JP2003530124A - 新規幹細胞成長因子様ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する方法および物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規ポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに新規ヒト幹細胞成長因子様タンパク質に相当する、それらの突然変異体または変異体を提供する。これらのポリヌクレオチドは、ヒト精巣細胞（Ｈｙｓｅｑ クローン識別番号２８８０９８４および２８８１６９５）、ヒト胎児皮膚（Ｈｙｓｅｑ クローン識別番号１５３７５１７６）、成人脾臓（Ｈｙｓｅｑ クローン識別番号１４８５６０９４）、およびヒト内皮細胞（Ｈｙｓｅｑクローン識別番号１３８０４７５６、１３６８７４８７、１３８０４７５６）由来のｃＤＮＡライブラリーから単離された核酸配列を含む。本発明の他の態様は、新規ヒト幹細胞成長因子様ポリペプチドを製造するためのプロセスを含むベクター、およびかかるポリペプチドに特異的な抗体を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 １．関連出願に対する相互参照 本出願は、米国特許仮出願第６０／２１５，７３３号(２０００年６月２８日
提出)の優先権を主張し、米国特許仮出願第６０／２６６，６１４号(２００１年
２月５日提出)（代理人書類番号２１２７２−０３９）は米国特許出願第０９／
７５７，５６２号（２００１年１月０９日提出。表題「Methods and Materials
Relating to Novel Stem Cell Growth Factor-Like Polypeptides and Polynucl
eotides」）（代理人書類番号ＨＹＳ−４ＣＯＮ）の一部継続出願であり、同様
にこれは米国特許出願第０９／５４３，７７４号（２０００年４月５日提出。表
題「Methods and Materials Relating to Novel Stem Cell Growth Factor-Like
Polypeptides and Polynucleotides」）（代理人書類番号ＨＹＳ−４）の継続
出願であり、これは同様に米国特許出願第０９／４９６，９１４号（２０００年
２月０３日提出。表題「Novel Contigs Obtained from Various Libraries」）
（代理人書類番号７８７）の一部継続出願である（これらの記載内容はすべて、
参照により本明細書中に援用される）。 【０００２】 ２．技術分野 本発明は、新規のポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドにより
コードされるタンパク質を、例えば治療、診断および研究方法におけるこれらの
ポリヌクレオチドおよびタンパク質に関する用途と共に提供する。特に本発明は
、新規のヒト幹細胞成長因子様タンパク質に関する。 【０００３】 ２．１ 背景技術 タンパク質因子（例えばリンホカイン、インターフェロン、循環可溶性因子、
ケモカインおよびインターロイキンなどのサイトカイン）の発見を目指す技術は
、過去１０年の間に急速に発達してきた。目下のルーチンはハイブリダイゼーシ
ョンクローニングおよび発現クローニング技法は、それらが発見タンパク質に直
接関連する情報（すなわちハイブリダイゼーションクローニングの場合は、タン
パク質の部分ＤＮＡ／アミノ酸配列；発現クローニングの場合はタンパク質の活
性）に頼るという意味で「直接的に」新規のポリヌクレオチドをクローニングす
る。より最近の「間接的」クローニング技法、例えば現在既知の分泌リーダー配
列モチーフ(motif)の存在に基づいてＤＮＡ配列を単離するシグナル配列クロー
ニング、ならびに種々のＰＣＲベースまたはローストリンジェンシーハイブリダ
イゼーション(low stringency hybridization)ベースのクローニング技法は、生
物学的活性を有することが既知であるタンパク質に関する多数のＤＮＡ／アミノ
酸配列を利用可能にすることにより、従来技術を進歩させてきた。例えばリーダ
ー配列クローニングの場合はタンパク質の分泌されるという性質により、ＰＣＲ
ベースの技法の場合はタンパク質の細胞または組織供給源により、あるいは既知
の生物学的活性のその他の遺伝子との構造的類似性により技術を進歩させてきた
。 【０００４】 同定ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、生物学的多様性を評価する
ために、かつＤＮＡおよびアミノ酸配列によって多数のその他の種類のデータお
よび生成物を作るために、例えば診断、法医学、遺伝子マッピング、遺伝的障害
またはその他の形質の原因となる突然変異の同定において、多数の用途を有する
。 【０００５】 ３．発明の概要 本発明は、幹細胞成長因子活性を有するポリペプチドをコードする単離された
ポリヌクレオチドであって、配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレ
オチド配列またはそれらの成熟タンパク質コード部分、又は成長因子活性を保持
するポリペプチドをコードするそれらの断片、類縁体、変異体もしくは誘導体を
含むポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドには、ストリンジェン
ト(stringent)なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号９、１１、１２、
３１または３３のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするもの、配列番
号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列と約８５％よりも高い配
列同一性を有するヌクレオチド配列を含むもの、配列番号９、１１、１２、３１
または３３のヌクレオチド配列と約９０％よりも高い配列同一性を有するヌクレ
オチド配列を含むもの、および配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌク
レオチド配列と約９２％よりも高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む
単離されたポリペプチドが含まれる。 【０００６】 １４．上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよい。本発明はまた、これ
らのポリヌクレオチドの相補体を含むポリヌクレオチドも含む。 【０００７】 本発明は、幹細胞成長因子活性を有するポリペプチドをコードする単離された
ポリヌクレオチドであって、配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレ
オチド配列またはそれらの成熟タンパク質コード部分、又は成長因子活性を保持
するポリペプチドをコードするそれらの断片、類縁体、変異体もしくは誘導体を
含む単離されたポリヌクレオチドを提供するが、但し、上記ポリヌクレオチド配
列は、配列番号４７のヌクレオチド配列から構成されない。これらのポリペプチ
ドには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号９、１
１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするも
の（但し、上記ポリヌクレオチド配列は、配列番号４７のヌクレオチド配列から
構成されない）、配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列
と約８５％よりも高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むもの（但し、
上記ポリヌクレオチド配列は、配列番号４７のヌクレオチド配列から構成されな
い）、配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列と約９０％
よりも高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むもの（但し、上記ポリヌ
クレオチド配列は、配列番号４７のヌクレオチド配列から構成されない）、およ
び配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列と約９２％より
も高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌペプチド（但し、上記
ポリヌクレオチド配列は、配列番号４７のヌクレオチド配列から構成されない）
が含まれる。 【０００８】 本発明は、配列番号９、１１、１２、３１または３３の成熟タンパク質コード
配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、配列番号９
、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレ
オチドを提供する。 【０００９】 本発明は、幹細胞成長因子活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであ
って、配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列またはそれ
らの成熟タンパク質コード部分、又は成長因子活性を保持するポリペプチドをコ
ードするそれらの断片、類縁体、変異体もしくは誘導体を含むポリヌクレオチド
を提供し、ここで、コードされるポリペプチドは、配列番号３２の少なくともア
ミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配列、もしくは配列番号３４の少なくと
もアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ酸配列を有するか、あるいはコードさ
れるタンパク質は、配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含む
アミノ酸配列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を
含むアミノ酸配列中に、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは挿入を
含むアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖もしくは生存
を支持する活性を有し、但し、Ｃ末端アミノ酸配列は、配列番号４６のアミノ酸
配列を含まない。 【００１０】 本発明は、幹細胞成長因子活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであ
って、配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列またはそれ
らの成熟タンパク質コード部分、又は成長因子活性を保持するポリペプチドをコ
ードするそれらの断片、類縁体、変異体もしくは誘導体を含むポリヌクレオチド
を提供し、上記ＤＮＡは、配列番号３１の少なくともヌクレオチド５７４〜１３
４７を含むＤＮＡ、又はストリンジェントな条件下で、配列番号３１のヌクレオ
チド配列または該配列から調製されるプローブとハイブリダイズ可能であり、か
つ造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活性を有するＤＮ
Ａである。これらには、以下のストリンジェントな条件：６×ＳＳＣ／５×デン
ハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび６８℃（ＳＳＣ ３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ
クエン酸ナトリウム）、５０×デンハルト溶液／１％ＢＳＡ／１％ポリビニル
ピロリドン、１％フィコール４００、又は６×ＳＳＣ、５×デンハルト、０．５
％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび４２℃下にて、ハイブリダイズするＤＮＡ
が挙げられる。 【００１１】 本発明は、幹細胞成長因子活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドをコードするＤＮＡであって、配列番号９、１１、１２、３１または３３
のヌクレオチド配列またはそれらの成熟タンパク質コード部分、又は成長因子活
性を保持するポリペプチドをコードするそれらの断片、類縁体、変異体もしくは
誘導体を含むポリヌクレオチドを提供し、上記ＤＮＡは、配列番号３３の少なく
ともヌクレオチド３２１〜１０７４を含むＤＮＡ、又はストリンジェントな条件
下で、配列番号３３のヌクレオチド配列または上記配列から調製されるプローブ
とハイブリダイズ可能であり、かつ造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖もしくは
生存を支持する活性を有するＤＮＡである。これらには、以下のストリンジェン
トな条件：６×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび６８℃（Ｓ
ＳＣ ３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム）、５０×デンハルト溶
液／１％ＢＳＡ／１％ポリビニルピロリドン、１％フィコール４００、又は６×
ＳＳＣ、５×デンハルト、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび４２℃下
にて、ハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。 【００１２】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを含むベクタ
ーを提供する。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺
伝子操作された宿主細胞を提供する。本発明は、宿主細胞中で本発明のポリヌク
レオチドの発現を制御する調節配列と操作的に連結されて、本発明のポリヌクレ
オチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。これらの宿主細胞に
は、内因性ポリヌクレオチドの発現を増加させる異種調節配列を含むように遺伝
子操作された宿主細胞が含まれる。 【００１３】 本発明は、幹細胞成長因子活性を有するポリペプチドを製造する方法であって
、上記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、培地中にてこれらの宿主細胞
を成長させること、および上記宿主細胞または上記培地から上記ポリペプチドを
単離することを含む方法を提供する。本発明はまた、この方法により製造される
ポリペプチドも含む。 【００１４】 本発明は、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列、もし
くはそれらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持するそれらの断片、
類縁体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチドを提供する。これ
らのポリペプチドには、幹細胞成長因子活性を有するポリペプチドをコードする
単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号９、１１、１２、３１または３
３のヌクレオチド配列またはそれらの成熟タンパク質コード部分、又は成長因子
活性を保持するポリペプチドをコードするそれらの断片、類縁体、変異体もしく
は誘導体を含むポリヌクレオチド、およびストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列
の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチ
ドが含まれる。 【００１５】 本発明は、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列、もし
くはそれらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持するそれらの断片、
類縁体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチドであって、配列番
号１０、１３、１６、３２または３４のヌクレオチド配列と約８５％よりも高い
配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１０、１３、１６、３２または３４
のヌクレオチド配列と約９２％よりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含
むポリペプチドを提供するが、但し、上記ポリペプチド配列は、配列番号４８の
アミノ酸配列から構成されない。 【００１６】 本発明はまた、配列番号１０、１３、１６、３２または３４の成熟タンパク質
部分を含む単離されたポリペプチドを提供する。 【００１７】 本発明は、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列、もし
くはそれらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持するそれらの断片、
類縁体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチドを提供し、ここで
上記ポリペプチドは、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、膜攻撃複合体構成成分／パ
ーフォリンドメイン、および神経下垂体ホルモンシグナチュア(hormone signatu
re)の群から選択される１つまたはそれ以上のモチーフを含む。 【００１８】 本発明は、本発明のＤＮＡの発現産物であるポリペプチドを提供し、これらの
ポリペプチドは、造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活
性を有するポリペプチドであるが、但し、Ｃ末端アミノ酸配列は、配列番号４６
のアミノ酸配列を含まない。 【００１９】 本発明は、配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列を含
む単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号３２の少なくともアミノ酸残
基２２〜２７９を含むアミノ酸配列、あるいは配列番号３２の少なくともアミノ
酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配列中に、１個又は数個のアミノ酸の欠失、
置換または挿入を含むアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドを提供する。 【００２０】 本発明は、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列、もし
くはそれらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持するそれらの断片、
類縁体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチドであって、配列番
号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ酸配列、あるいは配
列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ酸配列中に、１
個又は数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を含むアミノ酸配列を有する単離
されたポリペプチドを提供する。 【００２１】 本発明はまた、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列、
もしくはそれらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持するそれらの断
片、類縁体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチドであって、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニル−ピロリド
ン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチ
レンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(polyoxyethylated
polyol)およびポリビニルアルコールからなる群から選択される１つまたはそれ
以上の修飾剤により修飾されたポリペプチドを提供する。 【００２２】 本発明は、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列、もし
くはそれらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持するそれらの断片、
類縁体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチドであって、配列番
号１０または１３由来の少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む単離されたポリ
ペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号１０、１３、１６、３２または３
４のアミノ酸配列またはそれらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持
するそれらの断片、類縁体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチ
ドであって、配列番号１０または１３のＣ末端の１７個のアミノ酸由来の少なく
とも１０個の連続アミノ酸を含む単離されたポリペプチドを提供する。 【００２３】 本発明は、生物活性を有するポリペプチドであって、少なくとも２７２個のア
ミノ酸を含み、かつ配列番号１０と少なくとも９８％の同一性を有するポリペプ
チドを提供する。本発明はまた、幹細胞成長因子活性を有する単離されたポリペ
プチドであって、配列番号１０、１３、または１６と少なくとも９０％の同一性
を有し、かつアミノ酸配列ＧＩＥＶＴＬＡＥＧＬＴＳＶＳＱＲＴＱＰＴＰＣＲＲ
ＲＹＬ（配列番号２９）（ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパ
ラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒス
チジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝
アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、
Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン）を欠くポリ
ペプチドを提供する。 【００２４】 本発明はまた、幹細胞成長因子活性を有する単離されたポリペプチドであって
、配列番号１０、１３、または１６と少なくとも９０％の同一性を有し、かつア
ミノ酸配列ＧＩＥＶＴＬＡＥＧＬＴＳＶＳＱＲＴＱＰＴＰＣＲＲＲＹＬ（配列番
号２９）（ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝
グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イ
ソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン
、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン）由来の任意の１０個の連続
アミノ酸を欠く単離されたポリペプチドを提供する。 【００２５】 本発明は、幹細胞成長因子活性を有する単離されたポリペプチドであって、ア
ミノ酸配列ＳＶＳＶＳＴＶＨ（配列番号２７）またはＶＳＶＳＴＶＨ（配列番号
２８）（ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グ
ルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソ
ロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ
＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、
Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン）を有する単離されたポリペプ
チドを提供する。 【００２６】 本発明は、本発明の任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
。 【００２７】 本発明は、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列または
それらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持するそれらの断片、類縁
体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチドを含むキットを提供す
る。 【００２８】 本発明はさらに、幹細胞または生殖細胞の生存を維持するか、又はその増殖を
促進するのに有効な量の、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ
酸配列またはそれらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性ポリペプチドを保
持するそれらの断片、類縁体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプ
チドの量を含む培地を提供する。 【００２９】 配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列またはそれらの成
熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持するそれらの断片、類縁体、変異体
もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチド、および薬学的に許容可能な担体
または希釈剤を含む組成物。これらの組成物は、造血幹細胞又は造血前駆細胞の
増殖もしくは生存を支持する効果を有するものを含む薬学的組成物であって、配
列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配列、もしく
は配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ酸配列を有
するポリペプチド、又は配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を
含むアミノ酸配列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７
２を含むアミノ酸配列中に、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは挿
入を含むアミノ酸配列を有し、かつ造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖もしくは
生存を支持する活性を有するポリペプチドを含む薬学的組成物であり得る。 【００３０】 本発明は、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列または
それらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性を保持するそれらの断片、類縁
体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチドに結合する抗体を提供
する。本発明の抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結
合しないものを含む、配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配
列を有するポリペプチドに特異的に結合し得る。本発明の抗体には、ポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、およびヒト化抗体が含
まれる。さらに、本発明は、本発明の抗体を含むキットを含む。 【００３１】 本発明は、試料中の本発明のポリヌクレオチドを検出する方法であって、ａ）
上記ポリヌクレオチドに結合して複合体を形成する化合物と、該試料とを、上記
複合体を形成するのに十分な時間接触させ、かつｂ）上記複合体を検出し、その
結果複合体が検出されると、上記ポリヌクレオチドが検出される、上記方法を提
供する。本発明はまた、試料中の本発明のポリヌクレオチドを検出する方法であ
って、ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にある上記試料を
、かかる条件下で上記ポリヌクレオチドにアニーリングする核酸プライマーと接
触させ、ｂ）上記ポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む産物を増幅し、かつ
ｃ）上記産物を検出することにより、上記試料中の上記ポリヌクレオチドを検出
する方法を提供する。これらの方法には、検出されるポリヌクレオチドが、請求
項２３に記載のポリヌクレオチドである配列番号１０、１３、１６、３２または
３４のアミノ酸配列またはそれらの成熟タンパク質部分、又は成長因子活性ポリ
ペプチドを保持するそれらの断片、類縁体、変異体もしくは誘導体を含むポリペ
プチドをコードする方法が含まれ、上記方法はさらに、アニーリングしたＲＮＡ
分子をｃＤＮＡポリヌクレオチドへ逆転写することを含む。 【００３２】 本発明はまた、試料中の本発明のポリペプチドを検出する方法であって、ａ）
上記ポリペプチドに結合して複合体を形成する化合物と、上記試料とを、上記複
合体を形成する条件で、かつそれを形成するのに十分な時間接触させ、かつｂ）
上記複合体を検出し、その結果複合体の形成が検出されると、上記ポリヌクレオ
チドが検出される、上記方法を提供する。 【００３３】 本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であっ
て、ａ）ポリペプチド／化合物複合体を形成する条件下で、かつそれを形成する
のに十分な時間、上記化合物を上記ポリペプチドと接触させ、かつｂ）上記複合
体を検出し、その結果上記ポリペプチド／化合物複合体が検出されると、上記ポ
リペプチドに結合する化合物が同定される方法を提供する。 【００３４】 本発明はまた、本発明ののポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であ
って、ａ）ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間、細胞中で、
上記化合物を該ポリペプチドと接触させ（ここで、上記複合体は、細胞中のレポ
ーター遺伝子配列の発現を駆動する）、かつｂ）上記レポーター遺伝子配列の発
現を検出することにより、上記複合体を検出し、その結果上記ポリペプチド／化
合物複合体が検出されると、上記ポリペプチドに結合する化合物が同定される方
法を提供する。 【００３５】 本発明は、表面に付着した、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のポリ
ヌクレオチドの特有セグメントを含む核酸アレイを提供する。これらのアレイに
は、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドの特有セグメ
ントに対する完全マッチ(full-matches)を検出するアレイ、本発明のポリヌクレ
オチド、本発明のヌクレオチドの特有セグメントに対するミスマッチ(mismatche
s)を検出するアレイが含まれる。 【００３６】 本発明は、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドの活性または発現の増大が
必要な被験体の治療方法であって、上記方法は、上記被験体に、（ａ）治療に役
立つ量の上記ポリペプチドのアゴニストを含む組成物、（ｂ）治療に役立つ量の
上記ポリペプチドを含む組成物、又は（ｃ）上記ポリペプチドが産出されるよう
な形態で、かつそのような条件で上記ポリペプチドをコードする治療に役立つ量
のポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含み、上記組成物は、薬学的
に許容可能な担体または希釈剤を含む方法を提供する。 【００３７】 本発明はまた、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドの活性または発現の減
少が必要な被験体の治療方法であって、上記方法は、上記被験体に、（ａ）治療
に役立つ量の上記ポリペプチドのアンタゴニストを含む組成物、（ｂ）治療に役
立つ量の、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制するポ
リヌクレオチドを含む組成物、又は（ｃ）治療に役立つ量の、上記幹細胞成長因
子様ポリペプチドと、そのリガンドに関して競合するポリペプチドを含む組成物
を投与することを含み、上記組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を
含む方法を提供する。 【００３８】 本発明はまた、幹細胞又は生殖細胞の増殖もしくは生存を支持する方法であっ
て、上記細胞の生存を維持するか、又はその増殖を促進するのに有効な量の本発
明のポリペプチドと、上記細胞を接触させる方法を提供する。これらの方法には
、上記細胞が、始原生殖細胞、生殖系幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、造血前
駆細胞、多分化能性細胞、または全能性細胞である方法が含まれる。これらの方
法にはまた、上記ポリペプチドが、配列番号１０、１３、または１６のアミノ酸
配列を含むか、あるいは配列番号１０、１３、または１６に配列に対して９０％
の同一性のアミノ酸配列を含む方法が含まれる。これらの方法にはさらに、上記
幹細胞成長因子様ポリペプチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下で、配列番号１０、１３、または１６をコードするポリヌクレオチドの相
補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる方法が含まれる
。 【００３９】 本発明は、幹細胞又は生殖細胞の増殖もしくは生存を支持するのに有効な量で
、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作されたストローマ細胞
を含む。これらの細胞には、始原生殖細胞、生殖系幹細胞、胚性幹細胞、造血幹
細胞、造血前駆細胞、多分化能性細胞、または全能性細胞が含まれる。 【００４０】 本発明は、幹細胞又は生殖細胞の増殖もしくは生存を支持するのに有効な量で
、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞を含む移植片を
提供する。これらの本発明の移植片には、上記細胞が、始原生殖細胞、生殖系幹
細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、多分化能性細胞、または全能性
細胞である移植片が含まれる。 【００４１】 本発明は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１９８のもとで、２０００年６月２６
日に、産業技術総合研究所の生命工学技術研究所（郵便番号３０５−８５６６、
日本国茨城県つくば市東１−１−３）に寄託したプラスミドのタンパク質コード
ｃＤＮＡ挿入物を含む単離されたポリヌクレオチド、および適切な宿主細胞中で
、このポリヌクレオチドにより発現される成熟ポリペプチドを提供する。 【００４２】 本発明はまた、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１９７のもとで、２０００年６月
２６日に、産業技術総合研究所の生命工学技術研究所（郵便番号３０５−８５６
６、日本国茨城県つくば市東１−１−３）に寄託したプラスミドのタンパク質コ
ードｃＤＮＡ挿入物を含む単離されたポリヌクレオチド、および適切な宿主細胞
中で、このポリヌクレオチドにより発現される成熟ポリペプチド発現産物を提供
する。 【００４３】 任意に好ましいのは、２０００年２月３日に提出された米国出願第０９／４９
６，９１４号における配列番号３２８４として記載されるヌクレオチド配列（お
よびそれらにてコードされるポリペプチド配列）、およびGenbank受託番号ＢＡ
Ｂ２８８１１にて記載されるタンパク質以外のポリヌクレオチドならびにポリペ
プチドである。 【００４４】 本発明の組成物には、新規の単離されたポリペプチド、かかるポリペプチドを
コードする新規の単離されたポリヌクレオチド、例えば組換えＤＮＡ分子、クロ
ーニング遺伝子またはそれらの縮重変異体、特に対立遺伝子変異体のような天然
に存在する変異体、アンチセンスポリヌクレオチド分子、およびかかるポリペプ
チド上に存在する１つまたはそれ以上のエピトープを特異的に認識する抗体、な
らびにかかる抗体を産生するハイブリドーマが含まれる。特に、本発明のポリヌ
クレオチドは、ヒト精巣細胞（Ｈｙｓｅｑクローン識別番号２８８０９８４およ
び２８８１６９５）、ヒト胎児皮膚（Ｈｙｓｅｑ クローン識別番号１５３７５
１７６）、成人脾臓（Ｈｙｓｅｑクローン識別番号１４８５６０９４）、および
ヒト内皮細胞（Ｈｙｓｅｑ クローン識別番号１３８０４７５６、１３６８７４
８７、１３８０４７５６）から調製されたｃＤＮＡライブラリーから単離された
ポリヌクレオチドに基づいている。 【００４５】 一態様では、本発明は、配列番号９、１１、１２、３１または３０のヌクレオ
チド配列、それらの成熟タンパク質コード部分、それらの細胞外コード部分、ま
たはそれらの活性ドメインコード部分を含む、幹細胞成長因子活性を有する単離
されたポリヌクレオチドを含む。 【００４６】 一実施形態では、本発明は、生物活性を有するポリペプチドをコードする単離
されたポリヌクレオチドであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下で、幹細胞成長因子活性を有するポリヌクレオチドの相補体にハイブリダ
イズするポリヌクレオチドを含む。 【００４７】 さらなる実施形態では、本発明は、生物活性を有するポリペプチドをコードす
る単離されたポリヌクレオチドであって、幹細胞成長因子活性を有するポリヌク
レオチドと少なくとも約９２％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。 【００４８】 さらなる実施形態では、本発明は、生物活性を有するポリペプチドをコードす
る単離されたポリヌクレオチドであって、幹細胞成長因子活性を有するポリヌク
レオチドと少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。 【００４９】 さらなる実施形態では、幹細胞成長因子活性を有するポリヌクレオチドは、Ｄ
ＮＡである。 【００５０】 さらなる実施形態では、本発明は、上記ポリヌクレオチドは、幹細胞成長因子
活性を有するポリヌクレオチドの相補体を含む単離されたポリヌクレオチドを含
む。 【００５１】 本発明はまた、幹細胞成長因子活性を有するポリヌクレオチドを含むベクター
を含む。あるいは、本発明は、幹細胞成長因子活性を有するポリヌクレオチドを
含む発現ベクターを含む。幹細胞成長因子活性を有するポリヌクレオチドを発現
するように遺伝子操作された宿主細胞もまた提供される。宿主細胞中で、幹細胞
成長因子活性を有するポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と操作的に連
結されて、このポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞。 【００５２】 別の態様では、本発明は、配列番号１０、１３、１６、３２または３４、それ
らの成熟タンパク質部分、それらの細胞外部分、またはそれらの活性ドメインか
らなるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。 【００５３】 また、上記ポリペプチドおよび担体を含む組成物が提供される。別の実施形態
では、本発明は、ポリペプチドに対する抗体を含む。 【００５４】 別の態様では、本発明は、試料中の幹細胞成長因子活性を有するポリヌクレオ
チドを検出する方法であって、上記ポリヌクレオチドに結合して複合体を形成す
る化合物と、上記試料とを、上記複合体を形成するのに十分な時間接触させ、か
つｂ）上記複合体を検出し、その結果複合体が検出されると、上記ポリヌクレオ
チドが検出される、上記方法を含む。 【００５５】 本発明はまた、試料中の幹細胞成長因子活性を有するポリヌクレオチドを検出
する方法であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にある上
記試料を、かかる条件下で上記ポリヌクレオチドにアニーリングする核酸プライ
マーと接触させ、上記ポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む産物を増幅させ
、および上記産物を検出することにより、上記試料中の上記ポリヌクレオチドを
検出する方法を含む。 【００５６】 さらなる実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコード
するＲＮＡ分子であり、上記方法は、アニーリングしたＲＮＡ分子をｃＤＮＡポ
リヌクレオチドへ逆転写することをさらに含む。 【００５７】 また、試料中の上記ポリペプチドを検出する方法であって、上記ポリペプチド
に結合して複合体を形成する化合物と上記試料とを、上記複合体を形成する条件
で、かつそれを形成するのに十分な時間接触させ、および上記複合体の形成を検
出し、その結果複合体の形成が検出されると、上記ポリペプチドが検出される、
上記方法が提供される。 【００５８】 別の実施形態では、本発明は、上記ポリペプチドに結合する化合物を同定する
方法であって、ポリペプチド／化合物複合体を形成する条件下で、かつそれを形
成するのに十分な時間、上記化合物を上記ポリペプチドと接触させ、および上記
複合体を検出し、その結果上記ポリペプチド／化合物複合体が検出されると、上
記ポリヌクレオチドに結合する化合物が同定される方法を提供する。 【００５９】 さらなる実施形態では、本発明は、上記ポリペプチドに結合する化合物を同定
する方法であって、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間、細
胞中で、上記化合物を上記ポリペプチドと接触させ（ここで、上記複合体は、細
胞中のレポーター遺伝子配列の発現を駆動する）、かつ上記レポーター遺伝子配
列の発現を検出することにより上記複合体を検出し、その結果上記ポリペプチド
／化合物複合体が検出されると、上記ポリペプチドに結合する化合物が同定され
る方法を含む。 【００６０】 別の実施形態では、本発明は、上記ポリペプチドを製造する方法であって、上
記細胞中で上記ポリペプチドを発現するのに十分な期間、宿主細胞を培養し、か
つ上記細胞培養物または細胞から上記ポリペプチドを単離する方法を含む。 【００６１】 別の態様では、本発明は、上記ポリペプチドを含むキットを含む。また、表面
に付着した、上記ポリヌクレオチド、または上記ポリヌクレオチドのセグメント
を含む核酸アレイが提供される。さらなる実施形態では、上記アレイは、上記ポ
リヌクレオチド、または上記ポリヌクレオチドの特有セグメントに対する完全マ
ッチを検出する。別の実施形態では、上記アレイは、上記ポリヌクレオチド、ま
たは上記ポリヌクレオチドの特有セグメントに対するミスマッチを検出する。 【００６２】 本発明はまた、幹細胞成長因子様ポリペプチドの活性または発現の増大が必要
な被験体の治療方法であって、上記方法は、上記被験体に、ａ）治療に役立つ量
の上記ポリペプチドのアゴニストを含む組成物、ｂ）治療に役立つ量の上記ポリ
ペプチドを含む組成物、およびｃ）上記ポリペプチドが生産されるような形態で
、かつそのような条件下で、治療に役立つ量の、前記ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを含む組成物からなる群から選択される組成物を投与すること
を含む方法で提供し、上記組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。本発明は
また、幹細胞成長因子様ポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある被
験体の治療方法であって、上記方法は、上記被験体に、ａ）治療に役立つ量の上
記ポリペプチドのアンタゴニストを含む組成物、ｂ）治療に役立つ量の、上記ポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制するポリヌクレオチドを
含む組成物、およびｃ）治療に役立つ量の、上記幹細胞成長因子様ポリペプチド
と、そのリガンドに関して競合するポリペプチドを含む組成物からなる群から選
択される組成物を投与することを含む方法を提供し、上記組成物は、薬学的に許
容可能な担体を含む。 【００６３】 別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、１３、１６、３２または３４由
来の少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む、幹細胞成長因子活性を有するポリ
ペプチドを含む。さらなる別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、１３、
１６、３２または３４のＣ末端の１７個のアミノ酸由来の少なくとも１０個の連
続アミノ酸を含む、このポリペプチドを含む。 【００６４】 また、生物活性を有するポリペプチドであって、少なくとも２７２個のアミノ
酸を含み、かつ配列番号１０または３４と少なくとも９８％の同一性を有するポ
リペプチド、あるいは少なくとも２７３個のアミノ酸を含み、かつ配列番号１３
と少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドが提供される。 【００６５】 さらなる実施形態では、本発明は、幹細胞成長因子活性を有する単離されたポ
リペプチドであって、配列番号１０、１３、１６、３２または３４と少なくとも
９０％の同一性を有し、かつアミノ酸配列ＧＩＥＶＴＬＡＥＧＬＴＳＶＳＱＲＴ
ＱＰＴＰＣＲＲＲＹＬ（配列番号２９）（ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイ
ン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリ
シン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メ
チオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン
、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシ
ン）を欠く単離されたポリペプチドを含む。 【００６６】 さらなる別の実施形態では、本発明は、幹細胞成長因子活性を有する単離され
たポリペプチドであって、配列番号１０、１３、１６、３２または３４と少なく
とも９０％の同一性を有し、かつアミノ酸配列ＧＩＥＶＴＬＡＥＧＬＴＳＶＳＱ
ＲＴＱＰＴＰＣＲＲＲＹＬ（配列番号２９）（ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝シス
テイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝
グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ
＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギ
ニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チ
ロシン）由来の任意の１０個のアミノ酸を欠く単離されたポリペプチドを含む。 【００６７】 別の実施形態では、本発明は、始原生殖細胞、生殖系幹細胞、胚性幹細胞、多
分化能性細胞、および全能性細胞からなる群から選択される細胞の増殖を維持ま
たは促進する方法であって、上記細胞を、有効量の幹細胞成長因子様ポリペプチ
ドと接触させる方法に関する。さらなる実施形態では、上記ポリペプチドは、配
列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配列を含むか、あるいは配
列番号１０、１３、１６、３２または３４に配列に対して９０％の同一性のアミ
ノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、上記幹細胞成長因子様ポリペプチドは
、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１０、１３、
１６、３２または３４をコードするポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズ
するポリヌクレオチドによりコードされる。 【００６８】 本発明はまた、幹細胞成長因子活性を有する単離されたポリペプチドであって
、少なくともアミノ酸配列ＳＶＳＶＳＴＶＨ（配列番号２７）またはＶＳＶＳＴ
ＶＨ（配列番号２８）（ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラ
ギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチ
ジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝ア
スパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ
＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン）を有する単離
されたポリペプチドを含む。 【００６９】 さらなる実施形態では、本発明は、本発明によるポリペプチドに関し、上記ポ
リペプチドは、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、膜攻撃複合体構成成分／パーフォ
リンドメイン、および神経下垂体ホルモンシグナチュアの群から選択される１つ
またはそれ以上のモチーフを含む。 【００７０】 本発明はまた、本発明によるポリペプチドをコードするいかなるポリヌクレオ
チドをも含む。 【００７１】 本発明の組成物にはさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを
含むベクター、かかるポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された細胞、お
よびかかるポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された細胞が含まれる
。 【００７２】 本発明の単離されたポリヌクレオチドとしては、配列番号９、１１、１２、３
１または３３に記載されるヌクレオチド配列のいずれか１つを含むポリヌクレオ
チド、配列番号９、１１、１２、３１または３３の完全長タンパク質コード配列
のいずれかを含むポリヌクレオチド、および配列番号９、１１、１２、３１また
は３３の成熟タンパク質コード配列のヌクレオチド配列いずれかを含むポリヌク
レオチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドと
してはまた、（ａ）配列番号９、１１、１２、３１または３３に記載されるヌク
レオチド配列のいずれか１つの相補体、（ｂ）配列番号１０、１３〜２４、３２
または３４をコードするヌクレオチド配列に、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、上述の任意のポリヌ
クレオチド配列の対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチド、上述のタンパク質
のいずれかの種同族体（例えば、オーソログ）をコードするポリヌクレオチド、
あるいは配列番号１０、１３〜２４、３２または３４を含むポリペプチドのいず
れかの特定ドメインまたは切断を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドが挙げられるが、これらに限定されない。 【００７３】 本発明の核酸配列はまた、配列番号１１、１２、３１または３３の核酸配列か
らの配列情報を含む。上記配列情報は、配列番号１１、１２、３１または３３の
配列情報を一意に識別あるいは表示する、配列番号１〜７のいずれか１つのセグ
メントであり得る。２０量体がヒトゲノムにて完全にマッチする確率は、３００
分の１であるため、かかるセグメントは２０量体の核酸配列であり得る。ヒトゲ
ノムには、染色体の一群中に３０億個の塩基対が存在する。４²⁰の２０量体の存
在が可能であるため、ヒト染色体群中に塩基対が存在するよりも３００倍多い２
０量体が存在する。同一分析を用いると、ヒトゲノムにおいて完全にマッチされ
るべき１７量体の確率は、約５分の１である。これらのセグメントを発現の研究
用アレイに使用する場合、１５量体セグメントが使用され得る。１５量体が発現
される配列において完全にマッチする確率も、１つの組織中の発現配列が全ゲノ
ム配列の約５％を含むことから、約５分の１である。好ましくは、核酸断片また
はサブ配列は、２１個の３’コードヌクレオチドを含む。 【００７４】 同様に、単一ミスマッチを検出するための配列情報を用いる場合、セグメント
は２５量体であり得る。２５量体がヒトゲノムにて単一ミスマッチを伴って出現
する確率は、完全マッチに関する確率（１÷４²⁵）と各ヌクレオチド位置におけ
るミスマッチに関する確率の増加（３×２５）とを乗じることにより計算される
。単一ミスマッチを有する１８量体が発現研究用のアレイ中で検出され得る確率
は、約５分の１である。単一ミスマッチを有する２０量体がヒトゲノム中で検出
され得る確率は、約５分の１である。 【００７５】 本出願に使用される収集は、唯一のポリヌクレオチドの収集であり得る。各配
列の配列情報または特有の識別情報の収集は、核酸アレイ上で提供され得る。一
実施形態では、配列のセグメント情報は、上記セグメントを含むポリヌクレオチ
ドを検出する核酸アレイ上で提供される。上記アレイは、上記セグメントを含む
ポリヌクレオチドに対する完全マッチまたはミスマッチを検出するようにデザイ
ンされ得る。収集はまた、コンピューター読取り可能フォーマットにて提供され
る。 【００７６】 本発明にはまた、上述の核酸配列のいずれかの逆または直列の相補体、上記核
酸配列を含むクローニングまたは発現ベクター、およびこれらの発現ベクターで
形質転換した宿主細胞または生物体が含まれる。 【００７７】 ヒト幹細胞成長因子様ポリペプチド（配列番号１０または３４）は、グリコシ
ル化されていない約３０ｋＤａの予想分子質量を有する約２７２個のアミノ酸タ
ンパク質である。マウスの同族体は、配列番号３２に記載される。ＢＬＡＳＴア
ルゴリズムを用いたタンパク質データベース検索は、配列番号１０が、MUS musc
ulusトロンボスポンジン１型ドメインと相同であることを示す。図１は、ポリヌ
クレオチド配列番号９、およびＥＳＴ配列である配列番号１〜７のアライメント
(alignment)を示す。本発明の配列（配列番号１〜１２）は、本明細書中に記載
するように、造血幹細胞成長因子活性を含む幹細胞成長因子活性を有することが
期待される。 【００７８】 幹細胞成長因子様ポリペプチド（配列番号１０）また、配列番号１０に相当す
る指定アミノ酸配列にある以下のモチーフを有する、（ここで、Ａ＝アラニン、
Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニ
ン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイ
シン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ
＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン
、Ｙ＝チロシンである） １００ ＡＤＣＤＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧＦＹＬＨＬ １２２（配列番
号１７）にあるラミニン型ＥＧＦ様（ＬＥ）ドメインタンパク質 ９２ ＩＮＫＣＴＫＣＫＡＤＣＤＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧＦＹＬＨＬＧ
ＫＣＬＤＮＣＰＥＧＬＥＡＮＮ １３７（配列番号１８）にある脊椎動物メタロ
チオネインタンパク質 ３３ ＭＨＰＮＶＳＱＧＣＱＧＧＣＡＴＣＳＤＹＮ ５２（配列番号１９）に
ある内因性オピオイド神経ペプチド前駆物質タンパク質 １４５ ＩＶＨＣＥＶＳＥＷＮＰＷＳＰＣＴＫＫＧＫＴＣＧＦＫＲＧＴＥＴＲ
ＶＲＥＩＩＱ １８１（配列番号２０）にある膜攻撃複合体構成成分／パーフォ
リンタンパク質 ２１３ ＫＫＧＲＥＲＫＲＫＫ ２２２（配列番号２１）にあるＨＭＧ−１お
よびＨＭＧ−Ｙ ＤＮＡ結合ドメインタンパク質(Ahook) １９８ ＫＣＴＶＱＲＫＫＣＱＫＧＥＲＧＫＫＧＲＥＲＫＲＫＫＰＮＫＧＥＳ
ＫＥＡＩＰＤＳＫＳＬＥ ２３９（配列番号２２）にあるＨＭＧ１／２タンパク
質 １０４ ＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧ １１７（配列番号２３）にある脊椎
動物メタロチオネインサイン １４８ ＣＥＶＳＥＷＮＰＷＳＰＣＴＫＫＧＫＴＣＧ １６７（配列番号２４
）にある神経下垂体ホルモンシグナチュア 【００７９】 モチーフ１００〜２２のラミニン型ＥＧＦ様ドメインは、細胞成長を促進する
細胞外マトリックスの構成成分である。膜攻撃複合体構成成分／パーフォリンド
メイン（１４５〜１８５）は、細胞−細胞相互作用、従って細胞成長および分化
を媒介するとみなされる。神経下垂体ホルモンそれ自体は、インターロイキン−
１βおよびインターロイキン−６を含む多くの他の因子により調節される。これ
らのモチーフの存在は、幹細胞成長因子活性において期待される。 【００８０】 幹細胞成長因子様タンパク質および／または断片または誘導体は、幹細胞成長
因子ならびに同化成長因子および受容体に対して類似の活性を有するであろう。 【００８１】 本発明の単離ペプチドとしては、配列番号１０、１３ない２４、３２または３
４を含むポリペプチド、あるいは相当する完全長または成熟タンパク質が挙げら
れるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドにはまた、（ａ）配列番
号１〜９、１１、１２、３１または３３に記載されるヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチドのいずれか、または（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドによりコードされる、生物活性を有するポリペプチドが含まれる
。配列番号１０、１３〜２４、３２または３４として列挙されるタンパク質配列
のいずれかの生物学的あるいは免疫学的に活性な変異体、および好ましくは生物
活性を保持するそれらの「実質的な均等体物」（例えば、少なくとも約６５％、
７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する）
もまた意図される。本発明のポリペプチドは、全体的または部分的に化学合成さ
れてもよいが、好ましくは本発明の遺伝子操作された細胞（例えば、宿主細胞）
を用いて、組換え手段により製造される。 【００８２】 本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のポリ
ペプチド生成物はさらに、親水性（例えば薬学的に許容可能な）担体のような許
容可能な担体を含んでもよい。 【００８３】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドで形質変換またはトランスフェクト
した宿主細胞を提供する。 【００８４】 本発明はまた、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、所望のポリペ
プチドの発現を可能にする条件下で、適切な培地中で、本発明の宿主細胞の培養
物を成長させること、および上記培養物または上記宿主細胞から上記タンパク質
を精製することを含む方法に関する。好ましい実施形態としては、かかるプロセ
スにより製造されるタンパク質が、成熟形態のタンパク質であるものが挙げられ
る。 【００８５】 本発明によるポリヌクレオチドは、分子分生物学の技術分野の当業者に既知の
様々な技法における数多くの用途を有する。これらの技法としては、ハイブリダ
イゼーションプローブとしての使用、オリゴマーまたはプライマー（ＰＣＲ用）
としての使用、アレイにおける使用、コンピュータ読取り可能媒体における使用
、染色体および遺伝子マッピングのための使用、タンパク質の組換え生産におけ
る使用、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、それらの化学的類縁体等の生
成における使用が挙げられる。例えば、ｍＲＮＡの発現が、特定の細胞または組
織型に主に制限される場合、本発明のポリヌクレオチドは、例えばインシトゥ（
in situ）ハイブリダイゼーションを用いて、試料中の特定細胞または組織のｍ
ＲＮＡの存在を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用する
ことができる。 【００８６】 他の例示的実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、発現遺伝子を同定するた
めの発現配列タグ(tag)として診断法にて、あるいはヒトゲノムの物理的マッピ
ング用の発現配列タグとして、当該技術分野で既知であり、かつVollarathら, S
cience 258: 52-58(1992)により例示されるように使用される。 【００８７】 本発明によるポリヌクレオチドは、十分に確立された組換えＤＮＡ技術（Samb
rook, J.ら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor Laboratory, NYを参照）により、様々な他のヌクレオチド配列のいずれかに
結合され得る。ポリペプチドに結合する有用なヌクレオチド配列には、当該技術
分野で既知のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、λファージ誘導体、フ
ァージミド等）の組合せが含まれる。したがって、本発明はまた、本発明のポリ
ヌクレオチドを含むベクター、および上記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提
供する。一般に、ベクターは、少なくとも１つの生物体において機能的な複製起
点、利便性のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞のための選択マ
ーカーを含む。本発明によるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プロ
ーブ生成ベクター、およびシーケンシングベクターが含まれる。本発明による宿
主細胞は、原核または真核細胞であり得、また単細胞生物、または多細胞生物の
一部であり得る。 【００８８】 本発明によるポリペプチドは、他のタンパク質に現在適用される、様々な従来
型手法および方法にて使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドは
、上記ポリペプチドを特異的に結合する抗体を生成するために使用することがで
きる。かかる抗体、特にモノクローナル抗体は、組織中の上記ポリペプチドを検
出または定量化するのに有用である。本発明のポリペプチドはまた、分子量マー
カーとして、および食物サプリメントとして使用することができる。 【００８９】 病状を防止、治療または回復する方法であって、治療上有効な量の、本発明の
タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を、哺乳動物被験体に投
与する工程を含む方法もまた提供される。 【００９０】 特に、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、異常タンパ
ク質発現または生物活性を含む障害の防止および／または治療方法の一部として
利用することができる。 【００９１】 本発明の方法はまた、本明細書中に記載するような障害を治療する方法であっ
て、本明細書中に記載するような障害に関連した症状または傾向を示す個体への
、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの投与を含む方法を提供する。
さらに、本発明は、本明細書中に記載する疾患または障害を治療する方法であっ
て、標的遺伝子産物の活性全体を調節する化合物および他の物質を投与する工程
を含む方法を含む。化合物および他の物質は、標的遺伝子／タンパク質発現また
は標的タンパク質活性のレベルのいずれかに対して、かかる調節を達成すること
が可能である。具体的には、神経性疾患を含む症状を防止、治療または回復する
方法であって、ヒトを含むが、これに限定されない哺乳動物被験体に、治療上有
効な量の、本発明のポリペプチドを含む組成物、又は治療上有効な量の、本発明
の幹細胞成長因子様ポリペプチドの結合パートナー（例えば、そのペプチドに関
して特異的に反応性の抗体）を含む組成物を投与することを含む方法が提供され
る。特定の状態または病理学の機構は、本発明のポリペプチド、またはこれらの
結合パートナー（または阻害剤）が、治療を必要とする個体に対して有益である
かどうかを左右するであろう。 【００９２】 本発明または、創傷治癒を促進する方法であって、創傷または外傷部位に、本
発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。本
発明は、細胞成長および形態発生を促進する方法であって、神経細胞の培地に、
本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
この方法によれば、本発明のポリペプチドは、細胞機能のインビトロ（in vitro
）またはインビボ(in vivo)促進をもたらすために投与することができる。本発
明のポリペプチドは、幹細胞成長因子単独として、あるいは他の療法に対する付
属物として、インビボで投与することができる。 【００９３】 本発明はさらに、上述の方法において有用な薬剤を製造する方法を提供する。 【００９４】 本発明はさらに、試料（例えば、組織または試料）中の本発明のポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドの存在を検出する方法に関する。かかる方法は、例えば
、本明細書中に記載するような障害の予後的または診断的評価の一部として、ま
たかかる状態に対する素因を示す対象の同定のために利用することができる。本
発明はまた、本発明の方法を実施するための、ポリヌクレオチドプローブおよび
／またはモノクローナル抗体、ならびに任意に定量用標準物質を含むキットを提
供する。さらに、本発明は、上述の障害の治療のための臨床試験に含まれる、薬
物の有効性を評価し、患者の経過をモニターする方法を提供する。 【００９５】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現
あるいは活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）化合物の同定方法
を提供する。かかる方法は、例えば、本明細書中に記載するような障害の症状を
回復することができる化合物の同定のために利用することができる。かかる方法
として、本発明のポリペプチドと相互作用する（例えば、そのポリペプチドの結
合する）化合物および他の物質を同定するためのアッセイを挙げることができる
が、これらに限定されない。 【００９６】 ５．発明の詳細な説明 ５．１ 定義 「始原生殖細胞（ＰＧＣ）」という用語は、生殖細胞およびその他の細胞に分
化する潜在力を有する、胚形成中に、他の細胞系統から、特に卵黄嚢、腸間膜ま
たは生殖隆起から蓄えられる細胞の小集団を指す。ＰＧＣは、ＧＳＣおよびＥＳ
細胞が由来する源である。 【００９７】 「生殖系幹細胞（ＧＳＣ）」という用語は、配偶子の産生のための生殖細胞の
安定かつ連続的な供給源を提供する始原幹細胞に由来する幹細胞を指す。 【００９８】 「胚性幹細胞（ＥＳ）」という用語は、胚または成体中に多数の種類の分化細
胞、例えば生殖細胞を生じ得る細胞を指す。ＰＧＣ、ＧＳＣおよびＥＳ細胞は、
自己再生可能である。したがってこれらの細胞は、生殖系を集団形成し、成体固
有器官を構成する複数の最終分化細胞を生じるだけでなく、それら自体を再生し
得る。 【００９９】 「全能性(totipotent)」という用語は、成体生物体のすべての細胞型に分化す
る細胞の能力を指す。 【０１００】 「多分化能性(pluripotent)」という用語は、成体生物体中に存在する多数の
種類の分化細胞に分化する細胞の能力を指す。多分化能性細胞は、全能性細胞と
比較して、その分化能力が制限される。 【０１０１】 「ヌクレオチド配列(nucleotide sequence)」という用語は、ヌクレオチドの
ヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列を指す。「核酸(nucleic aci
d)」および「ポリヌクレオチド(polynucleotide)」という用語も、ヌクレオチド
のヘテロポリマーを指すために本明細書中で互換的に用いられる。一般に、本発
明により提供される核酸セグメントは、ゲノムおよび短いオリゴヌクレオチドリ
ンカーの断片から、または一連のオリゴヌクレオチドから、または個々のヌクレ
オチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロン、あるいは真核生物遺伝
子由来の調節要素を含む組換え転写ユニットで発現可能である合成核酸を提供し
得る。 【０１０２】 「オリゴヌクレオチド断片(origonucleotide fragment)」または「ポリヌクレ
オチド断片(polynucleotide fragment)」、「部分(portion)」または「セグメン
ト(segment)」という用語は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子の同一または関連部分
を同定または増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または種々のハイ
ブリダイゼーション手法で用いるのに十分長いヌクレオチド残基の配列である。
断片またはセグメントは、本発明の各ポリヌクレオチド配列を独自に同定し得る
。 【０１０３】 用語「オリゴヌクレオチド(oligonucleotides)」または「核酸プローブ(nucle
ic acid probes)」は、本発明で提供されるポリヌクレオチド配列に基づいて調
製される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１５個のヌクレオチドを、通常
は少なくとも約２０個のヌクレオチドを有するようなポリヌクレオチド配列の部
分を含む。核酸プローブは、約６ｋｂより少ない、通常は約１ｋｂより少ないヌ
クレオチドを有するようなポリヌクレオチド配列の部分を含む。擬陽性を排除す
るための適切な試験後、これらのプローブは、例えば特定のｍＲＮＡ分子が細胞
または組織中に存在するか否かを確定するために、あるいはWalsh等(Walsh, P.S
. ら, 1992, PCR Methods Appl 1:241-250)により記載されるように染色体ＤＮ
Ａから同様の核酸配列を単離するために用いられ得る。 【０１０４】 「プローブ(probes)」という用語は、天然に存在するまたは組換えあるいは化
学的合成一本鎖または二本鎖核酸を含む。それらは、ニックトランスレーション
(nick translation)、クレノウフィルイン反応(Klenow full-in reaction)、Ｐ
ＣＲまたは当該技術分野で既知のその他の方法により標識され得る。本発明のプ
ローブ、それらの調製および／または標識は、Sambrook, J.ら, 1989, Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY;またはA
usubel, F.M.ら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, New York NY（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含
まれる）に詳述されている。 【０１０５】 「ストリンジェントな(stringent)」という用語は、ストリンジェントである
と当該技術分野で一般に理解される条件を指すために用いられる。ストリンジェ
ントな条件は非常にストリンジェントな条件（すなわち６５℃での０．５ＭのＮ
ａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中での
フィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃での０．１×
ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄）、ならびに中等度のストリンジェントな条
件（すなわち４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄）を含み得
る。その他の例示的ハイブリダイゼーション条件は、本明細書中で実施例に記載
されている。 【０１０６】 デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例としては、３７℃（１４塩基オ
リゴに関して）、４８℃（１７塩基オリゴに関して）、５５℃（２０塩基オリゴ
に関して）および６０℃（２３塩基オリゴに関して）での６×ＳＳＣ／０．０５
％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。 【０１０７】 「組換え(recombinant)」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質に言
及するために本明細書中で用いる場合、ポリペプチドまたはタンパク質が組換え
（例えば微生物、昆虫または哺乳動物）発現系に由来することを意味する。「微
生物」とは、細菌または真菌（例えば酵母）発現系で作製される組換えポリペプ
チドまたはタンパク質を指す。生成物として、「組換え微生物」とは、自然内因
性物質を本質的に含有せず、関連自然グリコシル化を伴わないポリペプチドまた
はタンパク質を定義する。ほとんどの細菌培養、例えばエシェリヒア・コリ中で
発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化修飾を含有しない。
酵母中で発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳動物細胞中で発現さ
れるものとは一般に異なるグリコシル化パターンを有する。 【０１０８】 「組換え発現伝達体またはベクター(recombinant expression vehicle or vec
tor)」という用語は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からのポリペプチドを発現するため
のプラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターを指す。発現伝達体
は、（１）遺伝子発現における調節的役割を有する単数または複数の遺伝子的要
素、例えばプロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タン
パク質に翻訳される構造的配列またはコード配列、ならびに（３）適切な転写開
始および終止配列の集合を含む転写ユニットを含み得る。酵母または真核生物発
現系中で用いるために意図される構造ユニットは、好ましくは宿主細胞による翻
訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列(leader sequence)を含む
。あるいは、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列を伴わずに発現される
場合、それはアミノ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、最終生成物を
提供するために発現組換えタンパク質から実質的に切断され得ることもそうでな
いこともある。 【０１０９】 「組換え発現系(recombinant expression system)」という用語は、染色体Ｄ
ＮＡ中に組換え転写ユニットを安定的に組込んだ、または組換え転写ユニットを
染色体外に保有する宿主細胞を意味する。本明細書中で定義されるような組換え
発現系は、ＤＮＡセグメントまたは発現される合成遺伝子に連結される調節要素
の導入時に異種ポリペプチドまたはタンパク質を発現する。この用語は、遺伝子
発現において調節的役割を有する単数または複数の組換え遺伝子要素、例えばプ
ロモーターまたはエンハンサーを安定的に組込んだ宿主細胞も意味する。本明細
書中で定義されるような組換え発現系は、内因性ＤＮＡセグメントまたは発現さ
れる遺伝子に連結される調節要素の導入時に細胞に対して内因性であるポリペプ
チドまたはタンパク質を発現する。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る
。 【０１１０】 「オープンリーディングフレーム(open reading frame)」、すなわちＯＲＦと
いう用語は、任意の終止コドンを伴わずにアミノ酸をコードする一連のヌクレオ
チドトリプレット組を意味し、タンパク質に翻訳可能な配列である。 【０１１１】 「発現調節断片(expression modulating fragment)」、すなわちＥＭＦという
用語は、操作可能に連結されたＯＲＦまたは別のＥＭＦの発現を調節する一連の
ヌクレオチドを意味する。 【０１１２】 本明細書中で用いる場合、配列は、配列の発現がＥＭＦの存在により変更され
る場合、「操作可能に連結された配列の発現を調節する」と言われる。ＥＭＦと
しては、プロモーターおよびプロモーター調節配列（誘導性要素）が挙げられる
が、これらに限定されない。ＥＭＦの一クラスは、特異的調節因子または生理学
的事象に応答して、発現または操作可能に結合したＯＲＦを誘導する断片である
。 【０１１３】 本明細書中で用いる場合、「取込み調整断片(uptake modulating frame)」、
すなわちＵＭＦは、細胞中への結合ＤＮＡ断片の取込みを媒介する一連のヌクレ
オチドを意味する。ＵＭＦは、下記のコンピューターベースシステムにより、標
的配列または標的モチーフとして既知のＵＭＦを用いて容易に同定され得る。 【０１１４】 ＵＭＦの存在および活性は、ＵＭＦであると疑われるものをマーカー配列に結
合することにより確証され得る。次にその結果生じた核酸分子は、適切な条件下
で適切な宿主とともにインキュベートされて、マーカー配列の取込みが測定され
る。上記のように、ＵＭＦは連結マーカー配列の取込みの頻度を増大する。 【０１１５】 「活性な(active)」という用語は、任意の天然に存在するポリペプチドの生物
学的および／または免疫学的活性を保持するポリペプチドの形態を指す。本発明
によれば、「生物学的に活性な(biologically active)」という用語は、ポリペ
プチドが、本発明のポリペプチドの生物活性のうちの少なくとも１つを保持する
ことを意味する。「幹細胞成長因子活性(stem cell growth factor activity)」
または「幹細胞成長因子様活性(stem cell growth factor-like activity)」と
いう用語は、幹細胞成長因子ポリペプチドの生物活性に類似する生物学的活性、
例えば細胞成長または形態形成活性を指す。 【０１１６】 「天然に存在するポリペプチド(naturally occuring polypeptide)」という用
語は、遺伝子操作されていない細胞により産生されるポリペプチドを指し具体的
にはポリペプチドの翻訳後修飾、例えばアセチル化、カルボキシル化、グリコシ
ル化、リン酸化、脂質化およびアシル化（これらに限定されない）から生じる種
々のポリペプチドを意図する。 【０１１７】 「誘導体(derivative)」という用語は、ユビキチン結合、標識（例えば放射性
核種または種々の酵素による）、共有結合性ポリマーの結合、例えばペグ化（ポ
リエチレングリコールを用いた誘導体化）、ならびにヒトタンパク質中には普通
は生じないアミノ酸、例えばオルニチンの化学合成による挿入または置換のよう
な技法により化学的に修飾されたポリペプチドを指す。 【０１１８】 「変異体(variant)（または「類縁体(analog)」）」という用語は、例えば組
換えＤＮＡ技術を用いて作製されたアミノ酸の挿入、欠失および置換により天然
に存在するポリペプチドと異なる任意のポリペプチドを指す。アミノ酸残基が所
定の活性を無くすことなく置換、付加または欠失され得る測定に際しての指針は
、特定のポリペプチドの配列を相同ペプチドの配列と比較し、高相同性の領域で
なされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることにより、あるいはアミノ酸をコ
ンセンサス配列と置き換えることにより見出され得る。 【０１１９】 好ましくは、アミノ酸「置換(substitutions)」は、あるアミノ酸を、類似の
構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸と置き換えた結果、すな
わち保存的アミノ酸置き換えである。「保存的(conservative)」アミノ酸置換は
、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性
における類似性に基づいてなされ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸とし
ては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニ
ン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸としてはグ
リシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグル
タミンが挙げられ、正荷電（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リシンおよ
びヒスチジンが挙げられ、そして負荷電（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン
酸およびグルタミン酸が挙げられる。「挿入(insertions)」または「欠失(delet
ions)」は、典型的には約１〜５アミノ酸の範囲である。可能な変化は、組換え
ＤＮＡ技術を用いてポリペプチド分子中にアミノ酸の挿入、欠失または置換を系
統的に作製し、その結果生じた組換え変異体を活性に関してアッセイすることに
より、実験的に確定され得る。 【０１２０】 あるいは、機能の変更が望ましい場合、挿入、欠失または非保存的変更は、変
更ポリペプチドを生成するように操作され得る。このような変更は、例えば本発
明のポリペプチドの生物学的機能または生化学的特性のうちの１つまたはそれ以
上を変更し得る。例えば、このような変更は、ポリペプチド特性、例えばリガン
ド結合親和性、鎖間親和性または分解／代謝回転速度を変え得る。さらに、この
ような変更は、発現のために選択された宿主中での発現、スケールアップ等によ
り好適なポリペプチドを生成するよう選定され得る。例えばシステイン残基は、
ジスルフィド架橋を排除するために、欠失されるかまたは別のアミノ酸残基で置
換され得る。 【０１２１】 本明細書中で用いる場合、「実質的に等価の(substantially equivalent)」ま
たは「実質的に類似の(substantially similar)」とは、ともに、１つまたはそ
れ以上の置換、欠失または付加により参照配列とは異なるヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列の両方、例えば突然変異体配列を指し得るし、その正味効果は、参照
および対象配列間の逆機能的相違点を生じない。典型的には、このような実質的
に等価の配列は、約３５％以下で本明細書中に列挙したもののうちの１つから変
化する（すなわち、対応する参照配列と比較して、実質的に等価の配列中の個々
の残基の置換、付加および／または欠失の数を、実質的に等価の配列中の残基の
総数で割った値は、約０．３５以下である）。このような配列は、列挙した配列
と６５％の配列同一性を有すると言われる。一実施形態では、本発明の実質的に
等価の、例えば突然変異体の配列は、列挙配列とは３０％以下異なる（７０％の
配列同一性）。この実施形態の変形では、２５％以下（７５％の配列同一性）、
この実施形態のさらなる変形では、２０％以下（８０％の配列同一性）、この実
施形態のさらなる変形では、１０％以下（９０％の配列同一性）、またこの実施
形態のさらなる変形では５％以下（９５％の配列同一性）異なる。本発明による
実質的に等価の、例えば突然変異体のアミノ酸配列は、好ましくは列挙アミノ酸
配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも８５
％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらに好ま
しくは少なくとも９５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９８％の配
列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。本発明の実
質的に等価のヌクレオチド配列は、例えば遺伝コードの重複性または縮重を考慮
に入れて、より低いパーセント配列を有し得る。好ましくはヌクレオチド配列は
、少なくとも約６５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約７５％の同一性
、さらに好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、さらに好ましくは少なく
とも８５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さ
らに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも
９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
本発明の目的のために、実質的に等価の生物学的活性および実質的に等価の発現
特性を有する配列は、実質的に等価であると考えられる。等価性を確定する目的
のために、成熟配列の切断（例えば偽終止コドンを作製する突然変異により）は
無視されるべきである。配列同一性は、例えばJotun Hein法（Hein, J. (1990)
Methods Enzymol. 183:626-645）を用いて確定され得る。配列間の同一性は、当
該技術分野で既知の他の方法により、例えば種々のハイブリダイゼーション条件
により確定され得る。 【０１２２】 このような実質的に等価の配列、例えば列挙した同一性パーセントの配列をコ
ードする核酸配列は、当業者に既知の標準ハイブリダイゼーション法によりあり
きたりに単離および、同定され得る。 【０１２３】 望ましい場合、発現ベクターは、細胞の膜を貫通するポリペプチドを誘導する
「シグナルまたはリーダー配列(signal and leader sequence)」を含むようデザ
インされ得る。このような配列は、本発明のポリペプチド上に天然に存在し得る
か、あるいは組換えＤＮＡ技術により異種タンパク質源から提供され得る。 【０１２４】 ポリペプチド「断片(fragment)」、「部分(portion)」または「セグメント(se
gment)」は、少なくとも約５個のアミノ酸、しばしば少なくとも約７個のアミノ
酸、典型的には少なくとも約９〜１３個のアミノ酸の、また種々の実施形態にお
いては、少なくとも約１７個またはそれ以上のアミノ酸の一続きのアミノ酸残基
のである。活性であるためには、任意のポリペプチドは生物学的および／または
免疫学的活性を示すのに十分な長さを有さなければならない。 【０１２５】 あるいは、これらの同一または類似のポリペプチドをコードする組換え変異体
は、遺伝暗号中に「重複性(redundancy)」を使用することにより合成または選択
され得る。種々のコドン置換、例えば種々の制限部位を生成するサイレントな変
化は、プラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングを、あるいは特定の
原核生物系または真核生物系中での発現を最適化するために、導入され得る。ポ
リヌクレオチド配列中の突然変異は、ポリペプチドの任意の部分の特性を修飾し
て、リガンド結合親和性、鎖間親和性または分解／代謝回転速度のような特徴を
変えるためにポリペプチドに付加される、その他のペプチドのポリペプチドまた
はドメインにおいて反映され得る。 【０１２６】 「活性化(activated)」細胞という用語は、本出願中で用いられる場合、細胞
外または細胞内膜輸送、例えば正常または疾患過程の一部としての分泌または酵
素分子の輸出に携わるものである。 【０１２７】 「精製された(purified)」という用語は、本明細書中で用いる場合、示した核
酸またはポリペプチドが、他の生物学的高分子、例えばポリヌクレオチド、タン
パク質等の実質的な非存在下で存在することを意味する。一実施形態では、ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは、存在する示した生物学的高分子の少なくと
も９５重量％、さらに好ましくは少なくとも９９．８重量％を構成するように、
精製される（しかし、水、緩衝液およびその他の小分子、特に１０００ダルトン
未満の分子量を有する分子は存在し得る）。 【０１２８】 「単離された(isolated)」という用語は、本明細書中で用いる場合、その天然
供給源中に核酸またはポリペプチドとともに存在する少なくとも１つのその他の
構成成分（例えば核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプ
チドを指す。一実施形態では、核酸またはポリペプチドは、その溶液中に普通に
存在する（いずれかといえば）溶媒、緩衝液、イオンまたはその他の構成成分の
みの存在下で見出され得る。「単離された」および「精製された」という用語は
、それらの天然源中に存在する核酸またはポリペプチドを含まない。 【０１２９】 「感染(infection)」という用語は、ウイルスまたはウイルスベクターの使用
による適切な宿主細胞中への核酸の導入を指す。 【０１３０】 「形質転換(transformation)」という用語は、ＤＮＡが、染色体外要素として
、または染色体組込みにより、複製可能であるように適切な宿主細胞中にＤＮＡ
を導入することを意味する。 【０１３１】 「トランスフェクション(transfection)」という用語は、任意のコード配列が
実際に発現されるか否かに関わらず、適切な宿主細胞による発現ベクターの取込
みを指す。 【０１３２】 「中間断片(intermediate fragment)」という用語は、５〜１０００塩基長、
好ましくは１０〜４０ｂｐ長の核酸を意味する。 【０１３３】 「分泌された(secreted)」という用語は、膜を横切ってまたは通して輸送され
るタンパク質を、例えばそれが適切な宿主細胞中で発現される場合、そのアミノ
酸配列中のシグナル配列の結果としての輸送を含む。「分泌された」タンパク質
としては、それらが発現される細胞から全体的に（例えば可溶性タンパク質）ま
たは部分的に（例えば受容体）分泌されたタンパク質が挙げられるが、これに限
定されない。「分泌された」タンパク質としては、小胞体の膜を横断して輸送さ
れるタンパク質も挙げられるが、これに限定されない。「分泌された」タンパク
質は、非典型的シグナル配列（例えばインターロイキン−１β、Krasney, P.A.
and Young, P.R. (1992) Cytokine 4(2):134-143参照）および損傷細胞から放出
される因子（例えばインターロイキン−１受容体アンタゴニスト、Arend, W.P.
ら (1998) Annu. Rev. Immunol. 16:27-55参照）も含むよう意図される。 【０１３４】 上記の用語は各々、別記しない限り、各々に関して記載される全てを含むこと
を意味する。 【０１３５】 ５．１．１ 発明の説明 ストローマ細胞は、エクスビボ(ex vivo)で造血幹細胞または造血前駆細胞の
増殖もしくは生存を支持し得るため、ストローマ細胞は、本明細書中に規定する
ように、造血幹細胞または造血前駆細胞の支持増殖もしくは生存を媒介する因子
を産生すると予測される。 【０１３６】 本発明の目的は、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持す
る因子を提供することであり、これらの因子はストローマ細胞に由来し得る。 【０１３７】 マウスストローマ細胞は、上記のように、造血幹細胞または造血前駆細胞の増
殖もしくは生存を支持する因子を産生する。２種類のストローマ細胞が存在する
との注意が与えられる。１つは、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは
生存を支持する能力を有する（以後、「造血幹細胞を支持するための活性(activ
ity to support hematopoietic stem cell)」として言及される場合がある）。
その他は、造血幹細胞を支持する活性を有さない。この能力差は、転写レベルで
の造血幹細胞または前駆細胞の支持を促す因子の発現差によるものであり得る。
すなわち、支持ストローマ細胞はその因子をコードするｍＲＮＡを高レベルで発
現する、また、非支持ストローマ細胞はｍＲＮＡをあまり発現しないと推測され
る。したがってその因子をコードするｍＲＮＡは、非支持細胞の場合に比して、
支持細胞中でより高度に発現される遺伝子の１つであり得る。この状況において
、ＡＧＭ−ｓ３−Ａ９、ＡＧＭ−ｓ３−Ｄ１１、ＯＰ９およびＳＷＩＳＳ３Ｔ３
細胞系の造血幹および／または前駆細胞支持能力、ならびにＡＧＭ−ｓ３−Ａ７
、ＡＧＭ−ｓ３−Ｇ１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞系の非支持能力を、本発明者等は
確証した（ＡＧＭ−ｓ３−Ａ９、ＡＧＭ−ｓ３−Ｄ１１、ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７お
よびＡＧＭ−ｓ３−Ｇ１細胞系は、先願国際特許公開第９９／０３９８０号に開
示されたＡＧＭ由来のストローマ細胞株ＡＧＭ−ｓ３をサブクローニングするこ
とにより得られる）。次に、ＡＧＭ−ｓ３−Ａ９、ＡＧＭ−ｓ３−Ｄ１１、ＯＰ
９および３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ細胞系中で高度に発現され、低発現を示すか、または
ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７、ＡＧＭ−ｓ３−Ｇ１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞系では検出さ
れない遺伝子が同定された。これらの遺伝子群の増殖幹細胞または増殖前駆細胞
の増殖もしくは生存を支持する能力の評価、ならびに入念な検査後に、本発明は
完成された。 【０１３８】 すなわち本発明は、以下のものを提供する。 【０１３９】 （１）以下の（Ａ）または（Ｂ）で定義されるようなポリペプチドをコードす
るＤＮＡ： （Ａ）配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配
列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸２２〜２７２を含むアミノ酸配
列を有するポリペプチド、又は （Ｂ）配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配
列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸２２〜２７２を含むアミノ酸配
列中に１個または数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を含むアミノ酸配列を
有し、かつ造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活性を
有するポリペプチド。但し、Ｃ末端アミノ酸配列は配列番号４５のアミノ酸配列
を含まない。 【０１４０】 （２）以下の（ａ）または（ｂ）で定義されるようなＤＮＡである、（１）の
ＤＮＡ： （ａ）配列番号３１の少なくともヌクレオチド５７４〜１３４７を含むＤＮＡ
、又は （ｂ）ストリンジェントな条件下で配列番号３１のヌクレオチド配列あるいは
その配列から調製されるプローブまたは断片とハイブリダイズ可能であり、かつ
造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活性を有するＤＮ
Ａ。 【０１４１】 （３）ストリンジェントな条件が６×ＳＳＣ／５ｘデンハルド、０．５％ＳＤ
Ｓおよび６８℃（ＳＳＣ ３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）、５
０×デンハルド／１％ＢＳＡ／１％ポリビニルピロリドン、１％フィコール４０
０、あるいは６×ＳＳＣ、５×デンハルド、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミ
ドおよび４２℃である、（２）のＤＮＡ。 【０１４２】 （４）以下の（ａ）または（ｂ）で定義されるようなＤＮＡである、（１）の
ＤＮＡ： （ａ）配列番号３３の少なくともヌクレオチド３２１〜１０７４を含むＤＮＡ
、又は （ｂ）ストリンジェントな条件下で配列番号３３のヌクレオチド配列あるいは
その配列から調製されるプローブとハイブリダイズ可能であり、かつ造血幹細胞
または造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活性を有するＤＮＡ。 【０１４３】 （５）ストリンジェントな条件が６×ＳＳＣ／５×デンハルド、０．５％ＳＤ
Ｓおよび６８℃（ＳＳＣ３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）、５０
×デンハルド／１％ＢＳＡ／１％ポリビニルピロリドン、１％フィコール４００
、あるいは６×ＳＳＣ、５×デンハルド、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド
および４２℃である、（４）のＤＮＡ。 【０１４４】 （６）ＤＮＡが発現され得るような方法で、（１）〜（５）のいずれか１つの
ＤＮＡ、又は本発明のその他のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 【０１４５】 （７）ＤＮＡが発現され得るような方法で、（１）〜（５）のいずれか１つの
ＤＮＡ、又は本発明のその他のポリヌクレオチドを導入される（すなわち形質転
換またはトランスフェクトされる）細胞。 【０１４６】 （８）（１）〜（５）のいずれか１つのＤＮＡ、又は本発明のその他のポリヌ
クレオチドの発現産物であるポリペプチド（単離されたポリペプチド）であって
、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活性を有するポ
リペプチド。但し、Ｃ末端アミノ酸配列は配列番号１４のアミノ酸配列を含まな
い。 【０１４７】 （９）配列番号３２の、少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸
配列、あるいは配列番号３２の、少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むア
ミノ酸配列中に１個または数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を含むアミノ
酸配列を有する、（８）のポリペプチド。 【０１４８】 （１０）配列番号３４の、少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ
酸配列、あるいは配列番号３４の、少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含む
アミノ酸配列中に１つまたは数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を含むアミ
ノ酸配列を有する、（８）のポリペプチド。 【０１４９】 （１１）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニ
ル−ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオ
キシド／エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよび
ポリビニルアルコールからなる群から選択される1つまたはそれ以上の修飾剤で
修飾された（８）のポリペプチドまたは本発明のその他のポリペプチド。 【０１５０】 （１２）造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する作用を
有し、以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）で定義されるようなポリペプチドを含
む薬学的組成物： （Ａ）配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配
列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ
酸配列を有するポリペプチド、 （Ｂ）配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配
列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ
酸配列中の１個または数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を含むアミノ酸配
列を有し、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活性を
有するポリペプチド、あるいは （Ｃ）本明細書中に記載された本発明のその他のポリペプチドのいずれか。 【０１５１】 （１３）（９）〜（１１）のポリペプチドと結合するモノクローナル抗体。 【０１５２】 本明細書中で用いられる用語は、以下のように定義される。 【０１５３】 造血幹細胞は、全能性、すなわち造血細胞のすべての細胞系統に分化する能力
を有し、全能性を保持しながら、自己再生の能力を同時に有する細胞と定義され
る。赤血球前駆細胞は、インビトロ培養環境中ではほとんど生存および増殖せず
、急速に消失する。赤血球前駆細胞の生存および増殖が確証される場合、赤血球
前駆細胞の連続産生は、より未熟な造血幹細胞または造血前駆細胞の生存および
／または増殖により生じると思われる。したがって、ヒト造血幹細胞の生存およ
び／または増殖を評価するためには、培養中の赤血球前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ、Ｃ
ＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅｍｉｘ）を数え上げることが適切な方法である。 【０１５４】 造血前駆細胞は、造血系列の単一細胞系統または複数細胞系統に分化し得るが
、すべての細胞系統に分化し得るわけではない細胞と定義される。ストローマ細
胞は、インビボ造血環境をシュミレートするためにインビトロで造血幹細胞と一
緒に共培養(co-culture)され得る細胞と定義される。任意の起源に由来する細胞
は、細胞がインビトロで造血細胞と共培養され得る限り、用いることができる。 【０１５５】 本発明のポリペプチドは、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは生存
を支持する能力を有する。本発明のポリペプチドの具体的な実施形態は、マウス
ストローマ細胞から単離されたＳＣＲ−１と呼ばれる遺伝子（以後、「マウスＳ
ＣＲ−１」と呼ばれる場合がある）の発現産物（以後、マウスの「幹細胞の増殖
のための支持因子」と呼ばれる場合がある）、ならびにそのヒトオーソロガス遺
伝子（以後、時として「ヒトＳＣＲ−１」と呼ばれる）の発現産物（以後、時と
してヒトの「幹細胞の増殖のための支持因子」と呼ばれる）である。ＳＣＲ−１
という用語は、配列番号９、１１、１２、３１および３３で記述されるポリヌク
レオチド配列によりそれぞれコードされる、配列番号１０、ｌ３、１６、３２お
よび３４で記述されるポリペプチド配列を指すために本明細書中で用いられ得る
。 【０１５６】 ヒトＳＣＲ−１（配列番号３４）の発現産物のアミノ酸配列は、その機能が明
らかでない既知のポリペプチドと９７．４％の相同性を有するが、そのＣ末端領
域のアミノ酸配列は異なるため、それは新規のポリペプチドである。配列番号３
４の場合と異なる未知の機能を有する上記のポリペプチド中のアミノ酸配列の一
部は、配列番号４５で示される。他方、マウスＳＣＲ−１は、上記のポリペプチ
ドと８４．６％の相同性を有する。 【０１５７】 上記の相同性は、マニュアルでの比較を用いて、アミノ酸の総数に対する同一
アミノ酸の数のパーセントとして算定される（それぞれ２６６／２７３および２
３７／２８０）。 【０１５８】 幹細胞の増殖に関する支持因子、すなわち本発明のポリペプチドは、適切な宿
主細胞中にマウスまたはヒトＳＣＲ−１を形質導入することにより形質転換細胞
を調製すること、および形質転換細胞中でＤＮＡを発現させることにより製造さ
れ得る。配列番号３１で示されるヌクレオチド配列を含めたＤＮＡがＳＣＲ−１
として用いられる場合、幹細胞の増殖のためのマウス支持因子が得られる。配列
番号３３で示されるヌクレオチド配列を含めたＤＮＡがＳＣＲ−１として用いら
れる場合、幹細胞の増殖のためのヒト支持因子が得られる。幹細胞の増殖のため
のマウス支持因子および幹細胞の増殖のためのヒト支持因子は、それぞれ配列番
号３２および配列番号３４により表されるアミノ酸配列を含む。幹細胞の増殖の
ためのこれらの支持因子はシグナルペプチドを含めた前駆物質であり、マウスま
たはヒト細胞中の幹細胞の増殖のための成熟支持因子にプロセシングされると考
えられる。これらのアミノ酸配列中のシグナルペプチドの破断部位を探求するシ
グナルＰ試験の結果に基づいた場合（Nielsen H., protein Engineering, 10:1-
6, 1997; Nielsen H., Int. J. Neural Sys., 8:581-599, 1997）、破断または
切断部位は、配列番号３２および配列番号３４のアミノ酸配列中のアミノ酸２１
およびアミノ酸２２間に存在するように予測される。 【０１５９】 幹細胞の増殖のためのマウス成熟支持因子は、配列番号３２のアミノ酸２２〜
２７９により表されるアミノ酸配列を含む。幹細胞の増殖のためのヒト成熟支持
因子は、配列番号３４のアミノ酸２２〜２７２により表されるアミノ酸配列を含
む。 【０１６０】 幹細胞の増殖のための支持因子が調製される場合、宿主細胞中に導入されるＳ
ＣＲ−１は、前駆物質ポリペプチドをコードするＤＮＡまたは成熟ポリペプチド
をコードするＤＮＡであり得る。幹細胞の増殖のためのマウス成熟支持因子をコ
ードするＤＮＡの一例は、配列番号３１のヌクレオチド番号５７４〜１３４７か
らなる少なくとも１個のヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む。幹細胞の増殖の
ためのヒト成熟支持因子をコードするＤＮＡの一例は、配列番号３３のヌクレオ
チド番号３２１〜１０７４からなる少なくとも１個のヌクレオチド配列を含むＤ
ＮＡを含む。 【０１６１】 本発明のＤＮＡは、コードされる幹細胞の増殖のための支持因子の活性が喪失
されない限り、１個または数個のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含むアミノ
酸配列を有する上記の因子をコードし得る。幹細胞の増殖のためのこの支持因子
と実質的に同一のポリペプチドをコードするＤＮＡは、部位特異的突然変異誘発
を用いて、特定領域中のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含
むよう、ヌクレオチド配列を修飾することにより得られる。 【０１６２】 上記の突然変異を含むＤＮＡは適切な細胞中で発現され、発現産物の造血幹細
胞を支持する活性は、幹細胞の増殖のためのこの支持因子と実質的に同一である
機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが得られるよう、検査され得る。
さらに、幹細胞の増殖のためのこの支持因子と実質的に同一の活性タンパク質を
コードするＤＮＡは、例えばそれを有する細胞からの配列番号１または配列番号
３で記載されるようなヌクレオチド配列、あるいはストリンジェントな条件下で
これらのＤＮＡから調製されるプローブを含むＤＮＡとのハイブリダイゼーショ
ンにより、かつ造血幹細胞を支持する活性を保有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡを単離することにより得られる。ストリンジェントな条件は、例えば７０％
以上の、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズ
し、それらより低い相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズしないもので
ある。上記のストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハルド、０．５
％ＳＤＳおよび６８℃（ＳＳＣ；３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム
）（５０×デンハルド；１％ＢＳＡ、１％ポリビニルピロリドン、１％フィコー
ル４００）、又は６×ＳＳＣ、５×デンハルド、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルム
アミド、４２℃等である。ハイブリダイゼーションのストラテジー(strategy)は
さらに、本明細書中に記述されたような最終洗浄条件により定義される。 【０１６３】 微生物、例えばエシェリヒア・コリおよび酵母、動物または植物由来の培養細
胞等が、ＳＣＲ−１を発現するための宿主細胞に用いられる。好ましくは、哺乳
動物の培養細胞が、宿主細胞として用いられる。原核生物細胞が宿主細胞として
用いられる場合、発現は、好ましくは、−ラクタマーゼ（ｂｌａ）、アルカリホ
スファターゼ（ｐｈｏＡ）および外膜プロテインＡ（ｏｍｐＡ）等のような原核
生物細胞に適したリーダー配列でシグナルペプチド領域が置き換えられる条件で
、あるいはメチオニン残基が成熟タンパク質のＮ末端部位に付加される形態で、
実施される。 【０１６４】 上記のように得られる幹細胞の増殖のための支持因子は、マウスＳＣＲ−１に
おける位置２３、３６および１３７単独、またはそれらの複数の位置のいずれか
で、糖鎖とともに付加され得る。上記と同様に得られる幹細胞の増殖のための支
持因子は、ヒトＳＣＲ−１における位置２３、３６、１３７または１９４単独、
あるいはそれらの複数の位置のいずれかで糖鎖とともに付加され得る。 【０１６５】 例えばＳＣＲ−１は、発現が可能な形態で宿主に対応するベクター中に組込ま
れ、得られた組換えベクターは、宿主細胞中へのＳＣＲ−１の導入が完了される
よう、宿主細胞中に導入される。 【０１６６】 哺乳動物由来の培養細胞の例は、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ７細胞等で
ある。遺伝子発現調節配列、例えばＳＣＲ−１を発現するためのプロモーターは
ＳＣＲ−１それ自体から生じ得るか、あるいはその他の遺伝子、例えばサイトメ
ガロウイルスプロモーターおよび伸長因子１プロモーター等に由来し得る。 【０１６７】 動物培養細胞のためのベクターの例は、プラスミドベクター、レトロウイルス
ベクター、アデノウイルスベクター（Neering, S.J., Blood, 88:1147, 1996）
、ヘルペスウイルスベクター（Dilloo, D., Blood, 89:119, 1997）、ＨＩＶベ
クター等である。 【０１６８】 培養細胞中に組換えベクターを導入するために、培養細胞の形質転換のために
通常用いられる従来の方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リ
ポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーションおよびマイクロ
インジェクション法が用いられる。 【０１６９】 本発明のポリペプチドは、配列番号３２または配列番号３４または本発明のそ
の他のポリヌクレオチド中に表されるアミノ酸配列中に１個または数個のアミノ
酸が置換、欠失または挿入されるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３２または
配列番号３４または本発明のその他のポリヌクレオチド中に表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドに加えて造血幹細胞を支持する活性を有するポリペプチ
ドも含む。すなわち、幹細胞の増殖のためのマウスおよびヒト支持因子が置換、
欠失、挿入等により修飾された場合でも、幹細胞の増殖のための支持因子として
の必須機能を保有するポリペプチドは、幹細胞の増殖のための支持因子と実質的
に同一であると考えられ得る。上記の「数個の(several)」とは、本発明のポリ
ペプチドの領域によって、総数として２個〜１１０個の範囲、好ましくは２個〜
５５個の範囲を意味する。 【０１７０】 幹細胞の増殖のためのこれらの修飾支持因子は、上記のＤＮＡを含む幹細胞ま
たは宿主細胞の増殖のための支持因子をコードするＤＮＡを突然変異誘発物質で
処理するか、または部位特異的突然変異誘発を用いて特定部位でアミノ酸を置換
、欠失、または挿入するために、上記のＤＮＡを突然変異させることにより得ら
れる。得られた突然変異体ポリペプチド中での造血幹細胞を支持するための活性
の残余は、下記の実施例により確証される。すなわち、突然変異体ポリペプチド
を発現する培養造血幹細胞が照射マウス中に導入された後、導入後の末梢血液学
的細胞充実性が長時間観察され得る。 【０１７１】 本発明のヌクレオチド配列が記載されたため、幹細胞の増殖のための修飾支持
因子は、これらのヌクレオチド配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドが
プライマーとして用いられるＰＣＲを用いて、あるいはこれらのヌクレオチド配
列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドがプローブとして用いられるハイブ
リダイゼーションを用いて、マウスまたはヒトｃＤＮＡあるいは染色体ＤＮＡラ
イブラリーからの対応するＤＮＡを単離することによっても得られる。 【０１７２】 一態様において、本発明のＤＮＡは、下記のようにＳＢＨ（ハイブリダイゼー
ションによるシーケンシング）法（Drmanac, S., Nat. Biotechnol., 16. 54, 1
998; Drmanac, R., Methods. Enzymol., 303, 165, 1999）を用いて、造血幹細
胞を支持する活性を有するマウスストローマ細胞株であるＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細
胞のｃＤＮＡライブラリーから単離された。造血幹細胞を支持する活性を有する
マウスストローマ細胞系は、国際特許公開第９９／０３９８０号に開示された方
法を用いて、あるいはCell Development Bank of Institute of Physical and C
hemical Research (RIKEN)またはＡＴＣＣから得られる。 【０１７３】 ＳＢＨ法の概略は、以下で説明される。その配列が互いに異なる８個または９
個のヌクレオチドを含むプローブが調製される。プローブの配列に対応するヌク
レオチド配列が標的遺伝子中に存在する場合、プローブはその遺伝子とハイブリ
ダイズし得る。ハイブリダイゼーションは、放射性同位元素または蛍光結合プロ
ーブの利用により、容易に検出され得る。ライブラリー中の各クローンが採取さ
れ、膜上にブロットされる。次に、各クローンとハイブリダイズするプローブの
組合せを同定することができるよう、上記のプローブを用いて反復ハイブリダイ
ゼーションが実施される。各遺伝子とハイブリダイズするプローブの組合せはク
ローンの配列に依存しているため、同一遺伝子はプローブと同一特徴的ハイブリ
ダイゼーションパターンを有する。すなわち、同一遺伝子は、ハイブリダイズし
たプローブの特徴によって一群（クラスター）と同定され得る。ライブラリー中
の各遺伝子に由来するクローンの数は、プローブのハイブリダイゼーションプロ
フィールに基づいたクラスターの成員をクラスター化および、計数することによ
り確定され得る。したがって、ライブラリー中の各遺伝子の発現の発生率が確定
され得る。 【０１７４】 クラスター化分析は、支持および非支持ストローマ細胞系由来のｃＤＮＡライ
ブラリーに関して実施された。したがって、支持ストローマ細胞系中で特に高度
に発現される遺伝子が選択されるよう、細胞間の発現遺伝子の発生率が比較され
た。造血幹細胞を支持する活性を有する細胞中で高度に発現した遺伝子が得られ
るよう、各細胞中のこれらの遺伝子の発生率がノーザンブロット分析によりさら
に検査された。 【０１７５】 ＳＣＲ−１は、上記の過程を通して得られる支持細胞中で特異性を有して高度
に発現された遺伝子の１つである。クラスター化およびノーザンブロット分析を
用いた分析後、配列番号３１のヌクレオチド番号１０３２〜１４８４を含む遺伝
子が同定された。ＳＣＲ−１をコードする完全遺伝子は、ＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細
胞由来のｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。 【０１７６】 さらに、ＳＣＲ−１の造血に関する能力の支持を評価するために、ＳＣＲ−１
遺伝子中のＯＲＦ（配列番号３１のヌクレオチド番号５１１〜１３５０）を含む
遺伝子断片を、レトロウイルスベクターを用いて造血幹細胞を支持できないスト
ローマ細胞（ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７）に導入し、ストローマ細胞の造血幹細胞を支
持する活性の変化を評価した。実質的に、遺伝子を導入されなかったストローマ
細胞ならびに遺伝子を導入されたストローマ細胞が別々に、マウス造血幹細胞と
共培養された後、造血細胞は照射マウスに移植された。レシピエントマウス中の
共培養造血細胞の植え付け物が検査された。その結果、ＳＣＲ−１を導入された
ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞系と共培養された造血幹細胞を移植されたマウスは、Ｓ
ＣＲ−１遺伝子を導入されなかったＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞系と比較して、移植
後にキメラ現象の増大を示した。この結果は、ＳＣＲ−１を発現するＡＧＭ−ｓ
３−Ａ７ストローマ細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは生存の
ための支持活性を得たことを示す。その結果、ＳＣＲ−１が、造血幹細胞または
造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持するための活性を保有しないストローマ
細胞に上記の活性を付加する機能を有することが明らかになった。したがって、
ＳＣＲ−１は造血幹細胞または造血前駆細胞の生存もしくは増殖を支持する活性
を有する、あるいはストローマ細胞に造血幹細胞を支持する活性を付加する活性
を有することが明示された。 【０１７７】 本発明のポリペプチドは、ヒト造血幹細胞またはヒト造血前駆細胞を増殖また
は支持するための薬剤として用いられ得る。この薬学的組成物は、エクスビボで
のヒト造血幹細胞またはヒト造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持するために
用いられ得る。時として十分量の造血幹細胞を収集することができず、移植が実
施され得ないことが末梢血幹細胞移植および臍帯血幹細胞移植のような造血幹細
胞移植療法で問題となっている。十分な幹細胞が収集されない場合でも、本発明
のポリペプチドを用いたインビトロでの造血幹細胞の増幅により、十分量の造血
幹細胞が生成され（かつ移植され）得る。すなわち、造血幹細胞は、本発明のポ
リペプチドを含む培地中で造血幹細胞を培養することにより、分化を伴わずに増
幅され得る。培地への種々のサイトカインの添加により造血幹細胞はより効率的
に増幅され得るということも考えられ得る。 【０１７８】 造血幹細胞または造血前駆細胞が本発明のポリペプチドを含む培地中で培養さ
れる場合、造血幹細胞または造血前駆細胞は単独で用いられるか、または両者が
用いられる。さらに、細胞は少なくとも造血幹細胞または造血前駆細胞を含むべ
きであり、その他の造血細胞を含み得る。さらに、本発明のポリペプチドは、造
血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞集団からの精製造血幹細胞分画または造
血前駆細胞分画の造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖のために用いられ得る。 【０１７９】 本発明の方法による造血幹細胞および造血前駆細胞の供給源の例は、哺乳動物
、例えばヒトおよびマウス等の胎児肝臓、骨髄、胎児骨髄、末梢血、幹細胞がサ
イトカインおよび／または抗腫瘍薬投与により動員されるヒトからの末梢血、臍
帯血等である。組織が造血幹細胞を含む限り、任意の供給源が用いられ得る。 【０１８０】 培養のためのペトリ皿およびフラスコを使用する培養方法が、造血幹細胞また
は造血前駆細胞を培養するために用いられ得る。造血幹細胞および／または造血
前駆細胞の培養法は、培地組成、ｐＨなどを機械的に制御し、高密度培養が可能
なバイオリアクターを用いることにより、改良され得る（Schwartz, Proc. Natl
. Acad. Sci. U.S.A., 88:6760, 1991; Koller, M.R., Bio/Technology, 11:358
, 1993; Koller, M.R., Blood, 82:378, 1993; Palsson, B.O., Bio/Technology
, 11:368, 1993）。 【０１８１】 ＳＣＲ−１は、ストローマ細胞および造血細胞の共培養の条件下でストローマ
細胞の活性を増大して造血幹細胞を支持し得るため、造血幹細胞および／または
造血前駆細胞は、全骨髄細胞がＳＣＲ−１の存在下で培養されると、効率的に増
殖され得る。ストローマ細胞および造血細胞のこの種類の共培養は、複雑な細胞
分離なしに、骨髄細胞の収集後に簡単に実施されることができる。さらに、収集
骨髄細胞からの別々の構成成分、例えば造血幹細胞、造血前駆細胞およびストロ
ーマ細胞を用いた共培養を実施し、異なる個体からの造血細胞およびストローマ
細胞を併合し得る。さらに、ストローマ細胞を成長させ、造血幹細胞または造血
前駆細胞拡張のための造血幹細胞との共培養前にストローマ細胞培養を確立し得
る。この時点で、ストローマ細胞の成長および生存を促して、ストローマ細胞培
養を確立するために、細胞刺激因子を利用し得る。細胞刺激因子の例としては、
典型的にはサイトカインである成長因子、例えばＳＣＦ（幹細胞因子）、ＩＬ−
３（インターロイキン−３）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球／マクロファージコロニー
刺激因子）、ＩＬ−６（インターロイキン−６）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）
、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＴＧＦ−ｂ（形質転換成長因子−ｂ
）、ＭＩＰ−１ａ（Davatelis, G., J. Exp. Med. 167:1939, 1988）；分化およ
び増殖制御因子、例えば造血ホルモン、例えばＥＰＯ（エリスロポエチン）、ケ
モカイン、Ｗｎｔ遺伝子産物およびノッチリガンド；ならびに発生制御因子が挙
げられる。 【０１８２】 さらに、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖および生存は、組換えＳＣＲ−
１単独を用いて、またはストローマ細胞を伴わずに細胞刺激因子と組合せて用い
て、造血幹細胞および／または造血前駆細胞を培養することにより保持され得る
。この場合に用いられる細胞刺激因子の例は、上記の細胞刺激因子等である。 【０１８３】 培養のために用いられる培地は、造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしく
は生存が撹乱されない限り、特に制限されない。好ましい培地は、例えばＭＥＭ
−α培地（GIBCO BRL）、ＳＦ−０２培地（Sanko Junyaku）、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ
培地（GIBCO BRL）、ＩＭＤＭ培地（GIBCO BRL）およびＰＲＭＩ１６４０培地（
GIBCO BRL）である。培養温度は、通常は２５〜３９℃の範囲、好ましくは３３
〜３９℃の範囲である。培地への添加剤の例は、ウシ胎仔血清、ヒト血清、ウマ
血清、インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、エタノールアミン、ナ
トリウムセレナイト、モノチオールグリセロール、２−メルカプトエタノール、
ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、種々の
ビタミンおよび種々のアミノ酸である。ＣＯ₂の濃度は、通常は４〜６％の範囲
、好ましくは５％である。 【０１８４】 造血幹細胞はすべての造血細胞系統に分化することができるために、造血幹細
胞はインビトロで特定細胞型に分化するよう操作され、次に特定細胞が移植され
得る。例えば、赤血球が必要な場合、患者の幹細胞の培養および増殖後、その主
要構成成分が赤血球である造血細胞が、赤血球分化誘導または促進因子、例えば
ＥＰＯを用いて人工的に産生され得る。 【０１８５】 本発明のポリペプチドを用いて培養される造血幹細胞または造血前駆細胞は、
従来の骨髄移植または臍帯血移植のための移植片として置き換えられ得る。造血
幹細胞の移植は、移植片が半永久的に生着し得るため、従来の造血細胞移植療法
より優れている。 【０１８６】 造血幹細胞の移植は、白血病のための全身Ｘ線照射療法または高次化学療法に
関する組合せ療法としてのほかに、種々の疾患のための療法として用いられ得る
。例えば、有害反応として骨髄抑制を伴う療法、例えば化学療法、放射線療法等
が固形癌を有する患者に対して実施される場合、血液学的障害、血液学的不全は
、以下のように早期に改善され得る。骨髄は治療前に採集され、造血幹細胞また
は造血前駆細胞がインビトロで増殖される。次に、患者が早期回復の利益を得て
、化学療法の治療効果を高めるために従来のものより強い化学療法が実施され得
るよう、増殖細胞は治療後に患者に注入される。さらに、本発明により得られた
造血幹細胞または造血前駆細胞は、種々の造血細胞に分化される。所定の造血細
胞の形成不全を有する患者へのこれらの細胞の移植は、患者の不全状態を改善し
得る。さらにこの療法は、骨髄形成不全により引き起こされる再生不全性貧血の
ような貧血を発症する造血不全性貧血を改善し得る。さらに、本発明による造血
幹細胞の移植が有効である疾患の例は、免疫不全症候群（例えば慢性肉芽種症、
重複免疫不全症候群(duplicated immunodeficiency syndrome)、無ガンマグロブ
リン血症、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）等）サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、先天性貧血（例えば鎌状赤
血球血症）、ゴシェ病(Gaucher's disease)、網内系脂肪蓄積症（例えばムコ多
糖症）、副腎白質変性、種々の癌および腫瘍等である。 【０１８７】 造血幹細胞の移植は、用いられる細胞の差異以外の従来の骨髄移植または臍帯
血移植と同一の方法で実施され得る。 【０１８８】 上記の造血幹細胞移植のために用いられ得る造血幹細胞は、骨髄だけでなく、
上記の胎児肝臓、胎児骨髄、末梢血、サイトカインおよび／または抗腫瘍薬の投
与により誘導される幹細胞を有する末梢血、臍帯血等からも得られる。 【０１８９】 移植片は、本発明の方法により産生される造血幹細胞および造血前駆細胞のほ
かに、緩衝溶液等を含む組成物であり得る。 【０１９０】 本発明により産生される造血幹細胞または造血前駆細胞は、エクスビボ遺伝子
療法のために用いられ得る。染色体への標的遺伝子の組換えの発生率は、幹細胞
の休止状態、培養期間中の幹細胞の分化等により低いため、造血幹細胞に対する
遺伝子療法は確立するのが難しい。しかしながら本発明は、遺伝子導入の効力が
顕著に改善されることが予測されるよう、分化を伴わずに幹細胞を増幅し得る。
遺伝子療法において、外来遺伝子（療法用遺伝子）は造血幹細胞または造血前駆
細胞中に導入され、その後、得られた遺伝子導入細胞が用いられる。導入される
外来遺伝子は、疾患により適切に選定される。遺伝子療法の標的細胞が造血細胞
である疾患の例としては、免疫不全症候群（例えば慢性肉芽種症、重複免疫不全
症候群、無ガンマグロブリン血症、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、後天
性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等）、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、
先天性貧血（例えば鎌状赤血球血症）、ゴシェ病、網内系脂肪蓄積症（例えばム
コ多糖症）、副腎白質変性、種々の癌および腫瘍等が挙げられる。 【０１９１】 動物細胞中への遺伝子の導入のために用いられる通常の方法は、造血幹細胞ま
たは造血前駆細胞中への治療用遺伝子の導入のために用いられる。例は、遺伝子
療法のために利用されるウイルス由来の動物細胞のためのベクター、例えばレト
ロウイルスベクター（例えばモロニーマウス白血病ウイルス）、アデノウイルス
ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベク
ターおよびＨＩＶベクターを用いる方法（遺伝子療法のためのベクターに関して
は、Verma, I.M., Nature, 389:239, 1997参照）；リン酸カルシウムトランスフ
ェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレー
ション、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等で
ある。それらの中で、標的細胞の染色体ＤＮＡ中への挿入により遺伝子の発現が
恒久的に予測されるため、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクタ
ーまたはＨＩＶベクターを用いる方法が好ましい。 【０１９２】 例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、以下のように調製され得る
。まず、野生型アデノ随伴ウイルスＤＮＡの両端でＩＴＲ（逆方向末端反復）中
に治療のための遺伝子を挿入されたベクタープラスミド、およびウイルスタンパ
ク質を補うためのヘルパープラスミドが、２９３個の細胞株中に導入される。次
に、ウイルス粒子、例えばＡＡＶベクターが産生されるよう、ヘルパーウイルス
としてアデノウイルスが感染される。あるいはアデノウイルスの代わりに、ヘル
パー機能をコードするアデノウイルス遺伝子を発現するプラスミドがトランスフ
ェクトされ得る。得られたウイルス粒子は造血幹細胞または造血前駆細胞に感染
される。好ましくは、遺伝子の発現が調節されるよう、適切なプロモーターおよ
びエンハンサーがベクターＤＮＡ中の標的遺伝子の上流領域中に挿入される。マ
ーカー遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子が治療のための遺伝子のほかに用いられる
場合、治療のための遺伝子を導入された細胞は容易に選択される。治療のための
遺伝子は、センス遺伝子またはアンチセンス遺伝子であり得る。 【０１９３】 遺伝子療法のための組成物は、緩衝溶液および新規の有効成分等を、本発明の
方法による造血幹細胞または造血前駆細胞のほかに含み得る。 【０１９４】 遺伝子療法のためのベクターは、通常の方法を用いて発現ベクター中にＳＣＲ
−１を導入することにより製造され得る。遺伝子療法のためのこのベクターは、
ヒト造血幹細胞の生存および増殖を必要とする疾患を治療するために有用である
。すなわち、造血幹細胞または造血前駆細胞が支配的に増殖できるよう、ＳＣＲ
−１を製造するベクターが造血幹細胞中に導入され、細胞がインビトロで培養さ
れる。このように処理されたこれらの造血幹細胞を戻すことにより生じた造血幹
細胞が、インビボで増殖し得る。造血幹細胞は、遺伝子療法のためのこのベクタ
ーを身体中に導入することにより、インビボで有意に増殖し得る。あるいは、造
血幹細胞または造血前駆細胞が培養系中で増殖され得るよう、患者から得られた
骨髄細胞が培養され、遺伝子療法のためのこのベクターを導入される。あるいは
、造血幹細胞を支持するための活性が付加または増大され得るよう、遺伝子療法
のためのこのベクターは、骨髄から得られ、間葉性幹細胞とともに培養されたス
トローマ細胞中に導入される。 【０１９５】 実施例に示されているように、造血幹細胞を支持する活性を有さないストロー
マ細胞は、ＳＣＲ−１を用いてこの活性を含むよう修飾され得ると考えられるた
め、ヒトまたはマウス由来のストローマ細胞は、ＳＣＲ−１を遺伝子導入するこ
とにより造血幹細胞を支持する活性を有し得る。種々の治療に有用であるために
造血幹細胞または造血前駆細胞が存在および増殖できるよう、ＳＣＲ−１を発現
するストローマ細胞および造血幹細胞または造血前駆細胞は共培養される。 【０１９６】 造血幹細胞または造血前駆細胞はストローマ細胞中でＳＣＲ−１の発現により
生存および増殖できるため、ストローマ細胞の造血幹細胞を支持する能力は、指
標としてのＳＣＲ−１の発現を用いて評価され得る。ストローマ細胞中でのＳＣ
Ｒ−１の発現は、ＳＣＲ−１に対する抗体を用いて確証され得る。ＰＣＲプライ
マーは、配列番号３１、配列番号３３または本発明のその他のポリヌクレオチド
中に含まれる遺伝子から調製され、ＲＮＡは当該ストローマ細胞から調製されて
、ＳＣＲ−１の発現が確証され得るよう、ＲＴ−ＰＣＲが実施される。 【０１９７】 本発明の薬学的組成物は、ヒトに投与され得る。ヒト造血幹細胞または造血前
駆細胞を増殖または支持する活性を有する薬学的組成物は、医学的に許容可能な
希釈剤、安定剤、担体および／または本発明のポリペプチドを有するその他の添
加剤を混合することにより生成され得る。この時点で、インビボでのタンパク質
の安定性を増大するために、本発明のポリペプチドは修飾剤により修飾され得る
。修飾剤の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポ
リ（Ｎ−ビニル−ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリ
プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオ
ール、ポリビニルアルコール等である。ＰＥＧによるタンパク質の修飾の例は、
ＰＥＧの活性エステル誘導体がタンパク質と反応させられる方法、ＰＥＧの末端
部分のアルデヒド誘導体が還元剤の存在下でタンパク質と反応させられる方法等
である。日本国未審査特許出願第１０−５１０９８０号は、このようなタンパク
質の修飾を詳細に開示している。 【０１９８】 本発明の薬学的組成物がヒトに投与される場合、制癌の有害な薬剤反応による
血液学的抑制からの回復、骨髄移植、末梢血幹細胞移植または臍帯血移植での造
血細胞の早期回復、ならびに汎血球減少症、例えば再生不良性貧血（ＡＡ）およ
び骨髄形成形成性症候群（ＭＤＳ）での造血機能の回復が予測される。 【０１９９】 本発明の抗体は、本発明の上記のポリペプチドと特異的に反応する。この抗体
は、それらが上記のポリペプチドと特異的に反応する限り、モノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体であり得る。 【０２００】 本発明の抗体は、通常の方法により調製され得る。例えば抗体は、数週間の間
隔で１回または数回、アジュバントと一緒に抗原により動物がさらに免疫感作さ
れるインビボ方法で、あるいは適切な培養系で免疫細胞が単離および感作される
インビトロ方法で調製され得る。本発明の抗体を産生し得る免疫細胞の例は、脾
細胞、扁桃細胞、リンパ腺細胞等である。 【０２０１】 本発明の全ポリペプチドは、必ずしも抗原として用いられない。本発明のポリ
ペプチドの一部は、抗原として用いられ得る。抗原が短いペプチド、特に約２０
アミノ酸残基から作製されるポリペプチドである場合、抗原は、化学修飾等を用
いて、キーホールリンペットヘモシアニン(keyhole lympet hemocyanin)または
ウシ血清アルブミンのような高抗原性を有するキャリアタンパク質とそれを結合
することにより用いられ得る。あるいは抗原は、キャリアタンパク質の代わりに
リシンコアＭＡＰペプチドのような分枝骨格を有するペプチドとそれを共有結合
することにより用いられ得る（Posnettら, J. Biol. Chem., 263, 1719-1725, 1
988; Luら, Mol. Immunol., 28, 623-630, 1991; Briandら, J. Immunol. Metho
ds, 156, 255-265, 1992）。 【０２０２】 アジュバントの例は、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュ
バント、水酸化アルミニウムゲル等である。抗原を与えられる動物は、例えばマ
ウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウシ、ウマ、モルモット、ハ
ムスター等である。血液はこれらの動物から収集され、血清が分離される。次に
、硫酸アンモニウム沈降法、陰イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡク
ロマトグラフィーまたはプロテインＧクロマトグラフィーを用いて血清から免疫
グロブリンが精製されて、ポリクローナル抗体を得る。 【０２０３】 ニワトリに関しては、抗体は卵から精製され得る。モノクローナル抗体は、ハ
イブリドーマ細胞、またはハイブリドーマ細胞の腹腔内投与を受けた動物からの
腹水の培養の上清から精製および調製され得る。ハイブリドーマは、インビトロ
で感作された免疫細胞、または前記の動物からの免疫細胞の、培養可能な親細胞
との融合により作製される。親細胞の例は、Ｘ６３、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｘ６
３．６５３、ＳＰ２／Ｏ、Ｙ３、ＳＫＯ−００７、ＧＭ１５００、ＵＣ７２９−
６、ＨＭ２．０、ＮＰ４−１細胞株等である。調製は、上記の動物の免疫細胞に
対する適正なウイルス、例えばＥＢウイルスのインビトロでの感作または感染に
より得られた不死化抗体生成細胞を培養することにより実施され得る。 【０２０４】 これらの細胞操作法のほかに、抗体は遺伝子操作法を用いて得られ得る。例え
ば、上記の動物由来のインビトロ感作細胞または免疫細胞から得られる抗体遺伝
子は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅および単離され、増幅遺伝子
が微生物、例えばエシェリヒア・コリ中に導入されて、抗体を産生する。あるい
は抗体は、融合タンパク質としてファージの表面で発現され得る。本発明の抗体
は、本明細書において下記でも取り扱われる。 【０２０５】 ＳＣＲ−１は、本発明の抗体を用いてインビボで測定され得る。したがって、
ＳＣＲ−１と種々の疾患の病理学的状態との間の関係が明白にされ得る。さらに
抗体は、疾患の診断および治療、ならびにＳＣＲ−１の効率的アフィニティー精
製に用いられ得る。 【０２０６】 本発明は、それに影響を及ぼすかまたは作用することにより造血幹細胞または
造血前駆細胞の生存もしくは増殖を支持する活性、あるいはそれに影響を及ぼす
ことにより造血幹細胞を支持する活性を与える活性を有するポリペプチドを提供
し、さらにそれをコードするＤＮＡを提供する。本発明のポリペプチドは、造血
幹細胞または造血前駆細胞の増殖もしくは生存を効率的に維持し得る。 【０２０７】 さらに、本発明のポリペプチドは、ヒト造血幹細胞またはヒト造血前駆細胞を
増殖するためまたは支持するための薬剤として用いられ得る。 【０２０８】 あるいは、本発明は、以下に記述されるように説明される。 【０２０９】 ５．２ 本発明の核酸およびポリペプチド 本発明のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号１〜２４および３１〜
３４として記述される。生物学的活性を示すことができる本発明のタンパク質の
断片も、本発明に含まれる。タンパク質の断片は線状形態であり得るか、あるい
はそれらは、例えばH. U. Saragoviら, Bio/Technology 10, 773-778(1992)に、
ならびにR.S. McDowellら, J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253(1992)（これ
らの記載内容はともに、参照により本明細書中に援用される）に記載されている
ような既知の方法を用いて環化され得る。このような断片は、タンパク質結合部
位の原子価の増大を含めた多数の目的のためにキャリア分子、例えば免疫グロブ
リンに融合され得る。例えばタンパク質の断片は、「リンカー(linker)」配列を
介して免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され得る。２価形態のタンパク質に関し
ては、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ部分に対してであり得る。その他の免
疫グロブリンアイソタイプは、このような融合を生成するためにも用いられ得る
。例えばタンパク質−ＩｇＭ融合は、１０価形態の本発明のタンパク質を生成す
る。 【０２１０】 本発明は、全長および成熟形態（例えば、シグナル配列または前駆物質配列を
伴わない）の開示タンパク質も提供する。タンパク質コード配列は、開示ヌクレ
オチド配列の翻訳により列挙されている配列中で同定される。成熟形態のこのよ
うなタンパク質は、適切な哺乳動物細胞またはその他の宿主細胞中での全長ポリ
ヌクレオチドの発現により得られる。成熟形態のタンパク質の配列は、全長形態
のアミノ酸配列からも確定される。本発明のタンパク質が膜結合される場合、可
溶性形態のタンパク質も提供される。このような形態では、発現される細胞から
タンパク質が十分に分泌されるよう、タンパク質を膜結合させる領域の一部また
は全部が欠失される。 【０２１１】 本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在する、あるいは全部または一部合成
のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、ならびにＲＮＡ、例えばｍＲＮ
Ａを含む。配列番号１〜９、１１、１２、３１または３３は、ｃＤＮＡの全コー
ド領域を含み得るか、あるいはｃＤＮＡのコード領域の一部を示し得る。さらに
５’および３’配列は、当該技術分野で既知の方法を用いて得ることができる。
例えば、配列番号１〜９、１１、１２、３１または３３のポリヌクレオチドのい
ずれかに対応する全長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、プローブとして配列番号
１〜９、１１、１２、３１または３３のポリヌクレオチドあるいはその一部のい
ずれかを用いて、適切なハイブリダイゼーション条件下で適切なｃＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。
あるいは、配列番号１〜９、１１、１２、３１または３３のポリヌクレオチドは
、適切なゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー中での遺伝子の同定および／
または増幅を可能にする適切なプライマーのための基礎として用いられ得る。 【０２１２】 本発明の核酸配列は、構築したＥＳＴおよび１つまたはそれ以上の公共のデー
タベースから得られる配列（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列を含む）、例えば
ｄｂＥＳＴ、ｇｂｐｒｉおよびＵｎｉＧｅｎｅであり得る。本発明の範囲内の配
列はこれらの特定の配列に限定されず、それらの対立遺伝子および種の変異も含
む。対立遺伝子および種の変異は、配列番号８〜９、１１〜１２、３１または３
３で提供される配列、それらの代表的断片、あるいは配列番号８〜９、１１〜１
２、３１または３３と少なくとも９０％同一の、好ましくは９９．９％同一のヌ
クレオチド配列を、同一種の別の単離物からの配列と比較することによりありき
たりに確定され得る。さらに、コドン可変性を適応させるために、本発明は、本
明細書中に開示された特定のＯＲＦの場合と同一のアミノ酸配列をコードする核
酸分子を含む。言い換えれば、ＯＲＦのコード領域では、同一アミノ酸をコード
する別のコドンに代わるあるコドンの置換が、特に意図される。 【０２１３】 配列番号８および９と呼ばれる本発明の核酸は、シードとしてＥＳＴ配列を用
いて構築された。ＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知のプログラムまたはアルゴ
リズムにより、全長核酸に伸長され得る。好ましくは、帰納的アルゴリズムは、
この構築物に属する、異なるデータベース（例えばＥＳＴ配列、ｄｂＥＳＴバー
ジョン１１４、ｇｂ ｐｒｉ１１４およびＵｎｉＧｅｎｅバージョン１０１を含
むHyseqのデータベース）からさらなる配列を引き出すことにより、シードＥＳ
Ｔを伸長構築物に伸長するために用いられる。構築物を伸長するデータベースか
らのさらなる配列が存在しなかった場合、アルゴリズムは終結する。さらに、構
築物中への構成成分配列の含入は、３００より大きいＢＬＡＳＴスコアおよび９
５％より高い同一性％を有する伸長構築物に対するＢＬＡＳＴＮヒットに基づい
ていることが好ましい。Basic Local Alignment Search Toolを表すＢＬＡＳＴ
は、局所配列アライメントを検索するために用いられる（Altschul, S.F., J. M
ol. Evol. 36: 290-300 (1993)およびAltschul, S.F.ら, J. Mol. Biol. 21:403
-10(1990)）。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアライメント
を生成して、配列類似性を確定する。アライメントの局所性のために、ＢＬＡＳ
Ｔは的確なマッチを決定するのに特に有用である。 【０２１４】 ＥＳＴ配列（配列番号１〜７）は、全長遺伝子に関する同定配列情報、代表的
断片またはセグメント情報、あるいは新規のセグメント情報を提供し得る。 【０２１５】 配列番号９を含む本発明の核酸に関して最も近く隣接する結果は、アルゴリズ
ムまたはプログラムを用いてデータベースを検索することにより得られる。好ま
しくは、ＦＡＳＴＡバージョン３は、Ｆａｓｔｘｙアルゴリズムを用いて、Ｇｅ
ｎｐｅｐｔを検索する。最隣接物の結果は、Ｇｅｎｐｅｐｔからの各構築物に関
して最も近い同族体を示す（また、集合物がコードする翻訳アミノ酸配列を含む
）。 【０２１６】 本発明は、本明細書中に開示されたｃＤＮＡ配列に対応する遺伝子も提供する
。対応する遺伝子は、本明細書中に開示された配列情報を用いて既知の方法に従
って単離され得る。このような方法としては、適切なゲノムライブラリーまたは
ゲノム物質のその他の供給源における遺伝子の同定および／または増幅に関する
開示配列情報からのプローブまたはプライマーの調製を含む。 【０２１７】 開示ポリヌクレオチドおよびタンパク質の種同族体（またはオーソログ(ortho
log)）も、本発明により提供される。種同族体は、本明細書中で提供される配列
から適切なプローブまたはプライマーを作製し、所望の種からの適切な核酸供給
源をスクリーニングすることにより単離および同定され得る。 【０２１８】 本発明は、開示ポリヌクレオチドまたはタンパク質の対立遺伝子変異体、すな
わち、ポリヌクレオチドによりコードされるものと同一であるか、相同であるか
または関連するタンパク質もコードする単離されたポリヌクレオチドの天然に存
在する代替形態も含む。 【０２１９】 ５．３ 本発明の核酸 本発明の単離されたポリヌクレオチドとしては、配列番号１０、１３〜２４、
３２および３４を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはそ
の成熟タンパク質部分が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい核酸配
列は、配列番号９、１１、１２、３１または３３として記述される。 【０２２０】 本発明の単離されたポリヌクレオチドとしてはさらに、配列番号１〜９、１１
、１２、３１または３３のヌクレオチド配列のいずれかを含むポリヌクレオチド
、配列番号１〜９、１１、１２、３１または３３のポリヌクレオチドの全長タン
パク質コード配列を含むポリヌクレオチド、ならびに配列番号１〜９、１１、１
２、３１または３３のポリヌクレオチドの成熟タンパク質コード配列をコードす
るヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定され
ない。本発明のポリヌクレオチドとしては、好ましくは幹細胞成長因子活性を有
し、ストリンジェントな条件下で、（ｂ）配列番号１０、１３〜２４、３２また
は３４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する（ａ）配列番号１
〜９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列のいずれかの相補体とハ
イブリダイズするポリペプチド；上記の任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子変
異体であるポリヌクレオチド；上記のタンパク質のいずれかの種同族体をコード
するポリヌクレオチド；あるいは配列番号１０、１３〜２４、３２または３４の
ポリペプチドの特定ドメインまたは切断体を含むポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドも挙げられるが、これらに限定されない。当該ドメインは、コード
ポリペプチドの性質に依存し得る。例えば受容体様ポリペプチド中のドメインと
しては、リガンド結合、細胞外、膜貫通または細胞質ドメインあるいはそれらの
組合せが挙げられる、免疫グロブリン様タンパク質中のドメインとしては、可変
免疫グロブリン様ドメインが挙げられる、酵素様ポリペプチド中のドメインとし
ては、触媒および基質結合ドメインが挙げられる、また、リガンドポリペプチド
中のドメインとしては、受容体結合ドメインが挙げられる。 【０２２１】 本発明の好ましいポリペプチド切断体をコードするポリヌクレオチドは、本発
明の１つまたはそれ以上のドメインおよび異種タンパク質配列を含むキメラまた
は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを生成するために用いられ得る
。 【０２２２】 本発明のポリヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドのいずれかの相補体を
さらに含む。 【０２２３】 本発明のポリヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドと実質的に等価である
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチ
ドは、上記のポリヌクレオチドと、例えば少なくとも約６５％、少なくとも約７
０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８
４％、さらに典型的には少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％
、さらに典型的には少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さ
らにより典型的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配
列同一性を有し得る。本発明は、このようなポリヌクレオチドの相補体も提供す
る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、増幅または合成）または
ＲＮＡであり得る。このようなポリヌクレオチドを生成するための方法およびア
ルゴリズムは当業者に既知であり、その例としては、例えば所望の配列同一性を
有するポリヌクレオチドをありきたりに単離し得るハイブリダイゼーション条件
の確定方法が挙げられる。 【０２２４】 本発明のポリヌクレオチドは、十分に確立された組換えＤＮＡ技術により、種
々のその他のヌクレオチド配列のいずれかに連結され得る（Sambrook Jら(1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ,
NY参照）。ポリヌクレオチドに連結するための有用なヌクレオチド配列は、当該
技術分野で既知のベクターの組合せ、例えばプラスミド、コスミド、λファージ
誘導体，ファージミド等を含む。したがって本発明は、本発明のポリヌクレオチ
ドを含むベクター、およびポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。一般に
ベクターは、少なくとも１つの生物体中で機能的である複製起点、利便性のよい
制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞に関する選択マーカーを含む。本
発明のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター
およびシーケンシングベクターが挙げられる。本発明の宿主細胞は原核細胞また
は真核細胞であり得て、単細胞生物、または多細胞生物の一部であり得る。 【０２２５】 本発明の範囲内の配列は、記載された本明細書中の特定の配列に限定されず、
その対立遺伝子変異も含む。対立遺伝子変異は、配列番号１〜９、１１、１２、
３１または３３で提供されるヌクレオチド配列、その代表的断片、あるいは配列
番号１〜９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列のいずれかと少な
くとも９９．９％同一であるヌクレオチド配列を、同一種の別の単離物からの配
列と比較することによりありきたりに確定され得る。コドン変異性を適応させる
ために、本発明は、本明細書中に開示された特定のＯＲＦの場合と同一のアミノ
酸配列をコードする核酸分子を含む。言い換えれば、ＯＲＦのコード領域では、
同一アミノ酸をコードする別のコドンに代わるあるコドンの置換が、特に意図さ
れる。本明細書中に開示された任意の特定の配列は、特定の断片、例えばＯＲＦ
を、両方向に再シーケンシングする（すなわち両鎖をシーケンシングする）こと
により、エラーに関して容易にスクリーニングされ得る。 【０２２６】 本発明はさらに、配列番号１〜９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチ
ド配列またはその断片のいずれかを有する核酸、あるいは本発明の任意のその他
のポリヌクレオチドを含む組換え構築物を提供する。一実施形態では、本発明の
組換え構築物は、ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターを含み、
その中に、配列番号１〜９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列ま
たはその断片のいずれかを有する核酸が、順配向または逆配向で挿入される。本
発明のＯＲＦの１つを含むベクターの場合、ベクターは、ＯＲＦと操作可能に連
結される調節配列、例えばプロモーターをさらに含み得る。本発明のＥＭＦおよ
びＵＭＦを含むベクターに関しては、ベクターは、ＥＭＦまたはＵＭＦと操作可
能に連結されるマーカー配列または異種ＯＲＦをさらに含み得る。多数の適切な
ベクターおよびプロモーターが当業者に既知であり、本発明の組換え構築物を生
成するために市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌：ｐ
Ｂｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（
Stratagene）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ
５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmacia）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ
、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭ
ＳＧ、ｐＳＶＬ（Pharmacia）。 【０２２７】 本発明の単離されたポリヌクレオチドは、タンパク質を組換え的に生成するた
めに、Kaufmanら, Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490(1990)に開示されたｐＭ
Ｔ２またはｐＥＤ発現ベクターのような発現制御配列と操作可能に連結され得る
。多数の適切な発現制御配列は、当該技術分野で既知である。組換えタンパク質
を発現する一般的方法も既知であり、R. Kaufman, Methods in Enzymology 185,
537-566(1999)に例示されている。本明細書中で定義されているように、「操作
可能に連結される(operatively linked)」とは、本発明の単離されたポリヌクレ
オチド、ならびに発現制御配列が、連結ポリヌクレオチド／発現制御配列で形質
転換された（トランスフェクトされた）宿主細胞によりタンパク質が発現される
ような方法で、ベクターまたは細胞内に置かれることを意味する。 【０２２８】 プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベ
クターまたは選択マーカーを有するその他のベクターを用いて任意の所望の遺伝
子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ
７である。特定の命名された細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、
Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、およびｔｒｃが挙げられる。真核生物プロモータ
ーとしては、ＣＭＶ極初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０
、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられ
る。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内であ
る。一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点
および選択マーカー、例えばエシェリヒア・コリおよびビール酵母菌ＴＲＰ１遺
伝子のアンピシリン耐性遺伝子、ならびに下流構造配列の転写を指図するための
高度発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、解糖酵
素、例えば３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ａ−因子、酸性ホスフ
ァターゼまたは熱ショックタンパク質等をコードするオペロンから得られる。異
種構造配列は、翻訳開始および終結配列、好ましくはペリプラズム間隙または細
胞外媒質中への翻訳タンパク質の分泌を誘導することができるリーダー配列を用
いて適切な相で構築される。任意に、異種配列は、所望の特性、例えば発現組換
え産物の安定化または簡易精製を付与するアミノ末端同定ペプチドを含めた融合
タンパク質をコードし得る。細菌使用のための有用な発現ベクターは、所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、機能的プロモーターを伴う操作可能な
読取り相中で適切な翻訳開始および終結シグナルと一緒に挿入することにより構
築される。ベクターは、１つまたはそれ以上の表現型選択マーカーおよび複製起
点を含んで、ベクターの保持を保証し、所望により、宿主内での増幅を提供する
。形質転換のための適切な原核生物宿主としては、エシェリヒア・コリ、バチル
ス・サブチルス、サルモネラ・チフィムリウム、およびシュードモナス属、スト
レプトミセス属およびブドウ球菌属内の種々の種が挙げられるが、その他のもの
も選択物として用いられ得る。 【０２２９】 代表的な、しかし限定されない例としては、細菌使用のための有用な発現ベク
ターは、既知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺
伝子要素を含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌性複製起点を含
み得る。このような商業的ベクターとしては、例えばｐＫＫ２２３−３（Pharma
cia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）およびＧＥＭ１（Promega Biotech, Ma
dison, WI, USA）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン(backbon
e)」部分は、適切なプロモーターおよび構造配列と併合されて、発現される。適
切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖後、選定プロモー
ターは適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）により誘導または低下
され、細胞がさらなる期間、培養される。細胞は典型的には遠心分離により収集
され、物理的または化学的手段により破壊され、その結果生じた粗製抽出物はさ
らなる精製のために保持される。 【０２３０】 本発明の核酸配列の範囲内に含まれるのは、ストリンジェントな条件下で配列
番号１〜９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列、あるいはその相
補体のいずれかとハイブリダイズする核酸配列断片であって、この断片は、約１
０ｂｐより大きく、好ましくは２０〜５０ｂｐであり、１００ｂｐより大きく，
３００ｂｐより大きく、あるいは５００ｂｐより大きくさえある。選択可能であ
る（すなわち本発明のポリヌクレオチドのいずれかと特異的にハイブリダイズす
る）例えば１５、１６または２０ｂｐあるいはそれ以上の断片が意図される。ポ
リヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能なプローブは、本発明のポリヌク
レオチド配列を遺伝子の同一ファミリー中のその他のポリヌクレオチド配列と区
別し得るか、あるいはヒト遺伝子を他の種の遺伝子と区別し得るし、好ましくは
独自のヌクレオチド配列に基づいている。 【０２３１】 本発明によれば、配列番号１０、１３〜２４、３２または３４に対応する成熟
タンパク質コード配列を含むポリヌクレオチド配列、あるいはその機能的等価物
は、適切な宿主細胞中での核酸またはその機能的等価物の発現を誘導する組換え
ＤＮＡ分子を生成するために用いられ得る。本明細書中で同定されるクローンの
いずれかのｃＤＮＡ挿入物も含まれる。 【０２３２】 本発明の核酸配列はさらに、上記の核酸の変異体をコードする配列に関する。
これらのアミノ酸配列変異体は、自然または変異体ポリヌクレオチド中に適切な
ヌクレオチド変化を導入することにより、当該技術分野で既知の方法により調製
され得る。アミノ酸配列変異体の構築には、２つの変数が存在する：すなわち突
然変異の位置と、突然変異の性質である。アミノ酸配列変異体をコードする核酸
は、好ましくは、天然には生じないアミノ酸配列をコードするために、ポリヌク
レオチドに突然変異を起こさせることにより構築される。これらの核酸変更は、
異なる種からの核酸が異なる部位（可変位置）で、または高度保存領域（定常領
域）でなされ得る。このような位置選定の部位は、典型的には、例えばまず保存
的選択での置換（例えば疎水性アミノ酸を異なる疎水性アミノ酸に）、次により
離れた選択での置換（例えば疎水性アミノ酸を荷電アミノ酸に）により連続して
修飾され、次に欠失または挿入が標的部位でなされ得る。アミノ酸配列欠失は、
一般に約１〜３０残基、好ましくは約１〜１０残基の範囲であり、典型的には連
続している。アミノ酸挿入は、１〜１００またはそれ以上の残基長の範囲のアミ
ノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合を、ならびに単一または複数の
アミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入は、一般的に約１〜１０アミノ酸
残基、好ましくは１〜５残基の範囲であり得る。末端挿入の例としては、分泌に
、または種々の宿主細胞における細胞内ターゲティングに必要な異種単一配列、
ならびに発現タンパク質を精製するために有用な配列、例えばＦＬＡＧまたはポ
リヒスチジン配列が挙げられる。 【０２３３】 好ましい方法では、新規のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、部
位特異的突然変異誘発により変更される。この方法は、所望のアミノ酸変異体を
コードするためにポリヌクレオチドを変更するためのオリゴヌクレオチド配列を
、ならびに変更されている部位のいずれかの側に安定二重鎖を形成するために変
更アミノ酸の両側における十分な隣接ヌクレオチドを用いる。一般に、部位特異
的突然変異誘発の技術は当業者には既知であり、この技法は、Edelmanら, DNA 2
:183(1983)等の出版物により例示される。ポリヌクレオチド配列中に部位特異的
変化を生成するための多目的および有効な方法は、Zoller and Smith, Nucleic
Acids Res. 10:6487-6500(1982)により発表されている。新規の核酸のアミノ酸
配列変異体を作製するためには、ＰＣＲも用いられ得る。少量の鋳型ＤＮＡが出
発物質として用いられる場合、鋳型ＤＮＡ中の対応する領域と配列がわずかに異
なるプライマーは、所望のアミノ酸変異体を生成し得る。ＰＣＲ増幅は、プライ
マーにより特定される位置のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド鋳型と
は異なる生成物ＤＮＡ断片の集団を生じる。生成物ＤＮＡ断片は、プラスミド中
の対応する領域に取って代わり、これが所望のアミノ酸変異体をコードするポリ
ヌクレオチドを生じる。 【０２３４】 アミノ酸変異体を生成するためのさらなる技法は、Wellsら, Gene 34:315(198
5)に記載されているカセット突然変異誘発技法であり、当該技術分野で既知のそ
の他の突然変異誘発技法、例えばSambrookら（上記）、ならびにCurrent Protoc
ols in Molecular Biology, Ausubel,らにおける技法である。遺伝コードの固有
の縮重のために、実質的に同一または機能的に等価のアミノ酸配列をコードする
その他のＤＮＡ配列が、これら新規の核酸のクローニングおよび発現のために本
発明の実施に際して用いられ得る。このようなＤＮＡ配列は、ストリンジェント
な条件下で適切な新規の核酸配列とハイブリダイズ可能なものを含む。 【０２３５】 本発明のポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導するためにも用いられ得る。例
えば、Fanら, Nat. Biotech. 17:870-872(1999)（この記載内容は、参照により
本明細書中に援用される）に記載されているように、ポリペプチドをコードする
核酸配列は、裸プラスミドＤＮＡの局所投与後、またはＤＮＡの注入、好ましく
は筋内注射後にコードポリペプチドに対する抗体を生成するために用いられ得る
。核酸配列は、好ましくは組換え発現ベクター中に挿入され、裸ＤＮＡの形態で
あり得る。 【０２３６】 ５．３．１ アンチセンス核酸 本発明の別の態様は、幹細胞成長因子様ヌクレオチド配列、あるいはその断片
、類縁体または誘導体を含む核酸分子とハイブリダイズし得るかまたはそれと相
補的である単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タン
パク質をコードする「センス」核酸と相補的である（例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子
のコード鎖と相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列と相補的である）ヌクレオチド
配列を含む。特定の態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０
または５００ヌクレオチドあるいは全幹細胞成長因子様コード鎖と、あるいはそ
の一部のみと相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。幹細胞成
長因子様の断片、同族体、誘導体および類縁体をコードする核酸分子、または幹
細胞成長因子様核酸配列と相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。 【０２３７】 一実施形態では、アンチセンス核酸分子は、幹細胞成長因子様タンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスで
ある。「コード領域(coding region)」という用語は、アミノ酸残基に翻訳され
るコドン含む無ヌクレオチド配列の領域を指す。別の実施形態では、アンチセン
ス核酸分子は、幹細胞成長因子様タンパク質をコードするヌクレオチド配列のコ
ード鎖の「容認(conceding)領域」に対してアンチセンスである。「容認領域(co
nceding region)」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接す
る５’および３’配列を指す（すなわち、５‘および３’非翻訳領域とも呼ばれ
る）。 【０２３８】 コード鎖配列が本明細書中に開示された幹細胞成長因子様タンパク質をコード
するとすれば、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック型またはフー
グスティーン型塩基対の法則によりデザインされ得る。アンチセンス核酸分子は
幹細胞成長因子様ｍＲＮＡの全コード領域と相補的であり得るが、さらに好まし
くは、幹細胞成長因子様ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみに対し
てアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えばアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、幹細胞成長因子様ｍＲＮＡの翻訳開始部位周囲の領域と相補的で
あり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約５、１０、１５、２０
、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明
のアンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手法を用いる化学合成または酵素
連結反応を用いて構築され得る。例えばアンチセンス核酸（例えばアンチセンス
オリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学
的安定性を増大するよう、またはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される
二重鎖の物理的安定性を増大するようデザインされる種々に修飾されたヌクレオ
チドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体および
アクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。 【０２３９】 アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの例として
は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨ
ードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カ
ルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−
２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラ
シル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン，イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオ
シン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−
メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）
、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−
メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチル
ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢
酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カ
ルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン
が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向でサブ
クローニングされた発現ベクターを用いて、生物学的に製造され得る（すなわち
、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、以下の節でさらに説明される当該標的核酸
に対してアンチセンス配向を有する）。 【０２４０】 本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、幹細胞成長因子様タンパク質
をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは
結合し、それによりタンパク質の発現を抑制する（例えば転写および翻訳を抑制
することにより）よう、被験体に投与されるか、インシトゥ(in situ)で生成さ
れる。ハイブリダイゼーションは、安定二重鎖を形成するための従来のヌクレオ
チド相補性によるか、あるいは例えばＤＮＡ二重鎖と結合するアンチセンス核酸
分子の場合には、二重螺旋の主溝における特異的相互作用によるものであり得る
。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接注
入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選定細胞を標的にするた
めに修飾され、次に全身的に投与され得る。例えば、全身的な投与のためには、
アンチセンス分子は、それらが選定細胞表面に発現される受容体または抗原と特
異的に結合するよう（例えばアンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗
原と結合するペプチドまたは抗体と連結することにより）、修飾され得る。アン
チセンス核酸分子はさらに、本明細書中に記載されたベクターを用いて細胞に送
達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強ｐｏ
ｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物
が好ましい。 【０２４１】 さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核
酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常のα−ユニットとは逆に、鎖が互
いに並行に走る相補的ＲＮＡと特異的二重鎖ハイブリッドを形成する（例えばGa
ultierら, 1987. Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641参照）。アンチセンス核酸分
子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えばInoueら 1987. Nucl. Acids
Res. 15, 6131-6148参照）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（例えばInoueら,
1987. FEBS Lett. 215, 327-330）も含み得る。 【０２４２】 ５．３．２ リボザイムおよびＰＮＡ部分 核酸修飾としては、修飾塩基、ならびに糖リン酸塩主鎖が修飾されるかまたは
誘導体化される核酸が挙げられるが、これらに限定されない。これらの修飾は、
修飾核酸が例えば被験体における治療的用途でのアンチセンス結合核酸として用
いられ得るよう、修飾核酸の化学的安定性を増強するために少なくとも一部分実
行される。 【０２４３】 一実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイム
は、修飾核酸が相補的領域を有する一本鎖核酸、例えばｍＲＮＡを切断し得るリ
ボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（
例えばHaselhoff and Gerlach 1988. Nature 334, 585-591に記載されているよ
うなハンマーヘッドリボザイム）を用いて幹細胞成長因子様ｍＲＮＡ転写体を触
媒的に切断し、それにより幹細胞成長因子様ｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る。幹細
胞成長因子様コード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開
示された幹細胞成長因子様ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいてデザインされ
得る。例えば、幹細胞成長因子様コードｍＲＮＡ中の切断されるヌクレオチド配
列と活性部位のヌクレオチド配列が相補的であるテトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ
ＲＮＡの誘導体が構築され得る（例えば米国特許第４，９８７，０７１号（Ce
ch等）および米国特許第５，１１６，７４２号（Cech等）参照）。幹細胞成長因
子様ｍＲＮＡは、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡをＲＮＡ分子
のプールから選択するためにも用いられ得る（例えばBartelら, (1993) Science
261, 1411-1418参照）。 【０２４４】 あるいは、幹細胞成長因子様遺伝子発現は、幹細胞成長因子様核酸（例えば幹
細胞成長因子様プロモーターおよび／またはエンハンサー）の調節領域と相補的
なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞中での幹細胞成長因子様遺伝子の転
写を防止する三重螺旋構造を形成することにより抑制され得る（例えばHelene,
1991. Anticancer Drug Des. 6, 569-84; Heleneら 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci
. 660, 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14, 807-15参照）。 【０２４５】 種々の実施形態において、幹細胞成長因子様核酸は、例えば分子の安定性、ハ
イブリダイゼーションまたは溶解性を改良するために、塩基部分、糖部分または
リン酸塩主鎖で修飾され得る。例えば核酸のデオキシリボースリン酸塩主鎖は、
ペプチド核酸を生成するよう修飾され得る（例えばHyrupら, 1996. Bioorg Med
Chem 4, 5-23参照）。本明細書中で用いる場合、「ペプチド核酸」または「ＰＮ
Ａ」という用語は、デオキシリボースリン酸塩主鎖が擬ペプチド主鎖により置換
され、４つの天然核塩基だけが保持される核酸類似体（例えばＤＮＡ類似体）を
指す。ＰＮＡの中性主鎖は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡとの特
異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマ
ーの合成は、Hyrupら, 1996、上記; Perry-O'Keefeら, 1996. Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 93, 14670-14675に記載されているような標準固相ペプチド合成プロ
トコルを用いて実施され得る。 【０２４６】 幹細胞成長因子様物のＰＮＡは、治療的および診断的用途に用いられ得る。例
えばＰＮＡは、例えば転写または翻訳停止を誘導するか、または複製を抑制する
ことにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原剤と
して用いられ得る。幹細胞成長因子様物のＰＮＡは、他の酵素、例えばＳ１ヌク
レアーゼと組合せて用いられる場合の人工制限酵素として（Hyrupら, 1996、上
記参照）、あるいはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブ
またはプライマーとして（Hyrupら, 1996、上記；Perry-O'Keefeら, 1996、上記
参照）、例えば遺伝子中の単一塩基対突然変異（例えばＰＮＡ特異的ＰＣＲクラ
ンピング）の分析にも用いられ得る。 【０２４７】 別の実施形態では、幹細胞成長因子様のＰＮＡは、例えば親油性またはその他
のヘルパー基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によ
り、あるいはリポソームまたは当該技術分野で既知の薬剤送達のその他の技法に
より、それらの安定性または細胞取込みを増強するために修飾され得る。例えば
ＰＮＡおよびＤＮＡの有益な特性を併有し得る幹細胞成長因子様物のＰＮＡ−Ｄ
ＮＡキメラが生成され得る。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えばＲＮ
アーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）をＤＮＡ部分と相互作用させ、一方、ＰＮ
Ａ部分は高結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基
スタッキング、核塩基間の結合数、ならびに配向に関して選択される適切な長さ
のリンカーを用いて連結され得る（Hyrupら, 1996、上記参照）。ＰＮＡ−ＤＮ
Ａキメラの合成は、Hyrupら, 1996（上記）およびFinn,ら, 1996. Nucl Acids R
es 24, 3357-3363に記載されたように実施され得る。例えばＤＮＡ鎖は、標準ホ
スホルアミダイトカップリングケミストリーを用いて固形支持体上で合成され、
そして修飾ヌクレオシド類縁体、例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ
−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトは、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端
との間で用いられ得る（例えばMag,ら, 1989. Nucl Acid Res 17, 5973-5988参
照）。次にＰＮＡモノマーが段階的に結合されて、５’ＰＮＡセグメントと３’
ＤＮＡセグメントを用いてキメラ分子を生成する（Finn,ら, 1996、上記参照）
。あるいはキメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを
用いて合成され得る（例えばPetersen,ら, 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5,
1119-11124参照）。 【０２４８】 その他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えばインビボで
宿主細胞受容体を標的化するための）のようなその他の付属基、あるいは細胞膜
を（例えばLetsinger,ら, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6553-655
6; Lemaitre,ら, 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 648-652; 国際特許公開第
８８／０９８１０号参照）横断する輸送を促す物質、または血液−脳関門（例え
ば国際特許公開第８９／１０１３４号参照）を含み得る。さらにオリゴヌクレオ
チドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えばKrol,ら, 1988. BioTech
niques 6, 958-976参照）または挿入剤（例えばZon, 1988. Pharm. Res. 5, 539
-549参照）を用いて修飾され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは別
の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイ
ブリダイゼーション誘発性切断剤等と結合され得る。 【０２４９】 ５．４ 宿主 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むよう遺伝子操作された宿主
細胞を提供する。例えばこのような宿主細胞は、既知の形質転換、トランスフェ
クションまたは感染法を用いて宿主細胞中に導入される本発明の核酸を含有し得
る。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するよう遺伝子操作され
た宿主細胞を提供するが、この場合、このようなポリヌクレオチドは、細胞中の
ポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞と異種の調節配列と操作的に連結さ
れる。 【０２５０】 幹細胞成長因子様ＤＮＡ配列の知識は、幹細胞成長因子様ポリペプチドの発現
を可能にするかまたは増大する、他の細胞の修飾を可能にする。細胞は、細胞幹
細胞成長因子様ポリペプチドがより高レベルで発現されるよう、天然に存在する
幹細胞成長因子様プロモーターの全体または一部分を異種プロモーターの全部ま
たは一部と置き換えることにより、幹細胞成長因子様ポリペプチド発現増大を提
供するよう（例えば相同組換えにより）修飾され得る。異種プロモーターは、そ
れが幹細胞成長因子様コード配列と操作的に連結されるような方法で、挿入され
る（例えば国際特許公開第９４／１２６５０号、国際特許公開第９２／２０８０
８号および国際特許公開第９１／０９９５５号参照）。異種プロモーターＤＮＡ
のほかに、増幅可能マーカーＤＮＡ（例えば、カルバミルホスフェートシンター
ゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼをコード
するａｄａ、ｄｈｆｒおよび多機能性ＣＡＤ遺伝子）および／またはイントロン
ＤＮＡが、異種プロモーターＤＮＡとともに挿入され得るということも意図され
る。幹細胞成長因子様コード配列に連結される場合、標準選択法によるマーカー
ＤＮＡの増幅は、細胞中での幹細胞成長因子様コード配列の同時増幅を生じる。 【０２５１】 宿主細胞は、高等真核生物宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、下等真核生物宿主
細胞、例えば酵母細胞であり得るし、あるいは宿主細胞は原核細胞、例えば細菌
細胞であり得る。宿主細胞中への組換え構築物の導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介性トランスフェクションまたは
エレクトロポレーションにより実行され得る（Davis, L.ら, Basic Methods in
Molecular Biology (1986)）。本発明のポリヌクレオチドの１つを含む宿主細胞
は、単離断片（ＯＲＦの場合）によりコードされる遺伝子産物を生成するために
慣用的方法で用いられ得るか、あるいはＥＭＦの制御下で異種タンパク質を生成
するために用いられ得る。 【０２５２】 任意の宿主／ベクター系を用いて、本発明の１つまたはそれ以上のＯＲＦを発
現し得る。これらの例としては、真核生物宿主、例えばＨｅＬａ細胞、Ｃｖ−１
細胞、ＣＯＳ細胞およびＳｆ９細胞、ならびに原核生物宿主、例えばエシェリヒ
ア・コリおよびバチルス・サブチルスが挙げられるが、これらに限定されない。
最も好ましい細胞は、特定のポリペプチドまたはタンパク質を普通は発現しない
ものか、あるいは低天然レベルでポリペプチドまたはタンパク質を発現するもの
である。成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵
母、細菌またはその他の細胞中で発現され得る。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮ
Ａ構築物由来のＲＮＡを用いて、このようなタンパク質を生成するために用いら
れ得る。原核生物および真核生物宿主で用いるための適切なクローニングおよび
発現ベクターは、Sambrook等によりMolecular Cloning: A Laboratory Manual,
Second Edition, Cold Spring Harbor New York(1989)（この記載内容は、参照
により本明細書中に援用される）に記載されている。 【０２５３】 種々の哺乳動物細胞培養系も、組換えタンパク質を発現するために用いられ得
る。哺乳動物発現系の例としては、Gluzman, Cell 23:175(1981)により記載され
たサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系、ならびに適合性ベクターを発現し得るそ
の他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系
が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、なら
びに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー
およびアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列も
含む。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期プ
ロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、必要な非
転写化遺伝子要素を提供するために用いられ得る。細菌培養中で生成される組換
えポリペプチドおよびタンパク質は、通常は細胞ペレットからの初期抽出と、そ
の後の１つまたはそれ以上の塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグ
ラフィー過程により単離される。タンパク質リフォールディング過程は、成熟タ
ンパク質の立体配置を完成させる場合に、必要に応じて用いられ得る。最後に、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製過程のために用いられ得
る。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、任意の便利な方法により、例
えば凍結解凍サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用により破
壊され得る。 【０２５４】 多数の種類の細胞が、タンパク質の発現のための適切な宿主細胞として作用し
得る。哺乳動物宿主細胞としては、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣ
ｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、その他の形質転換した霊長類細
胞系、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養由来細胞株、一次外植片、Ｈ
ｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャ
ーカット細胞が挙げられる。 【０２５５】 あるいは、下等真核生物、例えば酵母中で、または原核生物、例えば細菌中で
タンパク質を生成することも可能である。考え得る適切な酵母菌株としては、サ
ッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・
ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)株、カ
ンジダ属(Candida)、または異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株が挙げら
れる。考え得る適切な細菌株としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)
、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)、サルモネラ・チフィムリウム(Sa
lmonella typhimurium)、または異種タンパク質を発現し得る任意の細菌株が挙
げられる。タンパク質が酵母または細菌中で作られる場合、機能的タンパク質を
得るためには、例えば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により、その中
で生成されるタンパク質を修飾する必要がある。このような共有結合は、既知の
化学的または酵素的方法を用いて成し遂げられ得る。 【０２５６】 本発明の別の実施形態では、細胞および組織は、誘導性調節要素の制御下で本
発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するよう操作され得るが、こ
の場合、内因性遺伝子の調節配列は、相同組換えにより置換され得る。本明細書
中に記載するように、遺伝子ターゲティングは、異なる遺伝子から単離された調
節配列、または遺伝子操作法により合成される新規の調節配列で、遺伝子の既存
の調節領域を置き換えるために用いられ得る。このような調節配列は、プロモー
ター、エンハンサー、スカフォールド結合領域、陰性調節要素、転写開始部位お
よび調節タンパク質結合部位または上記の配列の組合せで構成され得る。あるい
は、生成されるＲＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響を及ぼす配列
は、置換されるか、除去されるか、付加されるか、あるいはそうでなければター
ゲティングにより修飾され得るが、その例としては、タンパク質の輸送または分
泌特性を増強または修飾するためのポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定性要
素、スプライス部位、リーダー配列、あるいはタンパク質またはＲＮＡ分子の機
能または安定性を変更または改良するその他の配列が挙げられる。 【０２５７】 ターゲティング事象は、調節配列の単純な挿入、新規の調節配列の制御下での
遺伝子の配置、例えば新規のプロモーターまたはエンハンサー、あるいは両上流
の遺伝子の挿入であり得る。あるいはターゲティング事象は、調節要素の単純な
欠失、例えば組織特異的陰性調節要素の欠失であり得る。あるいはターゲティン
グ事象は既存の要素を置き換える、例えば組織特異的エンハンサーは、天然に存
在する要素より広範なまたは異なる細胞型特異性を有するエンハンサーにより置
換され得る。ここで、天然に存在する配列は欠失され、新規の配列が付加される
。すべての場合に、ターゲティング事象の同定は、ターゲティングＤＮＡと連続
する１つまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子の使用により促され、宿主細胞ゲ
ノム中に外因性ＤＮＡが組込まれた細胞の選択を可能にし得る。ターゲティング
事象の同定は、陰性選択マーカーが外因性ＤＮＡに連結されるよう、陰性選択の
特性を示す１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子の使用によっても促され得るが
、しかし陰性選択マーカーがターゲティング配列に隣接するように、また宿主細
胞ゲノム中の配列を有する正しい相同組換え事象が陰性選択マーカーの安定組込
みを生じないように、形造される。この目的のために有用なマーカーとしては、
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子または細菌キサンチン−
グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。 【０２５８】 本発明のこの態様にしたがって用いられ得る遺伝子ターゲティングまたは遺伝
子活性化技法は、米国特許第５，２７２，０７１号（Chappel）、米国特許第５
，５７８，４６１号（Sherwin等）、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２
７（国際特許公開第９３／０９２２２号）（Selden等）および国際特許出願ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９０／０６４３６（国際特許公開第９１／０６６６７号）（Skoultchi
等）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に援用される）にさらに特定
的に記載されている。 【０２５９】 ５．５ 本発明のポリペプチド 本発明の単離されたポリペプチドとしては、配列番号１０、１３〜２４、３２
または３４として記述されるアミノ酸配列、あるいは配列番号１〜９、１１、１
２、３１または３３のヌクレオチド配列のいずれかによりコードされるアミノ酸
配列、あるいは対応する全長または成熟タンパク質を含むポリヌクレオチドが挙
げられるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドとしては、好ましく
は、（ａ）配列番号１〜９、１１、１２、３１または３３に記述されるヌクレオ
チド配列のいずれかを有するポリヌクレオチド、あるいは（ｂ）配列番号１０、
１３〜２４、３２または３４として記述されるアミノ酸配列をコードするポリヌ
クレオチド、あるいは（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
で（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌ
クレオチドによりコードされる生物学的または免疫学的活性を有するポリペプチ
ドも挙げられる。本発明は、配列番号１０、１３〜２４、３２または３４として
記述されるポリペプチドアミノ酸配列、あるいは対応する全長または成熟タンパ
ク質のいずれかの生物活性または免疫学的活性変異体、ならびに生物活性を保持
するそれらの「実質的等価物(substantial equivalents)」（例えば、少なくと
も約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、
少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、典型的には少なくとも約９５％、９６％、９
７％、さらに典型的には少なくとも約９８％、または最も典型的には少なくとも
約９９％のアミノ酸同一性を有する）も提供する。対立遺伝子変異体によりコー
ドされるポリペプチドは、配列番号１０、１３〜２４、３２または３４を含むポ
リペプチドと比較して、同様の活性、増大された活性または低減された活性を有
し得る。 【０２６０】 本発明のタンパク質組成物は、許容可能な担体、例えば親水性の、例えば薬学
的に許容可能な担体をさらに含み得る。 【０２６１】 本発明は、適切な培地中で本発明の宿主細胞の培養を増殖し、そして細胞また
は細胞が増殖される培地からタンパク質を精製することを含むポリペプチドの製
造方法にも関する。例えば本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドを含む適
切な発現ベクターを含む宿主細胞がコードポリペプチドの発現を可能にする条件
下で培養されるポリペプチドの生産方法を含む。ポリペプチドは、培養液から、
便宜的には培地から、または宿主細胞から調製される溶解物から回収され、そし
てさらに精製され得る。好ましい実施形態は、このような方法により生成される
タンパク質が全長または成熟形態のタンパク質であるものを含む。 【０２６２】 本発明はさらに、本発明の核酸断片により、または本発明の核酸断片の縮重変
異体によりコードされる単離されたポリペプチドを提供する。「縮重変異体(deg
enerate variant)」とは、ヌクレオチド配列が本発明の核酸断片と異なるが、し
かし遺伝コードの縮重のために、同一ポリペプチド配列をコードする、意図され
たヌクレオチド断片である。本発明の好ましい核酸断片は、タンパク質をコード
するＯＲＦである。当該技術分野で既知の種々の方法論が、本発明の単離された
ポリペプチドまたはタンパク質のいずれかを生成するために利用され得る。最も
簡単なレベルでは、アミノ酸配列は市販のペプチド合成機を用いて合成され得る
。この技法は、小ペプチドおよび大型ポリペプチドの断片を製造するのに特に有
用である。断片は、例えば自然ポリペプチドに対する抗体を生成するのに有用で
ある。代替的方法では、ポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたは
タンパク質を天然に産生する細菌細胞から精製される。当業者は、本発明の単離
されたポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを生成するために、ポリペプ
チドおよびタンパク質を単離するための既知の方法に容易に従い得る。これらの
例としては、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラ
フィーが挙げられるが、これらに限定されない（例えばScopes, Protein Purifi
cation: Principles and Practice, Springer-Verlag (1994); Sambrook,ら, in
Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausubel,ら, Current Protocols i
n Molecular Biology参照）。生物学的／免疫学的活性を保持するポリペプチド
断片としては、約１００より大きいアミノ酸、または２００より大きいアミノ酸
をコードする断片、および特定のタンパク質ドメインをコードする断片が挙げら
れる。 【０２６３】 本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、代替的には、所望のポリペプチド
またはタンパク質を発現するよう変更された細胞から精製され得る。本明細書中
で用いる場合、それが通常では産生しないかまたは細胞が通常では低レベルで産
生するポリペプチドまたはタンパク質を産生するよう、遺伝子操作により細胞が
作製される場合、細胞は、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するよう
変更されるといわれる。本発明のポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを
産生する細胞を生成するために、真核細胞または原核細胞中に組換えまたは合成
配列を導入し、発現させるための手法を、当業者は容易に適応させ得る。 【０２６４】 本発明のタンパク質は、トランスジェニック動物の生成物として、例えばタン
パク質をコードするヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞を特徴とする
トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳の構成成分としても発現
され得る。 【０２６５】 タンパク質は、既知の慣用的化学合成によっても製造され得る。合成手段によ
り本発明のタンパク質を構築する方法は、当業者には既知である。合成的構築タ
ンパク質配列は、タンパク質と一次、二次または三次構造および／または立位配
座特徴を共有することによって、それと共通した生物学的特性、例えばタンパク
質活性を保有し得る。したがってそれらは、治療用化合物のスクリーニングにお
ける、ならびに抗体の開発のための免疫学的方法における天然精製タンパク質の
ための生物学的に活性なまたは免疫学的な代用物として用いられ得る。 【０２６６】 本明細書中で提供されるタンパク質としては、精製タンパク質と同様のアミノ
酸配列を特徴とするが、アミノ酸配列への修飾が目然に提供されるかまたは故意
に操作されるタンパク質も挙げられる。例えばペプチドまたはＤＮＡ配列におけ
る修飾は、既知の技法を用いて当業者により成され得る。タンパク質配列中の当
該修飾としては、コード配列中の選定アミノ酸残基の変更、置換、取替え、挿入
または欠失が挙げられる。例えば分子の立位配座を変更するために、１つまたは
それ以上のシステイン残基を欠失させるかまたは別のアミノ酸と取り替えられ得
る。このような変更、置換、取替え、挿入または欠失のための技法は、当業者に
は既知である（例えば米国特許第４，５１８，５８４号参照）。好ましくは、こ
のような変更、置換、取替え、挿入または欠失は、タンパク質の所望の活性を保
持する。タンパク質機能のために重要であるタンパク質の領域は、当該技術分野
で既知の種々の方法により、例えば単一または一連のアミノ酸をアラニンで系統
的に置換し、その後結果的に生じたアラニン含有変異体を生物学的活性に関して
試験することを含むアラニン走査法により確定され得る。この種類の分析は、生
物学的活性における置換アミノ酸の重要性を確定する。 【０２６７】 全体的にまたは部分的にタンパク質活性を保持すると予測され、またスクリー
ニングまたはその他の免疫学的方法論に有用であるタンパク質の配列のその他の
断片および誘導体は、本明細書中の開示が示されれば、当業者により容易に作製
され得る。このような修飾は、本発明に含まれる。 【０２６８】 本タンパク質は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを、１つまたはそれ以
上の昆虫発現ベクター中で適切な制御配列に操作可能に連結すること、および昆
虫発現系を用いることによっても生産され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発
現系のための材料および方法は、キット形態で、例えばinvitrogen, San Diego,
Calif., U.S.A. （ＭａｘＢａｔ（登録商標）キット）から市販されており、こ
のような方法は、Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station
Bulletin No.1555 (1987)（この記載内容は、参照により本明細書中に援用され
る）に記載されているように、当該技術分野で既知である。本明細書中で用いる
場合、本発明のポリヌクレオチドを発現し得る昆虫細胞は、「形質転換(transfo
rm)」される。 【０２６９】 本発明のタンパク質は、組換えタンパク質を発現するのに適した培養条件下で
形質転換した宿主細胞を培養することにより調製され得る。次にその結果生じる
発現タンパク質は、既知の精製方法、例えばゲル濾過およびイオン交換クロマト
グラフィーを用いて、このような培養（例えば培地または細胞抽出物）から精製
され得る。タンパク質の精製には、タンパク質と結合する物質を含有するアフィ
ニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ｈｅｐａｒｉｎ−ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ（登録商標）またはＣｉｂａｃｒｏｍ ｂｌｕｅ３ＧＡＳｅｐｈａｒｏ
ｓｅ（登録商標）のようなアフィニティー樹脂上での１つまたはそれ以上のカラ
ム工程、フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのような樹
脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１つまたはそれ以上の工程
、あるいはイムノアフィニティークロマトグラフィーも含み得る。 【０２７０】 あるいは本発明のタンパク質は、精製を促す形態でも発現され得る。例えば本
発明のタンパク質は融合タンパク質として、例えばマルトース結合タンパク質（
ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキ
シン（ＴＲＸ）の融合タンパク質として、あるいはＨｉｓタグとして発現され得
る。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、それぞれNe
w England BioLab(Beverly, Mass.)、Pharmacia(Piscataway, N.J.)およびinvit
rogenから市販されている。タンパク質は、エピトープを用いてタグ化され、そ
の後、このようなエピトープに対する特異的抗体を用いて精製され得る。このよ
うな一エピトープ（「ＦＬＡＧ（登録商標）」）は、KODAK(New Haven, Conn.)
から市販されている。 【０２７１】 最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地、例えばベンダントメチルまたはその他の
脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１つまたはそれ以上の逆相高速液体クロマ
トグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、タンパク質をさらに精製するために用
いられ得る。上記の精製工程のいくつかまたはすべてを、種々の組合せで用いて
も、実質的に均質な単離組換えタンパク質を提供し得る。このように精製される
タンパク質は、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含有せず、本発明により「単
離タンパク質(isolated protein)」と定義される。 【０２７２】 本発明のポリペプチドは、類縁体（変異体）を含む。類縁体は、断片、ならび
に欠失、挿入または置換された１つまたはそれ以上のアミノ酸を含むアンタゴニ
ストを含む。本発明の類縁体は、本発明のポリペプチドの融合物または本発明の
ポリペプチドの修飾物を含み、あるいは類縁体は、単数または複数の別の部分、
例えばターゲティング部分、イメージング部分または別の治療薬と融合される。
このような類縁体は、活性および／または安定性などの特性の改良を示し得る。
本発明のポリペプチドまたはその類縁体と融合され得る部分の例としては、例え
ば所望の細胞型へのポリペプチドの送達を提供するターゲティング部分が挙げら
れる。本発明のポリペプチドと融合され得るその他の部分としては、本明細書中
に記載する障害の治療のために用いられる治療薬が挙げられる。 【０２７３】 ５．５．１ ポリペプチドおよびポリヌクレオチド同一性および類似性の確定 好ましい同一性および／または類似性は、試験される配列間に最大のマッチを
与えるようデザインされる。同一性および類似性の確定方法は、コンピュータプ
ログラムで体系化され、その例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、例えば
ＧＡＰ（Devereux, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984); Geneti
cs Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI）、ＢＬＡＳＴＰ
、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＦＡＳＴＡ（Altschul, S.F.ら, J. Molec. Bi
ol. 215:403-410(1990)）、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Altschul, S.F.ら,Nucleic Ac
ids Res. Vol. 25, pp.3389-3402、この記載内容は、参照により本明細書中に援
用される）、ｅＭａｔｒｉｘソフトウェア（Wuら, J. Comp. Biol., vol.6, pp.
219-235(1999)、この記載内容は、参照により本明細書中に援用される）、ｅＭ
ｏｔｉｆソフトウェア（Nevill-Manningら, ISMB-97, vol 4, pp.202-209、この
記載内容は、参照により本明細書中に援用される）、ＧｅｎｅＡｔｌａｓソフト
ウェア（Molecular Simulations Inc.(MSI), San Diego, CA）（Sanchez and Sa
li (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 13597-13602; Kitson DHら, (2000)
“Remote homology detection using structural modeling ？ an evaluation”
Submitted; Fischer and Eisenberg (1996) Protein Sci. 5, 947-955）、Ｎｅ
ｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ ＳｉｇｎａｌＰ Ｖ１．１プログラム（Center for
Biological Sequence Analysis, The Technical University of Denmarkから）
およびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性予測アルゴリズム（J. Mol Biol, 1
57, pp.105-31(1982)、この記載内容は、参照により本明細書中に援用される）
が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴプログラムは、National C
enter for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）ならびにその他の供給元（B
LAST Manual, Altschul, S.ら NCB NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.
ら, J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)）から公的に利用可能である。 【０２７４】 ５．６ キメラおよび融合タンパク質 本発明は、幹細胞成長因子様キメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細
書中で用いる場合、幹細胞成長因子様「キメラタンパク質(chimeric protein)」
または「融合タンパク質(fusion protein)」は、異なる幹細胞成長因子様ポリペ
プチドまたは非幹細胞成長因子様ポリペプチドと作動的に連結される幹細胞成長
因子様ポリペプチドを含む。「幹細胞成長因子様ポリペプチド(stem-cell growt
h factor-like polypeptide)」とは、幹細胞成長因子様タンパク質に対応するア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを指すが、一方、「非幹細胞成長因子様ポリペ
プチド(non-stem cell growth factor-like polypeptide)」とは、幹細胞成長因
子様タンパク質と実質的に相同でないタンパク質、例えば幹細胞成長因子様タン
パク質と異なり、かつ同一のまたは異なる生物体に由来するタンパク質に対応す
るアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。幹細胞成長因子様融合タンパク質
内では、幹細胞成長因子様ポリペプチドは幹細胞成長因子様タンパク質のすべて
または一部に対応し得る。一実施形態では、幹細胞成長因子様融合タンパク質は
、幹細胞成長因子様タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性部分を含む。別
の実施形態では、幹細胞成長因子様融合タンパク質は、幹細胞成長因子様タンパ
ク質の少なくとも２つの生物学的活性部分を含む。さらに別の実施形態では、幹
細胞成長因子様融合タンパク質は、幹細胞成長因子様タンパク質の少なくとも３
つの生物学的活性部分を含む。融合タンパク質内では、「操作可能に連結される
(operatively-linked)」という用語は、幹細胞成長因子様ポリペプチドおよび／
または非幹細胞成長因子様ポリペプチドが互いに枠内で融合されることを示すよ
う意図される。非幹細胞成長因子様ポリペプチドは、幹細胞成長因子様ポリペプ
チドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。 【０２７５】 一実施形態では、融合タンパク質は、幹細胞成長因子様配列がＧＳＴ（グルタ
チオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合されるＧＳＴ−幹細胞成長
因子様融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換え幹細胞成長
因子様ポリペプチドの精製を促し得る。 【０２７６】 別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む
幹細胞成長因子様タンパク質である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細
胞）において、幹細胞成長因子様物の発現および／または分泌は、異種シグナル
配列の使用により増大され得る。 【０２７７】 さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質ファ
ミリーの一成員に由来する配列に幹細胞成長因子様配列が融合される幹細胞成長
因子様免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の幹細胞成長因子様免疫グ
ロブリン融合タンパク質は薬学的組成物中に組入れられて、細胞表面での幹細胞
成長因子様リガンドと幹細胞成長因子様タンパク質との間の相互作用を抑制し、
それによりインビボでの幹細胞成長因子様物媒介性シグナル伝達を抑制するため
に被験体に投与され得る。幹細胞成長因子様免疫グロブリン融合タンパク質は、
幹細胞成長因子様コグネイトリガンドの生物学的利用能に影響を及ぼすために用
いられ得る。幹細胞成長因子様リガンド／幹細胞成長因子様相互作用の抑制は、
増殖性および分化性障害の治療、ならびに細胞生存の調節（例えば促進または抑
制）のために療法的に有用であり得る。さらに、本発明の幹細胞成長因子様免疫
グロブリン融合タンパク質は、被験体において抗幹細胞成長因子様抗体を産生し
、幹細胞成長因子様リガンドを精製するための免疫原として、ならびに幹細胞成
長因子様物と幹細胞成長因子様リガンドの相互作用を抑制する分子を同定するた
めにスクリーニングアッセイにおいて用いられ得る。 【０２７８】 本発明の幹細胞成長因子様キメラまたは融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ
技法により製造され得る。例えば異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断
片は、慣用的技法にしたがって、例えば連結のための平滑末端または付着末端、
適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合の付着末端の充填、望ま
しくない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、ならびに酵素的連結
を用いることにより、フレーム内で一緒に連結される。別の実施形態では、例え
ば自動ＤＮＡ合成機を含めた慣用的技法により、融合遺伝子が合成され得る。あ
るいは、その後アニーリングされ、再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成し得
る２つの連続遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマー
を用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅が実行され得る（例えばAusubelら(eds.)Cur
rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992参照）。さら
に、すでに融合部分をコードする（例えばＧＳＴポリペプチド）多数の発現ベク
ターが市販されている。融合部分が幹細胞成長因子様タンパク質と枠内で連結さ
れるよう、幹細胞成長因子様コード核酸がこのような発現ベクター中でクローニ
ングされ得る。 【０２７９】 ５．７ 遺伝子療法 本発明遺伝子のポリヌクレオチドにおける突然変異は、コードされたタンパク
質の正常機能の損失を生じ得る。したがって本発明は、本発明のポリペプチドの
正常活性を回復するための、あるいは疾患状態を治療するための、本発明のポリ
ペプチドを含む遺伝子療法を提供する。本発明のポリペプチドをコードする機能
的遺伝子を適切な細胞へ送達することは、ベクター、特にウイルスベクター（例
えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）の使用により
エクスビボ、インシトゥまたはインビボに、あるいは物理的ＤＮＡ導入法（例え
ばリポソームまたは化学的処置）の使用によりエクスビボに実行される（例えば
Anderson, Nature, supplement to vol. 392, no.6679, pp.25-20(1998)参照）
。遺伝子療法技術のさらなる参照のためには、Friedmann, Science, 244:1275-1
281 (1989); Verma, Scientific American:68-84(1990);およびMiller, Nature,
357:455-460(1992)を参照されたい。本発明のヌクレオチドまたは本発明のポリ
ペプチドをコードする遺伝子のいずれかの導入は、染色体外基質（一過性発現）
または人工染色体（安定発現）を用いて成し遂げられ得る。このような細胞に及
ぼす所望の作用または細胞中での活性を増殖するかまたは生成するために、細胞
は、本発明のタンパク質の存在下でエクスビボで培養され得る。次に処理細胞は
、治療目的のためにインビボで導入され得る。あるいは、他のヒト疾患状態にお
いては、本発明のポリペプチドの発現の防止またはその活性の抑制は、疾患状態
の治療に有用であるということが意図される。アンチセンス療法または遺伝子療
法は、本発明のポリペプチドの発現を負に調節するよう適用され得ると意図され
る。 【０２８０】 タンパク質の発現を抑制するその他の方法としては、当該技術分野で既知の方
法による本発明の核酸、それらの相補体またはそれらの翻訳ＲＮＡ配列へのアン
チセンス分子の導入、標的化欠失法(targeted deletion method)を用いるような
本発明の核酸の除去、あるいは組織特異的であるサイレンサーのような陰性調節
要素の挿入が挙げられる。さらに本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチ
ドをコードする核酸とハイブリダイズするアンチセンス分子の導入により、また
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の除去により抑制され得る。 【０２８１】 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するためにインビボで遺伝
子操作される細胞を提供するが、この場合、このようなポリヌクレオチドは細胞
中でのポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞に対して異種である調節配列
と操作的に連結される。これらの方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドの発
現を増加または低減させ得る。 【０２８２】 本発明により提供されるＤＮＡ配列の知識は、内因性ポリペプチドの発現を可
能にし、増加させまたは低減させるための細胞の修飾を可能にする。細胞の全体
または一部分、細胞がより高レベルでタンパク質を発現するよう、天然に存在す
るプロモーターを異種プロモーターの全部または一部で置き換えることにより、
ポリペプチド発現増加を提供するように細胞は（例えば相同組換えにより）修飾
され得る。異種プロモーターは、それが所望のタンパク質コード配列と操作的に
連結されるような方法で挿入される（例えば国際特許公開第９４／１２６５０号
、国際特許公開第９２／２０８０８号および国際特許公開第９１／０９９５５号
参照）。異種プロモーターＤＮＡのほかに、増幅可能マーカーＤＮＡ（例えば、
カルバミルホスフェートシンターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼお
よびジヒドロオロターゼをコードするａｄａ、ｄｈｆｒおよび多機能性ＣＡＤ遺
伝子）および／またはイントロンＤＮＡが、異種プロモーターＤＮＡとともに挿
入され得る、ということも意図される。所望のタンパク質コード配列に連結され
る場合、標準選択法によるマーカーＤＮＡの増幅は、細胞中での所望のタンパク
質コード配列の同時増幅を生じる。 【０２８３】 本発明の別の実施形態では、細胞および組織は、誘導性調節要素の制御下で本
発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するよう操作され得るが、こ
の場合、内因性遺伝子の調節配列は、相同組換えにより置換され得る。本明細書
中に記載されているように、遺伝子ターゲティングは、遺伝子の既存の調節領域
を、異なる遺伝子から単離された調節配列、または遺伝子操作法により合成され
る新規の調節配列で置き換えるために用いられ得る。このような調節配列は、プ
ロモーター、エンハンサー、スカフォールド結合領域、陰性調節要素、転写開始
部位、調節タンパク質結合部位または上記の配列の組合せで構成され得る。ある
いは、生成されるＲＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響を及ぼす配
列は、置換されるか、除去されるか、付加されるか、あるいはそうでなければタ
ーゲティングにより修飾され得る。これらの配列としては、タンパク質の輸送ま
たは分泌特性を増強または修飾するためのポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安
定性要素、スプライス部位、リーダー配列、あるいはタンパク質またはＲＮＡ分
子の機能または安定性を変更または改良するその他の配列が挙げられる。 【０２８４】 ターゲティング事象は、調節配列の単純挿入、新規の調節配列の制御下での遺
伝子の配置、例えば新規のプロモーターまたはエンハンサー、あるいは両上流の
遺伝子の挿入であり得る。あるいはターゲティング事象は、調節要素の単純欠失
、例えば組織特異的陰性調節要素の欠失であり得る。あるいはターゲティング事
象は既存の要素を置き換える、例えば組織特異的エンハンサーは、天然に存在す
る要素より広範なまたは異なる細胞型特異性を有するエンハンサーにより置換さ
れ得る。ここで、天然に存在する配列は欠失され、新規の配列が付加される。す
べての場合に、ターゲティング事象の同定は、ターゲティングＤＮＡと連続する
１つまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子の使用により促され、外因性ＤＮＡが
細胞ゲノム中に組込まれた細胞の選択を可能にし得る。ターゲティング事象の同
定は、陰性選択マーカーが外因性ＤＮＡに連結されるよう、陰性選択の特性を示
す１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子の使用によっても促され得るが、しかし
陰性選択マーカーがターゲティング配列に隣接するように、かつ宿主細胞ゲノム
中の配列を有する正しい相同組換え事象が陰性選択マーカーの安定組込みを生じ
ないようにデザインされる。この目的のために有用なマーカーとしては、単純ヘ
ルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子または細菌キサンチン−グアニ
ンホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。 【０２８５】 本発明のこの態様にしたがって用いられ得る遺伝子ターゲティングまたは遺伝
子活性化技法は、米国特許第５，２７２，０７１号（Chappel）、米国特許第５
，５７８，４６１号（Sherwin等）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６
２７号（国際特許公開第９３／０９２２２号）（Selden等）および国際特許出願
第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６号（国際特許公開第９１／０６６６７号）（Sk
oultchi等）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に援用される）にさ
らに特定的に記載されている。 【０２８６】 ５．８ トランスジェニック動物 インビボで本発明のポリペプチドの生物学的機能を確定するための好ましい方
法では、本発明により提供される１つまたはそれ以上の遺伝子は、相同組換えを
用いて動物の生殖系列中で過剰発現されるかまたは不活性化される［Capecchi,
Science 244:1288-1292(1989)］。外因性または内因性プロモーター要素の調節
制御下で遺伝子が過剰発現される動物は、トランスジェニック動物として既知で
ある。内因性遺伝子が相同組換えにより不活性化された動物は、「ノックアウト
」動物と呼ばれる。ノックアウト動物、好ましくは非ヒト哺乳動物は、米国特許
第５，５５７，０３２号（この記載内容は、参照により本明細書中に援用される
）に記載されているように調製され得る。トランスジェニック動物は、生物学的
プロセス、好ましくは疾患状態において果たす本発明のポリペプチドの役割を確
定するために有用である。トランスジェニック動物は、脂質代謝を調節する化合
物を同定するためのモデル系として有用である。トランスジェニック動物、好ま
しくは非ヒト哺乳動物は、米国特許第５，４８９，７４３号および公開第９４／
２８１２２号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に援用される）に記
載されたような方法を用いて作製される。 【０２８７】 本発明のポリペプチドの発現のレベルを変更するために本発明のプロモーター
のポリヌクレオチドの全部または一部が活性化されるかまたは不活性化されるト
ランスジェニック動物が準備され得る。不活性化は、上記の相同組換え法を用い
て実行され得る。活性化は、タンパク質発現増加を提供するために同種プロモー
ターを補充するか、または取替えることにより達成され得る。同種プロモーター
は、特定組織中でのプロモーター活性化を付与することが既知である１つまたは
それ以上の異種エンハンサー要素の挿入により補充され得る。 【０２８８】 ５．９ 幹細胞成長因子様ポリペプチドの使用および生物活性 幹細胞成長因子様ポリペプチドは、ヒト精巣細胞から（Hyseqクローン識別番
号２８８０９８４および２８８１６９５）、ヒト胎児皮膚から（Hyseqクローン
識別番号１５３７５１７６）、成人脾臓から（Hyseqクローン識別番号１４８５
６０９４）、およびヒト内皮細胞から（Hyseqクローン識別番号１３８０４７５
６、１３６８７４８７、１３８０４７５６）調製されるｃＤＮＡライブラリーか
ら単離されたポリヌクレオチドに基づく。 【０２８９】 図１は、ポリヌクレオチド配列番号９およびＥＳＴ配列番号１〜７のアライメ
ントを示す。本発明の核酸配列（配列番号１〜９）は、幹細胞成長因子活性、例
えば本明細書中に記載されているような造血幹細胞成長因子活性を有するポリペ
プチドをコードすると予測される。配列番号１０のポリペプチド、その断片、少
なくとも９０％の相同性を有する配列も、幹細胞成長因子活性、例えば本明細書
中に記載されているような造血幹細胞成長因子活性を有することが予測されてい
る。 【０２９０】 配列番号１０の幹細胞成長因子様ポリペプチドは、グリコシル化されていない
約３０ｋＤａの予測分子量を有する約２７２−アミノ酸タンパク質である。ＢＬ
ＡＳＴＸアルゴリズムによるタンパク質データベース検索（Altschul S.F. ら,
J. Mol. Evol. 36:290-300(1993)およびAltschul S.F. ら, J. Mol. Biol. 21:4
03-10(1990)）（この記載内容は、参照により本明細書中に援用される）は、配
列番号１０がトロンボスポンジンＩ型ドメインおよびヒト分泌タンパク質クロー
ンｄａ２２８＿６と相同である。ｅＭＡＴＲＩＸソフトウェア（Stanford Unive
rsity, Stanford CA）によるタンパク質データベース検索はさらに、配列番号１
０の一部分が、ラミニン型ＥＧＦ様（ＬＥ）ドメイン、脊椎動物メタロチオネイ
ンドメイン、内因性オピオイド神経ペプチド前駆物質タンパク質ドメイン、膜攻
撃複合体構成成分／パーフォリンタンパク質ドメイン、ＨＭＧ−ＩおよびＨＭＧ
−Ｙ ＤＮＡ結合ドメインタンパク質（Ａｈｏｏｋ）、ＨＭＧ１／２タンパク質
ドメイン、脊椎動物メタロチオネインサインドメイン、および神経下垂体ホルモ
ンシグナチュアドメインを有することを示す。 【０２９１】 予測される約２１残基シグナルペプチドは、配列番号１０の約残基１〜残基２
１（配列番号１５）からコードされる。細胞外部分は、それ自体で有用である。
これは、哺乳動物細胞中での発現ならびに切断産物のシーケンシングにより確証
され得る。シグナルペプチド領域は、神経ネットワークシグナルＰ Ｖ１．１プ
ログラム（Nielsenら, (1997) Int. J. Neural Syst. 8, 581-599）を用いて予
測された。実際の切断部位はコンピュータープログラムにより予測されるものと
は異なり得ると当業者は認識するであろう。配列番号１６は、予測シグナルペプ
チドが配列番号１０から除去された場合に生じるペプチドである。 【０２９２】 ｅＭＡＴＲＩＸソフトウェアパッケージ（Stanford University, Stanford, C
A）（Wu ら, J. Comp. Biol., vol.6, pp.219-235(1999)）（この記載内容は、
参照により本明細書中に援用される）を用いると、配列番号１０のＳｉｇｌｅｃ
様ポリペプチドは、以下のドメインを有すると予測される（ここで、Ａ＝アラニ
ン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルア
ラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝
ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン
、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトフ
ァン、Ｙ＝チロシンである）： １００ ＡＤＣＤＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧＦＹＬＨＬ １２２（配列番
号１７）の ラミニン型ＥＧＦ様（ＬＥ）ドメインタンパク質 ９２ ＩＮＫＣＴＫＣＫＡＤＣＤＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧＦＹＬＨＬＧ
ＫＣＬＤＮＣＰＥＧＬＥＡＮＮ １３２（配列番号１８）の 脊椎動物メタロチオネインタンパク質 ３３ ＭＨＰＮＶＳＱＧＣＱＧＧＣＡＴＣＳＤＹＮ ５２（配列番号１９）の
内因性オピオイド神経ペプチド前駆物質タンパク質 １４５ ＩＶＨＣＥＶＳＥＷＮＰＷＳＰＣＴＫＫＧＫＴＣＧＦＫＲＧＴＥＴＲ
ＶＲＥＩＩＱ １８１（配列番号２０）の 膜攻撃複合体構成成分／パーフォリンタンパク質 ２１３ ＫＫＧＲＥＲＫＲＫＫ ２２２（配列番号２１）の ＨＭＧ−ＩおよびＨＭＧ−Ｙ ＤＮＡ結合ドメインタンパク質（Ａｈｏｏｋ） １９８ ＫＣＴＶＱＲＫＫＣＱＫＧＥＲＧＫＫＧＲＥＲＫＲＫＫＰＮＫＧＥＳ
ＫＥＡＩＰＤＳＫＳＬＥ ２３９（配列番号２２）の ＨＭＧ１／２タンパク質 １０４ ＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧ １１７（配列番号２３）の 脊椎動物メタロチオネインサイン １４８ ＣＥＶＳＥＷＮＰＷＳＰＣＴＫＫＧＫＴＣＧ １６７（配列番号２４
）の 神経下垂体ホルモンシグナチュア。 【０２９３】 ラミニン型ＥＧＦ様ドメインであるモチーフ１００〜１２２は、細胞成長を促
進する細胞外マトリックスの構成成分である。膜攻撃複合体構成成分／パーフォ
リンタンパク質ドメイン（１４５〜１８５）は、細胞−細胞相互作用を、したが
って細胞成長および分化を媒介するとみなされる。神経下垂体ホルモンは、それ
自体、多数のその他の因子、例えばインターロイキン−１βおよびインターロイ
キン−６により調節される。これらのモチーフの存在は、幹細胞成長因子活性に
おいて予測される。 【０２９４】 幹細胞成長因子様タンパク質および／または断片または誘導体は、幹細胞成長
因子ならびに同化成長因子および受容体と同様の活性を有する。 【０２９５】 幹細胞成長因子様活性を有する本発明のポリペプチドは、細胞増殖および形態
形成に、例えば造血幹細胞成長および／または特定の種類の造血細胞（例えばＢ
またはＴ細胞）の成長、組織特異的幹細胞成長、上皮細胞増殖および調節、卵胞
発達、神経細胞成長促進、ニューロン集団維持、軟骨リモデリング、創傷修復、
骨成長、免疫抑制、免疫応答調整、抗体および細胞媒介性免疫の調整、ならびに
血管リモデリングに有用であるが、これらに限定されない。したがって本発明の
ポリペプチドは、創傷治癒、成長および発達、軟骨成長および発達の調節、血管
リモデリング（血管形成）、免疫抑制、卵胞成長および発達ならびに神経突起成
長および発達により引き起こされるかまたはそれらに関与する障害および疾患の
予防または治療に用いられ得るが、これらに限定されない。本発明のポリペプチ
ドは、移植片または上皮移植片の製造および維持にも用いられ得る。 【０２９６】 本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、本明細書中で同定された１つ
またはそれ以上の用途または生物活性（本明細書中に引用されたアッセイに関連
するものも含む）を示すと予測される。本発明のタンパク質に関して記載された
用途または活性は、このようなタンパク質の、あるいはこのようなタンパク質を
コードするポリヌクレオチドの投与または使用により提供され得る（例えば、遺
伝子療法またはＤＮＡの導入に適したベクターにおいて）。特定の症状または病
態の基礎をなすメカニズムは、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチ
ドまたはそのモジュレーター（活性剤または阻害剤）が、治療を必要とする被験
体に有益であるか否かを指図する。したがって、「本発明の治療用組成物」とし
ては、本発明の単離されたポリヌクレオチド（例えば組換えＤＮＡ分子、クロー
ニング遺伝子およびその縮重変異体）またはポリペプチド（例えば全長タンパク
質、成熟タンパク質およびその切断またはドメイン）、あるいは標的遺伝子／タ
ンパク質発現または標的タンパク質活性のレベルで、標的遺伝子産物の全体的活
性を調節する化合物およびその他の物質が挙げられる。このようなモジュレータ
ーとしては、ポリペプチド、類縁体、（変異体）、例えば断片および融合タンパ
ク質、抗体およびその他の結合タンパク質、本発明のポリペプチドを直接的また
は間接的に活性化または抑制する化学化合物（例えば本明細書中に記載されたよ
うな薬剤スクリーニングアッセイにより同定される）、アンチセンスポリヌクレ
オチドおよび三重螺旋形成に適したポリヌクレオチド、ならびに特に本発明のポ
リペプチドの１つまたはそれ以上のエピトープを特異的に認識する抗体またはそ
の他の結合パートナー(binding partner)が挙げられる。 【０２９７】 本発明のタンパク質は、同様に、細胞活性化に、または本明細書中に記載され
たその他の生理学的経路のうちの１つに関与し得る。 【０２９８】 ５．９．１ 研究用途および実用性 本発明により提供されるポリヌクレオチドは、種々の目的のために研究共同体
により使用され得る。ポリヌクレオチドは、分析、特性化または治療的使用のた
めの組換えタンパク質を発現するために使用されうるものであり、対応するタン
パク質が（構成的に、あるいは組織分化または発達の特定の段階で、または疾患
状態で）優先的に発現される組織のためのマーカーとして、ゲル上の分子量マー
カーとして、染色体を同定するためのまたは関連遺伝子位置をマッピングするた
めの染色体マーカーまたはタグ（標識される場合）として、考え得る遺伝子障害
を同定するために患者における内因性ＤＮＡ配列を比較するために、新規の関連
ＤＮＡ配列をハイブリダイズし、それによって発見するためのプローブとして、
遺伝子フィンガープリンティング(genetic fingerprinting)のためのＰＣＲプラ
イマーを得るための情報源として、その他の新規のポリヌクレオチドを発見する
過程において既知の配列を「サブトラクトする(subtract−out)」ためのプロー
ブとして、「遺伝子チップ(gene tip)」または発現パターンの検査のためを含ん
だ、その他の支持体への取付けのためのオリゴマーを選択および作製するために
、ＤＮＡ免疫感作技法を用いて抗タンパク質抗体を増大するために、および抗Ｄ
ＮＡ抗体を増大するか、または別の免疫応答を引き出すための抗原として、使用
され得る。別のタンパク質と結合するかまたは結合する可能性のある（例えば受
容体−リガンド相互作用において）タンパク質をポリヌクレオチドがコードする
場合、ポリヌクレオチドは、結合が起こるその他のタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドを同定するために、または結合相互作用の阻害剤を同定するために
、相互作用トラップアッセイ(trap assay)（例えばGyuris ら, Cell 75:791-803
(1993)に記載されているような）にも用いられ得る。 【０２９９】 本発明により提供されるタンパク質は、生物活性を測定するためのアッセイに
おいて、例えばハイスループットスクリーニングのための多タンパク質のパネル
において、抗体を増大するか、または別の免疫応答を引き出すために、生物学的
流体(biological fluid)中のタンパク質（またはその受容体）のレベルを定量的
に測定するよう意図されたアッセイにおける試薬（例えば標識試薬）として、対
応するタンパク質が（構成的に、あるいは組織分化または発達の特定の段階で、
または疾患状態で）優先的に発現される組織のためのマーカーとして、そしても
ちろん、相補的受容体またはリガンドを単離するために、同様に用いられ得る。
タンパク質が別のタンパク質と結合するかまたは結合する可能性のある（例えば
受容体−リガンド相互作用において）場合、タンパク質は、結合が起こる別のタ
ンパク質を同定するために、または結合相互作用の阻害剤を同定するために用い
られ得る。これらの結合相互作用に関与するタンパク質は、結合相互作用のペプ
チドまたは小分子阻害剤(small molecule inhibitor)またはアゴニストに関して
スクリーニングするためにも用いられ得る。 【０３００】 本発明のポリペプチドは、幹細胞成長因子様タンパク質と特異的に免疫反応性
である抗体物質を作製するためにも有用である。本発明のポリペプチドと結合す
る抗体およびその一部（例えばＦａｂ断片）は、試料中のこのようなポリペプチ
ドの存在を同定するために用いられ得る。例えば組織試料中の配列番号１０に対
応する自然タンパク質のレベルは、軟骨細胞分化または胚状態の指標として測定
され得る。このような測定は、任意の適切なイムノアッセイフォーマットを用い
て実行され、抗体により特異的に結合される本発明の任意のポリペプチドは陽性
対照として用いられ得る。 【０３０１】 これらの研究実用性のいずれかまたは全てが、研究製品として商品化のための
試薬等級またはキットフォーマットに発展し得る。 【０３０２】 上記の用途の実施方法は、当業者には既知である。このような方法を開示する
参考文献としては、”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2d ed., Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Man
iatis eds., 1989および”Methods in Enzymology: Guide to Molecular Clonin
g Techniques”, Academic Press, Berger, S.L. and A.R.Kimmel eds., 1987が
挙げられるが、これらに限定されない。 【０３０３】 ５．９．２ 栄養学的用途 本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、栄養源またはサプリメントと
しても用いられ得る。このような用途としては、タンパク質またはアミノ酸サプ
リメントとしての使用、炭素源としての使用、窒素源としての使用、および炭水
化物の供給源としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。このような
場合、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、特定の生物体の食物に添
加され得るか、あるいは別々の固体または液体調製物として、例えば粉末、ピル
、溶液、懸濁液またはカプセルの形態で投与され得る。微生物の場合、本発明の
タンパク質またはポリヌクレオチドは、微生物がその中でまたはその上で培養さ
れる培地に添加され得る。 【０３０４】 さらに、本発明のポリペプチドは、分子量マーカーとして、および食品サプリ
メントとして用いられ得る。例えば配列番号１０からなるポリペプチドは、その
非加工および非グリコシル化状態の約３０ｋＤａの分子量を有する。タンパク質
食品サプリメントは既知であり、本発明のポリペプチドを含む適切な食品サプリ
メントの製剤は、食品調製業界の当業者のレベル内である。 【０３０５】 ５．９．３ サイトカインおよび細胞増殖／分化活性 本発明のタンパク質は、サイトカインに関する活性、細胞増殖（誘導または抑
制）または細胞分化（誘導または抑制）活性を示し得るか、あるいはある種の細
胞集団におけるその他のサイトカインの産生を誘導し得る。本発明のポリヌクレ
オチドは、このような属性を示すポリペプチドをコードし得る。今日までに発見
された多数のタンパク質因子、例えばすべての既知のサイトカインは、１つまた
はそれ以上の因子依存性細胞増殖アッセイにおいて活性を示し、それゆえアッセ
イはサイトカイン活性の確証として都合よく機能する。本発明の治療用組成物の
活性は、細胞系、例えば３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１
、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、
１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅ、ＣＭＫ、ＨＵ
ＶＥＣおよびＣａｃｏ（これらに限定されない）に関する多数のありきたりな因
子依存性細胞増殖アッセイのいずれかにより立証される。本発明の治療用組成物
は、下記に用いられ得る。 【０３０６】 Ｔ細胞または胸腺細胞増殖に関するアッセイとしては、Current Protocols in
Immunology, Ed by J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.Shevac
h, W.Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(C
hapter 3, in vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapte
r 7, Immunologic studies in Humans); Takai ら, J. Immunol. 137:3494-3500
, 1986; Bertagnolli ら, J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli ら,
Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Bertagnolli, ら, I. Immunol. 149
:3778-3783, 1992; Bowman ら, I. Immunol. 152:1756-1761, 1994に記載された
ものが挙げられるが、これらに限定されない。 【０３０７】 脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増
殖に関するアッセイとしては、Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.
M. and Shevach, E.M. In Current Protocols in Immunology. J.E. e.a. Colig
an eds. Vol 1 pp.3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto. 1994;およ
びMeasurement of mouse and human interleukin-, Schreiber, R.D. In Curren
t Protocols in Immumology. J.E. e.a. Coligan eds. Vol 1 pp.6.8.1-6.8.8,
John Wiley and Sons, Toronto. 1994に記載されたものが挙げられるが、これら
に限定されない。 【０３０８】 造血細胞およびリンパ球生成細胞の増殖および分化に関するアッセイとしては
、Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Botto
mly, K., Davis, L.S. and Lipsky, P.E. In Current Protocols in Immunology
. J.E. e.a. Coligan eds. Vol 1 pp.6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Tor
onto. 1991; deVries ら, J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991; Moreau ら, Nat
ure 336: 690-692, 1988; Greenberger ら, Proc. Natl. Aced. Sci. U.S.A. 80
:2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6-Nordan, R
. In Current Protocols in Immunology. J.E. Coligan eds. Vol 1 pp.6.6.1-6
.6.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Smith ら, Pro. Natl. Acad. Sci
. U.S.A. 83:1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11- Bennet
t, F., Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current Protocols
in Immunology. J.E. Coligan eds. Vol 1 pp.6.15.1 John Wiley and Sons, To
ronto. 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9- Ciarletta, A.
, Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K.J. In Current Protocols in Im
munology. J.E. Coligan eds. Vol 1 pp.6.13.1 John Wiley and Sons, Toronto
. 1991に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。 【０３０９】 抗原に対するＴ細胞クローン応答に関するアッセイ（増殖およびサイトカイン
産生を測定することにより、とりわけ、ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用、ならびに直接
Ｔ細胞作用に影響を及ぼすタンパク質を同定する）としては、Current Protocol
s in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M
. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Inters
cience(Chapter 3, in vitro assay for Mouse Lymphocyte Function; Chapter
6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7, Immunologic studie
s in Humans); Weinberger ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6091-6095, 19
80; Weinberger ら, Eur. J. Immun. 11:405-411, 1981; Takai ら, J. Immunol
. 137:3494-3500, 1986; Takai ら, J. Immunol. 140:508-512, 1988に記載され
たものが挙げられるが、これらに限定されない。 【０３１０】 ５．９．４ 幹細胞成長因子活性 本発明のポリペプチドは、幹細胞成長因子活性を示すこと、かつ多能性および
全能性幹細胞、例えば始原生殖細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、骨格筋幹細胞、
間葉性幹細胞、造血幹細胞および／または生殖系幹細胞の増殖、分化および生存
に関与することが示されている。インビボまたはエクスビボでの幹細胞への本発
明のポリペプチドの投与は、損傷または疾患組織の再操作、固形臓器および骨髄
移植片を含む移植、生物薬剤の製造およびバイオセンサーの開発のために有用で
ある全能性または多能性状態で細胞集団をインビボまたはエクスビボで維持およ
び増殖する。大量のヒト細胞を産生する能力は、一般にドナー体または非ヒト供
給源、パーキンソン病、アルツハイマー病およびその他の神経変性疾患のような
疾患を治療するための細胞の移植(implantation)、骨髄、皮膚、軟骨、腱、骨、
筋肉（心筋を含む）、血管、角膜、神経細胞、胃腸細胞等のような移植(graftin
g)のための組織、ならびに腎臓、肝臓、膵臓（膵島細胞を含む）、心臓および肺
のような移植(transplantation)のための器官から得られねばならないヒトタン
パク質の産生のための重要な作業用途を有する。 【０３１１】 例えば本明細書中に列挙した成長因子のいずれか、その他の幹細胞維持因子、
特に例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｆｌｔ−３リガ
ンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、インターロイキンのいずれか、ＩＬ−６に融合される組
換え可溶性ＩＬ−６受容体、マクロファージ炎症タンパク質１−α（ＭＩＰ−１
−α）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、血小板因子
４（ＰＦ−４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子および塩基性
線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含めた多数の異なる外因性成長因子および／
またはサイトカインが本発明のポリペプチドと組合せて投与されて、所望の作用
を達成し得ることが意図される。 【０３１２】 全能性幹細胞は事実上あらゆる成熟細胞型を生じ得るため、培養中でのこれら
の細胞の増殖は、多量の成熟細胞の産生を促す。幹細胞を培養するための技法は
当該技術分野で既知であり、任意にその他の成長因子および／またはサイトカイ
ンを伴う本発明のポリペプチドの投与は、幹細胞集団の生存および増殖を増強す
ると予測される。これは、培地への本発明のポリペプチドの直接投与により達成
され得る。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用
いてトランスフェクトされたストローマ細胞は、培養中またはインビボでの幹細
胞集団のための支持細胞層として用いられ得る。支持細胞層のためのストローマ
支持細胞としては、胚性骨髄線維芽細胞、骨髄ストローマ細胞、胎児肝細胞また
は培養胚性線維芽細胞が挙げられ得る（米国特許第５，６９０，９２６号参照）
。 【０３１３】 幹細胞自体は、本発明のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトさせて、
本発明のポリペプチドの自己分泌発現を誘導し得る。これは、現状のままで有用
である、あるいは次に所望の成熟細胞型に分化し得る未分化な全能性／多能性幹
細胞系の生成を可能にする。これらの安定細胞株は、ポリメラーゼ連鎖反応実験
のためのｃＤＮＡライブラリーおよび鋳型を作成するための、未分化な全能性／
多能性ｍＲＮＡの供給源としても機能し得る。これらの研究は、幹細胞増殖およ
び／または維持を調節する幹細胞集団における特徴的な発現遺伝子の単離および
同定を可能にする。 【０３１４】 全能性幹細胞集団の増殖および維持は、多数の病理的症状の治療に有用である
。例えば本発明のポリペプチドは、培養中の幹細胞を操作して、疾病、自己免疫
疾患、偶発的損傷または遺伝性障害、炎症性疾患、免疫不全、白血病および腫瘍
性骨髄性障害により損害を受けた細胞を増大させるかまたは取り替えるために用
いられ得る感覚上皮細胞を生じるために用いられ得る。本発明のポリペプチドは
、神経細胞の増殖を誘導するために、かつ神経および能組織の再生のために、す
なわち中枢および末梢神経系疾患およびニューロパシー、ならびに神経細胞また
は神経組織に対する変性、死または外傷を伴う機械的および外傷性障害の治療の
ために、有用であり得る。さらに、増殖した幹細胞集団は、遺伝子療法目的のた
めに、かつ移植片移植(grafting)または移植(transplantation)後の置換組織の
宿主拒絶を低減するために、遺伝子改変され得る。本発明のポリペプチドは、心
臓幹細胞の増殖を誘導するために、かつ心筋梗塞および動脈妨害のような心臓障
害により誘導される心臓損傷後、機能的心臓組織を再生するためにも有用であり
得る。さらに、本発明のポリペプチドは心筋細胞を強化し、心不全による心臓組
織損傷を防止および／または修復し得る（Weismann, Science, 287:1442-1446,
2001; Vogel, Science, 290:1672-1674, 2000 Kajstura ら, Nature, 410:701-7
05, 2001参照）。 【０３１５】 本発明のポリペプチドの発現および幹細胞に及ぼすその作用は、より分化され
た細胞型への幹細胞の制御分化を達成するためにも操作され得る。非分化幹細胞
集団から特異的分化細胞型の純粋集団を得る広範に適用可能な方法は、選択マー
カーを駆動する細胞型特異的プロモーターの使用を含む。選択マーカーは、望ま
しい型の細胞のみを生存させる。例えば幹細胞は、心筋細胞（Wobus ら, Differ
entiation, 48: 173-182, (1991); Klug ら, J. Clin. Invest., 98(1):216-224
, (1998)）または骨格筋細胞（Browder, L.W. In: Principles of Tissue Engin
eering eds. Lanza ら, Academic Press (1997)）に分化するよう誘導され得る
。あるいは、幹細胞の分化は、分化因子、例えばレチノイン酸、ならびに内因性
幹細胞因子活性の作用を抑制し、分化を進行させる本発明のポリペプチドのアン
タゴニストの存在下で幹細胞を培養することにより成し遂げられ得る。 【０３１６】 幹細胞のインビトロ培養は、本発明のポリペプチドが幹細胞成長因子活性を示
すか否かを確定するために用い得る。幹細胞は、種々の細胞供給源（例えば造血
幹細胞および胚性幹細胞）のいずれかから単離され、単独のまたは他の成長因子
またはサイトカインと組合せた本発明のポリペプチドの存在下で、Thompson ら
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 7844-7848(1995)に記載されたように支持
細胞層上で培養される。幹細胞増殖を誘導する本発明のポリペプチドの能力は、
例えばBernstein ら, Blood, 77:2316-2321(1991)により記載されるように、半
固体支持体上でのコロニー形成により確定される。 【０３１７】 ５．９．５ 造血調節活性 本発明のタンパク質は、造血の調節に関与し得、それゆえに骨髄性またはリン
パ系細胞障害の治療に関与し得る。コロニー形成細胞または因子依存性細胞系の
支持する周縁性生物活性でさえ、造血の調節への関与を示すものであり、例えば
単独のまたは他のサイトカインと組合せた赤血球前駆細胞の成長および増殖の支
持における関与を示し、それにより例えば種々の貧血の治療における実用性、ま
たは赤血球前駆細胞および／または赤血球系細胞の産生を刺激するための照射／
化学療法と一緒に使用するための実用性を示し；例えば結果として生じる骨髄抑
制を防止または治療するために化学療法と共同して有用である骨髄細胞、例えば
顆粒球および単球／マクロファージの成長および増殖の支持における関与（すな
わち伝統的循環可溶性因子活性）を示し；巨核球の成長及び増殖、およびその結
果としての血小板の成長および増殖を支持し、それにより血小板減少症等の種々
の血小板障害の予防または治療を可能にし、および一般的に血小板輸注の代わり
かまたはそれを補足的に使用を可能にすることへの関与を示し；および／または
上記の造血細胞のいずれかまたはすべてへの成熟が可能であり、したがって種々
の幹細胞障害（例えば移植を用いて通常は治療されるもの、例えば再生不良性貧
血および発作性夜間血色素尿症（これらに限定されない））において治療的実用
性を見出す造血幹細胞の成長および増殖の支持における、ならびに正常細胞、ま
たは遺伝子療法のために遺伝子操作されるような、インビボまたはエクスビボで
の、照射／化学療法後の幹細胞区画の再集団化（すなわち、骨髄移植と共同して
、または末梢前駆細胞移植（同種または異種）を用いて）における関与を示す。 【０３１８】 本発明の治療用組成物は、以下の記載で用いられ得る： 【０３１９】 種々の造血系列の増殖および分化のための適切なアッセイは、上記に列挙され
ている。 【０３２０】 胚性幹細胞分化に関するアッセイ（とりわけ、胚分化造血に影響を及ぼすタン
パク質を同定する）としては、Johansson ら Cellular Biology 15: 141-151, 1
995; Keller ら, Molecular and Cellular Biology 13:473-486, 1993; McClana
han ら, Blood 81:2903-2915, 1993に記載されたものが挙げられるが、これらに
限定されない。 【０３２１】 幹細胞生存および分化に関するアッセイ（とりわけ、リンパ球造血を調節する
タンパク質を同定する）としては、メチルセルロースコロニー形成アッセイ、Fr
eshney, M.G. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, ら eds. V
ol pp.265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994; Hirayama ら, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992;高増殖能力を有する始原造血コロ
ニー形成細胞(Primitive hematopoietic colony forming cells with high prol
iferative potential)、McNiece, I.K. and Briddell, R.A. In Culture of Hem
atopoietic Cells. R.I. Freshney, ら eds. Vol pp.23-39, Wiley-Liss, Inc.,
New York, N.Y. 1994; Neben ら, Experimental Hematology 22:353-359, 1994
; Cobblestone 領域形成細胞アッセイ(Cobblestone area forming cell assay)
、Ploemacher, R.E. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, ら
eds. Vol pp.1-21, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994;ストローマ細胞の
存在下での長期骨髄培養(Long term bone marrow cultures in the presence of
stromal cells)、Spooncer, E., Dexter, M. and Allen, T. In Culture of He
matopoietic Cells.R.I. Freshney, ら eds. Vol pp.163-179, Wiley-Liss, Inc
., New York, N.Y. 1994;細胞アッセイを開始する長期培養、Sutherland, H.J.
In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, ら eds. Vol pp.139-162
, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994に記載されたものが挙げられるが、
これらに限定されない。 【０３２２】 ５．９．６ 組織成長活性 本発明のタンパク質は、骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織成長また
は再生に、ならびに創傷治癒および組織修復および置換に、ならびに熱傷、切開
および潰瘍の治癒にも関与し得る。 【０３２３】 例えば、骨が普通は形成されない環境での軟骨および／または骨成長の誘導は
、ヒトおよびその他の動物における骨折および軟骨損傷または欠陥の治癒に適用
される。本発明のタンパク質、抗体、結合パートナーまたはその他の分子の組成
物は、閉鎖ならびに開放骨折低減に、また人工関節の固定改善においても予防的
用途を有し得る。骨形成剤により新たに誘導される骨形成は、先天性、外傷誘導
性、または腫瘍学的切除誘導性脳顔面頭蓋血管の修復に寄与し、美容形成外科に
おいても有用である。 【０３２４】 本発明のタンパク質は、骨形成細胞を誘引するか、骨形成細胞の成長を刺激す
るか、または骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導するのにも関与し得る。例えば
骨および／または軟骨修復の刺激による、あるいは炎症または炎症過程が介在す
る組織破壊（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性等）の過程を遮断することによる
、骨粗鬆症、変形性関節症、骨変性障害または歯周病の治療も、本発明の組成物
を用いて可能であり得る。 【０３２５】 本発明のタンパク質を含み得る組織再生活性の別のカテゴリーは、腱／靭帯形
成である。このような組織が普通は形成されない環境における腱／靭帯様組織ま
たはその他の組織形成は、ヒトおよびその他の動物における腱または靭帯断裂、
変形およびその他の腱または靭帯欠陥の治癒に適用される。腱／靭帯様組織誘導
性タンパク質を用いるこのような調製物は、腱または靭帯に対する損害の防止に
予防的用途を、ならびに骨またはその他の組織への腱または靭帯の固定改善にお
ける、および腱または靭帯組織に対する欠陥修復における用途を有し得る。本発
明の組成物により新たに誘導される腱／靭帯様組織形成は、先天性、外傷誘導性
、またはその他の起源の他の腱または靭帯欠陥の修復に寄与し、腱または靭帯の
付着または修復のための美容形成外科においても有用である。本発明の組成物は
、組織修復をインビボで実行するためのエクスビボでの回復のために、腱または
靭帯形成細胞を誘引するか、腱または靭帯形成細胞の成長を刺激するか、腱また
は靭帯形成細胞の前駆細胞の分化を誘導するか、あるいは腱／靭帯細胞または前
駆細胞の成長を誘導するための環境を提供し得る。本発明の組成物は、腱炎、手
根管症候群およびその他の腱または靭帯欠陥の治療においても有用である。本組
成物は、当該技術分野で既知であるように担体として適切なマトリックスおよび
／または金属封鎖剤も含み得る。 【０３２６】 本発明の組成物は、神経細胞の増殖のために、かつ神経および能組織の再生の
ために、すなわち中枢および末梢神経系疾患およびニューロパシー、ならびに神
経細胞または神経組織に対する変性、死または外傷を含む機械的および外傷性障
害の治療のために、有用であり得る。さらに具体的には、組成物は、末梢神経系
の疾患、例えば末梢神経損傷、末梢ニューロパシーおよび限局性ニューロパシー
、ならびに中枢神経系疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンテ
ィングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症およびシャイ−ドレーガー症候群(Shy-D
rager syndrome)の治療に用い得る。本発明に従って治療され得るさらなる症状
としては、機械的および外傷性障害、例えば脊髄障害、頭部外傷および脳血管性
疾患、例えば卒中が挙げられる。化学療法またはその他の医療に起因する末梢ニ
ューロパシーも、本発明の組成物を用いて治療可能であり得る。 【０３２７】 本発明の組成物は、非治癒創傷、例えば圧力潰瘍、血管不全に伴う潰瘍、外科
的および外傷性創傷等（これらに限定されない）のより良好なまたはより迅速な
閉合を促すためにも有用であり得る。 【０３２８】 本発明の組成物は、その他の組織、例えば臓器（例えば膵臓、肝臓、小腸、腎
臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋または心筋）および血管（例え
ば血管内皮）組織の生成または再生に、あるいはこのような組織を含む細胞の成
長を促すために関与し得る。繊維性瘢痕形成の抑制または調整は、正常組織を再
生させ得る。 【０３２９】 本発明の組成物は、消化管の防御または再生、ならびに胚または肝臓繊維症(l
iver fibrosis)、種々の組織における再灌流損傷(reperfusion injury)、および
全身性サイトカイン損傷(systemic cytokine damage)に起因する症状の治療にも
有用であり得る。 【０３３０】 本発明の組成物は、前駆物質組織または細胞からの上記の組織の分化を促進ま
たは抑制するために、あるいは上記の組織の成長を抑制するためにも有用であり
得る。 【０３３１】 本発明の治療用組成物は、以下に用いられ得る： 【０３３２】 組織生成活性に関するアッセイとしては、国際特許公開第９５／１６０３５号
（骨、軟骨、腱）、国際特許公開第９５／０５８４６号（神経、ニューロン）、
国際特許公開第９１／０７４９１号（皮膚、内皮）に記載されたものが挙げられ
るが、これらに限定されない。 【０３３３】 創傷治癒活性に関するアッセイとしては、Winter, Epidermal Wound Healing,
pps.71-112(Maibach, H.I. and Rovee, D.T., eds.), Year Book Medical Publ
ishers, Inc., Chicago, as modified by Eaglstein and Mertz, J. Invest. De
rmatol 71:382-84(1978)に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されな
い。 【０３３４】 ５．９．７ 免疫刺激または抑制活性 本発明の組成物は、免疫刺激または免疫抑制活性、例えばアッセイが本明細書
中に記載される活性（これらに限定されない）も示し得る。本発明のポリヌクレ
オチドは、このような活性に関与するポリペプチドをコードし得る。本発明のタ
ンパク質または抗体、その他の結合パートナーあるいはその他のモジュレーター
は、種々の免疫欠損症および障害（例えば重症複合免疫欠損（ＳＣＩＤ））の治
療において、例えばＴおよび／またはＢリンパ球の成長および増殖の調節（上向
きまたは下向き）、ならびにＮＫ細胞およびその他の細胞集団の細胞溶解活性の
実行において有用であり得る。これらの免疫欠損は、遺伝性であり得るか、また
はウイルス（例えばＨＩＶ）ならびに細菌または真菌感染により引き起こされ得
るか、あるいは自己免疫障害に起因し得る。特に、ウイルス、細菌、真菌により
引き起こされる感染またはその他の感染は、本発明のタンパク質、抗体、結合パ
ートナーまたはその他のモジュレーターを用いて治療可能であり、感染の例とし
ては、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、マイコバクテリア、リーシュ
マニア種、マラリア種による感染および種々の真菌感染、例えばカンジダ症、な
らびに例えば癌の治療における免疫系への追加免疫(boost)が望ましいその他の
症状が挙げられる。 【０３３５】 本発明のタンパク質を含み得る自己免疫障害としては、例えば結合組織疾患、
多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、自己免疫性肺性炎
症、ギラン・バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性真性糖尿病
、重症筋無力症、移植片対宿主病および自己免疫性炎症性眼病が挙げられる。本
発明のこのようなタンパク質は、アレルギー反応および症状、例えば喘息（特に
アレルギー性喘息）またはその他の呼吸器問題に関与し得る。 【０３３６】 本発明のタンパク質、抗体、結合パートナーまたはその他のモジュレーターを
用いて、多数の方法で、免疫応答を調整することも可能である。免疫応答は、増
強または抑制され得る。下向き調節は、すでに進行中の免疫応答を抑制または遮
断する形態であり得るか、あるいは免疫応答の誘導を防止することを含み得る。
活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞応答を抑制することにより、あるいはＴ細胞にお
ける特異的耐性を誘導することにより、またはその両方により、抑制され得る。
Ｔ細胞応答の免疫抑制は一般的に、阻害剤へのＴ細胞の連続曝露を必要とする活
性非抗原特異的過程である。Ｔ細胞における非応答性またはアネルギーを誘導す
ることを含む寛容は、一般的に抗原特異性であり、寛容化剤への曝露が終結した
後に残存する免疫抑制と区別できる。操作的には、寛容は、寛容化剤の非存在下
での特定抗原への再曝露時のＴ細胞応答の欠如により実証され得る。 【０３３７】 免疫応答の下向き調節または防止、例えば活性化Ｔ細胞による高レベルリンホ
カイン合成阻止は、組織、皮膚および器官移植の状況において、ならびに移植片
対宿主病（ＧＶＨＤ）において有用である。例えばＴ細胞機能の妨害は、組織移
植における組織破壊の低減を生じるであろう。典型的には、組織移植片において
、移植片の拒絶は、Ｔ細胞による異物としてそれを認識し、その後の移植片を破
壊する免疫反応により、開始される。免疫応答を抑制または遮断する分子（例え
ば受容体断片、結合パートナー、またはアンチセンスポリヌクレオチドのような
その他のモジュレーター）の投与は、免疫阻害剤として作用し得る。 【０３３８】 臓器移植片拒絶またはＧＶＨＤの阻止における特定の免疫応答モジュレーター
の効力は、ヒトにおける効力が予測される動物モデルを用いて評価され得る。用
いられ得る適切な系の例としては、ラットにおける同種異系心臓移植片およびマ
ウスにおける異種膵島細胞移植片が挙げられ、これらはともに、Lenschow ら, S
cience 257:789-792(1992)およびTurka ら, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11
102-11105(1992)に記載されたようなインビボでのＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク
質の免疫抑制作用を検査するために用いられた。さらに、ＧＶＨＤのネズミモデ
ル（Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp.84
6-847参照）は、その疾患の発症に及ぼすインビボでのＢリンパ球抗原機能の遮
断の影響を測定するために用いられ得る。 【０３３９】 炎症性応答の遮断は、自己免疫疾患を治療するのにも療法的に有用であり得る
。多数の自己免疫性障害は、自己組織に対して反応性であり、疾患の病理学に関
与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促すＴ細胞の不適切な活性化の結果
である。自己反応性Ｔ細胞の活性化の防止は、疾患症状を低減または排除し得る
。Ｔ細胞の同時刺激を遮断する試薬の投与は、Ｔ細胞活性化を抑制し、疾患過程
に関与し得る自己抗体またはＴ細胞由来サイトカインの産生を防止するために用
いられ得る。さらに、遮断試薬は、疾患からの長期軽減をもたらし得る自己反応
性Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘導し得る。自己免疫性障害の防止または軽減にお
ける遮断試薬の効力は、ヒト自己免疫疾患の多数の十分特性化された動物モデル
を用いて測定され得る。例としては、ネズミ実験的自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌ
ｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマト
ーデス、ネズミ自己免疫性コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットに
おける真性糖尿病、ならびにネズミ実験的重症筋無力症が挙げられる（Paul ed.
, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp.840-856参照）
。 【０３４０】 免疫応答の上向き調節も、治療において有用であり得る。免疫応答の上向き調
節は、既存の免疫応答を増強するか、または初期免疫応答を引き出す形態であり
得る。例えば免疫応答の増強は、ウイルス感染、例えばインフルエンザ、普通の
風邪および脳炎の場合に有用であり得る。 【０３４１】 あるいは、抗ウイルス免疫応答は、患者からＴ細胞を取り出し、インビトロで
Ｔ細胞を同時刺激し、患者にインビトロ活性化Ｔ細胞を再導入することにより、
感染患者において増強され得る。 【０３４２】 本発明の治療用組成物の活性は、他の手段の中でも特に、以下の方法により測
定され得る。 【０３４３】 胸腺細胞または脾臓細胞の細胞障害性に関する適切なアッセイとしては、Curr
ent Protocols in Immunology, Ed by J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margu
lies, E.M.Shevach, W.Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wile
y-Interscience(Chapter 3, invitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3
.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann ら, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann ら, J. Immunol. 128:196
8-1974, 1982; Handa ら, J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai ら, I. Im
munol. 137:3494-3500, 1986; Takai ら, J. Immunol. 140:508-512, 1988; Her
rmann ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann ら, J.
Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa ら, J. Immunol. 135:1564-1572, 1985
; Takai ら, J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bowman ら, J. Virology 61:1
992-1998; Takai ら, J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli ら, Cellu
lar Immunology 133:327-341, 1991; Brown ら, J. Immunol. 153:3079-3092, 1
994に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。 【０３４４】 Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプスイッチングに関するア
ッセイ（Ｔ細胞依存性抗体応答を調節する、およびＴｈ１／Ｔｈ２プロフィール
に影響を及ぼすタンパク質をとりわけ同定する）としては、Maliszewski, J. Im
munol. 144:3028-3033, 1990;およびAssays for B cell function: invitro ant
ibody production, Mond, J.J. and Brunswick, M. In Current Protocols in I
mmunology. J.E. e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and
Sons, Toronto. 1994に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない
。 【０３４５】 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（Ｔｈ１およびＣＴＬ応答を主に生じる
タンパク質を特に同定する）としては、Current Protocols in Immunology, Ed
by J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.Shevach, W.Strober, Pu
b. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3, invitr
o assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic
studies in Humans); Takai ら, J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai ら,
J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli ら, J. Immunol. 149:3778-378
3, 1992に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。 【０３４６】 樹状細胞依存性アッセイ（自然Ｔ細胞を活性化する樹状細胞により発現される
タンパク質を特に同定する）としては、Guery ら, J. Immunol. 134:536-544, 1
995; Inaba ら, Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991; Macat
onia ら, Journal of Immunology 154:5071-5079, 1995; Porgador ら, Journal
of Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nair ら, Journal of Virolog
y 67:4062-4069, 1993; Huang ら, Science 264:961-965, 1994; Macatonia ら,
Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj ら, Jour
nal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994;およびInaba ら, Journal o
f Experimental Medicine 172:631-640, 1990に記載されたものが挙げられるが
、これらに限定されない。 【０３４７】 リンパ球生存／アポトーシスに関するアッセイ（スーパー抗原誘導後のアポト
ーシスを防止するタンパク質、ならびにリンパ球ホメオスタシスを調節するタン
パク質を特に同定する）としては、Darzynkiewicz ら, Cytometry 13: 795-808,
1992; Gorczyca ら, Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca ら, Cancer Resear
ch 53:1945-1951, 1993; Itoh ら, Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, Journ
al of Immunology 145:4037-4045, 1990; Zamai ら, Cytometry 14:891-897, 19
93; Gorczyca ら, International Journal of Oncology 1:639-648, 1992に記載
されたものが挙げられるが、これらに限定されない。 【０３４８】 Ｔ細胞参加(commitment)および発達の初期段階に影響を及ぼすタンパク質に関
するアッセイとしては、Antica ら, Blood 84:111-117, 1994; Fine ら, Cellul
ar Immunology 155:111-122, 1994; Galy ら, Blood 85:2770-2778, 1995; Toki
ら, Proc. Nat. Acad Sci. USA 88:7548-7551, 1991に記載されたものが挙げら
れるが、これらに限定されない。 【０３４９】 ５．９．８ アクチビン／インヒビン活性 本発明のタンパク質は、アクチビンまたはインヒビン関連活性も示し得る。本
発明のポリヌクレオチドは、このような特性を示すポリペプチドをコードし得る
。インヒビンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を抑制するそれらの能力を特
徴とし、一方、アクチビンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激するそれ
らの能力を特徴とする。したがって、本発明のタンパク質は、単独でまたはイン
ヒビンファミリーの一成員を伴うヘテロ二量体で、雌哺乳動物における妊性を低
減し、雄哺乳動物における精子形成を低減するインヒビンの能力に基づいて、避
妊薬として有用であり得る。十分量のその他のインヒビンの投与は、これらの哺
乳動物における不妊性を誘導し得る。あるいは、本発明のタンパク質は、ホモ二
量体として、またはインヒビン群の他のタンパク質サブユニットを伴うヘテロ二
量体として、下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出を刺激する場合のアクチビン分
子の能力に基づいて、妊性誘導療法薬として有用であり得る（例えば米国特許第
４，７９８，８８５号参照）。本発明のタンパク質は、家畜、例えばウシ、ヒツ
ジおよびブタ（これらに限定されない）の生涯生殖性能を増大するために、性的
未熟哺乳動物における妊性の開始の促進に有用でもあり得る。 【０３５０】 本発明のタンパク質の活性は、その他の手段の中でも特に、以下の方法により
測定され得る。 【０３５１】 アクチビン／インヒビン活性に関するアッセイとしては、Vale ら, Endocrino
logy 91:562-572, 1972; Ling ら, Nature 321:779-782, 1986; Vale ら, Natur
e 321:776-779, 1986; Mason ら, Nature 318:659-663, 1985; Forage ら, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 83:3091-3095, 1986に記載されたものが挙げられるが
、これらに限定されない。 【０３５２】 ５．９．９ 走化性／ケモキネシス活性 本発明のタンパク質は、哺乳動物細胞、例えば単球、繊維芽細胞、好中球、Ｔ
細胞、マスト細胞、好酸球、上皮および／または内皮細胞に関する走化性または
ケモキネシスに関与し得る。本発明のポリヌクレオチドは、このような属性を示
すポリペプチドをコードし得る。走化性およびケモキネシス受容体活性化は、作
用の所望部位に所望の細胞集団を可動化または誘引するために用いられ得る。走
化性またはケモキネシス組成物（例えば本発明のタンパク質、抗体、結合パート
ナーまたはモジュレーター）は、創傷または組織に対するその他の外傷の治療に
おいて、ならびに限局性感染の治療において、特定の利益を提供する。例えば、
腫瘍または感染部位へのリンパ球、単球または好中球の誘引は、腫瘍または感染
作因に対する免疫応答の改善を生じ得る。 【０３５３】 タンパク質またはペプチドは、それがこのような細胞集団の指図された配向ま
たは動きを、直接または間接的に刺激し得る場合、特定の細胞集団に対する走化
性活性を有する。好ましくは、タンパク質またはペプチドは、指図された細胞の
動きを直接刺激する能力を有する。特定のタンパク質が細胞の集団に対して走化
性活性を有するか否かは、細胞走化性に関する任意の既知のアッセイにおけるこ
のようなタンパク質またはペプチドの使用により容易に確定され得る。 【０３５４】 本発明の治療用組成物は、以下において用いられ得る。 【０３５５】 走化性活性に関するアッセイ（走化性を誘導または阻止するタンパク質を同定
する）は、膜を横断する細胞の移動を誘導するタンパク質の能力、ならびに別の
細胞集団へのある細胞集団の接着を誘導するタンパク質の能力を測定するアッセ
イからなる。動きおよび接着に関する適切なアッセイとしては、Current Protoc
ols in Immunology, Ed by J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.
Shevach, W.Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Intersci
ence(Chapter6.12, Measurement of alpha and beta Chemokines 6.12.1-6.12.2
8; Taub ら J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind ら APMIS 103:140-14
6, 1995; Muller ら Eur. J. Immunol. 25:1744-1748; Gruber ら J. of Immuno
l. 152:5860-5867, 1994; Johnston ら J. of Immunol. 153:1762-1768, 1994に
記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。 【０３５６】 ５．９．１０ 止血性および血栓破壊性活性 本発明のタンパク質は、止血または血栓破壊あるいは血栓症にも関与し得る。
本発明のポリヌクレオチドは、このような属性を示すポリペプチドをコードし得
る。組成物は、種々の凝血障害（例えば血友病のような遺伝性障害）の治療に、
あるいは外傷、手術またはその他の原因に起因する創傷を治療する場合の凝血お
よびその他の止血性事象を増強するために有用である。本発明の組成物は、血栓
形成を溶解または抑制するために、およびそれに起因する症状（例えば心臓およ
び中枢神経系血管の梗塞（例えば卒中））の治療および予防のためにも有用であ
り得る。 【０３５７】 本発明の治療用組成物は、以下において用いられ得る。 【０３５８】 止血性および血栓破壊性活性に関するアッセイとしては、Linet ら, J. Clin.
Pharmacol. 26:131-140, 1986; Burdick ら, Thrombosis Res. 45:413-419, 19
87; Humphrey ら, Fibrinolysis 5:71-79(1991); Schaub, Prostaglandins 35:4
67-474, 1988に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。 【０３５９】 ５．９．１１ 癌診断および療法 本発明のポリペプチドは、癌細胞の生成、増殖または転移に関与し得る。本発
明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在または量の検出は、１つまたは
それ以上の型の癌の診断および／または予後のために有用であり得る。例えば本
発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの存在または発現増大は、癌の遺伝性危
険性、前癌症状または進行中の悪性疾患を示し得る。逆に、遺伝子における欠陥
またはポリペプチドの非存在は、癌症状に関連づけられ得る。癌に関連する単一
ヌクレオチド多型性または癌に対する疾病素質の同定も、診断または予後に有用
であり得る。 【０３６０】 癌治療は、腫瘍細胞増殖を抑制し、血管新生（腫瘍成長を支持するために必要
な新規の血管の成長）を抑制すること、および／または腫瘍細胞運動性または侵
襲性を低減することによって転移を妨げることにより、腫瘍後退を促す。本発明
の治療用組成物は、成体および小児腫瘍学において、例えば固相腫瘍／悪性疾患
、局所的進行性腫瘍、ヒト柔組織肉腫、転移性癌（例えばリンパ性転移）、血球
悪性疾患（例えば多発性骨髄腫、急性および慢性白血病）、ならびにリンパ腫、
頭部および頚部癌（例えば口腔癌、喉頭癌および甲状腺癌）、肺癌（例えば小細
胞癌および非小細胞癌）、乳癌（例えば小細胞癌および腺管癌）、消化管癌（例
えば食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌および結腸直腸新形成に関連したポリー
プ）、膵臓癌、肝臓癌、泌尿器癌（例えば膀胱癌および前立腺癌）、女性生殖路
の悪性疾患（例えば卵巣癌、子宮（子宮内膜を含む）癌および卵胞における固形
腫瘍）腎臓癌（例えば腎細胞癌）、脳癌（例えば内因性脳腫瘍、神経芽細胞腫、
星状細胞脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞侵襲）、骨癌（
例えば骨腫）、皮膚癌（例えば悪性黒色腫）、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進
行、扁平上皮癌、基底細胞癌、血管周囲細胞腫およびカポジ肉腫において有効で
あり得る。 【０３６１】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドのモジュレー
ター（例えば本発明のポリペプチドの生物学的活性の阻害剤および刺激剤）は、
癌を治療するために投与され得る。治療用組成物は、単独で、またはアジュバン
ト癌療法、例えば手術、化学療法、放射線療法、熱療法およびレーザー療法と組
合せて、治療学的有効用量で投与され、有益な作用、例えば腫瘍サイズ低減、腫
瘍成長速度の遅延、転移抑制またはそうでなければ全体的臨床症状の改善を提供
し得るが、必ずしも癌を根絶しない。 【０３６２】 組成物は、抗癌カクテル(cocktail)の一部として、治療学的有効量で投与され
得る。抗癌カクテルは、本発明のポリペプチドまたはモジュレーターと、送達の
ための薬学的に許容可能な担体のほかに、１つまたはそれ以上の抗癌薬との混合
物である。癌治療としての抗癌カクテルの使用は、慣例である。当該技術分野で
既知であり、本発明のポリペプチドまたはモジュレーターと組合せて治療として
用いられ得る抗癌薬としては、以下のものが挙げられる：アクチノマイシンＤ、
アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カル
ボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）
、シクロホスファミド、シタラビンＨＣｌ（シトシンアラビノシド）、ダカルバ
ジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ドキソルビシンＨＣｌ、エス
トラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（Ｖ１６−２１３）、フロキシウリ
ジン、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒ
ドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、
インターフェロンアルファ−２ｂ、ロイプロリドアセテート（ＬＨＲＨ−放出因
子類縁体）、ロムスチン、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）
、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート（ＭＴＸ）、マ
イトマイシン、ミトザントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロ
カルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、タモキシフェンシトレート、チオグアニ
ン、チオテパ、ビンブラスチンスルフェート、ビンクリスチンスルフェート、ア
ムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン、インターロイキン−２、マ
イトグアゾン、ペントスタチン、セムスチン、テニポシドおよびビンデシンスル
フェート。 【０３６３】 さらに、本発明の治療用組成物は、癌の予防的処置に用いられ得る。個体を癌
に罹り易くする当該技術分野で既知の遺伝的条件および／または環境的状況（例
えば発癌性物質への曝露）が存在する。これらの環境下では、治療上有効な用量
の本発明のポリペプチドでこれらの個体を治療して、癌発症の危険を低減するこ
とが有益であり得る。 【０３６４】 インビトロモデルは、有効用量の本発明のポリペプチドを考え得る癌治療とし
て確定するために用いられ得る。これらのインビトロモデルとしては、培養腫瘍
細胞の増殖アッセイ、軟質寒天中での培養腫瘍細胞の成長（Freshney, (1987) C
ulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Wiley-Liss, New Yor
k, NY Ch 18 and Ch21参照）、Giovanella ら, J. Natl. Can. Inst., 52:921-3
0(1974)に記載されているようなヌードマウスにおける腫瘍系、Pilkington ら,
Anticancer Res., 17:4107-9(1997)に記載されているようなボイデンチェンバー
アッセイ(Boyden Chamber assay)における腫瘍細胞の移動性および侵襲能力、な
らびにそれぞれRibatta ら, Intl. J. Dev. Biol., 40:1189-97(1999)およびLi
ら, Clin. Exp. Metastasis, 17:423-9(1999)に記載されているような血管新成
アッセイ、例えばニワトリ漿尿膜の血管新生の誘導または血管内皮細胞移動の誘
導が挙げられる。適切な腫瘍細胞系は、例えばAmerican Type Tissue Culture C
ollectionのカタログから入手可能である。 【０３６５】 ５．９．１２ 受容体／リガンド活性 本発明のタンパク質は、受容体、受容体リガンドまたは阻害剤あるいは受容体
／リガンド相互作用のアゴニストとしての活性も実証し得る。本発明のポリヌク
レオチドは、このような特徴を示すポリペプチドをコードし得る。このような受
容体およびリガンドの例としては、サイトカイン受容体およびそれらのリガンド
、受容体キナーゼおよびそれらのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそれら
のリガンド、細胞−細胞相互作用に関与する受容体およびそれらのリガンド（細
胞接着分子（例えばセレクチン、インテグリンおよびそれらのリガンド）を含み
、これらに限定されない）、ならびに抗原提示、抗原認識、および細胞および体
液性免疫応答の発現に関与する受容体／リガンド対が挙げられるが、これらに限
定されない。受容体およびリガンドは、関連受容体／リガンド相互作用の考え得
るペプチドまたは低分子阻害剤のスクリーニングにも有用である。本発明のタン
パク質（例えば受容体およびリガンドの断片（これらに限定されない））は、そ
れ自体が受容体／リガンド相互作用の阻害剤として有用であり得る。 【０３６６】 本発明のタンパク質の活性は、他の手段の中でも特に、以下の方法により測定
され得る。 【０３６７】 受容体−リガンド活性に関する適切なアッセイとしては、Current Protocols
in Immunology, Ed by J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.Shev
ach, W.Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience
(Chapter 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions
7.28.1-7.28.22); Takai ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6864-6868, 1987
; Bierer ら, J. Exp. Med. 168:1145-1156, 1988; Rosenstein ら, J. Exp. Me
d. 169:149-160 1989; Stoltenborg ら, J. Immunol. Methods 175:59-68, 1994
; Stitt ら, Cell 80:661-670, 1995に記載されたものが挙げられるが、これら
に限定されない。 【０３６８】 例として、本発明のポリペプチドはリガンドに対する受容体として用いられ、
それによりそのリガンドの生物学的活性を伝達し得る。リガンドは、結合アッセ
イ、アフィニティークロマトグラフィー、２ハイブリッドスクリーニングアッセ
イ、ＢＩＡコアアッセイ、ゲルオーバレイアッセイ(gel overlay assay)または
当該技術分野で既知のその他の方法により同定され得る。 【０３６９】 アゴニストまたはアンタゴニストあるいは部分的アゴニストまたは部分的アン
タゴニストとして薬剤またはタンパク質を特性化する研究は、競合するリガンド
として他のタンパク質の使用を要する。本発明のポリペプチドまたはそれらのリ
ガンドは、従来の方法により放射性同位元素、比色分子または毒素分子に結合さ
れることにより標識され得る（”Guide to Protein Purification” Murray P.
Deutscher(ed) Methods in Enzymology Vol. 182(1990) Academic Press, Inc.
San Diego）。放射性同位元素の例としては、三重水素および炭素−１４が挙げ
られるが、これらに限定されない。比色分子の例としては、蛍光分子、例えばフ
ルオレサミンまたはローダミンまたはその他の比色分子が挙げられるが、これら
に限定されない。毒素の例としては、リシンが挙げられるが、これに限定されな
い。 【０３７０】 ５．９．１３ 薬剤スクリーニング 本発明は、種々の薬剤スクリーニング技術のいずれかにおいて、新規のポリペ
プチドまたはその結合断片を用いることにより化学化合物をスクリーニングする
のに特に有用である。このような試験に用いられるポリペプチドまたは断片は、
溶液中に遊離するか、固体支持体に添付されるか、細胞表面に載せられるかまた
は細胞内に置かれ得る。薬剤スクリーニングの一方法は、ポリペプチドまたは断
片を発現する組換え核酸で安定的に形質転換される真核生物または原核生物宿主
細胞を利用する。薬剤は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞
に対してスクリーニングされる。このような細胞は、生存可能または固定形態で
、標準結合アッセイのために用いられ得る。例えば本発明のポリペプチドまたは
断片と試験される物質との間の複合体の形成を測定するか、または新規のポリペ
プチドと適切な細胞系との間の複合体形成の減少を検査し得るが、これは当該技
術分野で既知である。 【０３７１】 本発明のポリペプチドの活性を結合するかまたは調節する（すなわち増大また
は低減する）能力に関してスクリーニングされ得る試験化合物に対する供給源と
しては、（１）無機および有機化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー
、ならびに（３）無作為または類似ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分
子で構成されるコンビナトリアルライブラリー(combinatorial library)が挙げ
られる。 【０３７２】 化学ライブラリーは容易に合成され得るか、あるいは多数の商業的供給源から
購入され、既知の化合物、あるいは天然産物スクリーニングにより「ヒット(hit
s)」または「リード(leads)」と同定される化合物の構造的類縁体を含み得る。 【０３７３】 天然物ライブラリーの供給源は、微生物（例えば細菌および真菌）、動物、植
物またはその他の植生、あるいは海洋生物であり、スクリーニングのための混合
物のライブラリーは、（１）土壌、植物または海洋微生物からのブロスの発酵お
よび抽出、あるいは（２）生物自体の抽出により作製され得る。天然物ライブラ
リーとしては、ポリケチド、非リボソームペプチドおよびそれらの（非天然）変
異体が挙げられる。参考として、Science 282:63-68(1998)を参照されたい。 【０３７４】 コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまた
は有機化合物で構成され、伝統的自動合成法、ＰＣＲ、クローニングまたは有標
合成方法により容易に調製され得る。特に興味深いのは、ペプチドおよびオリゴ
ヌクレオチドコンビナトリアルライブラリーである。さらにその他の当該ライブ
ラリーとしては、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体、多重並行合成コレク
ション、再コンビナトリアルおよびポリペプチドライブラリーが挙げられる。コ
ンビナトリアルケミストリーおよびそれから作製されたライブラリーの参考とし
て、Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 8:701-707(1997)を参照されたい。ペプチ
ド類似体ライブラリーの参考および例に関しては、Al-Obeidi ら, Mol. Biotech
nol, 9(3):205-23(1998); Hruby ら, Curr Opin Chem Biol, 1(1):114-19(1997)
; Dorner ら, Bioorg Med Chem, 4(5):709-15(1996)（アルキル化ジペプチド）
を参照されたい。 【０３７５】 本明細書中に記載された種々のライブラリーの使用によるモジュレーターの同
定は、本発明のポリペプチドを結合する「ヒット」の能力を最適化する候補「ヒ
ット」（または「リード」）の修飾を可能にする。結合アッセイにおいて同定さ
れた分子は次に、当該技術分野で既知のインビボ組織培養または動物モデル中の
アンタゴニストまたはアゴニスト活性に関して試験される。要するに、分子は複
数の細胞培養または動物に滴定され、次に細胞／動物死または動物／細胞の長期
生存に関して試験される。 【０３７６】 このように同定された結合分子は、毒素、例えばリシンまたはコレラと、ある
いは放射性同位元素のような細胞に対して毒性であるその他の化合物と複合され
得る。毒素結合分子複合体は次に、本発明のポリペプチドに対する結合分子の特
異性により、腫瘍または他の細胞に対して標的化される。あるいは結合分子は、
ターゲティングおよびイメージング目的のためにイメージング剤と複合され得る
。 【０３７７】 ５．９．１４ 受容体活性に関するアッセイ 本発明は、ポリペプチド、例えばリガンドまたは受容体の特異的結合を検出す
るための方法も提供する。当該技術分野は、本発明の受容体ポリペプチドに関し
て従来未知の結合パートナーを同定するために特に有用である多数のアッセイを
提供する。例えば、哺乳動物または細菌細胞を用いる発現クローニング、あるい
は２ハイブリッドスクリーニングアッセイは、結合パートナーをコードするポリ
ヌクレオチドを同定するために用いられ得る。別の例として、本発明の適切な固
定化ポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーは、本発明のポリ
ペプチドを認識および結合するポリペプチドを単離するために用いられ得る。本
発明のポリペプチドの生物活性を調節する（すなわち増大または低減する）化合
物および特に小分子の同定のために用いられる多数の異なるライブラリーが存在
する。本発明の受容体ポリペプチドに対するリガンドは、本発明の受容体の発現
以外は遺伝的に同一である２つの細胞集団に外因性リガンドまたはリガンドのカ
クテルを添加することによっても同定され得る。一細胞集団は本発明の受容体を
発現し、他方は発現しない。リガンドの添加に対する２つの細胞集団の応答が次
に比較される。あるいは、発現ライブラリーは、細胞中で本発明のポリペプチド
と同時発現され、考え得るリガンドを同定するためにオートクリン応答(autocri
ne response)に関してアッセイされ得る。さらに別の例として、ＢＩＡコアアッ
セイ、ゲルオーバーレイアッセイまたは当該技術分野で既知のその他の方法は、
結合パートナーポリペプチド、例えば（１）有機および無機化学ライブラリー、
（２）天然産物ライブラリー、ならびに（３）無作為ペプチド、オリゴヌクレオ
チドまたは有機分子で構成されるコンビナトリアルライブラリーを同定するため
に用いられ得る。 【０３７８】 本発明のポリペプチドのシグナル伝達カスケードにおける下流細胞内シグナリ
ング分子の役割が確定され得る。例えば、本発明のポリペプチドの細胞質ドメイ
ンが、そのリガンドが同定されているタンパク質の細胞外部分と融合されるキメ
ラタンパク質は、宿主細胞中で産生される。次に細胞は、キメラタンパク質の細
胞外部分に特異的なリガンドとともにインキュベートされ、それによりキメラ受
容体を活性化する。次に細胞内シグナリングに関与する既知の下流タンパク質は
、予測される修飾、すなわちリン酸化に関してアッセイされ得る。受容体活性に
関与するシグナリング分子を同定するために、当業者に既知のその他の方法も用
いられ得る。 【０３７９】 ５．９．１５ 抗炎症活性 本発明の組成物は、抗炎症活性も示し得る。抗炎症活性は、炎症応答に関与す
る細胞に刺激を提供することにより、細胞−細胞相互作用（例えば細胞接着）を
抑制または促進することにより、炎症過程に関与する細胞の走化性を抑制または
促進することにより、細胞溢出を抑制または促進することにより、あるいは炎症
応答をより直接的に抑制または促進するその他の因子の産生を刺激または抑制す
ることにより、達成され得る。このような活性を有する組成物を用いて、炎症症
状、例えば慢性または急性症状を治療し得る。症状の例としては、感染に関連し
た暗示（例えば敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲ
Ｓ））、虚血−再灌流損傷、内毒素致死、関節炎、補体媒介性過急性拒絶、腎炎
、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病、あ
るいはＴＮＦまたはＩＬ−１のようなサイトカインの過剰産生に起因する疾患が
挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、抗原性物質または材
料に対するアナフィラキシーおよび過敏症を治療するためにも有用であり得る。
本発明の組成物は、例えば以下のような障害の予防および／または治療のための
方法の一部として症状を予防または治療するために利用され得るが、これらに限
定されない。敗血症、急性膵炎、内毒素ショック、サイトカイン誘導性ショック
、慢性関節リウマチ、慢性炎症性関節炎、１型真性糖尿病からの膵臓細胞損害、
移植片対宿主病、炎症性腸疾患、肺疾患に伴う炎症、その他の自己免疫疾患また
は炎症性疾患、例えば急性または慢性骨髄性白血病のための、あるいは子宮内感
染から派生する早産の防止における抗増殖性物質。 【０３８０】 ５．９．１６ 白血病 白血病および関連障害は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプ
チドの機能を促進または抑制する治療薬の投与により、治療または予防され得る
。このような白血病および関連障害としては、急性白血病、急性リンパ性白血病
、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、
慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病が挙げら
れるが、これらに限定されない（このような障害の再検討のためには、Fishman
ら, 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia参照）。 【０３８１】 ５．９．１７ 神経系障害 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの活性を調節する化合
物による介入の効力に関して試験され得る、および治療上の実用性の指標をこの
ような観察時に治療され得る細胞型を含めた神経系障害としては、神経系損傷、
ならびに軸索の切断、ニューロンの低減または変性、あるいは脱髄を生じる障害
が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って患者（例えばヒトおよ
び非ヒト哺乳動物患者）において治療され得る神経系病変としては、中枢（例え
ば脊髄、脳）または末梢神経系の以下の病変が挙げられるが、これらに限定され
ない。 （ｉ）外傷性病変、例えば物理的損傷により引き起こされるかまたは手術に付
随した病変、例えば神経系の一部を切断する病変、または圧縮損傷； （ｉｉ）虚血性病変、この場合、神経系の一部における酸素不足がニューロン
の損傷または死を、例えば脳梗塞または虚血、あるいは脊髄梗塞または虚血を生
じる。 （ｉｉｉ）感染性病変、この場合、神経系の一部が感染の結果として、例えば
膿瘍により、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスまたは単純ヘルペス
ウイルスによる感染に関連して、あるいはライム病、結核、梅毒に付随して、破
壊または損傷される。 （ｉｖ）変性病変、この場合、神経系の一部は、変性過程、例えばパーキンソ
ン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、または筋萎縮性側索硬化症に関
連する変性（これらに限定されない）の結果として破壊または損傷される； （ｖ）栄養性疾患または障害に関連した病変、この場合、神経系の一部は、栄
養性障害または代謝の障害、例えばビタミンＢ１２欠乏、葉酸欠乏、ウェルニッ
ケ脳症、タバコ−アルコール弱視、マルキヤファーヴァ・ビナミ病（脳梁の一次
変性）およびアルコール性小脳変性（これらに限定されない）により破壊または
損傷される； （ｖｉ）全身性疾患に関連する神経学的病変、例えば糖尿病（糖尿病性ニュー
ロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌腫またはサルコイドーシス
（これらに限定されない）； （ｖｉｉ）毒性物質、例えばアルコール、鉛または特定の神経毒により引き起
こされる病変；ならびに （ｖｉｉｉ）脱髄化病変、この場合、神経系の一部は、脱髄性疾患、例えば多
発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連ミエロパシー、横行性ミエロパシー、あ
るいは種々の病因、進行性多病巣性白質脳症および橋中央ミエリン溶解により破
壊または損傷される。 【０３８２】 神経系障害の治療のための本発明による有用な治療薬は、ニューロンの生存ま
たは分化の促進における生物学的活性に関して試験することにより選択され得る
。例えば、以下の作用のいずれかを引き出す治療薬が本発明により有用であり得
る。 （ｉ）培養中のニューロンの生存時間増大； （ｉｉ）培養中のまたはインビボでのニューロンの出芽増大； （ｉｉｉ）培養中のまたはインビボでのニューロン関連分子、例えば運動ニュ
ーロンに関するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステ
ラーゼの産生増大；あるいは （ｉｖ）インビボでのニューロン機能不全の症状低減。 【０３８３】 このような作用は、当該技術分野で既知の任意の方法により測定され得る。好
ましい非限定実施形態では、ニューロンの生存増大は、Arakawa等(1990, J. Neu
rosci. 10:3507-3515)に記述された方法により測定され、ニューロンの出芽増大
はPestronk等(1980, Exp. Neurol. 70:65-82)またはBrown等(1981, Ann. Rev. N
eurosci. 4:17-42)に記述された方法により検出され、ニューロン関連分子の産
生増大は、測定される分子によって、バイオアッセイ、酵素的アッセイ、抗体結
合、ノーザンブロットアッセイ等により測定され、運動ニューロン機能不全は、
運動ニューロン障害、例えば虚弱、運動ニューロン伝導速度または機能性不能の
物理的発現を評価することにより測定され得る。 【０３８４】 特定の実施形態では、本発明により治療され得る運動ニューロン障害としては
、運動ニューロンおよび神経系のその他の構成成分に影響を及ぼし得る梗塞、感
染、毒素への曝露、外傷、外科的損害、変性疾患または悪性疾患、ならびにニュ
ーロンに選択的に影響を及ぼす障害、例えば筋萎縮性側索硬化症、例えば進行性
脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、小児および若年性筋萎縮、
小児期の進行性球麻痺（ファチオ・ロンデ病）、ポリオおよびポリオ後症候群、
ならびに遺伝性運動感覚根性ニューロパシー（シャルコー・マリー・ツース病）
が挙げられるが、これらに限定されない。 【０３８５】 ５．９．１８ 関節炎および炎症 慢性関節リウマチに対する本発明の組成物の免疫抑制作用は、実験動物モデル
系で確定される。実験モデル系は、ラットにおけるアジュバント誘導性関節炎で
あり、プロトコルは、J. Holoshitz, ら, 1983, Science, 219:56により、また
はB. Waksman ら, 1963, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 23:129により記
載されている。疾患の誘導は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の死滅
ヒト結核菌の懸濁液を、一般に皮内に、１回注射することにより引き起こされう
る。注入経路は変わり得るが、ラットはアジュバント混合物を尾の基部に注射さ
れ得る。阻害剤は、約１〜５ｍｇ／ｋｇの用量でリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）中
で投与される。対照は、ＰＢＳのみの投与からなる。 【０３８６】 試験化合物の作用を試験するための手法は、ＣＦＡ中の死滅ヒト結核菌の皮内
注射と、その後の阻害剤の直接投与、ならびに２４日目までのその後の隔日の処
置からなる。結核菌ＣＦＡの注射後１４、１５、１８、２０、２２および２４日
目に、上記のJ. Holoskitzにより記載されたように、全体的な関節炎スコアが得
られる。データの分析は、試験化合物が、関節炎スコアの低減により測定される
ように、関節の腫脹に劇的な影響を及ぼしたことを明示した。 【０３８７】 ５．９．１９ その他の活性 本発明のタンパク質は、１つまたはそれ以上の下記のさらなる活性または作用
も示し得る。感染作因、例えば細菌、ウイルス、真菌およびその他の寄生生物（
これらに限定されない）の成長、感染または機能の抑制または殺害、身体的特徴
、例えば身長、体重、毛髪色、眼色、皮膚、脂肪対赤身比またはその他の組織色
素沈着、あるいは器官または身体部分サイズまたは形状（例えば乳房増大または
低減、骨形態または形状の変化）への作用（抑制するかまたは増強する）、バイ
オリズムまたは日周性周期またはリズムへの作用、雄または雌被験体の妊性への
作用、食餌脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補助因子
またはその他の栄養因子または構成成分の代謝、異化、同化、プロセシング、利
用、貯蔵または排除への作用、行動的特徴、例えば食欲、性欲、ストレス、認知
（認知障害を含む）、抑うつ（例えばうつ障害）、および暴挙への作用、鎮痛作
用またはその他の疼痛低減作用を提供、造血系統以は内分泌活性、酵素の場合、
酵素の欠乏の治癒、および欠乏関連疾患の治療、過増殖性障害（例えば乾癬）の
治療、免疫グロブリン様活性（例えば抗原または補体を結合する能力）、ならび
にこのようなタンパク質またはこのようなタンパク質と交差反応する別の物質ま
たは因子との反応性を高めるためにワクチン組成物中の抗原として作用する能力
。 【０３８８】 ５．９．２０ 多型性の同定 多型性の実証は、ヒト被験体におけるこのような多型性の同定、ならびに診断
および治療のためのこの情報の薬理遺伝学的使用を可能にする。このような多型
性は、例えば種々の疾患状態（例えば炎症または免疫応答を含む障害）に対する
特徴的な素因または感受性、あるいは薬剤投与に対する特徴的な応答に関連し、
この遺伝情報は、予防的または治療的処置を適切に適合させるために用いられ得
る。例えば、炎症または自己免疫疾患に対する素因に関連した多型性の存在は、
多型性の存在を同定することにより、ヒトにおけるこの症状の診断を可能にさせ
る。 【０３８９】 多型性は、すべてが一般に、患者から試料を採取し、試料からのＤＮＡを分析
することを含み、任意にＤＮＡの単離または増幅を含み、ＤＮＡ中の多型性の存
在を同定する、当該技術分野で既知の種々の方法で同定され得る。例えばＰＣＲ
は、ゲノムＤＮＡの適切な断片を増幅し、これが次にシーケンシングされ得るた
めに用いられ得る。あるいはＤＮＡは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハ
イブリダイゼーション（この場合、単一塩基ミスマッチの検出を可能にする条件
下で、適切なオリゴヌクレオチドがＤＮＡとハイブリダイズされる）に、あるい
は単一ヌクレオチド伸長アッセイ（この場合、多型性の位置のすぐ隣でハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドが1つまたはそれ以上の標識ヌクレオチドを用い
て伸長される）に付され得る。さらに、伝統的な制限断片長多型性分析（多型性
の存在または非存在によって、ゲノムＤＮＡの特徴的な消化を提供する制限酵素
を用いる）が実施され得る。本発明のヌクレオチド配列を有するアレイは、多型
性を検出するために用いられ得る。アレイは、本発明のヌクレオチド配列を検出
するために、本発明の修飾ヌクレオチド配列を含み得る。代替例では、本発明の
ヌクレオチド配列のいずれか１つが、それらの配列からの変化を検出するために
アレイ上に置かれ得る。 【０３９０】 あるいは、アミノ酸配列の変化を生じる多型性も、例えば変異体配列に特異的
な抗体により、タンパク質のアミノ酸配列の対応する変化を検出することにより
検出され得る。 【０３９１】 ５．１０ 治療方法 本発明の組成物（ポリペプチド断片、類縁体、変異体および抗体またはその他
の結合パートナー、あるいはモジュレーター、例えばアンチセンスポリヌクレオ
チドを含む）は、種々の治療方法に多数の用途を有する。治療的用途の例として
は、本明細書中に例示されたものが挙げられるが、それらに限定されない。 【０３９２】 ５．１０．１ 実施例 本発明の別の実施形態は、本発明のＩｇＳＦ成員を調節することにより調整さ
れ得る疾患または障害による影響を受けた個体への、有効量の本発明のポリペプ
チドまたは他の組成物の投与である。投与方式は特に重要でないが、非経口投与
が好ましい。投与方式の一例は、静脈内ボーラス(bolus)を送達することである
。本発明のポリペプチドまたは組成物の投与量は、普通は処方医により決定され
る。投与量は、個々の患者の年齢、体重、症状および応答によって変わると予測
される。典型的には、用量当たりで投与されるタンパク質またはその他の有効成
分の量は、約０．１〜２５ｍｇ／体重１ｋｇであり、好ましい用量は約０．１〜
１０ｍｇ／患者の体重１ｋｇである。非経口投与のためには、本発明のポリペプ
チドまたは他の有効成分は、薬学的に許容可能な非経口性伝達体を含んだ注射可
能な形態で配合される。このような伝達体は当該技術分野で既知であり、その例
としては、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ならびに少量のヒ
ト血清アルブミンからなる溶液が挙げられる。伝達体は、ポリペプチドまたはそ
の他の有効成分の等張性および安定性を維持する、より少量の添加剤を含有し得
る。このような溶液の調製物は、当該技術分野の技術内である。典型的には、サ
イトカイン阻害剤が、約１〜８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度でこのよう
な伝達体中に配合される。 【０３９３】 ５．１１ 製剤配合物および投与経路 本発明のタンパク質またはその他の組成物（あらゆる供給源からの、例えば組
換えおよび非組換え供給源からの、例えば本発明のポリペプチドの抗体およびそ
の他の結合パートナー）は、単独で、または種々の障害を治療または軽減するた
めの用量でそれが適切な担体または賦形剤と混合される薬学的組成物中で、患者
に投与され得る。このような組成物は、任意に（タンパク質またはその他の有効
成分および担体のほかに）希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤およ
び当該技術分野で既知のその他の物質を含有し得る。「薬学的に許容可能な(Pha
rmaceutically acceptable)」という用語は、有効成分の生物学的活性の効力を
妨害しない非毒性物質を意味する。担体の特徴は、投与経路に依存する。本発明
の薬学的組成物は、サイトカイン、リンホカインまたはその他の造血因子、例え
ばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−
４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−
１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦ−、
ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞
因子およびエリスロポエチンも含有し得る。さらなる組成物中では、本発明のタ
ンパク質は、骨および／または軟骨欠陥、創傷または当該組織の治療に有益なそ
の他の物質と組合せされ得る。これらの物質としては、種々の成長因子、例えば
上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子
（ＴＧＦ−およびＴＧＦ−）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ならびに本明
細書中に記載されたサイトカインが挙げられる。 【０３９４】 薬学的組成物はさらに、タンパク質またはその他の有効成分の活性を増強する
か、またはその活性を補完するか、または治療において使用するその他の物質を
含有し得る。このような付加的因子および／または物質は、本発明のタンパク質
またはその他の有効成分による相乗効果を生じるために、あるいは副作用を最小
限にするために薬学的組成物中に含まれ得る。逆に、本発明のタンパク質または
その他の有効成分は、サイトカイン、リンホカイン、その他の造血因子、血栓破
壊または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤の副作用を最小限にするために、特定の
サイトカイン、リンホカイン、その他の造血因子、血栓破壊または抗血栓因子、
あるいは抗炎症剤の製剤中に含まれ得る。本発明のタンパク質は、多量体（例え
ばへテロ二量体またはホモ二量体）中で、あるいはそれ自体または他のタンパク
質との複合体中で活性であり得る。その結果、本発明の薬学的組成物は、このよ
うな多量体または複合形態で本発明のタンパク質を含み得る。 【０３９５】 第１のタンパク質を含めた本発明の薬学的組成物中に含まれることの代替物と
して、第２のタンパク質または治療薬が、第１のタンパク質と同時に投与され得
る（例えば同一時期に、または異なる時期であるが、但し治療濃度の物質の組合
せが治療部位に到達される）。当該用途の化合物の処方および投与のための技法
は、”Remington's Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton
, PA, latest editionに見出され得る。治療的有効量はさらに、症状の改善、例
えば関連医学症状の治療、治癒、予防または改善、あるいはこのような症状の治
療、治癒、予防または改善の速度の増大を生じるのに十分な化合物の量を指す。
単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、治療的有効用量は、その成
分単独を言及する。組合せに適用される場合、治療的有効用量は、連続的である
か、同時であるかに関わらず、組合せて投与されると、治療効果を生じる有効成
分の併用量を指す。 【０３９６】 本発明の治療または使用の方法の実施に際しては、治療的有効量の本発明のタ
ンパク質またはその他の有効成分が、治療さるべき症状を有する哺乳動物に投与
される。本発明のタンパク質またはその他の有効成分は、本発明の方法にしたが
って、単独で、または他の治療、例えばサイトカイン、リンホカインまたはその
他の造血因子を用いる治療と組合せて投与され得る。１つまたはそれ以上のサイ
トカイン、リンホカインまたはその他の造血因子と同時投与される場合、本発明
のタンパク質またはその他の有効成分は、サイトカイン、リンホカイン、その他
の造血因子、血栓溶解または抗血栓因子と同時に、あるいは連続して投与され得
る。連続して投与される場合、主治医は本発明のタンパク質またはその他の有効
成分を、サイトカイン、リンホカイン、その他の造血因子、血栓溶解または抗血
栓因子と組合せて投与する適切な順序を決定する。 【０３９７】 ５．１１．１ 投与経路 適切な投与経路としては、例えば経口、直腸、経粘膜または腸投与、非経口送
達、例えば筋内、皮下、脊髄内注入、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、腹
腔内、鼻腔内または眼内注入が挙げられる。薬学的組成物中にまたは本発明の方
法を実施するために用いられる本発明のタンパク質またはその他の有効成分の投
与は、種々の慣用的方法で、例えば経口摂取、吸入、局所塗布、あるいは皮膚、
皮下、腹腔内、非経口的または静脈内注入で実行され得る。患者への静脈内投与
が好ましい。 【０３９８】 一方、例えばしばしばデポ剤または徐放性製剤中で、関節中かまたは繊維組織
中に直接的に化合物を注入することにより、全身的ではなく局所的に、化合物を
投与し得る。緑内障手術の合併症としてしばしば起こる瘢痕形成過程を防止する
ために、化合物は局所的に、例えば点眼剤として投与され得る。さらに、標的化
薬剤送達系で、例えば特異的抗体で被覆されたリポソーム中に薬剤を投与し、例
えば関節または繊維組織をターゲティングし得る。リポソームは、罹患組織に対
して標的化され、それにより選択的に取り込まれる。 【０３９９】 本発明のポリペプチドは、有効投与量を所望の作用部位に送達させる任意の経
路により投与される。特定の適応症のための適切な投与経路および有効投与量の
決定は、当該技術分野の技術のレベル内である。好ましくは創傷治療のためには
、治療用化合物をその部位に直接投与する。本発明のポリペプチドのための適切
な投与量範囲は、これらの投与量から、あるいは適切な動物モデルにおける同様
の研究から推定され得る。次に投与量は、必要な場合には、最大の治療利益を提
供するよう臨床医により調整され得る。 【０４００】 ５．１１．２ 組成物／製剤 本発明に従って用いるための薬学的組成物は、例えば、薬学的に用いられ得る
調製物中への活性化合物の加工を促す賦形剤および助剤を含む１つまたはそれ以
上の生理学的に許容可能な担体を用いて、慣用的方法で配合され得る。これらの
薬学的組成物は、それ自体既知の方法で、例えば慣用的混合、溶解、造粒、糖衣
錠作製、磨碑、乳化、封入、エントラッピングまたは凍結乾燥過程により製造さ
れ得る。適正な配合は、選定される投与経路によって決まる。治療的有効量の本
発明のタンパク質またはその他の有効成分が経口的に投与される場合、本発明の
タンパク質またはその他の有効成分は、錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリ
キシルの形態である。錠剤形態で投与される場合、本発明の薬学的組成物は、固
体担体、例えばゼラチンまたはアジュバントをさらに含有し得る。錠剤、カプセ
ルおよび粉末は、約５〜９５％の本発明のタンパク質またはその他の有効成分を
、好ましくは約２５〜９０％の本発明のタンパク質またはその他の有効成分を含
有する。液体形態で投与される場合、液体担体、例えば水、石油、動物または植
物源の油、例えば落花生油、鉱油、ダイズ油またはゴマ油、あるいは合成油が添
加され得る。液体形態の薬学的組成物は、生理食塩溶液、デキストロースまたは
その他の糖溶液、あるいはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレン
グリコールまたはポリエチレングリコールをさらに含有し得る。液体形態で投与
される場合、薬学的組成物は、約０．５〜９０重量％の本発明のタンパク質また
はその他の有効成分を、好ましくは約１〜５０％の本発明のタンパク質またはそ
の他の有効成分を含有する。 【０４０１】 治療的有効量の本発明のタンパク質またはその他の有効成分が、静脈内、皮膚
または皮下注射により投与される場合、本発明のタンパク質またはその他の有効
成分は、発熱性物質を含まない非経口的に許容可能な水性溶液の形態である。ｐ
Ｈ、等張性、安定性等を十分に考慮すれば、非経口的に許容可能なタンパク質ま
たはその他の有効成分溶液の調製は、当該技術分野の技術内である。静脈内、皮
膚または皮下注射のための好ましい薬学的組成物は、本発明のタンパク質または
その他の有効成分のほかに、等張伝達体、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガ
ー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液
、乳酸化リンガー注射液または当該技術分野で既知のその他の伝達体を含有する
必要がある。本発明の薬学的組成物は、安定剤、防腐剤、緩衝剤、酸化防止剤ま
たは当業者に既知のその他の添加剤も含有し得る。注射のためには、本発明の物
質は、水性溶液中に、好ましくは生理相溶性緩衝液、例えばハンクス溶液、リン
ガー液または生理学的食塩緩衝液中に配合され得る。経粘膜(transmucosal)投与
のためには、透過されるべきバリアに適した浸透剤が製剤中に用いられる。この
ような浸透剤は一般に当該技術分野で既知である。 【０４０２】 経口投与のためには、化合物は、活性化合物を当該技術分野で既知の薬学的に
許容可能な担体と組合せることにより、容易に処方され得る。このような担体は
、治療される患者による経口摂取のために、本発明の化合物を錠剤、丸剤、糖衣
錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー(slurries)、懸濁液等として配
合させ得る。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤中に生成され、任意
にその結果生じる混合物を粉砕し、所望により適切な助剤を添加後、顆粒の混合
物を加工し、錠剤または糖衣錠コアを得る。適切な賦形剤は、特に充填剤、例え
ば糖類（例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）、
セルロース調製物（例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプ
ン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースお
よび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））である。所望により、崩壊剤(d
isintegrating agent)、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天あるいはアルギ
ン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが添加され得る。糖衣錠コアは
、適切なコーティングを装備される。この目的のために、濃縮糖溶液が用いられ
得るが、これが任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポ
ールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液
、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。同定のために、また
は活性化合物用量の種々の組合せを特性化するために、染料または顔料が錠剤ま
たは糖衣錠コーティングに添加される。 【０４０３】 経口的に用いられる薬学的調製物は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル
(push-fit capsule)、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまた
はソルビトールから作製された軟質密封カプセルを含む。プッシュフィットカプ
セルは、充填剤、例えばラクトース、結合剤、例えばデンプン、および／または
滑剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、また任意に安定剤との混
和物中に有効成分を含有し得る。軟質カプセルでは、活性化合物は、適切な液体
中に、例えば脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶
解または懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与のための製剤
はすべて、このような投与に適した投与量であるべきである。口腔内投与のため
には、組成物は、慣用的方法で処方される錠剤またはロゼンジ剤の形態をとる。 【０４０４】 吸入による投与のためには、本発明に従って用いるための化合物は、適切な噴
射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ
テトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切なガスの使用を伴って、
加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾル噴霧提示の形態で送達されるの
が便利である。加圧エーロゾルの場合、投薬ユニットは、計測された量を送達す
るための弁を提供することにより確定され得る。吸引器または注入器中での使用
のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切
な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有して配合され
得る。化合物は、注入により、例えばボーラス注射または連続注入により、非経
口投与のために配合され得る。注入用製剤は、ユニット投薬形態で、例えばアン
プル中に、または多数回投与容器中に、さらなる防腐剤を含有して与えられる。
組成物は、油状または水性伝達体中の懸濁液、溶液または乳濁液の形態をとり、
安定剤、例えば沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤を含有し得る。 【０４０５】 非経口投与のための薬学的製剤としては、水溶性形態での活性化合物の水溶液
が挙げられる。さらに活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として調
製され得る。適切な新油性溶媒または伝達体としては、脂肪油、例えばゴマ油、
あるいは合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエートまたはトリグリセリド、
あるいはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増大す
る物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデ
キストランを含有し得る。任意に、懸濁液は適切な安定剤、または化合物の溶解
度を増大して高濃縮溶液の調製を可能にする物質も含有し得る。あるいは有効成
分は、使用前に、適切な伝達体、例えば滅菌発熱性物質無含有水を用いて構成す
るために、粉末形態であり得る。 【０４０６】 化合物は、例えば慣用的座薬基剤、例えばココアバターまたはその他のグリセ
リドを含有する直腸に影響する組成物、例えば座薬または保持浣腸中にも配合さ
れ得る。上記の製剤のほかに、化合物はデポ調製物としても配合され得る。この
ような長時間作用性の製剤は、移植（例えば皮下または筋肉内に）により、また
は筋肉内注射により投与され得る。したがって、例えば化合物は、適切な高分子
または疎水性物質（例えば許容可能な油中の乳濁液として）あるいはイオン交換
樹脂を用いて、あるいは難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として処方さ
れ得る。 【０４０７】 本発明の疎水性化合物のための薬学的担体は、ベンジルアルコール、非極性界
面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水相を含むコソルベント系(co-solvent
system)である。コソルベント系は、ＶＰＤコソルベント系であり得る。ＶＰＤ
は、無水エタノール中で体積をメークアップした３％ｗ／ｖベンジルアルコール
、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖポリ
エチレングリコール３００の溶液である。ＶＰＤコソルベント系（ＶＰＤ：５Ｗ
）は、水溶液中に５％デキストロースで１：１に希釈されたＶＰＤからなる。こ
のコソルベント系は、疎水性化合物をよく溶解し、全身的な投与時に、それ自体
が低毒性を生じる。当然、コソルベント系の割合はかなり変化し得るが、その溶
解度および毒性特徴を破壊しない。さらに、コソルベント構成成分の同一性は変
化し得る。例えば他の低毒性非極性界面活性剤が、ポリソルベート８０の代わり
に用いられ得る。ポリエチレングリコールの分画サイズは変わり得る。他の生適
合性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンが、ポリエチレングリコールに取っ
て代わり得る。他の糖類または多糖類が、デキストロースを置換し得る。あるい
は疎水性薬学的化合物のための他の送達系が用いられ得る。リポソームおよびエ
マルションは、疎水性薬剤のための送達伝達体または担体の既知の例である。あ
る種の有機溶媒、例えばジメチルスルホキシドも用いられ得るが、通常はより高
い毒性という犠牲を払う。さらに化合物は、徐放性系、例えば治療薬を含有する
固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを用いて送達され得る。様々な種類の
徐放性物質が確立されており、当業者に既知である。徐放性カプセルは、それら
の化学的性質によって、２〜３週間から１００日間またはそれ以上まで化合物を
放出する。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性によって、タンパク質ま
たはその他の有効成分安定化のためのさらなるストラテジーが用いられ得る。 【０４０８】 薬学的組成物は、適切な固体またはゲル相担体または賦形剤も含み得る。この
ような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種
々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー、例えばポリエ
チレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の有効成分の
多くは、薬学的相溶性対イオンを有する塩として提供され得る。このような薬学
的に許容可能な塩基付加塩は、生物学的有効性および遊離酸の特性を保持し、無
機または有機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア
、トリアルキルアミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、二塩基性アミ
ノ酸、酢酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリエタノールアミンなどとの反応
により得られる塩である。 【０４０９】 本発明の薬学的組成物は、本発明のタンパク質またはその他の有効成分とタン
パク質またはペプチド抗原との複合体の形態であり得る。タンパク質および／ま
たはペプチド抗原は、刺激シグナルをＢおよびＴリンパ球の両方に送達する。Ｂ
リンパ球は、それらの表面免疫グロブリン受容体を介して抗原に応答する。Ｔリ
ンパ球は、ＭＨＣタンパク質による抗原の提示後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介
して抗原に応答する。ＭＨＣおよび構造的関連タンパク質、例えば宿主細胞上の
クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ遺伝子によりコードされるものは、Ｔリンパ
球に対するペプチド抗原を提示するために機能する。抗原構成成分は、精製ＭＨ
Ｃ−ペプチド複合体として、単独で、またはＴ細胞に直接信号伝達し得る同時刺
激分子とともに供給され得る。あるいはＢ細胞上で表面免疫グロブリンおよびそ
の他の分子と結合可能な抗体、ならびにＴ細胞上でＴＣＲおよびその他の分子と
結合可能な抗体は、本発明の薬学的組成物と組合され得る。本発明の薬学的組成
物は、本発明のタンパク質が、その他の薬学的に許容可能な担体のほかに、水溶
液中のミセル、不溶性単一層、液晶または積層として凝集形態で存在する両性物
質、例えば脂質と組合されるリポソームの形態であり得る。リポソーム製剤のた
めの適切な脂質としては、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソ
レシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が挙げられるが、これらに限定されな
い。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば米国特許第４，２３５，８７１
号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号および第４，７３７，３
２３号（この記載内容は、参照により本明細書中に援用される）に開示されてい
るように、当該技術分野の技術のレベル内である。 【０４１０】 本発明の薬学的組成物中の本発明のタンパク質またはその他の有効成分の量は
、治療される症状の性質および重症度に、ならびに患者が施された前の治療の性
質による。最終的には、各々の個々の患者を治療するための本発明のタンパク質
またはその他の有効成分の量は、主治医が決定する。最初に、主治医は低用量の
本発明のタンパク質またはその他の有効成分を投与し、患者の応答を観察する。
患者にとって最適治療効果が得られるまで、より高い用量の本発明のタンパク質
またはその他の有効成分が投与され、その時点で投与量はそれ以上増大されない
。本発明の方法を実行するために用いられる種々の薬学的組成物は、約０．０１
μｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは約０．１μｇ〜約１０ｍｇ、さらに好ましくは
約０．１μｇ〜約１ｍｇ）の本発明のタンパク質またはその他の有効成分／体重
１ｋｇを含有すべきであるよう意図される。骨、軟骨、腱または靭帯再生に有用
である本発明の組成物に関しては、治療方法は、組成物を局所的に、全身に、あ
るいは移植片またはデバイス(device)として局所的に投与することを含む。投与
される場合、本発明に用いるための治療用組成物は、もちろん、発熱性物質を含
まない生理学的に許容可能な形態である。さらに組成物は、望ましくは、骨、軟
骨または組織損害の部位への送達のために粘性形態で封入されるかまたは注入さ
れ得る。局所投与は、創傷治癒および組織修復に適切であり得る。上記の組成物
中に任意に含まれ得る本発明のタンパク質またはその他の有効成分以外の治療的
に有用な物質は、代替的にまたはさらに、本発明の方法で組成物と同時または連
続的に投与され得る。好ましくは骨および／または軟骨形成のためには、組成物
はタンパク質含有またはその他の有効成分含有組成物を骨および／または軟骨損
害の部位に送達し、骨および軟骨を発達させるための構造を提供し、かつ任意に
身体中に再吸収されることができるマトリックスを含む。このようなマトリック
スは、他の移植医療用途のために現在使用中の物質で構成され得る。 【０４１１】 マトリックス物質の選択は、生適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観お
よび界面特性に基づく。組成物の特定の用途は、適切な製剤を規定する。組成物
のための考え得るマトリックスは、生分解性および化学的に規定される硫酸カル
シウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコー
ル酸およびポリ無水物であり得る。その他の考え得る物質は、生分解性のかつ生
物学的に十分規定された、例えば骨または皮膚コラーゲンである。さらなるマト
リックスは、純粋タンパク質または細胞外マトリックス構成成分で構成される。
その他の考え得るマトリックスは、非生分解性および化学的に規定され、例えば
焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネートまたはその他のセラミ
ックである。マトリックスは、上記の種類の物質、例えばポリ酢酸およびヒドロ
キシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムのいずれかの組合せ
で構成され得る。バイオセラミックは、組成物中で、例えばカルシウム−アルミ
ネート−ホスフェート中で改変されて、孔径、粒径、粒子形状および生分解性を
変えるよう加工され得る。目下好ましいのは、１５０〜８００μの範囲の直径を
有する多孔性粒子の形態の乳酸およびグリコール酸の５０：５０（分子量）コポ
リマーである。いくつかの用途においては、金属イオン封鎖剤、例えばカルボキ
シメチルセルロースまたは自系血餅を利用して、タンパク質組成物がマトリック
スから解離するのを防止するのが有用である。 【０４１２】 金属イオン封鎖剤の好ましい群は、セルロース系物質、例えばアルキルセルロ
ース（例えばヒドロキシアルキルセルロース）、例えばメチルセルロース、エチ
ルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、
ヒドロキシプロピル−メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースであ
り、最も好ましいのは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の陽イオン塩で
ある。その他の好ましい金属イオン封鎖剤としては、ヒアルロン酸、アルギン酸
ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カル
ボキシビニルポリマーおよびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。本明細書
中で有用な金属イオン封鎖剤の量は、総製剤重量に基づいて０．５〜２０重量％
、好ましくは１〜１０重量％であり、これはポリマーマトリックスからのタンパ
ク質の脱離を防止するために、ならびに前駆細胞がマトリックスに浸潤するのを
防止するほど多くないよう、組成物の適切な取り扱いを提供し、それにより前駆
細胞の骨形成活性を助ける機会をタンパク質に提供するために必要な量を表す。
さらに別の組成物では、本発明のタンパク質またはその他の有効成分は、骨およ
び／または軟骨欠陥、創傷または当該組織の治療に有益であるその他の物質と組
合され得る。これらの物質としては、種々の成長因子、例えば上皮成長因子（Ｅ
ＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−および
ＴＧＦ−）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）が挙げられる。 【０４１３】 治療用組成物は、目下、獣医学的用途にも有益である。特に、家畜動物および
サラブレッド馬は、ヒトのほかに、本発明のタンパク質またはその他の有効成分
を用いたこのような治療のための望ましい患者である。組織再生に用いられるタ
ンパク質含有薬学的組成物の投与レジメン(regimen)は、タンパク質の作用を改
変する種々の因子、例えば生成が望まれる組織重量、損害部位、損害組織の状態
、創傷のサイズ、損害組織の種類(例えば骨)、患者の年齢、性別、食餌、任意の
感染の重症度、投与時間、ならびにその他の臨床因子を考慮しながら、主治医に
より決定される。投与量は、再組成に用いられるマトリックスの種類に、ならび
に薬学的組成物中のその他のタンパク質の含入により変わり得る。例えば、その
他の既知の成長因子、例えばＩＧＦ Ｉ(インスリン様成長因子Ｉ)の最終組成物
への添加は、投与量にも作用し得る。組織／骨成長および／または修復の周期的
評価により、例えばＸ線組織形態測定およびテトラサイクリン標識により、進行
がモニタリングされ得る。 【０４１４】 ５．１１．３ 有効投与量 本発明に用いるのに適した薬学的組成物としては、有効成分が有効量で含まれ
て、その意図された目的を達成する組成物が挙げられる。特に治療的有効量とは
、治療される被験体の既存の症状の発達を防止し、それを軽減するのに有効な量
を意味する。有効量の決定は、特に本明細書中に提供された詳細な開示に鑑みて
、十分に当業者の能力内である。本発明の方法に用いられる任意の化合物に関し
ては、治療的有効用量は、適切なインビトロアッセイから最初に概算され得る。
例えば、ヒトにおける有用用量をより正確に確定するために用いられ得る循環濃
度範囲を達成するために、動物モデルにおいて用量が処方され得る。例えば用量
は、細胞培養中で確定されるようなＩＣ₅₀を含む循環濃度範囲(すなわち、Ｉｇ
ＳＦタンパク質の生物学的活性の最大の半分抑制(half-maximal inhibition)を
達成する試験化合物の濃度)を達成するよう、動物モデルにおいて処方され得る
。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に確定するために用
いられ得る。 【０４１５】 治療的有効用量とは、患者において症状の改善または生存の延長を生じる化合
物の量を指す。このような化合物の毒性および治療効力は、例えばＬＤ₅₀（集団
の５０％に対して致死性である用量）およびＥＤ₅₀（集団の５０％において治療
的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準薬学
的手法により確定され得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、
それはＬＤ₅₀およびＥＤ₅₀間の比として表され得る。高治療指数を示す化合物が
好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒ
トにおいて用いるためのある範囲の投与量を処方するのに用いられ得る。このよ
うな化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く有さないＥＤ₅₀ を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる投与形態ならびに利用さ
れる投与経路によって、この範囲内で変わり得る。的確な製剤、投与経路および
投与量は、患者の症状の点から見て、個々の医者により選択され得る(例えばFin
gl ら, 1975, in “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch.1 p.1
参照)。投与の量および間隔は、所望の作用を維持するのに十分な活性部分の血
漿レベル、あるいは最小有効濃度(ＭＥＣ)を提供するために、別々に調整され得
る。ＭＥＣは各化合物に関して変わるが、インビトロデータから概算され得る。
ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、投与の個々の特徴および経路によって決
まっている。しかしながらＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血
漿濃度を確定することができる。 【０４１６】 投与間隔も、ＭＥＣ値を用いて確定され得る。化合物は、時間の１０〜９０％
の間、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の間、血漿レベル
をＭＥＣより高く維持するレジメンを用いて投与されるべきである。局所投与ま
たは選択的取込みの場合には、薬剤の有効局所濃度は、血漿濃度に関連しない。 【０４１７】 本発明のポリペプチドまたはその他の組成物に関する投与レジメンの例は、０
．０１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇ／日の範囲であり、好ましい用量は、約０．１
〜２５ｍｇ／患者の体重１ｋｇ／日であって、成人と小児では変わる。投与は１
日１回であり得るか、あるいは等価の投与が、より長いかまたは短い間隔で送達
され得る。 【０４１８】 投与される組成物の量は、もちろん、治療される被験体に、被験体の年齢およ
び体重、疾患の重症度、投与方法、ならびに処方医の判断によって決まっている
。 【０４１９】 ５．１１．４ 包装 組成物は、所望により、有効成分を含有する１つまたはそれ以上のユニット投
薬形態を含み得るパックまたは計量分配装置中に呈示される。パックは、例えば
金属またはプラスチック箔を含み、例えばブリスターパック(blister pack)であ
り得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与に関する使用説明書が添付さ
れ得る。相溶性薬学的担体中に配合された本発明の化合物を含む組成物も調製さ
れ、適切な容器中に入れられて、適応症の治療に関するラベルを貼られる。 【０４２０】 ５．１２ 抗体 本発明のタンパク質またはタンパク質の断片に対する抗体も本発明に含まれる
。「抗体(antibody)」という用語は、本明細書中で用いられる場合、免疫グロブ
リン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、即ち抗原と特
異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。このような抗
体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆ_ab、Ｆ_ab'
およびＦ_(ab')2断片、ならびにＦ_ab発現ライブラリーが挙げられるが、これらに
限定されない。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、
ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関連するが、これらは分子中に存在す
る重鎖の性質が互いに異なる。あるクラスはさらに、サブクラス、例えばＩｇＧ₁ 、ＩｇＧ₂等を有する。さらにヒトにおいては、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得
る。抗体に対する本明細書中の参照は、すべてのこのようなクラス、サブクラス
、ならびにヒト抗体種の型に対する参照を含む。 【０４２１】 本発明の単離された関連タンパク質は、抗原、その一部または断片として機能
するよう意図され、さらに、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のた
めの標準技法を用いて、抗原を免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫
原として用いられ得る。全長タンパク質が用いられ得るし、あるいは本発明は、
免疫原として用いるための抗原の抗原ペプチド断片を提供する。抗原ペプチド断
片は、配列番号１０、１３〜２４、３２または３４で示されるアミノ酸配列のよ
うな、全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基を含み、ペプ
チドに対して産出された抗体が全長タンパク質と、またはエピトープを含む任意
の断片と特異的免疫複合体を形成するよう、そのエピトープを含む。好ましくは
、抗原ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ
酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残
基を含む。抗原ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、その表面に位置する
タンパク質の領域である。一般にこれらは親水性領域である。 【０４２２】 本発明のある種の実施態様では、抗原ペプチドに含まれる少なくとも１つのエ
ピトープは、タンパク質の表面に位置するＴＧＦα様タンパク質の領域、例えば
親水性領域である。ヒト関連タンパク質配列の疎水性分析は、関連タンパク質の
どの領域が特に親水性であるかを、したがって抗体産生をターゲティングするた
めに有用な表面残基をコードすると思われることを示す。抗体産生をターゲティ
ングするための手段として、親水性および疎水性の領域を示す水治療法プロット
は、フーリエ変換を用いてまたは用いずに、例えばカイト−ドーリットル(Kyte
Doolittle)またはホップ−ウッド(Hopp Woods)法などの当該技術分野で既知の任
意の方法で生成され得る（例えばHopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci
. USA 78:3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157:105-142参
照）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中に援用される）。抗原タ
ンパク質内の１つまたはそれ以上のドメインに特異的な抗体、あるいはその誘導
体、断片、類縁体または同族体も本明細書中に提供される。 【０４２３】 本発明のタンパク質、あるいはその誘導体、断片、類縁体、同族体またはオー
ソログは、これらのタンパク質構成成分と免疫特異的に結合する抗体の生成にお
ける免疫原として利用され得る。 【０４２４】 「に特異的な(specific for)」という用語は、本発明の抗体の可変領域が本発
明のポリペプチドを専ら認識し、結合する（即ち、ポリペプチドのファミリーに
見出される配列同一性、相同性または類似性にもかかわらず、本発明のペプチド
を、他の同様のポリペプチドと区別し得る）が、抗体の可変領域の外側の、特に
分子の定常部における配列との相互作用により、他のタンパク質（例えば黄色ブ
ドウ球菌プロテインＡまたはＥＬＩＳＡ技法におけるその他の抗体）とも相互作
用し得ることを示す。本発明の抗体の結合特異性を確定するためのスクリーニン
グアッセイは既知であり、当該技術分野でありきたりに実行される。このような
アッセイの包括的考察に関しては、Harlow ら (Eds), Antibodies A Laboratory
Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988),Ch
apter 6を参照されたい。本発明のポリペプチドの断片を認識し、結合する抗体
も考えられるが、但し、抗体は先ずおよび第一番に、上記のように、本発明の全
長ポリペプチドに特異的である。本発明の全長ポリペプチドに特異的である抗体
と同様に、断片を認識する本発明の抗体は、タンパク質のファミリー中に見出さ
れる固有の配列同一性、相同性または類似性にもかかわらず、ポリペプチドを同
一ファミリーのポリペプチドと区別し得るものである。 【０４２５】 本発明の抗体は、例えば治療目的（本発明のポリペプチドの活性を調節するこ
とによる）、本発明のポリペプチドを検出または定量するための診断目的、なら
びに本発明のポリペプチドの精製のために有用である。本明細書中に記載された
目的のいずれかのための本発明の抗体を含むキットに含まれる。一般に、本発明
のキットは、抗体が免疫特異的である対照抗原も含む。本発明はさらに、本発明
の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。本発明の抗体は、本発明のポリペ
プチドの検出および／または精製のために有用である。 【０４２６】 本発明のタンパク質と結合するモノクローナル抗体は、タンパク質の免疫検出
のための有用な診断薬であり得る。タンパク質と結合する中和モノクローナル抗
体は、タンパク質に関連した状態に、ならびにタンパク質の異常発現が関与する
何らかの形態の癌の治療にも有用な治療薬でもあり得る。癌性細胞または白血病
細胞の場合には、タンパク質に対する中和モノクローナル抗体は、タンパク質に
より媒介され得る癌性細胞の転移性拡散を検出し、かつ防止するのに有用であり
得る。 【０４２７】 本発明の標識抗体は、当該ポリペプチドの断片が発現される細胞または組織を
同定するためにインビトロ、インビボおよびインシトゥアッセイに用いられ得る
。抗体は、治療またはその他の診断にも直接用いられ得る。本発明はさらに、固
体支持体上に固定される上記の抗体を提供する。このような固体支持体の例とし
ては、プラスチック、例えばポリカルボネート、複合炭水化物、例えばアガロー
スおよびセファロース（商標）、アクリル系樹脂および例えばポリアクリルアミ
ドおよびラテックスビーズが挙げられる。抗体をこのような固体支持体に結合さ
せるための技術は、当該技術分野で既知である（Weir, D.M. ら, “Handbook of
Experimental Immunology” 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, O
xford, England, Chapter 10(1986); Jacoby, W.D. ら, Meth. Enzym. 34 Acade
mic Press, N.Y.(1974)）。本発明の固定化抗体は、インビトロ、インビボおよ
びインシトゥアッセイのために、ならびに本発明のタンパク質のイムノアフィニ
ティー精製のために用いられ得る。 【０４２８】 当該技術分野内で既知の種々の手法は、本発明のタンパク質に対して、あるい
はその誘導体、断片、類縁体、同族体またはオーソログに対するポリクローナル
またはモノクローナル抗体の産生のために用いられ得る（例えば、Antibodies;
A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, NY参照）（この記載内容は、参照により本
明細書中に援用される）。これらの抗体のうちのいくつかを以下で考察する。 【０４２９】 ５．１２．１ ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えばウサギ、
ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）は、自然タンパク質、その合成変異体、
または上記の誘導体を１回またはそれ以上注入することにより、免疫感作され得
る。適切な免疫原性調製物は、例えば天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫
原性タンパク質を表す化学合成ポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原
性タンパク質を含有し得る。さらにタンパク質は、免疫感作されている哺乳動物
中で免疫原性であることが既知である第２のタンパク質と結合され得る。このよ
うな免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血
清アルブミン、ウシチログロブリンおよびダイズトリプシン阻害剤が挙げられる
が、これらに限定されない。調製物はさらに、アジュバントを含み得る。免疫学
的応答を増大させるために用いられる種々のアジュバントとしては、フロイント
（完全および不完全）、無機ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、界面活性物質
（例えばリソレシチン、プルロニック(pluronic) ポリオール、ポリアニオン、
ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノール等）、ヒトに使用可能なアジュバント
、例えばバシラス・カルメッテ−グエリン(Bacille Calmette-Guerin)およびコ
リネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)または同様の免疫賦活剤
が挙げられるが、これらに限定されない。用いられ得るアジュバントのさらなる
例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレ
ハロースジコリノミコレート）が挙げられる。 【０４３０】 免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例え
ば血液から）単離され、さらに免疫血清のＩｇＧ分画を主に提供する、プロテイ
ンＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーのような既
知の技法、により精製され得る。その後、または代替的には、探し出された免疫
グロブリンの標的である特定の抗原またはそのエピトープはカラム上に固定され
て、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得
る。免疫グロブリンの精製は、例えばD. Wilkinson (The Scientist, published
by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No.8(April 17, 2000),
pp.25-28)により考察されている。 【０４３１】 ５．１２．２ モノクローナル抗体 「モノクローナル抗体(monoclonal antibody)」（ＭＡｂ）または「モノクロ
ーナル抗体組成物(monoclonal antibody composition)」という用語は、本明細
書中で用いる場合、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる
抗体分子の１分子種のみを含む抗体分子の集団を指す。特にモノクロナール抗体
の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団のすべての分子において同一である。した
がってＭＡｂは、それに対する独自の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピ
トープと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。 【０４３２】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein, Nat
ure, 256:495(1975)に記載されている方法を用いて調製され得る。ハイブリドー
マ法では、マウス、ハムスターまたはその他の適切な宿主動物は、典型的には免
疫感作剤で免疫感作されて、免疫感作剤と特異的に結合する抗体を産生するかま
たは産生し得るリンパ球を引き出し得る。あるいはリンパ球は、インビトロで免
疫感作され得る。 【０４３３】 免疫感作剤は、典型的にはタンパク質抗原、その断片またはその融合タンパク
質を含む。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球が用いら
れ、あるいは非ヒト哺乳動物供給源が望ましい場合には脾臓細胞またはリンパ節
細胞が用いられる。次にリンパ球は、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコ
ールを用いて不死化細胞系と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Godi
ng, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (198
6)pp.59-103）。不死化細胞系は、通常は形質転換した哺乳動物細胞、特にネズ
ミ、ウシおよびヒト起源の骨髄細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細
胞系が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、非融合不死化細胞の成長または生存
を抑制する１つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養
され得る。例えば親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための
培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（「
ＨＡＴ培地」）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。 【０４３４】 好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選定抗体産生細胞による抗体の安
定高レベル発現を指示し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性であるもので
ある。より好ましい不死化細胞系は、ネズミ骨髄腫系であり、これは、例えばSa
lk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California、およびAmer
ican Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから得られる。ヒト骨髄腫
およびマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関
して記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeur ら, Mon
oclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker,
Inc., New York, (1987)pp.51-63）。 【０４３５】 次に、ハイブリドーマ細胞が培養される培地は抗原に対するモノクローナル抗
体の存在に関してアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産
生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によるか、またはインビ
トロ結合アッセイにより、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結
合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により確定される。このような技法およびア
ッセイは、当該技術分野で既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例
えばMunson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のScatchard分析によ
り確定され得る。好ましくは、標的抗原に対して高度の特異性および高結合親和
性を有する抗体が単離される。 【０４３６】 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを、限界希釈手法により
標準的方法で成長させ得る。この目的のための適切な培地としては、例えばダル
ベッコの変法イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるい
は、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水としてインビボで増殖され得る。 【０４３７】 サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、慣用的イムノグロブリ
ン精製手法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロ
マトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィー
などにより、培地または腹水液から単離されるか、または精製され得る。 【０４３８】 モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６
７号に記載されているような方法によっても作製され得る。本発明のモノクロー
ナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用的手法（例えばネズミ抗体の重鎖および軽
鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用い
ることにより）を用いて容易に単離され、シーケンシングされ得る。本発明のハ
イブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単
離されれば、ＤＮＡは発現ベクター中に入れられ、これは次に、例えばサルＣＯ
Ｓ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免
疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞中のような宿主細胞にトランス
フェクトされて、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡ
は、例えば相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに対する
コード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison
, Nature 368, 812-13(1994)）、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドに関す
るコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列と共有結合的に連結
することにより修飾され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本
発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換され得るし、あるいは本発明の抗体の
一抗原併合部位の可変ドメインの代わりに置換されて、キメラ二価抗体を作製し
得る。 【０４３９】 ５．１２．３ ヒト化抗体 本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに
含み得る。これらの抗体は、投与免疫グロブリンに対してヒトが免疫応答を起こ
さず、ヒトへの投与に適している。ヒト化形態の抗体は、ヒト免疫グロブリンの
配列で主に構成され、そして非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ
免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂または抗体のその他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化
は、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に代えて置換する
ことにより、Winterと共同研究者の方法（Jones ら, Nature, 321:522-525(1986
); Riechmann ら, Nature, 332:323-327(1988); Verhoeyen ら, Science, 239:1
534-1536(1988））にしたがって実施され得る（米国特許第５，２２５，５３９
号も参照）。いくつかの場合に、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組み構造残基は、
対応する非ヒト残基により置き換えられる。ヒト化抗体は、受容体抗体中にも導
入ＣＤＲまたは枠組み構造配列中にも見出されない残基も含み得る。一般に、ヒ
ト化抗体は、少なくとも１つの、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的
にすべてを含むが、この場合、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非
ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そしてすべてのまたは実質的にすべての枠
組み構造領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗
体は、最適には、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部分を、典型的
にはヒト免疫グロブリンのものを含む（Jones ら, 1986; Riechmann ら, 1988;
およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)）。 【０４４０】 ５．１２．４ ヒト抗体 完全ヒト抗体は、ＣＤＲを含めた、軽鎖および重鎖の両方の本質的に全配列が
ヒト遺伝子から生じる抗体分子に関する。このような抗体は、本明細書中では「
ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、ト
リオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor, ら, 1983 Immunol Tod
ay 4:72参照）およびＥＢＶハイブリドーマ技法により調製されて、ヒトモノク
ローナル抗体を生じ得る（Cole, ら, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CAN
CER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96参照）。ヒトモノクローナル抗体
は、本発明の実施に際して利用され得るし、またヒトハイブリドーマを用いるこ
とにより（Cote, ら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030参照）
、またはインビトロでエプスタイン・バーウイルス(Epstein Barr Virus)を用い
てヒトＢ細胞を形質転換することにより（Cole, ら, 1985 In: MONOCLONAL ANTI
BODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96参照）作製され得
る。 【０４４１】 さらに、ヒト抗体は、さらなる技法、例えばファージディスプレイライブラリ
ーを用いても作製され得る（Hoognboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381(1
991); Marks ら, J. Mol. Biol., 222:581(1991)）。同様に、ヒト抗体は、トラ
ンスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全
に不活性化されたマウス中にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより
作製され得る。攻撃時に、ヒト抗体産生が観察されるが、これは、遺伝子再配列
、構築および抗体レパートリー(antibody repertoire)を含めたすべての点でヒ
トにおいて観察されたものと非常によく似ている。このアプローチは、例えば米
国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２
５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１
６号、ならびにMarks ら(Bio/Technology 10, 779-783(1992)); Lonberg ら (Na
ture 368 856-859 (1994)); Morrison(Nature 368, 812-13(1994)); Fishwild
ら(Nature Biotechnology 14, 845-51(1996)); Neuberger(Nature Biotechnolog
y 14, 826(1996));およびLonberg and Huszar(Intern. Rev. Immunol. 13 65-93
(1995))に記載されている。 【０４４２】 ヒト抗体は、抗原による攻撃に対する応答における動物の内在性抗体というよ
りむしろ完全ヒト抗体を産生するよう修飾されたトランスジェニック非ヒト動物
を用いてさらに作製され得る（国際特許公開第９４／０２６０２号参照）。非ヒ
ト宿主中の重鎖および軽免疫グロブリン鎖をコードする内在性遺伝子は、無能力
化され、そしてヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする遺伝子座は宿主
のゲノム中に挿入される。ヒト遺伝子は、例えば必要なヒトＤＮＡセグメントを
含む酵母人工染色体を用いて組入れられる。すべての所望の修飾を提供する動物
が次に、修飾の総数より少ない修飾を含む中間トランスジェニック動物を異種交
配することにより、子孫として得られる。このような非ヒト動物の好ましい実施
態様はマウスであり、国際特許公開第９６／３３７３５号および国際特許公開第
９６／３４０９６号に開示されているように、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）
と呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する
。抗体は、例えばポリクローナル抗体の調製物として、当該免疫原による免疫感
作後の動物から、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのよう
な動物由来の免疫感作化Ｂ細胞から、直接得ることができる。さらに、ヒト可変
領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子が回収されかつ抗体を直接生成
するために発現されるか、あるいは、例えば一本鎖Ｆｖ分子のような抗体の類縁
体を生成するためにさらに修飾され得る。 【０４４３】 内在性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く、マウスとして例示される非ヒト宿主
の作製方法の一例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。それ
は、遺伝子座の再配列を防止するため再配列した免疫グロブリン重鎖遺伝子座の
転写体の形成を防止するために、胚性幹細胞中の少なくとも１つの内在性重鎖遺
伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失させ（欠失は、選択マーカーをコードする
遺伝子を含むターゲティングベクターにより実行される）、そして、その体細胞
および生殖細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマ
ウスを胚性幹細胞から作製することを含めた方法により得られる。 【０４４４】 当該抗体、例えばヒト抗体の作製方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に
開示されている。それは、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクタ
ーを、培養中の一哺乳動物宿主細胞中に導入し、軽鎖をコードするヌクレオチド
配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞中に導入し、そして２つの細胞
を融合して、ハイブリッド細胞を形成することを含む。ハイブリッド細胞は、重
鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。 【０４４５】 この手法に関するさらなる改善において、免疫原上の臨床的関連エピトープを
同定するための方法、ならびに高親和性を有する関連エピトープと免疫特異的に
結合する抗体を選択するための相関的方法は、国際特許公開第９９／５３０４９
号に開示されている。 【０４４６】 ５．１２．５ ＦＡＢ断片および一本鎖抗体 本発明によれば、本発明の抗原タンパク質に特異的な一本鎖抗体の作製のため
の技法が適応され得る（例えば米国特許第４，９４６，７７８号参照）。さらに
、タンパク質またはその誘導体、断片、類縁体または同族体に対する所望の特異
性を有するモノクローナルＦ_ab断片の迅速且つ効果的同定を可能にするために、
Ｆ_ab発現ライブラリー（例えばHuse ら, 1989 Science 246:1275-1281参照）の
構築のための方法が適応され得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含
む抗体断片は、当該技術分野で既知の技法により作製され、その例としては、（
ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ_(ab')2断片；（ｉｉ）Ｆ_(ab')2 断片のジスルフィド架橋を低減することにより生成されるＦ_ab断片；（ｉｉｉ）
パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理により生成されるＦ_ab断片、なら
びに（ｉｖ）Ｆ_v断片が挙げられるが、これらに限定されない。 【０４４７】 ５．１２．６ 二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する
モノクローナルの、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。本発明の場合、結
合特異性の１つは、本発明の抗原タンパク質に対するものである。第二結合標的
は任意のその他の抗原であり、そして有益には細胞表面タンパク質または受容体
または受容体サブユニットである。 【０４４８】 二重特異性抗体の製造方法は、当該技術分野で既知である。従来から、二重特
異性抗体の組換え的産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を基
礎にしており、この場合、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Milstein and C
uello, Nature, 305:537-539(1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為
集合のために、このハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分
子の考え得る混合物を生成し、このうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有
する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィー過程によ
り成し遂げられる。同様の手法は、国際特許公開第９３／０８８２９号（１９９
３年５月１３日公開）に、ならびにTraunecker ら, 1991 EMBO J., 10:3655-365
9に開示されている。 【０４４９】 所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫
グロブリン定常ドメイン配列と融合され得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、Ｃ
Ｈ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメイン
とである。少なくとも１つの融合中に存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第一
重鎖定常部（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合を、そし
て所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター中
に挿入され、適切な宿主生物体中に同時トランスフェクトされる。二重特異性抗
体の生成についてのさらなる詳細に関しては、例えばSuresh ら, Methods in En
zymology, 121:210(1986)を参照されたい。 【０４５０】 国際特許公開第９６／２７０１１号に記載された別のアプローチによれば、抗
体分子対間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセント
を最大にするよう操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領
域の少なくとも一部を含む。この方法においては、第一抗体分子の界面からの１
つまたはそれ以上の小アミノ酸側鎖は、より大型の側鎖（例えばチロシンまたは
トリプトファン）で置き換えられる。大型側鎖と同一または類似サイズの補償「
キャビティー(cavities)」が、大型アミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラ
ニンまたはトレオニン）と置換することにより第二抗体分子の界面上に作製され
る。これは、その他の望ましくない最終産物、例えばホモ二量体、を上回るヘテ
ロ二量体の収量を増大させるためのメカニズムを提供する。 【０４５１】 二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）₂二重特異
性抗体）として調製され得る。抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技
法は、文献に記載されている。例えば二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製
され得る。Brennan ら, Science 229:81(1985)は、無傷抗体がタンパク質分解的
に切断されて、Ｆ（ａｂ’）₂断片を生成する手法を記載する。これらの断片は
、ジチオール錯生成剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、隣接ジチオール
を安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。生成されたＦａｂ‘断片は
次に、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。次にＦａｂ’−
ＴＮＢ誘導体のうちの１つは、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりＦａ
ｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合さ
れて、二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的
固定化のための物質として用いられ得る。 【０４５２】 さらに、Ｆａｂ’断片は、エシェリヒア・コリから直接回収され、化学的にカ
ップリングされて、二重特異性抗体を形成し得る。Shalaby ら, J. Exp. Med. 1
75:217-225(1992)は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）₂分子の産生を記
載する。各Ｆａｂ’断片は、エシェリヒア・コリから別々に分泌され、インビト
ロで導かれた化学カップリングに付されて、二重特異性抗体を形成した。このよ
うに形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および
正常ヒトＴ細胞と結合し、ならびにヒト乳癌標的に対するヒト細胞障害性リンパ
球の溶解活性を誘発し得た。 【０４５３】 組換え細胞培養から直接的に、二重特異性抗体断片を作製し、単離するための
種々の技法も記載されている。例えば二重特異性抗体は、ロイシンジッパー(leu
cine zipper)を用いて作製された（Kostelny ら, J. Immunol. 148(5): 1547-15
53(1992)）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは
、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモ
二量体は、ヒンジ領域で還元されて、単量体を形成し、次に再酸化されて、抗体
へテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の作製のためにも利用さ
れ得る。Hollinger ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)によ
り記載された「ジアボディ(diabody)」技術は、二重特異性抗体断片を作製する
ための代替的メカニズムを提供した。断片は、短すぎて同一鎖上の２つのドメイ
ン間を対合させることができないリンカーにより軽鎖可変ドメイン（Ｖ_L）に連
結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_H）を含む。したがってある断片のＶ_HおよびＶ_L
ドメインは、別の断片の相補的Ｖ_LおよびＶ_Hドメインと対合させられて、それに
より２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用による
二重特異性抗体断片の作製のための別のストラテジーも、報告されている（Grub
er ら, J. Immunol. 152:5368(1994)参照）。 【０４５４】 ２つより多い結合価を有する抗体が考えられる。例えば三重特異性抗体が調製
され得る（Tutt ら, J. Immunol. 147:60(1991)）。 【０４５５】 例示的二重特異性抗体は２つの異なるエピトープと結合し、そのうちの少なく
とも１つは、本発明のタンパク質抗原中に生じる。あるいは、特定の抗原を発現
する細胞に対する細胞の防御メカニズムに集中するために、免疫グロブリン分子
の抗抗原性アーム(arm)は、白血球、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ２、
ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７）またはＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃＲ）、例
えばＦｃＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ
１６）上の誘発分子と結合するアームと結び合わされ得る。二重特異性抗体は、
特定抗原を発現する細胞に細胞障害剤を誘導するためにも用いられ得る。これら
の抗体は、抗原結合アーム、ならびに細胞障害剤または放射性核種キレート剤、
例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡを結合するアームを保
有する。別の当該二重特異性抗体は、本明細書中に記載されたタンパク質抗原を
結合し、さらに組織因子（ＴＦ）を結合する。 【０４５６】 ５．１２．７ ヘテロ接合抗体 ヘテロ接合抗体も、本発明の範囲内である。ヘテロ接合抗体は、２つの共有結
合抗体で構成される。このような抗体は、例えば望ましくない細胞に対して免疫
系細胞を標的にするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ
感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／２００
３７３号；ヨーロッパ特許公開第０３０８９号）提唱された。抗体は、合成タン
パク質化学において既知の方法（例えば架橋剤を含むもの）を用いてインビトロ
で調製され得る、と意図される。例えばイムノトキシンは、ジスルフィド交換反
応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することにより構築され得る。この
目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メ
ルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号に
開示されたものが挙げられる。 【０４５７】 ５．１２．８ エフェクター機能操作 例えば癌を治療する際に抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に
関して本発明の抗体を修飾するのは望ましい。例えばシステイン残基がＦｃ領域
に導入され、それによりこのような領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可
能にし得る。このように生成されたホモ二量体抗体は、インターナライゼーショ
ン能力の改善および／または補体媒介性細胞殺害および抗体依存性細胞性細胞障
害性（ＡＤＣＣ）の増大を有し得る（Caron ら, J. Exp Med., 176: 1191-1195
(1992)およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照）。抗腫瘍活
性増強を示すホモ二量体抗体は、Wolff ら Cancer Research, 53:2560-2565(199
3)に記載されたようなヘテロ二官能性架橋剤を用いても調製され得る。あるいは
、二重Ｆｃ領域を有し、それにより補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強し得た抗
体が操作され得る（Stevenson ら, Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230(1989)
を参照）。 【０４５８】 ５．１２．９ 免疫複合体 本発明は、細胞障害剤、例えば化学療法薬、毒素（例えば細菌、真菌、植物ま
たは動物起源の酵素的に活性な毒素またはそれらの断片）、または放射性同位元
素（即ち放射性複合体）に結合された抗体を含む免疫結合体にも関する。 【０４５９】 このような免疫結合体の生成に有用な化学療法薬は、上記で説明されている。
用いられ得る酵素的活性毒素およびそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジ
フテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ
(Pseudomonas aeruginosa)から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシン(mod
eccin)Ａ鎖、α−サリシン、アレウリテス・フォルジ(Aleurites fordii)タンパ
ク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラーカ・アメリカーナ(Phytola
ca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、モモル
ディカ・シャランティア(momordica charantia)阻害剤、クルチン(curcin)、ク
ロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害
剤、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrict
ocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)およびトリコテ
セン(tricothecene)が挙げられる。種々の放射性核種は、放射能接合抗体の作製
に利用可能である。例としては、²¹²Ｂｉ、¹³¹Ｉ、¹³¹Ｉｎ、⁹⁰Ｙおよび¹⁸⁶Ｒｅ
が挙げられる。 【０４６０】 抗体および細胞障害剤の結合体は、種々の二官能性のタンパク質カップリング
剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネ
ート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二価誘導体（例
えばジメチルアジピイミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミ
ジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化
合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾ
ニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミ
ン）、ジイソシアネート（例えばトリエン２，６−ジイソシアネート）、および
ビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼ
ン）を用いて作製される。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta ら, Scie
nce, 238:1098(1987)に記載されているように調製され得る。炭素−１４標識１
−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−
ＤＴＰＡ）は、放射性核種と抗体との結合のためのキレート剤の一例である（国
際特許公開第９４／１１０２６号参照）。 【０４６１】 別の実施態様では、抗体は、腫瘍プレターゲティングにおける利用のために、
「受容体」（例えばストレプトアビジン）と結合され得るが、この場合、抗体−
受容体結合体は患者に投与され、その後、清澄剤を用いて循環から非結合結合体
が除去され、次に「リガンド(ligand)」（例えばアビジン）が投与され、次いで
これは細胞障害剤と結合される。 【０４６２】 ５．１３ コンピューター読取り可能配列 この実施態様の一用途において、本発明のヌクレオチド配列はコンピューター
読取り可能媒体に記録され得る。本明細書中で用いる場合、「コンピューター読
取り可能媒体(computer readable media)」とは、コンピューターにより読取ら
れ、直接アクセスされ得る任意の媒体を指す。このような媒体としては、磁気記
憶媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、お
よび磁気テープ、光学的記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、電気的記憶媒体、例え
ばＲＡＭおよびＲＯＭ、ならびにこれらのカテゴリーの混成タイプのもの、例え
ば磁気／光学記憶媒体が挙げられるが、これらに限定されない。今日既知のコン
ピューター読み取り可能媒体のいずれを用いて、本発明のヌクレオチド配列をそ
の上に記録されたコンピューター読取り可能媒体を含む製品を作製し得るかを当
業者は容易に理解することができる。本明細書中で用いる場合、「記録された(r
ecorded)」とは、コンピューター読取り可能媒体上に情報を保存するための過程
を指す。本発明のヌクレオチド配列情報を含む製品を生成するためにコンピュー
ター読取り可能媒体に情報を記録するための今日既知の方法のいずれかを、当業
者は用意に適応し得る。 【０４６３】 本発明のヌクレオチド配列をその上に記録されたコンピューター読取り可能媒
体を作製するために、種々のデータ保存構造が当業者に利用可能である。データ
保存構造の選択は一般に、保存情報にアクセスするために選択される手段に基づ
いている。さらに、種々のデータ処理プログラムおよびフォーマットを用いて、
本発明のヌクレオチド配列情報をコンピューター読取り可能媒体上に保存し得る
。配列情報は、言語処理テキストファイルで表され、市販のソフトウェア、例え
ばワードパーフェクトおよびマイクロソフトワードにフォーマットされ、あるい
はＡＳＣＩＩファイルの形態で表されて、データベースアプリケーション、例え
ばＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなどに保存される。本発明のヌクレオチ
ド配列情報をその上に記録されたコンピューター読取り可能媒体を得るために、
任意数のデータ処理構造化フォーマット（例えばテキストファイルまたはデータ
ベース）を、当業者は容易に適応し得る。 【０４６４】 ヌクレオチド配列の配列番号１〜９，１１、１２、３１または３３あるいはそ
れらの代表的断片のいずれかを、あるいは配列番号１〜９，１１、１２、３１ま
たは３３のヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも９９．９％同一のヌクレオ
チド配列をコンピューター読取り可能形態で提供することにより、種々の目的の
ために当業者は配列情報にありきたりにアクセスし得る。コンピューター読取り
可能媒体で提供された配列情報に当業者がアクセス可能であるコンピューターソ
フトウェアは、公的に利用可能である。下記の実例は、Ｓｙｂａｓｅシステム上
でＢＬＡＳＴ（Altschul ら, J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)）およびＢＬＡ
ＺＥ（Brutlag ら, Comp. Chem. 17:203-207(1993)）検索アルゴリズムを実行す
るソフトウェアがいかに用いられて、核酸配列内のオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）を同定するかを実証する。このようなＯＲＦはタンパク質コード断
片であり、商業的に重要なタンパク質、例えば発酵反応に用いられる酵素の製造
に、また商業的に有用な代謝産物の製造に有用であり得る。 【０４６５】 本明細書中で用いる場合、「コンピューターベースシステム(a computer-base
d system)」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するために用いられる
ハードウェア手段、ソフトウェア手段およびデータ保存手段を指す。本発明のコ
ンピューターベースシステムの最小ハードウェア手段は、中央処理装置（ＣＰＵ
）、入力手段、出力手段およびデータ保存手段を含む。現在利用可能なコンピュ
ーターベースシステムのいずれもが本発明に用いるのに適していると当業者は容
易に理解し得る。上記のように、本発明のコンピューターベースシステムは、本
発明のヌクレオチド配列をその中に保存されたデータ保存手段、ならびに検索手
段を指示し、実行するために必要なハードウェア手段およびソフトウェア手段を
含む。本明細書中で用いる場合、「データ保存手段(data storage means)」とは
、本発明のヌクレオチド配列情報を保存し得るメモリー、あるいは本発明のヌク
レオチド配列情報をその上に記録された製品にアクセスし得るメモリーアクセス
手段を指す。 【０４６６】 本明細書中で用いる場合、「検索手段(search means)」とは、標的配列または
標的構造モチーフをデータ保存手段内に保存された配列情報と比較するためにコ
ンピューターベースシステムで実行される１つまたはそれ以上のプログラムを指
す。検索手段は、特定の標的配列または標的モチーフと適合する既知の配列の断
片または領域を同定するために用いられる。種々の既知のアルゴリズムが公的に
開示されており、検索手段を実行するための種々の市販のソフトウェアが本発明
のコンピューターベースシステムで用いられ、また用いられ得る。このようなソ
フトウェアの例としては、Smith-Waterman、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）
、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＡ（ＮＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＩＡ）が挙げら
れるが、これらに限定されない。ホモロジー検索を実行するための利用可能なア
ルゴリズムおよび実行ソフトウェアパッケージのいずれもが、本発明のコンピュ
ーターベースシステムで使用するために適応され得ると当業者は容易に認識し得
る。本明細書中で用いる場合、「標的配列(target sequence)」とは、６または
それ以上のヌクレオチドあるいは２またはそれ以上のアミノ酸の任意の核酸また
はアミノ酸配列であり得る。標的配列が長いほど、データベース中のランダム発
生として存在する標的配列は短いと思われると当業者は容易に認識し得る。標的
配列の最も好ましい配列長は、約１０〜１００アミノ酸または約３０〜３００ヌ
クレオチド残基である。しかしながら商業的に重要な断片、例えば遺伝子発現お
よびタンパク質プロセシングに関与する配列断片に関する検索は短い長さのもの
であり得るということは十分認識されている。 【０４６７】 本明細書中で用いる場合、「標的構造モチーフ(a target structural motif)
」または「標的モチーフ(target motif)」とは、任意の合理的に選択された配列
または配列の組合せを指すが、この場合、配列は標的モチーフのフォールディン
グ時に形成される三次元立体配置を基礎にして選択される。当該技術分野で既知
の種々の標的モチーフが存在する。タンパク質標的モチーフとしては、酵素活性
部位およびシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。核酸標的モチ
ーフとしては、プロモーター配列、ヘアピン構造および誘導可能発現要素（タン
パク質結合配列）が挙げられるが、これらに限定されない。 【０４６８】 ５．１４ 発現調節配列 ＥＭＦ配列は、それらがＯＲＦに近接していることにより、ゲノム内で同定さ
れ得る。任意のＯＲＦから採取される約１０〜２００ヌクレオチド長の遺伝子間
セグメントまたは遺伝子間セグメントの断片は、天然結合ＯＲＦ配列で見出され
るのと同様の様式で、操作可能に結合した３’ＯＲＦの発現を調整するであろう
。本明細書中で用いる場合、「遺伝子間セグメント(intergenic segment)」とは
、本明細書に記載された２つのＯＲＦ間に存在するゲノムの断片を指す。あるい
はＥＭＦは、本発明のコンピューターベースシステム中の標的配列または標的モ
チーフとして既知のＥＭＦを用いて同定され得る。 【０４６９】 ＥＭＦの存在および活性は、ＥＭＦトラップベクター(EMF trap vector)を用
いて確証され得る。ＥＭＦトラップベクターは、マーカー配列に対するクローニ
ング部位５’を含む。マーカー配列は、同定可能な表現型，例えば抗生物質耐性
または補足栄養要求性因子をコードするが、これはＥＭＦトラップベクターが適
切な条件下で適切な宿主内に置かれた場合に、同定されまたはアッセイされ得る
。上記のように、ＥＭＦは操作可能に連結されたマーカー配列の発現を調整する
であろう。種々のマーカー配列についてのさらに詳細な考察は、以下に提供され
る。ＥＭＦであると疑われる配列が、ＥＭＦトラップベクター中のマーカー配列
から上流の１つまたはそれ以上の制限部位の３つのリーディングフレームすべて
でクローニングされる。次にベクターは既知の手法を用いて適切な宿主中で形質
転換され、形質転換した宿主の表現型が適切な条件下で検査される。上記のよう
に、ＥＭＦは、操作可能に連結されるマーカー配列の発現を調節するであろう。 【０４７０】 ５．１５ 三重螺旋形成 さらに、本発明の断片は、広範に記載されたように、三重螺旋形成またはアン
チセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を制御するために用いられ得るが
、この両方の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡとのポリヌクレオチド配列の結合に基
づいている。これらの方法に用いるのに適したポリヌクレオチドは、通常は２０
〜４０塩基長であり、転写に関与する遺伝子の領域（三重螺旋−Lee ら, Nucl.
Acids Res. 6:3073(1979); Cooney ら, Science 15241:456(1988);およびDervan
ら, Science 251:1360(1991)参照）と、あるいはｍＲＮＡそれ自体（アンチセ
ンス−Olmno, J. Neurochem. 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antise
nse Inhibitors of Gene Expression, CRC Press. Boca Raton, FL(1988)）と相
補的であるようデザインされる。三重螺旋形成は最適にＤＮＡからのＲＮＡ転写
の遮断を生じるが、一方、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションは、ポリ
ペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を遮断する。両技術は、モデル系において有効
であることが実証されている。本発明の配列中に含まれる情報は、アンチセンス
または三重螺旋オリゴヌクレオチドのデザインに必要である。 【０４７１】 ５．１６ 診断アッセイおよびキット 本発明は、適切な標識と任意に結合されるかそうでなければ付随する本発明の
核酸プローブまたは抗体を用いて、試験試料中の本発明のＯＲＦまたはその同族
体のうちの１つの存在または発現を同定するための方法をさらに提供する。 【０４７２】 一般に、本発明のポリヌクレオチドを検出するための方法は、複合体を形成す
るのに十分な期間、ポリヌクレオチドとの複合体と結合してそれを形成する化合
物を試料と接触させ、かつ複合体を検出し、その結果複合体が検出されると、本
発明のポリヌクレオチドが試料中に検出される。このような方法は、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下で、試料を、このような条件下で本発明
のポリヌクレオチドとアニーリングする核酸プライマーと接触させ、かつアニー
リングしたポリヌクレオチドを増幅させることを含み、その結果ポリヌクレオチ
ドが増幅されると、本発明のポリヌクレオチドが試料中に検出される。 【０４７３】 一般に、本発明のポリペプチドを検出するための方法は、試料を、複合体を形
成するのに十分な期間、ポリペプチドとの複合体を結合してそれを形成する化合
物と接触させ、かつ複合体を検出し得るものであり、その結果、複合体が検出さ
れると、本発明のポリペプチドが試料中に検出される。 【０４７４】 詳細には、このような方法は、試験試料を、本発明の１つまたはそれ以上の抗
体または１つまたはそれ以上の核酸プローブとともにインキュベートし、試験試
料内の構成成分との核酸プローブまたは抗体の結合に関してアッセイすることを
含む。 【０４７５】 核酸プローブまたは抗体を試験試料とともにインキュベートするための条件は
、多様である。インキュベーション条件は、アッセイに用いられるフォーマット
、用いられる検出方法、ならびにアッセイに用いられる核酸プローブまたは抗体
の種類および性質に依存している。一般的に利用可能なハイブリダイゼーション
、増幅または免疫学的アッセイフォーマットのいずれもが、本発明の核酸プロー
ブまたは抗体を用いるために容易に適応され得る、と当業者は認識するであろう
。このようなアッセイの例は、Chard, T., An Introduction to Radioimmunoass
ay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The N
etherlands(1986); Bullock, G.R. ら, Techniques in Immunocytochemistry, A
cademic Press, Orlando, FL Vol. 1(1982), Vol. 2(1983), Vol. 3(1985); Tij
ssen, P., Practice and Theory of immunoassays: Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterd
am, The Netherlands(1985)において見出され得る。本発明の試験試料としては
、細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物、あるいは生物学的流体、例えば唾液
、血液、血清、血漿または尿が挙げられる。上記の方法に用いられる試験試料は
、アッセイフォーマット、検出方法の性質、ならびにアッセイされる試料として
用いられる組織、細胞または抽出物に基づいて変わるであろう。細胞のタンパク
質抽出物または膜抽出物の製造方法は当該技術分野で既知であり、利用される系
と適合性である試料を得るために、容易に適応され得る。 【０４７６】 本発明の別の実施態様では、本発明のアッセイを実行するために必要な試薬を
含むキットが提供される。具体的には、本発明は、（ａ）本発明のプローブまた
は抗体のうちの１つを含む第１の容器、ならびに（ｂ）１つまたはそれ以上の以
下の：洗浄試薬、結合プローブまたは抗体の存在を検出可能な試薬を含む１つま
たはそれ以上の容器、を備える１つまたはそれ以上のをぴったり閉じ込めて受け
入れるためのコンパートメントキット(compartment kit)を提供する。 【０４７７】 詳細には、コンパートメントキットは、試薬が別々の容器中に含まれる任意の
キットを含む。このような容器としては、小型ガラス容器、プラスチック容器、
あるいはプラスチックまたは紙の細片が挙げられる。このような容器は、試料お
よび試薬が交差汚染されないように、また各容器の物質または溶液がある区画か
ら別の区画に定量的方式で添加され得るように、ある区画から別の区画に試薬を
効率的に移すことを可能にする。このような容器は、試験試料を受容するであろ
う容器、アッセイに用いられる抗体を含む容器、洗浄試薬（例えばリン酸緩衝生
理食塩水、トリス緩衝液等）を含む容器、ならびに結合抗体またはプローブを検
出するために用いられる試薬を含む容器を含む。検出試薬の種類としては、標識
核酸プローブ、標識二次抗体、または代替物では、一次抗体が標識される場合、
標識抗体と反応することが可能な酵素試薬または抗体結合試薬が挙げられる。本
発明の開示されたプローブおよび抗体が、当該技術分野で既知である確立された
キットフォーマットの１つに容易に組入れられ得ると当業者は容易に認識するで
あろう。 【０４７８】 ５．１７ 医学的画像処理 本発明の新規のポリペプチドおよび結合パートナーは、本発明の分子を発現す
る部位の医学的画像処理に有用である（例えば本発明のポリペプチドが免疫応答
に関与する場合に、炎症または感染の部位を画像処理するために）（例えば米国
特許第５，４１３，７７８号（Kunkel等）参照）。このような方法は、標識また
は画像処理剤の化学的結合、被験者への薬学的に許容可能な担体中の標識ポリペ
プチドの投与、ならびに標的部位でのインビボ標識ポリペプチドの画像処理を含
む。 【０４７９】 ５．１８ スクリーニングアッセイ 本発明の単離タンパク質およびポリヌクレオチドを用いて、本発明はさらに、
配列番号１〜９、１１、１２、３１または３３で記述されるヌクレオチド配列の
いずれかに対応するＯＲＦによりコードされるポリペプチドと結合するか、ある
いはその核酸によりコードされるポリペプチドの特定ドメインと結合する物質を
取得および同定する方法を提供する。詳細には、上記の方法は、 （ａ）物質を、本発明のＯＲＦによりコードされる単離タンパク質または本発
明の核酸と接触させる工程、および （ｂ）物質が上記のタンパク質または上記の核酸と結合するか否かを確定する
工程 を含む。 【０４８０】 したがって、一般に本発明のポリヌクレオチドと結合する化合物を同定するた
めのこのような方法は、ポリヌクレオチド／化合物複合体を形成するのに十分な
時間、化合物を本発明のポリヌクレオチドと接触させ、かつポリヌクレオチド／
化合物複合体が検出される場合には、本発明のポリヌクレオチドと結合する化合
物が同定されるよう複合体を検出する。 【０４８１】 したがって同様に、一般に本発明のポリペプチドと結合する化合物を同定する
ためのこのような方法は、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時
間、化合物を本発明のポリペプチドと接触させ、およびポリペプチド／化合物複
合体が検出される場合には、本発明のポリヌクレオチドと結合する化合物が同定
されるよう複合体を検出する。 【０４８２】 本発明のポリペプチドと結合する化合物を同定するための方法は、化合物を、
ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間、細胞中の本発明のポリ
ペプチドと接触させること（この場合、複合体は細胞中の受容体遺伝子配列の発
現を駆動する）、および受容体遺伝子配列発現を検出することにより複合体を検
出し、その結果ポリペプチド／化合物複合体が検出されると、本発明のポリペプ
チドと結合する化合物が同定される。 【０４８３】 このような方法により同定される化合物としては、本発明のポリペプチドの活
性を調節する（即ち、化合物の非存在下で観察される活性に対して、その活性を
増大または低減する）化合物が挙げられる。あるいは、このような方法により同
定される化合物としては、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する（即ち、
化合物の非存在下で観察される発現レベルに対して、発現を増大または低減する
）化合物が挙げられ得る。化合物、例えば本発明の方法により同定される化合物
は、活性／発現を調節するそれらの能力に関して、当業者に既知の標準アッセイ
を用いて試験され得る。 【０４８４】 上記のアッセイでスクリーニングされる物質は、ペプチド、炭水化物、ビタミ
ン誘導体、またはその他の薬学的物質であるが、これらに限定されない。物質は
、ランダムに選択およびスクリーニングされ得るか、あるいはタンパク質モデリ
ング技法を用いて合理的に選択またはデザインされ得る。 【０４８５】 ランダムスクリーニングに関しては、ペプチド、炭水化物、薬学的物質等のよ
うな物質は無作為に選択され、本発明のＯＲＦによりコードされるタンパク質と
結合するそれらの能力に関してアッセイされる。あるいは物質は、合理的に選択
またはデザインされ得る。本明細書中で用いる場合、物質は、特定のタンパク質
の立体配置に基づいて選択される場合、「合理的に選択またはデザインされる(r
ationally selected and designed)」と言われる。例えば、合理的にデザインさ
れた抗ペプチドペプチド（例えばHurby ら, Application of Synthetic Peptide
s: Antisense Peptides,” In Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H.Free
man, NY(1992), pp.289-307およびKaspczak ら, Biochemistry 28:9230-8(1989)
参照）あるいは薬学的物質等を生成するために、特定ペプチド配列と結合可能な
ペプチド、薬学的物質等を生成するための一般に利用可能な手法を当業者は容易
に適用し得る。 【０４８６】 上記のほかに、本発明の物質の一クラスは、広範に記載されるように、本発明
のＯＲＦまたはＥＭＦのうちの１つとの結合により遺伝子発現を制御するために
用いられ得る。前記のように、このような物質は、ランダムにスクリーニングさ
れ得るか、または合理的にデザイン／選択され得る。ＯＲＦまたはＥＭＦのター
ゲティングは、配列特異的または要素特異的物質を当業者がデザインし、発現対
照に対して、同一ＥＭＦに頼る単一ＯＲＦまたは多重ＯＲＦの発現を調節するこ
とを可能にする。一クラスのＤＮＡ結合物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡとの結合に
より三重螺旋形成をハイブリダイズまたは形成する塩基残基を含む物質である。
このような物質は、古典的ホスホジエステルリボ核酸主鎖に基づき得るか、ある
いは塩基結合能力を有する種々のスルフヒドリルまたは高分子誘導体であり得る
。 【０４８７】 これらの方法に用いるのに適した物質は一般に、２０〜４０塩基を含有し、転
写に関与する遺伝子の領域（三重螺旋−Lee ら, Nucl. Acids Res. 6:3073(1979
); Cooney ら, Science 241:456(1988);およびDervan ら, Science 251:1360(19
91)参照）と、あるいはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Okano, J. Neurochem. 56
:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expres
sion, CRC Press. Boca Raton, FL(1988)）と相補的であるようデザインされる
。三重螺旋形成は任意にＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、一方、アン
チセンスＲＮＡハイブリダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻
訳を阻止する。両技術は、モデル系において有効であることが実証されている。
本発明の配列中に含まれる情報は、アンチセンスまたは三重螺旋オリゴヌクレオ
チドおよび他のＤＮＡ結合物質のデザインに必要である。本発明のＯＲＦの１つ
によりコードされるタンパク質と結合する物質は、ＯＲＦによりコードされるタ
ンパク質の活性を調節することにより、細菌感染の制御において、診断薬として
用いられ得る。本発明のＯＲＦの１つによりコードされるタンパク質と結合する
物質は、薬学的組成物を生成するための既知の技法を用いて配合され得る。 【０４８８】 ５．１９ プローブとしての核酸の使用 本発明の別の態様は、天然に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能
なポリペプチド特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することであ
る。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド配列の配列番号
１〜９、１１、１２、３１または３３のいずれかから得られる。対応する遺伝子
が限定数の組織でのみ発現されるため、ヌクレオチド配列の配列番号１〜９、１
１、１２、３１または３３のいずれかから得られるハイブリダイゼーションプロ
ーブは、試料中のこのような組織の細胞型のＲＮＡの存在の指標として用いられ
得る。 【０４８９】 任意の適切なハイブリダイゼーション技法、例えばインシトゥハイブリダイゼ
ーションが用いられ得る。米国特許第４，６８３，１９５号および第４，９６５
，１８８号に記載されたようなＰＣＲは、ヌクレオチド配列に基づいたオリゴヌ
クレオチドに関するさらなる用途を提供する。ＰＣＲに用いられるこのようなプ
ローブは、組換え体由来のものであり得るか、化学的に合成され得るか、あるい
は両者の混合物であり得る。プローブは、同一配列の検出のための別個のヌクレ
オチド配列、あるいは密接に関連したゲノム配列の同定のための考え得る配列の
縮重プールを含む。 【０４９０】 核酸のための特異的ハイブリダイゼーションプローブを生成するためのその他
の手段としては、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中への核酸配列のク
ローニングが挙げられる。このようなベクターは当該技術分野で既知であり、市
販されており、Ｔ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのような適切なＲＮＡポリ
メラーゼおよび適切な放射能標識ヌクレオチドの付加により、インビトロでＲＮ
Ａプローブを合成するために用いられ得る。ヌクレオチド配列は、それらのそれ
ぞれのゲノム配列をマッピングするためのハイブリダイゼーションプローブを構
築するために用いられ得る。本明細書中で提供されるヌクレオチド配列は、既知
の遺伝子および／または染色体マッピング技法を用いて、染色体または染色体の
特定領域にマッピングされ得る。これらの技法としては、インシトゥハイブリダ
イゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析、既知の染色体に特異的
なライブラリーまたはフロー分別染色体調製物を用いたハイブリダイゼーション
スクリーニング等が挙げられる。染色体展開物の蛍光インシトゥハイブリダイゼ
ーションの技法は、他の箇所でも特に、Vermaら(1988) Human Chromosomes: A M
anual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, NYに記載されている
。 【０４９１】 染色体調製物の蛍光インシトゥハイブリダイゼーションおよびその他の物理的
染色体マッピング技法は、さらなる遺伝子地図データと相関し得る。遺伝子地図
データの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981f)に見出され得る。物
理的染色体地図上の核酸の位置と特定の疾患（または特定の疾患に対する素因）
の間の相関は、その遺伝病に関連したＤＮＡの領域を限定するのに役立ち得る。
本発明のヌクレオチド配列は、正常、担体または罹患個体間の遺伝子配列の差を
検出するために用いられ得る。ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術の既知の
方法を用いて精製ポリペプチドを生成するために用いられ得る。単離された後の
遺伝子の発現に関する方法を教示する多数の出版物の１つが、Goeddel (1990) G
ene Expression Technology, Methods and Enzymology, Vol 185, Academic Pre
ss, San Diegoである。ポリペプチドは、原核生物または真核生物の種々の宿主
細胞中で発現され得る。宿主細胞は、特定ポリペプチドヌクレオチド配列が単離
される同一種から、あるいは異なる種由来であり得る。組換えＤＮＡ技術により
ポリペプチドを製造する利点としては、精製のための適量のタンパク質が得られ
ること、ならびに単純化した精製手法の利用可能性が挙げられる。 【０４９２】 ５．２０ シーケンシングチップおよびアレイの調製 基本例は、２０×２０ｃｍアレイを得るために組合され得る３ｘ３ｍｍの寸法
のチップを生じるよう５０μｍ表面に結合された６量体を用いることである。別
の例は、５×５ｍｍの寸法を有する９量体チップを作製するために、１０×１０
μｍ表面に結合させた９量体オリゴヌクレオチドを用いることである。４０００
ユニットのこのようなチップは、３０×３０ｃｍアレイを作製するために用いら
れ得る。あるアレイでは、４，０００〜１６，０００個のオリゴチップが方形ア
レイに整列される。プレート、または管の集団は、描写されたように、シーケン
シングキットの一部としてアレイとともに包装され得る。 【０４９３】 アレイは、互いに物理的に、または疎水性表面により分離され得る。疎水性ス
トリップ分離(hydrophobic strip separation)を利用するための考え得る一方法
は、QA Laboratories, Toronto, Canadaにより製造されたイソ−グリッド微生物
学系(Iso-Grid Microbiology System)のような技術を用いることである。 【０４９４】 疎水性グリッド膜フィルター（ＨＧＭＦ）は、約１０年間、分析食品微生物学
で使用されてきたが、この場合、それらは、コロニーの広域数値範囲および自動
化された計測で独特の魅力がある。市販グリッドの１つは、QA Laboratories Lt
d.(Toronto, Canada)からのIso-Grid（登録商標）であり、これは正方形（６０
×６０ｃｍ）のポリスルホンポリマー（Gelman Tufryn ＨＴ−４５０、０．４５
ミクロン孔径）からなり、その上に、１６００（４０×４０）方形セルからなる
黒色疎水性インクグリッドが印刷される。ＨＧＭＦは、真空ろ過により細菌懸濁
液を予め接種されており、選定された分別または選択培地上でインキュベートさ
れる。 【０４９５】 微生物成長が膜上の既知の位置およびサイズのグリッドセルに局限されるため
、ＨＧＭＦは、従来のプレートまたは膜フィルターよりもＭＰＮ装置のように機
能する。Peterkin等（1987）は、これらのＨＧＭＦは、ＨＧＭＦ複製機とともに
用いられる場合、ゲノムライブラリーを増やし、かつ保存するために用いられ得
ると報告した。このような機器のひとつは、ＩＳＯ−ＧＲＩＤの１６００セルの
各々からの成長を複製し、マスターＨＧＭＦの多数のコピーを作製させる（Pete
rkin ら, 1987）。 【０４９６】 Sharpe等（1989）も、ＩＳＯ−ＧＲＩＤ ＨＧＭＦ（QA Laboratories）およ
び自動ＨＧＭＦカウンター（ＭＩ−１００ インタープリター）ならびにＲＰ−
１００複製機を用いた。彼等は、多数の微生物培養を維持およびスクリーニング
するための技法を報告した。 【０４９７】 Peterkin等は、後に、疎水性グリッド−膜フィルターを用いてＤＮＡプローブ
をスクリーニングする方法を記載した（Peterkin ら, 1989）。彼等は、ＨＧＭ
Ｆ上での直接的な有効コロニーハイブリダイゼーション法を報告した。従来、Ｈ
ＧＭＦがプリントされるエポキシスルホンポリマーの低ＤＮＡ結合能力のために
、十分な結果は得られていない。しかしながらPeterkin等（1989）は、ＤＮＡと
の接触前に、ポリエチレンイミン複製し、およびポリカチオンとともにインキュ
ベートしたＨＧＭＦを処理することにより、膜の表面へのＤＮＡの結合が改良さ
れることを報告した。この初期研究は細胞ＤＮＡ付着を用い、本発明に対して異
なる目的を有したが、記載された方法は、フォーマット３ＳＢＨに関して容易に
適用され得る。 【０４９８】 有用な配列を迅速に同定するために、Peterkin等（1989）は、種々のクローン
からの放射能標識プラスミドＤＮＡを用いて、調製されたＨＧＭＦ上のＤＮＡに
対するその特異性を試験した。この方法で、組換えプラスミドからのＤＮＡは、
容易に且つ再現可能的に調製され得るＨＧＭＦ複製物上の１００個の生物体に対
するコロニーハイブリダイゼーションにより迅速にスクリーニングされた。 【０４９９】 小型（２〜３ｍｍ）チップを用いた操作、ならびに数千もの反応の並行実施。
本発明の溶液は、対応するアレイ中のチップおよびプローブを保持するためであ
る。一例において、２５０，０００個の９−ｍｅｒを含むチップは、間に１ｍＭ
の溝を有する８×１２フォーマット（９６個のチップ）で整列された８×８ｍＭ
プレート（１５Ｍ／オリゴヌクレオチド、Pease ら, 1994）の形態でシリコンウ
エファー上で合成される。プローブは、マルチチャネルピペットまたはピンアレ
イにより、１チップ上に１プローブで添加される。４０００個の６量体すべてを
採点するためには、異なるものを用いて、または１組のチップアレイを数回再使
用することにより、４２個のチップアレイが用いられねばならない。 【０５００】 上記の場合、適用の初期命名法を用いると、Ｆ＝９、Ｐ＝６およびＦ＋Ｐ＝１
５である。チップは、式ＢｘＮｎ（式中、ｘは特定塩基Ｂの数であり、ｎは非特
定塩基の数である。したがってｘ＝４〜１０およびｎ＝１〜４）のプローブを有
する。より効率的ハイブリダイゼーションを達成するために、および任意の指示
オリゴヌクレオチドの考え得る影響を回避するために、特定塩基は非特定塩基に
取り囲まれ、したがって（Ｎ）ｎＢｘ（Ｎ）ｍのような式で表される。 【０５０１】 ５．２１ 支持結合オリゴヌクレオチドの調製 オリゴヌクレオチド、即ち小核酸セグメントは、自動オリゴヌクレオチド合成
機を用いて一般的に実施されるように、例えば化学的手段によりオリゴヌクレオ
チドを直接合成することにより、容易に調製され得る。 【０５０２】 支持結合オリゴヌクレオチドは、任意の適切な支持体、例えばガラス、ポリス
チレンまたはテフロン（登録商標）を用いて、当業者に既知の方法のいずれかに
より調製され得る。一つのストラテジーは、標準合成機により合成されるオリゴ
ヌクレオチドを精確にスポッティングすることである。固定化は、受動的吸着（
Inouye & Hondo, 1990）を用いて、ＵＶ光（Nagata ら, 1985; Dahlen ら, 1987
; Morriey & Collins, 1989）を用いて、または塩基修飾ＤＮＡの共有結合（Kel
ler ら, 1988; 1989）により達成され得る（これらの記載内容は、参照により本
明細書中に援用される）。 【０５０３】 用いられ得る別のストラテジーは、リンカーとしての強力なビオチン−ストレ
プトアビジン相互作用の使用である。例えば、Broude等(1994)はビオチン化プロ
ーブの使用を記載するが、これらは二重鎖プローブであり、ストレプトアビジン
被覆磁気ビーズ上に固定される。ストレプトアビジン被覆ビーズは、Dynal, Osl
oから購入され得る。もちろん、この同一リンキングケミストリー(same linking
chemistry)は、ストレプトアビジンを用いて任意の表面を被覆するために適用
可能である。ビオチン化プローブは、種々の供給元、例えばOperon Technologie
s (Alameda, CA)から購入され得る。 【０５０４】 Nunc Laboratories (Naperville, IL)も、用いられ得る適切な物質を販売して
いる。Nunc Laboratoriesは、ＤＮＡが、CovalinkＮＨと呼ばれるマイクロウェ
ル表面に共有結合され得る方法を開発した。CovaLinkＮＨは、第二アミノ基（＞
ＮＨ）でグラフト化されたポリスチレン表面であり、さらなる共有結合のための
架橋ビーズとして役立つ。CovaLink Modulesは、Nunc Laboratoriesから購入さ
れ得る。ＤＮＡ分子は、ホスホルアミデート結合により５’末端で専らCovaLink
と結合して、１ｐｍｏｌより多いＤＮＡの固定化を可能にし得る（Rasmussen ら
, 1991）。 【０５０５】 ５’末端でのＤＮＡ分子の共有結合のためのCovaLinkＮＨストリップ(CovaLin
k NH strip)の使用が記載されている（Rasmussen ら, 1991）。この技法におい
ては、ホスホルアミデート結合が用いられる（Chu ら, 1983）。これは、単一共
有結合のみを用いる固定化が好ましいので、有益である。ホスホルアミデート結
合は、２ｎｍ長スペーサーアームを介してポリスチレン表面に共有結合的にグラ
フトされたスペーサーアームの末端に置かれるCovaLinkＮＨ第二アミノ基にＤＮ
Ａを連結する。ホスホルアミデート結合を介してCovaLinkＮＨにオリゴヌクレオ
チドを連結するためには、オリゴヌクレオチド末端は５’末端ホスフェート基を
有さねばならない。ビオチンがCovaLinkＮＨと共有結合され、次にプローブを結
合するためにストレプトアビジンが用いられることは、恐らくは考えられる。 【０５０６】 特に連結方法は、水中にＤＮＡを溶解し（７．５ｎｇ／μｌ）、９５℃で１０
分間変性させ、氷上で１０分間冷却することを含む。氷冷０．１Ｍの１−メチル
イミダゾール、ｐＨ７．０（１−ＭｅＩｍ₇）を、次に最終濃度１０ｍＭの１−
ＭｅＩｍ₇に添加する。次にＡｓｓＤＮＡ溶液をCovaLinkＮＨストリップ中に分
取して（７５μｌ／ウェル）、氷上で放置する。 【０５０７】 １０ｍＭの１−ＭｅＩｍ₇中に溶解されたカルボジイミド０．２Ｍ １−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）を新たに
作り、ウェル当たり２５ｕｌを添加する。ストリップを５０℃で５時間インキュ
ベートする。インキュベーション後、例えばNunc-Immuno洗浄液を用いてストリ
ップ(strip)を洗浄し、まずウェルを３回洗浄し、次にそれらを洗浄溶液に５分
間浸漬して、最後にそれらを３回洗浄する（この場合、洗浄溶液は，５０℃に加
熱した０．４ＮのＮａＯＨ、０．２５％のＳＤＳである。）。 【０５０８】 本発明とともに用いるためのさらに適切な方法は、国際特許公開第９０／０３
３８２号（Southern & Maskos）（この記載内容は、参照により本明細書中に援
用される）に記載されたものであることが意図される。支持体に結合されたオリ
ゴヌクレオチドを調製するこの方法は、ヌクレオシド３’試薬を、共有ホスホジ
エステル結合によりホスフェート基を介して、支持体に保有される脂肪族ヒドロ
キシル基に結合することを含む。次にオリゴヌクレオチドは、支持ヌクレオシド
上で合成され、支持体からオリゴヌクレオチドを切断しない標準条件下で合成オ
リゴヌクレオチド鎖から保護基を除去する。適切な試薬としては、ヌクレオシド
ホスホルアミデートおよびヌクレオシド水素ホスホレートが挙げられる。 【０５０９】 ＤＮＡプローブアレイの調製のためのＤＮＡプローブの調製のために、オンチ
ップストラテジー(on-tip strategy)が用いられ得る。例えば、取り扱い可能な
レーザー活性化光脱保護化が、Fodor等（1991）（この記載内容は、参照により
本明細書中に援用される）により記載されたように、直接ガラス表面でオリゴヌ
クレオチドの化学合成に用いられ得る。プローブも、Van Ness等（1991）により
記載されたようにナイロン支持体上に固定され得るか、あるいはDuncan & Caval
ier（1988）の方法を用いてテフロンに結合される（これらの記載内容はすべて
、参照により本明細書中に援用される）。 【０５１０】 Van Ness等（1991）により記載されたようにナイロン支持体にオリゴヌクレオ
チドを連結するためには、アルキル化によるナイロン表面の活性化、ならびにシ
アヌル酸塩化物によるオリゴヌクレオチドの５’アミンの選択的活性化を要する
。 【０５１１】 支持結合オリゴヌクレオチドを調製するための特定の一方法は、Pease等（199
4、この記載内容は、参照により本明細書中に援用される）により記載された光
発生合成を利用することである。これらの著者等は、固定化オリゴヌクレオチド
プローブのアレイ（ＤＮＡチップ）を生成するための一般的写真平版技法を用い
た。高密度でオリゴヌクレオチドプローブの合成を指図するために光が用いられ
るこれらの方法は、アレイを小型化し、光不安定性５’−保護したＮ−アシル−
デオキシヌクレオシドホスホルアミダイト、表面リンカーケミストリーおよびバ
ーサタイルコンビナトリアル合成ストラテジーを利用する。２６５個の空間的に
規定されたオリゴヌクレオチドプローブはこのようにして生成され、次に本明細
書中に記載したように、有益なフォーマット３シーケンシング(Format 3 sequen
cing)に用いられる。 【０５１２】 ５．２２ 核酸試薬の調製 シーケンシングされる核酸は、任意の適切な供給源、例えばｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、超薄切断染色体バンド、コスミドまたはＹＡＣ挿入物お
よびＲＮＡ、例えばｍＲＮＡから、増幅過程を伴わずに得られる。例えばSambro
ok ら(1989)は、哺乳動物細胞からの高分子量ＤＮＡの単離のための３つのプロ
トコルを記載する（p.9.14-9.23）。 【０５１３】 ＤＮＡ断片は、Ｍ１３、プラスミドまたはラムダベクター中でクローンとして
調製され、および／またはＰＣＲまたはその他の増幅方法によりゲノムＤＮＡま
たはｃＤＮＡから直接調製され得る。試料は、マルチウェルプレート中に調整さ
れるか、または分取され得る。約１００〜１０００ｎｇのＤＮＡ試料が、２〜５
００ｍｌの最終体積で調製され得る。 【０５１４】 次に、当業者に既知の方法のいずれかにより、例えばSambrook ら(1989)の9.2
4-9.28に記載されたような制限酵素を用いて、超音波およびＮａＯＨ処理により
剪断することにより、核酸が断片化される。 【０５１５】 Schriefer等（1990、この記載内容は、参照により本明細書中に援用される）
により記載されたように、低圧剪断も適切である。この方法では、ＤＮＡ試料は
、種々の低〜中圧で、小フレンチプレッシャーセル(small French pressure cel
l)に通される。レバー装置が、セルへの低〜中圧の制御適用を可能にする。これ
らの試験の結果は、低圧剪断が、超音波および酵素ＤＮＡ断片化法の有用な代替
法であることを示す。 【０５１６】 ＤＮＡの断片化のための特に適切な一方法は、Fitzgerald等（1992）により記
載された２つの塩基認識エンドヌクレアーゼＣｖｉＪＩを用いるよう意図される
。これらの著者等は、ショットガンクローニングおよびシーケンシングに適切で
あるよう彼等が意図した特定サイズへのＤＮＡの迅速な断片化および分別のため
のアプローチを記載した。本発明者は、これが、本発明のシーケンシング技法に
用いるための、無作為ではあるが相対的に小型のＤＮＡの断片を生成するために
特に有用であることも意図する。 【０５１７】 制限エンドヌクレアーゼＣｖｉＪＩは、普通はＧおよびＣ間の認識配列ＰｕＧ
ＣＰｙを切断して、平滑末端を残す。この酵素（ＣｖｉＪＩ^**）の特異性を変え
る非典型的反応条件は、ＤＮＡ断片の準ランダム分布を生じ、小分子ｐＵＣ１９
（２６８８塩基対）を形成する。Fitzgerald等（1992）は、迅速ゲルろ過法によ
りサイズ分別され、末端修復を用いずにｌａｃＺ−Ｍ１３クローニングベクター
と直接連結されたｐＵＣ１９のＣｖｉＪＩ^**消化物を用いて、この断片化ストラ
テジーのランダム性を定量的に評価した。７６個のクローンの配列分析は、Ｃｖ
ｉＪＩ^**がＰｕＧＣＰｙ部位のほかにｐｙＧＣＰｙおよびＰｕＧＣＰｕを制限す
ること、および新規の配列データがランダム断片化と一致する速度で蓄積される
ことを示した。 【０５１８】 文献に報告されているように、音波処理およびアガロースゲル分別と比較した
場合のこのアプローチの利点は、少量のＤＮＡを要する（２〜５μｇの代わりに
０．２〜０．５μｇ）、およびより少ない過程が関与する（予備連結、末端修復
、化学的抽出またはアガロースゲル電気泳動および溶離を必要としない）ことで
ある。これらの利点は、フォーマット３によるシーケンシングのためにＤＮＡを
調製する場合にも有用であることが提唱されている。 【０５１９】 核酸断片が得られるかまたは調製される方法とは関係なく、ＤＮＡを変性して
、ハイブリダイゼーションに利用可能な一本鎖小片を生成することが重要である
。これは、ＤＮＡ溶液を８０〜９０℃で２〜５分間インキュベートすることによ
り達成される。次に溶液を２℃に急速冷却して、それらがチップと接触される前
に、ＤＮＡ断片の再結合を防止する。ホスフェート基は、当該技術分野で既知の
方法によりゲノムＤＮＡから除去されねばならない。 【０５２０】 ５．２３ ＤＮＡアレイの調製 支持体、例えばナイロン膜上にＤＮＡ試料をスポッティングすることにより、
アレイが調製され得る。スポッティングは、金属ピン（その位置はマイクロタイ
タープレート中のウェルのアレイに対応する）のアレイを用いて実施し、約２０
ｎｌのＤＮＡ溶液をナイロン膜に転写することにより反復し得る。オフセットプ
リンティングにより、ウェルの密度より高いドット密度を達成する。使用される
標識の種類によって、１ｍｍ²に１〜２５ドットが収容される。いくつかの予備
選定番号の横列および縦列のスポッティングを避けることにより、別個のサブセ
ット（サブアレイ）が形成され得る。１つのサブアレイ中の試料は異なる個体か
らのＤＮＡの同一ゲノムセグメント（または同一遺伝子）であり得るか、あるい
は異なる重複ゲノムクローンであり得る。サブアレイの各々は、同一試料のレプ
リカスポッティングを示し得る。一例では、選定遺伝子セグメントは、６４例の
患者から増幅され得る。各患者に関しては、増幅遺伝子セグメントは、１つの９
６ウェルプレート中に存在し得る（９６ウェルはすべて、同一試料を含む）。６
４例の患者の各々に関するプレートが調製される。９６ピン装置を用いることに
より、全試料が８×１２ｃｍ膜上にスポッティングされ得る。サブアレイは、各
患者から１つの、６４個の試料を含有し得る。９６個のサブアレイが同一である
場合、ドットスパンは１ｍｍ²であり、サブアレイ間に１ｍｍの間隙が存在する
。 【０５２１】 別のアプローチは、物理的スペーサー、例えば膜上に成形されたプラスチック
グリッドにより分配され、グリッドは、マルチウェルプレートの底、または疎水
性ストリップに適用される膜の種類と類似する。固定された物理的スペーサーは
、平坦リン蓄積スクリーンまたはＸ線フィルムへの曝露による画像処理のために
は好ましくない。 【０５２２】 本発明を、以下の実施例で説明する。本発明の開示内容を考慮すれば、本発明
の範囲で多数のその他の実施形態ならびに変更がなされ得ることを当業者は理解
するであろう。したがって、本発明のより広範な態様は、以下の実施例の開示に
限定されるよう意図されない。本発明は、本発明の単一態様の説明として意図さ
れる例示的実施形態による範囲に限定されるべきではなく、機能的に等価である
組成物および方法は、本発明の範囲内である。実際、本発明の好ましい実施形態
を考察すれば、本発明の実施に際して多数の修正および変更が生じることが、当
業者には予測される。したがって本発明の範囲を限定し得るのは、特許請求の範
囲に示されたものだけである。 【０５２３】 本明細書の本文内に引用された参考文献はすべて、それらの記載内容が、参照
により本明細書中に援用される。 【０５２４】 ６．０ 実施例 実施例１ ヒト細胞のｃＤＮＡライブラリーからの配列番号１〜７の単離 複数の新規核酸は、標準ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション配列サイン分析によ
るシーケンシング、およびサンガーシーケンシング技術(Sanger sequencing tec
hnique)を用いて、ヒト精巣細胞（Ｈｙｓｅｑ クローン識別番号２８８０９８
４および２８８１６９５）、ヒト胎児皮膚（Ｈｙｓｅｑ クローン識別番号１５
３７５１７６）、成人脾臓（Ｈｙｓｅｑ クローン識別番号１４５６０９４）、
およびヒト内皮細胞（Ｈｙｓｅｑ クローン識別番号１３８０４７５６、１３６
８７４８７、１３８０４７５６）から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ら
れた。ライブラリーの挿入物を、挿入物に隣接するベクター配列に特異的なプラ
イマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。これらの試料をナイロン膜上にスポッ
トし、オリゴヌクレオチドプローブに応答させて、配列サインを得た。クローン
は、類似または同一配列のグループに集団化し、ゲルシーケンシングのために、
単一の代表的なクローンを各グループから選択した。次に、典型的なサンガーシ
ーケンシングプロトコルにて、逆Ｍ１３シーケンシングプライマーを用いて、増
幅挿入物の５’配列を推定した。ＰＣＲ産物を増幅して、蛍光色素ターミネータ
ーサイクルシーケンシングを行った。２７７Applied Biosystems(ABI)シーケン
サーを用いて、シングルパスゲルシーケンシングを行った。これらの挿入物は、
このライブラリーからこれまでに得られてなく、また公共のデータベースにもこ
れまで報告されていない新規配列と同定された。これらの配列を、添付した配列
表にて配列番号１〜７と称する。 【０５２５】 実施例２ 配列番号８および９の構築物 本発明の新規核酸（配列番号８および９）は、上記実施例１に記載する方法に
より、ｃＤＮＡライブラリーから得られた配列、および場合によっては１つまた
はそれ以上の公共のデータベースから得られる配列から構築された。配列は、シ
ードとしてＥＳＴ配列（配列番号２）を用いて構築した。次に、帰納的アルゴリ
ズムを用いて、この構築物に属する種々のデータベース（すなわち、ＥＳＴ配列
を含むＨｙｓｅｑのデータベース、ｄｂＥＳＴバージョン１１４、ｂｇ ｐｒｉ
１１４およびＵｎｉＧｅｎｅバージョン１０１）からのさらなる配列を引き出
すことにより、シードＥＳＴを伸長構築物へと伸長した。構築物を伸長するであ
ろう上記データベースからのさらなる配列が存在しないと、アルゴリズムは終結
した。構築物への構成成分配列の含入は、３００よりも大きいＢＬＡＳＴスコア
および９５％より高い同一性％を有する伸長性構築物に対するＢＬＡＳＴＮヒッ
トに基づいている。配列番号８はさらに、配列番号９を得るために手動で編集さ
れた。図１は、配列番号１〜７との配列番号９のアライメントを示す。 【０５２６】 構築配列（配列番号８）に関する最隣接物の結果は、Ｆａｓｔｘｙアルゴリズ
ムを用いて、Ｇｅｎｐｅｐｔリリース１１４に対するＦＡＳＴＡバージョン３検
索により得られた。Ｆａｓｔｙは、コドン内フレームシフトを可能にするＦＡＳ
ＴＡアライメントの改良バージョンである。最隣接物の結果は、Ｇｅｎｐｅｔか
らの各構築物に関する最も近い同族体を示した（また構築物がコードする翻訳ア
ミノ酸配列を含む）。最隣接物の結果を以下に記載する。 【０５２７】 【表１】 【０５２８】 配列番号８に関する予想アミノ酸配列は、翻訳される新規ポリヌクレオチドの
既知のポリヌクレオチドに対する比較に基づいて、ポリペプチドを選択するＦＡ
ＳＴＹと呼ばれるソフトウェアプログラム（http://fasta:bioch.virginia.edu
から入手可能）を用いることにより得られた（W.R. Pearson, MEthods in Enzym
ology, 183:63-98 (1990)、参照により本明細書に援用される）。 【０５２９】 【表２】 【０５３０】 実施例３ 配列番号１０の構築物 ポリペプチド（配列番号１０）は、以下のように配列番号９によりコードされ
ると予測された。このポリペプチドは、既知のポリヌクレオチドに対する翻訳さ
れる新規ポリヌクレオチドの比較に基づいて、ポリペプチドを選択するＢＬＡＳ
ＴＸと呼ばれるソフトウェアプログラムを用いて予測した。最初のメチオニンは
、配列番号９の位置２９１で開始し、推定上の終止コドンであるＴＡＧは、ヌク
レオチド配列の位置１１０７で始まる。 【０５３１】 実施例４ 幹細胞成長因子様遺伝子のクローニング、ならびに幹細胞成長因子様たんぱく
質の発現および精製 幹細胞成長因子様ポリヌクレオチド（配列番号１１または１２）を、ＰＣＲに
より、Ｈｙｓｅｑの完全長幹細胞成長因子様クローンから、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉ
ｓ ＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター(invitrogen)にクローニングした。幹
細胞成長因子様遺伝子をさらに、ｐＣＤＮＡ３．１−Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター(i
nvitrogen)にサブクローニングし、Ｖ５−Ｈｉｓタグを用いてまたは用いずに発
現させた。製造業者が提唱するプロトコルを用いて、ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ
システム(invitrogen)を用いることにより、Ｈｉｓ−５タグを有する幹細胞成長
因子様遺伝子で、昆虫細胞(high Five, invitrogen)をトランスフェクトした。
以下に記載するようにｐＨ調節、陽イオン交換クロマトグラフィ、およびアフィ
ニティクロマトグラフィの組合せにより、幹細胞成長因子様たんぱく質を細胞培
地から精製した。簡潔に述べると、培地のｐＨを７．０に調節して、プロテアー
ゼ阻害剤ＰＭＳＦおよびＥＤＴＡを添加した。ＳＰ−セファロースファストフロ
ー、Ｈｉｔｒａｐヘパリンセファロース、およびＮｉ−ＮＴＡ樹脂の適切な大き
さのカラム上での連続的な混入物除去を用いて、室温にてPharmaciaのＡｋｔａ
計器システム上で、カラムクロマトグラフィ精製を実施した。カラム溶出分画を
、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに上での分離により分析し、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ
膜(Millipore)に転写して、製造業者のプロトコルを使用して、抗Ｖ５抗体によ
りタグ付けしたタンパク質を検出した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムから溶出した幹細胞
成長因子様活性を含む分画をプールして、ＰＢＳで平衡化し、幹細胞成長因子様
活性に関して分析するまで−８０℃で保管した。 【０５３２】 実施例５ 主要ヒト細胞における幹細胞成長因子様たんぱく質の発現 Marathon脾臓ライブラリーからの二次ネストＰＣＲ（nested PCR）の産物（配
列番号１１または１２）、あるいは幹細胞成長因子様ポリペプチドをコードする
任意の他のポリヌクレオチドを、適切な正および逆ＰＣＲプライマーを用いて、
適切なクローニング部位へと、ＭＳＣＶレトロウイルスベクター(Clontech)にク
ローニングした。次にこのレトロウイルスベクターを、ＦＵＧＥＮＥ−６トラン
スフェクション試薬を用いてパッケージング細胞系にトランスフェクトして、中
にクローニングした幹細胞成長因子様ＤＮＡを有するであろう、十分に大量のレ
トロウイルスを産生した。レトロウイルスを含む上清をパッケージング細胞系か
ら調製し、ストローマ細胞または幹細胞と混合した。レトロウイルス形質転換時
に、これらの形質転換細胞は、幹細胞成長因子様たんぱく質を発現し得る。 【０５３３】 実施例６ 共培養アッセイを用いた、幹細胞の成長および分化に関するアッセイ １×１０⁴個のマウス幹細胞を、無血清培地中で、１×１０⁴個の幹細胞成長因
子様ポリヌクレオチドで形質転換したストローマ細胞またはベクターで形質転換
したストローマ細胞（実施例５により作製される）と共培養した。７日目に、Ｉ
Ｌ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）をさらなる成長因
子として添加した。培養液を毎日顕微鏡でモニターした。さらなる適切なインキ
ュベーション後、細胞を収集し、血球計を用いて計数した。１つ実験からの結果
を以下の表に示す。 【０５３４】 【表３】 【０５３５】 実施例７ 幹細胞増殖および分化に関するアッセイ ＣＤ３４⁺造血幹細胞（ＨＳＣ）を、動員末梢血（ALLCellsから購入）から精
製した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ(Miltenyi)を用いて細胞を正選択することによ
り、ＣＤ３４⁺細胞は精製された。９６ウェルプレート中で、１０³／ウェルで幹
細胞を平板培養した。幹細胞成長因子活性を評価するために、培養液に、精製幹
細胞成長因子様タンパク質および他の造血サイトカイン（R&D systemsから購入
）、ならびにそれらの組合せを添加した。幹細胞の成長および分化を、光学顕微
鏡により、培養の５日後に検査した。６つの実験の結果を以下の表に示し、６つ
の実験のうち３つで幹細胞成長因子たんぱく質の正の効果が観察された。 略記：幹細胞成長因子様たんぱく質＝ＳＣＧＦ、インターロイキン−３＝ＩＬ−
３、トロンボポエチン＝ＴＰＯ、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３リガンド＝ｆｌ
ｔ−３リガンド、 （＋）は、幹細胞の成長および／または分化を示し、（−）は、幹細胞の成長も
しくは分化を示さず、かつその生存度の損失を示す。 【０５３６】 【表４】 【表５】【表６】 【０５３７】 実施例８ マウスＡＧＭから得られるストローマ細胞株の樹立 （１）胎児マウスからのＡＧＭ領域の単離 雄雌両方のＣ３Ｈ／ＨｅＮＳＬマウス（Japan SLC INC.から購入）をＳＰＦ（
特定病原体フリー）環境下にて飼育した。１匹または２匹の雌マウスおよび１匹
の雄マウスを同じケージの中に一晩にわたって飼育した。次の朝、膣栓の存在が
確認される雌マウスを別のケージに移して、飼育した。膣栓の存在が確認された
日を妊娠の０．５日目と定義した。妊娠の１０．５日目に、頚部脱臼によりマウ
スを屠殺した後、胎児を摘出した。ＡＧＭ領域の単離は、Godin らによる方法に
従って実施した(Godin, I., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:773-777, 199
5)、胎児を培養皿に載せて、そこにＰＢＳ（−）（リン酸緩衝生理食塩水）（Ni
ssui Seiyakuにより製造）を、胎児を覆う十分量で添加した。立体顕微鏡の下で
、他の領域を含まないように慎重にＡＧＭ領域を切除し、それらを別の２４ウェ
ル培養皿(Nunc)に入れた。 【０５３８】 （２）ＡＧＭから得られる細胞系の樹立 １０％ＦＣＳ(Hyclone)を含有するＭＥＭ培地(Sigma)一滴を、２４ウェル培養
皿(Nunc)中のＡＧＭ領域に添加して、インキュベーター中で一晩、ＡＧＭ領域を
培養した。５％ＣＯ₂の雰囲気下にて、湿度１００％で、３７℃にて１０％ＦＣ
Ｓ(Hyclone)を含むＭＥＭ培地(Sigma)中で培養を行った。ＡＧＭ領域に相当する
細胞が、一晩の培養後培養皿に接着したときに、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭ
培地２ミリリットルをさらに添加した。ストローマ細胞は、連続培養後、ＡＧＭ
領域組織断片周辺に出現し始めた。１週間の培養後、接着細胞をトリプシン処理
し（０．５３ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中の０．０５％トリプシン(Gibco
BRL)、３７℃にて３〜５分間）、分散させた。次にストローマ細胞を培地で２
回洗浄し、６ウェル培養皿(Nunc)上に播種した。翌日、培養皿に接着しなかった
細胞、および培地を除去し、続いて新鮮な培地を添加した。移してから２週間後
、６ウェル培養皿中の細胞を９００Ｒａｄでγ線照射し、内因性造血細胞を排除
した。この培養系からの限界希釈による直接細胞クローニングの試みは失敗し、
従って細胞増殖は観察されなかった。次に、以下に従った試みを行った。１つの
ウェル中で播種細胞を増加させることにより、少数の細胞から増殖することがで
きるように細胞を適応させた後、細胞を限界希釈によりクローニングした。 【０５３９】 換言すると、ＡＧＭを上述と同じ様式で適切および培養した。γ線照射２週間
後の培養系をトリプシン処理し（０．５３ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中の
０．０５％トリプシン(Gibco BRL)、３７℃にて３〜５分間）、細胞を懸濁させ
て、その結果細胞を２４ウェル培養皿に、５０〜１００細胞／ウェルの範囲で播
種した。培養を３週間続けた後、０．３細胞／ｍｌとなるように、限界希釈を用
いて、９６ウェル培養皿(Nunc)中に細胞を播種した。十分に播種した単一の細胞
に由来し、増殖した細胞について、培養を拡大させた。結果として、細胞は首尾
よくクローニングされ、線維芽細胞様細胞および敷石様細胞を得た。 【０５４０】 ヒト臍帯血から得られるＣＤ３４陽性細胞分画を、線維芽細胞様細胞と２週間
共培養させた。線維芽細胞様細胞との共培養系には、コロニー形成細胞は見られ
なかった。次に、同様の検査を、敷石様の形態型を示す７つの細胞クローンに関
して実施した。ヒト造血幹細胞を増殖および支持する活性を有する３つのクロー
ンが得られ、これをＡＧＭ−ｓ１、ＡＧＭ−ｓ２、およびＡＧＭ−ｓ３と命名し
た。 【０５４１】 マウス骨髄からの造血幹細胞の調製 Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１ｐｅｐ（８〜１０週齢、雄）（Professor K. Nak
auchi, University of Tsukubaから寄贈）の大腿から骨髄を収集し、ＰＢＳ中に
懸濁させた。常法 (S. Kouzu, Fundamental techiniques for immunology, YODO
SHA, 1995) に従って、比重遠心分離により、マウス骨髄の単核球を濃縮した後
、細胞を染色緩衝液（５％ＦＣＳおよび０．０５％ＮａＮ³を含有するＰＢＳ）
を用いて懸濁した。 【０５４２】 最も未熟な造血幹細胞分画を以下のように得た(Osawa, M. ら, Science 273:2
42-245, 1996)。 【０５４３】 単核球を、ビオチン化抗血統モノクローナル抗体（ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４、ＣＤ
８、Ｇｒ−１、Ｔｅｒ１１９、およびＣＤ１１ｃ、Pharmingenから購入）、フル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−抗−ＣＤ３４、フィコエリトリン
（ＰＥ）−抗Ｓｃａ−１、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−抗Ｃ−Ｋｉｔ
と、氷上で２０分間インキュベートした。染色した細胞を染色緩衝液で２回洗浄
し、ＣＤ３４陰性、Ｓｃａ−１陽性、ｃ−Ｋｉｔ陽性、およびＬｉｎ陰性細胞(L
in negative cell)を、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇａｅ(Becton Dickinson)上で単
離した。 【０５４４】 マウスストローマ細胞株のサブクローニング、および様々な細胞株の、造血幹
細胞を支持する活性の評価 （１）マウスストローマ細胞株のサブクローニング １）ＡＧＭ−ｓ３サブクローンの単離 非働化１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清、Hyclone）を含むＭＥＭα培地(GIBCO BR
L)中に継代培養したＡＧＭから得られるストローマ細胞株ＡＧＭ−ｓ３を、５％
ＦＣＳを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＦＣＳ）中に懸濁した。細胞選別機(ＦＡＣ
Ｓ Ｖａｎｔａｇｅ、Becton Dickinson)を用いて、１細胞／ウェルで、９６ウ
ェル培養皿(Falcon)中で、クローン選別を行った。９６ウェル中の細胞のうち、
増殖した細胞の培養を拡張し、その結果１３種のＡＧＭ−ｓ３サブクローンが得
られた。これらのＡＧＭ−ｓ３サブクローンの、造血細胞を支持する活性を評価
した。 【０５４５】 ２）ヒト臍帯血ＣＤ３４陽性幹細胞の単離 ヒト臍帯血は、キリンビール株式会社医薬探索研究所倫理委員会の基準に準拠
し、正常分娩時に採取した。凝固しないようにヘパリンを添加したシリンジを用
いて臍帯血を収集した。ヘパリン処理した臍帯血をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ(NYCOM
ED PHARMA)上に重層し、遠心分離（４００Ｇで、室温にて３０分間）により、単
核球を分離した。単核球細胞分画中に混入した赤血球を、室温で２分間の塩化ア
ンモニウム緩衝溶液（０．８３％ＮＨ₄Ｃｌ−トリスＨＣｌ、２０ｍＭ、ｐＨ６
．８）処理により溶解させた。単核球をＰＢＳ−ＦＣＳで洗浄した後、ヒトＩｇ
Ｇ１０ミリグラムを添加して、氷上に１０分間静置させた。次に、細胞をＰＢＳ
−ＦＣＳでさらに洗浄して、ヒト分化血球に特異的な抗原に対するビオチン化抗
体、すなわちＣＤ２、ＣＤ１１ｃ（ATCCハイブリドーマから精製）、ＣＤ１９(P
harmingen)、ＣＤ１５およびＣＤ４１(Leinco Technologies Inc.)、ならびにグ
リコホリンＡに対する抗体(Cosmo Bio)を添加して、氷上に２０分間静置させた
。ＰＢＳ−ＦＣＳで洗浄した後、５％ＦＣＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．
０５％ ＮａＮ₃を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＦＣＳ−ＥＤＴＡ−ＮａＮ₃）１ミ
リリットル中に懸濁し、ストレプトアビジン(BioMag. Per Septive Diagnostics
)を結合させたビーズを添加して、氷上に４０分間静置させた。分化抗原を発現
する分化血球を、磁気分離機を(Dynal MPC-1 Dynal)を用いて除去した。残存す
る分化血球抗原ネガティブ細胞分画に、ＦＩＴＣ標識ＣＤ３４抗体(Immunotech
S.A., Marseilles, France)を添加した。氷上で２０分間のインキュベーション
後、細胞選別機を用いてＣＤ３４陽性分画を回収した。この細胞分画を、ヒト臍
帯血から得られる造血幹細胞分画と定義した。 【０５４６】 ３）ヒト造血幹細胞およびＡＧＭ−ｓ３サブクローンの共培養 １３種のＡＧＭ−ｓ３サブクローンまたはマウス骨髄から得られるストローマ
細胞株ＭＳ−５を、１×１０⁴細胞／ウェルで２４ウェル培養皿(Falcon)に播種
した後、細胞がウェルの底面全部を覆うまで、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα
培地１ミリリットル中で細胞を培養した。ヒト臍帯血から得られるＣＤ３４陽性
造血幹細胞を、５００細胞／ウェルで上述のストローマ細胞上に振り分けて、１
０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα培地１ミリリットル中で共培養した。共培養を開
始して１週間後、同じ培地１ミリリットルをさらに添加した。共培養を開始して
２週間後、ストローマ細胞およびヒト臍帯血細胞をトリプシン処理し（０．５Ｍ
ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中の０．０５％トリプシン(GIBCO BRL)中、３７℃
にて２〜５分間静置）、培養皿から分散させた。コロニーアッセイを行い、造血
幹細胞を維持する活性を評価した。 【０５４７】 ４）クローン原性アッセイによる造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状態の
評価 上記共培養系中で増殖した細胞を適切に希釈して、メチルセルロース培養系１
ミリリットルに添加して、三連で分析した。メチルセルロース培養系を用いた分
析は、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ、ヒトＩＬ−３、ヒトＩＬ−６、ヒトＧ−Ｃ
ＳＦ、ヒトＴＰＯ、および２ＩＵ／ｍｌのＥＰＯ存在下にて、６ウェル培養皿(F
alcon)でＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４２３０(Stem Cell Technologies Inc.)を用
いて行った。様々な上記造血因子は全て組換え体であり、純粋なものであった。
２週間の培養の後、顕微鏡の下で、出現したコロニーを観察して、ＣＦＵ−ＧＭ
（顆粒球マクロファージ分化シリーズ）、ＢＦＵ−Ｅ（赤血球バースト形成ユニ
ット）、およびＣＦＵ−Ｅミックス（赤血球混合分化シリーズ）の数を計数した
。 【０５４８】 図４は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞およびＡＧＭ−ｓ３サブクローンＡ９、Ａ７
、またはＤ１１の２週間の共培養から得られた結果を示す。共培養の結果、１３
種のＡＧＭ−ｓ３サブクローンのうちのＡ９およびＤ１１サブクローンが、ＣＦ
Ｕ−ＧＭ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅミックスの３つの血統すべての増殖を支
持した。特に、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅミックス、すなわち赤血球の前駆細
胞は、通常ほとんど支持されないが、それらは、Ａ９またはＤ１１細胞を用いた
共培養系中で増殖した。上記結果は、Ａ９またはＤ１１細胞と、赤血球の前駆細
胞との共培養中で生じる造血幹細胞または造血前駆細胞の増殖あるいは維持は、
連続して供給されることを示した。対照的に、Ａ７は細胞形態学的にＡ９に類似
しているものの、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、およびＣＦＵ−Ｅミックスを支持
しなかった。 【０５４９】 ５）Ａ９と、マウス胎児から得られるストローマ細胞株ＯＰ９との間のヒト造
血幹細胞を支持する活性の比較 ＡＧＭ−ｓ３Ａ９およびＡ７と、マウス胎児から得られるストローマ細胞株Ｏ
Ｐ９との間の、ヒト臍帯血から得られるＣＤ３４陽性造血幹細胞を支持する活性
の比較は、上述の方法を用いて、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ、およ
びＣＦＵ−Ｅミックスを指標に実施した。図５は、２週間の共培養から得られた
結果を示す。Ａ７細胞培養系では、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ、およびＣＦＵ−
Ｅは著しく減少し、ＣＦＵ−Ｅミックスは、完全に消滅した。対照的に、ＯＰ９
細胞を用いた場合、Ａ９細胞よりも支持能力は劣るものの、ＣＦＵ−Ｅミックス
を含む様々な血球前駆細胞が支持された。したがって、ＯＰ９細胞は、造血幹細
胞を支持する能力を保有することが明確となった。 【０５５０】 （２）上述のストローマ細胞株（ＡＧＭ−ｓ３−Ａ９、ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７、
およびＡＧＭ−ｓ３−Ｇ１）、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３(ATCC)、ＯＰ９(RCB1124, RIKE
N Cell Development Bank)、およびＮＩＨ３Ｔ３(ATCC)を、５×１０⁴細胞／ウ
ェルで、２４ウェル培養皿(Falcon)中に播種した。非働化１０％ＦＣＳ（ウシ胎
児血清、Hyclone）を含有するＭＥＭα培地(GIBCO BRL)中で１日培養し、細胞が
ウェルの底面全部を覆うまで増殖させた。次に、培地を新たな培地１ミリリット
ルと取り換えて、実施例９で得られた（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１から得られ
る）マウス造血幹細胞３０個ずつそれぞれの細胞層上に振り分けて、共培養を開
始した。 【０５５１】 培養７日目、細胞をトリプシン処理し（０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢ
Ｓ中の０．０５％トリプシン(GIBCO BRL)、３７℃にて２〜５分間）、分散させ
て、培養皿上の細胞を回収した。各細胞株について回収した全細胞、および２０
０，０００細胞での全骨髄細胞（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙｓ５．２マウスから得ら
れる、Charles River)を、８．５ＧｙのＸ線を照射したＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５
．２マウス（８週齢、雄、Charles River)に、尾の静脈から移植した。移植後、
間隔を置いて眼窩後方洞から末梢血を採血し、ＦＡＣＳにより、Ｃ５７ＢＬ／６
−Ｌｙ５．１由来の細胞数の比を算定した。常法(S. Kouzu, Fundamental Techn
iques for immunology, YODOSHA, 1995)に従って、末梢血を分析した。赤血球を
溶解するために、蒸留水３５０μＬを末梢血５０μＬに添加して、３０秒間静置
させた。次に、２倍濃度のＰＢＳを添加して、遠心分離し、白血球を回収した。
染色緩衝液（５％ＦＣＳおよび０．０５％ＮａＮ₃を含有するＰＢＳ）を用いて
細胞を一度洗浄した後、抗ＣＤ１６抗体、ＦＩＴＣで標識したＬｙ５．１（ＣＤ
４５．１）抗体、フィコエリトリンで標識したＧｒ−１およびＣＤ１１ｃ抗体、
んならびにアロフィコシアニンで標識したＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２２０）およびＣＤ
９０（Ｔｈｙ１）抗体（これら全て、Pharmingenから購入した）を添加した。こ
れらの細胞を氷上で３０分間反応のために静置させた後、それらを染色緩衝液で
洗浄し、ＦＡＣＳ分析を行った。 【０５５２】 造血幹細胞培養中の再構成能を有する細胞数の増幅は、移植後、Ｇｒ−１また
はＣＤ１１ｃ陽性細胞（骨髄性細胞）中のＬｙ５．１陽性細胞、あるいはＣＤ９
０またはＣＤ４５Ｒ陽性細胞（リンパ球系細胞）中のＬｙ５．１陽性細胞の比率
を間隔を置いて算定することにより評価した。 【０５５３】 図６に結果を示す。細胞をＡＧＭ−ｓ３−Ａ９、ＯＰ９、およびＳｗｉｓｓ３
Ｔ３細胞と共培養すると、ドナー細胞の高いキメラ現象が移植後維持された。し
たがって、これらのストローマ細胞を、造血幹細胞を支持する高度な活性を有す
るとみなした。対照的に、細胞をＡＧＭ−ｓ３−Ａ７、ＡＧＭ−ｓ３−Ｇ１、お
よびＮＩＨ３Ｔ３細胞と共培養すると、移植された細胞の高度なキメラ現象は観
察されなかった。したがって、これらの細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞
を支持する活性が低かった。 【０５５４】 実施例１１ ＩＳＯＧＥＮ(Nippon gene, Japan)２０ｍＬ中に溶解した１．４×１０⁸個の
細胞のＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞から全ＲＮＡを添付文書に従って調製した。ｍＲ
ＮＡ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ(Amersham Pharmacia, U.S.A.)を用いて
、添付のプロトコルに従って、全ＲＮＡ１ミリグラムから、メッセンジャーＲＮ
Ａを精製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍ(GIBCO Lif
etech, U.S.A.)を用いて準備したオリゴ−ｄＴにより、このｍＲＮＡからｃＤＮ
Ａを合成し、ｐＳＰＯＲＴ１(GIBCO Lifetech, U.S.A.)に挿入した。ＳＢＨ法(H
yseq, U.S.A.)を用いて、このライブラリーよりＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞に特異
的なｃＤＮＡクローンを取得した。クローンのヌクレオチド配列は、ＡＢＩ３７
７ＤＮＡシーケンサー(Perkin Elmer, U.S.A.)を用いて決定された。取得した配
列を、ホモロジー検索により分析した結果、その遺伝子は、新規遺伝子ＳＣＲ−
１と同定された。得られたヌクレオチド配列は、配列番号３１のヌクレオチド番
号１０３２〜１４８４であった。 【０５５５】 実施例１２ マウスＳＣＲ−１の全クローニング ＩＳＯＧＥＮ(Nippon gene, Japan)２０ｍＬ中に溶解した１．４×１０⁸個の
ＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞から全ＲＮＡを添付文書に従って調製した。ｍＲＮＡ
ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ(Amersham Pharmacia, U.S.A.)を用いて、添付
のプロトコルに従って、全ＲＮＡ１ミリグラムから、メッセンジャーＲＮＡを精
製した。ＳＭＡＲＴｃＤＮＡ ＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＫｉｔ
(CLONTECH, U.S.A.)を用いて、添付文書に従い調製したｍＲＮＡ２ｍｇからｃＤ
ＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーには、全体で４００，０００種
の独立したクローンを含んでおり、１５の分画に分けられた。ＳＣＲ−１ ｃＤ
ＮＡクローンを含む分画を、以下の条件を用いてＰＣＲにより同定した。 【０５５６】 以下のプライマーは、実施例１１のＰＣＲで得られる遺伝子断片配列に基づい
て合成した、鋳型としてＡＧＭ−ｓ３−Ａ９ ｃＤＮＡライブラリーの各分画を
用いて、３５サイクルでＰＣＲを実施し、一サイクルは、９４℃で３０秒間、５
５℃で３０秒間、および７２℃で１分間で実施される工程であった。 ＳＣＲ−１Ｆ１：ＡＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＣ（配列番号３５
） ＳＣＲ−１Ｒ１：ＴＧＡＧＴＣＴＡＣＡＧＴＡＡＣＣＴＣＧＣＡ（配列番号３６
） 【０５５７】 ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動し、予想されるサイズのＰＣＲ
産物の分画を同定した。２つのポジティブ分画を直径１５ｃｍのペトリ皿に５０
，０００プラークで播種し、各分画を２つのペトリ皿に播種した。３７℃にて１
０時間、皿をインキュベートした後、各プラークをＢｉｏｄｙｎｅナイロンフィ
ルター(Pall, U.S.A.)に転写した。添付書類に従って、ナイロンフィルター上の
ＤＮＡを固定化した。³²Ｐ標識ＤＮＡプローブを用いて、スクリーニングを行っ
た。 【０５５８】 以下のようにしてプローブを調製した。ＳＣＲ−１Ｒ１およびＴ７プライマー
（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ）（配列番号３７）、ならびに鋳
型として実施例１１で得られる遺伝子断片を含むプラスミドを用いて、３５サイ
クルでＰＣＲを実施し、一サイクルは、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、
および７２℃で１分間で実施される工程であった。ＰＣＲ産物を２％アガロース
ゲルにて電気泳動し、ＪＥＴＳＯＲＢ(GENOMED Ger.)を用いて増幅断片を精製し
た。Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ標識キット(Amersham Pharmacia U.S.A.)および鋳型と
して精製ＰＣＲ断片２５ｎｇを用いて³²Ｐ標識ＤＮＡプローブを調製した。 【０５５９】 添付書類に従って、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＳｏｌｕｔｉｏｎ(CLONTEC, U.S.A.
)を用いたハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った。Ｘ線フィルム(Fuji Pho
to Film Co. Ltd., Japan)をハイブリダイズさせたナイロンフィルターに１日感
光させて、富士フィルム自動現像装置を用いて現像した。分析した結果に基づい
て、強く感光したスポットに相当するプラークをペトリ皿からかき取った。約２
００プラークを生成するように、そのプラークを再び直径１０ｃｍのペトリ皿上
に播種した。上述の方法に従ってスクリーニングを行い、その結果単一プラーク
を単離した。ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ ＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔの添付書類に従って、得られたファージクローンをエシェリヒア・コリＢ
Ｍ２５．８株に導入し、それはエシェリヒア・コリＢＭ２５．８株にてインビボ
で切除された。アンピシリン５０ｍｇ／ｍＬを添加したＬＢ寒天培地上で、トラ
ンスフェクトしたエシェリヒア・コリを、コロニーが形成されるまで培養した。
アンピシリン５０ｍｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地３ミリリットル中に、単一コロ
ニーを播種し、３０℃で一晩培養した。ＲＰＭキット(BIO101, U.S.A.)を用いて
、プラスミド約１０ｍｇを培養細胞から精製した。λＴｒｉｐｌＥｘ５’ＬＤ−
Ｉｎｓｅｒｔ Ｓｃｒｅｅｉｎｇ Ａｍｐｌｉｍｅｒ（ＣＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧ
ＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＧＧＴ：CLONTECH, U.S.A、配列番号３０）を用いて
、挿入断片の両端の配列を決定した。そのクローンは、配列番号３１の１から始
まるヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを含んでいることがわかった。ＡＢＩ３
７７ＤＮＡシーケンサーを用いて、挿入ｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列を決定し
た後、配列番号３１のヌクレオチド配列を確認した。上記ヌクレオチド配列から
予測されるアミノ酸配列を、配列番号３１および配列番号３２に示した。 【０５６０】 配列番号３１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含むプラスミドは、２００
０年６月２６日に、産業技術総合研究所の生命工学技術研究所（郵便番号３０５
−８６５５、日本国茨城県つくば市東１−１−３）に国際的に寄託し、登録番号
としてＦＥＲＭ ＢＰ−７１９８が付与された。 【０５６１】 実施例１３ ヒトＳＣＲ−１のクローニング マウスＳＣＲ−１のヌクレオチド配列に基づいて、Ｂｌａｓｔを用いてGenBan
k(NCBI, U.S.A.)にデータベースを検索した。マウスＳＣＲ−１との相同ヌクレ
オチド配列が見出された（アクセッション番号ＡＩ８７２１３３およびＡｗ３１
６５６２）。以下のプライマーは、ヒト由来の配列を用いて合成された。 ｈ７８２Ｆ１：ＴＣＧＣＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＧ（配列番号
３８） ｈ７８２Ｆ２：ＡＧＣＡＣＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＴＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧ
Ｔ（配列番号３９） ｈ７８２Ｒ１：ＣＴＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣ
Ｔ（配列番号４０） ｈ７８２Ｒ２：ＴＧＧＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＣＣＣＴＡＣＴＡＧＡＴＡＴＡＣＣ
Ｔ（配列番号４１） 【０５６２】 オリゴ−ｄＴプライマーおよび逆転写酵素(SuperscriptII, GIBCO-BRL)を用い
て、胎盤および骨格筋由来のｍＲＮＡ(CLONTECH, U.S.A.)３μｇからｃＤＮＡを
合成した。鋳型としてこのｃＤＮＡ、プライマーとしてｈ７８７Ｆ１、ｈ７８２
Ｆ２、ｈ７８２Ｒ１またはｈ７８２Ｒ２、およびＰｌａｔｉｎｕｍ ＰｆｘＤＮ
Ａポリメラーゼ(GIBCO Lifetech, U.S.A.)を用いて、ＰＣＲを実施した。結果と
して、各器官由来の増幅断片が得られた。それらのうち、胎盤から得られるＰＣ
Ｒ断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター(invitrogen, U.S.A.)に連結し、その遺伝
子をエシェリヒア・コリＤＨ５ａに導入した。次に、アンピシリン１００ｍｇ／
ｍｌを含有するＬＢ寒天培地上に、導入したエシェリヒア・コリを播種し、その
結果コロニーが形成された。単離した１６個のコロニーそれぞれを、ＰＣＲ溶液
１０ｍｌに添加して、９４℃で５分間処理した。次に、３５サイクルでＰＣＲを
実施し、サイクルは、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１
分間で実施される工程であった。Ｔ７プライマーまたはＳＰ６プライマー（ＧＡ
ＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ）（配列番号４２）をプライマーとして
最終濃度０．２ｍＭで使用した。ＰＣＲ産物に対して２％アガロースゲル電気泳
動を施した。増幅断片を確認した後、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーを用いて
、３つの確認した断片の配列を決定した。得られたｃＤＮＡのヌクレオチド配列
（配列番号３３）は、マウスＳＣＲ−１の配列に対してヒトオーソロガスである
ことが確認された。 【０５６３】 配列番号３３のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含むプラスミドは、２００
０年６月２６日に、産業技術総合研究所の生命工学技術研究所（郵便番号３０５
−８６５５、日本国茨城県つくば市東１−１−３）に国際的に寄託し、登録番号
としてＦＥＲＭ ＢＰ−７１９７が付与された。 【０５６４】 マウスＳＣＲ−１およびヒトＳＣＲ−１に関して、確立されたデータベースを
検索すると、未知の機能を有するヒト遺伝子配列が見出された（国際特許公開第
９８／４９３０２号）。これらの遺伝子のコード領域の相同性を第１表に示す。
相同性の比較は、ＤＮＡＩＳ−Ｍａｃバージョン３．７のホモロジー検索機能を
用いて、ソフトウェアのデフォルト設定（核酸モード：Ｎｏｒｍａｌ、レンジ：
Ａｌｌ（１〜８１９塩基）、カットオフ：４５、Ｋｔｕｐ：２）を用いて計算し
て実行した。この方法では、高相同性領域のみが計算に用いられ、末端に位置す
る低相同性領域は計算から排除される。 【０５６５】 【表７】 【０５６６】 ヒトＳＣＲ−１および未知の機能を有する遺伝子は、コード領域中の開始コド
ンから２６６番目のコドンの最初のヌクレオチド（配列番号３３のヌクレオチド
番号１０５４）まで同一のヌクレオチドを有していた。しかしながら、それらの
下流の配列は一致しなかった。未知の機能を有するこの遺伝子中のこの非同一性
領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４５および配列
番号４６に示した。配列番号４５の最初のヌクレオチドは、配列番号３３のヌク
レオチド番号１０５４に相当し、これらは一致した。両遺伝子における配列番号
３３中の５６７番目のヌクレオチドに相当する位置で、一ヌクレオチドは一致し
なかった。 【０５６７】 実施例１４ ＳＣＲ−１の発現領域の研究 実施例１３で使用したプローブを用いて、ノーザンブロット解析を行った。ヒ
トＭＴＮブロットＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、免疫系ＩＩ、マウスＭＴＮブロット(CLONT
ECH, U.S.A.)に関して、ハイブリダイゼーションを行った。供給業者の指示書に
従って、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＳｏｌｕｔｉｏｎ(CLONTECH, U.S.A.)を用いて、
ハイブリダイゼーションを行った。６８℃で２時間のプレハイブリダイゼーショ
ン後、標識プローブを添加した。６８℃で２時間、さらにハイブリダイゼーショ
ンを行った。２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ溶液中で、室温にて３０分間フィル
ターを洗浄し、もう一度繰り返した。さらに、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
溶液中で、５０℃にて３０分間、洗浄を２回行った。バイオイメージング分析機
ＢＡＳ２０００(Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan)を用いて、イメージングプ
レート(Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan)に３時間感光させることにより、ハ
イブリダイゼーションの分析を行った。実施例１３で使用したプローブ、および
ＭＴＮブロット(CLONTECH, U.S.A.)を用いてノーザンブロット技法解析を行って
、ヒトにおけるそれらの発現を検査した。結果として、約２．６ｋｂでのｍＲＮ
Ａの発現が、肝臓、胎盤、骨格筋および子宮を含む多くの器官で確認された。マ
ウスにおいて、約２．６ｋｂでのｍＲＮＡの発現が、同様の器官で確認された。 【０５６８】 実施例１５ ストローマ細胞におけるマウスＳＣＲ−１の発現 （１）マウスＳＣＲ−１の発現用レトロウイルスベクターの構築 ＳＣＲ−１遺伝子中のＯＲＦ配列のみ（配列番号３１中のヌクレオチド番号５
１１〜１３５０のヌクレオチド配列）をレトロウイルスベクターに挿入して、し
たがってストローマ細胞における発現用ベクターを構築した。 【０５６９】 ｍＲＮＡ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ(Amersham Pharmacia, U.S.A.)の
プロトコルに従って、ＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞中の全ＲＮＡ１ミリグラムから、
メッセンジャーＲＮＡを精製した。従来法に従って、このｍＲＮＡからｃＤＮＡ
を合成した。以下のプライマーを合成し、鋳型として上述のｃＤＮＡ、およびＰ
ｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ(GIBCO Lifetech, U.S.A.)を用い
て、３０サイクルでＰＣＲを実施し、一サイクルは、９４℃で２０秒間、５５℃
で３０秒間、および６８℃で１分間で実施される工程であった。 ｍ７８２Ｆ２：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧ
ＡＴＴＴＣ（配列番号４３） ｍ７８２Ｒ２：ＡＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧ
（配列番号４４） 【０５７０】 制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて、増幅断片を消化した。電気泳動
後、ＪＥＴＳＯＲＢ(Genomed, Germany)を用いて、ＤＮＡ断片を精製した。精製
ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベ
クター（Professor T. Kitamura, TOKYO UNIV. INST. OF MEDICAL SCIENCE, Jap
aから寄贈）に連結した。ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ＩＲＥＳ ＧＦＰをレ
トロウイルスベクターｐＭＸに挿入したプラスミドであった。得られた組換えベ
クターをエシェリヒア・コリＤＨ５ａに導入し、アンピシリン１００ｍｇ／ｍｌ
を含有するＬＢ培地上に播種し、その結果独立したコロニーが形成された。アン
ピシリン１００ｍｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地１００ｍＬ中で単離コロニーを培
養した後、ＱＩＡＧＥＮｔｉｐ１００(QIAGEN, U.S.A.)を用いて、プラスミドを
精製した。従来法を用いて、挿入遺伝子の配列を決定した結果、その配列は、配
列番号３１中の対応領域と一致することが確認された。 【０５７１】 （２）ストローマ細胞中へのマウスＳＣＲ−１の導入 最初に、２×１０⁶細胞／皿でＢＯＳＣ２３をコラーゲンタイプＩ被覆６０ｍ
ｍ皿(Asahi technoglass)上に播種し、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中
で、３７℃にて、５％ＣＯ₂の雰囲気下にて湿度１００％で培養した。培養開始
１２〜１８時間後に、培地をＯＰＴＩ ＭＥＭ培地(GIBCO BRL)２ミリリットル
と取り換えた。 【０５７２】 上述のｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰにＳＣＲ−１を挿入したプラスミド３μｇを
、ＯＰＴＩ ＭＥＭ培地１００μＬで希釈したＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬
(GIBCO BRL)１８μｌに添加して、室温で３０分間静置させた。調製したＤＮＡ
溶液を上記で調製したＢＯＳ２３細胞培養溶液に添加した。約５時間後、２０％
ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地(GIBCO BRL)２ミリリットルを添加した。 【０５７３】 ｍＲＮＡの内部部位へのリボソームの接近により、ＩＲＥＳ（Internal Ribos
ome Entry Site）を決定した。したがって、発現ベクター構築において、１つの
転写ユニット内で、ＩＲＥＳにより上流、下流に分離して２種の遺伝子を連結す
ることにより生じる、一つのｍＲＮＡから、２つの遺伝子を発現することができ
る。上述のプラスミドに関して、ＳＣＲ−１のｃＤＮＡを上流に挿入し、ＧＦＰ
（グリーン蛍光タンパク質）を下流に挿入した。したがって、ＦＡＣＳを用いて
ＧＦＰの発現を検出することにより、ＳＣＲ−１の発現をモニターすることがで
きた。 【０５７４】 約２４時間後、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ４ｍｌで培地を取り換えた。
さらに、約４８時間後、培地を収集した。０．４５μ、フィルターを通して培地
を濾過し、濾液を１，２００ｇで１６時間遠心分離し、上清を取り除き、こうし
てウイルス沈殿物が得られた。 【０５７５】 ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞を、１×１０⁴細胞／ウェルで、２４ウェル培養皿(FA
LCON)上で１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα培地(GIBCO BRL)１ミリリットル中で
培養した。１２〜１８時間後、ウイルス沈殿物を、１０％ＦＣＳを含有するＭＥ
Ｍα培地１ミリリットル中に懸濁して、ストローマ細胞培地とウイルス懸濁液を
入れ換えた。次に、ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ(Sigma, SEQUA-BRENE)を１０μｇ／ｍＬ
になるように添加した。培養皿を７００ｇで４５分間遠心分離した後、３７℃に
て、５％ＣＯ₂の雰囲気下にて湿度１００％で、細胞を培養した。４８時間後、
１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭ培地１ミリリットルで培地を取り換えた。２４時
間後、細胞を６ウェル培養皿(FALCON)上に継代播種し、１０％ＦＣＳを含有する
ＭＥＭ培地３ミリリットル中で培養した。継代播種の４８時間後、細胞選別機(F
ACSVantage, Becton Dickinson)を用いて、ストローマ細胞におけるＧＦＰ発現
を検出した結果、８０％以上の細胞がＳＣＲ−１を発現することが間接的に確認
された。 【０５７６】 実施例１６ ＳＣＲ−１遺伝子が過剰発現されたストローマ細胞と、マウス造血幹細胞との
共培養 レトロウイルス感染によりＳＣＲ−１遺伝子で形質転換したＡＧＭ−ｓ３−Ａ
９細胞、ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞、またはＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞を、１×１０⁵ 細胞／ウェルの密度で、２４ウェル培養皿中に播種し、細胞が増殖して、培養
皿の全底面を覆うことができるように、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα培地中
で１日培養した。 【０５７７】 次に、新鮮な培地１ｍｌで培地を取り換えて、実施例９で得られたマウス造血
幹細胞（Ｃ５７／ＢＬ／６−Ｌｙ５．１から得られる）をこの細胞層上に振り分
けて、共培養を開始した。 【０５７８】 培養７日後、共培養中の細胞すべてをトリプシン処理（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ
を含有するＰＢＳ中の０．０５％トリプシン、３７℃で２〜５分間）により収集
し、造血幹細胞および／または前駆細胞の増殖の度合いを以下の実験で分析した
。 【０５７９】 実施例１７ 照射レシピエントマウスへの造血細胞の移植 上述の手法によりＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１マウスから得られる３０個の単
離したての造血幹細胞（ＣＤ３４ネガティブ、Ｓｃａ−１ポジティブ、ｃ−Ｋｉ
ｔポジティブ、Ｌｉｎネガティブな細胞、またはＣ５７ｂＬ／６−Ｌｙ５．１ｐ
ｅｐマウスから得られる細胞）、あるいは３０個の造血幹細胞を用いて開始した
共培養７日目に収集した細胞全体を、８．５ＧｙでＸ線照射した匹のＣ５７ＢＬ
／６−Ｌｙ５．２マウス（８週齢、雄、Charles River）に、Ｃ５７ＢＬ／６−
Ｌｙ５．２マウス(Charles River)から得られる２００，０００個の全骨髄細胞
とともに尾静脈を介して移植した。 【０５８０】 移植後、時間をかけて眼窩後方洞から末梢血を採血し、Ｌｙ５．１造血細胞に
由来する細胞の比率に関して分析した。常法(S. Kouzu, Gundamental Technique
s for immunologym YODOSHA, 1995)に従って、末梢血を分析した。赤血球を溶解
するために、蒸留水３５０μＬを末梢血５０μＬに添加して、蒸留水添加の３０
秒後に、同量の２倍濃縮ＰＢＳを添加し、遠心分離して、白血球を回収した。染
色緩衝液（５％ＦＣＳおよび０．０５％ＮａＮ₃を含有するＰＢＳ）を用いて細
胞を一度洗浄した後、それらを抗ＣＤ１６抗体、ＦＩＴＣ−抗Ｌｙ５．１、ＰＥ
−抗骨髄性細胞（Ｇｒ−１およびＣＤ１１ｃ）およびＡＰＣ−抗リンパ球系細胞
（Ｂ２２２０およびＴｈｙ１）（Pharmingenから購入）で染色し、氷上で３０分
間インキュベートとした。染色緩衝液を用いて染色細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ分析
を行った。 【０５８１】 造血幹細胞の培養中の造血細胞再構成能を有する細胞数の増幅は、移植された
マウスの末梢血中のＧｒ−１またはＣＤ１１ｃポジティブ細胞（骨髄性細胞）中
のＬｙ５．１ポジティブ細胞、あるいはＣＤ９０またはＣＤ４５Ｒポジティブ細
胞（リンパ球系細胞）中のＬｙ５．１ポジティブ細胞の比率を間隔を置いて測定
することにより推定された。 【０５８２】 図７に結果を示す。ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞と共培養した細胞を移植した場合
、培養Ｌｙ５．１造血細胞に由来する高いキメラ現象は観察されなかった。この
結果から、ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞自体は、造血幹細胞または造血前駆細胞を支
持する活性が低いことが実証された。ＳＣＲ−１遺伝子が過剰発現されるＡＧＭ
−ｓ３−Ａ７細胞と共培養した細胞を移植した場合、培養細胞に由来する有意に
高比率の細胞が、末梢血中の骨髄性細胞およびリンパ系細胞の両方で検出された
。したがって、造血幹細胞および造血前駆細胞は、照射マウスの造血系を再構成
することができ、ＳＣＲ−１遺伝子を過剰発現するＡ７ストローマ細胞ににより
支持および増殖されることが明確であった。 【０５８３】 結果として、ＳＣＲ−１は、造血幹細胞又は造血前駆細胞の生存もしくは増殖
を支持する活性もたないストローマ細胞に、上述の活性を付与する機能を有する
ことが明白であった。これらの結果から、ＳＣＲ−１は、造血幹細胞又は造血前
駆細胞の増殖もしくは生存の支持に対して影響を及ぼす活性、あるいは造血幹細
胞を支持する活性をストローマ細胞に付与するようにストローマ細胞に影響を及
ぼす活性を有することが明白であった。 【０５８４】 実施例１８ ＳＣＲ−１トランスジェニックマウス マウスおよびヒトＳＣＲ−１の活性は、トランスジェニックマウスのような遺
伝的に改変したマウスを樹立することにより確認することができる。適切なプロ
モーターは、造血幹細胞成長または生存促進に関する活性が確認され得る配列番
号３１および３３の発現に関して選択される。ＧＡＴＡ−２プロモーターは、非
常に初期の造血幹細胞または前駆細胞集団における遺伝子の発現を駆動する。ト
ランスジェニックマウスにおけるＧＡＴＡ−２プロモーターの調節下にあるＳＣ
Ｒ−１遺伝子（配列番号３１または３３）は、造血幹細胞または前駆細胞に、Ｓ
ＣＲ−１遺伝子を発現させるであろう。造血前駆幹細胞でのこのＳＣＲ−１遺伝
子発現は、造血幹細胞または前駆細胞の増殖を導き、結果として胚、新生児また
は成体変異マウスにおいて造血細胞の増加をもたらすであろう。Minegishi らに
より記載されるＧＡＴＡ−２プロモーターは、この目的で使用され得る(L Biol
Chem. 1998 Feb 6:273(6):3625-34)。 【０５８５】 ＳＣＲ−１遺伝子（配列番号３１または３３）はまた、至るところに存在する
組織で作用するＣＡＧまたは他のプロモーターの制御下にて発現されてもよい(K
iwaki ら Gene Ther, 1996 May 1;7(7):821-30)。これにより、造血細胞ととも
に他の組織細胞型中でのＳＣＲ−１遺伝子発現の効果を決定することが可能とな
る。トランスジェニックマウスは、「マウス胚の操作(Manipulating the Mouse
Embryo)」に記載される方法に従って樹立することができる(Brigid Hogan, Rosa
Beddington, Frank Costantini, Elizabeth Lacy, 1994, Cold Spring Harbor
Laboratory Press)。 【図面の簡単な説明】 【図１】 図１は、配列番号１〜７との配列番号９のアライメントを示す。 【図２】 図２は、幹細胞成長因子様ポリペプチドである配列番号１０とマウストロンボ
スポンジン１型ドメインタンパク質配列番号２５との間のＢＬＡＳＴＰアミノ酸
配列アライメントを示す。これは、２つの配列が配列番号１０のアミノ酸残基１
９〜２５４にわたって６４％の類似性を、かつ配列番号１０の同一アミノ酸残基
１９〜２５４にわたって４７％の同一性を共有することを示す。この場合、Ａ＝
アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェ
ニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン
、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グル
タミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリ
プトファン、Ｙ＝チロシンである。ギャップはダッシュとして示されている。 【図３】 図３は、幹細胞成長因子様ポリペプチドである配列番号１０とヒト分泌タンパ
ク質クローンｄａ２２８＿６タンパク質（国際特許公開第９８／４９３０２号）
配列番号２６との間のＢＬＡＳＴＰアミノ酸配列アライメントを示す。これは、
２つの配列が配列番号１０のアミノ酸残基１〜２６５にわたって１００％の類似
性を、かつ配列番号１０の同一アミノ酸残基１〜２６５にわたって１００％の同
一性を共有することを示す。この場合、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝ア
スパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝
ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、
Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリ
ン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシンである。
ギャップはダッシュとして示されている。 【図４】 図４は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞とＡＧＭ−ｓ３サブクローンＡ９、Ａ７また
はＤ１１細胞の２週間の共培養後のクローン原性(clonogenic)アッセイにより測
定した造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状態を示す。 【図５】 図５は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞とＡＧＭ−ｓ３サブクローンＡ９、Ａ７また
はＯＰ９細胞の２週間の共培養後のクローン原性(clonogenic)アッセイにより測
定した造血幹細胞および造血前駆細胞の増殖状態を示す。 【図６】 図６は、ストローマ細胞と共培養した造血幹細胞を受容した照射レシピエント
マウスにおけるドナー由来リンパ球系統細胞または骨髄系統細胞再構成の時間経
過を示す。 【図７】 図７は、ＳＣＲ−１（ｐＭＸＩＧ−ＳＣＲ−１）を含むベクターまたはＳＣＲ
−１（ｐＭＸＩＧ）を含まないベクターでトランスフェクトしたＡＧＭ−ｓ３−
Ａ７細胞系（Ａ７／ｐＭＸＩＧ−ＳＣＲ−１およびＡ７／ｐＭＸＩＧ）と共培養
した造血幹細胞を受容した照射レシピエントマウスにおけるドナー由来リンパ系
統細胞または骨髄系統細胞再構成の時間経過を示す。 【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 25/00 ４Ｂ０６５ 17/02 29/00 ４Ｃ０８４ 25/00 35/00 ４Ｈ０４５ 29/00 35/02 35/00 37/00 35/02 37/06 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/52 37/06 16/24 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｍ 1/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 5/02 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 5/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 15/09 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＤ 5/00 Ａ 33/566 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｆ Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／７５７，５６２ (32)優先日 平成13年１月９日(2001．1．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２６６，６１４ (32)優先日 平成13年２月５日(2001．2．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドルマナック，ラドジェ ティー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94303 パロ アルト イースト グリーンウィ ッチ プレイス 850 (72)発明者 マイズ，ナンシー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94041 マウンテン ビュー マウンテン ビュ ー アベニュー 662 (72)発明者 西川 光郎 群馬県高崎市宮原町３番地 麒麟麦酒株式 会社 医薬探索研究所内 (72)発明者 カオ，チェン−チ アメリカ合衆国 カリフォルニア 95014 クーパーティノ ポータル プラザ 19980 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 AA19 BA21 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 FA02 GA11 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 FA15 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QS39 QX02 4B064 AG13 AG27 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 BB19 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 AA17 DB52 NA14 ZA012 ZA362 ZA892 ZB012 ZB082 ZB112 ZB262 ZB272 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 DA75 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 幹細胞成長因子活性を有するポリペプチドをコードする単離
   されたポリヌクレオチドであって、配列番号９、１１、１２、３１または３３の
   ヌクレオチド配列またはそれらの成熟タンパク質コード部分、または幹細胞成長
   因子活性を保持するポリペプチドをコードするそれらの断片、類縁体、変異体も
   しくは誘導体を含むポリヌクレオチド。 【請求項２】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列
   番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダ
   イズする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 【請求項３】 配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配
   列と約８５％よりも高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１
   に記載のポリヌクレオチド。 【請求項４】 配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配
   列と約９０％よりも高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１
   に記載のポリヌクレオチド。 【請求項５】 配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配
   列と約９２％よりも高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３
   に記載のポリヌクレオチド。 【請求項６】 前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号４７のヌクレオチド
   配列から構成されない、請求項１、２または３のいずれかに記載のポリヌクレオ
   チド配列。 【請求項７】 配列番号９、１１、１２、３１または３３の成熟タンパク質
   コード配列を含む単離されたポリヌクレオチド。 【請求項８】 配列番号９、１１、１２、３１または３３のヌクレオチド配
   列を含む単離されたポリヌクレオチド。 【請求項９】 （Ａ）配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９
   を含むアミノ酸配列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２
   ７２を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は （Ｂ）配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配
   列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ
   酸配列中に、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは挿入を含むアミノ
   酸配列を有し、かつ造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する
   活性を有するポリペプチド をコードするＤＮＡであって、但しＣ末端アミノ酸配列は、配列番号４６のアミ
   ノ酸配列を含まない、請求項１に記載のＤＮＡ。 【請求項１０】 （ａ）配列番号３１の少なくともヌクレオチド５７４〜１
   ３４７を含むＤＮＡ、又は （ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号３１のヌクレオチド配列または該
   配列から調製されるプローブとハイブリダイズ可能であり、かつ造血幹細胞又は
   造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活性を有するＤＮＡ である、請求項１に記載のＤＮＡ。 【請求項１１】 ストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ／５×デンハルト
   溶液、０．５％ＳＤＳおよび６８℃（ＳＳＣ ３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエ
   ン酸ナトリウム）、５０×デンハルト溶液／１％ＢＳＡ／１％ポリビニルピロリ
   ドン、１％フィコール４００、又は６×ＳＳＣ、５×デンハルト、０．５％ＳＤ
   Ｓ、５０％ホルムアミドおよび４２℃である、請求項１０に記載のＤＮＡ。 【請求項１２】 （ａ）配列番号３３の少なくともヌクレオチド３２１〜１
   ０７４を含むＤＮＡ、又は （ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号３３のヌクレオチド配列または該
   配列から調製されるプローブとハイブリダイズ可能であり、かつ造血幹細胞又は
   造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活性を有するＤＮＡ である、請求項１に記載のＤＮＡ。 【請求項１３】 ストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ／５×デンハルト
   溶液、０．５％ＳＤＳおよび６８℃（ＳＳＣ ３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエ
   ン酸ナトリウム）、５０×デンハルト溶液／１％ＢＳＡ／１％ポリビニルピロリ
   ドン、１％フィコール４００、又は６×ＳＳＣ、５×デンハルト、０．５％ＳＤ
   Ｓ、５０％ホルムアミドおよび４２℃である、請求項１２に記載のＤＮＡ。 【請求項１４】 ＤＮＡである、請求項１、２または３のいずれかに記載の
   ポリヌクレオチド。 【請求項１５】 請求項１、２または３のいずれか１項に記載のポリヌクレ
   オチドの相補体を含む単離されたポリヌクレオチド。 【請求項１６】 請求項１、２または３のいずれか１項に記載のポリヌクレ
   オチドを含むベクター。 【請求項１７】 請求項１、２または３のいずれか１項に記載のポリヌクレ
   オチドを含む発現ベクター。 【請求項１８】 請求項１、２または３のいずれか１項に記載のポリヌクレ
   オチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞。 【請求項１９】 宿主細胞中で請求項１、２または３のいずれか１項に記載
   のポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と操作的に連結された、該ポリヌ
   クレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞。 【請求項２０】 内因性ポリヌクレオチドの発現を増加させる異種調節配列
   を含むように遺伝子操作された、請求項１９に記載の宿主細胞。 【請求項２１】 幹細胞成長因子活性を有するポリペプチドを製造する方法
   であって、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、培地中にて、請求項
   １９に記載の宿主細胞を成長させ、および前記宿主細胞または前記培地から前記
   ポリペプチドを単離する方法。 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法により製造されるポリペプチド。 【請求項２３】 配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配
   列またはそれらの成熟タンパク質部分、または幹細胞成長因子活性を保持するそ
   れらの断片、類縁体、変異体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチド。 【請求項２４】 請求項２のポリヌクレオチドによりコードされる、請求項
   ２３に記載のポリペプチド。 【請求項２５】 配列番号１０、１３、１６、３２または３４のヌクレオチ
   ド配列と約８５％よりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２
   ３に記載のポリペプチド。 【請求項２６】 配列番号１０、１３、１６、３２または３４のヌクレオチ
   ド配列と約９２％よりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２
   ３に記載のポリペプチド。 【請求項２７】 前記ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列から構
   成されない、請求項２３に記載のポリペプチド。 【請求項２８】 配列番号１０、１３、１６、３２または３４の成熟タンパ
   ク質部分を含む単離されたポリペプチド。 【請求項２９】 前記ポリペプチドは、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、膜攻
   撃複合体構成成分／パーフォリンドメイン、および神経下垂体ホルモンシグナチ
   ュアの群から選択される１つまたはそれ以上のモチーフを含む、請求項２３に記
   載のポリペプチド。 【請求項３０】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現産物
   であり、造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する活性を有す
   るポリペプチドであって、但しＣ末端アミノ酸配列は、配列番号４６のアミノ酸
   配列を含まないポリペプチド。 【請求項３１】 配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含
   むアミノ酸配列、又は配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含
   むアミノ酸配列中に、１個又は数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは挿入を含む
   アミノ酸配列を有する、請求項８に記載のポリペプチド。 【請求項３２】 配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含
   むアミノ酸配列、又は配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含
   むアミノ酸配列中に、１個又は数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは挿入を含む
   アミノ酸配列を有する、請求項２３に記載のポリペプチド。 【請求項３３】 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリ
   （Ｎ−ビニル−ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプ
   ロピレンオキシド／エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオ
   ールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択される１つまたはそれ以上
   の修飾剤により修飾される、請求項２３に記載のポリペプチド。 【請求項３４】 配列番号１０または１３由来の少なくとも１０個の連続ア
   ミノ酸を含む、請求項２３に記載のポリペプチド。 【請求項３５】 配列番号１０または１３のＣ末端の１７個のアミノ酸由来
   の少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む、請求項２３に記載のポリペプチド。 【請求項３６】 生物活性を有するポリペプチドであって、少なくとも２７
   ２個のアミノ酸を含み、かつ配列番号１０と少なくとも９８％の同一性を有する
   ポリペプチド。 【請求項３７】 幹細胞成長因子活性を有する単離されたポリペプチドであ
   って、配列番号１０、１３、または１６と少なくとも９０％の同一性を有し、か
   つアミノ酸配列ＧＩＥＶＴＬＡＥＧＬＴＳＶＳＱＲＴＱＰＴＰＣＲＲＲＹＬ（配
   列番号２９）（ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、
   Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ
   ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギ
   ン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオ
   ニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン）を欠くポリペプチド。 【請求項３８】 幹細胞成長因子活性を有する単離されたポリペプチドであ
   って、配列番号１０、１３、または１６と少なくとも９０％の同一性を有し、か
   つアミノ酸配列ＧＩＥＶＴＬＡＥＧＬＴＳＶＳＱＲＴＱＰＴＰＣＲＲＲＹＬ（配
   列番号２９）（ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、
   Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ
   ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギ
   ン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオ
   ニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン）由来の任意の１０個の
   連続アミノ酸を欠くポリペプチド。 【請求項３９】 幹細胞成長因子活性を有する単離されたポリペプチドであ
   って、アミノ酸配列ＳＶＳＶＳＴＶＨ（配列番号２７）またはＶＳＶＳＴＶＨ（
   配列番号２８）（ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸
   、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、
   Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラ
   ギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレ
   オニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン）を有するポリペプチ
   ド。 【請求項４０】 請求項２３〜請求項３９のいずれか１項に記載のポリペプ
   チドをコードするポリヌクレオチド。 【請求項４１】 請求項２３に記載のポリペプチドを含むキット。 【請求項４２】 幹細胞または生殖細胞の生存を維持するか、又はその増殖
   を促進するのに有効な量の請求項２３に記載のポリペプチドを含む培地。 【請求項４３】 請求項２３に記載のポリペプチド、および薬学的に許容可
   能な担体または希釈剤を含む組成物。 【請求項４４】 薬学的組成物である、請求項４３に記載の組成物。 【請求項４５】 造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持す
   る効果を有する薬学的組成物であって、 （Ａ）配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配
   列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ
   酸配列を有するポリペプチド、又は （Ｂ）配列番号３２の少なくともアミノ酸残基２２〜２７９を含むアミノ酸配
   列、もしくは配列番号３４の少なくともアミノ酸残基２２〜２７２を含むアミノ
   酸配列中に、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは挿入を含むアミノ
   酸配列を有し、かつ造血幹細胞又は造血前駆細胞の増殖もしくは生存を支持する
   活性を有するポリペプチド を含む、請求項４４に記載の薬学的組成物。 【請求項４６】 請求項２３に記載のポリペプチドに結合する抗体。 【請求項４７】 配列番号１０、１３、１６、３２または３４のアミノ酸配
   列を有するポリペプチドに特異的に結合する、請求項１９に記載の抗体。 【請求項４８】 配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合
   しない、請求項２０に記載の抗体。 【請求項４９】 ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、キ
   メラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１９に記載の抗体。 【請求項５０】 請求項１７に記載の抗体を含むキット。 【請求項５１】 試料中の請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する方
   法であって、 ａ）前記ポリヌクレオチドに結合して複合体を形成する化合物と、前記試料と
   を、前記複合体を形成するのに十分な時間接触させ、 ｂ）前記複合体を検出し、 を含み、その結果複合体が検出されると、前記ポリヌクレオチドが検出される、
   前記方法。 【請求項５２】 試料中の請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する方
   法であって、 ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にある前記試料を、か
   かる条件下で前記ポリヌクレオチドにアニーリングする核酸プライマーと接触さ
   せ、 ｂ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む産物を増幅させ、 ｃ）前記産物を検出すること、およびそれにより前記試料中の前記ポリヌクレ
   オチドを検出する、 前記方法。 【請求項５３】 前記ポリヌクレオチドは、請求項２３に記載のポリペプチ
   ドをコードするＲＮＡ分子であり、前記方法は、アニーリングしたＲＮＡ分子を
   ｃＤＮＡポリヌクレオチドへ逆転写することをさらに含む、請求項５２に記載の
   方法。 【請求項５４】 試料中の請求項２３に記載のポリペプチドを検出する方法
   であって、 ａ）前記ポリペプチドに結合して複合体を形成する化合物と、前記試料とを、
   前記複合体を形成する条件で、かつそれを形成するのに十分な時間接触させ、 ｂ）前記複合体の形成を検出し、 その結果複合体の形成が検出されると、前記ポリペプチドが検出される、前記方
   法。 【請求項５５】 請求項２３に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定
   する方法であって、 ａ）ポリペプチド／化合物複合体を形成する条件下で、かつそれを形成するの
   に十分な時間、前記化合物を前記ポリペプチドと接触させ、 ｂ）前記複合体を検出し、その結果前記ポリペプチド／化合物複合体が検出さ
   れると、前記ポリペプチドに結合する化合物が同定される、前記方法。 【請求項５６】 請求項２３に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定
   する方法であって、 ａ）ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間、細胞中で前記化
   合物を前記ポリペプチドと接触させ（ここで、前記複合体は、細胞中のレポータ
   ー遺伝子配列の発現を駆動する）、 ｂ）前記レポーター遺伝子配列の発現を検出することにより、前記複合体を検
   出し、その結果前記ポリペプチド／化合物複合体が検出されると、前記ポリペプ
   チドに結合する化合物が同定される、前記方法。 【請求項５７】 表面に付着した、請求項１に記載のポリヌクレオチド、ま
   たは請求項１に記載のポリヌクレオチドの特有セグメントを含む核酸アレイ。 【請求項５８】 前記アレイは、請求項１に記載のポリヌクレオチド、また
   は該ポリヌクレオチドの特有セグメントに対する完全マッチを検出する、請求項
   ５７に記載のアレイ。 【請求項５９】 前記アレイは、請求項１に記載のポリヌクレオチド、該ヌ
   クレオチドの特有セグメントに対するミスマッチを検出する、請求項５７に記載
   のアレイ。 【請求項６０】 請求項２３に記載の幹細胞成長因子様ポリペプチドの活性
   または発現の増大が必要な被験体の治療方法であって、該方法は、前記被験体に
   、 （ａ）治療に役立つ量の前記ポリペプチドのアゴニストを含む組成物、 （ｂ）治療に役立つ量の前記ポリペプチドを含む組成物、又は （ｃ）前記ポリペプチドが生産されるような形態で、かつそのような条件下で
   、治療に役立つ量の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成
   物を投与することを含み、前記組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤
   を含む方法。 【請求項６１】 請求項２３に記載の幹細胞成長因子様ポリペプチドの活性
   または発現の減少が必要な被験体の治療方法であって、該方法は、前記被験体に
   、 （ａ）治療に役立つ量の前記ポリペプチドのアンタゴニストを含む組成物、 （ｂ）治療に役立つ量の、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
   発現を抑制するポリヌクレオチドを含む組成物、又は （ｃ）治療に役立つ量の、前記幹細胞成長因子様ポリペプチドと、そのリガン
   ドに関して競合するポリペプチドを含む組成物を投与することを含み、前記組成
   物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む方法。 【請求項６２】 幹細胞又は生殖細胞の増殖もしくは生存を支持する方法で
   あって、前記細胞の生存を維持するか、又はその増殖を促進するのに有効な量の
   請求項２３に記載のポリペプチドと、前記細胞を接触させる方法。 【請求項６３】 前記細胞は、始原生殖細胞、生殖系幹細胞、胚性幹細胞、
   造血幹細胞、造血前駆細胞、多分化能性細胞、または全能性細胞である、請求項
   ６２に記載の方法。 【請求項６４】 前記ポリペプチドは、配列番号１０、１３、または１６の
   アミノ酸配列を含むか、又は配列番号１０、１３、または１６の配列に対して９
   ０％の同一性のアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の方法。 【請求項６５】 前記幹細胞成長因子様ポリペプチドは、ストリンジェント
   なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１０、１３、または１６をコード
   するポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコ
   ードされる、請求項６２に記載の方法。 【請求項６６】 幹細胞又は生殖細胞の増殖もしくは生存を支持するのに有
   効な量で、請求項２３に記載のポリペプチドを発現するように遺伝子操作された
   ストローマ細胞。 【請求項６７】 前記細胞は、始原生殖細胞、生殖系幹細胞、胚性幹細胞、
   造血幹細胞、造血前駆細胞、多分化能性細胞、または全能性細胞である、請求項
   ６６に記載のストローマ細胞。 【請求項６８】 幹細胞又は生殖細胞の増殖もしくは生存を支持するのに有
   効な量で、請求項２３に記載のポリペプチドを発現するように遺伝子操作された
   細胞を含む移植片。 【請求項６９】 前記細胞は、始原生殖細胞、生殖系幹細胞、胚性幹細胞、
   造血幹細胞、造血前駆細胞、多分化能性細胞、または全能性細胞である、請求項
   ６８に記載の移植片。 【請求項７０】 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１９８のもとで、２０００年
   ６月２６日に、産業技術総合研究所の生命工学技術研究所（郵便番号３０５−８
   ５６６、日本国茨城県つくば市東１−１−３）に寄託したプラスミドのタンパク
   質コードｃＤＮＡ挿入物を含む単離されたポリヌクレオチド。 【請求項７２】 適切な宿主細胞中で、請求項７０に記載のポリヌクレオチ
   ドにより発現される成熟ポリペプチド。 【請求項７３】 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１９７のもとで、２０００年
   ６月２６日に、産業技術総合研究所の生命工学技術研究所（郵便番号３０５−８
   ５６６、日本国茨城県つくば市東１−１−３）に寄託したプラスミドのタンパク
   質コードｃＤＮＡ挿入物を含む単離されたポリヌクレオチド。 【請求項７４】 適切な宿主細胞中で、請求項７３に記載のポリヌクレオチ
   ドにより発現される成熟ポリペプチド発現産物。