JP6563379B2 - 白血球の枯渇による循環腫瘍細胞の濃縮 - Google Patents
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Description
本願は、係属中の米国仮特許出願第61/787611号(表題「Improved Molecular Characterization of Circulating Tumor Cells」、2013年3月15日出願)の優先権を主張する。
(a)ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーで白血球を標識する条件下で、ハプテンにコンジュゲートされたかかる白血球マーカーを用いて、かかるサンプルを処置する工程と、
(b)工程(a)の組成物を、かかる標識した白血球に接着する第2の媒体を用いて処置する工程と、工程(b)の組成物から、第2の媒体及びその接着した標識された白血球を分離する工程と、を含む。
本実施例は、抗CD45を用いた白血球の枯渇を示す。CD45は白血球に存在する一般的な白血球マーカーであり、全ての白血球が抗CD45に結合することが期待される。抗CD45でコーティングした固相を用いて、白血球と結合させ、白血球とCTCとの混合物からそれらを特異的に除去するために、抗CD45を用いた。抗CD45を次のように固相にコーティングした。
抗FITCはBD Biosciencesから購入し、50mMの重炭酸ナトリウム(pH 8.5)にて50μg/mLまで希釈した。抗FITC800μLを6ウェルのマイクロタイタープレートに添加し、室温で3時間、次いで2〜8℃で一晩、インキュベートした。一晩のインキュベーション後、プレートを室温にした。上清を吸引し、次いで、プレートをPBSで2回リンスした。次いで、1mLのPBS/1% BSAを用いて室温で4時間、ウェルをブロックした。緩衝液を吸引し、2mLのPBSでウェルを2回リンスした。リンスの後、全緩衝液を吸引し、プレートを1時間乾燥した。プレートは、使用するまで密封されたビニール袋に入れて2〜8℃で乾燥保管した。使用する日に、プレートを室温にした(最低30分間)。2mLのPBS/1% BSAをウェルに加え、15分間インキュベートした。吸引後、プレートを再び2mLのPBS/1% BSAでリンスした。サンプルをウェルに加える前に緩衝液を吸引した。
SKBR3細胞でスパイクした7.5mLのEDTA血液を、CellSearch CTCキットを用いてAutoPrepで処理した。このCTCアッセイからの濃縮されたサンプルを2μg/mLの最終濃度で抗CD45−FITCで染色した。2mLのPBS/1%BSAでサンプルを2回洗浄し、15分間磁性分離することによって、過剰のCD45−FITCを除去した。最終的なサンプルを900μLのPBS/5%BSAに再懸濁し、次いで、抗FITCでコーティングしたウェルに加えた。15分毎にやさしく攪拌して、サンプルを1時間インキュベートした。1時間後、300μLの上清をウェルから除去し、フローサイトメーターによって白血球及びSKBR3細胞の数を判定した。フローサイトメトリーによってSKBR3細胞を検出するために、アロフィコシアニン染料(APC)にコンジュゲートされた抗Her2neuで細胞を標識した。白血球は抗CD45−FITCで標識されているので、FITCチャネルに検出された。図2には、枯渇の前及び後に検出された細胞が示されている。
本実施例は、WBC枯渇の原理を他の希少細胞アッセイにも適用できることを示す。CellSearch CECアッセイは、CellSearch CECキットを用いて血液由来のCECを濃縮する。このキットは、CECの捕獲のための磁性流体磁性粒子にコンジュゲートされた抗CD146を含んでいる。このアッセイは、CTCアッセイと同様に、サンプルの調製のためにCellTracks AutoPrepシステムを用いる。CECは健常な血液サンプルに低頻度で存在するが、癌、心血管障害、感染症などの様々な条件によって上昇する。
6人の健常ドナーからの複製したEDTA血液7.5mLを、調整したCellSearch CTC Profileキットを用いてAutoPrepで処理した。WBCの標識がAutoPrepで行われるように、ProfileキットのPBS/ビオチン試薬に、2μg/mLの最終的な試薬濃度で抗CD45−FITCを補充した。AutoPrepで濃縮後、各ドナーからのチューブ1つを、サンプルからWBCを除去した「枯渇」プロトコル、又は枯渇処理なしのサンプルにおけるWBC汚染を測定するための対照として用いられる「非枯渇」プロトコルのいずれかに供した。
AutoPrepからサンプルを取り出し、マグネットに15分間置いた。緩衝液を吸引し、細胞をRLT緩衝液(Qiagen)に溶解した。
AutoPrepで濃縮後、2mLのPBS/1%BSAでサンプルを2回洗浄し、15分間磁性分離することによって、過剰のCD45−FITCを除去した。最終的なサンプルを900μLのPBS/5%BSAに再懸濁し、次いで、抗FITCでコーティングしたウェルに加えた。15分毎にやさしく攪拌して、サンプルを1時間インキュベートした。1時間後、300μLの上清をウェルから取り出し、細胞をマグネットに15分間置いた。緩衝液を除去し、細胞をRLT緩衝液(Qiagen)に溶解した。
CD45枯渇法の潜在的利点の1つは、白血球が寄与するバックグラウンド遺伝子発現がある程度存在するときにCTCを検出する能力又はCTC遺伝子発現を特定化する能力が改善されていることである。白血球数の低下はバックグラウンド遺伝子発現を低下させ、より少数のCTCにおいて転写物を検出する能力を改善するはずである。
CD45枯渇法の主な利点は、CTCの分子特性化の改善を可能にし、白血球が寄与するバックグラウンド遺伝子発現を最小限にすることである。
本実施例は、CellSearch Profile Kitを用いて濃縮したサンプルに存在する夾雑白血球の数を減少させるための代替方法を説明する。EpCAMに基づいた免疫磁性濃縮の後、夾雑CD45+WBCをプラスチックビーズで標識する。ビーズと結合したCD45+細胞を保持し未結合のCTCを通過させるフィルタで混合物を濾過して、WBCをCTCから分離する。こうして、より少ない数の夾雑WBCを用いる分子解析又は細胞解析にCTCが利用可能になる。
(1) 濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去する方法であって、
(a)ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーで白血球を標識する条件下で、ハプテンにコンジュゲートされたかかる白血球マーカーを用いて、かかるサンプルを処置する工程と、
(b)工程(a)の組成物を、かかる標識した白血球に接着する第2の媒体を用いて処置する工程と、工程(b)の組成物から、前記第2の媒体及びその接着した標識された白血球を分離する工程と、を含む、方法。
(2) 前記濃縮した希少細胞が、CTC、CEC、CMMC、及びCMCからなる群から選択される、実施態様1に記載の方法。
(3) 前記濃縮した希少細胞が、CTC及びCECからなる群から選択される、実施態様1に記載の方法。
(4) 前記濃縮した希少細胞がCTCである、実施態様1に記載の方法。
(5) かかる濃縮した希少細胞を免疫磁性マーカーで標識する、実施態様1に記載の方法。
(7) 前記白血球マーカーが、CD45、CD19、CD15、グリコフォリンA、CD2、CD14、CD16、CE38、及びCD66bに対する抗体からなる群から選択される、実施態様1に記載の方法。
(8) 前記白血球マーカーが、抗−CD45である、実施態様1に記載の方法。
(9) 前記白血球マーカーが、CD45のエピトープを含む抗体フラグメントである、実施態様1に記載の方法。
(10) 前記ハプチンが、フルオレセイン染料(「FITC」)、フィコエリトリン(「PE」)、アロフィコシアニン(「APC」)、及びビオチンからなる群から選択される、実施態様1に記載の方法。
(12) 前記濃縮した希少細胞がCTCであり、前記白血球マーカーが抗−CD45であり、前記ハプチンがビオチンである、実施態様1に記載の方法。
(13) 濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去するためのキットであって、ハプテンにコンジュゲートされる白血球マーカーと、前記白血球マーカー以外の第2のマーカーとを含み、前記第2のマーカーは、かかるハプテンに対する抗体を含む、キット。
(14) 濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去するためのキットであって、前記希少細胞及び白血球を免疫磁性法でマーキングするための試薬と、ハプテンにコンジュゲートされる白血球マーカーと、前記白血球マーカー以外の第2のマーカーとを含み、前記第2のマーカーは、かかるハプテンに対する抗体を含む、キット。
Claims (11)
- 濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去する方法であって、
(a)ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーで白血球を標識する条件下で、ハプテンにコンジュゲートされたかかる白血球マーカーを用いて、かかるサンプルを処置する工程であって、前記濃縮した希少細胞及び前記白血球は、ステップ(a)の前に、免疫磁性マーカーで標識されて、免疫磁性法により濃縮されている、工程と、
(b)工程(a)の組成物を、かかる標識した白血球に接着する第2の媒体を用いて処置する工程と、工程(b)の組成物から、前記第2の媒体及びその接着した標識された白血球を分離する工程と、を含み、
前記濃縮した希少細胞は、CTC、CEC、CMMC、及びCMCからなる群から選択され、
ステップ(b)は免疫磁性法を含まない、方法。 - 前記濃縮した希少細胞が、CTC及びCECからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記濃縮した希少細胞がCTCである、請求項1に記載の方法。
- 前記白血球マーカーが、CD45、CD19、CD15、グリコフォリンA、CD2、CD14、CD16、CE38、及びCD66bに対する抗体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記白血球マーカーが、抗CD45である、請求項1に記載の方法。
- 前記白血球マーカーが、CD45のエピトープを含む抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。
- 前記ハプテンが、フルオレセイン染料(「FITC」)、フィコエリトリン(「PE」)、アロフィコシアニン(「APC」)、及びビオチンからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ハプテンがFITCである、請求項1に記載の方法。
- 前記濃縮した希少細胞がCTCであり、前記白血球マーカーが抗−CD45であり、前記ハプテンがビオチンである、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法における使用のためのキットであって、前記ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーと、前記ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカー以外の第2のマーカーとを含み、前記第2のマーカーは、前記ハプテンに対する抗体を含む、キット。
- 請求項1に記載の方法における使用のためのキットであって、前記希少細胞及び白血球を免疫磁性法でマーキングするための試薬と、前記ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーと、前記白血球マーカー以外の第2のマーカーとを含み、前記第2のマーカーは、前記ハプテンに対する抗体を含む、キット。
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