WO2018139583A1 - 単核球分離装置及び単核球分離方法 - Google Patents

単核球分離装置及び単核球分離方法 Download PDF

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mononuclear
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明彦 田口
由紀子 新納
尚史 津村
森田　健一
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公益財団法人神戸医療産業都市推進機構
株式会社ジェイテックコーポレーション
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Definitions

  • the present invention relates to a mononuclear cell separation apparatus and a mononuclear cell separation method.
  • bone marrow fluid is very easy to coagulate, it is very difficult to completely prevent the formation of clots even when anticoagulants are sufficiently used when collecting bone marrow fluid from patients.
  • the clot is formed by gathering fibrin to form a network structure, and erythrocytes are entangled therewith, and the main components of the clot are fibrin, platelets and erythrocytes.
  • clots often interfere with the treatment. For example, when transplanting allogeneic bone marrow cells to leukemia patients, 500 ml or more of bone marrow fluid is collected, and first three types with different pore sizes are collected.
  • Non-patent Document 2 regenerative treatment using autologous bone marrow fluid for cerebral infarction patients has been suggested to promote recovery of neurological function (Non-patent Document 2), but a small amount of 25 ml compared to leukemia patients and limb ischemia patients or 50 ml of bone marrow fluid is collected, and mononuclear cells are separated manually in the cell processing center. The clot mixed in the layer containing mononuclear cells is manually removed and transplanted to the patient. is doing.
  • Non-Patent Document 3 The reason why a relatively small amount of bone marrow fluid is used in patients with cerebral infarction compared to patients with limb ischemia is that a sufficient effect can be expected even with a small amount (Non-Patent Document 3), and blood pressure reduction due to collection of a large amount of bone marrow This is because it may cause worsening of infarct symptoms.
  • a clot is removed using a filter during the separation and purification of a relatively small amount of bone marrow fluid, it is difficult to use the filter because the volume loss in the filter portion is large and the amount of bone marrow fluid is significantly reduced. .
  • Non-patent Document 4 a test in which bone marrow mononuclear cells were isolated manually and administered to patients with myocardial infarction showed the effectiveness of cell transplantation (Non-patent Document 4), but cells without clot removal function It has been reported that effectiveness was not recognized in clinical trials using cells separated by a separation device (Non-patent Document 5).
  • the manual separation of mononuclear cells in the cell processing center requires a great deal of cost in the construction and maintenance of the cell processing center in addition to its complicated operation. Therefore, in addition to existing devices, a separation apparatus for bone marrow mononuclear cells that does not require a cell processing center as in Patent Document 1 has been devised, but it does not have a clot removal function.
  • the present invention has been made in view of such problems, and provides a mononuclear cell separation apparatus and a mononuclear cell separation method in which clot-derived cells containing red blood cells and the like are unlikely to be mixed into the obtained mononuclear cell component.
  • the purpose is to provide.
  • a mononuclear cell separation apparatus includes an injection means for injecting a centrifugal separation medium from the bottom surface of a container in which a blood sample is stored, and a container in which the centrifugal separation medium and the blood sample are laminated in this order from the bottom surface side.
  • Centrifugation means for centrifuging, detection means for detecting a clot present in the bone marrow mononuclear cell layer after centrifugation, removal means for removing the detected clot, and collection means for collecting bone marrow mononuclear cells Have.
  • a centrifugation step for centrifuging the container, a detection step for detecting a clot present in the mononuclear cell layer after centrifugation, a removal step for removing the detected clot, and a collection step for collecting the mononuclear cells Have.
  • mixing of clot-derived cells containing erythrocytes or the like is unlikely to occur in the mononuclear cell component obtained by separation.
  • FIG. 1 is an external view of a mononuclear sphere separator according to this embodiment.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram for explaining the clot imaging means, in which (A) is a diagram for explaining the side imaging means, and (B) is a diagram for explaining the upper imaging means.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of a process from storing a blood sample in a container to moving the nozzle opening end to the container bottom.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of processes from the start of injection of the centrifugal separation medium to the bottom of the container until the completion of the centrifugal separation.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of the steps from the start of plasma aspiration to the completion of aspiration.
  • FIG. 1 is an external view of a mononuclear sphere separator according to this embodiment.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram for explaining the clot imaging means, in which (A) is a diagram for explaining the side imaging means, and (B) is a diagram
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of steps from the start of removal of the clot existing above the mononuclear cell layer to the completion of removal of the clot.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of the process from the start of collection of the mononuclear cell layer to the completion of collection.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of a method for measuring Atrophy index.
  • FIG. 9 is a diagram showing the ischemic injury inhibitory effect of bone marrow mononuclear cells separated by the method according to the present example.
  • FIG. 10 is a graph showing the cerebral cortical function recovery promoting effect of bone marrow mononuclear cell administration separated by the method according to the present example.
  • the mononuclear cell separation apparatus 900 includes an injection unit 210 that injects a centrifugal separation medium from the bottom surface of a container 100 in which a blood sample is stored, a centrifugal separation medium, and a blood sample.
  • Centrifugation means 300 for centrifuging containers 100 stacked in this order from the bottom side
  • detection means 400 for detecting clots present in the mononuclear cell layer after centrifugation, and removing the detected clots It has removal means 220 and collection means 230 for collecting mononuclear cells.
  • the container 100 is a centrifuge tube made of glass or plastic, for example.
  • the blood sample is not particularly limited, and is, for example, bone marrow fluid.
  • Bone marrow fluid can be collected, for example, by anesthetizing vertebrates (including humans) (local or general anesthesia), inserting a needle into the bone, and aspirating with a syringe.
  • Examples of bone include, but are not limited to, the femur, sternum, and iliac bone forming the pelvis.
  • the injection means 210 for injecting the centrifugal medium includes a nozzle that is connected to a centrifugal medium supply mechanism (not shown) and can inject the centrifugal medium into the container 100, and a bottom surface of the container 100 in which a blood sample is stored at the open end of the nozzle. And a moving mechanism (not shown) for moving the head.
  • a known liquid supply mechanism can be adopted as the centrifugal separation medium supply mechanism, and includes, for example, a tank that stores the centrifugal separation medium, a liquid feeding syringe, a flow path, and a solenoid valve.
  • Centrifugation media are not particularly limited, and for example, commercially available media for forming a density gradient such as Percoll (registered trademark) and Lymphoprep (registered trademark) can be used, and Ficoll-Paque (registered trademark) and Nycoprep ( (Registered trademark) can be used, but Ficoll-Paque® PREMIUM® (Ficoll is a registered trademark) is preferable.
  • Percoll registered trademark
  • Lymphoprep registered trademark
  • Ficoll-Paque registered trademark
  • Nycoprep (Registered trademark)
  • Ficoll-Paque® PREMIUM® Ficoll is a registered trademark
  • centrifugation medium is injected from the injection means 210 suddenly, the interface between the centrifugation medium and the blood sample may be disturbed. Therefore, it is desirable to inject at a predetermined speed or less. In the case of a 50-mL centrifuge tube, it is possible to inject the centrifuge medium at 0.05-mL to 1.0-mL / sec.
  • the centrifuge means 300 can use a known centrifuge mechanism, and centrifuges the container 100 in which the centrifuge medium and the blood sample are laminated in this order from the bottom side.
  • the centrifugal separator 300 includes, for example, four buckets provided on a rotating shaft that is rotated by a motor, and the container 100 is accommodated in the buckets.
  • the counterweight stored in a position opposite to the container 100 storing the blood sample is prepared by injecting PBS or the blood sample and the centrifugation medium into another container 100 in the injection means 210 described above. Can do.
  • the detection means 400 exists in the mononuclear cell layer after centrifugation, A clot to be removed is detected.
  • the clot that exists in the mononuclear cell layer and is a removal target includes a clot that exists in the mononuclear cell layer and a clot that exists on the mononuclear cell layer.
  • the detection means 400 includes an upper imaging means 410 that images the mononuclear sphere layer in the container 100 from the vertically upward direction, a side imaging means 420 that images the mononuclear sphere layer in the container 100 from the horizontal direction, and an upper imaging means.
  • Position information detecting means (not shown) for detecting position information of a clot existing in the mononuclear cell layer based on an image obtained by photographing and color information obtained from an image obtained by photographing by the side photographing means And comprising.
  • the upper photographing means 410 and the side photographing means 420 are, for example, CCD cameras, and images photographed by these CCD cameras are displayed as color images on a monitor (not shown).
  • the red blood cell layer 40 is observed as the lowermost layer, and the mononuclear cell layer 20 is observed as an approximately white belt layer between the plasma layer 10 and the centrifugation medium 30.
  • the clot 90 (in FIG. 2, the clot 90 is composed of, for example, 90a, 90b, 90c, and 90d) is mainly composed of erythrocytes, and thus is observed as a red foreign substance.
  • clots 90a and 90d As shown in FIG. 2 (B), clots 90a and 90d with the mononuclear cell layer 20 (white) in the background by the upper imaging means 410, clots 90b located below the mononuclear cell layer 20, and A clot in the mononuclear cell layer (not shown) is photographed at 90c.
  • the position information detecting means applies a spatial filter or the like to the image photographed by the upper photographing means 410 to emphasize a portion where the luminance changes, and binarizes the emphasized portion, for example, to obtain a mononuclear sphere Position information in a plan view of the clots 90a and 90d against the background of the layer 20 (white), the clots 90b and 90c located below the mononuclear cell layer 20, and the clots in the mononuclear cell layer are detected.
  • the clots 90a and 90d located above the mononuclear cell layer 20, the clots 90b and 90c located below the mononuclear cell layer 20, and the mononuclear cell layer It is difficult to distinguish from the clot inside.
  • the clot 90 is imaged from the horizontal direction by the side imaging means 420, and the position information detection means is the imaging of the side imaging means 420. Based on the obtained images, the clots 90a and 90d located above the mononuclear cell layer 20 are distinguished from the clots 90b and 90c located below the mononuclear cell layer 20 and clots in the mononuclear cell layer. I do. As a result, the position information detection means can detect the clot to be removed existing in the mononuclear cell layer 20 (the clots 90a and 90d existing in the upper part of the mononuclear cell layer 20 in FIG. 2).
  • a predetermined size of the clots existing on the upper part of the mononuclear cell layer 20 is used. It is also possible to detect and remove only the clot. For example, when detecting the clot as a shape approximating a spheroid, the detection means 400 can detect a clot to be removed when either the equator radius or the polar radius is 5 mm or more.
  • the detection means 400 calculates the area in a plan view of the clot imaged by the upper imaging means 410 from among the clots present on the mononuclear cell layer 20, and removes those exceeding a predetermined area It is possible to detect the target clot.
  • the removal means 220 is a clot that exists in the mononuclear cell layer 20 detected by the position information detection means and is a clot to be removed (the clots 90a and 90d that exist above the mononuclear cell layer 20 in FIG. 2). Remove.
  • the removing means 220 includes a nozzle that is connected to a clot suction mechanism (not shown) and can suck the clot, and a movement mechanism (not shown) that moves the open end of the nozzle to the clot existing in the mononuclear cell layer 20. .
  • the plasma layer removing means may employ a known liquid suction mechanism, and includes, for example, a suction nozzle, a tank for storing the sucked plasma layer, a suction pump, a flow path, and the like.
  • the plasma layer 10 is preferably aspirated by leaving a small amount of the plasma layer 10 for reasons that will be described later. Specifically, the aspiration is completed by leaving 10% to 20% of the liquid volume of the plasma layer 10 in the container 100. It is preferable to do this.
  • the clot is removed after the plasma layer is removed, and the clot can be removed simultaneously with the suction removal of the plasma layer, and the clot can be removed without removing the plasma layer 10. It is also possible to perform the removal.
  • the collection means 230 includes a nozzle that is connected to a mononuclear sphere collection bag (not shown) and can collect a mononuclear sphere, and a moving mechanism that moves the open end of the nozzle to the mononuclear sphere layer 20.
  • the collected mononuclear cells can be used as they are, and before use, for example, physiological saline can be added and washed multiple times with a centrifuge. When the aspiration of the plasma layer is completed with a small amount of the plasma layer 10 remaining, the residual plasma layer may be aspirated when collecting the mononuclear cell layer. Contamination of the remaining plasma layer can be eliminated.
  • a blood sample 50 collected from a subject is stored in a container 100.
  • the open end of the nozzle capable of injecting the centrifugal separation medium is put into the container 100 in which the blood sample is stored.
  • the open end of the nozzle is moved to the bottom surface of the container 100 in which the blood sample is stored.
  • centrifugal separation medium 30 As shown in the left side of FIG. 4, injection of the centrifugal separation medium 30 is started by the injection means 210, and the centrifugal separation medium 30 is stored on the bottom side of the container 100 as shown in the center of FIG. Thereafter, as shown on the right side of FIG. 4, after centrifugation, an erythrocyte layer 40, a centrifugation medium 30, a mononuclear cell layer 20, a plasma layer 10 are formed in order from the bottom of the container 100 in the container 100. Certain clots 90a, 90b, 90c, 90d may also be present.
  • the suction of the plasma layer 10 is started by the nozzle.
  • the nozzle is located above the plasma layer 10. That is, the nozzle starts removing the plasma layer 10 at a position away from the boundary between the plasma layer 10 and the mononuclear cell layer 20. This is because if the nozzle opening end, which is the tip of the nozzle, is close to the boundary portion, bone marrow mononuclear cells are involved in the flow that is generated when the plasma layer 10 is removed by suction, and the yield may be reduced.
  • the suction of the plasma layer 10 is continued until the remaining amount is small as shown in the center of FIG. 5, and then the suction of the plasma layer is completed while leaving a small amount of the plasma layer 10 as shown on the right side of FIG.
  • the suction of the plasma layer 10 is continued until the remaining amount is small as shown in the center of FIG. 5, and then the suction of the plasma layer is completed while leaving a small amount of the plasma layer 10 as shown on the right side of FIG.
  • it is possible to remove all of the plasma layer 10 since there is a possibility that the mononuclear cells present in the mononuclear cell layer 20 may be sucked and removed when the plasma layer 10 is removed, a small amount of the plasma layer 10 is removed. It is preferable to complete the suction of the plasma layer leaving
  • the removal of the clots 90a and 90d existing on the upper part of the mononuclear cell layer 20 is started.
  • the clot 90d is first removed by the removing means 220, and then the clot 90a is removed as shown on the right side of FIG.
  • the open end of a nozzle capable of collecting a mononuclear sphere is introduced into the mononuclear sphere layer 20, and then the mononuclear sphere layer 20 is sucked by the nozzle as shown in the center of FIG. Then, as shown on the right side of FIG. 7, the collection of all mononuclear cell layers 20 is completed.
  • Example 1 Inhibitory effect of bone marrow mononuclear cells on ischemic injury Inhibition of ischemic injury by bone marrow mononuclear cells separated by the mononuclear cell separation method according to the present example, in which clot contamination was suppressed Therefore, an experiment using a highly reproducible ischemic model mouse (Taguchi et al. J Exp Stroke Transl Med. 2010; 3: 28-33) developed by the inventors was performed. 48 hours after the creation of cerebral infarction, 1x10 5 isolated bone marrow mononuclear cells were administered from the tail vein, and as a method for evaluating the effect of suppressing ischemic injury 30 days after cell administration, a brain atrophy score (Taguchi et al.
  • An ischemic model for verifying the effect of bone marrow cell administration on microvessels was created by the following method.
  • An 8-week-old SCID mouse severe combined immunodeficiency mouse
  • SCID mouse severe combined immunodeficiency mouse
  • the left middle cerebral artery is coagulated with a bipolar electric scalpel and cleaved after coagulation to permanently occlude the left middle cerebral artery, An ischemic model with excellent reproducibility of the ischemic site and ischemic intensity limited to the cortex of the middle cerebral artery region was created.
  • Ficoll-Paque® PREMIUM Ficoll is a registered trademark
  • a tube containing bone marrow cells
  • centrifugation 400 G for 40 minutes.
  • the components of the mononuclear cell layer were aspirated and transferred to a new tube.
  • the cells Prior to administration, the cells were washed twice with a saline solution containing albumin (final albumin concentration 2%) using a centrifuge.
  • the details of the ischemic injury score by the macro specimen are as follows.
  • the cerebral ischemia model used in this study was limited to the cerebral cortex perfused with the left middle cerebral artery. In contrast, clear tissue atrophy occurs on the ischemic side.
  • Atrophy index is useful for quantitative evaluation of the degree of atrophy (Taguchi et al. Eur J Neurosci. 2007; 26 (1): 126-133.).
  • a method for measuring Atrophy index is shown in FIG. The Atrophy index is indicated by X / Y ⁇ 100 (%).
  • Atrophy index is an index indicating brain atrophy.
  • Control is a group administered with physiological saline. Examples are groups to which bone marrow mononuclear cells were administered. It was shown that administration of 1 ⁇ 10 5 bone marrow mononuclear cells had a significantly significant ischemic injury-reducing effect compared to the physiological saline administration group. * Indicates that there is a statistically significant difference between the Control group and the bone marrow mononuclear cell group.
  • Example 2 Function recovery promotion effect from ischemic injury of bone marrow mononuclear cells From ischemic injury caused by bone marrow mononuclear cells separated by the mononuclear cell separation method according to this example in which clot contamination was suppressed
  • an ischemic model mouse developed by the inventors was used (Taguchi et al. J Exp Stroke Transl Med. 2010; 3: 28-33).
  • mice are nocturnal, it is known that in normal mice, the amount of action decreases under bright conditions, and the amount of action increases by darkening the environment. Cerebral cortex function is important for behavioral suppression under light conditions, and it has been shown that cell therapy restores cerebral cortical function and behavioral suppression function under light conditions (Taguchi et al. J Clin Invest. 2004; 114: 330-338).
  • the mouse was automatically counted for 30 minutes under light conditions using an open field measuring device (Gyakuken Co., Ltd., free movement space 40cm x 40cm), and then it was raised for 30 minutes under dark conditions. The number of reactions was counted. The increase in momentum when changing from light to dark conditions was used as an indicator of functional recovery.
  • an open field measuring device Gyakuken Co., Ltd., free movement space 40cm x 40cm
  • FIG. 10 shows the results of the effect of promoting functional recovery from ischemic injury by bone marrow mononuclear cell administration.
  • Control is a group administered with physiological saline. Examples are groups to which bone marrow mononuclear cells were administered.
  • FIG. 10 shows the number of rearing (rising) for each of when physiological saline is administered and when bone marrow mononuclear cells are administered. Indicates the number of rises under dark conditions. In the group to which physiological saline was administered, no significant increase in momentum was observed due to changes to dark conditions, but a statistically significant increase in behavioral responses to dark reactions was observed with the administration of bone marrow mononuclear cells. It came to be.
  • the present invention can be used for separation of bone marrow mononuclear cells.
  • Plasma layer 20 Mononuclear cell layer 30 Centrifugation medium 40 Red blood cell layer 50 Blood sample 90 Clot 100 Container 210 Injection means 220 Removal means 230 Collection means 300 Centrifugation means 400 Detection means 410 Upper imaging means 420 Side imaging means 900 Single Nuclear sphere separator

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Abstract

本発明の単核球分離装置は、血液試料が貯留した容器100の底面から遠心分離媒体を注入する注入手段210と、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器100を遠心分離させる遠心分離手段300と、遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出手段400と、検出された凝血塊を除去する除去手段220と、単核球を採取する採取手段230と、を有する。また本発明の単核球分離方法は、本発明の単核球分離装置の各部構成要素に対応する、注入工程と、遠心分離工程と、検出工程と、除去工程と、採取工程とを有する。

Description

単核球分離装置及び単核球分離方法
　本発明は、単核球分離装置及び単核球分離方法に関する。
　近年、虚血性疾患患者の骨髄液を採取し、比重遠心法にて骨髄液中に存在する単核球細胞を分離し、分離した単核球細胞を虚血の局所にあるいは血管内に移植することにより、血管の再生を促進する細胞治療が開始されている。骨髄液から比重遠心法を用いて単核球細胞を分離する目的は、骨髄液中に含まれる顆粒球細胞及び赤血球細胞を除去することであり、これらの細胞を除去することにより細胞治療の治療効果が向上すると考えられている。
　一方、骨髄液は極めて凝固しやすいため、患者からの骨髄液採取に際し、抗凝固薬を十分に使用しても、凝血塊の形成を完全に防止することは非常に困難である。凝血塊とは、フィブリンが集まって網目構造をつくり、そこに赤血球が絡まるようにして生じたものであり、凝血塊の主成分はフィブリン、血小板及び赤血球である。骨髄細胞を用いた治療において、凝血塊は治療の妨げになることが多いため、例えば、白血病患者に対する他家骨髄細胞移植に際しては、500ml以上の骨髄液を採取し、まずポアサイズの違う3種類の骨髄移植用フィルターを通して、凝血塊を除去した後に、比重遠心法にて骨髄液中に存在する単核球細胞を分離する。四肢虚血患者に対する自己骨髄液を用いた再生治療は血管再生を促進することが示されているが(非特許文献１)、白血病患者に対する他家骨髄細胞移植と同様に、500ml以上の骨髄液を採取し、ポアサイズの違う3種類の骨髄移植用フィルターを通して、凝血塊を除去した後に、細胞分離機器を使用し比重遠心法にて骨髄液中に存在する単核球細胞を分離し、患者に移植している。また、脳梗塞患者に対する自己骨髄液を用いた再生治療は神経機能回復を促進することが示唆されているが(非特許文献２)、白血病患者や四肢虚血患者と比較すると少量である25mlあるいは50mlの骨髄液を採取し、セルプロセッシングセンター内において手作業で単核球細胞の分離を行い、単核球細胞が含まれる層に混入した凝血塊は、手作業で除去した後、患者に移植している。なお、四肢虚血患者と比較し、脳梗塞患者で比較的少量の骨髄液を用いる理由は、少量でも十分な効果が期待できること(非特許文献３)及び、大量の骨髄採取による血圧低下が脳梗塞症状の悪化を引き起こす可能性があるからである。また、比較的少量の骨髄液の分離精製時にフィルターを用いて凝血塊の除去を行うと、フィルター部分におけるボリュームロスが多く、骨髄液量が著しく減少するため、フィルターを使用することは困難である。我々と同様に、手作業で骨髄単核球を分離し心筋梗塞患者に投与した試験においては細胞移植の有効性が示されているものの(非特許文献４)、凝血塊の除去機能のない細胞分離機器により分離した細胞を用いた臨床試験では有効性が認められなかった(非特許文献５)ことが報告されている。ただ、セルプロセッシングセンター内で手作業での単核球細胞の分離は、その煩雑な操作に加えて、セルプロセッシングセンターの構築及び維持に多大な費用が掛かる。そこで、既存の機器以外にも特許文献１のようにセルプロセッシングセンターが不要な骨髄単核球細胞の分離装置が考案されているが、凝血塊の除去機能は有していない。
ＷＯ２０１１／００１９３６
Taguchi et al. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2003 Mar;25(3):276-8 Taguchi et al. Stem Cells Dev. 2015 Oct 1;24(19):2207-18 Uemura et al. Curr Vasc Pharmacol. 2012 May;10(3):285-8. Schachinger V　N Engl J Med. 2006 Sep 21;355(12):1210-21 Traverse JH、JAMA. 2012 Dec 12;308(22):2380-9.
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、取得する単核球成分へ赤血球等を含む凝血塊由来細胞の混入が発生しにくい単核球細胞分離装置及び単核球分離方法を提供することを目的とする。
　本発明にかかる単核球分離装置は、血液試料が貯留した容器の底面から遠心分離媒体を注入する注入手段と、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器を遠心分離させる遠心分離手段と、遠心分離後に骨髄単核球層に存在する凝血塊を検出する検出手段と、検出された凝血塊を除去する除去手段と、骨髄単核球を採取する採取手段と、を有する。
　また本発明にかかる単核球分離方法は、血液試料が貯留された容器の底面に遠心分離媒体を注入する注入工程と、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器を遠心分離させる遠心分離工程と、遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出工程と、検出された凝血塊を除去する除去工程と、単核球を採取する採取工程と、を有する。
　本発明によれば、分離取得された単核球成分へ赤血球等を含む凝血塊由来細胞の混入が発生しにくい。
図１は、本実施形態にかかる単核球分離装置の外観図である。 図２は、凝血塊の撮影手段を説明する概念図であり、そのうち（Ａ）は側部撮影手段を説明する図であり、（Ｂ）は上部撮影手段を説明する図である。 図３は、容器に血液試料を貯留してから、ノズル開口端を容器底部に移動させるまでの工程の説明図である。 図４は、容器底部への遠心分離媒体の注入開始から、遠心分離完了までの工程の説明図である。 図５は、血漿の吸引開始から吸引完了までの工程の説明図である。 図６は、単核球層の上部に存在する凝血塊の除去開始から、凝血塊の除去完了までの工程の説明図である。 図７は、単核球層の採取開始から、採取完了までの工程の説明図である。 図８は、Atrophy indexの測定方法の説明図である。 図９は、本実施例にかかる方法により分離した骨髄単核球細胞の虚血障害抑制効果を示す図である。 図１０は、本実施例にかかる方法により分離した骨髄単核球細胞投与の大脳皮質機能回復促進効果を示す図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　図１に示されるように、本実施形態にかかる単核球分離装置900は、血液試料が貯留した容器100の底面から遠心分離媒体を注入する注入手段210と、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器100を遠心分離させる遠心分離手段300と、遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出手段400と、検出された凝血塊を除去する除去手段220と、単核球を採取する採取手段230と、を有する。
　容器100は、例えばガラス又はプラスチック製の遠沈管である。血液試料は特に限定されるものではないが、例えば骨髄液である。骨髄液は、例えば、脊椎動物（ヒトを含む）を麻酔し（局所又は全身麻酔）、骨に針を刺し、シリンジで吸引することにより採取することが可能である。骨としては、例えば大腿骨、胸骨、骨盤を形成している腸骨等が挙げられるが、これらに限定されない。
　遠心分離媒体を注入する注入手段210は、図示しない遠心分離媒体供給機構に接続され容器100内に遠心分離媒体を注入可能なノズルと、このノズルの開口端を血液試料が貯留した容器100の底面に移動させる図示しない移動機構と、を備える。遠心分離媒体供給機構は公知の液体供給機構を採用することができ、例えば遠心分離媒体を収容するタンク、送液シリンジ、流路、電磁弁等から構成される。遠心分離媒体は特に限定されるものではなく例えばPercoll（登録商標）、Lymphoprep（登録商標）等の密度勾配形成用として市販されている媒体が使用でき、またFicoll-Paque（登録商標）やNycoprep（登録商標）等も使用できるが好ましくはFicoll-Paque PREMIUM （Ficollは、登録商標）である。
　注入手段210からの遠心分離媒体の注入は、急激に行うと遠心分離媒体と血液試料との界面が乱れる虞があるため、所定速度以下にて注入することが望ましく、具体的には容器100が50 mLの遠沈管の場合、0.05 mL/秒～1.0 mL/秒にて遠心分離媒体を注入することが可能である。
　遠心分離手段300は、公知の遠心分離機構を使用することができ、遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器100を遠心分離させる。遠心分離手段300は、モータによって回転する回転軸に設けられた例えば４つのバケットを備え、このバケットに容器100が収容されるようになっている。
　遠心分離を行う際、血液試料を収容した容器100に対向する位置に収容するカウンターウェイトは、上述の注入手段210において別の容器100にPBSあるいは血液試料及び遠心分離媒体を注入させて作成することができる。
　遠心分離後は、容器100内にて容器底部から順に、赤血球層、遠心分離媒体層、単核球層、血漿層ができるが、検出手段400は、遠心分離後に単核球層に存在し、除去対象となる凝血塊を検出する。ここで単核球層に存在し、除去対象となる凝血塊とは、単核球層中に存在する凝血塊と、単核球層上に存在する凝血塊とを包含するものとする。
　検出手段400は、容器100内の単核球層を鉛直上方方向から撮影する上部撮影手段410と、容器100内の単核球層を水平方向から撮影する側部撮影手段420と、上部撮影手段により撮影して得られた画像及び側部撮影手段により撮影して得られた画像から得られる色彩情報に基づいて単核球層に存在する凝血塊の位置情報を検知する図示しない位置情報検知手段と、を備える。上部撮影手段410及び側部撮影手段420は例えばCCDカメラであり、これらCCDカメラにより撮影した画像は、カラー画像として図示しないモニターにて表示される。
　図２（Ａ）に示されるように、遠心分離後においては、赤血球層40を最下層に、単核球層20は血漿層10と遠心分離媒体30との中間におよそ白色の帯状層として観察され、凝血塊90（図２においては、凝血塊90は、例えば、90a、90b、90c、90dからなるものとする。）は主として赤血球にて構成されるためおよそ赤色の異物として観察される。
　図２（Ｂ）に示されるように、上部撮影手段410により単核球層20(白色)を背景とする凝血塊90a、及び90dと、単核球層20の下部に位置する凝血塊90b及び90c並びに、図示されていない単核球層内の凝血塊が撮影される。そして位置情報検知手段は、上部撮影手段410の撮影した画像に対して空間フィルター等を適用して輝度が変化する部分を強調し、この強調した部分を例えば２値化することによって、単核球層20(白色)を背景とする凝血塊90a及び90dと、単核球層20の下部に位置する凝血塊90b及び90c並びに単核球層内の凝血塊の平面視における位置情報を検知する。
　しかしながら上部撮影手段410により撮影された画像のみでは、単核球層20の上部に位置する凝血塊90a、90dと、単核球層20の下部に位置する凝血塊90b、90c並びに単核球層内の凝血塊との区別が困難である。
　そこで本実施形態にかかる発明では、図２（Ａ）に示されるように、側部撮影手段420により水平方向からも凝血塊90を撮影し、位置情報検知手段は、側部撮影手段420の撮影した画像に基づいて、単核球層20の上部に位置する凝血塊90a、90dと、単核球層20の下部に位置する凝血塊90b、90c並びに単核球層内の凝血塊との区別を行う。これにより位置情報検知手段は、単核球層20に存在する除去対象となる凝血塊（図２においては単核球層20の上部に存在する凝血塊90a、90d）を検出することができる。
　また、作業効率の観点から、単核球層20の上部に存在する凝血塊の全てを検出して除去するのではなく、単核球層20の上部に存在する凝血塊のうち所定大きさの凝血塊のみを検出して除去することも可能である。例えば検出手段400は凝血塊を回転楕円体に近似する形状ととらえた場合、赤道半径又は極半径の何れかが5mm以上の場合に除去対象となる凝血塊として検出することが可能である。また、例えば検出手段400は、単核球層20の上に存在する凝血塊のうち、上部撮影手段410により撮影された凝血塊の平面視での面積を計算し、所定面積以上のものを除去対象となる凝血塊と検出することが可能である。
　除去手段220は位置情報検知手段により検出された、単核球層20に存在し、除去対象となる凝血塊（図２においては単核球層20の上部に存在する凝血塊90a、90d）を除去する。除去手段220は、図示しない凝血塊吸引機構に接続され凝血塊を吸引可能なノズルと、このノズルの開口端を単核球層20に存在する凝血塊に移動させる図示しない移動機構と、を備える。
　検出された凝血塊を除去し易くするために、凝血塊を除去する前に血漿層10を除去する血漿層除去手段を設けることが可能である。血漿層除去手段は公知の液体吸引機構を採用することができ、例えば吸引ノズル、吸引した血漿層を収容するタンク、吸引ポンプ、流路等から構成される。血漿層10は後述する理由により少量の血漿層10を残して吸引を完了するのが好ましく、具体的には容器100内の血漿層10の液量の10％～20％を残して吸引を完了するのが好ましい。なお、血漿層を除去した後に凝血塊を除去する構成に限定されず、血漿層の吸引除去と同時に凝血塊の除去を行うことも可能であり、また血漿層10を除去すること無く凝血塊の除去を行うことも可能である。
　採取手段230は、図示しない単核球採取バックに接続され単核球を採取可能なノズルと、このノズルの開口端を単核球層20に移動させる移動機構と、を備える。採取した単核球はそのまま使用することも可能であるし、また使用する前に例えば生理食塩水を加えて遠心分離機により複数回洗浄を行うことも可能である。少量の血漿層10を残して血漿層の吸引を完了している場合には、単核球層を採取する際に残存血漿層も吸引する可能性があるが、使用前に洗浄を行うことにより残存血漿層の混入を排除できる。
　次に上述の構成を備える本実施形態にかかる単核球分離装置900の使用態様の一具体例について説明する。
　図３左側に示されるように、被験者から採取した血液試料50を容器100に貯留する。次に図３中央に示されるように、遠心分離媒体を注入可能なノズルの開口端が、血液試料が貯留した容器100内に投入される。次に図３右側に示されるように、ノズルの開口端は血液試料が貯留した容器100の底面へ移動させられる。
　図４左側に示されるように、注入手段210により遠心分離媒体30の注入が開始され、そして図４中央に示されるように、遠心分離媒体30が容器100の底面側に貯留される。その後、図４右側に示されるように、遠心分離後は、容器100内にて容器底部から順に、赤血球層40、遠心分離媒体30、単核球層20、血漿層10ができ、更に異物である凝血塊90a、90b、90c、90dも存在することがある。
　図５左側に示されるようにノズルにより血漿層10の吸引が開始される。ここではノズルは血漿層10の上部に位置する。即ち、ノズルは血漿層10と単核球層20の境界部分から離れた位置にて血漿層10の除去を開始する。ノズルの先であるノズル開口端が該境界部分に近いと、血漿層10を吸引除去する時にできる流れに骨髄単核球が巻き込まれて、収率が低下する虞があるからである。
　そして図５中央に示されるように残りわずかとなるまで血漿層10の吸引が継続され、その後図５右側に示されるように少量の血漿層10を残して血漿層の吸引が完了する。血漿層10を全て除去することも可能であるが、血漿層10を除去する際に単核球層20内に存在する単核球も吸引して除去する虞があるため、少量の血漿層10を残して血漿層の吸引を完了するのが好ましい。
　図６左側に示されるように、本実施形態では単核球層20の上部に存在する凝血塊90a、90dの除去が開始される。そして図６中央に示されるように、除去手段220によりまずは凝血塊90dが除去され、その後図６右側に示されるように、凝血塊90aが除去される。
　図７左側に示されるように、単核球を採取可能なノズルの開口端が単核球層20内に導入され、次に図７中央に示されるようにノズルにより単核球層20の吸引が開始され、その後図７右側に示されるように全ての単核球層20の採取が完了する。
　（実施例１）骨髄単核球細胞の虚血障害抑制効果
　凝血塊の混入を抑制した本実施例にかかる単核球分離方法により分離した骨髄単核球細胞による虚血障害抑制効果を検証するために、発明者らが開発した再現性の高い虚血モデルマウス(Taguchi et al. J Exp Stroke Transl Med. 2010;3:28-33)を用いた実験を行った。脳梗塞作成48時間後に、尾静脈より1x105個の分離した骨髄単核球細胞を投与し、細胞投与30日後における虚血障害抑制効果に関する評価法として、マクロ標本による脳萎縮スコア(Taguchi et al. Eur J Neurosci. 2007;26(1):126-133.)を使用した。非治療コントロール群では、細胞投与群と同量(100μl)の生理食塩水を尾静脈より投与した。実験には各群6匹の虚血マウスを使用した。
　骨髄細胞投与の微小血管に与える作用を検証する虚血モデルは下記の手法で作成した。
　8週齢のSCIDマウス(severe combined immunodeficiency mouse: 重度複合免疫不全マウス)をハロセン麻酔により全身麻酔し、左頬骨部よりアプローチして左中大脳動脈に直達できるよう頭蓋底に1.5mm程度の穿孔を行った。嗅索を通過した直後(嗅索交差部の遠位側)の左中大脳動脈を、バイポーラ電気メスを用いて凝固させ、凝固後切断することにより、左中大脳動脈を永久に閉塞し、左中大脳動脈領域の皮質に限局する虚血部位及び虚血強度の再現性に優れた虚血モデルを作成した。
　次にヒト骨髄液を購入し、骨髄細胞の入ったチューブ(容器)の底面よりFicoll-Paque PREMIUM(Ficollは、登録商標)液を注入した後、400Gで40分間遠心を行った。単核球層の上部に混在する長径5mm以上の凝血塊を除去した後、単核球層成分を吸引し、新しいチューブに移した。細胞は投与前に、アルブミン入り生理食塩水(最終アルブミン濃度2％)を用いて、遠心分離機を用いて洗浄を2度行った。
　マクロ標本による虚血障害スコアの詳細は下記の通りである。本研究で使用した脳虚血モデルは左中大脳動脈が潅流する大脳皮質に限局したものであるが、虚血後は炎症細胞の浸潤等により、対側(脳虚血を作成しない側)に比し、虚血側では明らかな組織の委縮が生じる。我々はその委縮の程度の定量的な評価にAtrophy indexが有用であることを示してきた(Taguchi et al. Eur J Neurosci. 2007;26(1):126-133.)。Atrophy indexの測定方法を図８に示す。なお、Atrophy indexはX/Y×100(％)にて示される。
　虚血障害軽減に関する治療効果を図９に示す。Atrophy indexは脳萎縮を示す指標である。Controlとは生理食塩水を投与された群である。実施例とは骨髄単核球細胞を投与された群である。1ｘ105個の骨髄単核球細胞の投与により、生理食塩水投与群と比し、統計学的にも有意に虚血障害軽減効果があることが示された。＊印は、Control群と骨髄単核球細胞群との間に統計学的有意差が存在することを示す。
　以上の結果より、本実施例にかかる方法により分離した骨髄単核球細胞の優れた虚血障害抑制効果が明らかになった。
　（実施例２）骨髄単核球細胞の虚血障害からの機能回復促進効果
　凝血塊の混入を抑制した本実施例にかかる単核球分離方法により分離した骨髄単核球細胞による虚血障害からの機能回復促進効果を検証するために、発明者らが開発した再現性の高い虚血モデルマウスを用いた(Taguchi et al. J Exp Stroke Transl Med. 2010;3:28-33)。脳梗塞作成48時間後に、尾静脈より1x105個の分離した骨髄単核球細胞を投与し、細胞投与30日後における虚血障害からの機能回復促進効果に関する評価法として、オープンフィールドテストによる明暗条件に対する反応性(Taguchi et al. J Clin Invest. 2004;114:330-338)を使用した。実験には各群6匹の虚血マウスを使用した。骨髄細胞投与の機能回復促進効果を検証する虚血モデルは、実施例１と同様の手法を用いた。投与細胞の処理は、実施例１と同様の手法を用いた。
　機能回復促進効果に関する評価法として、オープンフィールドテストを実施した。その測定原理及び測定法は下記の通りである。マウスは夜行性であるため、正常のマウスにおいては、明条件では行動量が低下し、環境を暗くすることにより行動量が増加することが知られている。明条件下における行動抑制においては大脳皮質機能が重要であり、また細胞治療により大脳皮質機能が回復し、明条件下における行動抑制機能が回復することが示されてきた(Taguchi et al. J Clin Invest. 2004;114:330-338)。本研究では、マウスをオープンフィールド測定装置((株)行医研製、自由移動空間40cmｘ40cm)にて明条件下で30分間立ち上がり反応(rearing)の回数を自動カウントし、その後暗条件下で30分間立ち上がり反応の回数をカウントした。明条件から暗条件に変化した時の運動量の増加を、機能回復の指標として用いた。
　骨髄単核球細胞投与による虚血障害からの機能回復促進効果の結果を図１０に示す。Controlとは生理食塩水を投与された群である。実施例とは骨髄単核球細胞を投与された群である。図１０では、生理食塩水が投与された場合、及び、骨髄単核球細胞が投与された場合のそれぞれにつきrearing(立ち上がり)の回数が示されており、白色は明条件での立ち上がり回数、黒色は暗条件での立ち上がり回数を示す。生理食塩水が投与された群では暗条件への変化によって有意な運動量の増加を認めなかったが、骨髄単核球細胞の投与により、統計学的に有意な暗反応に対する行動量の増加が観察されるようになった。＊印は骨髄単核球細胞群において、明条件から暗条件への変化で、立ち上がり回数の統計学的に有意な増加が認められたことを示す。即ち骨髄単核球細胞の投与で脳神経機能回復促進効果があることが示された。
　以上の結果より、本実施例にかかる方法により分離した骨髄単核球細胞投与の優れた大脳皮質機能回復促進効果が明らかとなった。
　本発明は、骨髄単核球の分離に利用できる。
　本出願は、日本で出願された特願2017－012742（出願日：2017年1月27日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。
　10　　　血漿層
　20　　　単核球層
　30　　　遠心分離媒体
　40　　　赤血球層
　50　　　血液試料
　90　　　凝血塊
　100　　　容器
　210　　　注入手段
　220　　　除去手段
　230　　　採取手段
　300　　　遠心分離手段
　400　　　検出手段
　410　　　上部撮影手段
　420　　　側部撮影手段
　900　　　単核球分離装置

Claims (9)

  1. 　血液試料が貯留した容器(100)の底面から遠心分離媒体を注入する注入手段(210)と、
    　遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器(100)を遠心分離させる遠心分離手段(300)と、
    　遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出手段(400)と、
    　検出された凝血塊を除去する除去手段(220)と、
    　単核球を採取する採取手段(230)と、
    を有する単核球分離装置。
  2. 　前記検出手段(400)は、容器(100)内の単核球層を鉛直上方方向から撮影する上部撮影手段(410)と、容器(100)内の単核球層を水平方向から撮影する側部撮影手段(420)と、を有することを特徴とする請求項１に記載の単核球分離装置。
  3. 　前記検出手段(400)は、前記凝血塊を回転楕円体で近似した形状における赤道半径又は極半径の何れかが５mm以上の場合に除去対象となる凝血塊と検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の単核球分離装置。
  4. 　前記除去手段(220)で凝血塊を除去する前に、遠心分離後に単核球層の上部にある血漿層を除去する血漿層除去手段を有することを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の単核球分離装置。
  5. 　前記血漿層除去手段は、前記血漿層の上部から該血漿層を吸引除去することを特徴とする請求項４に記載の単核球分離装置。
  6. 　前記血漿層除去手段は、前記血漿層の液量の10～20％を残して該血漿層を吸引除去することを特徴とする請求項４又は５に記載の単核球分離装置。
  7. 　前記注入手段(210)は、0.05～1.0 mL/秒にて遠心分離媒体を注入することを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の単核球分離装置。
  8. 　血液試料が貯留された容器の底面に遠心分離媒体を注入する注入工程と、
    　遠心分離媒体と血液試料とが底面側からこの順にて積層されている容器を遠心分離させる遠心分離工程と、
    　遠心分離後に単核球層に存在する凝血塊を検出する検出工程と、
    　検出された凝血塊を除去する除去工程と、
    　単核球を採取する採取工程と、
    を有する単核球分離方法。
  9. 　前記除去工程では、単核球層の上部に存在する凝血塊を除去することを特徴とする請求項８に記載の単核球分離方法。
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