JP2005501236A - 分析用の細胞および生物学的検体の安定化 - Google Patents

分析用の細胞および生物学的検体の安定化 Download PDF

Info

Publication number
JP2005501236A
JP2005501236A JP2003523608A JP2003523608A JP2005501236A JP 2005501236 A JP2005501236 A JP 2005501236A JP 2003523608 A JP2003523608 A JP 2003523608A JP 2003523608 A JP2003523608 A JP 2003523608A JP 2005501236 A JP2005501236 A JP 2005501236A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
coagulant
stabilizer
group
composition
polyethylene glycol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003523608A
Other languages
English (en)
Inventor
ガラ・チャンドラ・ラオ
メリッサ・ハーマン
ハーマン・ラトナー
レオン・テルスタッペン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunivest Corp
Original Assignee
Immunivest Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26979228&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2005501236(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunivest Corp filed Critical Immunivest Corp
Publication of JP2005501236A publication Critical patent/JP2005501236A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/549—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic with antigen or antibody entrapped within the carrier
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Abstract

血液検体中の稀な細胞を安定化させ、血液検体の品質を維持し、および細胞固定剤としても働く組成物および方法を開示し、これは、標的細胞（例えば、循環腫瘍細胞）の喪失、および標的細胞、非−標的細胞および血漿成分からのデブリスおよび凝集体の形成を最小化し、それにより、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および、究極的には、癌患者における腫瘍負荷のより正確な分析および分類を可能とする。検体の安定化は、癌患者から吸い取った血液検体からの稀な細胞の豊富化を必要とするプロトコルにおいて特に望ましい。例えば、通常の処理、混合、震盪、血液輸送による遅延で遭遇する潜在的にストレスのかかる条件へのそのような検体の暴露は、ＣＴＣの数を減少させるのみならず、もし存在すれば、標的細胞の正確な計数に干渉することが見出されている血液検体中でデブリスおよび凝集体を発生させないことが観察された。安定化剤は、イン・ビボＣＴＣ崩壊およびイン・ビトロ試料劣化の間を区別するのに必要である。

Description

【０００１】
発明者：Galla Ghandra Rao、Melissa Hermann、Herman RutnerおよびLeon WMM Testrappen
【０００２】
優先権の情報
本出願は、２００１年８月２３日に出願された米国仮出願番号60/314,151および２００２年４月３日に出願された米国仮出願番号60/369,628に対して米国特許法第１１９条（ｅ）の下に優先権を主張する。これらの出願は、共に、ここに引用して一体化させる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に、細胞および血液の安定化の分野、さらに詳しくは、血液検体中の稀な細胞の安定化、最も詳しくは、引き続いての豊富化および分析のための全血中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の安定化に関する。
【０００４】
発明の背景
腫瘍細胞は１８６９年と早くに血液中で検出された。原発性癌は、臨床的発現の出現に先立って、初期の病気段階において新形成細胞を循環系に放出することを始めるという証拠がある。腫瘍の血管形成に際して、循環系に放出される腫瘍細胞は、離れた部位に付着し、そこで集落化して転移を形成することができる。これらの循環腫瘍細胞は、通常、健康な個体では見出されず、かくして、特定の癌腫の診断および治療のための基礎を形成することができる。新生血管形成は、腫瘍が、検出のためにはほぼ５ｍｍの腫瘍サイズを要する乳房撮影法のごとき慣用的方法によって、検出されるには余りにも小さなサイズである１ないし２ｍｍの直径まで成長したときに起こる。現在の価値ある標準的乳房撮影法よりもより初期の段階で少数のＣＴＣを検出するための感度および特異性を有するテスト方法は、初期段階の癌の診断および病気の管理を劇的に改良できるであろう。Terstappenらによる米国特許第6,365,362号にそのようなテストが教示されており、ここに、それを引用して一体化させる。
【０００５】
全血は、患者の体内で起こるとここに定義されるイン・ビボで、血液吸取後に起こるとここでは定義される、６時間を超える間に延長された保存で特に起こり得る多数の生化学および酵素反応を受けることができる細胞および可溶性成分の種々の集団を含む複雑な体液である。これらの反応のいくつかは、外来性種としての循環腫瘍細胞の破壊に向けられる。患者の免疫応答は、さらに、ファゴサイトーシスおよび好中球活性化を含めた通常の防御メカニズムによって、腫瘍細胞を弱らせるか、または破壊する。化学療法は、同様に、壊死による細胞死滅を誘導することによって、細胞の機能および増殖の双方を低下させることが意図される。
【０００６】
これらの外的破壊因子に加え、きびしい条件の環境中で損傷した腫瘍細胞は、プログラムされた死滅またはアポトーシスを受けるであろう。アポトーシスまたは壊死を受けつつある細胞は、変化した膜透過性を有し、それによりＤＮＡ、ＲＮＡおよび他の細胞成分の逃避を可能とし、それは、細胞デブリスの形成および結局はＣＴＣの完全な崩壊に至る。そのような腫瘍細胞デブリスは、無傷細胞に特徴的なエピトープを依然として担っており、循環癌細胞の偽の増加に至り得る。健康な個体からの全血検体でさえ、低下した血液の質と広く分類され、ここで定義される細胞組成の実質な変化を受け、これは、２４時間よりも長い間の延長された貯蔵で起こり得る。赤血球は破裂し、ヘモグロビンを放出し、細胞ゴーストを生じる。白血球、特に顆粒球は、貯蔵に際して不安定であり、消滅することが知られている。そのような変化は、正常な血液細胞に由来する細胞デブリスの量を増加させるか、または蛋白質が、ＣＴＣのごとき稀な標的細胞の単離および検出に干渉することが見出されている。これらの破壊的プロセスの組み合わされた効果は、例えば、フローサイトメトリーおよび顕微鏡分析で容易に検出できる細胞デブリスの実質的な増加を示す。そのような分析のための方法は、ここに引用して一体化させる、「循環腫瘍細胞、断片およびデブリスの分析」なる発明の名称の共通に所有された同時係属出願に記載されている。
【０００７】
顕微鏡イメージングによる循環腫瘍細胞の検出は、分類可能な腫瘍細胞の偽りの減少および干渉する染色可能なデブリスの対応する増加によって同様に悪影響を受ける。よって、血液吸取および検体処理の間に２４時間もの長い遅れがあり得るので、血液検体の完全性または品質の維持は極度に重要である。
【０００８】
このアッセイのための血液の処理で用いられる技術および器具は各研究所では容易には入手できないので、そのような遅れはかなり通常のものである。試料処理のために研究所に試料が到達するのに必要な時間はかなり変化し得る。従って、試料を処理することができる時間ウインドウを確立するのは重要である。しかしながら、稀な血液細胞の分析はより臨界的であるので、血液試料を分析できる時間ウインドウは短縮される。その例は、一般に行うのに２４時間以内を必要とする血液細胞の免疫表現型分けである。癌血液アッセイにおいては、より大きな容量の血液を処理しなければならず、血液試料の劣化はより問題となり得る。というのは、細胞を崩壊させることによって放出される物質はバックグラウンドを左右させかねず、従って腫瘍細胞を検出する能力を低下させるからである。
【０００９】
経時的な正常血液細胞の安定性および安定化に関する膨大な公開されたまたは特許された技術があり、いくつかの専有市販の安定化剤、例えばStreck Laboratories, Omaha, NEからのCyto-ChexTM、BioErgonomics, St, Paul, MNからのStabilCyteTM、およびUK MEQAS, Sheffield, UKからのTRANSfixTMが、白血球を保存するために入手できる。
【００１０】
WO 97/45729においては、TRANSfixTM安定化剤が、病理学的検体の分析に特に、ＨＩＶおよび白血病血液検体で適していると主張されている。しかしながら、これらの出願では、長期間の貯蔵の間にＣＴＣを安定化し、または保護するためのTRANSfixTM安定化剤の使用についてデータは示されていない。TRANSfixTM安定化剤は架橋固定剤パラホルムアルデヒドおよび重金属イオンを含むと主張されている。また、それは、フローサイトメトリーによって測定されたごとく、少なくとも５日間顆粒球を含めた白血球の一体性を保存することが示された。ＣＴＣまたは他の病原体についてはデータは示されていない。
【００１１】
パラホルムアルデヒド、またはパラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサールを含有する試薬の欠点にもかかわらず、そのような試薬は、血液または組織学検体中の腫瘍細胞を固定し、安定化するために頻繁に使用されている（例えば、D.B.Tseら、米国特許第6,004,762号参照）。さらに膜構造および脆いＣＴＣの一体性を弱めるサポニンまたは界面活性剤のごときポア−形成試薬をＣＴＣに浸透させた後、効果的な固定は特に重要である。浸透化は、例えば、核染色ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）での、およびサイトケラチンについてのごとき、ＣＰＣを特徴付け、およびそれを正常血液細胞から区別するのに用いられる標識抗体での細胞内エレメントの染色または免疫染色を可能とするのに必要である。
【００１２】
二官能性または架橋性アルデヒドに対する別の固定剤が用いられてきた。より古い固定剤のいくつかは、皮革のなめしの作用の態様と同様に重金属、例えばクロムまたはマンガンに基づいているが、特異性および毒性のそれらの欠如は適用を制限する。固定に対するもう１つのアプローチは、保存剤として化粧品で広く用いられているホルムアルデヒドの単官能性誘導体、または複素環アミンまたはアミドのメチロール誘導体、例えば、ジアゾリジニル尿素およびイミダゾリジニル尿素を利用する。また、（約２０，０００ＭＷの）ポリエチレングリコールは白血球のための効果的な安定化剤として記載されている。そのような化合物は、一時的には、血液学制御として用いるための特定の血液細胞集団を安定化されることが意図された。Streck Laboratries，Omaha NEに対して発行されたいくつかの米国特許に開示されている（米国特許第5,459,073号；米国特許第5,849,517号；米国特許第5,981,282号；米国特許第6,017,764号；米国特許第6,051,433号；米国特許第6,124,089号；米国特許第6,159,682号；米国特許第6,200,500号）。
【００１３】
メチロール誘導体の作用態様は知られていないが、過剰な固定剤の除去に際して解離し得る細胞蛋白質のアミノ基との弱い可逆的な結合を含むと推測される。メチロールまたはヒドロキシメチル誘導体は、化学的に不安定であり、蛋白質とで短い範囲の、または単一炭素の架橋を形成し得る少量のホルムアルデヒドを放出し得る。いわゆるホルムアルデヒドドナーから放出されたホルムアルデヒドは、核酸塩基、特に、アデニンと反応して、ヒドロキシメチロール誘導体およびメチレンブリッジを可逆的に形成し、それにより、核酸を不可逆的に架橋させると報告されており、これは化粧品における殺生物作用態様であり得る。しかしながら、遊離ホルムアルデヒドは、前記特許においてはCyto-ChexTM安定化剤において有効成分であるとは主張されていない。これらの特許は、血液または他の生物学的検体において、ＣＴＣを安定化するか、または固定化する用途を開示していない。血液中の腫瘍細胞の循環は、ＣＴＣの知られた脆性のため正常な血液細胞と同様に安定化され、もしそれが起これば、ＣＴＣのいずれの安定化も処理工程の間に終始存在すると推定することができない。従って、ここに、我々が、もし存在すれば、ＣＴＣの正確な分類および計数を必要とする豊富化および検出手法で臨界的であることを示した、貯蔵の間にイン・ビトロでＣＴＣを安定化するための、および血液を加工し、および血液の品質を保持するための効果的な試薬を同定することに対する明らかな要望が存在する。
【００１４】
発明の概要
安定化剤は、イン・ビボでの腫瘍細胞の崩壊およびイン・ビトロ試料分解による崩壊を区別するのに必要である。本発明により、生物学的検体の品質を維持するための安定化剤、固定剤および保存剤として働くいくつかの組成物が発見された。また、生物学的検体を安定化するための方法および装置も発見された。これらの改良または発見は、本明細書中に記載された発明が、当該分野におけるシステムおよび方法を凌いで大いに改良され、および全血におけるＣＴＣの豊富化および計数の適用を有することを可能とした。
【００１５】
多数の組成物が、血液検体を保存するのに発見されている。これらの組成物は、抗−凝固剤および安定化剤の組合せである。さらに、本発明は、安定化された試料、抗−凝固剤、および安定化剤または複数安定化剤の組成物を教示する。さらに、本発明は、生物学的検体をこれらの組成物と接触させて安定性を増強させる種々の方法を教示する。さらに、本発明は、生物学的検体をこれらの組成物と接触させて、安定性を増強するための種々の装置を教示する。一般に、これらは、生物学的検体を保存するために、特に、血液試料中のＣＴＣを保存するのに用いることができる。
【００１６】
従って、血液吸取に先立って、安定化剤を血液収集試験管へ添加することを含む改良されたプロトコルが提供される。また、血液試験管中の変化させた容量の検体を補うためのプロトコルを含めた、血液吸取直後に安定化剤を血液試験管に添加する方法が本発明によって提供される。
【００１７】
さらに、生物学的検体の処理で用いる１以上の緩衝液に安定化剤を添加し、かくして、必要であれば、両者は安定化剤および／または固定化剤として働く方法が本発明によって提供される。従って、本発明の主な目的は、分析に先立って、生物学的検体用の安定化剤を提供することにある。本発明の具体的な用途は、血液試料中のＣＴＣを安定化させることに向けられる。不意の混合の間に、または輸送中の不意の混合または震盪の間に、あるいは分析に先立っての検体の機械的再混合の間に起こり得るごとく、機械的応力に暴露された場合、全血検体を少なくとも２４時間、７２時間まで維持するための安定化剤および保存剤を提供するのが本発明のもう１つの目的である。
【００１８】
本発明によるこれらの発見は、当業者によって考えることができる組成物および方法の多くのさらなる潜在的適用の例示であり、かくして、本発明の範囲を限定する意図ではないことは理解され、認識されるべきである。従って、添付の請求の範囲と共に、以下の詳細な記載から、本発明の他の目的および利点は当業者に明らかであろう。
【００１９】
発明の詳細な記載
本明細書中においては、当業者によく理解される種々の用語を用いる。これらの用語の意図された意味は、認められた意味から逸脱するものではない。
検体試料または血液の品質は、以下のパラメーターによってここでは定義され、実験的に決定される；
１．ＣＴＣまたはスパイクされた培養腫瘍細胞と比較して、バックグラウンドとして非特異的に選択される白血球の相対的数；
２．核染色ＤＡＰＩで検出可能に染色される粒状物質およびより大きな凝集体によって測定されるＤＮＡまたはＤＮＡ断片を含む細胞デブリス；および
３．白血球上のＣＤ−４５についてのフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗−サイトケラチン抗体で、またはアロフィコシアニン（ＡＴＣ）−標識抗体で非特異的に、または特異的に検出される細胞質デブリスまたは凝集体。
【００２０】
用語「生物学的検体」または「生物学的試料」は相互交換的に用いることができ、注目する細胞を含むことが疑われ、かつ分析されるべきヒト対象から採取された流体または組織の小部分をいう。生物学的検体は流体または細胞部分、または可溶性物質を含む部分をいうこともできる。生物学的検体または生物学的試料は、限定されるものではないが、末梢血液、組織ホモゲネート、乳頭吸引物、結腸洗浄物、痰、気管支洗浄物のごとき体液、およびヒト対象から得ることができる細胞のいずれの他の源も含む。例示的な組織ホモゲネートは、乳癌患者における前哨節から得ることができる。
【００２１】
用語「稀な細胞」とは、本明細書中においては、生物学的検体に普通には存在しないが、感染症、慢性病、負傷または妊娠のごとき異常な状態のインジケーターとして存在し得る細胞と定義される。また、稀な細胞とは、生物学的検体に普通は存在し得るが、正常な生物学的検体に典型的には存在する細胞よりも数桁低い頻度で存在する細胞もいう。
【００２２】
用語「抗−凝固剤」または「抗−凝固試薬」は相互交換的に用いることができ、いずれの望まない天然または人工の凝固、凝集反応、または凝集をも阻害する目的で生物学的検体に添加される組成物をいい、さらに、集合的に、「クランピング」または「集塊形成」と定義される。しかしながら、そのような集塊は、もし、それらが無傷ＣＴＣについての分類基準を満たすならば、無傷ＣＴＣとして個々にカウントされるＣＴＣの「クラスター」または凝集体とは区別されなければならない。二次転移性腫瘍部位を確立するためのその接着性および特性によって、ＣＴＣのクラスターは、単一ＣＴＣよりも大きな増殖能力を有すると考えられ、かくして、それらの存在は診断的にはかなり有意義である。凝固の例は、血液凝固であり、通常の抗−凝固剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）によって例示される、またはヘパリン、ならびにヘパリン硫酸および低分子量ヘパリンのごときヘパリン種のごとき錯化剤によって例示されるキレート化剤である。
【００２３】
（ここでは、相互交換可能に用いられる）理想的な「安定化剤」または「保存剤」は、標的細胞の単離、検出および計数、および非標的細胞からのその区別を断じて邪魔しない、生物学的検体中の凝集体および／または細胞デブリスに干渉する形成を最小化させつつ、生物学的検体に存在する注目する標的細胞を保存することができる組成物と定義される。他の用語においては、抗−凝固剤と組み合わせた場合、安定化剤は抗−凝固剤の性能に対立的に作用するべきではない。逆に、抗−凝固剤は安定化剤の性能に干渉すべきではない。加えて、開示された凝固剤は、浸透された細胞を固定し、それにより、それを安定化させる第３の機能としても働き、ここに、該表現「浸透された」または「浸透」および「固定する」、「固定された」または「固定」は、細胞生物学においては慣用的に定義されるごとく用いられる。本明細書中における安定化剤の記載は、濃度または量が損傷を引き起こすことなく標的細胞を安定化させるのに有効な場合、細胞生物学における当業者に容易に明らかな、適切な濃度または量においてこれらの剤を用いることを意味する。稀な細胞を保存する目的で本発明の組成物、方法および装置を用いる者は、明らかに、それらを用いてこれらの同一の稀な細胞を損傷し、または破壊せず、従って、適切な濃度または量を固有に選択するであろう。例えば、ホルムアルデヒドドナーであるイミダゾリジニル尿素は、当該検体の容量の０．１ないし１０％、より好ましくは０．５ないし５％、最も好ましくは約１ないし３％の好ましい濃度にて効果的であることが判明した。また、ポリエチレングリコールのごときさらなる剤は、検体容量の約０．１％ないし５％、より好ましくは約０．１％ないし１％、最も好ましくは約０．１％ないし０．５％の好ましい濃度で添加された場合、効果的であることが判明した。
【００２４】
安定化剤は、少なくとも数時間の間、試料を保存することができなければならない。しかしながら、本明細書中に示した実施例では、試料は少なくとも７２時間まで安定化させることができるのが示される。そのような長期間の安定性は、試料が、処理および分析が行われる場所とは離れた場所で得られる場合に重要である。さらに、試料は、輸送の間の機械的損傷に対して安定化されなければならない。
【００２５】
用語「循環腫瘍細胞」またはＣＴＣとは、しばしば、大きな数で腫瘍から放出されることが知られている細胞をいう。定常状態レベルは、腫瘍負荷のサイズに依存する、ＣＴＣの破壊が放出速度に等しい場合に維持される（JG Morenoら、"Changes in Circulating Carcinoma Cells in Patients with Metastatic Prostate Cancer Correlates with Diseases State" Urology 58. 2001参照）。一般に、より抵抗性で増殖性の細胞は、生存して、二次的または転移性部位を確立する。循環腫瘍細胞は、本発明によって安定化し、または固定すべき好ましい標的の稀な細胞である。
【００２６】
用語「細胞組成物」とは、生物学的検体に由来する最もありそうには異なるタイプの複数の細胞をいう。この細胞組成物は、標的および非標的細胞を共に含む。例えば、癌を有することが疑われる対象から採取された血液の一部において、細胞組成物は赤血球細胞、白血球細胞、およびもし存在すれば循環腫瘍細胞であろう。しかしながら、本明細書中に記載するごとく、技量のある生物学者であれば、生物学的検体の源に依存して、他の生物学的検体は異なる細胞型を含むことを認識するであろう。
【００２７】
（ここに引用して一体化させる）米国特許第6,365,362号においてTerstappenらによって教示されたもののごとき豊富化の方法の間に、豊富化された細胞画分は主として白血球および、もし存在すれば、かなり少ない数のＣＴＣを含む。処理の間に、細胞には温和な界面活性剤ImmunipermTM（０．０５％サポニン−Immunicon Corp, Huntingdon Valley, PAを含有するＰＤＳ）を浸透させて、約８ｍｍの直径の小さなポアを形成させ、免疫染色抗体、抗−サイトケラチン−ＰＥ、および核染色ＤＡＰＩの侵入を可能とする。ＤＡＰＩは、細胞および細胞外ＢＭＥ中のアデニン−チミンに選択的に結合する蛍光インターカレーティング色素である。これらのポアは、さらに、細胞膜の構造的一体性を弱め、穴を「ふさぐ」ための染色の後に、細胞固定剤または安定化剤を必要とする。前記したごとく、浸透した膜を強化することを意図した、当該分野において慣用的なアルデヒドおよび重金属ベースの固定剤は、本発明で用いる磁気収集のプロセスおよび染色プロトコルに適合しないことが判明した。対照的に、本発明で用いるCyto-ChexTM安定化剤は、予期せぬことに、染色後工程において固定剤としてかなり効果的であることが判明し、かくして、本明細書中で提案された試薬処方に含める。よって、同時または順次に記載され、本発明で用いる安定化剤は、３つの臨界的な機能を行うことが発見された：
１．輸送、貯蔵、試料調製および引き続いての分析のための血液検体中でのＣＴＣ非標的細胞の安定化
２．デブリスおよび／または凝集体形成を阻害することによる血液検体の品質の維持および
３．浸透後における固定剤としての働き。
【００２８】
これらの機能の１以上は、本発明で利用される豊富化アッセイにおいてＣＴＣまたは稀な細胞の正確な分子に必須であることが判明した。
（例えば、ＤＡＰＩのごとき核色素によって染色可能な）染色可能な核の存在は、有核細胞の必須の形態学的特長である。陽性ＤＡＰＩ染色は、ＤＡＰＩ−虚弱またはＤＡＰＩ−陰性によって特徴づけられた「疑われるＣＴＣ」および／または抗−サイトケラチン抗体によって認識される細胞骨格蛋白質の不規則なまたはまだらな細胞質染色から区別される「無傷ＣＴＣ」としてのサイトケラチン−陽性細胞を定義し、それを分化させるにおける臨界的な要素である（図５ａ）。無傷および疑われるＣＴＣは、ともに、ＤＡＰＩ−陽性であるが、白血球−特異的マーカーＣＤ４５を発現する白血球から区別することができる。「疑われるＣＴＣ」は、無傷ＣＴＣと結合することができ、「無傷ＣＴＣ」に由来するか、あるいは腫瘍部位から循環系に放出された上皮細胞起源の壊死、アポトーシス細胞または「アポトーシス体」であり得るいくつかの形態学的特徴を依然として有する（図５ｂ）。
【００２９】
粒子または検出可能な事象の第３のカテゴリーは表ＩＩおよび図５および図５ｂにおいて印をつけた「帰属されない事象」、「疑われるＣＴＣ」と同様な染色特徴を有することができるが、細胞の構造形態学的特徴は欠き、すなわち、それらは、安定化された血液検体と比較して不安定化が統計学的により支配することが見出された大いに不規則な凝集体または凝塊である（ｐ＝０．０３２７）。安定化された血液検体における「無傷ＣＴＣ」に対する実質数の「疑われるＣＴＣ」の存在は、増殖／腫瘍負荷、患者の免疫状態および／または治療応答に関する臨床化に対して重要な診断情報を提供することができる。表Ｉは、８人の癌患者における無傷ＣＴＣ、疑われるＣＴＣ、および「帰属されない事象の相対数」に対する異なる安定化剤の安定化効果を示す。表ＩＩは、安定化剤無しと比較した発散したCyto-ChexTM安定化剤での（帰属されない事象）の数の有意な減少（ｐ＝０．０３２７）および癌腫を持つ３１人の患者における安定化剤無し（ｐ＝０．０００４）と比較したＣＴＣに対するCyto-ChexTM安定化剤の有意な安定化効果を示す。疑われるＣＴＣの数は、安定化された、および安定化されていない血液の間で統計学的に異ならなかった（ｔ＝０．１５４８）。不安定化血液におけるバックグラウンドの上昇についてのありそうな原因は、「真実の」疑われるＣＴＣとは区別できない人工物である。イン・ビボで形成された人工物および疑われるＣＴＣまたは腫瘍デブリスの間の識別は、臨床的重要性を有することができ、血液吸取およびＣＴＣ分析の間の試料の分解によって引き起こされた人工物からの寄与なくして患者の血液中のＣＴＣ状態の評価を可能とする血液／ＣＴＣ安定化剤に対する必要性を強調する。以下の実施例で用いた豊富化プロセスにおいて、（ここでは包括に特別に言及しない限りは無傷および疑われるＣＴＣ双方よりなる）ＣＴＣ、細胞断片および細胞デブリスは、（例えば、ここに引用して一体化させる米国特許第6,120,856号に記載されたごとく、約０．２μｍ（２００ｎｍ）直径に付着した抗ＥｐＣＡＭ抗体で）ＣＴＣ上の特異的な表面マーカーを認識する磁気的に標識された抗体で捕獲される。ＣＴＣの表面の多数の小さいが密な磁性粒子の存在はさらに、磁気（場内）インキュベーションの間および磁気収集の間に、高勾配磁気セパレーター（例えば、米国特許第5,186,827号および第5,466,574号のもとで特許されたImmunicon四極子９ＭＳ１７）内で発生した強力な磁場中での、磁気的に標識された細胞の迅速な移動の間で弱まった非安定化細胞膜をさらに高くした。
【００３０】
本発明の安定化剤は、遠心、撹拌およびピペッティングにおけるごとき、普通の検体処理の間にさえ磁気および非−磁気応力双方から起こり得る磁気的に標識した細胞に対する損傷を阻害することが判明した。例えば、Dynal Inc., Lake Success, NYによって販売されている２．８μｍおよび４．５μｍ直径のより大きな磁性粒子またはビーズでの免疫磁気標識を用いる場合に、稀な細胞およびＣＴＣに対する実質的により大きな損傷が観察された。
【００３１】
血液吸取および引き続いての検体の処理の間に、末梢循環系に存在する生存するつぶされた腫瘍細胞には、排気した試験管への血液吸取の間における乱れによって、および検体の処理、例えば、分析に先立っての血液試験管の輸送および混合によって、さらに応力がかかり、損傷され得る。そのような機械的な損傷は、絶え間ない免疫学的、アポトーシス的および壊死的プロセスに追加されるものであり、時間依存的にイン・ビトロで起こるＣＴＣの破壊に至る。我々は、検体がより長く貯蔵されれば、ＣＴＣの喪失はより大きくなり、かつ干渉するデブリスおよび／または凝集体の量はより大きくなることを見出した。事実、本明細書に示すデータ（図１および２）は、室温に２４時間以上保存したいくつかの血液検体におけるＣＴＣカウントの劇的な減少を示し、これは、血液吸取の後におけるＣＴＣの実質的なイン・ビトロ破壊を示す。貯蔵の間の造血系細胞の喪失はよく知られた現象であって、Streck Labsその他による前記特許の主題であるが、混合または輸送による機械的損傷の発生は、今日まで、ＣＴＣまたは稀な細胞の喪失で認識された因子ではなかった。細胞デブリスの形成、およびＣＴＣまたは他の稀な細胞の分析におけるデブリスおよび凝集体を蓄積する干渉効果は今日まで同様に認識されていなかった。それは、比較的大きな血液容量（５ないし５０ｍＬ）の処理を必要とするかなり感度の良い豊富化アッセイ、および容量低下（１ｍＬ未満）の後における標的細胞の引き続いての顕微鏡検出またはイメージングにおいて最も明らかであり、かつ問題なようである。そのようなデブリスは通常は見られないか、あるいは、例えば、フローサイトメトリーによる慣用的な非豊富化アッセイにおいて、または密度勾配方法による豊富化において、干渉しない。
【００３２】
要約すると、前記因子の全てまたはいくつかは、本発明で開示する豊富化手法によるＣＴＣの検出に干渉しないように観察されたイン・ビトロのデブリスおよび／または凝塊形成に寄与することが判明した。本発明で開示する安定化剤組成物およびその使用は、予期せぬことに、ＣＴＣを保存し、検出可能な細胞デブリスおよび凝集体の形成を低下させることによって血液検体の品質を劇的に改良し、かつ豊富化プロセスにおいて安定化剤および固定剤として働くことが判明した。より重要なことには、ＣＴＣに対するイン・ビトロ損傷、および血液検体の品質の劣化を最小化する効果的な安定化剤の発見は、患者におけるＣＴＣのイン・ビボ状態のより完全な像を提供する。図５に示すごとく、無傷ＣＴＣ、損傷したまたは疑われるＣＴＣの数、ならびにＣＴＣに対する損傷の程度は、腫瘍負荷、腫瘍細胞の増殖能力、および／または治療の有効性の診断的に重要なインジケーターとして働く。対照的に、非−安定化試料を用いる現在の技術は、避けることのできるイン・ビトロ貯蔵および処理の損傷に、ＣＴＣに対する避けることのできないイン・ビボ損傷を重ねる。損傷したＣＴＣからの断片およびデブリスの分析は、患者で起こりつつあるのが何かを理解するのに重要である。従って、そのような分析を行うための方法および試薬は、「循環腫瘍細胞、断片およびデブリス」なる発明の名称の同時係属出願に記載されている。その共通に所有された出願を、ここに、引用して一体化させる。
【００３３】
以下の実施例により本発明を説明するが、これは本発明の範囲を限定する意図のものではなく、むしろ、本発明の一般的な使用の場合を提供する。
【００３４】
実施例１
血液中における循環腫瘍細胞の安定化
Cyto-ChexTM、StabilCyteTMおよびTRANSfixTMは、商業的に入手可能であって、長時間の間血液検体中の血液細胞を安定化する用途を有する３つの安定化剤の例である。これらの安定化剤は、（主として、収縮を最小化することによって）細胞のサイズを維持し、主として、フローサイトメトリーによって測定されるごとく、細胞表面の抗原を保持するように最適化される。意図した出願は、一般に、直接的分析を含み、試料の広範な操作または特定の細胞集団の豊富化を必要としない。対照的に、本発明で単離され、検出された循環腫瘍細胞、または他の稀な標的細胞は非常に低い頻度で存在する病理学的に異常なまたは稀な細胞を含み、そのように定義され、かくして、検出に先立って実質的な豊富化を必要とする。
【００３５】
ＣＴＣは、室温または２ないし８℃における２４時間の貯蔵の後においてさえ血液中でしばしば検出できるが、前記した理由によりより脆くなり得る。いずれの操作または豊富化方法もこれらの脆性細胞を損傷しかねないことが示され、かくして、単離のプロセスの間に、潜在的細胞の喪失およびデブリスおよび凝集体の形成がもたらされる。図１および２は、２４時間までの貯蔵に際してのいくつかの検体におけるＣＴＣの実質的な喪失を示す。
【００３６】
本実施例においては、２４時間古い検体からの豊富化の後におけるＣＴＣの患者に対する種々の安定化剤の効果を調べた。進行した癌腫を持つ患者からの血液試料を入手し、以下のごとく、血液吸取の２時間前に安定化剤で処理した。各患者から、ＥＤＴＡを含有する異なる試験管へ吸い取られた血液をプールし、等容量の１部を別々の試験管に入れた。Cyto-ChexTM安定化剤、StabilCyteTM安定化剤、およびTRANSfixTM安定化剤よりなる添加剤を、３０％Cyto-ChexTM安定化剤、２０％StabilCyteTM安定化剤、および１０％TRANSfixTM安定化剤において別々の試験管に添加し、ここに、これらは血液容量のパーセントである。１つの試験管を、緩衝剤または安定化剤を添加しない対照として用いた。次いで、試料を混合し、室温にて２４時間貯蔵した。等容量のImmunicon System緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．２％カゼインおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）を各試料に添加した。混合の後、試料を８００×ｇにて１０分間遠心して、血漿を除去した。Immunicon AB緩衝液（制御された可逆的凝集のメディエーターとしてのストレプトアビジンを含有するSystem緩衝液）（ここに引用して一体化される米国出願番号09/351,515および09/702,188に記載された技術）を、１．５×初期血液容量の最終容量まで試験管に添加した。試料を混合した後、ＣＡ ＥｐＣＡＭフェロフルイド（抗−ＥｐＣＡＭ抗体にカップリングした、制御された可逆的凝集のメディエーターとしてのデスチオビオチンと共に０．２μｍの磁性粒子）を試料に添加して、ＣＴＣを磁気的に標識した。
【００３７】
ここに引用して一体化させる米国出願番号09/240,939に記載されているごとく、各１０分後にＱＭＳ１７磁石の内側で再度混合しつつ２回の１０分間の期間、Immunicon四極子高勾配磁気セパレーター（ここに引用して共に一体化させる米国特許第5,186,827号および第5,466,574号下で特許されたＱＭＳ１７）の内側でＣＡ ＥｐＣＡＭフェロフルイドと共に試料をインキュベートした。これらの磁気インキュベーション後、試料を２０分間で磁気的に分離した。未収集画分を吸い取り、試験管をＱＭＳ１７から取り出した。磁気的に収集した画分をSystem緩衝液に再度懸濁させ、ＱＭＳ１７にて１０分間で再度分離した。未収集画分を再度吸い取り、収集された細胞を２００μｌのImmunipermTM(０．０５％サポニンを含有するＰＢＳ）に再度懸濁させて、捕獲された細胞を浸透させ、細胞内染色を可能とした。
【００３８】
浸透した試料を、いくつかの蛍光マーカー：２０μｌの抗−サイトケラチン−ＰＥ、２０μｌ抗−ＣＤ４５−ＡＰＣおよび２０μｌＤＡＰＩよりなるカクテルで１５分間で染色した。区別するための抗−サイトケラチンは上皮細胞を染色し、抗−ＣＤ４５は白血球を染色して、標的ＣＴＣから非特異的に染色されたいずれの白血球も区別する。ＤＡＰＩは、全ての有核細胞を同定し、細胞を非有核細胞デブリスから区別するのに用いられる。磁気分離によって過剰の染色試薬を洗い流した後、試料を３２０μＬのImmunicon CellFixTM（０．５％ＢＳＡ、１０ｍｇ／ｍＬビオチンおよび２５％Cyto-ChexTM安定化剤を含有するSystem緩衝液）に再度懸濁させた。
【００３９】
各試料は、（ここに引用して一体化させる米国出願番号10/074,900に記載されているごとき）Immunicon CellSpotter（登録商標）チャンバー、（ここに引用して一体化させる米国特許第6,136,182号に記載されているごとく）二極の角度をつけた磁石アセンブリーにフィットするように設計された光学的に平坦で透明な上方観察ウインドウを備えたキュレット様−エンクロージャーに移した。観察ウインドウの下面の磁気的に表示された標的細胞の磁気収集により、蛍光顕微鏡によるイメージングが可能となる。試料チャンバーの表面は４つの異なるフィルターで自動的にスキャンした。ソフトウェアによりイメージを収集し、分析するが、引き続いての再観察および分類のための優れたＣＴＣ候補としてのサイトケラチン−ＰＥおよびＤＡＰＩ双方につき陽性であるイメージのみ提示する。パン−白血球マーカーＣＤ４５−ＡＰＣの陰性染色を除き、サイトケラチン−ＰＥおよびＤＡＰＩについての形態および陽性染色を確認した後、分類された無傷ＣＴＣ、疑われるＣＴＣおよび「帰属されない事象」（デブリス粒子）をカウントした。表Ｉは、分析に先立っての２４時間における、種々の安定化剤での８人の癌患者からの検体を保存する効果を示す。結果は「無傷ＣＴＣ」、「疑われるＣＴＣ」および「帰属されない事象」の事象として表す。
【００４０】
【表１】
Figure 2005501236
【００４１】
安定化剤を添加しない血液試料と比較した場合、より多数の無傷および疑われるＣＴＣが、全ての３つの安定化剤でのこれらの血液試料の２４時間の貯蔵の後に患者試料のほとんどで検出された。無傷ＣＴＣから疑われるＣＴＣへの実質的な変換は安定化されていない検体で起こる可能性があり、あるいは細胞が喪失される可能性がある。これらのデータの統計学的解析は、安定化剤および安定化剤無しの間で検出された合計ＣＴＣの数の有意な差を示す（ｐ−値＝０．０２）この差は乳癌および前立腺癌双方の試料で観察された。しかしながら、３つのテストした安定化剤の間では差はなかった（ｐ−値＝０．１８）。安定化剤の存在下で検出されたより多い数の無傷および疑われるＣＴＣは非特異的染色による人工物であるとは考えられない。というのは、この効果は正常なドナーからの２４時間古い試料で観察されなかったからである。これらのデータは、癌患者からの血液試料での安定化剤の添加により、貯蔵の間におよび試料処理工程において循環腫瘍細胞を保存し、かくして、イン・ビボレベルの無傷ＣＴＣおよび疑われるＣＴＣのより正確な分類を可能とすることを明瞭に示す。
【００４２】
実施例２
分析についての試料の品質の保持
ＣＴＣは低い頻度で血液に存在し、検出には大きな試料容量および効果的な豊富化方法を必要とする。ＣＴＣのための豊富化方法は、細胞を損傷し、細胞からのＤＮＡ漏出によりデブリスおよび凝塊を生じさせかねない磁気分離方法を含めた何回かの洗浄工程を含む。しかしながら、予期せぬことには、むしろ驚くべきことには、血液細胞を懸濁したまま保持するためにほとんどの血液癌研究所でルーチン的に行われているごとき、旋回器での血液試験管の温和な回転させながらの混合は、ＣＴＣの検出および計数に干渉しかねない細胞デブリスの有意な形成を引き起こすことが判明した。さらに、血液吸引またはアッセイ試験管の不完全な充填は、さらに、この混合損傷を悪化させることが観察されたが、静止した試験管で損傷は観察されなかった。図３に示すごとく、送付の間の患者試料のいずれかの混合または他の機械的な応力もまた、予期せぬことに、干渉デブリスを増加させることが示された。表ＩＩは、血液試料の一晩の送付の後における、ＣＴＣの回収に対するCyto-ChexTM安定化剤の効果を示す。ＣＴＣの検出は、各臨床研究所ではルーチン的に入手できない大きな試料容量ならびに特殊な技能および装置を必要とする。その結果、それらの血液試料は、処理のために中央研究所まで送らなければならない。前記したごとく、ＣＴＣはデリケートであって、いずれの機械的混合または震盪も送付の間に細胞の損傷をしかねない。我々のデータは、本発明で開示した安定化剤を開示して血液検体の輸送、貯蔵および処理に先立ってＣＴＣおよび試料の品質を維持するのは絶対的に必須であることを示す。
【００４３】
ＣＴＣおよび試料の品質に対するこれらの悪影響は、今日まで検出から逃げてきた。というのは、そのように応力のかかった試料は、ほとんどの研究所または臨床分析で依然として満足できるからである。例えば、フローサイトメトリーによるイムノフェノタイピングは、デブリスの存在が見かけ上分析に干渉しないいずれの豊富化方法も必要としない。しかしながら、我々の試験は、顕微鏡または他の光学的方法によって豊富化された稀な標的細胞をアッセイする場合に、血液試料の品質を保持するのに臨界的に重要であることを示唆する。
【００４４】
実施例３
２ないし３時間混合された正常検体の試料の品質に対するCyto-ChexTM安定化剤の効果
細胞核のＤＡＰＩでの染色は、通常、もし核が無傷であれば浸透された、生きたまたは死滅した細胞内部で検出することができる。また、もしＤＮＡが漏出すれば、ＤＮＡ染色は、細胞外部の染色可能な凝集体のごとき細胞断片または細胞デブリスで検出することもできる。かくして、ＤＡＰＩへの染色、および蛍光顕微鏡下での観察は試料の品質を容易にチェックすることができる。３つの試験管分の血液を正常なドナーから１０ｍＬのＰＡ抗−凝固処理した試験管に吸い取った。CellStabilizeTM注射デバイスを用いることによって、キャッププラグを取り外すことなくCyto-ChexTM安定化剤を１つの血液試験管に以下のごとく添加した。適切な量の安定化剤の所望の最終濃度までの添加を可能とする血液容量を見積るのを可能とする平滑化にて、血液試験管をキャリブレートされたデバイスに入れた。第２の針（２０Ｇ，１１／２インチ）およびシリンジを用いて安定化剤の排気および必要な容量を試験管に注入しつつ、１つの針（２７ｇ，１／２インチ）を試験管のストッパーを通して挿入した。検体試験管をデバイスから取り出し、試験管を数回倒立させることによって混合した。２つの血液検体（１つは安定化剤無しのもの、もう１つは３０％Cyto-ChexTM安定化剤を含む試験管）を旋回ミキサーで２ないし３時間混合して、送付の条件を模倣した。安定化剤無しの対照として用いるために第３の血液試験管は混合しなかった。２ないし３時間後、７．５ｍＬの血液を各「安定化剤無し」試験管から移し、９．７５ｍＬの血液を「Cyto-ChexTM安定化剤」試験管から、実施例１に記載したごとき処理のために、別の１５ｍＬのポリプロピレン製遠心管に移した。
【００４５】
試料を、蛍光イメージング顕微鏡を用いるCellSpotter（登録商標）分析のためにImmunicon CellSpotter（登録商標）チャンバーに移した。チャンバーの観察ウインドウの下面に磁気的に配置された標的細胞につき、試料を４つの異なるフィルターでスキャンした。異なるフィルターからのイメージを貯蔵した。検出可能な有核ＣＴＣおよび非標的細胞の数と比較して試料の品質を検出可能なＤＡＰＩ染色事象（無傷ＣＴＣ、疑われるＣＴＣ、および染色可能な帰属されない事象）またはデブリスの数から決定した。最適な試料の品質のためには、染色可能な細胞デブリスおよび凝集体は、無傷ＣＴＣおよび疑われるＣＴＣの正確な検出および計数を可能とするように小さく保つべきである。
【００４６】
図３におけるイメージは、３０％Cyto-ChexTM安定化剤を添加した試験管（図３ｂ）と比較した。安定化剤無しでの血液試験管の輸送（図３ａ）の損傷効果を示す。同様に、図４ａ、図４ｂ、および図４ｃは、細胞核のＤＡＰＩでの染色を示す。安定化剤または撹拌なしの対照試料（図４ａ）およびCyto-ChexTM安定化剤＋混合を伴う試料（図４ｃ）と比較して、細胞を存在するいずれの安定化剤もなくして、混合した場合に（図４ｂ）多数のＤＡＰＩ染色可能細胞凝塊およびＤＮＡデブリスがあった。これらのデータは、予期せぬことに、血液試料の混合が脆性ＣＴＣのみならず、正常な造血細胞をも損傷し、それにより、豊富化後に検出できるデブリスおよび凝集体を生じることを示す。驚くべきことに、試料を混合する前の安定化剤の血液試料への添加は、双方の細胞損傷を最小化し、治療の品質を保持した。
【００４７】
実施例４
送付の間における循環腫瘍細胞におけるCyto-ChexTM安定化剤の効果
本実施例では、２つの試験管のＥＤＴＡ抗−凝固処理した血液を、浸透した段階の病気を持つ３１人の癌患者（３人は２回の別々の回数を受けた反復患者であった）から吸い取った。Cyto-ChexTMの最終容量が合計容量の３０％となるように、実施例３に記載したCellStabilizeTMデバイスでの排気を用い、Cyto-ChexTM安定化剤を試験管の１つの組に直接注入した。試験管の第２の組は未処理対照であった。次いで、双方の試料の組を、アイスパック無しの１晩の郵便によってImmuniconに送った。当該日付の古い試料をＣＴＣの豊富化およびCellSpotterTM分析による検出によって処理した。ＣＴＣを豊富化し、それを検出するのに本実施例で用いた手法は、実施例１で用いた手法と同様である。Cyto-ChexTM安定化剤の添加の有り無しでの血液試料に対する結果を表ＩＩに示す。
【００４８】
【表２】
Figure 2005501236
【００４９】
１を超える無傷ＣＴＣを示したいずれの試料も陽性であると考えられた。安定化剤無しまたは有りでのデータ組へのWilcoxon署名のランクテストの適用により、以下のｐ−値が得られた：
・無傷ＣＴＣ、ｐ＜０．０００４（大いに有意）、
・ＣＴＣが疑われる、ｐ＜０．１５５（有意でない）、および
・帰属されない事象、ｐ＜０．０３２７（有意）
【００５０】
Cyto-ChexTM安定化剤を加えた場合、ほとんどの検体は陽性となるか、あるいは無傷ＣＴＣの増加を示した。非−安定化検体でより多くの無傷ＣＴＣまたは疑われるＣＴＣが検出された場合は、おそらくは、人工的なものであり、無傷または疑われるＣＴＣからの「帰属されない事象」として分類される特徴的な細胞形態を伴わずして染色可能なデブリスおよび凝集体を区別するのが困難な結果である。平均して約３倍を超える無傷ＣＴＣは、非−安定化検体と比較して、安定化された検体で検出された。これらのデータは、腫瘍細胞および検体双方の品質を維持するに置いて、全血安定化剤の予期せぬ保存効果を強調する。
【００５１】
実施例５
２４ｖｓ７２時間安定化
送付実験において（実施例４）、安定化が、血液を吸い取った２４時間後に処理された試料で細胞を保存することが示された。しかしながら、細胞を少なくとも７２時間安定とするのが望ましいであろう。本実施例では、血液吸取の２４および７２時間後に血液試料を処理し、以下のごとく分析した：最小２つの１０ｍＬのEDTA Vacutainer（登録商標）試験管の血液（試験管当たり〜８ｍＬの血液）を転移性癌患者から得た。血液吸取の１５分以内に、適当な量のCyto-ChexTMを手動でＥＤＴＡ試験管の各々に添加して、実施例３に記載したごときCellStabilizeTM注入デバイスを用いて、３０容量Cyto-ChexTMを得た。
【００５２】
血液検体の受領に際して、血液をプールし、７．５ｍＬの安定化された血液を、実施例１に記載したのと同一アッセイを用いて、２４時間および／または７２時間においてテストし、実施例１に記載したのと同一のCellSpotter（登録商標）システム分析を用いて分析した。これらの２つの時点においてＣＴＣを比較した。９０％出力において、０．０１の両側ｐ−値と共に０．９５の予測された相関係数を検出するために、対値を持つ合計８検体が必要である。２４時間ｖｓ７２時間比較において、対値を持つ合計２８検体があったが、１つの試料は極端に高いＣＴＣを有し、それは図６には存在しない。
【００５３】
図６は、２４時間ｖｓ７２時間における明らかなＣＴＣ結果を伴う２７検体のプロットを示す。回帰方程式、ｒ−平方値、相関係数、およびｔ−検定ｐ−値をグラフに示す。ｒ−平方値およびパーソンの相関係数は、２４時間後におけるＣＴＣカウントが７２時間におけるそれと高度に相関することを示し、ｔ−検定は、２つのカウントの平均が統計学的に有意には異ならないことを示す（２４時間＝１１，７２時間＝１１）。直線の傾き（１．０８０３）は、血液安定化剤でのインキュベーションの２４時間および７２時間後におけるほぼ同数の明白なＣＴＣを示す。ウイルコキソン（Wilcoxon）の非−パラメーター兆候−ランクテストは、さらに、これらの２つの時点における２つのＣＴＣカウントが有意には異ならないことを示した（ｐ＝０．９１０５）。該結果は、安定化剤でのインキュベーションの７２時間の後にＣＴＣの喪失はなく、７２時間におけるカウントは２４時間におけるカウントとほとんど同一であることを示す。
【００５４】
実施例６
安定化剤の添加の様式
前記したごとく、血液中のＣＴＣは（無傷、損傷した等のごとく）異なる形態で存在し、一般に、それらは脆い。試験管中のさらなる細胞損傷を防ぐためには、血液が試験管中に吸い取られるや否や安定化剤を加える必要はない。しかしながら、添加の時点を制御するのは困難なプロセスであり、これは、血液吸取の場所に依存する。血液を吸い取るいくつかの部位は、必ずしも安定化剤を有する必要はなく、従って、試料をもう１つの部位に送って、安定化剤を添加する必要がある。これは、安定化剤添加の種々の時点を作り出す。これらの部位においてさえ、安定化剤添加の時点は吸い取られた試験管の数に依存するであろう。血液を吸い取る切開者は安定化剤を添加しないが、安定化剤添加のために試料を他の技術者に渡すであろう。
【００５５】
従って、好ましい安定化剤が、一時的な過浸透圧条件への暴露および細胞に対する可能な損傷を最小化するために、濃縮された液体として、または水中の溶液としての希釈された形態で用いることができる。液体または固体安定化剤は、好ましくは、血液吸取に先立って、または、最適ではないが、しかる後直ちに血液吸取容器に加えて、血液吸取の間の乱れによる損傷からの最大保護効果を得る。
【００５６】
プレフィル血液収集試験管、例えば、１０ｍＬのVacutainer（登録商標）試験管（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)または（Greiner America, Lake Mary, FLからの）Vacuette（登録商標）試験管は商業的に入手可能であり、減圧に先立って、約２ｍＬの液体試薬で、または粒状コーティング物質で予め充填される。プレフィル試験管を製造するための別の手段は、凍結された液体の慣用的なイン・サイチュ凍結乾燥を含む。もう１つの特許された技術は、２５０μＬまでの液滴を液体窒素に滴下し、続いて、容器の内側で凍結されたビーズを慣用的に凍結乾燥して、区別される剛直なビーズを形成することによって調製される、区別される凍結乾燥ビーズ、いわゆるLyoSpheres（米国特許第6,106,836号；Akzo Nobel N.V., オランダ国）、およびBiolyph（ミネアポリス，ＭＮ）を利用する。
【００５７】
まとめると実施例１ないし６は、安定化剤の血液試料への添加は、本発明で使用する豊富化アッセイにおいて、試料の品質およびＣＴＣを維持することを示す。安定化剤の最適な量は変化し、実施例６に記載したごとく、液体から凍結乾燥されたペレット、さらに粉末への範囲の安定化剤のタイプおよび物理的状態に依存することが認識されるべきである。例えば、Cyto-ChexTM安定化剤の濃度は、１ないし５０％、好ましくは約５ないし約４０％、最も好ましくは約１０ないし約３０％の範囲がすることでき、TRANSfixTM安定化剤については、０．１ないし３０％好ましくは約１ないし２５％、最も好ましくは約１ないし１０％の範囲とすることができるのが判明したが、他のタイプの安定化剤についての濃度または量は特定の範囲とは異なるかも知れず、各安定化剤および適用について最適化されなければならないのは認識されるべきである。理想的には、抗−凝固剤および該安定化剤は、安定化剤の同一の効果的な濃度を維持しつつ、生物学的検体の合計容量の約０．１ないし５０％、より好ましくは約０．３ないし３０％、最も好ましくは約０．３ないし５％の容量で存在させる。最も重要には、あまり希釈しないのがより望ましい。
【００５８】
本発明によって提供される改良は、前記した米国特許、および本明細書中に記載したことも好ましい具体例を参照することにより当業者に容易に明らかであろう。本発明の１つの特に有利な態様は、それが、貯蔵の間、豊富化処理の間に、全血中の稀な標的細胞およびＣＴＣを維持するための安定化剤を開示することである。本発明によって提供されるさらなる改良は、血液吸取に先立っての、または血液吸取の直後における安定化剤の添加、および液体および固体双方の形態における安定化剤の利用に由来する。本発明によって提供される改良を、前記実施例１ないし６での好ましい具体例により記載し、例示してきた。
【００５９】
本発明は、さらに、無傷ＣＴＣ、疑われるＣＴＣ、および帰属されない事象の分析を改良し、後者は血液吸取時に存在する、または、処理の間に形成されたデブリスおよび／または凝集体よりなる。本発明は、特に、ＣＴＣの稀な細胞を安定化させるための組成物および態様を開発する本発明の改良された組成物および方法の開発でなされた広範な研究プロジェクトの結果である。本明細書中に開示したごとく、これらの改良を取り込んだ本発明の好ましい具体例は、本発明が、癌診断に加えた分野および適用で使用されるのを可能とすると信ずる。本発明の改良された診断態様は、好ましい具体例のこれまでの記載によって限定されるべきでないのは当業者に明らかであろう。最後に、前記で掲げたある具体例は詳細な記載を与えるが、以下の請求の範囲は該詳細な記載によってその範囲が制限されるものではない。事実、以下の請求の範囲の精神の逸脱することなく種々の修飾をなすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、室温での２４時間の保存の後における、９人の癌患者からの全血検体中の検出可能なＣＴＣの減少を示す。
【図２】図２は、０、６、１８および２４時間における、３人の癌患者からの全血検体中の検出可能なＣＴＣを示す。
【図３】図３は、表ＩＩ中の１人の癌患者番号２８１６２からの２つの検体試験管：ａ.）安定化剤を含まない検体試験管、ｂ.）３０％Cyto-ChexTM安定化剤を含む検体試験管の送付後における、検体品質に対するCyto-ChexTM安定化剤の効果を示す。イメージは、核酸色素ＤＡＰＩを添加した後の豊富化された試料における細胞のＤＮＡの染色を示す。丸い物体の大部分は、ＣＴＣを含めた有核細胞内側の核を表し、他方、不規則な凝塊は損傷した細胞から放出されたＤＮＡを含み得る。
【図４】図４は、ａ）混合無し、かつ安定化剤無し、ｂ）混合有り、かつ安定化剤無し、ｃ）３０％Cyto-ChexTM安定化剤の存在下で混合有りにて、２４時間の放置、または旋回器での混合後における検体品質に対するCyto-ChexTM安定化剤の効果を示す。ＤＡＰＩ染色後のイメージ解析は、図３ｂ）に記載する。
【図５】図５は、３つのタイプのＣＴＣ分解：無傷ＣＴＣ（図５ａ）、疑われるＣＴＣ（図５ｂ）、および「帰属されない事象」（図５ｃおよび５ｄ）を示す。
【図６】図６は、有意に類似するカウント、ならびに比較用の統計学的有意性を示す、２４時間および７２時間における、２７人の対象の安定化された血液からのＣＴＣを比較する。

Claims (145)

  1. ａ．抗−凝固剤、および
    ｂ．安定化剤；
    よりなる生物学的検体を保存するための組成物。
  2. 該抗−凝固剤がキレート剤である請求項１記載の組成物。
  3. 該抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）よりなる群から選択される請求項２記載の組成物。
  4. 該抗−凝固剤が錯化剤である請求項１記載の組成物。
  5. 該抗−凝固剤がヘパリンおよびシトレートよりなる群から選択される請求項４記載の組成物。
  6. 該安定化剤がホルムアルデヒドドナーである請求項１記載の組成物。
  7. 該ホルムアルデヒドドナーがアミンもしくはアミドのメチロールもしくはヒドロキシメチル誘導体、ジアゾリニジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、メテンアミンおよびパラホルムアルデヒドよりなる群から選択される請求項６記載の組成物。
  8. 該安定化剤がアルデヒドである請求項１記載の組成物。
  9. 該アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項８記載の組成物。
  10. 該安定化剤が少なくとも１つの重金属元素と組み合わせたホルムアルデヒドドナーまたはアルデヒドである請求項１記載の組成物。
  11. 該重金属元素がクロム、マンガンおよび亜鉛よりなる群から選択される請求項１０記載の組成物。
  12. さらなる安定化剤がポリエチレングリコールである請求項１記載の組成物。
  13. 該ポリエチレングリコールの分子量が約１０００ないし約３５０００の範囲にある請求項１２記載の組成物。
  14. 該ポリエチレングリコールの分子量が約５０００ないし約２００００の範囲にある請求項１２記載の組成物。
  15. 該ポリエチレングリコールの分子量が約８０００ないし約２００００の範囲にある請求項１２記載の組成物。
  16. ａ．抗−凝固剤、および
    ｂ．安定化剤；
    よりなる循環腫瘍細胞を含むことが疑われる血液試料を保存するための組成物。
  17. 該抗−凝固剤がキレート剤である請求項１６記載の組成物。
  18. 該抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）よりなる群から選択される請求項１７記載の組成物。
  19. 該抗−凝固剤が錯化剤である請求項１６記載の組成物。
  20. 該抗−凝固剤がヘパリンおよびシトレートよりなる群から選択される請求項１９記載の組成物。
  21. 該安定化剤がホルムアルデヒドドナーである請求項１６記載の組成物。
  22. 該ホルムアルデヒドドナーがアミンもしくはアミドのメチロールもしくはヒドロキシメチル誘導体、ジアゾリニジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、メテンアミンおよびパラホルムアルデヒドよりなる群から選択される請求項２１記載の組成物。
  23. 該安定化剤がアルデヒドである請求項１６記載の組成物。
  24. 該アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびグリオキサールよりなる群から選択される請求項２３記載の組成物。
  25. 該安定化剤が、少なくとも１つの重金属元素と組み合わされたホルムアルデヒドドナーまたはアルデヒドである請求項１６記載の組成物。
  26. 該重金属元素がクロム、マンガンおよび亜鉛よりなる群から選択される請求項２５記載の組成物。
  27. さらなる安定化剤がポリエチレングリコールである請求項１６記載の組成物。
  28. 該ポリエチレングリコールの分子量が約１０００ないし約３５０００の範囲にある請求項２７記載の組成物。
  29. 該ポリエチレングリコールの分子量が約５０００ないし約２００００の範囲にある請求項２７記載の組成物。
  30. 該ポリエチレングリコールの分子量が約８０００ないし約２００００の範囲にある請求項２７記載の組成物。
  31. ａ．生物学的検体、
    ｂ．抗−凝固剤、および
    ｃ．安定化剤；
    よりなる安定化された細胞組成物。
  32. 該生物学的検体が、循環腫瘍細胞を含むことが疑われる血液の画分である請求項３１記載の安定化された細胞組成物。
  33. 該循環腫瘍細胞が該安定化剤によって安定化されている請求項３２記載の安定化された細胞組成物。
  34. 該抗−凝固剤がキレート剤である請求項３１記載の安定化された細胞組成物。
  35. 該抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）よりなる群から選択される請求項３４記載の安定化された細胞組成物。
  36. 該抗−凝固剤が錯化剤である請求項３１記載の安定化された細胞組成物。
  37. 該抗−凝固剤がヘパリンおよびシトレートよりなる群から選択される請求項３６記載の安定化された細胞組成物。
  38. 該安定化剤がホルムアルデヒドドナーである請求項３１記載の安定化された細胞組成物。
  39. 該ホルムアルデヒドドナーがアミンもしくはアミドのメチロールもしくはヒドロキシメチル誘導体、ジアゾリニジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、メテンアミンおよびパラホルムアルデヒドよりなる群から選択される請求項３８記載の安定化された細胞組成物。
  40. 該安定化剤がアルデヒドである請求項３１記載の安定化された細胞組成物。
  41. 該アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項４０記載の安定化された細胞組成物。
  42. 該安定化剤が少なくとも１つの重金属元素と組み合わされたホルムアルデヒドドナーまたはアルデヒドである請求項３１記載の安定化された細胞組成物。
  43. 該重金属元素がクロム、マンガンおよび亜鉛よりなる群から選択される請求項４２記載の安定化された細胞組成物。
  44. さらなる安定化剤がポリエチレングリコールである請求項３１記載の安定化された細胞組成物。
  45. 該ポリエチレングリコールの分子量が約１０００ないし約３５０００の範囲にある請求項４４記載の安定化された細胞組成物。
  46. 該ポリエチレングリコールの分子量が約５０００ないし約２００００の範囲にある請求項４４記載の安定化された細胞組成物。
  47. 該ポリエチレングリコールの分子量が約８０００ないし約２００００の範囲にある請求項４４記載の安定化された細胞組成物。
  48. 該抗−凝固剤および該安定化剤が、該生物学的検体の合計容量の約０．１ないし約５０％の容量で存在する請求項３１記載の安定化された細胞組成物。
  49. 該容量が該生物学的検体の合計容量の約０．３ないし約３０％の範囲にある請求項４７記載の安定化された細胞組成物。
  50. 該容量が該生物学的検体の合計容量の約０．３ないし約５％の範囲にある請求項４７記載の安定化された細胞組成物。
  51. ａ．細胞を含む生物学的検体を入手し、次いで、
    ｂ．該生物学的検体を、該細胞を安定化することができる安定化剤と接触させる；
    ことを特徴とする生物学的検体を保存する方法。
  52. 該安定化剤がホルムアルデヒドドナーである請求項５１記載の方法。
  53. 該ホルムアルデヒドドナーがアミンもしくはアミドのメチロールもしくはヒドロキシメチル誘導体、ジアゾリニジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、メテンアミンおよびパラホルムアルデヒドよりなる群から選択される請求項５２記載の方法。
  54. 該安定化剤がアルデヒドである請求項５１記載の方法。
  55. 該アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項５４記載の方法。
  56. 該安定化剤が、少なくとも１つの重金属元素と組み合わされたホルムアルデヒドドナーまたはアルデヒドである請求項５１記載の方法。
  57. 該重金属元素がクロム、マンガンおよび亜鉛よりなる群から選択される請求項５６記載の方法。
  58. さらなる安定化剤がポリエチレングリコールである請求項５１記載の方法。
  59. 該ポリエチレングリコールの分子量が約１０００ないし約３５０００の範囲にある請求項５８記載の方法。
  60. 該ポリエチレングリコールの分子量が約５０００ないし約２００００の範囲にある請求項５８記載の方法。
  61. 該ポリエチレングリコールの分子量が約８０００ないし約２００００の範囲にある請求項５８記載の方法。
  62. 該検体をさらに抗−凝固剤と接触させる請求項５１記載の方法。
  63. 該抗−凝固剤がキレート剤である請求項６２記載の方法。
  64. 該抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）よりなる群から選択される請求項６３記載の方法。
  65. 該抗−凝固剤が錯化剤である請求項６２記載の方法。
  66. 該抗−凝固剤がヘパリンおよびシトレートよりなる群から選択される請求項６５記載の方法。
  67. 該生物学的検体と接触させる前に、該抗−凝固剤および該安定化剤を合わせる請求項６２記載の方法。
  68. 該抗−凝固剤がキレート剤である請求項６７記載の方法。
  69. 該抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）よりなる群から選択される請求項６８記載の方法。
  70. 該抗−凝固剤が錯化剤である請求項６７記載の方法。
  71. 該抗−凝固剤がヘパリンおよびシトレートよりなる群から選択される請求項７０記載の方法。
  72. 該抗−凝固剤および該安定化剤を、該生物学的検体の合計容量の約０．１ないし約５０％の容量で存在させる請求項６７記載の方法。
  73. 該容量が、該生物学的検体の合計容量の約０．３ないし約３０％の範囲にある請求項７２記載の方法。
  74. 該容量が、該生物学的検体の合計容量の約０．３ないし約５％の範囲にある請求項７２記載の方法。
  75. ａ．細胞を含む生物学的検体を入手し、次いで、
    ｂ．該生物学的検体を、該細胞を安定化させることができる安定化剤と接触させる；
    ことを特徴とする循環腫瘍細胞を含むことが疑われる血液試料を保存する方法。
  76. 該安定化剤がホルムアルデヒドドナーである請求項７５記載の方法。
  77. 該ホルムアルデヒドドナーがアミンもしくはアミドのメチロールもしくはヒドロキシメチル誘導体、ジアゾリニジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、メテンアミンおよびパラホルムアルデヒドよりなる群から選択される請求項７６記載の方法。
  78. 該安定化剤がアルデヒドである請求項７５記載の方法。
  79. 該アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項７８記載の方法。
  80. 該安定化剤が少なくとも１つの重金属元素と組み合わされたホルムアルデヒドドナーまたはアルデヒドである請求項７５記載の方法。
  81. 該重金属元素がクロム、マンガンおよび亜鉛よりなる群から選択される請求項８０記載の方法。
  82. さらなる安定化剤がポリエチレングリコールである請求項７５記載の方法。
  83. 該ポリエチレングリコールの分子量が約１０００ないし約３５０００の範囲にある請求項８２記載の方法。
  84. 該ポリエチレングリコールの分子量が約５０００ないし約２００００の範囲にある請求項８２記載の方法。
  85. 該ポリエチレングリコールの分子量が約８０００ないし約２００００の範囲にある請求項８２記載の方法。
  86. 該検体をさらに抗−凝固剤と接触させる請求項７５記載の方法。
  87. 該抗−凝固剤がキレート剤である請求項８６記載の方法。
  88. 該抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）よりなる群から選択される請求項８７記載の方法。
  89. 該抗−凝固剤が錯化剤である請求項８６記載の方法。
  90. 該抗−凝固剤がヘパリンおよびシトレートよりなる群から選択される請求項８９記載の方法。
  91. 該生物学的検体と接触させる前に、該抗−凝固剤および該安定化剤を合わせる請求項８６記載の方法。
  92. 該抗−凝固剤がキレート剤である請求項９１記載の方法。
  93. 該抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）よりなる群から選択される請求項９２記載の方法。
  94. 該抗−凝固剤が錯化剤である請求項９１記載の方法。
  95. 該抗−凝固剤がヘパリンおよびシトレートよりなる群から選択される請求項９３記載の方法。
  96. 該抗−凝固剤および該安定化剤が、該生物学的検体の合計容量の約０．１ないし約５０％の容量で存在する請求項８６記載の方法。
  97. 該容量が、該生物学的検体の合計容量の約０．３ないし約３０％の範囲にある請求項９６記載の方法。
  98. 該容量が、該生物学的検体の合計容量の約０．３ないし約５％の範囲にある請求項９６記載の方法。
  99. ａ．抗−凝固剤、および
    ｂ．安定化剤；
    を含む排気された血液吸取管よりなる生物学的検体を保存するための装置。
  100. 該抗−凝固剤がキレート剤である請求項９９記載の装置。
  101. 該抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）よりなる群から選択される請求項１００記載の装置。
  102. 該抗−凝固剤が錯化剤である請求項９９記載の装置。
  103. 該抗−凝固剤がヘパリンおよびシトレートよりなる群から選択される請求項１０２記載の装置。
  104. 該安定化剤がホルムアルデヒドドナーである請求項９９記載の装置。
  105. 該ホルムアルデヒドドナーがアミンもしくはアミドのメチロールもしくはヒドロキシメチル誘導体、ジアゾリニジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、メテンアミンおよびパラホルムアルデヒドよりなる群から選択される請求項１０４記載の装置。
  106. 該安定化剤がアルデヒドである請求項９９記載の装置。
  107. 該アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項１０６記載の装置。
  108. 該安定化剤が、少なくとも１つの重金属元素と組み合わされたホルムアルデヒドドナーまたはアルデヒドである請求項９９記載の装置。
  109. 該重金属元素がクロム、マンガンおよび亜鉛よりなる群から選択される請求項１０８記載の装置。
  110. 該安定化剤が凍結乾燥されている請求項９９記載の装置。
  111. さらなる安定化剤がポリエチレングリコールである請求項９９記載の装置。
  112. 該ポリエチレングリコールの分子量が約１０００ないし約３５０００の範囲にある請求項１１１記載の装置。
  113. 該ポリエチレングリコールの分子量が約５０００ないし約２００００の範囲にある請求項１１２記載の装置。
  114. 該ポリエチレングリコールの分子量が約８０００ないし約２００００の範囲にある請求項１１２記載の装置。
  115. 該さらなる安定化剤が凍結乾燥されている請求項１１１記載の装置。
  116. 該抗−凝固剤および安定化剤が、該吸取管の合計容量の約０．１ないし約５０％の容量で存在する請求項９９記載の装置。
  117. 該容量が、該吸取管の合計容量の約０．３ないし約３０％の範囲にある請求項１１６記載の装置。
  118. 該容量が、該吸取管の合計容量の約０．３ないし約５％の範囲にある請求項１１６記載の装置。
  119. ａ．抗−凝固剤、および
    ｂ．安定化剤；
    を含有する排気された血液吸取管よりなる循環腫瘍細胞を含むことが疑われる血液試料を保存するための装置。
  120. 該抗−凝固剤がキレート剤である請求項１１９記載の装置。
  121. 該抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）よりなる群から選択される請求項１２０記載の装置。
  122. 該抗−凝固剤が錯化剤である請求項１１９記載の装置。
  123. 該抗−凝固剤がヘパリンおよびシトレートよりなる群から選択される請求項１２２記載の装置。
  124. 該安定化剤がホルムアルデヒドドナーである請求項１１９記載の装置。
  125. 該ホルムアルデヒドドナーがアミンもしくはアミドのメチロールもしくはヒドロキシメチル誘導体、ジアゾリニジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、メテンアミンおよびパラホルムアルデヒドよりなる群から選択される請求項１２３記載の装置。
  126. 該安定化剤がアルデヒドである請求項１１９記載の装置。
  127. 該アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項１２６記載の装置。
  128. 該安定化剤が、少なくとも１つの重金属元素と組み合わされたホルムアルデヒドドナーまたはアルデヒドである請求項１１９記載の装置。
  129. 該重金属元素がクロム、マンガンおよび亜鉛よりなる群から選択される請求項１２８記載の装置。
  130. 該安定化剤が凍結乾燥されている請求項１１９記載の装置。
  131. さらなる安定化剤がポリエチレングリコールである請求項１１９記載の装置。
  132. 該ポリエチレングリコールの分子量が約１０００ないし約３５０００の範囲にある請求項１３１記載の装置。
  133. 該ポリエチレングリコールの分子量が約５０００ないし約２００００の範囲にある請求項１３１記載の装置。
  134. 該ポリエチレングリコールの分子量が約８０００ないし約２００００の範囲にある請求項１３１記載の装置。
  135. 該さらなる安定化剤が凍結乾燥されている請求項１３１記載の装置。
  136. 該抗−凝固剤および該安定化剤が、該吸取管の合計容量の約０．１ないし約５０％の容量で存在する請求項１１９記載の装置。
  137. 該容量が、該吸取管の合計容量の約０．３ないし約３０％の範囲にある請求項１３６記載の装置。
  138. 該容量が、該吸取管の合計容量の約０．３ないし約５％の範囲にある請求項１３６記載の装置。
  139. さらなる安定化剤が、検体容量の約０．１％ないし約５％、好ましくは約０．１％ないし約１％、最も好ましくは約０．１％ないし約０．５％の濃度のポリエチレングリコールである請求項１記載の組成物。
  140. さらなる安定化剤が、検体容量の約０．１％ないし約５％、好ましくは約０．１％ないし約１％、最も好ましくは約０．１％ないし約０．５％の濃度のポリエチレングリコールである請求項１６記載の組成物。
  141. さらなる安定化剤が、検体容量の約０．１％ないし約５％、好ましくは約０．１％ないし約１％、最も好ましくは約０．１％ないし約０．５％の濃度のポリエチレングリコールである請求項３１記載の安定化された細胞組成物。
  142. さらなる安定化剤が、検体容量の約０．１％ないし約５％、好ましくは約０．１％ないし約１％、最も好ましくは約０．１％ないし約０．５％の濃度のポリエチレングリコールである請求項５１記載の方法。
  143. さらなる安定化剤が、検体容量の約０．１％ないし約５％、好ましくは約０．１％ないし約１％、最も好ましくは約０．１％ないし約０．５％の濃度のポリエチレングリコールである請求項７５記載の方法。
  144. さらなる安定化剤が、検体容量の約０．１％ないし約５％、好ましくは約０．１％ないし約１％、最も好ましくは約０．１％ないし約０．５％の濃度のポリエチレングリコールである請求項９９記載の装置。
  145. さらなる安定化剤が、検体容量の約０．１％ないし約５％、好ましくは約０．１％ないし約１％、最も好ましくは約０．１％ないし約０．５％の濃度のポリエチレングリコールである請求項１１９記載の装置。
JP2003523608A 2001-08-23 2002-08-23 分析用の細胞および生物学的検体の安定化 Pending JP2005501236A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31415101P 2001-08-23 2001-08-23
US36962802P 2002-04-03 2002-04-03
PCT/US2002/026867 WO2003018757A2 (en) 2001-08-23 2002-08-23 Stabilization of cells and biological specimens for analysis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2005501236A true JP2005501236A (ja) 2005-01-13

Family

ID=26979228

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003523961A Pending JP2005502863A (ja) 2001-08-23 2002-08-23 循環腫瘍細胞、断片およびデブリスの分析
JP2003523608A Pending JP2005501236A (ja) 2001-08-23 2002-08-23 分析用の細胞および生物学的検体の安定化
JP2009011194A Pending JP2009109514A (ja) 2001-08-23 2009-01-21 循環腫瘍細胞、断片およびデブリスの分析

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003523961A Pending JP2005502863A (ja) 2001-08-23 2002-08-23 循環腫瘍細胞、断片およびデブリスの分析

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009011194A Pending JP2009109514A (ja) 2001-08-23 2009-01-21 循環腫瘍細胞、断片およびデブリスの分析

Country Status (11)

Country Link
EP (2) EP1425294B2 (ja)
JP (3) JP2005502863A (ja)
KR (2) KR20040030984A (ja)
CN (2) CN1596265A (ja)
AT (1) ATE401574T1 (ja)
AU (2) AU2008288601B2 (ja)
BR (2) BR0212125A (ja)
CA (2) CA2457891C (ja)
DE (1) DE60227678D1 (ja)
IL (2) IL160209A0 (ja)
WO (2) WO2003018757A2 (ja)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008533487A (ja) * 2005-03-14 2008-08-21 イムニベスト・コーポレイション 循環腫瘍細胞を用いる転移性乳癌患者の療法中の各追跡期間ポイントでの無増悪および全生存を予測する方法
WO2013168767A1 (ja) 2012-05-10 2013-11-14 コニカミノルタ株式会社 赤血球除去方法および採血用遠沈管
JP2016518827A (ja) * 2013-03-18 2016-06-30 キアゲン ゲーエムベーハー 細胞外核酸の安定化および単離
JP2017058326A (ja) * 2015-09-18 2017-03-23 東ソー株式会社 腫瘍細胞の検出方法
JP2017511124A (ja) * 2014-03-18 2017-04-20 キアゲン ゲーエムベーハー 細胞外核酸の安定化および単離
JP2019509486A (ja) * 2016-03-07 2019-04-04 シーエフジーノーム， エルエルシー 非侵襲的分子対照
EP3575791A1 (en) 2018-05-31 2019-12-04 ARKRAY, Inc. Blood treatment method and blood collection tube
WO2019230532A1 (ja) * 2018-05-29 2019-12-05 東ソー株式会社 血液試料保存剤
JP2020535789A (ja) * 2017-08-02 2020-12-10 ザルシュテット・アーゲー・ウント・コー・カーゲー 無細胞核酸及び細胞を安定化するための方法及び組成物
WO2023181468A1 (ja) * 2022-03-25 2023-09-28 積水メディカル株式会社 循環腫瘍細胞分離キット、循環腫瘍細胞分離容器及び循環腫瘍細胞の分離方法

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7863012B2 (en) 2004-02-17 2011-01-04 Veridex, Llc Analysis of circulating tumor cells, fragments, and debris
WO2003018757A2 (en) * 2001-08-23 2003-03-06 Immunivest Corporation Stabilization of cells and biological specimens for analysis
US8980568B2 (en) 2001-10-11 2015-03-17 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample
US8986944B2 (en) 2001-10-11 2015-03-24 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples
EP2260942A3 (en) 2002-05-13 2011-03-09 Becton, Dickinson and Company Protease Inhibitor Sample Collection System
ATE531257T1 (de) 2002-09-27 2011-11-15 Gen Hospital Corp Mikrofluidische vorrichtung zur zelltrennung und verwendungen davon
ES2784011T3 (es) 2002-10-16 2020-09-21 Streck Inc Procedimiento y dispositivo para recoger y preservar las células para su análisis
ATE489452T1 (de) 2003-02-27 2010-12-15 Veridex Llc Zirkulierende tumorzellen (ctc's): frühe beurteilung von time-to-progression, überleben und ansprechen auf therapie bei patienten mit metastasiertem krebs
WO2005028663A2 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Immunivest Corporation Operator independent programmable sample preparation and analysis system
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
CN101495650B (zh) 2005-06-20 2015-02-04 领先细胞医疗诊断有限公司 检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
US8337755B2 (en) 2006-03-13 2012-12-25 Veridex, Llc Operator independent programmable sample preparation and analysis system
US8940493B2 (en) * 2006-06-02 2015-01-27 Veridex Llc Circulating tumor cell assay
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
EP2029779A4 (en) 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
US8372584B2 (en) 2006-06-14 2013-02-12 The General Hospital Corporation Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
EP2041299A4 (en) 2006-07-14 2010-01-13 Aviva Biosciences Corp METHOD AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF RARE CELLS FROM A BIOLOGICAL SAMPLE
US20110312511A1 (en) * 2007-02-27 2011-12-22 Ola Winquist Multiplex Detection of Tumour Cells Using a Panel of Agents Binding to Extracellular Markers
US8003314B2 (en) 2007-04-16 2011-08-23 Diagnostic Hybrids, Inc. Methods for direct fluorescent antibody virus detection in liquids
WO2008128243A1 (en) 2007-04-16 2008-10-23 Immunivest Corporation A rapid, semi-automated method to detect respiratory virus infected cells in direct specimens
US7828968B2 (en) 2007-08-30 2010-11-09 Veridex, Llc Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets
US8110101B2 (en) 2007-08-30 2012-02-07 Veridex, Llc Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets
EP2229441B1 (en) 2007-12-12 2014-10-01 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus for magnetic separation of cells
SI2562268T1 (sl) 2008-09-20 2017-05-31 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Office of the General Counsel Building 170 Neinvazivna diagnoza fetalne anevploidije s sekvenciranjem
US11634747B2 (en) 2009-01-21 2023-04-25 Streck Llc Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma
US8304187B2 (en) 2009-02-18 2012-11-06 Streck, Inc. Preservation of cell-free RNA in blood samples
US20130023433A1 (en) 2009-09-28 2013-01-24 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acid sequences with high specificity
EP3045918B1 (en) 2009-10-21 2017-12-06 The Scripps Research Institute Method of using non-rare cells to detect rare cells
EP2529030B1 (en) 2010-01-29 2019-03-13 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Methods of in situ detection of nucleic acids
WO2011099565A1 (ja) * 2010-02-10 2011-08-18 シスメックス株式会社 血液中癌細胞の検出方法及びそれに用いるプログラム
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
DE102010020785A1 (de) * 2010-05-18 2011-11-24 Siemens Aktiengesellschaft Vorrichtung und Verfahren zum Erkennen von magnetisch markierten Mikroobjekten
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2572003A4 (en) 2010-05-18 2016-01-13 Natera Inc METHOD FOR NONINVASIVE PRANATAL PLOIDIE ASSIGNMENT
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20120252038A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-04 Chianese David A Steroid receptor assays
WO2012151391A2 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Streck, Inc. Inactivated virus compositions and methods of preparing such compositions
TW201312117A (zh) * 2011-07-28 2013-03-16 Univ Pennsylvania 用以診斷與漿液相關之腫瘤細胞的症狀及特性的方法及試劑
US11021733B2 (en) 2011-09-26 2021-06-01 Qiagen Gmbh Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
AU2012314515B2 (en) 2011-09-26 2018-03-15 Preanalytix Gmbh Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids
KR102037891B1 (ko) * 2012-03-09 2019-10-30 한국전자통신연구원 다중 분리 장치 및 혈중 암세포 분리 방법
JP6608280B2 (ja) 2012-09-25 2019-11-20 キアゲン ゲーエムベーハー 生物学的試料の安定化
WO2014145075A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Princeton University Methods and devices for high throughpout purification
WO2014145152A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Gpb Scientific, Llc On-chip microfluidic processing of particles
US20150064153A1 (en) 2013-03-15 2015-03-05 The Trustees Of Princeton University High efficiency microfluidic purification of stem cells to improve transplants
WO2014146781A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Qiagen Gmbh Stabilisation of biological samples
US10091984B2 (en) 2013-07-24 2018-10-09 Streck, Inc. Compositions and methods for stabilizing circulating tumor cells
CA2928779A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 The General Hospital Corporation Methods relating to circulating tumor cell clusters and the treatment of cancer
EP3100047B1 (en) 2014-01-27 2021-08-11 Epic Sciences, Inc. Circulating tumor cell diagnostics for prostate cancer biomarkers
EP3108246B1 (en) 2014-02-21 2019-10-09 Epic Sciences, Inc. Methods for analyzing rare circulating cells
CN103940997B (zh) * 2014-03-21 2017-01-04 上海柏慧康生物科技有限公司 一种乳腺癌循环肿瘤细胞检测系统及试剂盒
CN106460070B (zh) 2014-04-21 2021-10-08 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
CN103980365A (zh) * 2014-06-03 2014-08-13 国家纳米科学中心 一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子、其制备方法及用途
EP3164204B1 (en) * 2014-07-02 2021-03-10 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Selective nucleic acid separation
US10564075B2 (en) 2015-02-24 2020-02-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Prefixation for increased rare cell recovery
US11168351B2 (en) 2015-03-05 2021-11-09 Streck, Inc. Stabilization of nucleic acids in urine
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
CA2936167A1 (en) * 2015-07-15 2017-01-15 Streck, Inc. Method and device for stabilizing of proteins
US20180328848A1 (en) * 2015-11-04 2018-11-15 Axon Dx, Llc Cell detection, capture, analysis, aggregation, and output methods and apparatus
US20170145475A1 (en) 2015-11-20 2017-05-25 Streck, Inc. Single spin process for blood plasma separation and plasma composition including preservative
CN108291250B (zh) 2015-11-20 2022-05-27 凯杰有限公司 用于稳定细胞外核酸的已灭菌组合物的制备方法
CN105372109A (zh) * 2015-12-15 2016-03-02 苏州药明康德新药开发股份有限公司 添加稳定剂的生物基质的制备方法
WO2017152028A1 (en) * 2016-03-04 2017-09-08 Janssen Diagnostics, Llc Preservation of cellular components from cells with a preservative
JP2017219479A (ja) 2016-06-09 2017-12-14 住友電気工業株式会社 微小粒子計測装置及び分析方法
EP3491381A1 (en) 2016-07-29 2019-06-05 Streck, Inc. Suspension composition for hematology analysis control
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
WO2018094385A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
CN111065399B (zh) 2017-09-01 2023-11-28 Gpb科学有限公司 使用微流体制备治疗活性细胞的方法
CA3079415A1 (en) * 2017-10-19 2019-04-25 Streck, Inc. Compositions for hemolysis and coagulation regulation and stabilization of extracellular vesicles
EP3794146A1 (en) 2018-05-14 2021-03-24 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
CN108865976B (zh) * 2018-07-19 2022-06-28 复旦大学附属中山医院 一种离散汲取收集外泌体(exosome)的方法及试剂
CN110250159A (zh) * 2019-05-28 2019-09-20 天津中科生物科技有限公司 一种细胞保护液及其制备方法和应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4040785A (en) * 1976-10-18 1977-08-09 Technicon Instruments Corporation Lysable blood preservative composition
US4320111A (en) * 1977-06-14 1982-03-16 American Home Products Corporation Immunologic compositions methods of preparation and use
FR2475737A1 (fr) * 1980-02-07 1981-08-14 Pasteur Institut Perfectionnements apportes aux procedes de conservation d'hematies par lyophilisation en vue de leur utilisation dans des reactions d'hemagglutination et hematies non agglutinables spontanement obtenues par ce procede
US4404181A (en) * 1981-10-15 1983-09-13 Cambridge Chemical Products, Inc. Extended-life tissue fixative composition and method of using the same
FR2523810B1 (fr) * 1982-03-23 1988-11-25 Carpentier Alain Tissu biologique greffable et procede pour sa preparation
FR2528848A1 (fr) * 1982-06-16 1983-12-23 Sanofi Sa Nouveau derive de thieno-pyridone, son procede de preparation et son application therapeutique
EP0156537A3 (en) * 1984-03-02 1987-05-13 Board Of Regents University Of Texas System Biological magnetic fluids
US4654312A (en) * 1984-05-14 1987-03-31 Becton, Dickinson And Company Lysing agent for analysis of peripheral blood cells
US4788139A (en) * 1987-08-06 1988-11-29 Streck Laboratories, Inc. Platelet aggregation reagent, reagent container and method of determining platelet aggregation in EDTA-anticoagulated blood
US5385707A (en) * 1988-12-28 1995-01-31 Stefan Miltenyi Metal matrices for use in high gradient magnetic separation of biological materials and method for coating the same
US5698271A (en) * 1989-08-22 1997-12-16 Immunivest Corporation Methods for the manufacture of magnetically responsive particles
US5849517A (en) * 1991-05-08 1998-12-15 Streck Laboratories, Inc. Method and composition for preserving antigens and nucleic acids and process for utilizing cytological material produced by same
EP0627879A1 (en) * 1991-09-20 1994-12-14 CAMIENER, Gerald, W. Methods and compositions with aldehyde stabilizing solution
DE69434942T2 (de) * 1993-02-25 2007-11-29 Abbott Laboratories, Abbott Park Mehrzweckreagenzsystem zur schnellen lysierung von vollblutproben
US6190870B1 (en) * 1995-08-28 2001-02-20 Amcell Corporation Efficient enrichment and detection of disseminated tumor cells
GB2313288B (en) * 1996-05-24 2000-07-12 North Gen Hospital Nhs Trust Specimen collection fluid
US6197523B1 (en) * 1997-11-24 2001-03-06 Robert A. Levine Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of circulating cancer and/or hematologic progenitor cells in whole blood
US6670197B2 (en) * 1997-11-24 2003-12-30 David L. Rimm Method for assaying whole blood for the presence or absence of circulating cancer or other target cell fragments
WO1999041613A1 (en) * 1998-02-12 1999-08-19 Immunivest Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
AU2876900A (en) * 1999-02-10 2000-08-29 Cell Works Inc. Class characterization of circulating cancer cells isolated from body fluids andmethods of use
AU7351800A (en) * 1999-09-13 2001-04-17 Neil H. Bander A method for isolation of prostatic epithelial cells from semen
WO2003018757A2 (en) * 2001-08-23 2003-03-06 Immunivest Corporation Stabilization of cells and biological specimens for analysis

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008533487A (ja) * 2005-03-14 2008-08-21 イムニベスト・コーポレイション 循環腫瘍細胞を用いる転移性乳癌患者の療法中の各追跡期間ポイントでの無増悪および全生存を予測する方法
WO2013168767A1 (ja) 2012-05-10 2013-11-14 コニカミノルタ株式会社 赤血球除去方法および採血用遠沈管
JPWO2013168767A1 (ja) * 2012-05-10 2016-01-07 コニカミノルタ株式会社 赤血球除去方法および採血用遠沈管
JP2016518827A (ja) * 2013-03-18 2016-06-30 キアゲン ゲーエムベーハー 細胞外核酸の安定化および単離
JP2017511124A (ja) * 2014-03-18 2017-04-20 キアゲン ゲーエムベーハー 細胞外核酸の安定化および単離
JP2017058326A (ja) * 2015-09-18 2017-03-23 東ソー株式会社 腫瘍細胞の検出方法
JP2019509486A (ja) * 2016-03-07 2019-04-04 シーエフジーノーム， エルエルシー 非侵襲的分子対照
JP7064665B2 (ja) 2016-03-07 2022-05-11 ファーザー フラナガンズ ボーイズ ホーム ドゥーイング ビジネス アズ ボーイズ タウン ナショナル リサーチ ホスピタル 非侵襲的分子対照
JP2020535789A (ja) * 2017-08-02 2020-12-10 ザルシュテット・アーゲー・ウント・コー・カーゲー 無細胞核酸及び細胞を安定化するための方法及び組成物
WO2019230532A1 (ja) * 2018-05-29 2019-12-05 東ソー株式会社 血液試料保存剤
EP3575791A1 (en) 2018-05-31 2019-12-04 ARKRAY, Inc. Blood treatment method and blood collection tube
WO2023181468A1 (ja) * 2022-03-25 2023-09-28 積水メディカル株式会社 循環腫瘍細胞分離キット、循環腫瘍細胞分離容器及び循環腫瘍細胞の分離方法
JP7355473B1 (ja) 2022-03-25 2023-10-03 積水メディカル株式会社 循環腫瘍細胞分離キット、循環腫瘍細胞分離容器及び循環腫瘍細胞の分離方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1425294B1 (en) 2008-07-16
BR0212125A (pt) 2005-06-28
WO2003019141A3 (en) 2004-04-01
CA2457891A1 (en) 2003-03-06
EP1425383A2 (en) 2004-06-09
CA2457894C (en) 2014-07-08
JP2009109514A (ja) 2009-05-21
WO2003018757A2 (en) 2003-03-06
AU2009200013A1 (en) 2009-02-05
ATE401574T1 (de) 2008-08-15
JP2005502863A (ja) 2005-01-27
IL160210A0 (en) 2004-07-25
CN1571634A (zh) 2005-01-26
AU2008288601A1 (en) 2009-04-02
IL160209A0 (en) 2004-07-25
BR0212124A (pt) 2004-07-20
AU2009200013B2 (en) 2012-03-08
DE60227678D1 (de) 2008-08-28
CA2457891C (en) 2019-10-01
WO2003019141A2 (en) 2003-03-06
CA2457894A1 (en) 2003-03-06
EP1425294A4 (en) 2005-11-16
CN1596265A (zh) 2005-03-16
KR20040030984A (ko) 2004-04-09
EP1425294A2 (en) 2004-06-09
EP1425294B2 (en) 2012-12-12
KR20040053115A (ko) 2004-06-23
WO2003018757A3 (en) 2003-09-12
AU2008288601B2 (en) 2012-05-31
EP1425383A4 (en) 2005-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2008288601B2 (en) Stabilization of cells and biological specimens for analysis
US20060194192A1 (en) Stabilization of cells and biological specimens for analysis
US7863012B2 (en) Analysis of circulating tumor cells, fragments, and debris
US7901950B2 (en) Method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells
EP2848935A1 (en) Process for removing red blood cells and centrifugal tube for blood collection
JP2004534210A (ja) 希少細胞検出アッセイにおける内部機能対照として用いる標識細胞
WO2006054991A1 (en) Magnetic enrichment of circulating cells, fragments and debris for enabling hts proteomics and genomics in disease detection
JP6617516B2 (ja) 血液試料中に含まれる目的細胞の検出方法
JP6617495B2 (ja) 腫瘍細胞の検出方法
JP6563379B2 (ja) 白血球の枯渇による循環腫瘍細胞の濃縮
JP7143678B2 (ja) 標的細胞を検出する方法
WO2021010369A1 (ja) ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法
US20070248999A1 (en) Method for Determining the Concentration of Vital Epithelial Tumor Cells in a Body Fluid
AU2002331696A1 (en) Stabilization of cells and biological specimens for analysis
JP7279542B2 (ja) 試料中に含まれる目的細胞の定量方法
US20170089896A1 (en) Allograft rejection test
JP2019509468A (ja) 蛍光クエンチングおよび再染色を連続して使用した生体試料の複数表現型サブタイプ分類
CN117074691A (zh) 一种检测ctc抵抗nk细胞杀伤的试剂盒及其应用
AU2002326741A1 (en) Analysis of circulating tumor cells, fragments, and debris

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050216

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080205

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20080722