクフィン
ガー領域を有する他のポリペプチド(例えば、Ｉｋａｒｏｓポリペプチド)ともダ
イマーを形成することができる。
【００７０】 この発明は又、Ｉｋａｒｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓ又はＡｉｏｌｏｓ／Ｈｅｌｉｏｓ
ダイマーをも包含する。このダイマーのＩｋａｒｏｓメンバーは、任意のＩｋａ
ｒｏｓポリペプチド例えば任意の天然のＩｋａｒｏｓ又は米国特許出願第０８／
２３８，２１２号(１９９４年５月２日出願)(参考として、本明細書中に援用す る)において言及された任意のＩｋａｒｏｓであってよい。このダイマー中のＡ ｉｏｌｏｓメンバーは、任意のＡｉｏｌｏｓポリペプチド例えば任意の天然のＡ
ｉｏｌｏｓ又は米国特許出願第６０／００５，５２９号(１９９５年１０月１８ 日出願)(参考として、本明細書中に援用する)において言及された任意のＡｉｏ ｌｏｓであってよい。
【００７１】 この発明は又：精製されたＩｋａｒｏｓ又はＡｉｏｌｏｓ蛋白質をコードする
ＤＮＡ及び精製されたＨｅｌｉｏｓ蛋白質をコードするＤＮＡを含む細胞例えば
培養細胞又は幹細胞；Ｉｋａｒｏｓ及びＨｅｌｉｏｓ蛋白質を発現することので
きる細胞；トランスジェニック動物又は造血系細胞例えばリンパ球系細胞例えば
Ｔ細胞の均質集団を生じることのできる細胞；本質的に均質な細胞の集団(各細 胞は、精製されたＩｋａｒｏｓ又はＡｉｏｌｏｓ蛋白質をコードするＤＮＡ及び
精製されたＨｅｌｉｏｓ蛋白質をコードするＤＮＡを含む)；及びこの発明のＤ ＮＡ(好ましくは、精製されたＤＮＡ)を含む細胞を培地中で培養してこれらのペ
プチドを発現させることを含むこの発明のダイマーの製造方法をも包含する。
【００７２】 この発明は又：精製されたＩｋａｒｏｓ又はＡｉｏｌｏｓ蛋白質をコードする
ＤＮＡを含む細胞及び精製されたＨｅｌｉｏｓ蛋白質をコードするＤＮＡを含む
細胞を含む細胞調製物(例えば、培養細胞又は幹細胞の調製物)をも包含する。
【００７３】 この発明は又、Ｉｋａｒｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓダイマー又はＡｉｏｌｏｓＨｅｌ
ｉｏｓダイマーに対する抗体好ましくはモノクローナル抗体(これは、好ましく は、Ｉｋａｒｏｓ−Ｉｋａｒｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ−Ａｉｏｌｏｓ又はＨｅｌｉｏ
ｓ−Ｈｅｌｉｏｓダイマーには結合しない)の実質的に純粋な調製物；Ｉｋａｒ ｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓダイマー又はＡｉｏｌｏｓＨｅｌｉｏｓダイマー及び製薬上
許容し得るキャリアーを含む治療用組成物；この発明の純粋なＤＮＡ及び製薬上
許容し得るキャリアーを含む治療用組成物をも包含する。
【００７４】 他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック
動物、又は免疫系疾患例えばＴ若しくはＢ細胞関連疾患のモデル動物(例えば、 ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス)を治療する方法であって、治療上有効な量の Ｉｋａｒｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓ又はＡｉｏｌｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓダイマーをその動
物に投与することを含む当該方法を特徴とする。
【００７５】 他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック
動物、又は免疫系疾患例えばＴ若しくはＢ細胞関連疾患のモデル動物(例えば、 ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス)を治療する方法であって、その動物に、Ｉｋ ａｒｏｓ遺伝子及びＨｅｌｉｏｓ遺伝子の産物の発現について選択した(好まし くは、イン・ビトロで選択した)細胞例えば造血幹細胞例えばＩｋａｒｏｓ若し くはＡｉｏｌｏｓペプチドをコードするＤＮＡ及び又はＨｅｌｉｏｓペプチドを
コードするＤＮＡでトランスフォームした細胞例えばＩｋａｒｏｓ若しくはＡｉ
ｏｌｏｓ及び又はＨｅｌｉｏｓペプチドをコードするＤＮＡでトランスフォーム
した造血幹細胞を投与することを含む当該方法を特徴とする。このＩｋａｒｏｓ
Ａｉｏｌｏｓ又はＨｅｌｉｏｓＤＮＡは、同一細胞内に存在しても異なる細胞内
に存在してもよい。
【００７６】 好適具体例において：これらの細胞は、それらを投与する動物から採取し；こ
れらの細胞は、それらを投与する動物とＭＨＣマッチの動物から採取し；これら
の細胞は、それらを投与する動物と同系の動物から採取し；これらの細胞は、そ
れらを投与する動物と同じ種の動物から採取する。
【００７７】 他の面において、この発明は、動物例えばヒト、マウス、トランスジェニック
動物、又は免疫系疾患例えばＴ若しくはＢ細胞関連疾患のモデル動物(例えば、 ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス)を治療する方法であって、その動物に、Ｉｋ ａｒｏｓペプチドをコードする核酸とＨｅｌｉｏｓペプチドをコードする核酸を
投与して、それらの核酸を発現させることを含む。
【００７８】 他の面において、この発明は、治療例えば造血を促進し又は阻害するようにデ
ザインされた治療の効果を評価する方法であって、その治療を実施して、その治
療のＩｋａｒｏｓ又はＨｅｌｉｏｓ遺伝子の発現に対する効果を評価することを
含む当該方法を特徴とする。
【００７９】 好適具体例において、この治療を：動物例えばヒト、マウス、トランスジェニ
ック動物若しくは免疫系疾患例えばＴ若しくはＢ細胞関連疾患のモデル動物(例 えば、ヌードマウス又はＳＣＩＤマウス)又は細胞例えば培養幹細胞に施与する 。
【００８０】 他の面において、この発明は、患者例えばヒトが、Ｉｋａｒｏｓ遺伝子の誤発
現に関係する病気例えば白血病又は他の免疫系疾患例えば免疫不全又はＴ若しく
はＢ細胞関連疾患例えばＴ若しくはＢ細胞の不足を特徴とする病気の危険にある
かどうかを測定する方法であって、その患者をＩｋａｒｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓ又は
Ａｉｏｌｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓダイマーの発現について調べることを含む当該方法
(非野生型の発現又は誤発現が危険を示す)を特徴とする。
【００８１】 他の面において、この発明は、免疫疾患例えばＴ細胞関連疾患例えばＴ若しく
はＢ細胞の不足を特徴とする病気のモデル動物又は細胞を評価する方法であって
、そのモデル動物又は細胞中のＩｋａｒｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓ又はＡｉｏｌｏｓ−
Ｈｅｌｉｏｓダイマーが予め決めたレベルで発現されるかどうかを測定すること
を含む当該方法を特徴とする。好適具体例において：この予め決めたレベルは、
野生型又は正常の動物におけるレベルより低く；この予め決めたレベルは、野生
型又は正常の動物におけるレベルより高く；又はイソ型の発現パターンは、野生
型から変化している。
【００８２】 他の面において、この発明は、Ｉｋａｒｏｓ若しくはＡｉｏｌｏｓ遺伝子又は
Ｉｋａｒｏｓ若しくはＡｉｏｌｏｓ蛋白質をコードするＤＮＡ及びＨｅｌｉｏｓ
遺伝子又はＨｅｌｉｏｓ蛋白質をコードするＤＮＡを含むトランスジーンを有す
るトランスジェニックゲッ歯動物例えばマウスを特徴とする。好適具体例におい
て：このＩｋａｒｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ及び又はＨｅｌｉｏｓ遺伝子又はＤＮＡは
、欠失例えば少なくとも１つのエキソンの全部又は部分の欠失を含む。
【００８３】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座に少なくとも１つの突然
変異を有するＨｅｌｉｏｓを誤発現する細胞の培養方法を特徴とする。この細胞
は、例えば、造血細胞例えばＴリンパ球であってよい。この方法は：この細胞を
、哺乳動物(好ましくは、この細胞を最初に単離した哺乳動物とは異なる哺乳動 物)に導入し；そしてその細胞を培養することを含む。
【００８４】 好適具体例において、この方法は、更に：この細胞をその哺乳動物中で増殖さ
せることを含む。
【００８５】 好適具体例において：この哺乳動物は、非ヒト哺乳動物例えばブタ、非ヒト霊
長類例えばサル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウスである。
【００８６】 好適具体例において、この発明は、更に：Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞を分
裂させて、増殖統制解除された細胞例えばトランスフォームされたリンパ球を生
じさせ；多数の増殖統制解除された細胞例えばリンパ球又はトランスフォームさ
れたリンパ球(哺乳動物由来)を提供することを含む。
【００８７】 好適具体例において：この哺乳動物、細胞又はこれら両者は、Ｈｅｌｉｏｓ遺
伝子座においてヘテロ接合であり；この哺乳動物、細胞又はこれら両者は、Ｈｅ
ｌｉｏｓ遺伝子に突然変異(例えば、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の全部又は部分の点突 然変異又は欠失、例えば、ＤＮＡ結合領域における突然変異、例えば、Ｈｅｌｉ
ｏｓ蛋白質のＤＮＡ結合を媒介する４つのＮ末端ジンクフィンガー領域の少なく
とも１つの全部若しくは部分又はＨｅｌｉｏｓ蛋白質のダイマー形成を媒介する
２つのＣ末端ジンクフィンガー領域の少なくとも１つにおける点突然変異又は欠
失)を有し；この哺乳動物は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンについてヘテロ接合 であるか又はホモ接合であり；この哺乳動物、細胞又はこれら両者は、Ｈｅｌｉ
ｏｓ遺伝子の制御領域内に突然変異を有する。
【００８８】 好適具体例において：この哺乳動物、細胞又はこれら両者は、Ｈｅｌｉｏｓ遺
伝子に、転写活性化又はダイマー形成の一方又は両方を不活性化する突然変異例
えば点突然変異又は欠失を有する(これは、この蛋白質の半減期を減じ、又はＣ 末端ジンクフィンガードメインの一方若しくは両方を不活性化する)。
【００８９】 好適具体例において、この細胞(例えば、単一細胞)は、ヌル突然変異について
ホモ接合である(例えば、それは、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座において、その蛋白質 のＣ末端の欠失についてホモ接合である)。
【００９０】 好適具体例において、この細胞(例えば、マウス細胞)は、ヌル突然変異につい
てホモ接合である(例えば、それは、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座において、その蛋白 質のＣ末端の欠失についてホモ接合であり且つＩｋａｒｏｓに突然変異例えば優
性ネガティブ突然変異を含む)。好ましくは、このＩｋａｒｏｓ突然変異は、ヘ テロ接合である。
【００９１】 好適具体例において：Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞は、ホモ接合の変異型Ｈ
ｅｌｉｏｓ細胞例えばリンパ球であり；Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞は、Ｂリ
ンパ球であり；Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーン
についてヘテロ接合であるか又はホモ接合である。
【００９２】 好適具体例において、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞は、リンパ球であり且つ
少なくとも一の抗炎症性サイトカインを分泌する細胞であり；抗原又はイディオ
タイプ特異的な細胞である。
【００９３】 好適具体例において：哺乳動物を抗原で免疫化し；細胞を外因的に供給し、哺
乳動物又はこの細胞を提供する哺乳動物の一方又は両方を抗原で免疫化する。こ
の抗原は：同種異系抗原；異種抗原；自己抗原；蛋白質；又は抗イディオタイプ
リンパ球を生じさせる抗原であってよい。
【００９４】 好適具体例において：Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞(例えば、リンパ球)を、
外因的に哺乳動物に(例えば、ホモ接合の野生型Ｈｅｌｉｏｓ哺乳動物に又はＨ ｅｌｉｏｓ遺伝子に突然変異を有する哺乳動物例えばＨｅｌｉｏｓ遺伝子の全部
若しくは部分に点突然変異若しくは欠失を有する哺乳動物に)供給する。外因的 に供給するのであれば、この細胞は、ヒトの又は非ヒトの例えばブタの、非ヒト
霊長類例えばサルの、ヤギの、若しくはゲッ歯動物例えばラット若しくはマウス
のリンパ球であってよい。
【００９５】 Ｈｅｌｉｏｓ野生型細胞は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する哺乳動物中で培養する
ことができる。 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞の活性を調節す
る方法又は該細胞と標的組織若しくは細胞との相互作用を促進する方法を特徴と
する。この方法は：標的を準備して；その標的を、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細
胞例えば造血細胞例えばＴリンパ球(好ましくは、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座に少な くとも１つの変異型対立遺伝子を有する)にさらすことを含む(但し、好ましくは
、標的は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現せず；標的とこの細胞は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子
座以外の遺伝子座において遺伝子型が異なり；標的とこの細胞は、異なる動物に
由来し；標的とこの細胞は、異なる種に由来し；標的の活性は、レシピエント哺
乳動物において調節され且つ標的又はこの細胞の何れかがレシピエント哺乳動物
以外のドナー哺乳動物に由来し；又は標的は、この細胞に、イン・ビトロ系でさ
らされる)。
【００９６】 好適具体例において：Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞のドナーは、Ｈｅｌｉｏ
ｓトランスジーンについてヘテロ接合であるか又はホモ接合であり；Ｈｅｌｉｏ
ｓを誤発現する細胞のドナーは、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座においてヘテロ接合であ
り；Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞のドナーは、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の全部又は
部分に点突然変異又は欠失(例えば、ＤＮＡ結合領域における突然変異、例えば 、ＨｅｌｉｏｓのＤＮＡへの結合を媒介する４つのＮ末端ジンクフィンガー領域
の少なくとも１つの全部若しくは部分又はＨｅｌｉｏｓダイマー形成を媒介する
Ｃ末端ジンクフィンガー領域の一方若しくは両方における点突然変異又は欠失) を有し；Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞のドナーは、ヒト又は非ヒト哺乳動物例
えばブタ、サル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウスである。好
適具体例において、例えば、ヒトがドナーの場合、Ｈｅｌｉｏｓの統制解除例え
ばＨｅｌｉｏｓ障害を生じさせる操作を、イン・ビトロで行うことができる。
【００９７】 好適具体例において：Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞を提供する哺乳動物は、
Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子に、転写活性化又はダイマー形成の一方又は両方を不活性化
する突然変異例えば点突然変異又は欠失を有する(これは、この蛋白質の半減期 を減じ又はＣ末端ジンクフィンガードメインの一方若しくは両方を不活性化する
)。
【００９８】 他の好適具体例において：この細胞は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンについて
ヘテロ接合であるか又はホモ接合であり；この細胞は、ヘテロ接合のＨｅｌｉｏ
ｓ細胞であり；この細胞は、ホモ接合の変異型Ｈｅｌｉｏｓ細胞であり；このリ
ンパ球は、Ｔリンパ球である。
【００９９】 好適具体例において、この細胞は、リンパ球であり且つ：Ｔ細胞であり；少な
くとも一の抗炎症性サイトカインを分泌する細胞であり；抗原又はイディオタイ
プ特異的なＴ細胞である。
【０１００】 好適具体例において：この方法を、イン・ビトロ系で実施し；この方法を、イ
ン・ビボで例えば哺乳動物例えばゲッ歯動物例えばマウス若しくはラット又は霊
長類例えば非ヒト霊長類若しくはヒトにおいて実施する。この方法をイン・ビト
ロで実施するのであれば、標的細胞又は組織及びリンパ球のドナーは、同じであ
っても異なってもよい。この方法をイン・ビボで行うならば、一のレシピエント
動物と一以上のドナーが存在する。
【０１０１】 好適具体例において：この方法を、イン・ビボで、一以上の標的細胞又は組織
のレシピエント、ドナーで行い、この細胞のドナーを抗原で免疫化し；この方法
を、イン・ビトロで、一以上の標的細胞又は組織のドナーで行い、この細胞のド
ナーを抗原で免疫化する。この抗原は：同種異系抗原であってよく；異種抗原又
は自己抗原であってよく；蛋白質であってよく；又は抗イディオタイプリンパ球
を生じさせる抗原であってよい。
【０１０２】 好適具体例において：標的を、Ｔ若しくはＢリンパ球、マクロファージ、炎症
性白血球例えば好中球若しくは好酸球、単核食細胞、ＮＫ細胞又はＴリンパ球よ
りなる群から選択し；標的は、抗原提示細胞例えば専門の抗原提示細胞又は非専
門的抗原提示細胞であり；標的は、脾臓組織、骨髄組織、リンパ節組織又は胸腺
組織であり、又は標的は、同系の、異系の又は異種の組織である。
【０１０３】 他の好適具体例において、標的は、哺乳動物例えばヒトに由来し；哺乳動物は
、非ヒト哺乳動物例えばブタ、サル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しく
はマウスである。
【０１０４】 好適具体例において、調節される標的の活性は：サイトカインの産生であり；
免疫系の細胞の増殖又は活性化であり；抗体の産生であり；抗原提示細胞の溶解
又は細胞障害性Ｔリンパ球の活性化であり；感染抵抗性に対する標的の効果であ
り；寿命に対する標的の効果であり；体重に対する標的の効果であり；免疫系の
組織又は器官の存在、機能又は形態に対する標的の効果であり；刺激(例えば、 拡散性物質例えばサイトカイン、免疫系の他の細胞、又は器官)に応答する免疫 系の構成要素の能力に対する標的の効果であり；同種異系抗原又は異種抗原に対
する免疫寛容を示す能力に対する標的の効果である。
【０１０５】 好適具体例において、相互作用は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞により産生
された抗体と標的との結合である。
【０１０６】 好適具体例において：この標的と細胞は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座以外の遺伝子
座において遺伝子型が異なり；この標的と細胞は異なる動物に由来し；この標的
は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現しない。
【０１０７】 他の面において、この発明は、免疫系を再構成する方法を特徴とする。この方
法は：レシピエント哺乳動物を準備し、そのレシピエント哺乳動物に好ましくは
外因的にＨｅｌｉｏｓを誤発現するドナー哺乳動物(例えば、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝 子座に少なくとも１つの変異型対立遺伝子を有するもの)から免疫系構成要素を 導入することを含む。このレシピエント哺乳動物は、例えば、ヒト又は非ヒト哺
乳動物例えばブタ、非ヒト霊長類例えばサル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラッ
ト若しくはマウスであってよい。ドナー哺乳動物は、例えば、ヒト又は非ヒト哺
乳動物例えばブタ、サル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウスで
あってよい。もしドナー哺乳動物がヒトであるならば、Ｈｅｌｉｏｓの誤発現を
生じさせる操作(例えば、Ｈｅｌｉｏｓ障害の導入)をイン・ビトロで行うことが
できる。このドナー哺乳動物とレシピエント哺乳動物は、異なる個体であっても
同じ個体であってもよい。
【０１０８】 好適具体例において、この構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞例えば
造血細胞例えば多能性幹細胞、又は幹細胞の子孫例えばリンパ球であり又は該細
胞を含む。
【０１０９】 好適具体例において、この構成要素は、ドナー哺乳動物例えばヒト又は非ヒト
哺乳動物例えばブタ、サル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウス
に由来する。
【０１１０】 好適具体例において、この方法は、更に：構成要素を患者に導入する前に、リ
ンパ球を処理して、例えばこの構成要素を照射することにより増殖を阻害するこ
とを含む。
【０１１１】 好適具体例において、ドナー哺乳動物は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子に突然変異(例 えば、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の全部又は部分の欠失)を有する。
【０１１２】 他の好適具体例において：この免疫系構成要素は、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆細胞、
全能性造血幹細胞、多能性造血幹細胞、Ｂ細胞前駆細胞、ナチュラルキラー細胞
、ナチュラルキラー細胞前駆細胞、骨髄組織、脾臓組織又は胸腺組織の何れかで
ある。
【０１１３】 好適具体例において：この免疫系構成要素は、レシピエント哺乳動物と同じ種
に由来し；この免疫系構成要素は、レシピエント哺乳動物と異なる種に由来する
。
【０１１４】 好適具体例において：このレシピエント哺乳動物は、野生型動物であり；ヒト
の病気のモデル動物(例えば、ＮＯＤマウス)であり；この動物は、照射、化学療
法又は遺伝的欠損により免疫無防備状態であり(例えば、この動物は、ＳＣＩＤ マウス又はヌードマウスである)；このレシピエントは、免疫機能不全であり(例
えば、このレシピエントは、胸腺摘出されており、免疫系の構成要素例えば細胞
又は抗体が涸渇している)；このレシピエントは、化学療法又は照射を施与され てきている。
【０１１５】 好適具体例において：免疫系構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座においてヘテ
ロ接合であり；免疫系構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子に突然変異(例えば、Ｈ ｅｌｉｏｓ遺伝子の全部又は部分における点突然変異又は欠失、例えば、ＤＮＡ
結合領域内の突然変異、例えば、Ｈｅｌｉｏｓ蛋白質のＤＮＡ結合を媒介する４
つのＮ末端ジンクフィンガー領域の少なくとも１つの全部若しくは部分又はＨｅ
ｌｉｏｓ蛋白質のダイマー形成を媒介する２つのＣ末端ジンクフィンガー領域の
少なくとも１つにおける点突然変異又は欠失)を有し；免疫系構成要素は、Ｈｅ ｌｉｏｓトランスジーンについてヘテロ接合又はホモ接合であり；免疫系成分は
、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の制御領域内に突然変異を有する。
【０１１６】 好適具体例において：免疫系構成要素は、Ａｉｏｌｏｓ遺伝子座に、転写活性
化又はダイマー形成の一方又は両方を不活性化する突然変異例えば点突然変異又
は欠失を有する(これは、この蛋白質の半減期を減じ、又はＣ末端ジンクフィン ガードメインの一方若しくは両方を不活性化する)。
【０１１７】 好適具体例において：この方法をイン・ビボで実施し、レシピエント哺乳動物
若しくはドナー哺乳動物又はその両者を抗原で免疫化する。この抗原は：同種異
系抗原であってよく；異種抗原又は自己抗原であってよく；蛋白質であってよく
；又は抗イディオタイプリンパ球を生じさせる抗原であってよい。
【０１１８】 好適具体例において、この方法は、更に：免疫系機能に関係するパラメーター
の値を測定することを含む。この免疫系機能に関係するパラメーターは：サイト
カインの産生；免疫系の細胞の増殖又は活性化；抗体の産生；抗原提示細胞の溶
解又は細胞溶解性Ｔリンパ球の活性化；感染抵抗性；寿命；体重；免疫系の組織
又は器官の存在、機能又は形態；刺激(例えば、拡散性物質例えばサイトカイン 、免疫系の他の細胞、又は抗原)に応答する免疫系構成要素の能力；抗原を提示 する能力；同種異系抗原又は異種抗原に対する免疫寛容を示す能力の何れであっ
てもよい。
【０１１９】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞例えば造血細胞
例えばＴリンパ球と免疫系成分との相互作用を評価する方法を特徴とする。この
方法は：動物例えばブタ、非ヒト霊長類例えばサル、ヤギ、又はゲッ歯動物例え
ばラット若しくはマウスを準備し；細胞及び免疫系構成要素をその動物に導入し
；そしてＨｅｌｉｏｓを誤発現する細胞と免疫系構成要素との間の相互作用を評
価することを含む。
【０１２０】 好適具体例において、この方法は、更に：細胞の患者への導入の前に、リンパ
球を処理して増殖を阻止する(例えば、細胞を照射することによる)ことを含む。
【０１２１】 好適具体例において：免疫系構成要素は、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆細胞、全能性造
血幹細胞、多能性造血幹細胞、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆細胞、ナチュラルキラー細胞
、ナチュラルキラー細胞前駆細胞、骨髄組織、脾臓組織、又は胸腺組織の何れか
であり；免疫系構成要素は、動物と同じ種に由来し；免疫系構成要素は、動物と
異なる種に由来し；免疫系構成要素は、リンパ球と同じ種に由来し；免疫系構成
要素は、リンパ球が得られる種と異なる種に由来する。
【０１２２】 他の好適具体例において：この細胞は、動物と同じ種に由来し；この細胞は、
動物の種と異なる種に由来する。
【０１２３】 他の好適具体例において：レシピエント哺乳動物は、野生型動物であり；ヒト
の病気のモデル動物(例えば、ＮＯＤマウス)であり；動物は、照射、化学療法又
は遺伝的欠損により免疫無防備状態であり(例えば、動物は、ＳＣＩＤマウス又 はヌードマウスである)；レシピエントは、免疫機能不全であり(例えば、レシピ
エントは、胸腺摘出されており、免疫系構成要素例えば細胞又は抗体が涸渇して
いる)；レシピエントは、化学療法又は照射を施与されてきている。
【０１２４】 好適具体例において：細胞は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンについてヘテロ接
合であるか又はホモ接合である。
【０１２５】 好適具体例において、評価は：サイトカインの産生；免疫系の細胞の増殖又は
活性化；抗体の産生；抗原提示細胞の溶解又は細胞溶解性Ｔリンパ球の活性化；
感染抵抗性；寿命；体重；免疫系の組織又は器官の存在、機能又は形態；刺激( 例えば、拡散性物質例えばサイトカイン、免疫系の他の細胞、又は抗原)に応答 する免疫系構成要素の能力；抗原を提示する能力；同種異系抗原又は異種抗原に
対する免疫慣用を示す能力の何れかを評価することを含む。
【０１２６】 好適具体例において：この方法をイン・ビボで実施し、動物、Ｈｅｌｉｏｓを
誤発現する細胞のドナー、免疫系構成要素のドナーの少なくとも一を抗原で免役
化する。この抗原は：同種異系抗原であってよく；異種抗原又は自己抗原であっ
てよく；蛋白質であってよく；又は抗イディオタイプリンパ球を生じさせる抗原
であってよい。
【０１２７】 他の面において、この発明は、外因的に導入された免疫系構成要素を有する哺
乳動物例えば非ヒト哺乳動物例えばブタ、非ヒト霊長類例えばサル、ヤギ、又は
ゲッ歯動物例えばラット若しくはマウスであって、該構成要素が、ヒト又は非ヒ
ト哺乳動物例えばブタ、非ヒト霊長類例えばサル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えば
ラット若しくはマウス、又はＨｅｌｉｏｓを誤発現し若しくはＨｅｌｉｏｓ遺伝
子座に少なくとも１つの変異型対立遺伝子を有する細胞培養物に由来する上記の
哺乳動物を特徴とする。好適具体例において、例えば、もし免疫系構成要素が野
生型動物例えばヒトに由来するならば、Ｈｅｌｉｏｓ統制解除(例えば、Ｈｅｌ ｉｏｓ障害)を生じさせる操作をイン・ビトロで行うことができる。
【０１２８】 好適具体例において、この構成要素は、ヒト又は非ヒト哺乳動物例えばブタ、
非ヒト霊長類例えばサル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウス( Ｈｅｌｉｏｓを誤発現するもの)に由来する。
【０１２９】 好適具体例において：この構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する哺乳動物に
由来し；この構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座においてヘテロ接合である哺乳
動物に由来し；この構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子に突然変異(例えば、Ｈｅ ｌｉｏｓ遺伝子の全部又は部分における点突然変異又は欠失、例えば、ＤＮＡ結
合領域における突然変異、例えば、Ｈｅｌｉｏｓ蛋白質のＤＮＡ結合を媒介する
４つのＮ末端ジンクフィンガー領域の少なくとも１つの全部若しくは部分又はＨ
ｅｌｉｏｓ蛋白質のダイマー形成を媒介する２つのＣ末端ジンクフィンガー領域
の少なくとも１つにおける点突然変異又は欠失)を有する哺乳動物に由来し；こ の構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンについてヘテロ接合又はホモ接合で
ある哺乳動物に由来し；この構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の制御領域内に突
然変異を有する哺乳動物に由来する。
【０１３０】 好適具体例において：この構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子に転写活性化又は
ダイマー形成の一方又は両方を不活性化する突然変異例えば点突然変異又は欠失
を有する(これは、この蛋白質の半減期を減じ、又はＣ末端ジンクフィンガード メインの一方若しくは両方を不活性化する)哺乳動物に由来する。
【０１３１】 好適具体例において、免疫系構成要素は：ヘルパーＴ細胞であり；細胞傷害性
Ｔ細胞であり；サプレッサーＴ細胞であり；少なくとも一の抗炎症性サイトカイ
ン例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０又はＩＬ−１３を分泌するＴ細胞であり；抗原又
はイディオタイプ特異的なＴ細胞であり；自己抗体に対して又は同種異系若しく
は異種移植片組織を認識する抗体に対して抗イディオタイプであるサプレッサー
Ｔ細胞であり；このリンパ球は、抗原非特異的Ｔ細胞である。
【０１３２】 他の好適具体例において：免疫系構成要素は、Ｔ細胞前駆細胞、全能性造血幹
細胞、多能性造血幹細胞、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆細胞、ナチュラルキラー細胞、ナ
チュラルキラー細胞前駆細胞、骨髄組織、脾臓組織、または胸腺組織の何れかで
あり；免疫系構成要素は、動物と同じ種に由来し；免疫系構成要素は、動物と異
なる種に由来する。
【０１３３】 好適具体例において：哺乳動物若しくは免疫系構成要素を生成するドナー動物
又は両者を抗原で免疫化する。この抗原は：同種異系抗原であってよく；異種抗
原又は自己抗原であってよく；蛋白質であってよく；抗イディオタイプリンパ球
を生じさせる抗原であってよい。
【０１３４】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞を含み又はＨｅ
ｌｉｏｓを誤発現し若しくはＨｅｌｉｏｓ遺伝子座に少なくとも１つの変異型対
立遺伝子を有する動物若しくは細胞培養物に由来する免疫系構成要素及び標的組
織又は細胞を含む反応混合物好ましくはイン・ビトロ反応混合物を特徴とし(好 ましくは、この免疫系構成要素と標的は、Ｈｅｌｉｏｓ又はＩｋａｒｏｓ遺伝子
座以外の遺伝子座において、遺伝子型が異なる)；この構成要素と標的は、異な る種に由来し、又はこの構成要素と標的は、異なる動物に由来する。
【０１３５】 好適具体例において、この構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する動物又は細
胞培養物に由来する。
【０１３６】 好適具体例において：免疫系構成要素は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーン例えば
転写活性化又はダイマー形成の一方又は両方を不活性化する点突然変異又は欠失
(これは、この蛋白質の半減期を減じ、又はＣ末端ジンクフィンガードメインの 一方若しくは両方を不活性化する)を有するトランスジーンについてヘテロ接合 又はホモ接合であるリンパ球であり；免疫系構成要素は、Ｃ末端欠失についてヘ
テロ接合又はホモ接合であるリンパ球である。
【０１３７】 好適具体例において、免疫系構成要素は：Ｂ細胞である。 他の好適具体例において：免疫系構成要素は、Ｔ細胞前駆細胞、全能性造血幹
細胞、多能性造血幹細胞、Ｂ細胞、Ｂ細胞前駆細胞、ナチュラルキラー細胞、ナ
チュラルキラー細胞前駆細胞、骨髄組織、脾臓組織又は胸腺組織の何れかであり
；免疫系構成要素は、標的細胞と同じ種に由来し；免疫系構成要素は、標的細胞
の種と異なる種に由来する。
【０１３８】 好適具体例において：標的を、Ｔ若しくはＢリンパ球、マクロファージ、炎症
性白血球例えば好中球若しくは好酸球、単核食細胞、ＮＫ細胞又はＴリンパ球よ
りなる群から選択し；標的は、抗原提示細胞例えば専門的抗原提示細胞又は非専
門的抗原提示細胞であり；標的は、脾臓組織、リンパ節組織、骨髄組織又は胸腺
組織であり、又は同系、同種異系、異種若しくは類似遺伝子の組織である。
【０１３９】 好適具体例において：免疫系構成要素のドナー若しくは標的のドナー又は両者
を抗原で免疫化する。この抗原は：同種異系抗原であってよく；異種抗原又は自
己抗原であってよく；蛋白質であってよく；又は抗イディオタイプリンパ球を生
じさせる抗原であってよい。
【０１４０】 好適具体例において、この構成要素のドナーは：ヒト又は非ヒト哺乳動物例え
ばブタ、非ヒト霊長類例えばサル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくは
マウスである。好適具体例において、例えば、野生型ドナー例えばヒトの場合、
Ｈｅｌｉｏｓ統制解除(例えば、Ｈｅｌｉｏｓ障害)を生じさせる操作をイン・ビ
トロで導入することができる。
【０１４１】 好適具体例において、標的のドナーは：ヒト又は非ヒト哺乳動物例えばブタ、
非ヒト霊長類例えばサル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウスで
ある。
【０１４２】 好適具体例において、この反応混合物は、外来的に加えたサイトカイン又は抗
原例えば蛋白質抗原を含む。
【０１４３】 他の面において、この発明は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンを含むか、或は、
Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子を誤発現する細胞又は細胞の精製された調製物を特徴とする
。この細胞調製物は、ヒト又は非ヒト細胞例えばゲッ歯動物細胞例えばマウス若
しくはラット細胞、ウサギ細胞、又はブタ細胞からなるものであってよい。好適
具体例において、この(又は、これらの)細胞は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーン例
えば異種形態のＨｅｌｉｏｓ遺伝子例えばヒト由来の遺伝子を含む(非ヒト細胞 の場合)。このＨｅｌｉｏｓトランスジーンは、誤発現(例えば、過剰発現又は過
少発現)され得る。他の好適具体例において、この(又は、これらの)細胞は、内 因性Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子を誤発現する遺伝子(例えば、発現が破壊された遺伝子 、例えばノックアウト)を含む。かかる細胞は、変異した若しくは誤発現される Ｈｅｌｉｏｓ対立遺伝子に関係する病気の研究のためのモデルとして又は薬物ス
クリーニングにおける利用のために役立ち得る。
【０１４４】 他の面において、この発明は、抗体(例えば、ポリクローナル又はモノクロー ナル抗体)を与える方法を特徴とする。その方法は、下記の含む： Ｈｅｌｉｏｓ統制解除された細胞例えばＨｅｌｉｏｓを誤発現する(好ましく は、過少発現する)細胞(例えば、造血細胞)を有する哺乳動物例えばマウスを準 備し；そして その動物又はその動物に由来する細胞(例えば、ハイブリドーマ)から抗体を単
離する。
【０１４５】 好適具体例において：哺乳動物を抗原で免疫化し；細胞を外因的に供給し、哺
乳動物又は細胞を提供する哺乳動物の一方又は両方を抗原で免疫化する。この抗
原は：同種異系抗原であってよく；異種抗原であってよく；自己抗原であってよ
く；蛋白質であってよく；又は抗イディオタイプリンパ球を生じさせる抗原であ
ってよい。好適具体例において、この抗原は、自己抗原であり且つ動物を免疫化
しない。
【０１４６】 好適具体例において：この哺乳動物は、非ヒト哺乳動物例えばブタ、非ヒト霊
長類例えばサル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウスである。
【０１４７】 好適具体例において、この方法は、更に：Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞を分
裂させ、増殖統制解除された又は抗体を産生する細胞(例えば、リンパ球)を生じ
させることを含む。
【０１４８】 好適具体例において：増殖統制解除された又は抗体を産生する細胞例えばリン
パ球例えばトランスフォームされたリンパ球は、哺乳動物のリンパ腫から単離さ
れる。
【０１４９】 好適具体例において：この哺乳動物は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子に突然変異(例え ば、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の全部又は部分における点突然変異又は欠失、例えば、
ＤＮＡ結合領域における突然変異、例えば、Ｈｅｌｉｏｓ蛋白質のＤＮＡ結合を
媒介する４つのＮ末端ジンクフィンガー領域の少なくとも１つの全部若しくは部
分又はＨｅｌｉｏｓ蛋白質のダイマー形成を媒介する２つのＣ末端ジンクフィン
ガー領域の少なくとも１つにおける点突然変異又は欠失)を有し；この哺乳動物 は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の制御領域内に突然変異を有する。
【０１５０】 好適具体例において、この哺乳動物例えばマウスは、ヌル突然変異についてホ
モ接合であり、例えば、それは、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座において、この蛋白質の
Ｃ末端の欠失についてホモ接合である。
【０１５１】 好適具体例において、この哺乳動物例えばマウスは、ヌル突然変異についてホ
モ接合であり、例えば、それは、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座において、この蛋白質の
Ｃ末端の欠失についてホモ接合であり且つＩｋａｒｏｓに突然変異(例えば、Ｉ ｋａｒｏｓにおける優性ネガティブ突然変異)を含む。好ましくは、このＩｋａ ｒｏｓ突然変異は、ヘテロ接合である。
【０１５２】 好適具体例において：この哺乳動物は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子に、転写活性化又
はダイマー形成の一方又は両方を不活性化するホモ接合の突然変異例えば点突然
変異又は欠失を有する(これは、この蛋白質の半減期を減じ、又はＣ末端ジンク フィンガードメインの一方若しくは両方を不活性化する)。
【０１５３】 好適具体例において：増殖統制解除された又は抗体を産生する細胞は、ホモ接
合の変異型Ｈｅｌｉｏｓ細胞例えばリンパ球であり；増殖統制解除された又は抗
体を産生するリンパ球は、Ｂリンパ球であり；増殖統制解除された又は抗体を産
生する細胞は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンについてヘテロ接合又はホモ接合で
ある。
【０１５４】 好適具体例において、この細胞は、リンパ球であり且つ：少なくとも一の抗炎
症性サイトカインを分泌する細胞であり；抗原又はイディオタイプ特異的な細胞
であり；抗体例えばＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＥ抗体を産生し又は過剰産生する細
胞である。
【０１５５】 好適具体例において：Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する細胞(例えば、リンパ球)を、
外因的に、哺乳動物に、例えば、ホモ接合の野生型Ｈｅｌｉｏｓ哺乳動物又はＨ
ｅｌｉｏｓ遺伝子に突然変異(例えば、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の全部又は部分にお ける点突然変異又は欠失)を有する哺乳動物に供給する。外因的に供給するので あれば、その細胞は、ヒトの又は非ヒトの、例えばブタ、非ヒト霊長類例えばサ
ル、ヤギ、又はゲッ歯動物例えばラット若しくはマウスのリンパ球であってよい
。この外因的に供給される細胞は、ヌル突然変異についてホモ接合であってよく
、例えば、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座において、その蛋白質のＣ末端の欠失について
ホモ接合であってよい。この外因的に供給される細胞は、ヌル突然変異について
ホモ接合であり、例えば、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座において、その蛋白質のＣ末端
の欠失についてホモ接合であり且つＩｋａｒｏｓに突然変異(例えば、Ｉｋａｒ ｏｓにおける優性ネガティブ突然変異)を含んでよい。好ましくは、このＩｋａ ｒｏｓ突然変異は、ヘテロ接合である。
【０１５６】 好適具体例において、この方法は、更に、少なくとも１つの細胞例えばリンパ
球を哺乳動物から単離して、その(それらの)細胞を増殖させて、細胞(例えば、 リンパ球)の単クローン性集団とすることを含む。
【０１５７】 好適具体例において、この方法は、更に、少なくとも１つの細胞例えばリンパ
球を哺乳動物から単離して、その(それらの)細胞を増殖させて、細胞(例えば、 リンパ球)の単クローン性集団とすること及びそれから抗体を単離することを含 む。
【０１５８】 好適具体例において、この動物からの細胞を、第２の細胞と融合させて、ハイ
ブリドーマを与える。
【０１５９】 好適具体例において、この動物からの細胞を、第２の細胞と融合させて、ハイ
ブリドーマを与え、そのハイブリドーマから抗体を単離する。
【０１６０】 この発明の方法により処理した細胞例えば幹細胞を、哺乳動物例えばヒト、非
ヒト霊長類その他の哺乳動物例えばゲッ歯動物に導入することができる。好適具
体例において、この処理を、エキス・ビボで行い且つ：この細胞は、自家性であ
り、例えばそれは、それが得られた同じ個体に戻され；この細胞は、同種異系で
あり、即ちそれは、それが投与される哺乳動物と同じ種に由来し；この細胞は、
異種性であり、即ちそれは、それが投与される哺乳動物と異なる種に由来する。
【０１６１】 Ｈｅｌｉｏｓ統制解除された細胞は、変異型の又は誤発現されるＨｅｌｉｏｓ
遺伝子(例えば、不活性化されたＨｅｌｉｏｓ遺伝子)を有する細胞である。
【０１６２】 造血細胞は、例えば幹細胞例えば全能性若しくは多能性幹細胞、又は幹細胞の
子孫例えばリンパ球例えばＢリンパ球若しくはＴリンパ球であってよい。
【０１６３】 Ｈｅｌｉｏｓを誤発現する動物は、ここで用いる場合、少なくとも１つの、好
ましくは実質的にすべての細胞がＨｅｌｉｏｓを誤発現する動物である。
【０１６４】 Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子座における突然変異は、ここで用いる場合、Ｈｅｌｉｏｓ
遺伝子又はその遺伝子産物の発現、構造又は活性を変える任意の突然変異を含む
。これらは、Ｈｅｌｉｏｓのコード領域又は制御領域の全部又は部分の点突然変
異及び特に欠失を含む。
【０１６５】 外因的に供給された細胞、組織又は細胞生成物(例えば、サイトカイン)は、こ
こで用いる場合、それが供給され又は投与された動物以外の動物に由来する細胞
、組織又は細胞生成物である。それは、それが供給される動物と同じ種に由来し
てもよいし、異なる種に由来してもよい。
【０１６６】 ２つ以上の細胞(例えば、リンパ球)の実質的に均質な集団は、ここで用いる場
合、細胞の少なくとも５０％、一層好ましくは少なくとも７０％、一層好ましく
は少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％又は９９％が主
題の細胞型(例えば、リンパ球)である細胞の集団を意味する。しかしながら、Ｈ
ｅｌｉｏｓ遺伝子座に関しては、これらの細胞は、すべて(＋／−)、すべて(− ／−)、又は(＋／−)細胞と(−／−)細胞との混合物であってよい。
【０１６７】 培養は、ここで用いる場合、細胞又は組織を、その細胞又は組織の生存力を支
持し且つ好ましくはその細胞又は組織の増殖を支持する環境に接触させることを
意味する。
【０１６８】 細胞(例えば、リンパ球)の実質的に精製された調製物は、ここで用いる場合、
細胞の少なくとも５０％、一層好ましくは少なくとも７０％、一層好ましくは少
なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％又は９９％が主題細
胞(例えば、リンパ球)である細胞の調製物を意味する。しかしながら、Ｈｅｌｉ
ｏｓ遺伝子座に関しては、これらの細胞は、すべて(＋／−)、すべて(−／−)、
又は(＋／−)細胞と(−／−)細胞との混合物であってよい。
【０１６９】 免疫無防備状態化されたとは、ここで用いる場合、免疫系の少なくとも一面が
野生型哺乳動物において認められるレベルより低レベルで機能する哺乳動物をい
う。この哺乳動物は、化学療法により、照射により、又は例えばヌード、ベージ
ュ、ヌードベージュ若しくはＩｋａｒｏｓ表現型を生じる遺伝的欠損により免疫
無防備状態化され得る。この哺乳動物は又、後天的疾患により、例えばウイルス
により、例えばＨＩＶによっても免疫無防備状態化され得る。
【０１７０】 ここで用いる場合、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンは、Ｈｅｌｉｏｓコード配列
又は調節配列の全部又は部分を含むトランスジーンである。この用語は又、ゲノ
ムに組み込まれた場合にＨｅｌｉｏｓ遺伝子座を破壊するか或は突然変異を誘発
するＤＮＡ配列をも包含する。組み込まれたときにＨｅｌｉｏｓ遺伝子の全部又
は部分の欠失を生じるＨｅｌｉｏｓトランスジーン配列。組込みに際して内因性
Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の誤発現を生じ；組込みに際して細胞中のＨｅｌｉｏｓ遺伝
子の更なるコピーを生じ；組込みに際して非Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子をＨｅｌｉｏｓ
調節領域の制御下に置くトランスジーンが包含される。Ｈｅｌｉｏｓトランスジ
ーンの誤発現(野生型と比べて)を生じる突然変異例えば欠失その他の突然変異を
有するＨｅｌｉｏｓ遺伝子のコピーを含み；Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の機能的コピー
(即ち、野生型の活性例えばＴ、Ｂ又はＮＫ細胞の発生を支持する能力の少なく とも５％を有する配列)を含み；機能的(即ち、野生型活性の少なくとも５％例え
ば転写の野生型レベルの少なくとも５％を有する)又は非機能的(即ち、野生型活
性の５％未満例えば転写の野生型レベルの５％未満を有する)Ｈｅｌｉｏｓ調節 領域{これは、(適宜)野生型若しくは変異型Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子産物又はＨｅｌ ｉｏｓ遺伝子産物以外の遺伝子産物(例えば、レポーター遺伝子、毒素遺伝子又 はＨｅｌｉｏｓが発現される組織又は発生ステージで発現されるべき遺伝子)を コードする核酸配列に操作可能に結合され得る}を含むトランスジーンも包含さ れる。好ましくは、このトランスジーンは、天然のＨｅｌｉｏｓ配列と少なくと
も５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９９％の相同性を有する少なくとも
１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１，０００又は２，
０００塩基対を含む。好ましくは、このトランスジーンは、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子
のエキソン３及び４の全部又は幾らかに欠失を含み、又はＨｅｌｉｏｓ遺伝子の
エキソン７の幾らか若しくは全部に欠失を含む。
【０１７１】 「異種プロモーター」は、ここで用いる場合、自然においてＨｅｌｉｏｓ遺伝
子と結合されていないプロモーターである。
【０１７２】 Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド又はその断片若しくは類似体(或はＨｅｌｉｏｓ− Ｈｅｌｉｏｓ又はＨｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓダイマー)の「精製された調製物 」又は「実質的に純粋な調製物」は、ここで用いる場合、Ｈｅｌｉｏｓポリペプ
チド(或はＨｅｌｉｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓ又はＨｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓダイマ ー)が自然において共存している少なくとも一種の蛋白質脂質及び核酸を含まな いＨｅｌｉｏｓポリペプチド又はその断片若しくは類似体(或はＨｅｌｉｏｓ− Ｈｅｌｉｏｓ又はＨｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓダイマー)を意味する。好ましく は、このポリペプチド又はその断片若しくは類似体(或はＨｅｌｉｏｓ−Ｈｅｌ ｉｏｓ又はＨｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓダイマー)は又、それを精製するために 用いられた物質例えば抗体又はゲルマトリクス(例えば、ポリアクリルアミド)か
らも分離されている。好ましくは、このポリペプチド又はその断片若しくは類似
体(或は、Ｈｅｌｉｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓ又はＨｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓダイマ ー)は、精製された調製物の少なくとも１０、２０、５０、７０、８０又は９５ 重量％(乾量)を構成する。好ましくは、この調製物は：蛋白質の配列決定を可能
にするのに十分なポリペプチドを含有し；少なくとも１、１０又は１００ｇのポ
リペプチドを含有し；少なくとも１、１０又は１００ｍｇのポリペプチドを含有
する。
【０１７３】 「細胞の精製された調製物」は、ここで用いる場合、植物又は動物細胞の場合
には、細胞のイン・ビトロ調製物をいい、完全な無傷の植物又は動物をいうので
はない。培養細胞又は微生物細胞の場合には、それは、少なくとも１０％の、一
層好ましくは少なくとも５０％の主題細胞の調製物よりなる。
【０１７４】 「処理」は、ここで用いる場合、任意の治療的処理例えば治療剤又は治療用物
質(例えば、薬物)の投与を包含する。
【０１７５】 「実質的に純粋な核酸」例えばＨｅｌｉｏｓポリペプチドをコードする実質的
に純粋なＤＮＡは、次の一方又は両方である核酸である：その核酸が得られた生
物の天然のゲノム中でそれが直接に隣接しているコード鎖(即ち、５’末端側の ものと３’末端側のもの)の一方又は両方と直接に隣接せず；又はその核酸が得 られた生物中で共存していた核酸配列を実質的に含まない。この用語は、例えば
、ベクター中に(例えば、自律的に複製するプラスミド若しくはウイルス中に、 又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に)取り込まれた組換えＤＮＡ 、又は他のＤＮＡ配列とは独立して別個の分子として存在する組換えＤＮＡ(例 えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたｃＤＮＡ又はゲ
ノムＤＮＡ断片)を包含する。実質的に純粋なＤＮＡは又、更なるＨｅｌｉｏｓ 配列をコードする雑種遺伝子の部分である組換えＤＮＡをも包含する。
【０１７６】 「相同」は、ここで用いる場合、２つのポリペプチド分子間又は２つの核酸分
子間の配列類似性をいう。２つの比較される配列の両方の１つの位置が同じ塩基
又はアミノ酸モノマーサブユニットで占められているならば、例えば２つのＤＮ
Ａ分子の各々の１つの位置がアデニンで占められているならば、それらの分子は
、その位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、それら２つの
配列に共有されるマッチし又は相同な位置の数を比較された位置の数で除して１
００倍したものの関数である。例えば、２つの配列中の１０の位置の内の６がマ
ッチし又は相同であるならば、これらの２つの配列は、６０％相同である。例と
して、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは、５０％相同性を共有する。一
般に、比較は、２つの配列を最大の相同性を与えるように整列させて行う。
【０１７７】 ２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の相同性パーセントを測定するには、それ
らの配列を最適の比較目的のために整列させる(例えば、第１のアミノ酸又は核 酸配列中にギャップを導入して第２のアミノ酸又は核酸配列との最適のアライン
メントとすることができる)。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド 位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。一方の配列(SEQ ID NO:２)中
の１つの位置が他方の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチ
ドで占められているならば、これらの分子は、その位置で相同である(即ち、こ こで用いる場合、アミノ酸又は核酸の「相同性」は、アミノ酸又は核酸の「同一
性」と同等である)。２つの配列間の相同性パーセントは、それらの配列に共有 される同一である位置の数の関数である(即ち、相同性％＝同一の位置の数／位 置の総数×１００)。例えば、２つの配列中の１０の位置の内の６がマッチし又 は相同であるならば、これら２つの配列は、６０％相同であり又は６０％の配列
同一性を有する。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは、５０％
相同性又は配列同一性を共有する。一般に、比較は、２つの配列を最大の相同性
又は配列同一性を与えるように整列させて行う。
【０１７８】 配列の比較及び２つの配列間の相同性パーセントの測定は、数学的アルゴリズ
ムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴ
リズムの非制限的例は、Karlin及びAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2
264-68のアルゴリズム(Karlin及びAltschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5
873-77において改変)である。かかるアルゴリズムは、Altschul等(1990)J.Mol.B
iol.214:403-10のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２．０)
に取り込まれている。胚ヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム(スコア ＝１００、ワード長―１２)を用いて行って、この発明の核酸と相同なヌクレオ チド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴ蛋白質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラ
ム(スコア＝５０、ワード長＝３)を用いて行って、この発明の蛋白質分子と相同
なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップを入れたアライ
ンメントを得るためには、Altschul等(1997)Nucleic Acids Research 25(17):33
89-3402に記載されたように、ギャップトＢＬＡＳＴを利用することができる。 ＢＬＡＳＴ及びギャップトＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれ
のプログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータ
ーを用いることができる。http:＼＼www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。配
列の比較に用いられる他の好適な数学的アルゴリズムの非制限的例は、Myers及 びMiller,CABIOS(1989)のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ シーケンスアラインメントソフトウェアパッケージの部分であるＡＬＩＧＮプロ
グラム(バージョン２．０)に取り込まれている。アミノ酸配列を比較するために
ＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合には、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ
長ペナルティー１２及びギャップペナルティー４を用いることができる。それら
が生成する結果に関して同等であるプログラムは、用いることができる。
【０１７９】 用語「ペプチド」、「蛋白質」及び「ポリペプチド」は、ここでは、交換可能
に用いる。
【０１８０】 ここで用いる場合、用語「トランスジーン」は、それが導入されたトランスジ
ェニック動物若しくは細胞に対して部分的に若しくは完全に異種性である(即ち 、外来性の)核酸配列(例えば、少なくとも一のＨｅｌｉｏｓポリペプチド又はＨ
ｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓダイマー)又はそれが導入されたトランスジェニック 動物若しくは細胞の内因性遺伝子に相同であるが、それが挿入された細胞のゲノ
ムが変化するような仕方でその動物のゲノムに挿入されるようにデザインされた
若しくは挿入された核酸配列(例えば、それは、天然の遺伝子と異なる位置に挿 入され又はその挿入はノックアウトを生じる)を意味する。トランスジーンは、 少なくとも１つの転写調節配列及び選択した核酸の最適な発現に必要であり得る
任意の他の核酸例えばイントロン(すべて選択した核酸に操作可能に結合される)
を含むことができ、そしてエンハンサー配列を含むことができる。
【０１８１】 ここで用いる場合、用語「トランスジェニック細胞」は、トランスジーンを含
む細胞である。
【０１８２】 ここで用いる場合、「トランスジェニック動物」は、細胞の少なくとも１つ好
ましくは本質的に全部がトランスジーンを含む任意の動物である。このトランス
ジーンは、意図的な遺伝子操作により(例えば、マイクロインジェクション又は 組換えウイルスの感染により)、直接または間接的に前駆細胞への注入により細 胞に導入することができる。この分子は、染色体中に組み込まれ得て、或は、染
色体外で複製するＤＮＡであってよい。
【０１８３】 ここで用いる場合、用語「組織特異的プロモーター」は、プロモーターとして
役立ち(即ち、そのプロモーターに操作可能に結合されたＨｅｌｉｏｓ及び／又 はＩｋａｒｏｓ遺伝子等の選択したＤＮＡ配列の発現を調節する)、そして選択 したＤＮＡ配列の組織の特異的細胞(例えば、リンパ球)における発現を達成する
ＤＮＡ配列を意味する。この用語は又、主に一の組織において選択したＤＮＡの
発現を調節するが、他の組織においても発現を引き起こす、いわゆる「漏出性」
プロモーターをもカバーする。
【０１８４】 ポリペプチドは、もしそれが、次の特性の少なくとも１つを有するならば、Ｈ
ｅｌｉｏｓの生物学的活性を有する：(１)(ａ)野生型Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド
、(ｂ)天然の変異型Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド又は(ｃ)(ａ)若しくは(ｂ)の何れ
かの断片に特異的な抗体又は抗体断片と反応する能力；(２)Ｈｅｌｉｏｓダイマ
ー、Ｈｅｌｉｏｓ／アイオロス、及び／又はＨｅｌｉｏｓ／Ｉｋａｒｏｓダイマ
ーを形成する能力；(３)造血幹細胞の発生を調節する能力；(４)配列からの転写
を刺激する能力；又は(５)(１)、(２)、(３)若しくは(４)に列記した活性のアン
タゴニスト又はアゴニストとして作用する能力。
【０１８５】 「誤発現」は、ここで用いる場合、非野生型パターンのＨｅｌｉｏｓ遺伝子発
現をいう。それは：非野生型レベルでの発現(即ち、過剰又は過少発現)；遺伝子
が発現される時期又はステージに関して野生型と異なる発現のパターン(例えば 、予め決められた発生の時期又はステージにおける野生型と比較して増大した又
は減少した発現)；予め決められた細胞型又は組織型における野生型と比較して 減少した発現により野生型と異なる発現パターン；発現されたＨｅｌｉｏｓ及び
／又はＩｋａｒｏｓポリペプチドのスプライシング、サイズ、アミノ酸配列、過
渡後修飾、安定性、又は生物学的活性に関して野生型と異なる発現パターン；Ｈ
ｅｌｉｏｓ及び／又はＩｋａｒｏｓ遺伝子の発現に対する環境刺激又は細胞外刺
激に関して野生型と異なる発現のパターン(例えば、刺激の強度の増大又は減少 の存在下での野生型と比較して増大した又は減少した発現のパターン)；野生型 と異なるＩｋａｒｏｓ−ＩｋａｒｏｓダイマーのＨｅｌｉｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓダ
イマーに対する比；野生型と異なるＨｅｌｉｏｓの、Ｈｅｌｉｏｓ−Ｈｅｌｉｏ
ｓダイマー、Ｉｋａｒｏｓ−Ｉｋａｒｏｓダイマー又はＩｋａｒｏｓ−Ｈｅｌｉ
ｏｓダイマーに対する比；野生型と異なるＩｋａｒｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓダイマー
の、Ｈｅｌｉｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ、Ｈｅｌｉｏｓ−Ｈｅｌｉｏｓダイマー又はＩ
ｋａｒｏｓ−Ｉｋａｒｏｓダイマーに対する比を包含する。
【０１８６】 ここに記載のように、この発明の一つの面は、Ｈｅｌｉｏｓをコードするヌク
レオチド配列を含む純粋な(又は、組換えの)核酸及び／又はかかる核酸の同等物
を特徴とする。用語「核酸」は、ここで用いる場合、断片及び同等物を包含し得
る。用語「同等物」は、機能的に同等なポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列又は例えばＨｅｌｉｏｓポリペプチドに特異的な抗体と反応する能力を保持
している機能的に同等なポリペプチドをいう。同等なヌクレオチド配列は、少な
くとも１つのヌクレオチドの置換、付加又は欠失により異なる配列(例えば、対 立遺伝子変異物)を包含し、従って、遺伝コードの縮重によりSEQ ID NO:１、SEQ
ID NO:３又はSEQ ID NO:６に示したＨｅｌｉｏｓのヌクレオチド配列と異なる 配列を包含する。
【０１８７】 本発明の実施においては、別途指示しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子
生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の慣用
の技術を用いる(これらは、当業者の技術範囲内にある)。かかる技術は、文献に
記載されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第二版、S
ambrook, Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989
)；DNA Cloning, I及びII巻(D.N.Glover編、1985)；Oligonucleotide Synthesis
(M.J.Gait編、1984)；Mullis等、米国特許第４，６８３，１９５号；Nucleic Ac
id Hybridization(B.D.Hames及びS.J.Higgins編、1984)；Transcription And Tr
anslation(B.D.Hames及びS.J.Higgins編、1984)；Culture Of Animal Cells(R.I
.Freshney, Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Pre
ss,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；学術論 文、Methods In Enzymology(Academic Press, Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vect
ors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos編、1987,Cold Spring Har
bor Laboratory)；Methods In Enzymology, 154及び155巻(Wu等編)、Immunochem
ical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及びWalker編、Academic P
ress, London,1987) ；Handbook Of Experimental Immunology, I-IV巻(D.M.Wei
r及びC.C.Blackwell編、1986)；Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照されたい。
【０１８８】 本発明のＨｅｌｉｏｓ遺伝子及びポリペプチドは、望ましくない細胞増殖と関
係する病気例えば白血病又はリンパ腫を研究し、診断し及び／又は治療するのに
有用である。この遺伝子(及びその断片)を用いて、望ましくない機能を有するポ
リペプチドをコードする変異型又は野生型のＨｅｌｉｏｓ遺伝子の発現を阻止す
ることのできるアンチセンス構築物を製造することができる。或は、Ｈｅｌｉｏ
ｓポリペプチドを用いて、異常な細胞増殖又はリンパ球分化(例えば、Ｔ細胞成 熟)と関係する蛋白質又は蛋白質レベルを検出することのできる抗体を高めるこ とができる。更に、Ｈｅｌｉｏｓペプチド、抗体又は核酸を用いて、リンパ球分
化のステージ(例えば、Ｔ細胞分化のステージ)を同定することができる。
【０１８９】 この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らか
となろう。
【０１９０】発明の詳細な説明 遺伝子療法 本発明の遺伝子構造体を、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのＨｅｌｉｏ
ｓポリペプチドをコードする核酸を投与する遺伝子療法プロトコルの一部として
用いることもできる。本発明は、生体内トランスフェクション用の発現ベクター
、及び特定の型の細胞（例えば皮膚細胞）内で行うＨｅｌｉｏｓポリペプチドの
発現を特徴とする。これを用いることによって、ポリペプチドが発現される又は
誤発現される（misexpressed）細胞内において、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの機
能が再構成されるか、向上されるか又は打ち消される。
【０１９１】 Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの発現構造体は、生物学的に有効なあらゆる担体（
例えばＨｅｌｉｏｓ遺伝子を生体内で細胞に効果的に運搬することのできる全て
の配合又は組成物）で投与することができる。その方法として、ウイルスベクタ
ー（例えば組替えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及び単
純性疱疹ウイルス１等）、或いは組替えバクテリア又は真核細胞プラスミドに、
目的の遺伝子を挿入する方法がある。ウイルスベクターは細胞を直接トランスフ
ェクトする。これに対しプラスミドＤＮＡは、例えばカチオン性リポソーム（リ
ポフェクチン）或いは変性（例えば抗体結合の）ポリリジン結合体、グラミシジ
ンＳ、人工ウイルスエンベロープ又は他のそのような細胞内担体等による補助を
介して運搬されるか、或いは遺伝子構造体の直接投与又は生体内で行われるＣａ
ＰＯ4沈降によって運搬される。
【０１９２】 生体内での細胞内への核酸導入の好ましい方法としては、核酸（例えばＨｅｌ
ｉｏｓポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターを用いる方
法が挙げられる。ウイルスベクターを用いた細胞感染には、標的細胞の殆どが核
酸を受け取ることができるという利点がある。さらに、ウイルスベクター内で（
例えばウイルスベクター内に含まれるｃＤＮＡによって）コードされる分子は、
ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞内で効率的に発現される。
【０１９３】 レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターは、外来性遺伝子を
生体内（特にヒト内）に導入するための組替え遺伝子運搬系として用いることが
できる。これらのベクターは遺伝子を細胞内に効率的に運搬する。導入された核
酸は宿主の染色体ＤＮＡ内に安定的に統合される。複製に欠陥のあるレトロウイ
ルスのみを産生する特異的細胞系（「パッケージング細胞」と称する）が開発さ
れており、これによって遺伝子療法用のレトロウイルスの有用性が高まった。欠
陥レトロウイルスは、遺伝子療法を目的とした遺伝子導入に用いられることで知
られる［例えばＭｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ７６、２７１参
照］。複製欠陥レトロウイルスをビリオン内にパッケージングしたものを、ヘル
パーウイルスを用いた標準法によって標的細胞を感染するのに用いることができ
る。組替えレトロウイルスの産生方法のプロトコル、及びそれらのウイルスを用
いた生体外又は生体内での細胞感染のプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ
．Ｍ．他（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
（１９８９）、９．１０−９．１４及び他の標準的実験マニュアルに記載がある
。好適なレトロウイルスの例としては、当分野で公知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷ
Ｅ及びｐＥＭが挙げられる。環境栄養性及び両栄養性レトロウイルス系の両方を
調製するのに好適なパッケージングウイルス系の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣ
ｒｅ、Ψ２及びΨＡｍが挙げられる。レトロウイルスは様々な遺伝子を様々な細
胞（例えば上皮細胞）に生体外及び／又は生体内で導入するのに用いられている
［例えばＥｇｌｉｔｉｓ他（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３９５−１３
９８；Ｄａｎｏｓ及びＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ他（１９８８）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４−３０１８；Ａ
ｒｍｅｎｔａｎｏ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ他（１９９１
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７−８３８１；
Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ他（１９９１）Ｓｃｉｎｅｃｅ２５４：１８０２−１８０５
；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ他（１９９２）Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ３：６４１−６４７；Ｄａｉ他（１９９２）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ
他（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第
４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／
０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４
５；及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３参照］。
【０１９４】 本発明に有用な他のウイルス遺伝子運搬系はアデノウイルス由来のベクターを
用いるものである。目的の遺伝子産物をコードし発現するが、通常の溶菌サイク
ル中に複製する能力をあらわさないように、アデノウイルスのゲノムを処理する
ことができる［例えばＢｅｒｋｎｅｒ他（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｎｉｑｕｅｓ
６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１
−４３４；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５
５参照］。アデノウイルス株Ａｄ亜属５型ｄｌ３２４又はアデノウイルスの他株
（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する好適なアデノウイルスベクター
は、当分野において公知である。細胞分裂しない細胞を感染できないこと、上皮
細胞を含む非常に多様な細胞の感染に用いることができることから、組替えアデ
ノウイルスはある種の環境において利点を有する［Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９
９２）上述参照］。その上更に、ウイルス粒子は精製及び濃縮に対して比較的安
定で反応性がよく、上記したように広い感染性を有すように改変することができ
る。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（及びそこに含まれる外来ＤＮＡ
）は宿主細胞のゲノムに統合されることなくエピソームにとどまる。その結果、
導入されたＤＮＡ（例えばレトロウイルスＤＮＡ）が宿主ゲノムに統合された場
合に起こりうる、挿入突然変異誘発による問題を回避することができる。その上
更に、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡ容量（〜８キロベース）は、他の遺伝
子運搬ベクターに比較して大きい［Ｂｅｒｋｎｅｒ他、上述；Ｈａｊ−Ａｈｍａ
ｎｄ及びＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７］。
【０１９５】 目的のＨｅｌｉｏｓ遺伝子を運搬するのに有用な他のウイルスベクターは、ア
デノ関連ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ関連ウイルスは、効率的な複製及び
増殖サイクルのために、他のウイルス（例えばアデノウイルスやヘルペスウイル
ス）をヘルパーウイルスとして必要とする、天然に存在する欠陥ウイルスである
［Ｍｕｚｙｃｚｋａ他、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９参照］。アデノ関連ウイ
ルスは更に、細胞分裂しない細胞のＤＮＡに、安定的に高頻度で統合する数少な
いウイルスの一つである［例えばＦｌｏｔｔｅ他（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓ
ｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ
他（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；及びＭｃＬａｕｇ
ｈｌｉｎ他（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３］。３００
塩基対程の小さなＡＡＶを含むベクターはパッケージング及び統合することがで
きる。外来ＤＮＡ用の空間は約４．５ｋｂに制限されている。例えばＴｒａｔｓ
ｃｈｉｎ他（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０
に記載のＡＡＶベクターを用いて、ＤＮＡを細胞に導入することができる。様々
な核酸が、ＡＡＶベクターを用いて様々な種類の細胞に導入されている［例えば
Ｈｅｒｍｏｎａｔ他（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ他（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１：Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ他（１９８８
）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ他（１
９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；及びＦｌｏｔｔｅ他（１９９
３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０］。
【０１９６】 上記したウイルス導入方法に加えて、ウイルスを用いない方法を用いて、哺乳
類（例えばヒト等）組織中でＨｅｌｉｏｓポリペプチドの発現を引き起こすこと
もできる。ウイルスを用いない遺伝子導入法の殆どは、哺乳類細胞が高分子の摂
取及び細胞内輸送を行うのに用いている通常の機能に依存している。好ましい態
様においては、本発明のウイルスを用いない遺伝子運搬系は、目的のＨｅｌｉｏ
ｓ遺伝子を標的細胞に摂取させるのに、エンドサイトーシス回路に依存している
。この種の遺伝子運搬系の例としては、リポソーム由来系、ポリリジン結合体、
及び人工ウイルスエンベロープが挙げられる。
【０１９７】 代表的な態様においては、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドをコードする遺伝子は、
（例えばリポフェクチンなどの）表面に陽電荷を帯びた、（場合によっては）標
的組織の細胞表面抗原に対する抗体で標識化したリポソームに閉じ込めることが
できる［Ｍｉｚｕｎｏ他（１９９２）脳神経外科２０：５４７−５５１；ＰＣＴ
公開番号ＷＯ９１／０６３０９；日本国特許出願第１０４７３８１；及び欧州特
許公開番号ＥＰ−Ａ−４３０７５参照］。
【０１９８】 臨床上では、当分野で公知の方法を何種類でも組合せて、治療用Ｈｅｌｉｏｓ
遺伝子運搬系を患者に導入することができる。例えば、遺伝子運搬系の薬剤調製
物を全身に（例えば静脈注射によって）導入することができ、遺伝子運搬ビーク
ル；受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型又は組織型発現；
又はその組合せによって提供されるトランスフェクションの特異性が要因となっ
て、標的細胞への蛋白質の特異的な形質導入が支配的に起こる。他の態様におい
ては、動物への投与が極めて局所的であるため、組替え遺伝子の初期投与はより
制限されている。例えば、遺伝子運搬ビークルをカテーテル（米国特許第５，３
２８，４７０号参照）又は定位注射（例えばＣｈｅｎ他（１９９４）ＰＮＡＳ９
１：３０５４−３０５７参照）によって導入することができる。本発明の好まし
い態様においては、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子は造血細胞を標的にする。
【０１９９】 遺伝子療法用構造体の薬剤調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子運搬系から
実質的に構成することができるか、或いは遺伝子運搬ビークルが埋め込まれてい
る緩効性の基質を包含することができる。又、遺伝子運搬系全体が組替え細胞か
ら未反応で産生される場合（例えばレトロウイルスベクター）、薬剤調製物は遺
伝子運搬系を産生する１以上の細胞を包含することができる。
【０２００】 アンチセンス療法 本発明の他の特徴は、単離した核酸を「アンチセンス」療法に用いることに関
する。ここでいう「アンチセンス」療法とは、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド又はそ
の突然変異体をコードする細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと細胞内条件下
で特異的にハイブリダイズ（例えば結合）する、オリゴヌクレオチド又はそれら
の誘導物の投与又はインシトゥーな産生のことをいう。これらのオリゴヌクレオ
チド又は誘導物は、例えば転写及び／又は翻訳を阻害することによって、コード
された蛋白質の発現を阻害する。結合は従来の塩基対相補性によるものであって
もよいし、ＤＮＡ二重鎖に結合する場合には、二重螺旋の主要溝における特異的
な相互作用によるものであってもよい。一般に、「アンチセンス」療法とは、当
分野において一般に用いられている一連の方法のことをいい、オリゴヌクレオチ
ド配列への特異的な結合に依存する全ての療法を含む。
【０２０１】 一つの態様においては、アンチセンス構造体は、（例えば遺伝子の発現に関与
する）天然Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子配列に結合する。これらの配列の例としては、開
始コドン、停止コドン及びＲＮＡプライマー結合部位が挙げられる。
【０２０２】 別の態様においては、アンチセンス構造体は、野生型遺伝子中に存在しないヌ
クレオチド配列に結合する。例えばアンチセンス構造体は、外因性の非野生型配
列を挿入したＨｅｌｉｏｓ遺伝子の領域に結合することができる。或いはＨｅｌ
ｉｏｓ遺伝子において欠失があった領域、すなわち通常は一緒に位置することが
ない２つの遺伝子領域が結合されて新たに形成された非野生型配列に、アンチセ
ンス構造体は結合することができる。
【０２０３】 被験者に生体内投与される場合、非野生型配列に結合するアンチセンス構造体
が、野生型Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の発現を阻害することなく、突然変異Ｈｅｌｉｏ
ｓ遺伝子の発現を阻害するという利点がある。
【０２０４】 本発明のアンチセンス構造体は例えば、細胞内で転写される時に、Ｈｅｌｉｏ
ｓポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくともユニーク部位に相補性を
有するＲＮＡを産生する発現プラスミドとして用いることができる。或いはアン
チセンス構造体は、エクスビボで産生されて、細胞内に導入された場合にＨｅｌ
ｉｏｓ遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリダイズして発現を阻害
する、オリゴヌクレオチドプローブである。このようなオリゴヌクレオチドプロ
ーブは、内因性ヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌク
レアーゼ）に耐性を有する、従って生体内で安定するように改変さたオリゴヌク
レオチドであることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いら
れる核酸分子の例としては、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオアート及
びメチルホスホネート類似体が挙げられる（米国特許第５，１７６，９９６号、
第５，２６４，５６４号及び第５，２５６，７７５号参照）。加えて、アンチセ
ンス療法に有用なオリゴマーを作成する一般的方法は、例えばＶａｎ ｄｅｒ
Ｋｒｏｌ他（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：９５８−９７６；及び
Ｓｔｅｉｎ他（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ４８：２６５９−２６６８に記
載がある。
【０２０５】 従って本発明の改変オリゴマーは、療法、診断、研究の分野において有用であ
る。療法においては、一般的なアンチセンス療法に適した方法でオリゴマーを利
用する。そのような療法においては、本発明のオリゴマーを様々な投与（例えば
全身及び局所投与）向けに配合することができる。全身投与の場合、筋肉内、静
脈内、腹腔内及び皮下等の注射が好ましく、本発明のオリゴマーを液体溶液、好
ましくは生理学的適合性を有する緩衝液（例えばハンクス液又はリンゲル液）に
配合することができる。さらに、オリゴマーを固形で配合して、使用直前に再溶
解又は懸濁してもよい。冷凍乾燥の形態も本発明に含まれる。
【０２０６】 化合物は経口、又は経粘膜又は経皮で投与することができる。経粘膜又は経皮
投与については、浸透対象となるバリアに対して適当な浸透剤が配合に用いられ
る。このような浸透剤は当分野で公知のものを用いることができ、例として経粘
膜投与胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体、並びに洗浄剤が挙げられる。経粘膜投与
は、スプレー式点鼻薬を用いて行ってもよいし、座薬を用いてもよい。経口投与
においては、オリゴマーを例えばカプセル、タブレット及び強壮剤などの従来の
経口投与形態に配合する。局所投与においては、本発明のオリゴマーを軟膏、軟
膏剤、ゲル、又はクリームなどの従来公知の形態に配合する。
【０２０７】 療法における使用に加えて、本発明のオリゴマーを、特異的結合によって標的
ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の存在又は不在を調べる診断試薬として用いることもでき
る。
【０２０８】 本発明のアンチセンス構造体は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子の発現に拮抗させること
によって、生体内又はエクスビボの細胞培養処理に用いることができる。
【０２０９】 トランスジェニック動物 本発明は、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンを含み、好ましくは（場合によっては
）１個以上の細胞中で外因性又は内因性Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子を発現（又は誤発現
）する細胞を含むトランスジェニック動物を含む。 Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンは突然変異Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドをコードする
ことができる。このような遺伝子を含む動物は、疾患モデル動物として用いるこ
とができ、あるいはＨｅｌｉｏｓの誤発現の修正に効果的な作用薬をスクリーン
するのに用いることができる。あるいは、Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンは野生型
蛋白質をコードすることができるか、又はその同族体（アゴニスト、アンタゴニ
スト、及びアンチセンス構造体等）をコードすることができる。好ましい態様に
おいてはトランスジーンの発現は、（例えば望ましいパターンに発現を制御する
シス作用配列を利用する）特異的な細胞集合又は組織に限定される。組織特異的
調節配列及び条件調節配列を用いて、ある空間パターンのトランスジーンの発現
を制御することができる。発現の一時的な（temporal）パターンは、例えば条件
組替え系又は原核転写調節配列などによって提供することができる。好ましい態
様においては、トランスジーン動物は「ノックアウト」Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子をゆ
うする、即ちＨｅｌｉｏｓ遺伝子の全て又は部分を欠損する。
【０２１０】 部位特異的遺伝子操作を通じて生体内で調節される、トランスジーンの発現を
可能にする遺伝子方法は、当業者に公知のものである。例えば、標的配列の遺伝
的組替えを引き起こすリコンビナーゼの発現を調節することを可能にする、遺伝
子系が利用可能である。ここでいう「標的配列」とは、リコンビナーゼによって
遺伝的に組替えられるヌクレオチド配列のことをいう。標的配列の両脇にはリコ
ンビナーゼ認識配列が存在し、一般に標的配列はリコンビナーゼ活性を発現する
細胞内で切り出されるかまたは反転させられる。標的配列の組替えが起こった結
果、目的のＨｅｌｉｏｓ遺伝子の発現が活性化又は抑制されるように、リコンビ
ナーゼにより引き起こされる組替えを設計することができる。（例えばアゴニス
ト同族体をコードする）組替えＨｅｌｉｏｓ遺伝子の発現を妨害する標的配列を
切り出すことによって、その遺伝子の発現を活性化させることができる。この蛋
白質発現妨害は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子をプロモーター因子又からの空間的分離や
、内部に存在する停止コドンなど、様々な機構に由来する。
【０２１１】 その上更に、遺伝子のコード配列の両脇にリコンビナーゼ認識配列を位置させ
、まずそのコード配列の細胞内でのトランスフェクションがプロモーター因子に
対して３’−５’の方向で起こるように、トランスジーンを作成することができ
る。このような例においては、プロモーター因子に対してプロモーターによる転
写活性化が可能な方向にコード配列の５’末端を位置させることによって、標的
配列が反転し、目的の遺伝子が方向づけられる［例えばバクテリオファージＰ１
のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系についての記述（Ｌａｋｓｏ他（１９９２
）ＰＮＡＳ８９：６２３２−６２３６；Ｏｒｂａｎ他（１９９２）ＰＮＡＳ８９
：６８６１−６８６５）又はサッカロミケス・セレビシエのＦＬＰリコンビナー
ゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ他（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：１３５１−１３
５５；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６９４）参照］。標的配列の遺伝子組替え
はＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存している。リコンビナーゼの発現は、（例
えば組織特異性、発生段階特異性、外的に添加した作用物質による誘導性又は抑
制性の）調節制御下にあるプロモーター因子によって調節することができる。こ
の調節された制御によって、リコンビナーゼ発現がプロモーター因子によって媒
介される細胞内においてのみ、標的配列の遺伝子組替えが引き起こされる。従っ
て、組替えＨｅｌｉｏｓ遺伝子の発現活性は、リコンビナーゼ発現の制御を通じ
て調節することができる。
【０２１２】 トランスジーンの発現を可能にするためには原核蛋白質の同時発現を必要とす
る原核プロモーター配列を用いて、同様な条件トランスジーンを提供することが
できる。プロモーター及びそれに対応する転写活性誘導化原核蛋白質の例として
、米国特許第４，８３３，０８０号に記載のものが挙げられる。その上更に、条
件トランスジーンの発現は、転写活性誘導化蛋白質（例えばリコンビナーゼ又は
原核蛋白質）をコードする遺伝子が組織に運搬されて例えば細胞型特異的な方法
によって発現されるといった、遺伝子療法的方法によって引き起こすことができ
る。この方法によって、転写活性誘導体によって「励起」されるまで、成熟期の
Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンは休止している。
【０２１３】 断片及び類似体の作成 本発明者は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの１次アミノ酸構造を得た。中心構造
の一例が開示されたので、その構造を変化させて断片又は類似体を新たに作成し
、新たな構造の活性を試験することが当業者には可能であろう。断片及び類似体
の作成及び試験を行う従来方法の例は、以下に述べる。これらの方法又は類似の
方法は、少なくとも１つの生物学的活性を有する（Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドに
特異な抗体、例えばモノクローナル抗体などと反応する）Ｈｅｌｉｏｓポリペプ
チドの断片及び類似体を作成及びスクリーンするのに用いることができる。
【０２１４】 断片の作成 蛋白質の断片は、例えば組替え、蛋白質消化分解又は化学合成といった、幾つ
かの方法で作成することができる。ポリペプチドの内部又は末端断片は、ポリペ
プチドをコードする核酸の一端（末端断片の場合）又は両端（内部断片の場合）
から１個以上のヌクレオチドを除去することによって作成することができる。突
然変異を起こされたＤＮＡの発現によってポリペプチド断片が産生される。「末
端ニブリング」エンドヌクレアーゼによる消化切断によって、一連の断片をコー
ドするＤＮＡを産生することができる。蛋白質断片をコードするＤＮＡは、ラン
ダム剪断、制限酵素消化又は上記した方法の組合せによって作成することもでき
る。
【０２１５】 従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学法等の、当分野にお
いて公知の方法を用いて、断片を化学合成することもできる。例えば、本発明の
ペプチドは断片がオーバーラップしないように望ましい長さの断片に任意に分割
してもよいし、望ましい長さのオーバーラップする断片に分割してもよい。
【０２１６】 改変ＤＮＡ及びペプチド配列の作製：ランダム法 蛋白質又は蛋白質の特定の領域をコードするＤＮＡをランダム突然変異誘発す
ることによって、蛋白質のアミノ酸配列変異体を調製することができる。有用な
方法として、ＰＣＲ突然変異誘発及び飽和突然変異誘発が挙げられる。又、ラン
ダムアミノ酸配列変異体のライブラリーを、一連の変性オリゴヌクレオチド配列
を合成することによって作成することができる。（変異体ライブラリー中の蛋白
質のスクリーニング方法については、本明細書の他の部分に述べる。）
【０２１７】 ＰＣＲ突然変異誘発 ＰＣＲ突然変異誘発において、忠実度を低下させたＴａｑポリメラーゼを用い
てＤＮＡ断片クローン中にランダム突然変異を誘発する（Ｌｅｕｎｇ他、１９８
９、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１：１１−１５）。これはランダム突然変異を誘導する
方法としては非常に強力で比較的迅速な方法である。突然変異誘発されるＤＮＡ
領域は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の忠実度を低下させた（例
えばｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ比を５とし、Ｍｎ2+をＰＣＲ反応に添加する）条件下で
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅される。増幅されたＤＮＡ断片の
プールは適当なクローンベクターに挿入され、ランダム突然変異ライブラリーが
得られる。
【０２１８】 飽和突然変異誘発 飽和突然変異誘発によって、クローンされたＤＮＡ断片内へ多量の単塩基置換
を迅速に導入することが可能になる（Ｍａｙｅｒｓ他、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２２９：２４２）。この方法の例として、一本鎖ＤＮＡの生体外での化学処理
又は放射線照射による突然変異の発生、相補的ＤＮＡ鎖の合成が挙げられる。処
理の厳格性を調節することによって、突然変異頻度を調節することができ、可能
な塩基置換を実質的に全て得ることができる。この処理では突然変異断片を遺伝
的に選択する工程を含んでいないので、中性の置換並びに機能の変化した断片の
両方が得られる。点突然変異の分布は、保存配列因子に偏向しない。
【０２１９】 変性オリゴヌクレオチド 類似体のライブラリーを、一連の変性オリゴヌクレオチド配列から作成するこ
ともできる。自動ＤＮＡ合成機によって変性配列を化学合成することができ、合
成された遺伝子は適当な発現ベクター内に連結される。変性オリゴヌクレオチド
の合成は当分野において公知のものである（例えばＮａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８
３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８１）Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏ
ｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編、アムステルダム：
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４）Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６；Ｉｋｅ他（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｒｅｓ．１１：４７７参照）。このような方法は他の蛋白質の有向進化に用
いられている（例えばＳｃｏｔｔ他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６
−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ他（１９９２）ＰＮＡＳ８９：２４２９−２４３３；
Ｄｅｖｌｉｎ他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒ
ｌａ他（１９９０）ＰＮＡＳ８７：６３７８−６３８２；米国特許第５，２２３
，４０９号；第５，１９８，３４６号；及び第５，０９６，８１５号参照）。
【０２２０】 改変ＤＮＡ及びペプチド配列の作成：有向突然変異誘発法 非ランダム又は方向性を持たせた突然変異誘発法を用いて、特異な配列又は特
異な領域における突然変異体を提供することができる。これらの方法を用いて蛋
白質の公知のアミノ酸配列残基の欠失、挿入又は置換などを含む変異体を作成す
ることができる。例えば（１）まず保存アミノ酸で置換し、ついでその結果に応
じてより大きな変化を与えるもので置換する（２）標的残基を欠失させる、又は
（３）隣接する部位に同じ又は異なるクラスの残基を挿入する、或いは（１）〜
（３）の組合せを用いることによって、突然変異の部位を個別に変えることもで
きるし、連続的に変えることもできる。
【０２２１】 アラニン走査突然変異誘発 アラニン走査突然変異誘発法は、突然変異誘発に好ましい部位又は領域である
、望ましい蛋白質の特定の残基又は領域を同定するのに有用な方法である（Ｃｕ
ｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５
、１９８９）。アラニン走査において、（複数の）標的残基（例えばＡｒｇ、Ａ
ｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕといった正電荷の残基）が同定され、中性の又
は陰電荷のアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）によって置換
される。アミノ酸の置換によって、アミノ酸と細胞内又は外を取り巻く水性環境
との相互作用に影響が与えられる。置換に対して機能的感応性を示す領域は、置
換部位に更なる又は他の変異体を導入することによって、細かに区別することが
できる。従って、アミノ酸配列を導入する部位を予め決定する一方で、突然変異
それ自体の性質は予め決定する必要はない。例えば、所定の位置における突然変
異の実行性を最適化するために、アラニン走査又はランダム突然変異誘発を標的
コドン又は領域において行うことができ、発現された目的の蛋白質サブユニット
変異体を、望まれる活性の最適な組合せについてスクリーンする。
【０２２２】 オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発 オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、ＤＮＡの置換、欠失及び挿入変異体
を調製する有用な方法である（Ａｄｅｌｍａｎ他、ＤＮＡ２：１８３、１９８３
参照）。以下簡単に述べると、突然変異体をコードするオリゴヌクレオチドをＤ
ＮＡ鋳型にハイブリダイズすることによって目的のＤＮＡを改変する。ここで用
いる鋳型は目的の蛋白質の未改変又は天然ＤＮＡ配列を含むプラスミド又はバク
テリオファージの単鎖形状をしている。ハイブリダイズの後、ＤＮＡポリメラー
ゼを用いて鋳型の第二の相補鎖全体を合成する。第二の相補鎖はオリゴヌクレオ
チドプライマーと連結され、目的の蛋白質ＤＮＡで選択的改変をコードする。一
般に、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが用いられる。最適
なオリゴヌクレオチドは、突然変異体をコードするヌクレオチドのどちらかの側
の鋳型に完全な相補性を有する１２〜１５ヌクレオチドを含む。これによってオ
リゴヌクレオチドが単鎖ＤＮＡ鋳型分子と適切にハイブリダイズする。オリゴヌ
クレオチドは従来公知の方法で容易に合成される（Ｃｒｅａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：５７６５（１９７８）参照）。
【０２２３】 カセット突然変異誘発 変異体を調製する他の方法であるカセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ他（Ｇ
ｅｎｅ３４：３１５（１９８５））に記載の方法に基づいている。出発原料は、
突然変異される蛋白質サブユニットＤＮＡを含むプラスミド（又は他のベクター
）である。突然変異される蛋白質サブユニットＤＮＡ中のコドンを同定する。同
定された突然変異部位のそれぞれの側にはユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位
が存在するはずである。そのような制限酵素部位が存在しない場合には、上記し
たオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を用いて、目的の蛋白質サブユニット
ＤＮＡ内の適切な位置に制限酵素部位を導入してもよい。プラスミドに制限酵素
部位を導入したのち、プラスミドをそれらの部位で切断し線形化する。制限酵素
部位間のＤＮＡ配列をコードし更に目的の突然変異を含む２重鎖オリゴヌクレオ
チドを、標準法を用いて合成する。２本鎖を個別に合成し、標準法によってハイ
ブリダイズする。この２重鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。このカセ
ットは、プラスミドに直接連結できるように、線形プラスミドの両端に対応する
３’及び５’末端を有するように設計される。こうしてプラスミドに突然変異し
た目的の蛋白質サブユニットＤＮＡ配列を含有させる。
【０２２４】 組合せ突然変異誘発 組合せ突然変異誘発を用いて突然変異体を作成することもできる。例えば核酸
レベルの組合せ突然変異誘発によって、多彩性の遺伝子ライブラリーによりコー
ドされる変異体のライブラリーを作成することができる。例えば、酵素を用いて
合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に連結し、潜在的に可能な配列の
変性セットを、個々のペプチドとしてか、或いは変性配列のセットを含む大きな
融合蛋白質のセットとして、発現可能にする。
【０２２５】 ペプチド断片又は同族体のライブラリーをスクリーニングする、一次高処理量法 当分野において、作成された突然変異遺伝子産物をスクリーニングする方法と
して様々なものが知られている。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングす
る方法は通常、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクター内にクローニングし
、得られたベクターライブラリーで適当な細胞を形質転換させ、目的の活性（例
えばこの場合、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドに特異な抗体との結合）の検出が可能
な条件下で遺伝子を発現する工程が含まれる。下記に述べる各方法は、（例えば
ランダム突然変異誘発法によって）作成された大量の配列をスクリーンする高処
理量分析に従う。
【０２２６】 ディスプレーライブラリー スクリーニングアッセイにおける方法の一つでは、候補ペプチドが細胞又はウ
イルス粒子表面上に呈示される。特定の細胞又はウイルス粒子の、呈示された産
物を介した適当な受容体蛋白質との結合能は「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）アッ
セイ」によって検出される。例えば、遺伝子ライブラリーをバクテリア細胞の表
面膜蛋白質の遺伝子内にクローンして、得られる融合蛋白質をパニングによって
検出する（Ｌａｄｎｅｒ他、ＷＯ８８／０６６３０；Ｆｕｃｈｓ他（１９９１）
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０−１３７１；及びＧｏｗａｒｄ他（
１９９２）ＴＩＢＳ１８：１３６−１４０参照）。同様に、検出可能に標識化し
た配位子を用いて、潜在的な機能的ペプチド同族体を調べることができる。蛍光
標識化した配位子、例えば受容体を用いて、配位子結合活性を保持する同族体を
検出することができる。蛍光標識化配位子を用いることによって、細胞を視覚的
に調べて蛍光顕微鏡下で分離する（あるいは細胞の形態によっては蛍光活性化細
胞選別器によって分離する）ことが可能になる。
【０２２７】 遺伝子ライブラリーは、ウイルス粒子表面上の融合蛋白質として発現すること
ができる。例えば、繊維状ファージ系においては、感染性ファージの表面上に異
種ペプチド配列を発現させることができ、これによって２つの重要な利点が提供
される。第一に、これらのファージを親和性基質に１０13ファージ／ｍｌを上回
る濃度で適用し、大量のファージを１度にスクリーンすることができる。第二に
、各感染性ファージは遺伝子産物を表面上に呈示するので、特定のファージが親
和性基質から低い収率で回収される場合、もう一度感染を行ってファージを増幅
することができる。殆ど同一である大腸菌繊維状ファージＭ１３、ｆｄ及びｆｌ
グループは、ファージディスプレーライブラリーに最もよく用いられている。フ
ァージｇＩＩＩ又はｇＶＩＩＩ外殻蛋白質のどちらを用いても、ウイルス粒子の
最終的なパッケージングを損なうことなく融合蛋白質を産生することができる。
異種エピトープはｐＩＩＩのＮＨ2末端で発現でき、そのようなエピトープを産 生するファージは、このエピトープを欠く過剰量のファージから回収される（Ｌ
ａｄｎｅｒ他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２９０９；Ｇａｒｒａｒｄ他、ＰＣ
Ｔ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ｍａｒｋｓ他（１９９２）Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ他（１９９３）
ＥＭＢＯ Ｊ１２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ他（１９９１）Ｎａｔｕ
ｒｅ３５２：６２４−６２８；及びＢａｒｂａｓ他（１９９２）ＰＮＡＳ８９：
４４５７−４４６１参照）。
【０２２８】 一般的な方法では、大腸菌のマルトース受容体（外膜蛋白質、ＬａｍＢ）をペ
プチド融合の相手として用いる（Ｃｈａｒｂｉｔ他（１９８６）ＥＭＢＯ５、３
０２９−３０３７参照）。ＬａｍＢ遺伝子をコードするプラスミドにオリゴヌク
レオチドを挿入する。ＬａｍＢ遺伝子から産生されるペプチドは細胞外ループ蛋
白質の一つに融合される。これらのペプチドは配位子（例えば抗体）との結合能
を有し、細胞が動物内に投与された場合に免疫応答を引き起こすことができる。
【０２２９】 他の細胞表面蛋白質、例えばＯｍｐＡ（Ｓｃｈｏｒｒ他（１９９１）Ｖａｃｃ
ｉｎｅｓ９１、ｐｐ．３８７−３９２）、ＰｈｏＥ（Ａｇｔｅｒｂｅｒｇ他（１
９９０）Ｇｅｎｅ８８、３７−４５）及びＰＡＬ（Ｆｕｃｈｓ他（１９９１）Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈ９、１３６９−１３７２）並びにバクテリア表面構造体は、ペプ
チド呈示手段として用いられてきた。ペプチドは、バクテリア間の遺伝情報交換
のピリ繊毛導管を重合形成する蛋白質であるピリンと融合することができる（Ｔ
ｈｉｒｙ他（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５
、９８４−９９３参照）。他の細胞との相互作用を行う役割から、ピリ繊毛は細
胞外環境にペプチドを呈示するのに有用である。ペプチド呈示に用いられる他の
大型表面構造体としては、バクテリア動力器官、鞭毛が挙げられる。ペプチドが
サブユニット蛋白質フラジェリンに融合することによって、宿主細胞に大量のペ
プチドコピーが高濃度で提供される（Ｋｕｗａｊｉｍａ他（１９８８）Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈ．６、１０８０−１０８３参照）。他のバクテリア種の表面蛋白質もペ
プチド融合の相手として用いることができる。例としては、ブドウ球菌蛋白質Ａ
及びナイセリア外膜プロテアーゼＩｇＡが挙げられる（Ｈａｎｓｓｏｎ他（１９
９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、４２３９−４２４５及びＫｌａｕｓｅ
ｒ他（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９、１９９１−１９９９参照）。
【０２３０】 上記した繊維状ファージ系及びＬａｍＢ系において、ペプチドとそれをコード
するＤＮＡとの物理的結合が、ペプチドを表面に持つ粒子（細胞又はファージ）
内へのＤＮＡの封じ込めによって起こる。ペプチドを封じ込めることによって、
粒子及びその内部のＤＮＡを封じ込める。他の方法では、ＤＮＡ結合蛋白質Ｌａ
ｃＩを用いてペプチドとＤＮＡとの結合を形成する（Ｃｕｌｌ他（１９９２）Ｐ
ＮＡＳ ＵＳＡ８９：１８６５−１８６９参照）。この系では３’末端にＬａｃ
Ｉ遺伝子とオリゴヌクレオチドクローニング部位を有するプラスミドを用いる。
制御されたアラビノースによる誘発下で、ＬａｃＩ−ペプチド融合蛋白質を産生
する。この融合では、ＬａｃＯオペレーター（ＬａｃＯ）として知られる短いＤ
ＮＡ配列に結合するＬａｃＩ生来の能力が保持される。２個のＬａｃＯを発現プ
ラスミドに挿入することによって、それをコードするプラスミドにＬａｃＩ−ペ
プチド融合体がしっかりと結合する。各細胞中のプラスミドは１個のオリゴヌク
レオチド配列のみを含み、各細胞は１個のペプチド配列のみを発現するので、ペ
プチドは合成を方向付けるＤＮＡ配列に特異的且つ安定的に関連していることが
わかる。ライブラリーの細胞を緩やかに溶解し、ペプチド−ＤＮＡ複合体を固定
化受容体の基質にさらして活性化ペプチドを含む複合体を回収する。関連プラス
ミドＤＮＡを細胞に再導入して増幅し、ＤＮＡ配列決定してペプチド配位子を同
定する。本方法の実用上の有用性を示すために、ドデカペプチドの大型ランダム
ライブラリーを作成し、オピオイドペプチドダイノルフィンＢに対するモノクロ
ーナル抗体を用いて選択した。ペプチドのコホートを回収したが、全てダイノル
フィンＢの６残基部分に相当するコンセンサス配列に関連していた（Ｃｕｌｌ他
（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９−１８
６９参照）。
【０２３１】 時としてペプチド−オン−プラスミドと称されるこの方法は、ファージディス
プレー法とは２つの重要な点で異なる。第一に、ペプチドは融合蛋白質Ｃ末端に
結合しているため、ライブラリーメンバーはカルボキシ末端には何も結合してい
ないペプチドとして呈示される。繊維状ファージ外殻蛋白質ｐＩＩＩ及びｐＶＩ
ＩＩは両方とも、Ｃ末端を通じてファージに固着しており、ゲストペプチドは外
向きに突出したＮ末端領域に位置する。いくつかの設計では、ファージ呈示ペプ
チドは融合蛋白質のアミノ末端に呈示される（Ｃｗｉｒｌａ他（１９９０）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７、６３７８−６３８２参
照）。第二に、ライブラリー中に実際に存在するペプチド群に影響を与える一連
の生物学的偏向が挙げられる。ＬａｃＩ融合分子は、宿主細胞の細胞質に閉じ込
められる。翻訳の間、ファージ外殻融合体は細胞質にわずかにさらされるが、内
膜を通じてペリプラズム区画内に迅速に分泌され、Ｃ末端疎水性領域によって膜
に固着している一方、ファージ粒子内への組み込みを待つ間にペプチドを含むＮ
末端はペリプラズムに突出する。異なる蛋白質分解活性にさらした結果、Ｌａｃ
Ｉとファージライブラリーのペプチドは有意に異なりうる。ファージ外殻蛋白質
には、内膜を通じた輸送と、ファージ内への組み込みの先駆けとなるシグナルペ
プチダーゼ処理が必要となる。ある種のペプチドはこれらの処理に有害な影響を
及ぼし、ライブラリー中に発現されない（Ｇａｌｌｏｐ他（１９９４）Ｊ．Ｍｅ
ｄ．Ｃｈｅｍ．３７（９）：１２３３−１２５１参照）。これらの特定の偏向は
ＬａｃＩディスプレー系における因子ではない。
【０２３２】 組み替えランダムライブラリー中に小型ペプチドを大量に調製することができ
る。通常１０7〜１０9個の異なるクローンのライブラリーが調製される。１０11 個の大きさのライブラリーが作成されているが、この寸法が実用のクローンライ
ブラリーの限界である。ランダム化セグメントを含むＤＮＡを宿主バクテリア細
胞内にトランスフォームする段階で、ライブラリーの寸法が制限される。この制
限を克服するために、ポリソーム複合体中の未完成ペプチドの呈示に基づく生体
外系が開発されている。このディスプレーライブラリー法は、現在用いられてい
るファージ／ファージミド又はプラスミドライブラリーに比べて３〜６桁大きい
ライブラリーを作成する能力がある。さらに、ライブラリーの作成、ペプチドの
発現及びスクリーニングを、細胞が全く存在しないフォーマットで行うことがで
きる。
【０２３３】 本方法の適用例の一つ（Ｇａｌｌｏｐ他（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
３７（９）：１２３３−１２５１参照）において、１０12 デカペプチドをコー ドする分子ＤＮＡライブラリーを作成し、転写／翻訳系に組み合わせた大腸菌Ｓ
３０内において生体外でライブラリーを発現する。ｍＲＮＡ上にリボソームがと
どまるように条件を選択して、ポリソーム中に大部分のＲＮＡを蓄積させ、コー
ドするＲＮＡに結合したままの未完成ペプチドを含む複合体を産生する。ポリソ
ームは充分に頑丈なので、より一般的な組み換えペプチドディスプレーライブラ
リーをスクリーンするのとほぼ同じ方法で、固定化受容体上でのポリソームの親
和精製を行うことができる。結合した複合体からＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡに変
換し、ＰＣＲによって増幅して次のサイクルの合成及びスクリーニング用鋳型を
作成する。ポリソームディスプレー法をファージディスプレー系と組み合せるこ
とができる。何サイクルかのスクリーニングに次いで、ポリソーム強化プールか
らｃＤＮＡをファージミドベクター内にクローニングする。このベクターは外殻
蛋白質に融合したペプチドを呈示するペプチド発現ベクター、並びにペプチド同
定用のＤＮＡ配列決定ベクターの両方として作用する。ファージ上にポリソーム
由来ペプチドを発現することによって、このフォーマットにおける親和性選択処
理を続けるか、あるいは個々のクローン上のペプチドについて、結合活性をファ
ージＥＬＩＳＡで検定するか、結合特異性を完了（completion）ファージＥＬＩ
ＳＡで検定することができる（Ｂａｒｒｅｔ他（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ２０４、３５７−３６４参照）。活性ペプチドの配列を同定するために、
ファージミド宿主によって産生されたＤＮＡの配列を決定する。
【０２３４】 ２次スクリーニング 上記した高処理量アッセイについで２次スクリーニングを行い、例えば当業者
がアゴニストとアンタゴニストを区別できるように、生物学的活性を更に同定す
る。用いる２次スクリーニングの種類は、試験される目的の活性に依存する。例
えば、目的の蛋白質とそれに対応する配位子との相互作用を阻害する能力を用い
て、上記した１次スクリーニングによって単離したペプチド断片群からアンタゴ
ニストを同定するアッセイを行うことができる。 従って、断片及び類似体を作成し、それらの活性を試験する方法は従来公知の
ものを用いることができる。目的の蛋白質の中心的配列（例えばここに開示する
Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの１次アミノ酸配列）を同定できると、当業者には類
似体及び断片の作成は容易であろう。
【０２３５】 Ｈｅｌｉｏｓのペプチド類似体 Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドのペプチド類似体のアミノ酸の長さは、好ましくは
４００、３００、２００、１５０、１３０、１１０、９０、７０未満であり、よ
り好ましくは５０未満であり、最も好ましくは３０、２０、又は１０未満である
。好ましい態様においては、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドのペプチド類似体のアミ
ノ酸の長さは、少なくとも約１０、２０、３０、５０、１００又は１３０である
。
【０２３６】 Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドのペプチド類似体は天然のＨｅｌｉｏｓポリペプチ
ドと好ましくは少なくとも約６０、７０、７４、８０、８５、９０、９５又は９
９％の相同性又は配列類似性を有する。
【０２３７】 Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドのペプチド類似体は、天然のＨｅｌｉｏｓポリペプ
チドと少なくとも１、２、５、１０又は２０アミノ酸残基が異なるが、好ましく
は天然のＨｅｌｉｏｓポリペプチドと１５、１０又は５未満のアミノ酸残基が異
なる。
【０２３８】 Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの有用な類似体は、アゴニストであってもアンタゴ
ニストであってもよい。ＨｅｌｉｏｓポリペプチドのアンタゴニストはＨｅｌｉ
ｏｓ−Ｉｋａｒｏｓ二量体を形成するが、いくつかの追加的な生物学活性（例え
ばリンパ球発達を制御する遺伝子の転写活性化）を欠失した分子であってもよい
。Ｈｅｌｉｏｓアンタゴニスト及びアゴニストは、リンパ球の成熟及び機能を調
節する（例えば阻害又は促進する）ことのできる誘導体である。 Ｈｅｌｉｏｓ領域の数多くの重要な機能が、本発明者らによって明らかにされ
ている。そこで得られた知見によって、当事業者はＨｅｌｉｏｓ類似体を作成で
きるであろう。ある領域において非保存アミノ酸が変化すると、その領域が関与
している活性が失われることは理解されよう。特に、重要な機能領域外の保存ア
ミノ酸の変化によって、活性の変化が調節されることはあまりない。保存アミノ
酸置換についての説明を下記に述べる。
【０２３９】 Ｈｅｌｉｏｓ及びＩｋａｒｏｓ蛋白質の基本的構造は、非常によく似ており、
４ブロックの配列が特によく保存されている。第一の保存ブロックは、Ｉｋａｒ
ｏｓ蛋白質のＤＮＡ結合を媒介するＩｋ−１アイソホーム中に含まれる、ジンク
フィンガーモジュールをコードする（Ｍｏｌｎａｒ他（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、８２９２−８３０３参照）。第二の保存ブロックは機能
的に特徴付けられていない。
【０２４０】 第３の保存ブロックは、Ｉｋａｒｏｓ蛋白質の転写活性を媒介することが示さ
れている高度に保存された８１アミノ酸配列である。このＩｋａｒｏｓの活性化
領域は、酸性アミノ酸領域（stretch）とそれに続く疎水性残基領域から構成さ れる。両方とも、完全な活性能を発現するのに必要である。Ｉｋａｒｏｓのみか
らのこの領域又はＩｋａｒｏｓ蛋白質の全長は、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合領域を有
する融合蛋白質に転写活性を与える。この例によって、Ｈｅｌｉｏｓの相同的領
域は、酵母菌及び哺乳類細胞中の転写活性領域でもあることが示され、Ｈｅｌｉ
ｏｓ転写活性領域が哺乳類細胞中でＩｋａｒｏｓからの相同的領域よりも強い転
写活性を有することが示された。その結果、Ｈｅｌｉｏｓの２３２Ｃ末端アミノ
酸には酵母菌細胞内で転写活性化を与える能力があることが示された。保存領域
を含まないＨｅｌｉｏｓの１４９Ｃ最末端アミノ酸では、活性は検出されなかっ
た。
【０２４１】 第４の保存ブロックは、二量化を媒介するジンクフィンガーに相当する。２個
の末端ジンクフィンガー領域を含むＨｅｌｉｏｓのＣ末端１４９アミノ酸は、蛋
白質の二量化を媒介した。
【０２４２】 抗体 本発明は、目的のＨｅｌｉｏｓポリペプチド又はＨｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓ
二量体に特異的に反応する抗体も含む。抗蛋白質／抗ペプチド抗血清又はモノク
ローナル抗体は、標準的プロトコルに従って作成することができる［Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａ
ｎｅ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）参照 ］。マウス、ハムスター又はウサギなどの哺乳類を、免疫原形態のペプチドで免
疫化することができる。蛋白質又はペプチドに免疫原性を与える方法としては、
担体への結合又は当分野で公知の他の方法が挙げられる。目的のＨｅｌｉｏｓポ
リペプチド免疫原部分を、アジュバントの存在下に投与することができる。免疫
化の進行は、血漿又は血清中の抗体力価を検出することによってモニターするこ
とができる。標準的ＥＬＩＳＡ又は他の免疫アッセイに、免疫原を抗原として用
いて、抗体のレベルを調べることができる。好ましい態様においては目的の抗体
は、本発明のＨｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓ二量体又はＨｅｌｉｏｓポリペプチド
の抗原決定基（例えば配列番号２、４又は６のポリペプチドを有する抗原決定基
）に免疫特異性を有する。
【０２４３】 ここでいう「抗体」は、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド又はＨｅｌｉｏｓ−Ｉｋａ
ｒｏｓ二量体に特異的に反応する断片も包含することを企図している。抗体は従
来法を用いて断片化することができ、全抗体について上記したのと同様の方法で
実用の断片をスクリーンする。例えば、抗体をペプシンで処理することによって
Ｆ（ａｂ’）2断片を作成することができる。得られたＦ（ａｂ’）2断片を処理
してジスルフィド架橋を除去し、Ｆａｂ’断片を得る。 Ｈｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓ二量体又はＨｅｌｉｏｓポリペプチド、あるいは
その断片又は類似体に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体（Ａｂ）、
並びにＦａｂ’やＦ（ａｂ’）2といった抗体断片を用いて、Ｈｅｌｉｏｓ及び ／又はＩｋａｒｏｓポリペプチドの作用をブロックし、本発明のＨｅｌｉｏｓポ
リペプチドの役割を研究することが可能になる。
【０２４４】 Ｈｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓ二量体又はＨｅｌｉｏｓポリペプチドエピトープ
に特異的に結合する抗体を用いて、組織試料を免疫組織化学染色して、Ｈｅｌｉ
ｏｓ−Ｉｋａｒｏｓ二量体又はＨｅｌｉｏｓポリペプチドの発現の量及びパター
ンを調べることができる。抗Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド抗体を用いて診断的に免
疫沈降及び免疫ブロットを行い、臨床試験の一部として組織又は体液中の野生型
又は突然変異Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドレベルを検出し調べることができる。同
様に、個人において、Ｈｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓ二量体又はＨｅｌｉｏｓポリ
ペプチドレベルをモニターすることができるので、リンパ球分化及び／又は増殖
の調節に関連した疾患を有する個人に、効果的な治療養生法を与えることができ
る。Ｈｅｌｉｏｓ−Ｉｋａｒｏｓ二量体又はＨｅｌｉｏｓペプチドのレベルは、
例えばバイオプシーによって産生された組織内で測定することができる。
【０２４５】 本発明の抗Ｈｅｌｉｏｓ抗体の他の用途としては、ｇｔ１１、ｇｔ１８−２３
、ＺＡＰ及びＯＲＦ８等の発現ベクター内に構築されたｃＤＮＡライブラリーの
免疫学的スクリーニングに用いることが挙げられる。正読み枠及び正方向に挿入
されたコード配列を有するこの種のメッセンジャーライブラリーは、融合蛋白質
を産生することができる。例えばｇｔ１１は、アミノ末端がβ−ガラクトシダー
ゼアミノ酸配列からなりカルボキシ末端が異種ポリペプチドからなる融合蛋白質
を産生する。目的のＨｅｌｉｏｓポリペプチドの抗原性エピトープは、例えば抗
Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド抗体で感染したプレートにのせてはがしたニトロセル
ロース膜フィルターと反応させるなどして、抗原を用いて検出することができる
。このアッセイによって調べたファージを、感染プレートから単離することがで
きる。従って、Ｈｅｌｉｏｓ同族体の存在を他の動物から検出してクローンする
ことができ、代替のアイソホーム（スプライシング変異体を含む）をヒトから検
出してクローンすることができる。
【０２４６】 薬剤スクリーニングアッセイ 精製した組替えＨｅｌｉｏｓポリペプチドを入手可能にすることによって、本
発明は、（この場合、目的のＨｅｌｉｏｓポリペプチドの）通常の細胞機能のア
ゴニスト又はアンタゴニストである薬剤のスクリーニングに用いることのできる
アッセイを提供する。一つの態様においては、アッセイによりＨｅｌｉｏｓポリ
ペプチドと天然の配位子（例えばＨｅｌｉｏｓポリペプチド又はＩｋａｒｏｓポ
リペプチドに特異な抗体）との結合を調節する化合物の能力が評価される。様々
なアッセイフォーマットを用いることができるということは、本発明に鑑みて、
当業者に容易に理解されるであろう。
【０２４７】 化合物ライブラリーと天然抽出物を試験する多くの薬剤スクリーニングプログ
ラムにおいて、所定の時間内に調査する化合物の数を最大化するために、高処理
量アッセイが望ましい。細胞の存在しない（例えば精製又は半精製蛋白質に由来
する）系において実施されるアッセイは、「一次」スクリーニングとして好まし
い場合が多い。というのは試験化合物によって、迅速に結果が得られ分子標的中
の変化を比較的容易に検出できるからである。さらに、試験化合物の細胞毒性及
び／又は生物学的利用能の効果は、生体外系では一般に無視することができ、ア
ッセイは代わりに、他の蛋白質との結合親和性の変質の結果又は分子標的の酵素
特性が変化した結果明らかになると思われる、薬剤が分子標的に及ぼす効果に主
に焦点を置く。
【０２４８】 他の態様 本発明に含まれる態様の例としては、対立変異体；天然突然変異；誘発突然変
異；高度又は低度の緊縮条件下で、配列番号２、４又は６のポリペプチドをコー
ドする核酸にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる蛋白質（高度又は
低度の緊縮条件の定義については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニ
ューヨーク、１９８９、６．３．１−６．３．６参照）；及び、Ｈｅｌｉｏｓポ
リペプチドに対する抗血清によって特異的に結合されるポリペプチドが挙げられ
る。
【０２４９】 本発明の核酸及びポリペプチドは、ここに開示する配列の配列決定エラーによ
る、開示の配列と異なるものも含む。
【０２５０】 本発明に更に含まれるのは、例えばＨｅｌｉｏｓ／Ｈｅｌｉｏｓ二量体又はＨ
ｅｌｉｏｓ／Ｉｋａｒｏｓペプチド等のＨｅｌｉｏｓポリペプチド；例えば担体
、希釈剤又は溶媒などの追加成分を含む組成物である。追加成分は、組成物に生
体外、生体内、薬学的又は獣医学的用途における有用性を与えるものであっても
よい。生体外用途の例としては、結合の研究が挙げられる。生体内用途の例とし
ては、抗体の誘発が挙げられる。
【０２５１】 本発明は又、断片、好ましくは生物学的に活性な断片、又はＨｅｌｉｏｓポリ
ペプチドの類似体が含まれる。生物学的に活性な断片又は類似体とは、配列番号
２、４又は６に示されるＨｅｌｉｏｓポリペプチド、又は他の天然Ｈｅｌｉｏｓ
ポリペプチドの特徴である生体内または生体外活性（例えば上記した生物学的活
性のうち１個以上）を有する断片又は類似体である。特に好ましいのは、生体内
に存在する断片、例えば転写後プロセッシングの結果生じる、又は別にスプライ
シングされたＲＮＡの翻訳の結果生じる断片である。断片は、天然又は内因性細
胞中に発現されるもの、例えば翻訳後プロセッシングの結果（例えばアミノ末端
シグナル配列を除去した結果）発現される断片、並びに発現系（例えばＣＨＯ細
胞内）で産生される断片を含む。ペプチド（例えばＨｅｌｉｏｓポリペプチド）
はしばしば一連の生理学的特徴を有し、そのような特徴は分子の異なる部分に影
響を与えうるので、有用なＨｅｌｉｏｓポリペプチド断片又はＨｅｌｉｏｓポリ
ペプチド類似体は、どのようなＨｅｌｉｏｓポリペプチド活性生物学的アッセイ
においても生物学的活性を示す。最も好ましい断片又は類似体は、どのような生
体内又は生体外Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド活性アッセイにおいても、１０％、好
ましくは４０％、又は少なくとも９０％のＨｅｌｉｏｓポリペプチド（配列番号
２、４又は６）活性を有する。
【０２５２】 類似体は、アミノ酸配列において又は配列に関与しない点で、又はその両方に
おいて、天然のＨｅｌｉｏｓポリペプチドと異なる。配列以外の改変は、Ｈｅｌ
ｉｏｓポリペプチドの生体内又は生体外の化学的変性を含む。配列以外の改変は
、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化又はグリコシル化を含む。
【０２５３】 好ましい類似体の例としては、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドの生物学活性を損な
わない、１以上の保存アミノ酸置換によって又は１以上の非保存アミノ酸置換、
欠失又は挿入によって野生型配列とは異なる配列を有するＨｅｌｉｏｓポリペプ
チド（又は生物学的に活性なその断片）が挙げられる。保存置換は一般に、１個
のアミノ酸とそれに類似する特徴を有する他のアミノ酸との置換、例えば下記群
内での置換を含む：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイ
シン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
他の保存置換を下記表から選んで用いることもできる。
【０２５４】
【表１】
【０２５５】 本発明に含まれる他の類似体として、改変してペプチド安定性を増加させたも
のが挙げられる。例えばそのような類似体は、１個以上の非ペプチド結合（ペプ
チド結合から置き換わったもの）をペプチド配列内に含む。他の例としては、天
然のＬ−アミノ酸（例えばＤ−アミノ酸）或いは非天然又は合成アミノ酸（例え
ばβ又はγアミノ酸）以外の残基を含む類似体、並びに環状類似体が挙げられる
。
【０２５６】 Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド類似体について用いた「断片」という語は、通常少
なくとも約２０残基、より一般的には少なくとも約４０残基、好ましくは少なく
とも約６０残基の長さを有する断片のことを意味する。Ｈｅｌｉｏｓポリペプチ
ドの断片は当業者に公知の方法で作成することができる。得られた断片がＨｅｌ
ｉｏｓポリペプチドの生物学的活性を示す能力があるかどうかは、ここに開示す
るように、当業者に公知の方法で調べることができる。さらに、ペプチドの生物
学的活性に必要とされない、別のｍＲＮＡスプライシング又は別の蛋白質プロセ
ッシングによって産生された残基を含むＨｅｌｉｏｓポリペプチドも含まれる。
【０２５７】 公知の方法によって、ＨｅｌｉｏｓポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベ
クター内に導入し、目的の蛋白質を発現するのに好適な細胞内にベクターを導入
し、ペプチドを回収して精製することによってＨｅｌｉｏｓポリペプチドを得る
ことができる。公知の方法によって、動物（例えばウサギ又はマウス）を免疫化
して、抗Ｈｅｌｉｏｓポリペプチド抗体を回収し、ペプチド及び蛋白質に対する
抗体を得ることができる。
【０２５８】 実施例 新規なＩｋａｒｏｓ関連遺伝子であるＨｅｌｉｏｓの同定 新規なＩｋａｒｏｓ関連因子を同定するために、ＰＣＲに基づく方法を用いた
。ＩｋａｒｏｓＮ末端（Ｉｋ−Ｆ）及びＣ末端ジンクフィンガー（Ｉｋ−Ｒ）領
域中に保存配列をコードする、変性プライマーＧＥＫＰＦＫ及びＹＴＩＨＭＧ（
Ｔｕｒｐｅｎ他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ７：３２５−３３４、１９９７）を用いてＡ
ｉｏｌｏｓ突然変異マウスの脾臓に由来するｃＤＮＡを増幅した。大きさが９８
０塩基対と推定されるＰＣＲ産物をクローンし、Ｉｋａｒｏｓ遺伝子に相同性を
有するユニークＤＮＡ配列を有することが示された。重複（nested）特異性内部
プライマーを用いたＲＡＣＥ ＰＣＲによって全長コード配列を得た。重複遺伝
子特異性プライマーは下記の通りである。 ５”−ＲＡＣＥ Ｒ５１：ＧＧＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＡＧＧＴ（配列番号９）
及びＲ５２：ＣＣＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣ
ＴＣＣ（配列番号１０）；３’−ＲＡＣＥ Ｒ３１：ＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴ
ＧＡＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧ（配列番号１１）及びＲ３２：ＣＡ
ＣＣＴＡＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＣＴＴＣＡＣＣＣ（配列番号１２）
。
【０２５９】 マラソンｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロア
ルト）及びＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造、日本国
滋賀県）を用いて、ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。増幅条件は９５℃、１．５分を
１サイクル；９８℃、２０秒及び７２℃、２．５分を５サイクル；９８℃、２０
秒及び７０℃、２．５分を５サイクル；９８℃、３０秒及び６８℃、２．５分を
３２サイクル；並びに７２℃、１０分を１サイクルとした。重複プライマーを持
ちいた第二の増幅は、第一の増幅によって得た産物の部分を鋳型として用いて行
った。第二の増幅は、９５℃、１．５分を１サイクル；９８℃、２０秒及び６８
℃、２．５分を２０サイクル；並びに７２℃、１０分を１サイクル行った。５’
及び３’産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコン
シン州マディソン）内にクローンし、通常２バンドを生ずる特異的な５”及び３
”プライマー対の様々な組合せを用いて、造血細胞中のＨｅｌｉｏｓ発現のＰＣ
Ｒ分析によって配列決定した。これらの２つのバンドをクローンして配列決定し
た結果、２個の別にスプライシングされた転写物は、第一のＮ末端ジンクフィン
ガーをコードする配列の有無が異なることが示された。
【０２６０】 コードされる蛋白質（Ｈｅｌｉｏｓと称する）は、Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌ
ｏｓに対して高い保存性を示した（それぞれ全体に渡って７３％及び６７％の類
似性を示した）（図１）。３個の蛋白質はＮ末端ジンクフィンガーＤＮＡ結合領
域に渡ってほぼ同一であった。第一〜第四ジンクフィンガーについてＨｅｌｉｏ
ｓとＩｋａｒｏｓ間では、９３％の同一性があり、ＨｅｌｉｏｓとＡｉｏｌｏｓ
では８８％の同一性があった。Ｃ末端ジンクフィンガーを包含する蛋白質二量化
領域について、ＨｅｌｉｏｓとＩｋａｒｏｓ間では８６％の同一性があり、Ｈｅ
ｌｉｏｓとＡｉｏｌｏｓでは７５％の同一性があった。転写活性領域を含む第３
の領域においては、ＨｅｌｉｏｓはＩｋａｒｏｓと６８％の同一性、Ａｉｏｌｏ
ｓと７０％の同一性を示した。上記したように、胸腺ｃＤＮＡを用いたＰＣＲに
よって、２個の別にスプライシングされたＨｅｌｉｏｓを同定した。配列分析に
よって、２個のＨｅｌｉｏｓアイソホームは、Ｎ末端ジンクフィンガーの個数が
異なる産物をコードすることが示された。全長アイソホーム（Ｈｅｌ−１）は、
ＤＮＡ結合ジンクフィンガーを４個とも全て有するという点において、Ｉｋａｌ
ｏｓアイソホームＩｋ−１と相同性を有する。第２のアイソホーム（Ｈｅｌ−２
）は、ジンクフィンガー１がないという点でＩｋ−２と相同性を有するが、Ｉｋ
−２を得るために除去したエクソンにジンクフィンガーＮ末端側の追加の配列が
含まれていたのに対し、Ｈｅｌ−２アイソホームの場合はアイソホーム中に保持
されていた。様々な組合せでプライマー対を用いたＰＣＲ分析の結果、下記に述
べるように約６４〜６６ｋＤａで移動するアイソホームは他に存在しないことが
分かった。Ｈｅｌｉｏｓに対する親和精製ポリクローナル抗体を用いた胸腺細胞
核抽出物のウエスタンブロット分析の結果、他に蛋白質は検出されなかった。Ｈ
ｅｌ−１及びＨｅｌ−２と、ＩｋａｒｏｓアイソホームＩｋ−１及びＩｋ−２と
の間にＮ末端ジンクフィンガーモチーフについて強い保存性があることから、類
似した親和性及びＤＮＡ結合特異性があることが予想される。
【０２６１】 ５’及び３’ジンクフィンガー領域から得た変性プライマーを用いて上記伝達
暗号の内部のクローニングを行った後、５’及び３’ＲＡＣＥ法を用いてヒトＨ
ｅｌｉｏｓ ｃＤＮＡの末端をクローンした。３’非翻訳領域は、更に３ｋｂ伸
長していた。ヒトクローンは、マウスＨｅｌｉｏｓと同一の蛋白質をコードした
。マウス及びヒトＨｅｌｉｏｓのヌクレオチド及び推定蛋白質配列を、ＧＣＧ最
適プログラムを用いて比較した。
【０２６２】 胚形成間のＨｅｌｉｏｓの発現 マウス胚形成間のＨｅｌｉｏｓの発現を、インシトゥーハイブリダイゼーショ
ンによって調べた。比較のために、各段階において、隣接する部分のＩｋａｒｏ
ｓ発現を分析した。胚の調製、プローブ合成及びインシトゥーハイブリダイゼー
ションを含むインシトゥーハイブリダイゼーション法は、実質的にＩｋｅｄａ、
Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ２０：３１８−３２９（１９９６）に記載の方法で実
施した。第８、１１、１３及び１６日目の胚から４個のマイクロメートル部分を
得て、各遺伝子に特異な単鎖［３３Ｐ］ＵＴＰ標識化アンチセンスＲＮＡプロー
ブでハイブリダイズした。スライドを５週間さらし、ヘマトキシリン及びエオシ
ンで染色し、明視野及び暗視野顕微鏡で分析した。
【０２６３】 発達中の胚の全ての造血中心において、Ｈｅｌｉｏｓが発現することがわかっ
た。胚造血の第一の部分を構成するのが卵黄嚢の血島である。Ｈｅｌｉｏｓ及び
Ｉｋａｒｏｓは妊娠第８日目にこの外胚部位で発現された。しかし第１１日目ま
でにＨｅｌｉｏｓ発現が有意に減少する一方、Ｉｋａｒｏｓ発現はこの領域にお
いて１３日間保持された。Ｈｅｌｉｏｓ及びＩｋａｒｏｓは第１１日に肝臓で発
現された。しかしＨｅｌｉｏｓのｍＲＮＡはこの組織の細胞小群内に表れた。造
血発達を通じて、肝臓中でのＨｅｌｉｏｓ発現は分散した少量の細胞中に検出さ
れた。これに対してＩｋａｒｏｓは、中期〜後期の妊娠期間中、この組織中に存
在するほとんどの細胞において高いレベルで発現された。胸腺において、Ｈｅｌ
ｉｏｓはまず第１３日に低レベルで検出されたのに対し、Ｉｋａｒｏｓ発現は２
日前からこの部位で容易に検出された。第１６日には、Ｈｅｌｉｏｓは、脈管構
造から初期幹細胞が入る領域である、胸腺の中心に向って高濃度で検出された。
これに対してＩｋａｒｏｓはほとんどの胸腺細胞において検出された。Ｈｅｌｉ
ｏｓのこの発現パターンは、生後の胸腺においても保持された。Ｈｅｌｉｏｓは
成人脾臓内の細胞小群からも検出された。免疫化細胞の脾臓胚芽中心において、
少量の細胞が中レベルのＨｅｌｉｏｓを発現し、その一方でＩｋａｒｏｓはこれ
らの中心に渡って高レベルで発現された。これらの局在化は、これらがＤＣ４+ ＴＨ2細胞であることを示唆している。
【０２６４】 造血系の他には、Ｈｅｌｉｏｓの発現は多くの上皮組織において高いレベルで
あった。これらは腸の内皮、腎臓の細管、気道内皮及び嗅上皮を含む。後期妊娠
期間中、唾液線及び唾液管において高レベルのＨｅｌｉｏｓが検出された。
【０２６５】 ＨｅｌｉｏｓのＮ末端ジンクフィンガーとＣ末端ジンクフィンガーとの間の領
域をプローブとして用いて、ＰｏｌｙＡ+により選択したＲＮＡのノーザンブロ ット分析によって成人組織中のＨｅｌｉｏｓ発現を調べた。ノーザンブロット分
析とＲＴ−ＰＣＲは、以下のように行った。９８０ｂｐのｃＤＮＡを、ノーザン
分析のプローブとして用いた。このプローブは、異なる寸法の転写物を産生する
Ｉｋａｒｏｓ又はＡｉｏｌｏｓと交差反応しなかった。ブロットを前もってＧＡ
ＰＤＨプローブでスクリーンし、ＲＮＡ試料の相当負荷（equivalent loading）
を調べた。ノーザン分析の結果は、約８ｋｂの転写物が胸腺で検出されたことを
示した。胚形成の様々な時点において、Ｈｅｌｉｏｓは肺、肝臓、腎臓及び脳内
で発現された。しかし成人のこれらの組織中ではノーザン分析によってＨｅｌｉ
ｏｓのｍＲＮＡは検出されなかった。Ｈｅｌｉｏｓプローブは、胸腺及び脾臓に
おいて寸法の異なるより多くの伝達暗号をコードするＩｋａｒｏｓ又はＡｉｏｌ
ｏｓとは、交差反応しなかった。
【０２６６】 造血亜集団におけるＨｅｌｉｏｓの発現 分類された成人造血及びリンパ系幹細胞中におけるＩｋａｒｏｓ遺伝子ファミ
リーメンバーの発現を、Ｈｅｌｉｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓに対する
特異的プライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲによって調べた。下記のＲＴ−ＰＣＲ
条件、Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓプライマーを用いて行った。ＨＰＲＴプラ
イマー（正方向：ＴＧＧＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧ（配列番号１３
）；逆方向：ＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣ（配列番号１４））を
ＲＮＡ回収用の対照として用いた。造血細胞中のＨｅｌｉｏｓ発現を分析するた
めに、下記のプライマー対を用いた。正方向（２Ｆ）：ＧＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡ
ＴＡＴＧＧＣＣ（配列番号１５）（Ｈｅｌｉｏｓ ｃＤＮＡのヌクレオチド６０
〜７８）及び逆方向（８Ｒ）：ＧＧＣＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣ（
配列番号１６）（Ｈｅｌｉｏｓ ｃＤＮＡのヌクレオチド１３２７−４７）。Ｐ
ＣＲにおいて、プライマー１２５Ｆ：ＡＧＡＡＴＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣ
Ｔ（配列番号１７）（ヌクレオチド７０７−７２６）及び８Ｒを用いて増幅した
。この正方向プライマーは、第一のジンクフィンガーをコードする領域の下流に
位置し、従ってＨｅｌｉｏｓアイソホームを１個だけ増幅する。全ての場合にお
いて、アニール温度は６０℃であり、線形レンジ（linear range）に入るように
増幅を決めた。細胞数が限定されている幹細胞群に由来する骨髄について、５０
細胞相当のｃＤＮＡを３２サイクルに渡って増幅した。胸腺細胞前駆体について
、１００細胞相当の増幅を各プライマーについて２６サイクルに渡って行った。
他の試料、例えばＩｋａｒｏｓについては２５サイクル行い、Ｈｅｌｉｏｓ及び
Ａｉｏｌｏｓについては２８サイクル行った。
【０２６７】 研究及び固体発生に用いた血−リンパ球小群を、図２に示す。野生型マウスの
骨髄から、幹細胞群（ｃｋｉｔ+Ｓｃａ−１+、系統-）及び初期幹細胞（ｃｋｉ ｔ+Ｓｃａ−１-、系統-及びｃｋｉｔ+ＳＣＡ−１+Ｓｃａ２+、系統-）を精製し た。細胞表面マーカーに対する抗体及び磁気二次抗体を用いて、系統関連赤血球
（ｌｅｒ１１９+）、ｐｒｅＢ（Ｂ２２０+）、顆粒球（Ｍａｃ］+、ＧＲ+）、単
球／マクロファージ（Ｍａｃｌ+、ＧＲ-）群を、野生型マウスの骨髄から精製し
、ＭＡＣＳ磁気分離カラムを用いて分離した。ＰｒｏＢ細胞をＲａｇ−／−マウ
スの骨髄からＢ２２０+分類し、成熟Ｂ細胞を野生型マウス脾臓からＢ２２０+分
類した。−Ｒａｇ−／−マウスからの脾細胞の赤血球を涸渇させ、ＮＫ胸腺細胞
及び脾臓の樹状細胞の濃縮源を精製した。ダブルポジティブ（ＣＤ４+ＣＤ８+）
及びシングルポジティブ（ＣＤ４+又はＣＤ８+）を野生型胸腺から分類し、この
分化状態にて停止するＲａｇ−／−マウスの胸腺細胞から可溶性ネガティブ（Ｃ
Ｄ４ＣＤ８）を得た。ダブル胸腺細胞（ＣＤ４10、ｃｋｉｔ+ＣＤ２５+、ｃｋｉ
ｔ-ＣＤ２５+、ｃｋｉｔ、ＣＤ２５）の発達段階は、９８〜９９％の純度で分類
された。
【０２６８】 幹細胞活性を高度に富化した骨髄幹細胞群中（ｃｋｉｔ+／Ｓｃａ−１+系統- ）にＨｅｌｉｏｓ ｍＲＮＡを検出したが、より制限されたリンパ系又は赤血球
骨髄ポテンシャルの造血幹細胞（それぞれｃｋｉｔ+／Ｓｃａ−１+／Ｓｃａ−２ + 及びｃｋｉｔ+／Ｓｃａ−１-／Ｓｃａ−２-）中にも存在した。Ｉｋａｒｏｓが
これらの造血幹細胞群中で類似の発現パターンを示すのに対し、Ａｉｏｌｏｓは
リンパ球発達に関係した幹細胞（ｃｋｉｔ+／Ｓｃａ−１+／Ｓｃａ−２+）にお いてのみ検出された。
【０２６９】 Ｈｅｌｉｏｓは、固有赤血球前駆体（ｔｅｒ１１９+）で発現され、非常に低 いレベルのＨｅｌｉｏｓ ｍＲＮＡが成人骨髄中の単球（ｍａｃ１+ＧＲ-）及び
顆粒細胞（Ｍａｃ１+ＧＲ+）群内に存在した。ＡｉｏｌｏｓではなくＩｋａｒｏ
ｓが、これら３種の細胞全てに低レベルで検出された。Ｈｅｌｉｏｓはｐｒｏ−
Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ+／ＣＤ４３+）中に低レベルで存在し、ｐｒｅ−Ｂ細胞（Ｃ
Ｄ４５Ｒ+／ＩｇＭ+）に変化するにつれて減少した。これに対し、Ａｉｏｌｏｓ
発現はｐｒｏ−Ｂ細胞において低く、ｐｒｅ−Ｂ及び成熟Ｂ細胞において劇的に
増加した。
【０２７０】 骨髄赤血球及びＢリンパ球系統においてＨＳＣが分化するにつれて、Ｈｅｌｉ
ｏｓ発現は低減した。しかし、Ｈｅｌｉｏｓは分析した全てのＴ細胞小群におい
て様々なレベルで存在した。胸腺に入る最も初期のリンパ球幹細胞は、ＣＤ４10 （及びｃｋｉｔ+）であり、Ｔ細胞系統に必ずしも関連していない。Ｈｅｌｉｏ ｓ及びＩｋａｒｏｓの両方とも、これら最も初期のリンパ球幹細胞中で検出され
る。ｃｋｉｔ+ＣＤ２５+次いで（Ａｉｏｌｏｓが最初に検出された）ｃｋｉｔ- ＣＤ２５+への遷移中のＨｅｌｉｏｓにおける増加は明らかである。次の段階で 顕著なＡｉｏｌｏｓレベルの増加が観察された（ｃｋｉｔ-ＣＤ２５-）一方、Ｈ
ｅｌｉｏｓ発現は低下した。ＩｋａｒｏｓのレベルはこれらＴ細胞分化の初期段
階において一定であった。対照として、野生型及びＲａｇ−／−マウスの全胸腺
細胞群から得たＲＮＡ中の遺伝子発現を行った。Ｒａｇ−／−マウスにおいて、
多くの胸腺細胞が、Ｔ細胞発達がブロックされるｃｋｉｔ+ＣＤ２５+段階にある
一方、野生型の胸腺において、細胞の大部分がダブルポジティブ（ＣＤ４+ＣＤ ８+）段階後期にあった。Ｈｅｌｉｏｓ ｍＲＮＡはＴ細胞がＣＤ４-ＣＤ８-ダ ブルネガティブからＣＤ４+ＣＤ８+ダブルポジティブにいたるにつれて増加し、
シングルポジティブ（ＣＤ４+又はＣＤ８+）胸腺細胞になるにつれて減少した。
周辺Ｔ細胞は皮膚（Ｖγδ）及び腸（ＩＥＬ）のγδＴ細胞中において最も高い
レベルでＨｅｌｉｏｓを発現したが、未成熟胸腺細胞より低いレベルでの発現だ
った。Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓはこれらＴ細胞群中に存在したが、Ａｉｏ
ｌｏｓは胎児由来皮膚γδＴ細胞中では検出されなかった。３つの遺伝子全ては
、ＮＫ細胞中に発現された。胸腺樹状細胞（ＤＣ）由来のリンパ球と、脾臓ＣＤ
８+及びＣＤ８-樹状細胞小群は、非常に低いレベルのＨｅｌｉｏｓを発現した。
Ｉｋａｒｏｓは３つの群全てにおいて存在したが、脾臓ＣＤ８-ＤＣ小群におい て最もレベルが高かった。ＤＣ亜集団中、Ａｉｏｌｏｓは脾臓ＤＣ８-ＤＣにお いて最もレベルが高かった。
【０２７１】 ２個のＨｅｌｉｏｓイソホームの発現を、第一のジンクフィンガーに先立つ５
’プライマーを用いるＰＣＲによって検出した。これらのイソホームはＨｅｌ−
１及びＨｅｌ−２ ｃＤＮＡに相当し、試験した全ての細胞型においておおよそ
等しいレベルで発現した。上記したように、本明細書の条件では、異なる造血細
胞群におけるＩｋａｒｏｓイソホームの比について有意な差は検出できなかった
が、これに対して増幅は線型レンジ中に含まれることがわかった。分析した全て
の種の造血細胞において、Ｉｋ−１及びＩｋ−２が高レベルで発現されたのに対
し、Ｉｋ−４及び５は低レベルで発現された。Ｉｋ−６に相当するかすかなバン
ドも、試験された全ての群において検出された。
【０２７２】 造血細胞発達中、Ｈｅｌｉｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓはオーバーラ
ップするがはっきりと異なる発現パターンを示した。造血系においてこれら３個
の因子が異なる発現パターンを持つことは、分化の間にそれぞれが特異的な調節
機能を有することを示している。
【０２７３】 ＨＳＣが発生する部位においてＨｅｌｉｏｓが発現することは、この遺伝子が
造血細胞発達の初期段階における重要な調節因子であることを示唆している。卵
黄嚢中では第８日に、胎児肝臓中では第１１日に、造血幹細胞が蓄積した。Ｉｋ
ａｒｏｓ及びＨｅｌｉｏｓは初期段階にこれらの領域中でおおよそ同じ数だけ発
現した。妊娠期間が経つにつれて、これらの部位において、より関連のある赤血
球幹細胞も増加した。Ｉｋａｒｏｓ発現が両方の部位で増加するのに対して、Ｈ
ｅｌｉｏｓは限られた数の細胞内でしか発現されない。このことが、胚中の関連
度の低い造血幹細胞中の選択的発現に影響を与えると思われる。成人中の分類さ
れた造血細胞中のＨｅｌｉｏｓの発現が、この考えを支持している。Ｈｅｌｉｏ
ｓは成人ＨＳＣ内で発現されるが、その発現量は成熟中の赤血球、マクロファー
ジ及びＢリンパ球系統において減少する。Ｈｅｌｉｏｓは、Ｔ細胞発達の初期段
階において発現量が最も高く、胸腺で成熟し周囲に移送されたＴ細胞では減少す
る。有意なレベルのＨｅｌｉｏｓが僅かな成熟Ｔ細胞小群においてのみ保持され
ていた。免疫化に際して、脾臓胚芽中心における非常に僅かな数の細胞中でＨｅ
ｌｉｏｓが検出された。Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓの場合と比較すると、Ｈ
ｅｌｉｏｓ発現のこの概要は、Ｉｋａｒｏｓ及びＨｅｌｉｏｓを含む転写複合体
が造血の初期段階において支配的であることを示唆している。この組み合わせは
、ＩｋａｒｏｓＤＮ同形接合マウスにおいて損なわれた初期幹細胞の自己再生能
にとって重要であろう。発達が進行するにつれて増加するＡｉｏｌｏｓ及びＩｋ
ａｒｏｓの発現によって、系統発達及び分化を促進する複合体が得られるであろ
う。
【０２７４】 Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓが造血系において支配的に発現されるのに対し
、Ｈｅｌｉｏｓは胚の他の部分でも発現されている。この観察に基づいて、Ｉｋ
ａｒｏｓ遺伝子ファミリーは他の組織上での系統発達も調節していると推測され
る。胚におけるＨｅｌｉｏｓの劇的な発現は、そのような役割と矛盾しない。Ｈ
ｅｌｉｏｓ遺伝子の突然変異分析を用いることによって、造血系及び胚の他の部
分における幹細胞発達の調節における役割が詳細に分析できる。
【０２７５】 Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓとの、Ｈｅｌｉｏｓによる同質二量体及び異質二
量体の形成 Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓが同質又は異質二量化するときに媒介となるこ
とが分かっている、それらのＣ末端ジンクフィンガーは、Ｈｅｌｉｏｓにおいて
高レベルで保存されている。Ｈｅｌｉｏｓに特異的なポリクローナル抗体を作成
して、ＨｅｌｉｏｓアイソホームとＩｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓ蛋白質との相
互作用を研究した。Ｈｅｌｉｏｓ特異的ポリクローナル抗体は以下のように作成
した。ＨｅｌｉｏｓのＮ末端ジンクフィンガーとＣ末端ジンクフィンガーとの間
の領域を、ＰＣＲによって増幅し、ｐＲＳＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、カリフォルニア州カールズバッド）の枠内にクローニングした。蛋白質をＢＬ
２１大腸菌内で発現し、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カー
ルズバッド）の指示に従って変性蛋白質をニッケル親和性カラムで精製した。こ
の蛋白質に対してウサギポリクローナル抗体を作成し、ｐＨ溶出によって親和精
製した。この抗体がＨｅｌｉｏｓに対して特異性を有するが他のＩｋａｒｏｓ同
族体には特異性を有さないことを、トランスフェクト２９３Ｔ細胞からの蛋白質
抽出物のウエスタンブロット分析と、トランスフェクト細胞の免疫蛍光検査によ
って確認した。ウエスタン分析では、蛋白質溶解物を１×レムリ試料緩衝液に入
れ、９５℃で１５分加熱し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離させた。分離
した蛋白質を、親和精製したポリクローナルＨｅｌｉｏｓ抗体（ＰＢＳ、０．０
５％ＴＷＥＥＮ−２０中で１／５００倍希釈）をプローブとするイモビロンＰ膜
上に写した。一次細胞中のＨｅｌｉｏｓを検出するために、１／５０００倍希釈
したビオチン化ヤギ−α−ウサギ抗体と共に膜を保温して増幅し、同じ倍率で希
釈したペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）
中に入れた。検出にはＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スウェーデン国ウプサ
ラ）を用いた。
【０２７６】 抗Ｈｅｌｉｏｓ抗体は、野生型のＩｋａｒｏｓナル及びＩｋａｒｏｓ ＤＮ＋
／−突然変異マウスからの胸腺細胞核抽出物中に２種のＨｅｌｉｏｓアイソホー
ムを認識した。胸腺細胞中に検出されたＨｅｌｉｏｓアイソフォームは約６４及
び６８ｋＤａであり、上皮細胞系２９３Ｔ内に共発現されたとき、Ｈｅｌ−１及
びＨｅｌ−２ ｃＤＮＡにより産生された蛋白質と共に移動した。
【０２７７】 一次細胞においてＨｅｌｉｏｓが物理的にＩｋａｒｏｓと相互作用を起こすの
かを調べるために、マウストランスジェニックの胸腺から得た細胞溶解物を用い
て、ＣＤ２ミニ遺伝子から発現したＩｋ−７アイソホームにエプトープ標識化（
ＦＬＡＧ）したものを得た。Ｉｋ−７はＩｋａｒｏｓ ＤＮ突然変異遺伝子座に
よって産生される支配的なアイソホームであり、ＤＮＡ結合領域を有さないが未
反応のＣ末端二量化ジンクフィンガーモチーフを有する。ＦＬＡＧエビトープに
特異なマウスモノクローナル抗体を用いて胸腺全細胞溶解物から複合体を免疫沈
降した。Ｈｅｌｉｏｓポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット分析によ
って、免疫沈降した複合体中に二種のＨｅｌｉｏｓアイソホームが存在すること
がわかった。従って、ＩｋａｒｏｓＤＮ蛋白質はＨｅｌｉｏｓ蛋白質アイソホー
ムと安定した蛋白質複合体を形成し、それらの通常の活性を生体内で阻害しうる
。
【０２７８】 ＨｅｌｉｏｓアイソホームＨｅｌ−１及びＨｅｌ−２が自身、Ｉｋａｒｏｓ及
びＡｉｏｌｏｓと二量体を形成する能力についてより詳しく調べるために、これ
らの因子を対の組合せで２９３Ｔ細胞内で一過性に発現させた。２９３Ｔ細胞内
におけるＩｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓの一過性発現は、下記のように行った。
５’又は３’末端にプライマー［５’ＡＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＣ
ＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＴＧＧ（配列番号１８）及び３’Ｒ：ＴＴＴＴＣＣＴＴＴ
ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＴＣＧＣＣＡＴＣＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧ（配列番号１
９）］を用いたＰＣＲで、胸腺細胞ｃＤＮＡから全長Ｈｅｌ−１又はＨｅｌ−２
アイソホームを増幅し、ＣＤＭ８哺乳類発現ベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔｌ部
位（ＣＤＭ８−Ｈｅｌ−１、ＣＤＭ８−Ｈｅｌ−２）との間にクローニングした
。ＦＬＡＧ又は血球凝集素（ＨＡ）標識（ＦＬＡＧ−Ｈｅｌ−１、ＦＬＡＧ−Ｈ
Ｅ１−２、ＨＡ−ＨＥ１、ＨＡ−Ｈｅｌ−２）を有する追加の構造体を作成した
。クローンを配列決定して突然変異がないこと、及びエピトープ標識と共に枠内
にあることを確認した。２９３Ｔ細胞を各ｃＤＮＡ１０μｇでトランスフェクト
した。２日後、各１０ｃｍプレートから得た細胞をそれぞれ０．５ｍｌ溶解緩衝
液に入れ、１０μｌの抽出物をウエスタンブロット分析に用いて各蛋白質の発現
を確認し、１００μｌの抽出物を蛋白質Ｇアガロースで確保し、抗ＦＬＡＧ Ｍ
５親和性ゲルによって免疫沈降させた。洗浄の後、ビーズを２×レムリ試料緩衝
液中に再懸濁し、９５℃で１５分間保温した。ビーズをスピンダウンし、上澄液
の１／３を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。２９３Ｔ抽出物について
、Ｉｋａｒｏｓ又はＨｅｌｉｏｓに特異な親和精製ポリクローナル抗体による保
温に続いてペルオキシダーゼ結合ヤギ−α−ウサギ２次抗体との保温を行ったこ
とを除いては、上記したのと同様にウエスタンブロット分析を実施した。一次細
胞からの免疫沈降用に、ＦＬＡＧ標識化優性ネガティブ突然変異体Ｉｋａｒｏｓ
アイソホームＩｋ−７をＣＤ２ミニ遺伝子から発現するトランスジェニックマウ
スから、胸腺細胞又は脾細胞を得た。細胞を回収し、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で洗
浄した。１００μｌ溶解緩衝液あたり１×１０7細胞個の溶解を行って蛋白質抽 出物を調製した。
【０２７９】 上記したように、ＨｅｌｉｏｓアイソホームＨｅｌ−１及びＨｅｌ−２が自身
、Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓと二量体を形成できるかどうかを調べるために
、これらの因子を対の組合せで２９３Ｔ細胞内で一過性に発現させた。各発現対
中の１個の蛋白質をエピトープ標識化（ＦＬＡＧ）した。２日後、細胞溶解物を
調製し、Ｈｅｌｉｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓ蛋白質にそれぞれ特異な
抗体を用いてウエスタンブロット分析を行ったところ、蛋白質の発現が確認され
た。エピトープ標識に対する抗体（抗ＦＬＡＧ）を用いて、２９３Ｔ細胞溶解物
から複合体を免疫沈降させ、Ｉｋａｒｏｓ又はＨｅｌｉｏｓに特異な抗体を用い
て沈降した複合体の蛋白質相互作用を分析した。抗ＦＬＡＧ抗体はＦＬＡＧ−Ｈ
ｅｌ−１及びＨｅｌ−２の両方と共沈降した。これは、２個のアイソホームが二
量化できることを示している。同様の方法を用いてＨｅｌｉｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ
及びＡｉｏｌｏｓ相互作用を研究した。ＦＬＡＧ−Ｈｅｌ−１又はＦＬＡＧ−Ｈ
ｅｌ−２はＩｋ−１と共発現された。抗ＦＬＡＧ抗体は、両方の場合において免
疫沈降複合体中にＩＫ−１を沈降させた。Ｈｅｌｉｏｓ／Ｉｋａｒｏｓ蛋白質相
互作用の特異性を制御するために、ＩｋＭ１（Ｉｋ−１突然変異体）もこれらの
アッセイに用いた。ＩｋＭ１はＩｋａｒｏｓのＣ末端ジンクフィンガー中に２個
の突然変異をコードする（この突然変異は二量化能を不能にする）。Ｉｋ−１と
は対照的に、この二量化不能ＩｋａｒｏｓはＨｅｌｉｏｓアイソホームのいずれ
とも相互作用できなかった。最後に、細胞をＦＬＡＧ−Ａｉｏｌｏｓ及びＨｅｌ
−１又はＨｅｌ−２で細胞を共トランスフェクトさせ、各Ｈｅｌｉｏｓアイソホ
ームがＡｉｏｌｏｓと異質二量体を形成できることが示された。これらの研究結
果は、Ｈｅｌｉｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓのＣ末端ジンクフィンガー
が機能的に保持され、造血並びにリンパ球分化及び機能にとって重要と思われる
これら蛋白質間の安定な相互作用を媒介することを示している。
【０２８０】 Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓを含む高次核構造の部分としてのＨｅｌｉｏｓ Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓに関する本発明者らの研究は、これらの蛋白質
が増殖していない（活性化に際して劇的に変化する）リンパ球中の高次構造の部
分であることを示している。Ｈｅｌｉｏｓがこれらの核高分子構造に関与してい
るかどうかを調べるために、一次リンパ系細胞における亜細胞性の局在化につい
て共焦点免疫蛍光顕微鏡で調べた。一次胸腺細胞又は脾細胞が得られた。胸腺細
胞を２０μｇ／ｍｌのＣＤ３で覆ったプレート上で４０時間活性化した。細胞を
回収してリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。１スライドあたり１×１０5 個の細胞をサイトスピンにかけ、４％パラホルムアルデヒド、０．５％ＴＷＥＥ
Ｎを含むＰＢＳ中に４℃で固定し、ＰＢＳで洗浄した。抗体保温の前に３％ＢＳ
Ａ、１％ヤギ血清、１％ロバ血清を含むＰＢＳで１時間ブロックした。スライド
を１／５０倍に希釈した一次親和精製したＨｅｌｉｏｓ抗体と共にブロッキング
緩衝液中に４℃で一晩保温した。次いで５ｎｇ／μｌビオチン化ヤギ−α−ウサ
ギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）で室温にて６０分保温し、次いで５ｎｇ
／μｌビオチン化ヤギ−α−ウサギＩｇＧで室温にて６０分保温した。各抗体保
温段階の後には、ＰＢＳによる洗浄を３回行った。５ｎｇ／１μｌアビジン−Ｆ
ＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓ）と共に１％透析化ＦＣＳ／３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中にて４５分保温して検
出を行った。最終段階として、二重染色用に、Ａｌｅｘａ５６８発蛍光団（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に直接結合する親和性ポリクローナルＡｉｏｌ
ｏｓで４℃にて一晩保温した。Ｈｅｌｉｏｓの三重染色用に、トランスジーンマ
ウスからの細胞中のＡｉｏｌｏｓ及びＦＬＡＧ標識化ＩＫ−７を更に５ｎｇ／１
μｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ５モノクローナル抗体（Ｋｏｄａｋ）と共に室温にて６０
分間保温し、洗浄して５ｎｇ／μｌ Ｃｙ５結合ヤギ抗マウス抗体と共に６０分
間保温した。特異的染色を共焦点免疫蛍光顕微鏡にて映像化した。
【０２８１】 野生型マウスから単離した、増殖していない又は活性化された胸腺細胞及び脾
細胞を、これらの共焦点研究から調製した。Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓとは
対照的に、Ｈｅｌｉｏｓの明染色は、少数の、増殖していない又は活性化された
胸腺細胞においてのみ検出された（細胞２５個につき約１個）。これら少数の細
胞の核内において、Ｈｅｌｉｏｓは斑点状に検出されたが、これは上記したＩｋ
ａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓの場合に類似している。胸腺細胞の活性化に際して、
Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓの場合と同様に、Ｈｅｌｉｏｓは細胞核中の環状
構造内に再分配された。Ｈｅｌｉｏｓはごく僅かな数の脾細胞中にしか検出され
なかった。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、Ｈｅｌｉｏｓは成熟Ｂ細胞、骨髄性又は赤
血球系細胞において有意なレベルで発現されなかったので、細胞はおそらくＴ又
はＮＫ細胞であろう。
【０２８２】 高次構造中のこれら蛋白質の潜在的な共局在化を調べるために、脾細胞をＡｉ
ｏｌｏｓ及びＨｅｌｉｏｓについて二重染色した。脾臓中のほとんどの細胞がＡ
ｉｏｌｏｓを発現したが、脾細胞小群もＨｅｌｉｏｓを発現した。ほとんどの場
合において、これら２個の蛋白質は完全にオーバーラップし、核内に斑点状パタ
ーンを形成した。しかし、Ｈｅｌｉｏｓ又はＡｉｏｌｏｓのみが検出される小さ
な点が幾つか存在する。加えて、幾つかの細胞はＨｅｌｉｏｓについて明るく染
色されたが、Ａｉｏｌｏｓについては僅かに染色されただけだった。Ｉｋａｒｏ
ｓ及びＨｅｌｉｏｓについて染色された細胞は、類似の蛋白質共局在化パターン
を示した。
【０２８３】 ＨｅｌｉｏｓとＩｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓの核内局在化について更に調べ
るために、ＦＬＡＧ−Ｉｋ−７トランスジーンを発現するマウスの脾臓から得た
Ｔ細胞を用いた。ＦＬＡＧエピトープを三重染色研究に用いて、Ｉｋ−７と内因
性Ｈｅｌｉｏｓ及びＡｉｏｌｏｓ蛋白質の局在化について調べた。若い動物の細
胞において、これら３個の蛋白質は各構造内に共局在化したが、野生型細胞にお
いて観察されたのと類似した結果であった。
【０２８４】 これらの研究は、核内の同じ構造内に３ファミリーメンバー全てが存在するこ
とを示しており、ＩｋａｒｏｓＤＮ突然変異蛋白質が、同じ高分子核構造内に共
局在化することによって、内因性Ｈｅｌｉｏｓ及びＡｉｏｌｏｓ蛋白質の活性に
干渉する能力があることを実証している。分類された細胞の発現の概要から推論
されるように、この免疫蛍光のデータも、胸腺及び脾臓における異なった細胞亜
集団内で、異なるＩｋａｒｏｓファミリー蛋白質が様々な組合せで共発現するこ
とを示している。
【０２８５】 転写活性物質として機能するＨｅｌｉｏｓ Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓは、哺乳類細胞における異所性発現の正の転写
調節因子として機能することが示されている。これら両方の蛋白質の転写活性領
域を、酵母菌１ハイブリッドアッセイによって同定し、哺乳類細胞において同じ
ように機能することが判明した。Ｈｅｌｉｏｓ蛋白質はＩｋａｒｏｓ及びＡｉｏ
ｌｏｓの転写活性領域を保持することが示された。Ｈｅｌｉｏｓ及びＩｋａｒｏ
ｓ間のＤＮＡ結合領域において非常に近い同一性があると仮定して、Ｉｋａｒｏ
ｓ結合部位からのＨｅｌｉｏｓの転写活性能を調べた。４つの高親和性Ｉｋａｒ
ｏｓ結合部位（ＩｋＢＳ２）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現を、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞中、Ｈｅｌｉｏｓ又はＩｋａｒｏｓの存在下に試験した。両方の蛋白
質がバックグラウンドレベルを上回って、リポーター遺伝子の発現の増加を示し
た（図３）。Ｈｌｉｏｓの存在下では５倍の増加が、Ｉｋａｒｏｓの存在下では
７．８倍の増加が検出された。このＨｅｌｉｏｓに媒介される転写活性は、Ｉｋ
ａｒｏｓのコンセンサス結合部位を必要とする。これらの結果は、ＤＮＡ結合領
域と転写活性領域の両方が機能的に保存されることを示している。
【０２８６】 Ｈｅｌｉｏｓ 本発明は、Ｉｋａｒｏｓ遺伝子ファミリーの新規なメンバーであるＨｅｌｉｏ
ｓを同定し特徴付けるものである。Ｉｋａｒｏｓファミリーの３種の遺伝子全て
によってコードされる３種の蛋白質は、保存機能的領域を媒介して、著しく類似
した特性を有する。これら３種全ては、共トランスフェクションアッセイにおい
てＩｋａｒｏｓ及び隣接するプロモーターからの活性転写の特徴となるコンセン
サスＤＮＡ結合部位に結合する。Ａｉｏｌｏｓ及びＩｋａｒｏｓのように、Ｈｅ
ｌｉｏｓは自身または他のファミリーメンバー（Ｉｋａｒｏｓの優性ネガティブ
アイソホームを含む）と、二量体を形成することができる。こららの領域の保存
はこれら蛋白質の類似性を明確にしているが、これらの遺伝子によってコードさ
れる蛋白質間で他の領域は異なり、それらの間に機能特異性を与えている。ファ
ミリーメンバーの間で異なる領域が、他の種においてこれら遺伝子の相同分子種
内で保持されるという事実は、それらが持つ機能の重要性を裏付けている。 造血系統の最初期段階におけるＨｅｌｉｏｓの選択発現は、遺伝子が初期幹細胞
において支配的機能を発揮しうることを示している。優性ネガティブＩｋａｒｏ
ｓ蛋白質がＨＳＣに欠陥を起こし、Ｈｅｌｉｏｓが、系統のこの段階で発現され
るこの蛋白質の唯一の同定された標的であるという事実は、ＨｅｌｉｏｓがＨＳ
Ｃ発達において重要な役割を果たすことを意味している。造血系外でのＨｅｌｉ
ｏｓの発現は、Ｉｋａｒｏｓ遺伝子ファミリーが、他の組織中の幹細胞発達にお
いても役割を持つことを意味している。
【０２８７】 同等物 当業者は、これ以上の慣例的な実験を行うことなく、ここに開示した特異な方
法について多くの同等物が可能であることを理解されるであろう。このような同
等物は本発明の範囲に入るとものであり、請求項によってカバーされる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Ｈｅｌｉｏｓの予想されるアミノ酸配列のＩｋａｒｏｓ(SEQ ID NO: ７)及びＡｉｏｌｏｓ(SEQ ID NO:８)の配列とのアラインメントを描写している 。ＤＮＡ結合ドメインを含む４つのＮ末端ジンクフィンガー(ＺＦ１−４)、蛋白
質のダイマー形成を媒介するＣ末端ジンクフィンガー(ＺＦ５−６)及び保存され
た転写活性化ドメイン(ＴＡＤ)を略記してある。矢印は、保存された配列であっ
て、それらに対して、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子をクローン化するために縮重オリゴＩ
ｋ−１(ＧＥＫＰＫＦ、Ｉｋ−Ｆ)及びＩｋ−２(ＹＴＩＨＭＧ、ＩＫ−Ｒ)がデザ
インされた当該保存された配列を示している。
【図２】 図２は、Ｈｅｌｉｏｓファミリー遺伝子発現について分析した前駆細胞及び拘
束された細胞の造血階層の図式表示を描写している。
【図３】 図３は、マウスのＨｅｌｉｏｓ−１のヌクレオチド(SEQ ID NO:１)及びアミノ
酸(SEQ ID NO:２)配列を描写している。
【図４】 図４は、マウスのＨｅｌｉｏｓ−２のヌクレオチド(SEQ ID NO:３)及びアミノ
酸(SEQ ID NO:４)配列を描写している。
【図５】 図５は、ヒトのＨｅｌｉｏｓ−２のヌクレオチド(SEQ ID NO:５)及びアミノ酸
(SEQ ID NO:６)配列を描写している。
【図６】 図６は、マウスＨｅｌｉｏｓのヌクレオチド配列のヒトのＨｅｌｉｏｓとのア
ラインメントを描写している。
【図７】 図７は、マウスＨｅｌｉｏｓのアミノ酸配列のヒトのＨｅｌｉｏｓとのアライ
ンメントを描写している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ 37/02 16/18 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 クレア ケリー アメリカ合衆国 02144 マサチューセッ ツ、サマビル、ソーンダイク ストリート ９ ナンバー３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA50 CA04 DA02 EA02 EA04 GA03 GA11 HA01 HA12 HA15 HA17 4B063 QA01 QA17 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 AG27 BA15 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA91Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 NA14 ZB072 ZB112 ZB262 ZB272 4C086 AA01 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB07 ZB11 ZB26 ZB27 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA22 FA74 HA06

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 SEQ ID NO:１、３又は５のヌクレオチド配列と少なくとも６
    ０％同一であるヌクレオチド配列を含む実質的に純粋な核酸。
  2. 【請求項２】 SEQ ID NO:１、３又は５のヌクレオチド配列を含む、請求項
    １に記載の核酸。
  3. 【請求項３】 核酸が、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドをコードする核酸又はそ
    の相補物と高緊縮条件下でハイブリダイズする、請求項１に記載の核酸。
  4. 【請求項４】 核酸が、Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドに特異的な抗体と反応す
    るポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸。
  5. 【請求項５】 少なくとも６０アミノ酸長のＨｅｌｉｏｓポリペプチドの断
    片をコードする実質的に純粋な核酸。
  6. 【請求項６】 Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドと少なくとも６０％相同である実
    質的に純粋なポリペプチド。
  7. 【請求項７】 SEQ ID NO:２、４又は６のアミノ酸配列を含む、請求項６に
    記載のＨｅｌｉｏｓポリペプチド。
  8. 【請求項８】 Ｈｅｌｉｏｓポリペプチドが下記の特性を有する、請求項６
    に記載の純粋な調製物： (ａ)それは、Ｈｅｌｉｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ又はＩｋａｒｏｓポリペプチドとダ
    イマーを形成することができ； (ｂ)それは、造血幹細胞において発現され； (ｃ)それは、約６４ｋＤａ又は６８ｋＤａの分子量を有し； (ｄ)それは、少なくとも１つのジンクフィンガードメインを有し；そして (ｅ)それは、リンパ球系遺伝子の転写アクチベーターである。
  9. 【請求項９】 少なくとも５０アミノ酸の長さの、請求項８に記載のＨｅｌ
    ｉｏｓポリペプチドの断片。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜５に記載の何れかの核酸を含むベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜５及び１０の何れかの核酸を含む細胞。
  12. 【請求項１２】 抗Ｈｅｌｉｏｓ抗体の精製された調製物。
  13. 【請求項１３】 Ｈｅｌｉｏｓペプチドの製造方法であって、請求項１１の
    細胞を培地中で培養してＨｅｌｉｏｓポリペプチドを発現させることを含む当該
    製造方法。
  14. 【請求項１４】 天然のＨｅｌｉｏｓポリペプチドの少なくとも１つの生物
    学的活性を有するＨｅｌｉｏｓポリペプチドの製造方法であって、配列の少なく
    とも１つの残基を変え、その変化されたポリペプチドを所望の活性について試験
    することを含む上記の製造方法。
  15. 【請求項１５】 動物の病気の治療方法であって、治療上有効な量のＨｅｌ
    ｉｏｓポリペプチド、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子産物の発現について選択した細胞、又
    はＨｅｌｉｏｓペプチドをコードする核酸をその動物に投与することを含む上記
    の治療方法。
  16. 【請求項１６】 患者がＨｅｌｉｏｓ遺伝子の誤発現と関係する病気の危険
    にあるかどうかを測定する方法であって、その患者をＨｅｌｉｏｓ遺伝子の発現
    又は構造について調べ、非野生型の構造又は発現が危険を示す上記の方法。
  17. 【請求項１７】 Ｈｅｌｉｏｓトランスジーンを有するトランスジェニック
    動物。
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