WO2013168767A1 - 赤血球除去方法および採血用遠沈管 - Google Patents

赤血球除去方法および採血用遠沈管 Download PDF

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恒子 千代田
幸司 宮崎
淳吾 荒木
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コニカミノルタ株式会社
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    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/491—Blood by separating the blood components

Definitions

  • the present invention relates to a method for previously removing a large amount of red blood cells contained in a blood-derived specimen in order to detect rare cells that may be contained in the blood-derived specimen, a cell fixing agent, an anticoagulant, and a density gradient centrifugation.
  • the present invention relates to a centrifuge tube for blood collection which is filled with a separation liquid.
  • Circulating tumor cells [CTC], vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, various stem cells, etc. (collectively referred to herein as “rare cells”) are cells that are very rarely present in peripheral blood depending on the disease state. It is. While it is obvious that detection of these rare cells is clinically useful, it is still often difficult to detect all rare cells from a whole blood sample.
  • Patent Document 1 discloses that blood collected from a cancer patient is collected in a Cyto-Cex (registered trademark) stabilizer, and plasma is removed by performing normal centrifugation, and then an antibody specific for a CTC surface antigen. Has disclosed a method of magnetically separating CTCs using magnetic particles on which is immobilized.
  • Cyto-Cex registered trademark
  • CTC is generally derived from metastatic breast cancer, prostate cancer, colon cancer, etc.
  • not all CTCs have the same properties (for example, from colon cancer of the same tissue). Even if it is CTC, it cannot be said that the kind and the number of molecules (surface antigens) expressed on the cell surface are uniform.) May have missed CTC.
  • Patent Document 2 discloses a method for detecting rare cells in blood, which removes red blood cells from blood to obtain a cell suspension containing white blood cells and rare cells, and the cell suspension.
  • a cell deployment step for spreading the liquid in an observation region provided with a plurality of holes, a photographing step for optically photographing the cells developed in the observation region, and detection for detecting rare cells from the image obtained by the photographing A method comprising the steps of:
  • red blood cells may be separated by density gradient centrifugation (paragraph [0038]). When cells are fixed by the formalin method or the like, after centrifugation (when developing on a cell observation member) Or with the staining process when observing cells (paragraphs [0042] to [0043]).
  • the present invention relates to a blood-derived sample that has been stored for several days from the time when blood is collected and a long time has elapsed until red blood cells are separated in the case of developing and observing cells contained in blood.
  • An object of the present invention is to provide a method for removing erythrocytes and a centrifuge tube for blood collection that can improve the detection accuracy of rare cells contained in blood with almost no loss of rare cells.
  • the method for removing red blood cells reflecting one aspect of the present invention is to detect rare cells that may be contained in a blood-derived specimen.
  • a method for removing red blood cells contained in a blood-derived specimen in advance comprising: (A) a step of fixing cells contained in the blood-derived specimen; and (B) a blood-derived specimen obtained in step (A) above. It includes a step of separating into at least two layers of a layer containing a large amount of red blood cells and a layer containing a large amount of cells other than red blood cells by density gradient centrifugation.
  • the centrifuge tube for blood collection reflecting another aspect of the present invention is pre-filled with a cell fixing agent, an anticoagulant, and a density gradient centrifugation separation solution.
  • red blood cells are removed using the method for removing red blood cells of the present invention or a centrifuge tube for blood collection
  • the blood-derived specimen has been stored for several days from the time of blood collection, and a long time has passed until red blood cells are separated.
  • rare cells are hardly lost, and deterioration such as contraction or expansion of cells can be suppressed.
  • the blood-derived specimen from which the red blood cells have been removed is developed and observed, thereby being contained in the blood-derived specimen.
  • a rare cell such as CTC (which may be contained)
  • the reliability of the determination result as to whether or not the rare cell is present in the blood-derived sample is improved, and the rare cell is further detected from the blood-derived sample. The accuracy of detecting is increased.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a centrifuge tube (1) before and after performing the density gradient centrifugation of step (B) in the red blood cell removal method according to the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing changes over time in the leukocyte recovery rate obtained in Example 2 and Comparative Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing changes over time in (a) white blood cells and (b) red blood cell contamination ratio obtained in Example 5.
  • the method for removing red blood cells of the present invention is a method for removing in advance a large amount of red blood cells contained in a blood-derived specimen in order to detect rare cells that may be contained in the blood-derived specimen. A) and (B) are included.
  • the “blood-derived specimen” in the present invention means blood that has not been treated after blood collection, blood diluted with an appropriate diluent, or blood coagulation using an “anticoagulant” as described later. Inhibited blood or blood that has been appropriately treated with a diluent, anticoagulant, or the like.
  • the cell fixing treatment step (A) it is preferable to fix cells and inhibit blood coagulation, and inhibit blood coagulation by reacting blood with an anticoagulant immediately after blood collection.
  • An embodiment in which the blood cells are fixed by addition is preferred.
  • the centrifuge tube (1) preliminarily filled with the separation solution (3) for density gradient centrifugation is obtained in the step (A).
  • the process is divided into:
  • the layer (4) in FIG. 1 corresponding to the “layer containing a large amount of cells other than red blood cells”, which is a layer other than the “layer containing a large amount of red blood cells” (7) It is preferable to collect all of (6).
  • the red blood cells are removed from the blood-derived specimen using the method for removing red blood cells of the present invention, the cells are then expanded, and when the target rare cells are detected, whether the target cells are present in the blood-derived specimen.
  • the reliability of the determination result can be improved, and the detection accuracy can be improved when the target cell exists.
  • the “rare cell” that may be contained in the blood-derived specimen used in the present invention is a general term for cells existing in a very small amount in the body, for example, circulating tumor cells (also called blood circulating cancer cells) [ CTC], vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, various stem cells and the like. It may also be a target cell for detection from a blood-derived specimen obtained after carrying out the red blood cell removal method of the present invention.
  • CTC can be used as an indicator for cancer prognosis, metastasis diagnosis, and monitoring of therapeutic effect. Therefore, CTC is suitable as a rare cell in the present invention.
  • the anticoagulant is a drug for preventing “blood coagulation” in which collected blood becomes a gel. Depending on the use of the blood-derived specimen, an anticoagulant may or may not be necessary. However, when collecting rare cells as in the present invention, an anticoagulant is usually required.
  • anticoagulants include ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], diethylenetriaminepentaacetic acid [DTPA], 1,2-diaminocyclohexanetetraacetic acid [DCTA], ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid [EGTA];
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid
  • DCTA 1,2-diaminocyclohexanetetraacetic acid
  • EGTA ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid
  • EGTA ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid
  • EDTA is used as an anticoagulant when calculating the number of white blood cells or the percentage of lymphocytes.
  • heparin or EDTA may be used.
  • a solution containing sodium citrate for example, ACD [acid citrate dextrose], CPD [citrate
  • the “anticoagulant” that can be used in the present invention any of these conventionally known anticoagulants can be selected, and the present invention is not limited thereto.
  • Cell fixing agent In the step (A), that is, in the step of fixing the cells contained in the blood-derived specimen, the cells are fixed using a cell fixing agent.
  • “Fixing” or “cell fixation” generally refers to a treatment performed for the purpose of delaying autolysis or spoilage of cells or tissues and maintaining their form and antigenicity. In the present invention, such treatment brings about effects such as an improvement in the recovery rate of rare cells and a reduction in the red blood cell contamination ratio.
  • Examples of a general substance as a cell fixing agent include aldehydes, alcohols, heavy metal elements and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • the cell fixing agent such as formaldehyde is liberated by itself undergoing hydrolysis or the like, for example, a formaldehyde donor (“formaldehyde donor” or “FA donor”).
  • formaldehyde donor or “FA donor”.
  • Formaldehyde donors are particularly preferred because formaldehyde can be released by hydrolysis immediately after touching blood-derived specimens or blood even after long-term storage (but under conditions that do not undergo hydrolysis). .
  • Aldehydes dissociate existing binding modes of proteins (for example, disulfide bonds and hydrogen bonds) to form new bonds.
  • the bond may be a covalent bond with an amino group terminal such as lysine or arginine, an aromatic activated carbon such as tryptophan or thyroxine, or a methylene bridge formed by linking with another amino acid terminal residue.
  • These new bonds can change the higher-order structure of the protein, and free molecules that are not involved in such bonds and cross-links can also hold the polypeptide chain to prevent further denaturation, thereby stabilizing the protein structure.
  • a cell fixing agent capable of suppressing enzyme activity by gelling cell protoplasts.
  • formaldehyde [FA] is typical, and glutaraldehyde, glyoxal and the like are also included.
  • Alcohols represented by ethanol and methanol are cell fixing agents that can denature and precipitate proteins.
  • heavy metal elements include chromium [Cr], manganese [Mn], and zinc [Zn].
  • formaldehyde donors include methylols of amines and amides, hydroxymethyl derivatives, diazolidinyl urea, imidazolidinyl urea, methenamine, and paraformaldehyde.
  • the present invention may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • the amount of the cell fixing agent used in the step (A) can be appropriately adjusted according to the type, but the concentration of the cell fixing agent is 0.01 to 50.0 vol with respect to 100 vol% of blood contained in the blood-derived specimen. % Is adjusted.
  • the concentration of the FA donor is preferably 0.1 to 10.0 vol% with respect to 100 vol% of blood contained in the blood-derived specimen.
  • the concentration of the FA donor is within the above range, the FA is slowly released, and the following preferable FA concentration range can be maintained over several days. This is because it usually takes several days from the time of blood collection until the test.
  • the FA concentration is preferably 0.01 to 1.0 vol%, more preferably 0.02 to 0.2 vol% with respect to 100 vol% of blood contained in the blood-derived specimen.
  • the concentration of the cell fixing agent is preferably 1.0 to 50.0 vol%.
  • the cell fixing agent When the cell fixing agent is used within the above range, it is possible to prevent the fixed rare cells from being almost mixed into the layer containing a large amount of red blood cells in the density gradient centrifugation performed in the step (B). If the amount of the cell fixing agent is too much or too little, a sufficient leukocyte recovery rate and erythrocyte contamination ratio may not be achieved.
  • the treatment time for bringing the blood-derived specimen and the cell fixing agent into contact with each other can be adjusted as appropriate, but the reaction proceeds after mixing the two until the effects of the present invention are sufficiently exhibited. It is desirable to ensure a certain time.
  • the present inventor has a tendency to depend on the balance between the fixing agent concentration and the processing time in order for the effects of the present invention to be fully exerted, depending on the concentration of the fixing agent. We think that processing time is decided.
  • the treatment time in a typical case such as when using Cyto-Cex (registered trademark) BCT as shown in this example described later is preferably taken into consideration the degree of deterioration of the blood itself used as a sample. 10 minutes or more and 7 days or less.
  • the “density gradient centrifugation method” performed in the step (B) is a method mainly used in molecular biology experiments, and is usually applied to a solution in a centrifuge tube by using a desired “separation solution”.
  • the density (specific gravity) decreases from the bottom to the top and the sample is centrifuged in that state, the target substance or cell forms a layer of a constant density solution according to the density (specific gravity). This is a method of sorting the target object using various properties.
  • the density gradient centrifugation method is a method for separating an object whose density (specific gravity) is known in advance from an object other than the object, so that those skilled in the art usually have an object whose specific gravity is unknown. Density gradient centrifugation is not used to separate the.
  • the “separation liquid” used in the density gradient centrifugation method is not particularly limited as long as it has a specific gravity and can be adjusted to an osmotic pressure and pH without destroying cells.
  • commercially available Ficoll (Registered trademark), Percoll (registered trademark), sucrose solution, and the like can be used.
  • blood-derived specimens are classified into “layers rich in red blood cells” and “other than red blood cells”.
  • the layer containing a large amount of cells can be separated into at least two layers, and by removing all of the “layer containing a large amount of cells other than red blood cells”, the red blood cells can be substantially removed from the blood-derived specimen.
  • the specific gravity of the separation liquid to be used is preferably 1.113 or less, more preferably 1.085 or less, the contamination rate of erythrocytes contained in all the “layers containing many cells other than erythrocytes” is 2 to 6% or less. Therefore, it is preferable.
  • Two or more types with different specific gravities may be used in combination, and in this case, cells other than red blood cells (eg, eosinophils, neutrophils, basophils, lymphocytes, mononuclear cells) Spheres and the like) can be further separated, and these cells other than the rare cells to be detected can be further excluded.
  • red blood cells eg, eosinophils, neutrophils, basophils, lymphocytes, mononuclear cells
  • Spheres and the like can be further separated, and these cells other than the rare cells to be detected can be further excluded.
  • the specific gravity of the main cell components contained in the blood-derived specimen generally has a magnitude relationship of plasma ⁇ platelet ⁇ white blood cell ⁇ red blood cell. It is known that the specific gravity of CTC is about the same as that of platelets and leukocytes, or even smaller than that of platelets and leukocytes, depending on the type and nature of the CTC.
  • the centrifuge tube for blood collection of the present invention is preliminarily filled with the “cell fixing agent”, the “anticoagulant”, and the “separation liquid” for density gradient centrifugation. It is preferable that the liquid and the cell fixing agent and the anticoagulant are physically separated by a “porous barrier” and / or “thixotropic gel”, in which case the cell fixing agent and the anticoagulant are in a solid state ( For example, a powder or a granule is preferable, and the cell fixing agent is particularly preferably a formaldehyde donor.
  • the “porous barrier” is preferably made of an elastomer, and is preferably a filter-like one having a through-hole having a size (pore diameter 5 to 8 ⁇ m) that allows passage of one red blood cell and a pore size of about 150 ⁇ m or less.
  • the thickness is not particularly limited as long as it is strong enough not to be damaged even when subjected to mechanical force by density gradient centrifugation, and is, for example, about 2 to 15 mm.
  • the cell fixing agent and the anticoagulant are preferably granules having a diameter larger than the pore diameter of the porous barrier.
  • thixotropic gel is preferably a gel-like substance composed of a thixotropic substance selected from the group consisting of silicic acid, bentonite, hectorite, kaolin, alginate and / or a mixture thereof, Although fluidized by the action of a mechanical force by density gradient centrifugation, it has the property of curing when such a force is not applied.
  • porous barrier and thixotropic gel suitable for the centrifuge tube for blood collection of the present invention those described in JP-T-2008-529541 can be suitably used.
  • Example 1 White blood cell recovery rate and red blood cell contamination ratio of formaldehyde-treated blood Benogect (registered trademark) II vacuum blood collection tube “VP-DK053K” manufactured by Terumo Corporation was used as a blood collection tube.
  • This blood collection tube is filled with a predetermined amount of granules of ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium [EDTA-2K] in advance, and this amount seems to be an amount that makes the EDTA concentration about 1.5 mg / mL with respect to the amount of blood collected.
  • the volume of the blood collection tube is 5 mL.
  • Cell fixation was performed by adding 0.3 mL of a 20% neutral buffered formalin solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to 3 mL of the collected blood. Then, it was mixed by inverting 10 times.
  • This “20% neutral buffered formalin solution” is prepared by adjusting a formalin stock solution (37% formaldehyde solution) to about 7.4% with phosphate buffered saline [PBS].
  • FA was added to the blood collection tube so that the final concentrations were 0.01 vol%, 0.02 vol%, 0.04 vol%, 0.08 vol% and 0.1 vol%, respectively.
  • Each blood collection tube is allowed to stand at room temperature for 3 days. On the third day, the blood collection tube is turned over again to mix the plasma component and the blood cell component, and then the bovine serum albumin is added to the contents of each blood collection tube.
  • the solution was diluted 2-fold with a PBS solution containing 0.5% by weight of [BSA]. Of these, 4 mL was layered on top of the centrifuge tube pre-filled with 3 mL of density gradient centrifugal separation liquid (Ficoll, specific gravity 1.077), and centrifuged at 400 ⁇ g for 40 minutes at room temperature.
  • Example 1 leukocyte recovery and erythrocyte contamination ratio were determined in the same manner as in Example 1 except that PBS was used instead of “20% neutral buffered formalin solution”. The results are shown in Table 1.
  • Example 2 White blood cell recovery rate of Cyto-Cex (registered trademark) -treated blood First, Cyto-Cex (registered trademark) BCT (Streck) commercially available as a blood collection tube pre-filled with an anticoagulant and a cell fixing agent. 3ml of collected blood was put into each bottle (made by Innovations).
  • the cell fixing agent packed in “Cyto-Cex® BCT” is expected to be a formaldehyde donor such as diazolidinyl urea or imidazolidinyl urea. It is considered that cell release action is exhibited by sustained release. Further, it is considered that the anticoagulant filled in “Cyto-Cex (registered trademark) BCT” is an EDTA solution. When Cyto-Cex (registered trademark) BCT is used as a blood collection tube, the effect of protecting the surface antigen of leukocytes for a long time is expected.
  • the blood collection tube was inverted 10 times and mixed.
  • Each group was mixed (so that the plasma component and blood cell component were mixed) and subjected to density gradient centrifugation; and left to stand at room temperature for 3 days and mixed once by inversion and subjected to density gradient centrifugation.
  • Cyto-Cex registered trademark
  • each blood collection tube was diluted 2 times with a PBS solution containing 0.5% by weight of BSA. 4 mL of this was layered on the centrifuge tube pre-filled with 3 mL of density gradient centrifugation solution (Ficoll [registered trademark], specific gravity 1.077), and centrifuged at 400 ⁇ g for 40 minutes at room temperature. went.
  • Example 2 In Example 2, instead of “Cyto-Cex (registered trademark) BCT”, “Benoject (registered trademark) II vacuum blood collection tube” (the same as that used in Example 1 was filled with a predetermined amount of EDTA-2K in advance. The white blood cell collection rate was determined in the same manner as in Example 2 except that the blood collection tube was used. The results are shown in Table 2 and FIG.
  • Example 3 Comparison of formaldehyde-treated blood and Cyto-Cex (registered trademark) -treated blood As a group treated with formaldehyde [FA], in Example 1, the final concentration of formaldehyde [FA] with respect to 3 mL of blood is 0.08 vol%.
  • the blood collection tubes prepared in the same manner as in Example 1 and each blood collection tube prepared by adding 0.16 vol% of the final concentration of formaldehyde [FA] to 3 mL of blood In place of “I left it for 3 days”, it was allowed to stand at room temperature for 1 day, and the leukocyte recovery rate was determined in the same manner as in Example 1.
  • Cyto-Cex (registered trademark) BCT (hereinafter, “Cyto-Cex (registered trademark) treatment”)
  • Example 2 the mixture was allowed to stand and mixed once by inversion after standing for one day.
  • the white blood cell recovery rate was determined in the same manner as in Example 2 except that the above was performed.
  • Example 4 Leukocyte collection rate and erythrocyte contamination ratio depending on standing temperature
  • the leukocyte collection rate and erythrocyte contamination ratio were determined by shaking the temperature during standing. That is, when cell fixation by “Cyto-Cex (registered trademark) BCT” was performed, the temperature at which it was allowed to stand for 3 days was changed to four stages of 4 ° C., 20 ° C., 29 ° C., and 37 ° C. Except for, the same operation as in Example 2 was performed, and the leukocyte collection rate and the erythrocyte contamination ratio were calculated for each sample. The results are shown in Table 4. It can be seen that room temperature (20 ° C.) is particularly suitable for leukocyte recovery and erythrocyte contamination ratio.
  • Example 5 Change in leukocyte collection rate and erythrocyte contamination ratio over time at 4 ° C and 20 ° C
  • the change over time of the mixing ratio for 5 days from the blood collection date was followed in the same manner as in Example 2. That is, when performing cell immobilization with “Cyto-Cex (registered trademark) BCT”, the temperature for standing is changed to two stages of 4 ° C. and 20 ° C., and the time for standing is also 10 minutes.
  • the same operation as in Example 2 was performed except that the sample was shaken in three stages of (0 day), 3 days (3 days), and 5 days (5 days).

Abstract

本発明は、血液に含まれる細胞を展開し観察する場合において、採血した時点から、数日間保管されるなどして、赤血球が分離されるまでに長時間が経過した血液由来検体であっても、希少細胞をほとんどロスすることがなく、血液に含まれる希少細胞の検出精度を向上することができる赤血球除去方法および採血用遠沈管を提供することを目的とする。血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、(Ａ)：血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程；および、(Ｂ)：上記工程(Ａ)で得られた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程を含むことを特徴とする赤血球除去方法。

Description

赤血球除去方法および採血用遠沈管
　本発明は、血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に多量に含まれる赤血球を予め除去する方法および細胞固定剤と抗凝固剤と密度勾配遠心用分離液とが充填されている採血用遠沈管に関する。
　循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、各種幹細胞等（本明細書において、まとめて「希少細胞」という。）は、病態に応じて抹消血中に極めて稀に存在する細胞である。これら希少細胞の検出は臨床的に有用であることは自明であるが、全血サンプルからすべての希少細胞を検出することは未だに困難である場合がほとんどである。
　近年、様々な細胞分離手法を応用して希少細胞の検出が試みられ、製品化されているが、いずれにおいても対象の希少性およびヘテロ性が故に、検出結果の有効性やその保証手段が重要であると考えられている。例えば、細胞分離工程のいくつかを経るうちに希少細胞をロスしたり、多種多様な不要細胞の混入により希少細胞を識別するのが困難であったりするので、希少細胞をどの程度ロスしたかの評価や希少細胞をロスしないための手段を講じることが重要である。
　例えば、特許文献1には、癌患者から採血した血液をＣｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)安定化剤に回収し、通常の遠心分離を行って血漿を除去した後、ＣＴＣ表面抗原に特異的な抗体が固定化された磁性粒子を使用し、ＣＴＣを磁気的に分離する方法が開示されている。
　しかしながら、一概にＣＴＣとは言え、転移性の乳癌や前立腺癌、大腸癌などに由来するものであるから、ＣＴＣすべてが同じ性質を有するとは限らず（例えば、同一組織の大腸癌に由来するＣＴＣであっても、その細胞表面に発現している分子（表面抗原）の種類・数が一様であるとは言い切れない。）、特許文献1の磁気的に分離する工程において、ある種のＣＴＣを取りこぼしている可能性がある。
　また、特許文献2には、血液中の希少細胞を検出する方法であって、血液から赤血球を除き、白血球および希少細胞が含有される細胞懸濁液を得る前処理工程と、該細胞懸濁液を複数の穴が設けられた観察領域に展開する細胞展開工程と、該観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する撮影工程と、撮影で得られた画像から希少細胞を検出する検出工程とを含む方法が開示されている。前処理工程において、密度勾配遠心法によって赤血球を分離してもよいこと（段落[0038]）、またホルマリン法等で細胞固定する場合は遠心分離の後で（細胞観察部材への展開の際に、または細胞観察をする際に染色処理とともに）行うこと（段落[0042]～[0043]）が記載されている。
　しかしながら、特許文献2の検出方法では、採血から該検出方法を実施するまでに長時間を要するため、血液中の細胞が劣化しやすいと考えられ、特に前処理工程において密度勾配遠心法を行った場合、希少細胞の回収率が低下したり、単核球層に赤血球が多く混入したりしてしまい、前処理工程後の工程が阻害され、正確な検出結果が得られないことがあった。
特表2005-501236号公報 国際公開第2011/108454号
　本発明は、血液に含まれる細胞を展開し観察する場合において、採血した時点から、数日間保管されるなどして、赤血球が分離されるまでに長時間が経過した血液由来検体であっても、希少細胞をほとんどロスすることがなく、血液に含まれる希少細胞の検出精度を向上することができる赤血球除去方法および採血用遠沈管を提供することを目的とする。
　通常、ホルムアルデヒド等を用いて細胞固定を行うと、細胞が有するタンパク質等の分子が、その分子内または分子間で架橋される。細胞固定された細胞は、その比重が細胞固定前とほとんど変わらないものもあるかもしれないが、細胞の種類に関係なく大なり小なり変動することも十分考えられる。しかしながら、細胞固定前後の細胞の比重の変化についてこれまで詳細に調べられていないため、どの種類の細胞がどの程度比重が変動するか、まったくわかっていない。
　このような状況で、そのような細胞固定処理を、比重による厳密な分離を行う密度勾配遠心分離の前に行うという発想は、これまでまったくなかった。
　しかしながら、本発明者らは、血液由来検体に含有される細胞に対して細胞固定処理を行った後に密度勾配遠心分離をしたところ、細胞固定された希少細胞が、赤血球以外の細胞が多く含まれる層にほぼ確実に含まれるようになり、希少細胞の回収率の向上、赤血球混入比の低下を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、上述した目的のうち少なくとも１つを実現するために、本発明の１つの側面を反映した赤血球除去方法は、血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、(Ａ) 血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程；および、(Ｂ) 上記工程(Ａ)で得られた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程を含む。
　また、本発明のもう１つの側面を反映した採血用遠沈管は、細胞固定剤、抗凝固剤および密度勾配遠心用分離液が予め充填されている。
　本発明の赤血球除去方法または採血用遠沈管を用いて赤血球を除去すると、採血した時点から、数日間保管されるなどして、赤血球が分離されるまでに長時間が経過した血液由来検体であっても、希少細胞をほとんどロスすることがなく、細胞が収縮または膨張する等の劣化を抑えることができる。
　また、本発明の赤血球除去方法または採血用遠沈管を用いて血液由来検体から赤血球を除去した後、赤血球が除去された血液由来検体を展開し観察することによって、該血液由来検体に含有される（含有される可能性のある）ＣＴＣ等の希少細胞を検出する場合、該血液由来検体に希少細胞が存在するか否かの判断結果の信頼性が向上し、さらに該血液由来検体から希少細胞を検出する精度が高くなる。
図1は、本発明に係る赤血球除去方法における工程(Ｂ)の密度勾配遠心法を実施する前後の遠沈管(1)を模式的に示した図である。 図2は、実施例2および比較例2で得られた白血球回収率の経時変化をグラフにしたものである。 図3は、実施例5で得られた(a)白血球の経時変化、および(b)赤血球混入比の経時変化をグラフにしたものである。
　以下、本発明に係る赤血球除去方法および採血用遠沈管を詳細に説明する。
　　　　　　　　　　　　　　＜赤血球除去方法＞
　本発明の赤血球除去方法は、血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に多量に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、下記の工程(Ａ)および(Ｂ)を含むことを特徴とする。
　細胞固定処理工程(Ａ)：血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程。
　密度勾配遠心工程(Ｂ)：細胞が固定された血液由来検体を、密度勾配遠心法により、「赤血球が多く含まれる層」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」との少なくとも二層に分離する工程。
　本発明における「血液由来検体」とは、採血した後なんら処理を施していない血液や、適切な希釈剤を用いて希釈された血液、後述するように「抗凝固剤」を用いて血液凝固が阻害された血液、または、希釈剤や抗凝固剤等を併用して適切な処理を施した血液などをいう。
　細胞固定処理工程(Ａ)において、細胞固定するとともに血液凝固を阻害することが好ましく、採血直後に血液と抗凝固剤とを反応させることによって血液凝固を阻害しつつ、さらに「細胞固定剤」を添加することによって血液細胞を固定する態様が好ましい。
　また、密度勾配遠心工程(Ｂ)の一態様として、図1に示されるように、密度勾配遠心用の分離液(3)が予め充填された遠沈管(1)に、工程(Ａ)で得られた、細胞固定された血液由来検体(2)を該分離液(3)の上に重層する工程；および、この遠沈管(1)を密度勾配遠心法により遠心分離することによって、「赤血球が多く含まれる層」(7)と「分離液の層」(6)と「単核球が多く含まれる層」(5)と「血小板が多くまれる血漿からなる層」(4)とに分離する工程、に分けられる。
　密度勾配遠心工程(Ｂ)を実施した後、「赤血球が多く含まれる層」(7)以外の層である「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」に相当する、図1の層(4)～(6)をすべて採取することが好ましい。
　本発明の赤血球除去方法を用いて、血液由来検体から赤血球を除去すると、その後、細胞展開し、目的とする希少細胞を検出する際、血液由来検体中に目的の細胞が存在するか否かの判断結果の信頼性を向上させ、また目的の細胞が存在する場合は、その検出精度を向上させることができる。
　〔希少細胞〕
　本発明で用いる血液由来検体に含まれている可能性のある「希少細胞」とは、体内に極微量に存在する細胞の総称であり、例えば循環腫瘍細胞（血液循環癌細胞ともいう。）〔ＣＴＣ〕、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、各種幹細胞等が挙げられる。本発明の赤血球除去方法を実施した後に得られた血液由来検体から検出するための目的の細胞でもあり得る。
　特にＣＴＣは、癌の予後や転移の診断や治療効果のモニタリングの指標となり得ることから、本発明では希少細胞としてＣＴＣが好適である。
　〔抗凝固剤〕
　抗凝固剤は、採血した血液がゲル状になる「血液凝固」を防止するための薬剤である。血液由来検体の用途によって抗凝固剤が必要な場合と不要な場合とがあるが、本発明のように希少細胞を回収する場合は通常は抗凝固剤が必要となる。
　一般的な「抗凝固剤」としては、エチレンジアミン四酢酸〔ＥＤＴＡ〕、ジエチレントリアミン五酢酸〔ＤＴＰＡ〕、1,2-ジアミノシクロヘキサン四酢酸〔ＤＣＴＡ〕、エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)四酢酸〔ＥＧＴＡ〕；ヘパリン、ヘパリン硫酸、低分子ヘパリン等のヘパリン種；クエン酸、シュウ酸等が挙げられる。例えば、白血球の数やリンパ球の百分率を出す場合は、抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用する。ＣＤ4数などリンパ球のサブセットを調べる場合は、ヘパリンであってもＥＤＴＡであってもよい。輸血用の血液を採血する場合は、クエン酸ナトリウムを含む液（例えばＡＣＤ〔acid citrate dextrose〕、ＣＰＤ〔citrate phosphate dextrose〕など）を使用する。
　本発明で用いることができる「抗凝固剤」としては、これら従来公知の抗凝固剤をいずれも選択でき、本発明はこれらに限定されるものではない。
　〔細胞固定剤〕
　工程(Ａ)、すなわち、血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程では、細胞固定剤を使用して細胞を固定する。「固定」または「細胞固定」とは、一般的には、細胞または組織の自己分解や腐敗を遅延させるとともに、その形態および抗原性を保持する目的で行われる処理をいう。本発明では、このような処理が希少細胞の回収率の向上、赤血球混入比の低下などの効果をもたらす。
　細胞固定剤として一般的な物質としては、例えば、アルデヒド類、アルコール類、重金属元素などが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。また、細胞固定剤として直接作用するものではないが、それ自体が加水分解等を受けることによって例えばホルムアルデヒド等の細胞固定剤を遊離するような、例えばホルムアルデヒド供与体（「ホルムアルデヒドドナー」または「ＦＡドナー」ともいう。）なども、本発明で用いる細胞固定剤に包含される。ホルムアルデヒド供与体は、長期間保存（ただし、加水分解を受けないような条件下で）した後であっても、血液由来検体や血液に触れた直後から加水分解によってホルムアルデヒドを遊離できることから、特に好ましい。
　アルデヒド類は、タンパク質の既存の結合様式（例えば、ジスルフィド結合や水素結合など）を解離させ、新たな結合を形成する。その結合は、リジン、アルギニン等のアミノ基末端やトリプトファン、チロキシン等の芳香族活性炭素との共有結合であったり、別のアミノ酸末端残基と連結して形成されるメチレン架橋であったりする。これらの新たな結合によってタンパク質の高次構造を変化させたり、このような結合や架橋に関与しない遊離分子もポリペプチド鎖をホールドすることによってさらなる変性を防いだりすることができ、タンパク質構造を安定化するとともに、細胞原形質をゲル化して酵素活性を抑えることができる細胞固定剤である。このようなアルデヒド類としては、ホルムアルデヒド〔ＦＡ〕が代表的であり、グルタルアルデヒドやグリオキサールなども含まれる。
　エタノールやメタノールに代表されるアルコール類は、タンパク質を変性させて沈殿させることができる細胞固定剤である。
　重金属元素としては、例えば、クロム〔Ｃｒ〕、マンガン〔Ｍｎ〕、亜鉛〔Ｚｎ〕などが挙げられる。
　また、ホルムアルデヒド供与体としては、例えば、アミンやアミドのメチロール、ヒドロキシメチル誘導体、ジアゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、メテンアミン、パラホルムアルデヒドなどが挙げられる。
　本発明においては、これらを一種単独で用いても二種以上併用してもよいが、これらに限定されるものではない。
　工程(Ａ)において用いる細胞固定剤の量は、その種類に応じて適宜調整することができるが、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、細胞固定剤の濃度は0.01～50.0ｖｏｌ％の範囲で調整される。
　例えば、ＦＡドナーを細胞固定剤として用いる場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対してＦＡドナーの濃度が好ましくは0.1～10.0ｖｏｌ％となるように含ませる。ＦＡドナーの濃度が上記範囲内であると、ＦＡがゆっくり遊離され、下記の好ましいＦＡの濃度範囲を数日にわたって維持することができるので好適である。というのも、採血したときから検査するまでに、通常、数日を要するからである。
　例えば、ＦＡを細胞固定剤として用いる場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、ＦＡの濃度が好ましくは0.01～1.0ｖｏｌ％、より好ましくは0.02～0.2ｖｏｌ％となるように含ませ、一方、アルコール類を用いる場合は、該細胞固定剤の濃度が好ましくは1.0～50.0ｖｏｌ％となるように含ませる。
　細胞固定剤を上記範囲内で用いると、工程(Ｂ)で実施する密度勾配遠心法において、固定された希少細胞が赤血球を多く含む層にほぼ混入しないようにすることができる。細胞固定剤の量が多すぎても少なすぎても、充分な白血球回収率および赤血球混入比を達成できない場合がある。
　また、血液由来検体と細胞固定剤とを接触させる処理時間は適宜調整することができるが、両者を混合してから反応が進行し、本発明の作用効果が充分に奏されるようになるまで、一定の時間を確保することが望ましい。ここで、本発明者は、本発明の作用効果が充分に発揮されるためには、固定化剤濃度と処理時間との両方のバランスに依存する傾向があり、固定化剤の濃度に応じて処理時間が決まると考えている。例えば、後述する本実施例に示すようにＣｙｔｏ－Ｃｈｅｘ（登録商標）ＢＣＴを用いた場合等典型的な場合における処理時間は、サンプルとして用いる血液自体の劣化の程度も考慮に入れて、好ましくは10分間以上7日間以下である。
　〔密度勾配遠心法〕
　工程(Ｂ)で実施される「密度勾配遠心法」とは、主に分子生物学実験で用いられる手法であり、所望の「分離液」を用いることによって遠沈管内の溶液に対して通常は底部から上部に向かって密度（比重）を低下させ、その状態で試料を遠心分離すると、目的とする物質や細胞がその密度（比重）に従って一定の密度溶液の層をそれぞれ形成するが、そのような性質を利用して目的物を分取する方法である。
　すなわち、密度勾配遠心法は、その密度（比重）が予めわかっている目的物を、該目的物以外の物から分離するための手法であるから、当業者は、通常、比重が不明な目的物を分離するために密度勾配遠心法は用いることはしない。
　密度勾配遠心法に用いられる「分離液」としては、特定の比重を有し、細胞を破壊することのない浸透圧およびｐＨに調節できるものであれば特に限定されないが、例えば、市販のフィコール(登録商標)やパーコール(登録商標)、ショ糖溶液などを用いることができる。
　この分離液の比重を、赤血球の比重よりも小さく、且つ、白血球の比重よりも大きく設定して密度勾配遠心法を実施すると、血液由来検体を、「赤血球が多く含まれる層」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」との少なくとも二層に分離することができ、この「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」を全部取り出すことによって、血液由来検体から赤血球をほぼ取り除くことができる。
　用いる分離液の比重を、好ましくは1.113以下、より好ましくは1.085以下とすると、取り出した全部の「赤血球以外の細胞が多く含まれる層」に含まれる赤血球の混入率を2～6％またはそれ以下に抑えられるため好適である。
　分離液として、比重の異なる二種以上（例えば比重1.077と1.119）を併用してもよく、この場合、赤血球以外の細胞（例えば好酸球、好中球、好塩基球、リンパ球、単核球など）をさらに分離することができ、検出対象である希少細胞以外のこれらの細胞をさらに排除することができる。
　なお、血液由来検体に含まれている主な細胞成分の比重は、一般的に、血漿＜血小板＜白血球＜赤血球という大小関係を有している。ＣＴＣの比重は、その種類・性質にもよるが、血小板や白血球と同程度、あるいは、血小板や白血球よりもさらに小さいことが知られている。
　　　　　　　　　　　　　　　＜採血用遠沈管＞
　本発明の採血用遠沈管は、上記「細胞固定剤」、上記「抗凝固剤」および密度勾配遠心用の上記「分離液」が予め充填されていることを特徴とし、充填の態様として、分離液と細胞固定剤および抗凝固剤とが「多孔質バリア」および/または「チキソトロープゲル」によって物理的に分断されているのが好ましく、その際、細胞固定剤および抗凝固剤が固体状（例えば粉末や顆粒など）であるのが好ましく、特に細胞固定剤がホルムアルデヒド供与体であるとより好ましい。
　この「多孔質バリア」とは、好適にはエラストマー製であり、赤血球が一個通過できる程度の大きさ（孔径5～8μｍ）以上かつ孔径150μｍ以下程度の貫通孔を有するフィルター状のものが好ましく、その厚さは密度勾配遠心法による機械的な力を受けても損傷しない程度の強度を有する厚さであればよく、例えば2～15ｍｍ程度である。多孔質バリアのみを用いて分離液と細胞固定剤および抗凝固剤とを分断する場合、細胞固定化剤および抗凝固剤が、多孔質バリアの孔径より大きい直径を有する顆粒であることが好ましい。さらには、分離液と接しないように、細胞固定化剤および抗凝固剤をフィルムコート状の形態で、遠沈管の上部に固定しておくことが好ましい。
　また、「チキソトロープゲル」とは、好適には、ケイ酸、ベントナイト、ヘクトライト、カオリン、アルギン酸塩および/またはこれらの混合物からなる群から選択されるチキソトロープ物質からなるゲル状のものであり、密度勾配遠心法による機械的な力が作用することによって流動化するが、このような力が作用しないと硬化する性質を有する。
　なお、本発明の採血用遠沈管に好適な多孔質バリアおよびチキソトロープゲルとして、特表2008-529541号公報に記載のものを好適に使用することができる。
　以下、本発明について実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　［実施例１］ホルムアルデヒド処理血液の白血球回収率および赤血球混入比
　採血管として、テルモ(株)製のベノジェクト(登録商標)II真空採血管「VP-DK053K」を用いた。この採血管には予めエチレンジアミン四酢酸二カリウム〔ＥＤＴＡ-2Ｋ〕の顆粒が所定量充填されており、この量は採血量に対してＥＤＴＡ濃度が1.5ｍｇ/ｍＬ程度になる量と思われる。なお、この採血管の容積は５ｍＬである。
　採血した血液３ｍＬに、20％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業(株)製）の希釈液0.3ｍＬを添加して細胞固定を行った。そして、10回転倒して混和させた。
　この「20％中性緩衝ホルマリン液」は、ホルマリン原液（37％ホルムアルデヒド溶液）をリン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕で約7.4％に調整されたものであり、血液３ｍＬに対して、ホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度がそれぞれ0.01ｖｏｌ％、0.02ｖｏｌ％、0.04ｖｏｌ％、0.08ｖｏｌ％および0.1ｖｏｌ％になるようにして採血管に添加した。
　各採血管を室温で３日間静置し、その３日目に再度採血管を転倒させて、血漿成分と血球成分とを混和させた後、各採血管の内容物に対して、ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を0.5重量％含むＰＢＳ溶液で２倍希釈した。そのうち４ｍＬを、密度勾配遠心用分離液（Ｆｉｃｏｌｌ、比重1.077）３ｍＬが予め充填された遠沈管の該分離液の上から重層し、室温で400×ｇで40分間遠心分離を行った。
　遠心後、赤血球が多く含まれる層以外の層をすべて採取し、フィコエリスリン〔ＰＥ〕標識抗ＣＤ45抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ33342により細胞染色を行った。そのうち20μＬを血球計算盤にて顕微鏡下で観察し、明視野にて全細胞数をカウント、また蛍光励起にて観察されるＰＥおよびＨｏｅｃｈｓｔ33342のシグナルを白血球としてカウントした。
　また、別途、密度勾配遠心前の血液も一部採取しておき、同様に細胞染色を行い、適宜ＰＢＳ溶液で希釈して、遠心前の白血球数をカウントした。
　実際にカウントしたサンプルの希釈倍率や全体のサンプル量から補正を行い、２ｍＬ血液および遠心後サンプルに存在する全白血球数を算出し、遠心分離前の白血球数に対する遠心分離後の白血球数の比を算出して、白血球回収率（％）を求めた。また、遠心後サンプルの全細胞数に対し、白血球数を除いた値を赤血球数とし、赤血球数と白血球数の比を算出し、赤血球混入比を求めた。その結果を表１に示す。
　［比較例1］
　実施例１において、「２０％中性緩衝ホルマリン液」の代わりにＰＢＳを用いた以外は実施例１と同様にして白血球回収率と赤血球混入比を求めた。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　［実施例２］Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)処理血液の白血球回収率
　まず、抗凝固剤と細胞固定剤とが予め充填された採血管として市販されているＣｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ（Streck Innovations社製）一本当たりに、採血した血液3ｍＬを入れた。
　この「Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」に充填されている細胞固定剤は、本発明者らが分析した結果、ジアゾリジニル尿素やイミダゾリジニル尿素などのホルムアルデヒド供与体であると予想され、血液混和後にホルムアルデヒドを徐放して細胞固定作用を発揮するものと考えられる。また、「Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」に充填されている抗凝固剤は、ＥＤＴＡ溶液であると考えられる。Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴを採血管として用いると、白血球の表面抗原が長時間保護されるという効果が期待されている。
　次に、採血管を10回転倒し、混和した。
　Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)に血液3ｍＬが入っているこのような採血管は３本用意し、10分間静置後、密度勾配遠心法を実施した群と；室温で２日間静置後に一度転倒混和（血漿成分と血球成分とが混和されるように）し、密度勾配遠心法を実施した群と；室温で３日間静置後に一度転倒混和し、密度勾配遠心法を実施した群とにそれぞれ用いた。
　各採血管の内容物に対して、ＢＳＡを0.5重量％含むＰＢＳ溶液で２倍希釈した。そのうち４ｍＬを、密度勾配遠心用分離液（Ｆｉｃｏｌｌ〔フィコール〕(登録商標)、比重1.077）３ｍＬが予め充填された遠沈管の該分離液に重層し、室温で400×ｇで40分間遠心分離を行った。
　密度勾配遠心後、赤血球層以外の層をすべて採取し、ＰＥ標識抗ＣＤ45抗体およびＨｏｅｃｈｓｔにて細胞染色を行った。そのうち20μＬを血球計算盤にて顕微鏡下で観察し、蛍光励起にて観察されるＰＥおよびＨｏｅｃｈｓｔ33342のシグナルを白血球としてカウントした。また、別途、密度勾配遠心前の血液由来検体（Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)で処理後）も一部採取しておき、同様に細胞染色を行い、適宜ＰＢＳ溶液で希釈して、密度勾配遠心前の白血球数をカウントした。実際にカウントしたサンプルの希釈倍率や全体のサンプル量から補正を行い、２ｍＬ血液および遠心分離後サンプルに存在する全白血球数を算出し、遠心分離前の白血球数に対する遠心分離後の白血球数の比を算出して、白血球回収率（％）を求めた。この結果を表２および図２に示す。
　［比較例２］
　実施例２において、「Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」の代わりに「ベノジェクト(登録商標)II真空採血管」（実施例１で用いたものと同じ、所定量のＥＤＴＡ-2Ｋが予め充填されている採血管）を用いた以外は、実施例２と同様にして白血球回収率を求めた。この結果を表２および図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表２から、実施例２で3日間静置した場合の方が、採血日と同日の場合より、白血球回収率が高いことがわかった。これは、細胞固定剤からホルムアルデヒドがゆっくりと放出（徐放）され、徐々に細胞との反応が進むからであると考えられる。
　［実施例３］ホルムアルデヒド処理血液とＣｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)処理血液の比較
　ホルムアルデヒド〔ＦＡ〕による処理群として、実施例１において、血液３ｍＬに対するホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度が0.08ｖｏｌ％になるよう添加した採血管と、実施例１と同様にして、血液３ｍＬに対するホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度が0.16ｖｏｌ％になるよう添加して準備した採血管それぞれに対し、実施例１において、「室温で３日間静置した」ことに代えて、室温で１日間静置し、実施例１と同様にして白血球回収率を求めた。
　また、Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴによる処理群（以下、「Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)処理」）として、実施例２において、静置及び混和を、１日間静置後に一度転倒混和することによって行ったこと以外は実施例２と同様にして白血球回収率を求めた。
　これらの結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　十分なホルムアルデヒド〔ＦＡ〕の最終濃度で処理すれば、静置１日後であっても、Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)処理の場合と同等の白血球回収率（％）を得られることがわかる。
　［実施例４］静置温度による白血球回収率および赤血球混入比
　実施例２の３日間静置において、静置時の温度を振って白血球回収率と赤血球混入比を求めた。すなわち、「Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」による細胞固定化を行う際に、３日間静置を行う温度を、４℃，２０℃，２９℃，３７℃という４段階の温度に振ったことを除いては、実施例２と同様の操作を行い、それぞれのサンプルについて、白血球回収率及び赤血球混入比の算出を行った。
　その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　室温（２０℃）が特に白血球回収率および赤血球混入比において適していることがわかる。
　［実施例５］4℃および20℃における白血球回収率および赤血球混入比の経時変化
　実施例４において、長時間の保管に適していると推測された4℃および20℃において、白血球回収率および赤血球混入比についての、採血日から５日間の経時変化を実施例２と同様な方法で追跡した。すなわち、「Ｃｙｔｏ－Ｃｈｅｘ(登録商標)ＢＣＴ」による細胞固定化を行う際に、静置を行う温度を４℃，２０℃という２段階の温度に振るとともに、静置を行う時間についても10分間（０日），３日間（３日），５日間（５日）という３段階の時間に振ったことを除いては、実施例２と同様の操作を行い、それぞれのサンプルについて、白血球回収率及び赤血球混入比の算出を行った。
　ここで、比較例２と同様に細胞固定化を行わなかったサンプルについての、20℃における白血球回収率および赤血球混入比の経時変化についても同様に追跡を行った。
　結果を図３に示す。
　1・・・遠沈管
　2・・・細胞固定された血液由来検体
　3・・・分離液
　4・・・血小板が多く含まれる血漿からなる層
　5・・・単核球が多く含まれる層
　6・・・分離液の層
　7・・・赤血球が多く含まれる層

Claims (11)

  1. 　血液由来検体に含まれている可能性のある希少細胞を検出するために、血液由来検体に含まれる赤血球を予め除去する方法であって、
    　(Ａ)：血液由来検体に含まれる細胞を固定する工程；および
    　(Ｂ)：上記工程(Ａ)で得られた血液由来検体を、密度勾配遠心法により、赤血球が多く含まれる層と赤血球以外の細胞が多く含まれる層との少なくとも二層に分離する工程
    を含む赤血球除去方法。
  2. 　上記工程(Ａ)において、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、細胞固定剤を、その濃度が0.01ｖｏｌ％以上50.0ｖｏｌ％以下となるように含ませる、請求項1に記載の赤血球除去方法。
  3. 　上記工程(Ａ)において、ホルムアルデヒド供与体を細胞固定剤として用いて細胞を固定する場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、ホルムアルデヒド供与体の濃度が0.1ｖｏｌ％以上10.0ｖｏｌ％以下となるように含ませる、請求項1に記載の赤血球除去方法。
  4. 　上記工程(Ａ)において、ホルムアルデヒドを細胞固定剤として用いて細胞を固定する場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、ホルムアルデヒドの濃度が0.01ｖｏｌ％以上1.0ｖｏｌ％以下となるように含ませる、請求項1に記載の赤血球除去方法。
  5. 　上記工程(Ａ)において、アルコール類を用いて細胞を固定する場合、血液由来検体に含有される血液100ｖｏｌ％に対して、該細胞固定剤の濃度が1.0ｖｏｌ％以上50.0ｖｏｌ％以下となるように含ませる、請求項1に記載の赤血球除去方法。
  6. 　上記工程(Ａ)において、細胞固定する時間が10分間以上7日間以下である、請求項1～5のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
  7. 　上記工程(Ａ)において、細胞固定するとともに血液凝固を阻害する、請求項1～6のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
  8. 　上記工程(Ｂ)において、密度勾配遠心法に用いる分離液の比重が、1.113以下である、請求項1～7のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
  9. 　上記工程(Ｂ)において、密度勾配遠心法に用いる分離液の比重が、1.085以下である、請求項1～7のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
  10. 　上記工程(Ｂ)を実施した後、赤血球が多く含まれる層以外の層を全部採取する、請求項1～9のいずれか一項に記載の赤血球除去方法。
  11. 　細胞固定剤、抗凝固剤および密度勾配遠心用分離液が予め充填されている採血用遠沈管。
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