JP2015512389A - ヒトリンパ器官由来の抑制性ストローマ細胞の単離および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年3月21日に出願された米国特許仮出願第61/613,697号に対して、米国特許法第119条(e)に基づく優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
政府支援
本発明は、NIHグラントDK074500、K01DK087770およびAI045757の米国政府支援を得てなされたものである。従って、発明の一定の権利は米国政府が有するものである。
免疫抑制薬は、特定の疾患の処置のために免疫系の活性を阻害または防止するために使用される。臨床的には、例えば、移植された臓器および組織(例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓等)の拒絶反応を防止するため、および関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬および炎症性腸疾患などの炎症性疾患または自己免疫疾患の処置などの多数の病状を処置または防止するために使用される。慢性炎症性疾患の処置に現在認可されている免疫抑制薬は、頻繁に投与する必要があり、腎毒性や罹病のリスクなどの重要な副作用がある。
いくつかの態様において、LSSCが対象に埋め込まれる二次元または三次元フレームワークの上または中にある。いくつかの態様において、LSSCが、静脈内、腹腔内、動脈内、皮下または筋肉内注射により、または病変部、臓器、臓器皮膜、脂肪またはリンパ節への局所投与により、対象に投与される。
本発明の一つの側面によれば、LSSCを単離する方法が提供される。この方法は、酵素混合物および攪拌の組み合わせを使用してリンパ組織断片を消化すること、その後、LSSCを収集することを含む。
(i)酵素混合物とともに、リンパ組織断片をインキュベートすること;
(ii)ピペットを使用して組織を攪拌した後、インキュベーションして大きな断片を沈降させること;
(iii)上清を取り除き、すべての断片が消化されるまで工程(i)および(ii)を繰り返すこと;
ここで、LSSCは、すべての上清画分をプールした後、遠心分離により細胞ペレットを得ることにより収集する。
本発明の一つの側面によれば、単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞(LSSC)を含む組成物が提供される。LSSCは、上記の方法を使用して単離することができる。
いくつかの実施態様では、単離されたLSSCが、細胞培養により増幅される。いくつかの実施態様では、単離されたLSSCが、ex vivo増幅細胞である。いくつかの実施態様では、単離されたLSSCは、収集細胞をLSSCが実質的に非LSSCを含まなくなるまで生育することにより増幅される。
本発明の実施態様および側面の各々は、独立してまたは組み合わせて実施することが可能である。また、本明細書で使用される表現および用語は、記載の目的であって、限定するものとみなされるべきではない。本明細書で使用される「含む」、「備える」、「有する」、「含有する」、「関与する」およびその語尾変化形は、その後に挙げられた項目およびその均等物ならびに追加の項目を含むことを意図するものである。
本明細書で特定されたすべての文献は、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
ある側面では、本発明は、単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞(LSSC)に関する。本明細書には、商業上実用可能な様式でLSSCを単離しex vivo増幅するおよび方法、LSSCを含む新規組成物およびLSSCの使用、特に自己、同種および異種免疫応答を抑制するための治療への応用が記載される。
本発明者等は、リンパ節のストローマ細胞が免疫系の活性を抑制可能であることを発見した。更に、リンパ組織由来ストローマ細胞は免疫細胞を誘引するが、これは、他の免疫抑制性ストローマ細胞集団の特徴としては知られていない。リンパ組織由来ストローマ細胞がT細胞、B細胞、NK細胞などの免疫細胞を誘引する能力は、それらの免疫抑制機能と組合わせて、対象における免疫応答を抑制するための驚くべきほど効果的な治療ツールとなるであろう。LSSCは、単独であるいは他の免疫抑制薬と組合わせて、T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞、樹状細胞およびマクロファージの活性を抑制するために使用可能である。
本明細書で使用される「単離された」とは、非ストローマ細胞の他の集団からストローマ細胞の集団を分離することを意味する。単離は、細胞を分離する任意の手順、例えば、増殖条件、磁気ビーズの使用などの精製法、セルソーティングまたは他の同様の方法により行うことが可能である。いくつかの態様において、LSSCは、本明細書に記載される方法を使用して単離される。
「自己免疫または炎症性疾患」という用語は、患者の免疫応答が患者自身の構成物に向けられ、望ましくない、しばしば極度に衰弱する病状をもたらす病態および病状を意味する。本明細書において使用される「自己免疫または炎症性疾患」は、自己免疫病状、症候群などを更に含むことを意図している。自己免疫または炎症性疾患の例としては、それに限定するものではないが、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、移植片対宿主病および敗血症が挙げられる。
対象は動物であり、典型的には哺乳類である。ある側面では、対象はイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたは齧歯類である。重要な実施態様では、対象はヒトである。
LSSCは、有効量が投与される。有効量は、医療的に望ましい結果を得るのに十分な用量であり、通常の方法を使用して当業者により決定可能である。いくつかの態様において、有効量は、処置すべき病状に改良をもたらす量である。いくつかの態様において、有効量は、処置すべき疾病又は病状の種類および範囲および/または1つ以上の追加の治療薬剤の使用に依存するであろう。しかしながら、当業者は、例えばin vitroおよび/またはin vivo試験および/または化合物用量の他の知識に基づいて、使用する治療薬剤の適切な用量および範囲を決定可能である。
自己免疫または炎症性疾患の処置においては、有効量は、疾患の進行を遅延する量、疾患の進行を停止する量、または疾患の進行を逆行させる量である。有効量には、自己免疫または炎症性疾患と関連する1つ以上の症状を遅延、低減、阻害、寛解、または逆行させる量も含まれる。いくつかの態様において、そのような用語は、1つ以上の関節の腫脹の低減、または自己免疫または炎症性疾患に関連する疼痛、疲労および/または発熱の低減を意味する。いくつかの態様において、そのような用語は、自己免疫または炎症性疾患と関連する循環自己抗体のレベルの低減を意味する。いくつかの態様において、そのような用語は、ヒトのPASIスコアの低減を意味する。いくつかの態様において、そのような用語は、ヒトのグローバル・アセスメント・スコアの改善を意味する。
いくつかの態様において、LSSCは、対象に埋め込まれる二次元または三次元フレームワーク上または中に存在する。インプラントまたはマトリックスとしては、繊維またはハイドロゲルに基づいたデバイスなどの高分子マトリックスが挙げられる。インプラントは、生分解性であっても生分解性でなくてもよい。繊維またはハイドロゲルインプラントは、市販の材料を使用して製造または構築可能である。インプラントは通常は、天然または合成高分子から生成される。LSSCは、細胞懸濁液をインプラントへ塗布することでインプラントに播種される。これは、インプラントを細胞培養容器に浸漬すること、または細胞の注射、他にはインプラントへの直接塗布により達成可能である。細胞を播種したインプラントは、標準的な外科技術を使用して埋め込まれる。インプラントは、移植の前にin vitroで播種・培養すること、播種しすぐに埋め込むこと、または埋め込んだ後に細胞を播種することが可能である。好ましい実施態様では、細胞をインプラント上または中に播種し、約10時間から2週間の間in vitroで培養する。
いくつかの態様において、LSSCが非LSSCを実質的に含まなくなるまで、LSSCを増殖する。いくつかの態様において、ストローマ細胞の数が少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200%またはそれ以上増加するまで、LSSCを増殖する。いくつかの態様において、単離したLSSCを1〜10,000個/cm2の密度で増殖する。いくつかの態様において、単離したLSSCを10〜500個/cm2の密度で増殖する。
本発明のいくつかの側面によれば、医薬製剤が提供される。この医薬製剤は、単離したリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞(LSSC)の組成物を含む。LSSCは、化学的、機械的、および電気的細胞分離プロセスの1つ以上を使用してリンパ組織断片を処置した後、LSSCを収集することにより単離することができる。例えば、細胞は、酵素的または化学的消化、物理的破壊および攪拌、および/または電場の使用により分離できる。
本発明の医薬製剤は、医薬的に許容される担体を含むか、またはそれで希釈されてもよい。本明細書において使用される「医薬的に許容される担体」という用語は、ヒトまたはイヌ、ネコまたはウマなどの他の哺乳類への投与に好適である、適合性のある充填剤、希釈剤または他の同様の物質の1つ以上を意味する。「担体」という用語は、有効成分が混合されて投与を容易にする有機または無機、天然または合成の成分を意味する。担体は、所望の医薬的効能や安定性を実質的に損うような相互作用がない仕方で、本発明の調製物と、および相互に混合可能である。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの製剤に好適な担体は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Paが参照できる。
材料および方法
マウス
4〜6週齢の雄C57Bl/6マウスは、 Jackson Laboratory から入手した。 ImmGen 選別に使用したマウスは、正確に6週齢とした。雄C57BL/6Rag−/−マウスは、 Taconic から入手した。すべてのマウスは輸送後5日間休息させ、特定の病原体を有さず、研究所のガイドラインおよびアメリカ国立衛生研究所のガイドラインに則って世話をした。実験手順は、 Dana-Farber Cancer Instutute のリサーチ・アニマル・ケア小委員会の承認を得て行った。
ヒトリンパ節は、National Disease Resarch Interchagne (NDRI) のリソースセンター(Philadelphia, USA)を介して死体ドナーから調達した。無傷のリンパ節を、氷上DMEM中で輸送し、24時間以内にフローサイトメトリーまたは細胞培養用に処理した。
マウスリンパ節ストローマのフローサイトメトリー、セルソーティングセルソーティングおよび凍結切片染色のために、以下の抗体を使用した。抗CD45(クローン40−F11、 BD Biosciences)、抗ポドプラニン(クローン8.1.1、Developmental Studies Hybridoma Bank)、抗CD31(クローンMEC13.3、Biolegend)、抗Lyve1(クローン10.1.1、 Dr. Andrew Farr の厚意により入手)および抗MadCAM(クローンMECA−367、eBioscience)。ヨウ化プロピジウムおよびクローンTER119(Biolegend)を適宜使用し、死んだ細胞および赤血球を排除した。ヒト細胞の染色のために、抗体として、抗CD45(クローンHI30、Biolegend社)、抗CD31(クローンWM59、 BD Biosciences)および抗ポドプラニン(クローンNZ−1、 AngioBio Co)を使用し、高度にクロス吸着した抗ratIgG(H+L)Alexa−488(Invitrogen)で検出した。
フローサイトメトリー分析または細胞培養のために、個々のマウスからのリンパ節を切断、細いピンセットで一度貫通し、氷上で5mLのRPMI−1640中に配置した。皮膚流入領域リンパ節の使用が特定されている場合は、腋窩、上腕および鼠径リンパ節を切断した。すべてのリンパ節を切断した後、RPMI−1640を除去し、0.8mg/mLのディスパーゼおよび0.2mg/mLのコラゲナーゼP(ともに Roche)および0.1mg/mLのDNaseI(Invitrogen)を含むRPMI−1640からなる新たに調製した酵素混合物2mLで置換した。試験管を水浴中37℃でインキュベートし、内容物が十分に混合するよう5分の間隔でゆっくりと反転した。20分後、1mLのピペットを使用して、リンパ節を大変ゆっくりと吸引し吐出して、皮膜を破壊し、ほとんどの白血球を遊離した。混合物を水浴中に配置し、大きな断片を30秒間沈降させ、その後、酵素混合物を除去し、10mLの氷冷FACSバッファー(2%FCS、5mM EDTA入りPBS)を添加し、遠心分離した(300g、4分、4℃)。2mLの新鮮な酵素混合物を消化用試験管に添加し、内容物を1mLのピペットを使用してゆっくり混合し、1mLのピペットを使用して定期的にゆっくり混合しながらインキュベートした。10分後、細胞を、1mLのピペットを使用して30秒間激しく混合した。断片を再び沈降させ、上清を取り出し、予めスピンした細胞ペレットに添加し、2mLの新鮮な酵素混合物を消化用試験管に添加した。ここから、消化用ミックスを、光を透過させたときにすべての残存するリンパ節断片が完全に消化されたことが明らかになるまで、1mLのピペットを使用して5分毎に激しく混合した。最初のインキュベーション時から完全な消化までのこの手順は、通常50分かかったが、60分を超えることはなかった。最終的に各採取用試験管が個々のマウスの回収したリンパ節の全細胞内容物を含むまで、取り出す度に上清を遠心分離した(300g、4分、4℃)。細胞を、80μmのナイロンメッシュで濾過し、血球計数器を使用してカウントし、トリパンブルーを使用して生存率を評価した。生存率は95%を超えた。その後、染色毎に5x106個の細胞を、50μLの希釈した抗体とともに、氷冷したFACSバッファー(2%FCS、5mM EDTA入りPBS)中4℃で20分間インキュベートし、FACSCaliburまたはFACSAria IIu(BD Biosciences)上で取得した。
多数のプールしたマウスの消化は、大概は2.1項に記載したように進行したが、以下のように変更した(図1にグラフで示す):4〜10匹のマウスからのリンパ節を、単一の試験管にプールし、一回の消化工程につき5mLの酵素混合物を使用して消化した。リンパ節が十分に消化され、細胞を遠心分離し、カウントした後で、CD45ミクロビーズおよびオートMACSシステム(ともに Miltenyi)を使用して単一細胞調製物中の非造血ストローマ細胞を濃縮した。107個の細胞につき7μLのビーズを使用し、4℃の回転ホイール上でFACSバッファー中20分間インキュベートした。標識した画分を、使用説明書に従ってディプリートプログラムを使用して枯渇させた。その後、濃縮したストローマをカウントし、セルソーティングセルソーティング用の抗体を多量(106個の細胞につき100μLの希釈抗体カクテル)使用して染色した。
ヒトリンパ節から、脂肪と結合組織を注意深く除去し、その後細いハサミを使用して小片に切り刻んだ(<0.5cm)。2.4項にしたがって消化が進行したが、酵素濃度を、RPMI−1640中、2.4mg/mLのディスパーゼおよび0.6mg/mLのコラゲナーゼP(ともにロシュ社)および0.3mg/mLのDNaseI(Invitrogen社)に増加した。いくつかのケースでは、臓器全体を消化する代わりに、リンパ節のすべての領域を代表する約20個の断片混合物の一部をランダムに選択した。60分後、詳細を上記したようにリンパ節断片を完全に消化後、濾過、カウントし、必要に応じて染色した。
ストローマ細胞のフローサイトメトリーによる選別は、専用の低圧、大開口構成を使用することにより改良される;しかしながら、非標準的な仕様にソーターを再設定し、その後純粋な集団を首尾よく選別することには、固有の技術的な課題がある。ここでは、20psiにセットし、100μmのチップを装着した、FACSDivaソフトウェア(すべてBD Bioscience)を利用したFACSAriaまたは改良型FACSAria IIu装置を使用した。装置によって異なるが、以下の仕様概略が、ストローマ選別用に設定した少なくとも4台の異なるFACSAria装置に適用されたことを見出した。これらは、製造会社により特定された設定提案とは異なるものである。
ストローマセルソーティングのための補正は、濃縮ストローマ細胞を使用して厳密に行われるべきである。ストローマは、ある程度の自己蛍光を伴う大きな細胞である。白血球を使用して補正した装置は、ストローマをソーティングするときは、集団の解像度が最適以下となる。未濃縮集団では、ストローマは稀であり、自己補正ソフトウェアは、消化された単一細胞懸濁液中の自己蛍光の正常なレベルと真のストローマ染色とを区別することができないので、濃縮ストローマを補正に使用すべきである。
オートMACS濃縮ストローマを、TRIzol(Invitrogen)中へ高純度(>95%)に機械的にソーティングした。CD45−ヨウ化プロピジウム−ストローマにゲートをかけた後、サブセットを以下のようにソーティングした:細網線維芽細胞(FRC)、ポドプラニン+CD31−;リンパ管内皮細胞(LEC)、ポドプラニン+CD31−;血管内皮細胞(BEC)、ポドプラニン−CD31+;二重陰性ストローマ細胞(DN)、ポドプラニン−CD31−。
10,000〜15,000個のソーティングした細胞からのRNAを、既述の方法(Yamagata et al., 2004)で単離した後、使用説明書に従ってGeneChip Whole Transcript Sense Target Labeling Assayを使用して増幅し、Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Arrays(Santa Clara, CA, USA)とハイブリッド形成した。これにより、各遺伝子の複数の位置に結合するよう設計されたプローブを使用して全転写情報を得た。生データを、GenePattern の Expression File Creator モジュールで、ロバストマルチアレイ平均(RMA)処理アルゴリズム(バックグラウンド調整、分位標準化および要約を行う)(Irizarry et al., 2003)を使用して標準化した。プローブリストを、少なくとも1つのサブセット(すべてのサブセットを通して平均発現値<120の場合除外)における発現、およびレプリカ中の変動の少なさ(いずれかの集団において変動係数>0.5の場合除外)に関して解析した。GenePattern の Multiplot モジュールを使用して、皮膚リンパ節FRCと腸間膜リンパ節FRCの差を算出した。差は、発現における倍率変化が>2かつP<0.05(スチューデントのt検定)の場合、更なる解析が検討された。アウトプットされたデータのリストは、マイクロソフトエクセルを使用して順位付けし、遺伝子リストは、DAVIDプログラムの Functional Annootation ツール(NIAID, david.abcc.ncifcrf.gov(Dennis et al., 2003))を使用し、MoGene-1_0-st-v-1チップに設定した Affymetrix のエクソンバックグラウンドで、KEGGパスウェイ全体を濃縮に関して解析した。複数の仮説(Benjamini)間の相関後のt検定P値<0.05でのKEGGパスウェイ解析は有意であると考えられた。データシリーズのNCBIGEOアクセッション番号はGSE15907である。
リンパ節を、詳細を上記したように、消化後カウントし、5x105個/cm2の濃度で播種した。細胞培地として、10%のバッチテストしたIg低量FCSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシン添加αMEMを使用した。プレートは、24時間後に洗浄し、非接着細胞を除去した。5日後、マウス細胞培養物は主にLECとFRCを含んでいた。ヒト細胞培養物はよりゆっくりと増殖し、7日後に回収した。ヒトリンパ節ストローマ細胞培養物には、主にFRCとDNが含まれていた。重要な細胞表面マーカーのトリプシンによる切断を最小とするためにEDTA入り低濃度のトリプシン中での短時間のインキュベーションからなる非標準回収プロトコールを、通常通りに使用した(表2)。細胞をPBSで洗浄し、残存するタンパク質を除去し、収集用バッファー(PBS中5mM EDTA入り0.2%トリプシン)を培養プレートに添加した。細胞を収集用バッファー中37℃で2分間インキュベートした。この時点で、それらの形態は丸くなり、同容積の完全培地をウェルにすぐに添加した。細胞を、1mLピペットを使用して軽く撹拌しながらプレートから洗浄し、遠心分離(300g、3分、4℃)のために上清を他の同容積の完全培地に添加した。FRCおよびLECを再播種し、ソーティングまたは必要に応じてこの調製物からMACS精製した。
リンパ節を新たに切断し、10%パラホルムアルデヒド中で4時間固定し、10%ショ糖溶液中に一晩放置した。その後、ブロックをOCT化合物(VWR)中に包埋し、急速冷凍し、その後、−80℃で保管した。リンパ節は、 Leica 製クリオスタットを使用して凍結切片(7μm)し、アセトン固定後、2%BSAを使用して30分間ブロッキングした。PBS中で洗浄後、切片を一次抗体で60分間染色後、洗浄し、二次抗体で60分間染色した。スライドには、蛍光染色用マウンティングメディウム(DAKO)を使用してカバーガラスを載せ、4℃で保管した。画像は、Leica Sp5 共焦点顕微鏡を使用して取得した。
GenePatternのMultiplotプログラムを使用して、任意のサンプルのレプリカ間の変動係数が0.5未満である標準化した配列データについてt検定P値を算出した。観察された倍率変化が2未満である場合、0.05未満のP値を有意とみなした。遺伝子は、改良フィッシャーの正確確率検定およびBenjamini の多重仮説相関によるt検定を使用してデータを比較するDAVIDプログラム(david.abcc.ncifcrf.gov)を使用して、KEGGパスウェイ関連に対して解析し、特定のリストにおける2つ以上の遺伝子の濃縮を示した。ノンパラメトリックMann-Whitney U検定を使用して、フローサイトメトリーのデータを比較した(Prism)。
3〜6週齢のC57Bl6/JマウスをFRCドナーとして使用した。皮膚および腸間膜リンパ節を切断し、酵素的および機械的手段で消化した。10匹のマウスからのリンパ節を、0.8mg/mLのディスパーゼ、0.2mg/mLのコラゲナーゼPおよび0.1mg/mLのDNaseを含むRPMI−1640中37℃で60分間定期的に攪拌し、酵素混合物を交換しながらインキュベートした。消化した細胞は遠心分離により回収した。消化が完了したら、細胞をRPMI−1640中に再懸濁し、80μmのメッシュで濾過し、血球計数器およびトリパンブルーを使用してカウントした。細胞は、5x105個/cm2で培養フラスコに播種した。培地は、αMEM中に1%ペニシリン/ストレプトマイシンと10%のバッチテストした低量IgFCSを含有した。24時間後、細胞を洗浄し、更に6日間増殖後、PBS中の0.2%トリプシンおよび5mM EDTAを使用して一度継代培養し、使用前に更に5〜6日間増殖のために1:10の比率でスプリットした。
MSCは、上記したFRCドナーマウスの骨髄から収集した。大腿骨と脛骨を、10匹のマウスから取り出した。骨髄を遠心分離により回収し、ピペットを使用して無菌のRPMI−1640中に再懸濁した。細胞は、5x105個/cm2で培養フラスコに播種した。培地は、αMEM中に1%ペニシリン/ストレプトマイシンと10%のバッチテストした低量IgFCSを含有した。細胞は、24時間後洗浄し、更に6日間増殖後、PBS中の0.2%トリプシンおよび5mM EDTAを使用して一度継代培養し、使用前に更に5〜6日間増殖のために1:10の比率でスプリットした。
細胞は、PBS中0.2%トリプシンおよび5mM EDTAを使用して収集後、血球計数器およびトリパンブルーを使用してカウントし(生存率は95%を超えた)、107個の細胞につき10uLの抗CD31ビオチンおよび10uLの抗CD45ビオチンとともに、1mLのFACSバッファー(2%FCSおよび5mM EDTA添加PBS)中に再懸濁した。15分後、細胞を洗浄し、抗ビオチンミクロビーズとともにインキュベートし、使用説明書(Miltenyi Biotec)に従ってMACSLSカラムを通過させた。MACS精製FRCを、すべての試験で使用した。
3〜6週齢(若年)または18〜24月齢(老齢)のC57Bl6/JマウスにLPSを1回注射し、無菌性敗血症を生じさせた。若年マウスには、100uLの生理食塩水中に300μgのLPSを腹腔内投与し、老齢マウスには、100uLの生理食塩水中に150μgのLPSを腹腔内投与した。記載の時点で生理食塩水中1x106FRCを1回の注射で腹腔内に投与した。以下の終点のいずれかに到達した場合、マウスを安楽死させた:意識喪失、覚醒不可能、起立不可能または呼吸速度が20呼気/10秒以下に持続的に低下。
Balb/cマウスに腸管穿孔(CLP)を施して、多微生物性敗血症を誘発した。簡潔に言えば、マウスに麻酔をかけ、皮膚および腹腔筋を通る正中線切開を行った。盲腸の位置をみつけ、無菌の外科環境で外に取り出した後、盲腸の80%を、6.0縫合糸を使用して結紮し、盲腸を23g針を使用して2度穿刺した。糞便の小滴を浸出させた後、盲腸を再配置し、筋肉と皮膚を閉じた。マウスに、1mLの生理食塩水を皮下注射により投与した。記載の時点で、マウスに、生理食塩水または生理食塩水中1x106個の同種FRCのいずれかを1回の腹腔内注射により投与した。この時点で、抗生物質処置も、すべてのマウスに開始した(生理食塩水中15mgアンピシリンを腹腔内注射した)。抗生物質は、12時間毎に投与した。以下の終点のいずれかに到達した場合、マウスを安楽死させた:意識喪失、覚醒不可能、起立不可能または呼吸速度が20呼気/10秒以下に持続的に低下。
詳細を上記したように血液を取得し、血漿を遠心分離により収集した。分析物の濃度は、使用説明書に従ってxPONENTソフトウェア搭載のLuminexMAGPIX解析・リーダーを使用して求めた。
8週齢の雌C/B17scidマウスを大腸炎レシピエントとして使用した。7週齢の雌Balb/cドナーを、大腸炎を誘発するための細胞ドナーとして使用した。脾臓と皮膚および腸間膜リンパ節を20匹のBalb/cマウスから切断し、機械的破壊によりRPMI−1640中へ懸濁した。細胞を濾過、カウントした後、使用説明書に従ってCD4+CD62L+CD44low単離キット(R&D Systems)を使用してナイーブCD4+T細胞を濃縮した。その後、CD4+CD45RBhi+T細胞を、FACSを使用してソーティングし、無菌RPMI−1640中に再懸濁した。15匹のC/B17scidマウスに、100uLのRPMI−1640中5x105個の細胞を静脈内投与した。マウスは、大腸炎誘発後2週間して体重が減少し始め、疾患の発症を示唆した。その後、研究の期間中、マウスに1x106個の同種FRCを週に2回腹腔内注射により投与した。以下の終点のいずれかに到達した場合、マウスを安楽死させた:初期体重から20%を超える減少または後肢麻痺。
マウスおよびヒトリンパ節ストローマ細胞の酵素単離
リンパ節ストローマ細胞の研究は、近年活発化しており、ナイーブT細胞の維持(Link et al., 2007)および除去(Lee et al., 2007, Nichols et al., 2007, Gardner et al., 2008, Magnusson et al., 2008, Yip et al., 2009, Cohen et al., 2010, Fletcher et al., 2010)における新たに発見された役割を精査するインパクトの大きいいくつかの論文が発表されている。しかしながら、方法論的な能力が、制約因子となっている。
死体ドナーからの非腸間膜由来のヒトリンパ節を入手した。このリンパ節を消化するためには高い酵素濃度が必要とされたが(方法の項参照)、消化されたストローマ組成物はマウスのものと著しく類似していた(図2Dと2Bを比較)。これらの結果は、マウスのリンパ節ストローマ細胞技法は、ヒトの研究にも同等に適用できるかもしれないことを示唆している。
消化を更に検証するために、リンパ節ストローマ細胞サブセットの構成比率が同年齢マウス間でどの程異なっているかを評価することにより、再現性を試験した。また、皮膚流入領域および腸間膜リンパ節のストローマ組成を比較した。これらのリンパ節は、組織学により構造的に類似していることは十分に確立され、研究されているが、それらの個体発生は異なる時期におこり、異なるシグナル経路に依存している(Mebius, 2003)。更に、腸間膜リンパ節は絶えず腸や胃粘膜由来の抗原に曝されているが、皮膚流入領域リンパ節はそうではない。
我々は、この相違がFRCゲート内にあることを見出し(図2B)、MRCサブセットの割合の変化によるのかどうかを調べた(Katakai et al., 2008)。FRCゲート内の細胞の10〜20%は、5週齢の雄マウスでは、皮膚流入領域リンパ節よりも腸間膜リンパ節においてより高い割合でMadCAMを発現した(図2B、3D)。しかしながら、MRCの割合は、LECと同様にサイト間で有意に変化しているが、それらの総数はそうではなかった(図3E)。これは、MRCの数とFRC数が別々に調整されていることを示唆している。なぜなら、他のストローマサブセットのように、MRCは数的にはサイト間で類似しており、FRCは腸間膜リンパ節で減少しているからである。
Rag−/−マウスのリンパ節はより小型であるが(図3F)、同年齢の野生型対照と同等に正常な数のFRCを処理していた(図3G)。しかしながら、LECの数は有意に減少しており、それらの数の恒常性は成熟リンパ球の存在と関連付けられることを示唆している。Rag−/−FRCの細胞代謝回転速度は、WTと異なっておらず(データ示さず)、マウスにLPSを注射した後、FRCの数はT細胞およびB細胞と一緒に増加しなかった(データ示さず)。従って、FRCの数は、リンパ球減少性の定常状態および炎症性条件下で、成熟リンパ球とは完全に独立して維持されていた。
リンパ節の消化に成功した後、ストローマ細胞のソーティングおよび培養のために、この手段を適応した。ストローマ細胞のソーティングは技術的に困難であり得(方法の項参照)、ソーティング時間を短縮し、得られる純度を高めるために、造血細胞のMACSに基づく枯渇を使用した。この追加の工程は、ストローマの損失を最小限とし(図4A、B)、ストローマの組成に検出可能な変化はなかった;ストローマサブセットのMACS後の選択的損失は観察されず(図4C)、ソーティング後、良好な純度を達成した(図4D)。
この方法を使用して、多施設ImmGen共同事業体の一環として、皮膚流入領域および腸間膜リンパ節からFRCをソーティングした。これには、厳しく制御された変動を最小とした条件下でソーティングされた細胞のトランスクリプトーム解析が含まれ、総合的な目的は、免疫学的ゲノムの包括的な相互参照されたマップを提供する公共データベースを作成することである。
我々は、これらの異なる場所からのFRCが、CD140a、CCL19、IL−7などの既に公表されているFRC特異的マーカーの発現を共有すること(データ示さず)をまず確認し、その後相違に関してデータを解析した。皮膚流入領域対腸間膜リンパ節FRCを比較し、倍率変化とP値を表す火山型プロットは、130個のプローブが腸間膜リンパ節に比較して皮膚流入領域からのFRCにおいて有意に発現上昇していることを示し、97個のプローブの発現は皮膚流入領域に比較して腸間膜リンパ節FRCで有意に高かった(倍率変化>2、P<0.05)(図5A)。プローブを固有の遺伝子に対してマッピングした後、これらのデータは、皮膚流入領域リンパ節FRCにおける126個の遺伝子(データ示さず)および腸間膜リンパ節FRCの54個の遺伝子(データ示さず)の上方制御に対応していた。
次に、リンパ節ストローマが培養で増殖する能力をテストした。よく消化されたリンパ節細胞懸濁液からのストローマが播種後2時間以内に組織培養プレートへ容易に接着し、CD45+白血球の犠牲で増幅し始め、この白血球は5日後には培養物の10%未満となっていることを見出した(図6A)。FRCおよびLECは培養で容易に増殖する一方、BECおよびDN細胞は増殖しなかった(図6A)。FDCは培養で増殖しなかった(図6B)。重要なことは、我々の低量トリプシン、高量EDTA収集プロトコールは、CD31(図6C)およびCD140a(図示せず;表2参照)などの重要な表面マーカーの保持を可能としたことである。約5x103個のストローマ細胞を含む5x105個/cm2の細胞が、5日間の培養の後で約1.5〜2x104個/cm2のストローマを常に生成したことがわかった。この培養システムは、FRC、LECおよびMRCの増殖および操作を容易にした。
これらの結果をまとめると、マウスのリンパ節ストローマがフローサイトメトリーおよびソーティング用に容易に単離され、白血球の不在下で培養可能であり、にもかかわらず、in vivoでの報告のように白血球が容易に移動する広範な3Dネットワークを形成したことを示した。我々のデータは、ヒトリンパ節ストローマがマウス用技術を使用した研究に同様に適用できることを示唆した。
これらの結果はともに、様々なex vivoおよびin vitro条件下でのマウスおよびヒトにおけるリンパ節ストローマ細胞の研究に適用可能である一連の技術を確認するものである。
未分画のLSSCを、血縁でないドナーから新たに単離されたヒト脾細胞とともに培養した。脾細胞を、細胞分裂時に希釈される蛍光染料であるCFSEで標識した。脾細胞集団内のT細胞を、PHAおよびIL−2を使用して活性化した。図7は、T細胞抗原レセプターの発現により同定したT細胞を示すヒストグラムである。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。培養ストローマ細胞なしに刺激されたT細胞は、LSSCとともに培養した細胞よりも、そのCFSEを希釈し、LSSCは用量依存的にT増殖を抑制する(図7)。
未分画のLSSCを新たに単離したマウス脾細胞とともに培養した。脾細胞を、細胞分裂時に希釈されるCFSEで標識した。その後、抗CD3および抗CD28抗体を使用してT細胞を活性化した。図8は、T細胞抗原レセプターの発現により同定したT細胞を示すヒストグラムである。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。培養ストローマ細胞なしに刺激された血液由来のT細胞は、LSSCとともに培養した細胞よりも、そのCFSEを希釈した。PDPN+およびPDPN−LSSC亜集団の両者は、等しくT細胞を抑制することが可能である。LSSCは異種応答の強力なサプレッサーである(図7に示す同種抑制と比較して)。
マウスにおいて、リンパ節由来のPDPN+ストローマ細胞は、T細胞由来のIFNgおよびストローマ細胞由来の一酸化窒素を必要不可欠とする機序により自己T細胞増殖を抑制する(Lukacs-Kornek et al., Nature Immunology, 2011)。我々のLSSCが同様の機序でT細胞応答を抑制するかどうかをテストした。
未分画のLSSCを、野生型またはIFNg−/−マウス由来の新たに単離された脾細胞とともに培養した。脾細胞を、細胞分裂時に希釈されるCFSEで標識した。その後、抗CD3および抗CD28抗体を使用してT細胞を活性化した。図9Aは、T細胞抗原レセプターの発現により同定したT細胞を示すヒストグラムである。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。
LSSCは、野生型T細胞と等しく良好にIFNg−/−T細胞を抑制したことがわかった。PDPN+またはPDPN−LSSC亜集団あるいは未分画のLSSCのどれも、抑制解析において検出可能な一酸化窒素/亜硝酸塩を産出しなかった。LSSCは、新規のIFNgおよび一酸化窒素非依存性機序によりT細胞増殖を抑制し、従ってマウスPDPN+リンパ節ストローマ集団とは有意に異なっている。
図10Aにおいて、LSSCの2つの亜集団を、糖タンパク質−36(PDPNとしても知られる)の発現または欠損に基づいて精製した。両亜集団とも、非内皮性(CD31陰性)および非造血性(CD45陰性)であった。
PDPN+LSSC、PDPN−LSSCまたは未分画のLSSCを血縁でないドナーから新たに単離、精製したヒト血液由来のT細胞とともに、1:5比率(LSSC対T細胞)で培養した。T細胞を、細胞分裂時に希釈されるCFSEで標識した。PHAおよびIL−2を使用して、T細胞を活性化した。図10Bは、T細胞抗原レセプターの発現により同定したT細胞を示すヒストグラムである。比率は、ストローマに対する脾細胞の割合を示す。
培養ストローマ細胞なしに刺激された血液由来のT細胞は、LSSCとともに培養した細胞よりも、CFSEを希釈することが観察された。PDPN+およびPDPN−LSSC亜集団の両者は等しくT細胞を抑制することが可能である。
LSSCのいくつかの治療応用は、進行中の免疫応答を有する個体への輸血または移植を必要とするであろう。従って、LSSCが予め活性化したT細胞を抑制することができるかどうかを調べた。
PDPN+LSSC、PDPN−LSSCまたは未分画のLSSCは、血縁でないドナーから新たに単離、精製したヒト血液由来のT細胞とともに培養した。T細胞を、細胞分裂時に希釈されるCFSEで標識した。T細胞をPHAおよびIL−2を使用して活性化し、2日間分裂させた後、一部のT細胞をLSSCに再播種して再刺激、または再播種しLSSCなしに再刺激し、または再刺激なしに再播種した。図11は、T細胞抗原レセプターの発現により同定したT細胞を示すヒストグラムである。比率は、T細胞に対するLSSCの割合を示す。
2日間刺激し、その後、再播種し、LSSCとともに再刺激したT細胞は、十分に活性化され再播種の前に数回の細胞分裂を行っているという事実にもかかわらず、細胞分裂を終止することがわかった(「再播種したが、再刺激していない」対照とともに示す)。PDPN+およびPDPN−LSSC亜集団の両者は、予め活性化された同種T細胞を抑制することが等しく可能である。
レシピエントマウスは、同種骨髄移植を受けた(分割致死線量照射後、全骨髄の静脈内注射)。アロ反応性T細胞を含有するドナー由来の脾細胞を同時注入することによって、移植時に重度のGVHDを誘発した。1x106個のヒトLSSCを、GVHD誘発後の時点で腹腔内に注射し、一方対照マウスには、生理食塩水(媒体)を与えた。生存をモニターした。
すべてのマウスが同様の時点でGVHDを発症したが、LSSCを与えたマウスは、早期時点でのGVHD関連死亡率が有意に減少し、LSSCが免疫攻撃を低減することを示唆した。早期LSSC投与の効果は、注入後3週間持続し、その時点で保護は無効となり、再投与の必要が示唆された。重度に発症したマウスへの注射投与が遅延した場合(24日目)、罹患率または死亡率は逆行しなかった。
図15に示すように、ex vivo増幅したマウスリンパ節ストローマは、マウスにおける急性敗血症性ショックの死亡率を低減した。
表面マーカーのフローサイトメトリーおよび分泌された因子のRT−PCR(図13A)、およびmRNAトランスクリプトームを得るための Affymetrix HuGene ST 1.0 遺伝子配列(図13B)を使用してヒトLSSCの転写特性を得た。
LSSC(黒色ライン)の代表的なフローサイトメトリープロファイル(図13A)を、間葉系マーカーPDGFRa、耐性関連タンパク質PD−L1およびPD−L2、筋関連タンパク質ITGA7およびリンパ器官ストローマに特徴的なタンパク質TBR、IL7RおよびPDPNの発現を示す適切な陰性染色対照(灰色)と比較した。PDPNおよびITGA7は、おそらくバルクLSSCのサブセットにより発現された。別名または遺伝子名を括弧内に示す。RT−PCRは、LSSCがケモカインCCL19およびCCL21のための転写物を発現することを示した(陽性対照としてのLTbRに対して示した)。
ウシ胎仔血清添加アルファMEM中で増殖した培養LSSCは、線維芽細胞様形態を示した(図14)。それらは、多くの場合に、長い突起、葉状仮足、糸状仮足、波状のリーディングエッジおよび接着点を示した。更に、リンパ節および扁桃腺から単離されたLSSCは、表現型的に類似している(図19)。
無菌性敗血症モデルおよび腸管穿孔(CLP)敗血症モデルの両者において、FRCは、顕著な延命効果を付与した(図16)。図16Eは、FRCで処置したマウスの血液中の炎症性サイトカインのレベルが減少したことを示す。これらの炎症性サイトカインは、通常は自然免疫系に関連している。従って、FRCは敗血症において自然免疫系と相互作用する。
精製したナイーブT細胞を免疫不全マウスに注射することにより大腸炎を誘発した。同種FRCを、マウスが病気の徴候を示し、顕著な体重減少を示し始めた、2週間目に投与した(治療時間経過)。生理食塩水で処置した対照と比較し、FRCを2週目から6週目まで週2回注射し、生存時間をモニターした。FRCは顕著な延命効果を付与した(図17)。
培養したヒトLSSCが、多数の可溶性サイトカイン因子を分泌することが示された(図18)。リンパ節および扁桃腺から単離されたLSSCは、可溶性因子による同等レベルのT細胞抑制を示した(図20)。
一次組織から再現性のある組成で生存単一細胞懸濁液を作成するなどの免疫学や細胞生物学で通常用いている技法をリンパ節ストローマに適用することは困難である。従って、組織学および全臓器PCRまたはリンパ球の読み取りを含むin vivoシステムがこの分野の標準であった。これらは、定常状態の寛容や免疫性におけるリンパ節ストローマ細胞サブセットの役割に関していくつかの重要な進歩をもたらした。しかしながら、直接的な生物学的および医学的関連性の探求されていない疑問が多数ある。これらの希少で繊細な細胞タイプに使用するよう改良、適応した現代の免疫学的および細胞生物学的技法が、これらの疑問に答えるために要求されるであろうと考える。
我々は、同年齢若年雄C57Bl/6マウス間でストローマ細胞サブセットの差異が驚くべきほど小さいことを見出した。また、リンパ球とストローマとの間のクロストークが特定のストローマサブセットの増殖に必要であるかどうかのテストでは、FRC、LEC、BECおよびDNストローマがRag−/−マウスにおいて通常の割合で存在し、それらの発達または増殖にT細胞またはB細胞が必要とされないことを見出した。MRC(MadCAM−1+)ストローマサブセットはフローサイトメトリー分析用に未だ単離されておらず、我々は、MRCがポドプラニン+CD31−FRCゲート内にサブセットを形成することを見出した。MRCはFRCとの類似点を示し、VCAM−1およびICAM−1を発現し、ラミニンなどのECM成分を分泌するが、MRCは更に、多量のCXCL13を産出し、MadCAM−1の発現により同定可能である(Katakai et al., 2008)。
興味深いことに、腸間膜および皮膚流入領域リンパ節の両者からのFRCは、内皮細胞へのシグナル伝達に関与する遺伝子を発現した。FRCが、定常状態条件下での皮膚流入領域リンパ節中のVEGFの主要な産出者であることは知られている(Chyou et al., 2008)。驚くべきことに、皮膚流入領域リンパ節からのFRCは、腸間膜リンパ節からのものよりも高いレベルでVEGFaを発現したことを見出した。実際、腸間膜リンパ節は、皮膚流入領域リンパ節と比較して比較的少ないリストの遺伝子の上方制御を示し、多重仮説ロバスト統計相関を行ったとき、それらの結果は、機能的なパスウェイに位置づけられなかった。しかしながら、Lrat、Tgm2、Meis1およびPltpの上方制御と同様に、腸間膜リンパ節中でのMadCAM発現およびリンパ球分離に必要なNkx2−3などの公知の腸関連遺伝子の上方制御が観察された(Pabst et al., 2000)。これらの遺伝子は、レチノイン酸の代謝サイクルに関与するか、またはレチノイン酸により上方制御された(Matsuura et al., 1993, Cao et al., 2002, Galdones et al., 2006, Rebe et al., 2009)。レチノイン酸は、腸間膜リンパ節で処理されて腸特異的ホーミング表現型をT細胞に付与する(Iwata, 2009)。また、数種の血管拡張剤(Vipr2、Itih4、Npr1)および血管収縮剤(Agt)の発現も観察され、FRCがリンパ節血管と活発に情報交換していることを示唆した。同様に、神経突起伸長を誘発する遺伝子(Efna5、gpr126、Tmem35およびNgf)の上方制御は、リンパ節の正常な交感神経支配を維持する役割の可能性を示唆する(Panuncio et al., 1999)。これらの結果を確認するための更なる研究が必要とされるであろう。
共に、これらのデータは、リンパ節ストローマ細胞に適応される技術を網羅する目録を象徴するものである。
Claims (35)
- 免疫応答を抑制する方法であって、
かかる処置を必要とする対象に、単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞(LSSC)を該対象における免疫応答を抑制する効果のある量で投与することを含む、前記方法。 - 対象に投与されるLSSCが、ex vivo増幅細胞である、請求項1に記載の方法。
- 対象に投与されるLSSCが、非LSSCを実質的に含まない、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも10万個のLSSC/kgが、対象に投与される、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも100万個のLSSC/kgが、対象に投与される、請求項3に記載の方法。
- 対象に投与されるLSSCが、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および/またはパイエル板由来である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- LSSCが対象に埋め込まれる二次元または三次元フレームワークの上または中にある、請求項6に記載の方法。
- LSSCが、静脈内、腹腔内、動脈内、皮下または筋肉内注射により、または病変部、臓器、臓器皮膜、脂肪またはリンパ節への局所投与により、対象に投与される、請求項6に記載の方法。
- 対象が自己免疫または炎症性疾患を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 自己免疫または炎症性疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、移植片対宿主病および敗血症からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- LSSCが、対象に対して自己、同種または異種である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- リンパ組織由来抑制性ストローマ細胞(LSSC)を単離する方法であって、酵素混合物および攪拌の組み合わせを使用してリンパ組織断片を消化すること、その後、LSSCを収集することを含む、前記方法。
- リンパ組織断片の消化を、以下の一連の工程により行い;
(i)酵素混合物とともに、リンパ組織断片をインキュベートすること;
(ii)ピペットを使用して組織を攪拌した後、インキュベーションして大きな断片を沈降させること;
(iii)上清を取り除き、すべての断片が消化されるまで工程(i)および(ii)を繰り返すこと;
ここで、LSSCは、すべての上清画分をプールした後、遠心分離により細胞ペレットを得ることにより収集する、請求項12に記載の方法。 - 単離されたLSSCを、成長因子、血清、血小板溶解物および抗生物質の1つ以上を添加した基底細胞培地を含む培地で増殖する、請求項13に記載の方法。
- 単離されたLSSCを、1〜10,000個の細胞/cm2の密度に増殖する、請求項14に記載の方法。
- 単離されたLSSCを、0.1〜21%分圧の酸素で増殖する、請求項14に記載の方法。
- LSSCを、実質的に非LSSCがなくなるまで増殖する、請求項14に記載の方法。
- LSSCを、ストローマ細胞の数が少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200%またはそれ以上に増えるまで増殖する、請求項14に記載の方法。
- 酵素混合物が、培地、ディスパーゼ、コラゲナーゼおよびDNaseIを含む、請求項12または13に記載の方法。
- LSSCが、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺またはパイエル板由来である、請求項12〜17のいずれか一項に記載の方法。
- LSSCが、請求項12〜20のいずれか一項に記載の方法を使用して単離される、請求項1に記載の方法。
- 単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞(LSSC)を含む組成物であって、LSSCが請求項12〜20のいずれか一項に記載の方法を使用して単離される、前記組成物。
- 単離されたリンパ組織由来抑制性ストローマ細胞(LSSC)の組成物を含む医薬製剤。
- LSSCが、化学的、機械的、電気的細胞分離プロセスの1つ以上を使用してリンパ組織断片を処置し、その後LSSCを収集することにより単離される、請求項23に記載の医薬組成物。
- 単離されたLSSCが、細胞培養により増幅される、請求項24に記載の医薬組成物。
- 単離されたLSSCが、ex vivo増幅細胞である、請求項23〜25のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 単離されたLSSCが、LSSCが実質的に非LSSCを含まなくなるまで収集した細胞を増殖して増幅される、請求項23〜26のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 単離されたLSSCが、CD140aとPD−L2とを共発現する、請求項23〜27のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 単離されたLSSCが、CD140aとLTBRとを共発現する、請求項23〜27のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 単離されたLSSCが、CD140aとPD−L2とLTBRとを共発現する、請求項23〜27のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 単離されたLSSCが、PD−L1、Thy−1、MADCAM−1、MYH11、IL−7RまたはITGA7からなる群から選択される少なくとも1つの他のリンパ球マーカーを発現する、請求項28〜30のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 単離されたLSSCが、IL−6、CCL19、CCL21またはVEGFからなる群から選択される少なくとも1つの因子を発現する、請求項23〜31のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 細胞が、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、イノシシ科、ウシ科および齧歯類からなる群から選択される種から単離される、請求項23〜32のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 細胞が、in vitroでT細胞の増殖を抑制する、請求項23〜33のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- LSSCが、リンパ節、脾臓、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺またはパイエル板から単離される、請求項23〜34のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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