WO2013175797A1

WO2013175797A1 - 細胞分離バック、細胞分離方法及び細胞分離システム

Info

Publication number: WO2013175797A1
Application number: PCT/JP2013/003287
Authority: WO
Inventors: 研一山原; 明彦田口
Original assignee: 独立行政法人国立循環器病研究センター; 公益財団法人先端医療振興財団
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2013-11-28

Abstract

　密度勾配遠心法により極めて簡易な手法で目的細胞の層を正確に分離できる細胞分離バックを提供する。遠心分離処理前には試料溶液が注入されると共に遠心分離処理後には目的細胞が位置する第１バック部１１０と、遠心分離処理前には密度勾配遠心分離媒体が注入されると共に遠心分離処理後には不要成分が位置する第２バック部１２０と、接続部１３０と、を備える。第１バック部１１０は、液体を注出又注入させるポート部３１０を備える。接続部１３０は、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を非連通状態にする第１の仮止め部２１０を備える。

Description

細胞分離バック、細胞分離方法及び細胞分離システム

　本発明は、血液、骨髄等から無菌的に簡単且つ純度良く単核球等の目的細胞を密度勾配遠心法により分離することができる細胞分離バック、その細胞分離バックを使用する細胞分離方法、及び細胞分離システムに関する。

　近年、幹細胞移植による心血管再生治療が新しい治療法として期待されている。特に骨髄から密度勾配遠心法により得られた単核球を移植する骨髄幹細胞移植治療は、急性心筋梗塞患者での有効性が二重盲検試験で明らかにされている。

　密度勾配遠心法により単核球を分離する一般的な技術としては、特許文献１や特許文献２に記載されているように、試験管の底に密度勾配遠心分離媒体フィコール・パック（Ficoll-Paque、登録商標、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）社製）を設置する密度勾配遠心法をあげることができる。

　この方法は、(a)所定量のフィコール・パックを試験管底に設置する工程、(b)血液試料をフィコール・パック上にピペットで移す工程、(c)フィコール・パックの比重よりも大
きい比重を有する赤血球等の血液成分がフィコール・パックを通過するように遠心分離する工程、(d)フィコール・パックの上方に分離された単核球層をピペットで採取する工程、(e)採取された単核球層に食塩水等の希釈液を加え、遠心操作により単核球を沈殿させ回収することで不要成分を除去する工程、からなる。

　しかし、上述の技術では、工程(b)において、血液試料をフィコール・パック上に移すとき、フィコール・パックとの界面を乱さないように血液試料を静かに重層しなければならないという問題点を有する。また、遠心分離後の工程(d)において、フィコール・パックの上方に分離された単核球層をピペットで採取する際には、不要な成分をピペットにて採取しないように注意深く採取する必要があり、操作が煩雑であるという問題点を有する。また、工程(e)における、遠心操作による単核球沈殿後の回収は技術的に簡易ではなく、更に、単核球層を採取・回収、する操作は開放系且つ手作業であるため、CProC（Cell Processing Center＝セルプロセッシングセンター）のような環境温度・室圧等の作業環境が厳密にコントロールされた閉鎖系設備が必要となり、高度且つ特殊な技術を要するという問題点を有する。

　一方、特許文献３には、両端部に位置する第１バッグ部及び第２バック部と、中間部に位置する幅の長さが短い第３バック部とからなるバック本体を備える血液成分分離用血液バックが記載されており、遠心分離による血液成分分離の後、各バック部の境界部に沿ってバック本体をシールし、そのシール箇所より各バック部を切り離す血液成分分離方法が記載されている。この特許文献３には、各バック部の境界部をバック本体の外側からシールし、各バック部内をお互いに連通しないように独立させることで、各血液成分同士が混入することがなくなり、純粋な血液成分を得ることが可能となると記載されており、遠心分離後の工程において不要な成分を採取することなく、目的細胞を採取することができるとも考えられ得る。

特表２０１０－５０４０８３号公報特表２００７－５０９６０１号公報特許４４３１９２９号

　しかし、例えば、特許文献３のように、ヒト全血成分は密度勾配遠心分離媒体を用いずに遠心分離すると、上部に血漿成分の層、中間部に白血球（単核球及び顆粒球）・血小板の層、下部に赤血球の層が形成されるが、遠心分離後において、白血球の層は赤血球層に隣接しており、拡散して白血球が赤血球と容易にコンタミし、各層の境界が曖昧となる。かかる場合に特許文献３の技術では、各層の境界が曖昧にもかかわらず各層成分の境界と考えられる部分をシールしていることになるので、各血液成分同士の混入を避けることは極めて困難であるという問題点を有する。そもそも特許文献３の技術では、第１バック部には赤血球層、第２バック部には血漿層、第３バック部には白血球・血小板層を分離することを意図しており、顆粒球及び単核球の混在状態で目的成分が取得されるのだから、単核球のみの正確な分離が困難である。

　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、密度勾配遠心法により極めて簡易な手法で目的細胞の層を正確に分離できる細胞分離バック及び細胞分離方法を提供することを目的とする。

　本発明にかかる細胞分離バックは、目的細胞を含む複数成分からなる試料溶液を、密度勾配遠心分離媒体を用いて遠心分離処理することで、前記複数成分を比重の違いにより分離させて目的細胞を採取する、軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成される２つの袋の開口部どうしが連通状態に接続されて形成される筒状の細胞分離バックであって、前記細胞分離バックは、遠心分離処理前には前記試料溶液が注入されると共に遠心分離処理後には目的細胞が層を形成して位置する袋状の第１バック部と、遠心分離処理前には前記密度勾配遠心分離媒体が注入されると共に遠心分離処理後には不要成分である高比重成分が位置する袋状の第２バック部と、前記第１バック部及び前記第２バック部の開口部どうしが連通状態に接続され、幅の長さが前記第１バック部及び第２バック部の幅の長さよりも短い接続部と、を備え、前記第１バック部は、液体を注出又注入させるポート部を長手方向の端部に備え、前記接続部は、前記第１バック部と前記第２バック部との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖する第１の仮止め部を備え、第１バック部は、遠心分離処理後に位置する目的細胞の層より高比重成分側に位置し、前記目的細胞の層と該目的細胞の層よりも高比重成分の層とを区画して第１バック部の内部空間を液密にシールするシール部を備えることを特徴とする。

　また、本発明にかかる細胞分離システムは、請求項１に記載の細胞分離バックと、軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成される筒状袋を備え、前記筒状袋の長手方向の一方の端部は、前記筒状袋の幅方向の両端部から前記一方の端部へ向かって傾斜するテーパ状端部であり、前記テーパ状端部には、前記テーパ状端部の内部空間を前記筒状袋の幅方向に一時的に閉鎖するテーパ内部仮止め部が形成されている、細胞洗浄バックと、前記細胞分離バックの第１バック部の前記ポート部側の端部と、前記細胞洗浄バックの筒状袋の長手方向の他方の端部と、を連通させる連通部と、を備えることを特徴とする。

　また、本発明にかかる細胞分離方法は、袋状の第１バック部と、袋状の第２バック部と、前記第１バック部及び前記第２バック部の開口部どうしが連通状態に接続され、幅の長さが前記第１バック部及び第２バック部の幅の長さよりも短い接続部とを備え、前記第１バック部は液体を注出又注入させるポート部を長手方向の端部に備えており、軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成された筒状の細胞分離バックを使用する遠心分離による細胞分離方法であって、前記第２バック部に密度勾配遠心分離媒体を注入し、前記接続部における第１バック部と第２バック部との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖して第１の仮止めを行い、前記第１バック部に目的細胞を含む複数成分からなる試料溶液を注入する第１工程と、前記第１工程の後、前記第１の仮止めを解除して、前記第１バック部と前記第２バック部とを連通状態にし、前記第２バック部を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行う第２工程と、前記第２工程の後、前記第１バック部に形成される目的細胞の層よりも高比重成分側を、前記目的細胞の層と該目的細胞の層よりも高比重成分の層とを区画して第１バック部の内部空間を液密にシールすると共に、前記目的細胞の層より低比重成分側を、前記目的細胞の層と該目的細胞の層よりも低比重成分の層とを区画して第１バック部の内部空間を一時的に閉鎖して第２の仮止めを行う第３工程と、前記第３工程の後、前記第２の仮止めにより区画された箇所よりも低比重成分の層を排出させてから希釈液を注入する第４工程と、前記第４工程の後、前記第２の仮止めを解除して、前記第１バック部のポート部を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行う第５工程と、前記第５工程の後、前記第１バック部のポート部から、目的細胞を採取する第６工程と、を備えることを特徴とする。

　本発明によれば、CProCのような高度且つ特殊な閉鎖系設備を要することなく、遠心分離前における試料溶液及び密度勾配遠心分離媒体を細胞分離バックに導入する際の操作、並びに遠心分離後における目的細胞を採取する操作を極めて簡易に行うことができる。また、面倒な動作を行うこと無しに他の成分から正確に分離して高純度の目的細胞を採取することができる。更には、本発明にかかる細胞分離バックを使用して、無菌的で安全な閉鎖系のシステムを構成することも可能であるため、特殊な機械・設備や特別な知識・技能・訓練を必要とせず、一般病院でも使用できる。

本実施形態にかかる細胞分離バックの概観を説明する図である。密度勾配遠心分離媒体を第２バック部に注入する状態を説明する図である。試料溶液を第１バック部に注入する状態を説明する図である。遠心分離後において試料溶液中の複数成分が比重の違いにより分離している状態を説明する図である。単核球層よりも低比重成分側である血小板・血漿層を排出させた後に希釈液を注入する状態を説明する図である。第１バック部のポート部から単核球を採取する状態を説明する図である。細胞分離システムの概観を説明する図である。細胞分離システムに、骨髄液バックと生理食塩水バックとを別途付加して用いた場合の全体構成図である。

　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。

　（第１の実施形態）
　図１は、本実施形態にかかる細胞分離バックの概観を説明する図である。図１に示されるように、細胞分離バック９００は、目的細胞を含む複数成分からなる試料溶液を、密度勾配遠心分離媒体を用いて遠心分離処理するために使用され、袋状の第１バック部１１０と、袋状の第２バック部１２０と、第１バック部１１０及び第２バック部１２０の開口部どうしが連通状態に接続された接続部１３０とを有して構成されており、全体として略筒状形状を有している。細胞分離バック９００は、軟質プラスチック製の可撓性を有する透明又は半透明の材質にて形成され、特に限定されるものではないが、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、軟質ポリ塩化ビニル、スチレンエチレンブチレンスチレンブロック共重合体等である。細胞分離バック９００の貯蔵弾性率Ｅ’は例えば８．０×１０⁹ｄｙｎｅ／ｃｍ²以下であり、厚みは例えば８０～２００μｍである。

　第１バック部１１０は、遠心分離処理前には試料溶液が注入されると共に遠心分離処理後には目的細胞が層を形成して位置する。試料溶液は、目的細胞を含む試料であれば特に限定されるものではない。目的細胞も特に限定されるものではなく、例えば単核球、間葉系幹細胞、血管内皮細胞である。目的細胞が単核球の場合、試料溶液は例えば骨髄液、血液、又は臍帯血を含むものが好ましい。試料溶液には、目的細胞を遠心分離しやすくするために、医療用生理食塩水等の低比重等張液を含有させることが可能である。

　一方、第２のバック部１２０は、遠心分離処理前には密度勾配遠心分離媒体が注入されると共に遠心分離処理後には不要成分である高比重成分が位置する。密度勾配遠心分離媒体は、特に限定されるものではなく、例えば、Ficoll（登録商標）、Percoll（登録商標）、Lymphoprep（登録商標）等の密度勾配形成用として市販されている媒体が使用でき、またFicoll-Paque（登録商標）やNycoprep（登録商標）等ヨード造影剤を含有する遠心分離媒体も使用できる。ヨード造影剤は、ヨードを含有する造影剤であり、画像診断の際に画像にコントラストを付けたり特定の組織を強調して撮影するために患者に投与される医薬品である。目的細胞が単核球の場合、ヨード造影剤は赤血球・顆粒球と単核球とを分画するために好適である。ヨード造影剤は、水溶性ヨード造影剤であることが好ましく、特に安全性から非イオン性水溶性ヨード造影剤であることが好ましい。非イオン性水溶性ヨード造影剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、イオヘキソール、イオパミドール、イオメプロール、イオキシラン、イオベルソール、又はイオプロミド等を用いることが可能である。

　密度勾配遠心分離媒体には、医療用生理食塩水や医療用蒸留水等を含有することが可能である。遠心分離媒体の比重は、特に限定されるものではなく、例えば目的細胞が単核球の場合は、赤血球・顆粒球と単核球とを分画できる比重であれば特に限定されるものではないが、室温（２０℃～２５℃）において例えば１．０６６～１．０８３ｇ／ｍｌであり、好ましくは１．０７３～１．０８０ｇ／ｍｌ、特に好ましくは１．０７７ｇ／ｍｌである。密度勾配遠心分離媒体のｐＨは、分離される目的細胞に悪影響を与えないものであれば特に限定されるものではないが、目的細胞が単核球の場合は例えば７．０～７．８であり、好ましくは７．２～７．６であり、特に好ましくは７．４である。遠心分離媒体の浸透圧は、分離される目的細胞に対して親和性を有するものであれば特に限定されるものではないが、目的細胞が単核球の場合は例えば０．９～１．１（医療用生理食塩水に対する比）であり、好ましくは１．０である。

　第１バック部１１０及び第２バック部１２０の内容積は、遠心分離後の赤血球・顆粒球分画等の高比重成分が第２バック部１２０に位置し、単核球等の目的細胞の層が第１バック部１１０に位置するものであれば特に限定されるものではなく、例えば第１バック部１１０の内容積：第２バック部１２０の内容積を１：１～２：１とすることが可能である。

　また、本実施形態では第１バック部１１０と第２バック部１２０との幅の長さは同じに形成されているが、接続部１３０の内容積における幅の長さは第１バック部１１０及び第２バック部の内容積における幅の長さよりも短く形成されている。

　図１に示されるように、第１バック部１１０には、液体を注出又注入させるポート部３１０が略筒状形状の細胞分離バック９００の長手方向の端部に備えられている。ポート部３１０は、第１バック部１１０において、接続部１３０の位置する側と反対側の端部中央に形成されている。ポート部３１０は例えばニードルレスポートであり、シリンジの挿入により開口して連結されるコネクタであり、通常は閉じている開口部が注射針を用いなくてもシリンジを挿入することで内部と連通が可能となる。本実施形態において、ポート部３１０は目的細胞を採取するために使用される。

　第２バック部１２０には、密度勾配遠心分離媒体を注入するための例えばニードルレスポートである媒体注入ポート部３２０が備えられている。また、第１バック部１１０には、ポート部３１０以外に、略筒状形状の細胞分離バック９００の幅方向の端部に例えばニードルレスポートであるポート部３３０が設けられている。本実施形態において、ポート部３３０は、試料溶液を注入する、遠心分離後において目的細胞の層よりも低比重成分側に形成される低比重成分の層を排出させる、更にその後生理食塩水等の希釈液を注入するために使用される。

　図１に示されるように、第１バック部１１０において、接続部１３０側（図面下側）の端部の形状は、幅方向の両端部から接続部１３０へ向かって傾斜するテーパ状である。また、第１バック部１１０において、接続部１３０側と反対側（図面上側）の端部の形状も、同様に、幅方向の両端部からポート部３１０へ向かって傾斜するテーパ状である。

　接続部１３０には、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖する第１の仮止め部２１０が備えられる。第１の仮止め部２１０は、特に限定されるものではなく、例えば、内側に対向する状態で設けられた互いに嵌合可能な凸部材及び凹部材からなるチャック部にて構成することができる。これによれば外側から凸部材及び凹部材を押し合わせて嵌合させることにより、簡易に第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を非連通状態に閉鎖することができる。また再度第１バック部１１０と第２バック部１２０とを連通状態に回復させる場合は、例えば外側から摘んで凸部材及び凹部材を各々反対方向に引っ張ることにより嵌合を解除させる。また、第１の仮止め部２１０は特定の構造を有するものではなく仮止めされる箇所を示す部分であり、その仮止めの手法として例えばクリップ等の外側からの挟持手段により第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖することも可能である。その場合、クリップ等の挟持手段を使用しやすいように、第１の仮止め部２１０として、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通箇所にクリップを挟み込むための目印となるラインを設けておくことが可能である。

　また、第１バック部１１０には、遠心分離後において目的細胞の層より低比重成分側に位置し、目的細胞の層と該目的細胞の層よりも低比重成分の層とを区画して第１バック部１１０の内部空間を一時的に閉鎖する第２の仮止め部２２０が設けられる。第２の仮止め部２２０の構造は、特に限定されるものではなく、例えば第１の仮止め部２１０と同様にチャック部にて構成することができる。また、第２の仮止め部２２０は特定の構造を有するものではなく仮止めされる箇所を示す部分であり、例えばクリップ等により第１バック部１１０の内部空間を一時的に閉鎖することも可能である。その場合、クリップを使用しやすいように、第２の仮止め部２２０としてクリップを挟み込むための目印となるラインを設けておくことが可能である。

　更に、第１バック部１１０には、遠心分離処理後において目的細胞の層より高比重成分側に位置し、目的細胞の層と該目的細胞の層よりも高比重成分の層とを区画して第１バック部１１０の内部空間を液密にシールするシール部２３０が設けられる。シール部２３０は、特に限定されるものではなく、第１及び第２の仮止め部と同様にチャック部にて構成することができる。もっともシール部２３０は第１及び第２の仮止め部と異なり、閉鎖した後に再度開くことを予定していないため、第１及び第２の仮止め部よりも凸部材及び凹部材の嵌合強度が高いものを使用することが好ましい。シール部２３０は特定の構造を有するものではなくシールされる箇所を示す部分であり、例えばヒートシールや超音波溶着によるシール等により第１バック部１１０の内部空間を液密にシールすることも可能である。その場合、シール操作を行いやすいように、シール部２３０としてシールのための目印となるラインを設けておくことが可能である。

　次に、上述の構成の遠心分離バック９００を用いる目的細胞の分離を説明する。ここでは目的細胞として単核球を採取する場合について説明する。

　第１バック部１１０の内容積は例えば２０ｍｌとし、第２バック部１１０の内容積は例えば１０ｍｌとする。密度勾配遠心分離媒体は、例えば、医療用であるヨード造影剤に医療用生理食塩水と医療用蒸留水とを混和することにより作成される。図２は、密度勾配遠心分離媒体４１０を第２バック部１２０に注入する状態を説明する図である。図２では第２の仮止め部２２０は仮止めされておらず、シール部２３０もシールされていないので、図面の簡略化のために第２の仮止め部２２０及びシール部２３０は記載されていない。図２に示されるように、第２バック部１２０に備えられている媒体注入ポート部３２０から例えばシリンジにより、例えば１０ｍｌの密度勾配遠心分離媒体４１０が第２バック部１２０に注入される。この場合、細胞分離バック９００が軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成されているから、第２バック部１２０内部における溶液の移動が簡易であり、また媒体注入ポート部３２０からの溶液の出し入れに伴って空気を排出又は吸入するための空気孔を設ける必要がない。その後、接続部１３０に備えられている第１の仮止め部２１０に例えばクリップを挟み込むことにより、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖して第１の仮止めを行う。細胞分離バック９００が軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成されているから、第１の仮止め部２１０に例えばクリップを挟んだとしても容易に第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を閉鎖でき、更にクリップを取り除いた場合も軟質プラスチックの弾力性により容易に第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態が回復する。

　図３は、試料溶液４９０を第１バック部１１０に注入する状態を説明する図である。図３では、図面の簡略化のために第２の仮止め部２２０及びシール部２３０は記載されていない。試料溶液４９０は、例えば、ヒト骨髄液原液１０ｍｌと医療用生理食塩水１０ｍｌとを混和することにより２０ｍｌ調整する。図３に示されるように、第１バック部１１０に備えられているポート部３３０から例えばシリンジにより、例えば２０ｍｌの試料溶液４９０が第１バック部１１０に注入される。かかる場合、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通が閉じた状態にて試料溶液を入れるので、試料溶液と密度勾配遠心分離媒体との界面の乱れを考慮することなく簡易な操作にて試料溶液の導入ができる。また、接続部１３０は、幅の長さが第１バック部１１０及び第２バック部１２０の幅の長さよりも短いので、接続部１３０の容積を小さくすることができ、接続部１３０における第１の仮止めを解除した際にも第１バック部１１０と第２バック部１２０それぞれの溶液の移動が発生しにくくなる。更に、細胞分離バック９００が軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成されているから、第１バック部１１０内部における溶液の移動が簡易であり、またポート部３３０からの溶液の出し入れに伴って空気を排出又は吸入するための空気孔を設ける必要がない。

　なお、本実施形態では、第２バック部１２０に密度勾配遠心分離媒体４１０を注入し、接続部１３０における第１の仮止めを行い、第１バック部１１０に試料溶液４９０を注入しているが、このような実施形態に限定されるものではなく、例えば、接続部１３０における第１の仮止めを行い、ポート部３３０から第１バック部１１０に試料溶液４９０を注入し、その後媒体注入ポート部３２０から第２バック部１２０に密度勾配遠心分離媒体４１０を注入することも可能である。

　その後は、第１の仮止め部２１０に挟み込まれたクリップを取り去ることにより第１の仮止めを解除して、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を回復させて、第２バック部１２０を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行う。遠心分離の条件は、特に限定されるものではなく、例えば２０℃、４００ｇ、２０分間遠心を行うことができる。第１バック部１１０において接続部１３０側の端部の形状が幅方向の両端部から接続部１３０へ向かって傾斜するテーパ状であるから、遠心分離の際に第１バック部１１０において接続部１３０側に高比重成分を収集させやすくなる。

　図４は、遠心分離後において試料溶液中の複数成分が比重の違いにより分離している状態を説明する図である。図４では第１の仮止め部２１０は仮止めされていないので、図面の簡略化のために第１の仮止め部２１０は記載されていない。図４に示されるように、遠心分離後は、例えば、第２バック部１２０には高比重成分である赤血球・顆粒球層４２０が約５ｍｌ、第１バック部１１０には目的細胞の層である単核球層４３０が約３ｍｌ、更に、低比重成分である血小板・血漿層４４０が約１２ｍｌ、そして赤血球・顆粒球層４２０と単核球層４３０との中間には密度勾配遠心分離媒体４１０が約１０ｍｌ、となる４層構造となる。なお、図４では、各層の境界は明確に記載されているが、これは理解の容易のために便宜的に記載しているにすぎない。

　その後、第１バック部１１０に形成される単核球層４３０よりも高比重成分側にあるシール部２３０にて例えばヒートシールにより、単核球層４３０と密度勾配遠心分離媒体４１０の層とを区画して第１バック部１１０の内部空間を液密にシールする。更に、第１バック部１１０に形成される単核球層４３０よりも低比重成分側にある第２の仮止め部２２０に例えばクリップを挟み込むことにより、単核球層４３０と血小板・血漿層４４０とを区画して第１バック部の内部空間を一時的に閉鎖して第２の仮止めを行う。細胞分離バック９００が軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成されているから、第２の仮止め２２０に例えばクリップを挟んだとしても容易に第１バック部１１０の内部空間を一時的に閉鎖でき、更にクリップを取り除いた場合も軟質プラスチックの弾力性により容易に第１バック部１１０の内部空間の閉鎖が回復する。なお、シール部２３０におけるヒートシール及び第２の仮止め部２２０における仮止めは、各層の境界が曖昧である場合があり、かかる場合は大凡の位置にてシール又は仮止めを行う。

　そして、図４に示されるように、第１バック部１１０に備えられているポート部３３０から例えばシリンジにより、血小板・血漿層４４０の血小板・血漿分画を排出させる。かかる場合、第２の仮止め部２２０において仮止めがなされることにより単核球層４３０と血小板・血漿層４４０とを区画してあるから、余分に単核球分画を排出させてしまう可能性を抑制して血小板・血漿分画を排出させることができる。

　図５は、単核球層４３０よりも低比重成分側である血小板・血漿層４４０を排出させた後に希釈液を注入する状態を説明する図である。図５では第１の仮止め部２１０は仮止めされていないので、図面の簡略化のために第１の仮止め部２１０は記載されていない。図５に示されるように、ポート部３３０から希釈液である例えば１２ｍｌの生理食塩水４５０がシリンジにより、第１バック部１１０に注入される。かかる場合、細胞分離バック９００が軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成されているから、ポート部３３０からの生理食塩水４５０の注入に伴って空気を排出するための空気孔を設ける必要がない。また、第２の仮止め部２２０において仮止めがなされている状態にて生理食塩水４５０を入れるので、急速に生理食塩水を注入させたとしても、単核球分画がシリンジ側へ流出させる虞を考慮することなく簡易な操作にて生理食塩水の注入ができる。

　その後は、第２の仮止め部２２０における仮止めを解除し、第１バック部１１０のポート部３１０を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行う。この遠心分離の条件は、特に限定されるものではなく、例えば２０℃、４００ｇ、１５分間遠心を行うことができる。第１バック部１１０において接続部１３０側と反対側の端部の形状が幅方向の両端部からポート部３１０へ向かって傾斜するテーパ状であるから、遠心分離の際にポート部３１０側に単核球分画を収集させやすくなる。

　図６は、第１バック部１１０のポート部３１０から単核球を採取する状態を説明する図である。図６に示されるように、第１バック部１１０のポート部３１０側には精製された単核球層４３０が形成される。そして、第１バック部１１０に備えられているポート部３１０から例えばシリンジにより、精製された単核球分画を採取する。単核球層４３０と血小板・血漿層４４０との境界や単核球層４３０と密度勾配遠心分離媒体４１０の層との境界は曖昧となる場合があるが、かかる場合であっても、単核球層４３０の高比重成分側にシール部２３０を設け、低比重成分側に第２の仮止め部２２０を設けて単核球層４３０を密度勾配遠心分離媒体４１０の層及び血小板・血漿層４４０と区画するのみならず、更に血小板・血漿層４４０を取り除いて希釈液を混ぜた後に再度遠心分離にて単核球層４３０を精製させるから、単核球分画を正確に細胞分離できる。また、ポート部３１０は最終的に精製された単核球分画を採取する場合にのみ使用するので、ポート部３１０の予期せぬ故障が生じる可能性を抑えることができ、最終的に採取する単核球分画に不純物が混入する虞が少ない。以上、上述したように、本実施形態によれば、密度勾配遠心法により極めて簡易な手法で目的細胞の層を正確に分離できる。

　なお、図６に示されるように第１バック部１１０のポート部３１０から単核球分画を採取する際に、ポート部３１０側に位置する単核球層４３０と、その低比重成分側に形成される生理食塩水４５０の層との間に例えばクリップを挟み込むことにより、単核球層４３０と生理食塩水４５０の層とを区画してから、ポート部３１０から単核球分画を採取することも可能である。かかる場合は、ポート部３１０から採取する単核球分画に生理食塩水が混入する虞を低減させることができる。

　また、第２の仮止め部２２０が設けられていない場合は、遠心分離後において、シール部２３０の上に、目的細胞の層である単核球層４３０と、低比重成分である血小板・血漿層４４０とが積層することになり、単核球を密度勾配遠心分離媒体及び高比重成分である赤血球・顆粒球から分離して精製することになる。その後は、別途遠心分離を行うことにより、単核球と血小板・血漿とを分離することが可能であるし、また、単核球と血小板・血漿とを混在した状態にて使用することも可能である。

　（第２の実施形態）
　図７は、本実施形態にかかる細胞分離システム９７０の概観を説明する図である。図７に示されるように、細胞分離システム９７０は、細胞分離バック９００と、細胞洗浄バック９３０と、連通部９５０と、を備える。

　細胞分離バック９００は、袋状の第１バック部１１０と、袋状の第２バック部１２０と、第１バック部１１０及び第２バック部１２０の開口部どうしが連通状態に接続された接続部１３０とを有して構成されており、全体として略筒状形状を有している。

　図７に示されるように、第１バック部１１０には、液体を注入させるポート部３４０が細胞分離バック９００の長手方向の端部に備えられている。また、第１バック部１１０には、ポート部３４０とは別に開口部３５０が設けられている。第１バック部１１０において、接続部１３０側（図面下側）の端部の形状は、幅方向の両端部から接続部１３０へ向かって傾斜するテーパ状である。

　接続部１３０には、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖する第１の仮止め部２１０が備えられる。第１の仮止め部２１０は、特に限定されるものではなく、例えば、内側に対向する状態で設けられた互いに嵌合可能な凸部材及び凹部材からなるチャック部にて構成することができる。また、第１の仮止め部２１０は特定の構造を有するものではなく仮止めされる箇所を示す部分であり、その仮止めの手法として例えばクリップ等の外側からの挟持手段により第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖することも可能である。

　更に、第１バック部１１０には、遠心分離処理後において目的細胞の層より高比重成分側に位置し、目的細胞の層と該目的細胞の層よりも高比重成分の層とを区画して第１バック部１１０の内部空間を液密にシールするシール部２３０が設けられる。シール部２３０は、特に限定されるものではなく、第１及び第２の仮止め部と同様にチャック部にて構成することができる。シール部２３０は特定の構造を有するものではなくシールされる箇所を示す部分であり、例えばヒートシールや超音波溶着によるシール等により第１バック部１１０の内部空間を液密にシールすることも可能である。

　細胞洗浄バック９３０は、軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成される筒状袋５００を備える。筒状袋５００の長手方向の一方の端部は、筒状袋５００の幅方向の両端部から一方の端部へ向かって傾斜するテーパ状端部５１０として形成されている。テーパ状端部５１０には、その内部空間を筒状袋５００の幅方向に一時的に閉鎖するテーパ内部仮止め部５２０が形成されている。テーパ内部仮止め部５２０は、特に限定されるものではなく、例えば、内側に対向する状態で設けられた互いに嵌合可能な凸部材及び凹部材からなるチャック部にて構成することができる。また、テーパ内部仮止め部５２０は特定の構造を有するものではなく仮止めされる箇所を示す部分であり、その仮止めの手法として例えばクリップ等の外側からの挟持手段を用いることが可能である。筒状袋５００の長手方向の他方の端部には、液体を注入又は抽出させるポート部３７０が設けられている。また、筒状袋５００の長手方向の他方の端部には、ポート部３７０とは別に開口部３６０が設けられている。

　連通部９５０は、第１バック部１１０の開口部３５０と、筒状袋５００の開口部３６０とを液密に連通させている。

　次に、上述の構成の遠心分離システム９７０を用いる目的細胞の分離を説明する。ここでは目的細胞として単核球を採取する場合について説明する。

　細胞分離システム９７０は、細胞分離バック９００と、細胞洗浄バック９３０と、連通部９５０と、を備えるものであるが、目的細胞の分離を簡易に実行するために、細胞分離バック９００及び細胞洗浄バック９３０以外に、希釈された骨髄液が入っている骨髄液バック９１０と、生理食塩水が入っている生理食塩水バック９２０と、を使用する。

　図８は、本実施形態にかかる細胞分離システム９７０に、骨髄液バック９１０と生理食塩水バック９２０とを別途付加して用いた場合の全体構成図である。骨髄液バック９１０には開口部８１０が設けられており、開口部８１０と細胞分離バック９００のポート部３４０とは連通部８２０により液密に連通されている。また、生理食塩水バック９２０には開口部８３０が設けられており、開口部８３０と細胞洗浄バック９３０のポート部３７０とは連通部９６０により液密に連通されている。

　まず、連通部８２０と細胞分離バック９００のポート部３４０との接続を解除し、そして第１の仮止め部２１０及びシール部２３０を開通状態にしておき、ポート部３４０から、例えばシリンジにより密度勾配遠心分離媒体を第２バック部１２０に注入する。

　次に、接続部１３０に備えられている第１の仮止め部２１０に例えばクリップを挟み込むことにより、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖する。

　次に、連通部８２０とポート部３４０とを接続させ、骨髄液バック９１０に封入されている希釈骨髄液を、連通部８２０を介して第１バック部１１０に注入する。

　その後は、第１の仮止め部２１０に挟み込まれたクリップを取り去ることにより仮止めを解除して、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を回復させて、第２バック部１２０を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行う。

　遠心分離後は、第２バック部１２０には高比重成分である赤血球・顆粒球層が位置し、第１バック部１１０には目的細胞の層である単核球層と低比重成分である血小板・血漿層とが位置する。赤血球・顆粒球層と単核球層との中間には密度勾配遠心分離媒体が位置する。

　その後、シール部２３０にて例えばヒートシールにより、単核球層と密度勾配遠心分離媒体の層とを区画して第１バック部１１０の内部空間を液密にシールする。

　次に、テーパ内部仮止め部５２０を開通状態にしておき、単核球層と血小板・血漿層とを、連通部９５０を介して細胞洗浄バック９３０に注入する。

　次に、生理食塩水バック９２０に封入されている生理食塩水を、連通部９６０を介して細胞洗浄バック９３０に注入する。

　その後は、細胞洗浄バック９３０のテーパ状端部５１０を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行う。遠心分離後は、テーパ状端部５１０の先細り先端部分に単核球層が位置し、この単核球層に隣接して生理食塩水層が位置する。

　次に、テーパ状端部５１０に備えられているテーパ内部仮止め部５２０に例えばクリップを挟み込むことにより、単核球層と生理食塩水層とを区画してその内部空間を一時的に閉鎖する。

　その後、連通部９６０とポート部３７０との接続を解除させて、洗浄に使用した生理食塩水をポート部３７０から排出させる。これにより、目的成分である単核球が簡易且つ効率的に分離精製される。

　その後は、例えば、テーパ内部仮止め部５２０を開通状態にして、ポート部３７０から生理食塩水を注入して細胞懸濁液を作成して、分離精製した単核球成分をポート部３７０経由して患者に脈管注射等することが可能である。

　（その他の実施形態）
　上述の実施形態では、第１バック部１１０はポート部３３０を備え、第２バック部１２０は媒体注入ポート部３２０を備えていたが、本発明の範囲はこのような実施形態に限定されるものではなく、細胞分離バック９００は、第１バック部１１０にポート部３１０のみを設ける構成とすることも可能である。かかる構成の場合において、目的細胞として例えば単核球の場合における分離方法を下記に示す。まず、図２とは異なり、ポート部３１０からシリンジにより、密度勾配遠心分離媒体４１０が第２バック部１２０に注入される。その後、接続部１３０に備えられている第１の仮止め部２１０に例えばクリップを挟み込むことにより、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖して第１の仮止めを行う。次に、図３とは異なり、ポート部３１０から例えばシリンジにより、試料溶液４９０が第１バック部１１０に注入される。

　その後は、第１の仮止め部２１０に挟み込まれたクリップを取り去ることにより第１の仮止めを解除して、第１バック部１１０と第２バック部１２０との連通状態を回復させて、第２バック部１２０を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行う。遠心分離後は、第２バック部１２０には高比重成分である赤血球・顆粒球層４２０、第１バック部１１０には目的細胞の層である単核球層４３０、更に、低比重成分である血小板・血漿層４４０、そして赤血球・顆粒球層４２０と単核球層４３０との中間には密度勾配遠心分離媒体４１０の層が位置するように４層構造となる。その後、シール部２３０にて例えばヒートシールにより、単核球層４３０と密度勾配遠心分離媒体４１０の層とを区画してシールする。更に第２の仮止め部２２０にクリップを挟み込むことにより、単核球層４３０と血小板・血漿層４４０とを区画して第２の仮止めを行う。

　そして、図４とは異なり、ポート部３１０から例えばシリンジにより、血小板・血漿層４４０の血小板・血漿分画を排出させ、図５とは異なり、ポート部３１０から希釈液である例えば生理食塩水をシリンジにより第１バック部１１０に注入する。その後は、第２の仮止め部２２０における仮止めを解除し、第１バック部１１０のポート部３１０を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行い、ポート部３１０から最終的に精製された単核球分画を採取する。この実施形態によれば、細胞分離バック９００にポート部を１つ形成するのみであるので、細胞分離バックを簡易に構成することができる。

　図１に示されているように、内容積３０ｍｌの第１バック部１１０と内容積１５ｍｌの第２バック部１２０と接続部１３０とを備える軟質ポリプロピレンで形成された細胞分離バック９００を使用した。細胞分離バック９００は、図１に示されているように、ポート部３１０及びポート部３３０を第１バック部１１０に備え、媒体注入ポート部３２０を第２バック部１２０に有するものであった。細胞分離バック９００の貯蔵弾性率Ｅ’は７．０×１０⁹ｄｙｎｅ／ｃｍ²であり、バックの厚みは１００μｍであった。

　媒体注入ポート部３２０から細胞分離バック９００の第２バック部１２０に密度勾配遠心分離媒体としてフィコール・パック（GEHealthcare社製：Ficoll-Paque PLUＳ）１５ｍｌを注入した。接続部１３０における第１の仮止め部２１０にクリップ（99945：QOSINA社製）を挟み、密度勾配遠心分離媒体の上に、ポート部３３０からヒト末梢静脈血１０ｍｌと生理食塩水２０ｍｌ（テルモ生食100ml：テルモ社製）とを混和することにより調整した試料溶液３０ｍｌを第１バック部１１０に重層した。

　次いで、クリップを外して２０℃、４００ｇ、２０分にて遠心分離を行うことにより、高比重成分側から赤血球・顆粒球分画が約８ｍｌ、密度勾配遠心分離媒体が約１５ｍｌ、単核球分画が約４ｍｌ、血小板・血漿分画が約１８ｍｌの各分画に分離することができた。赤血球・顆粒球分画は第２バック部１２０に位置し、密度勾配遠心分離媒体は第１バック部１１０と第２バック部１２０とにまたがって位置し、単核球分画は第１バック部１１０に位置し、血小板・血漿分画も第１バック部１１０に位置していた。後述するように、この状態における単核球分画に含まれる密度勾配遠心分離媒体の含有量を測定するために、単核球分画を微量採取した。

　そして、密度勾配遠心分離媒体の層と単核球層との間にあるシール部２３０をプラスチック・フィルム・シーラー（FR-200LB Lucheng Songshan 社製）によりシールし、更に、血小板・血漿層と単核球層との間にある第２の仮止め部２２０にクリップ（99945：QOSINA社製）を挟み、第１バック部１１０に備えられているポート部３３０からシリンジにより血小板・血漿分画を排出させた。そしてポート部３３０から生理食塩水１８ｍｌをシリンジにより第１バック部１１０に注入した。その後、第２の仮止め部２２０における仮止めを解除し、第１バック部１１０のポート部３１０を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて再度２０℃、４００ｇ、５分間遠心分離を行った。ポート部３１０側には単核球層４３０が形成されており、シリンジによりポート部３１０から精製された単核球分画を採取した。

　最終的に採取された精製された単核球分画と、途中採取された単核球分画とにつき、密度勾配遠心分離媒体が生理食塩水よりも比重が重いことを利用し、密度勾配遠心分離媒体の含有量を屈折計（MASTER-Pα：アタゴ社製）により評価した。結果を下記表１に示す。

　密度勾配遠心分離媒体の屈折率はBrix １５．０％、生理食塩水は同１．０％であった。表１に示されるように、途中採取された単核球分画の屈折率は同６．８％であったのに対し、最終的に採取された精製された単核球分画の屈折率は同１．２％と、生理食塩水とほぼ同等であった。これにより、目的とする単核球分画における密度勾配遠心分離媒体の残留はごく僅かであったことが実証された。

　本発明によれば単核球を簡易且つ精度良く遠心分離することができ、この単核球移植により脳血管障害、心血管障害、末梢血管障害等の効果的な治療が可能となる。

　１１０：第１バック部
　１２０：第２バック部
　１３０：接続部
　２１０：第１の仮止め部
　２２０：第２の仮止め部
　２３０：シール部
　３１０，３３０，３４０，３７０：ポート部
　３２０：媒体注入ポート部
　４１０：密度勾配遠心分離媒体
　４２０：赤血球・顆粒球層
　４３０：単核球層
　４４０：血小板・血漿層
　４５０：生理食塩水
　４９０：試料溶液
　５００：筒状袋
　５１０：テーパ状端部
　５２０：テーパ内部仮止め部
　９００：細胞分離バック
　９１０：骨髄液バック
　９２０：生理食塩水バック
　９３０：細胞洗浄バック
　９５０：連通部
　９７０：細胞分離システム

Claims

　目的細胞を含む複数成分からなる試料溶液を、密度勾配遠心分離媒体を用いて遠心分離処理することで、前記複数成分を比重の違いにより分離させて目的細胞を採取する、軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成される２つの袋の開口部どうしが連通状態に接続されて形成される筒状の細胞分離バックであって、
　前記細胞分離バックは、遠心分離処理前には前記試料溶液が注入されると共に遠心分離処理後には目的細胞が層を形成して位置する袋状の第１バック部と、遠心分離処理前には前記密度勾配遠心分離媒体が注入されると共に遠心分離処理後には不要成分である高比重成分が位置する袋状の第２バック部と、前記第１バック部及び前記第２バック部の開口部どうしが連通状態に接続され、幅の長さが前記第１バック部及び第２バック部の幅の長さよりも短い接続部と、を備え、
　前記第１バック部は、液体を注出又注入させるポート部を長手方向の端部に備え、
　前記接続部は、前記第１バック部と前記第２バック部との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖する第１の仮止め部を備え、
　第１バック部は、遠心分離処理後に位置する目的細胞の層より高比重成分側に位置し、前記目的細胞の層と該目的細胞の層よりも高比重成分の層とを区画して第１バック部の内部空間を液密にシールするシール部を備えることを特徴とする細胞分離バック。
　前記第１バック部は、前記目的細胞の層より低比重成分側に位置し、前記目的細胞の層と該目的細胞の層よりも低比重成分の層とを区画して第１バック部の内部空間を一時的に閉鎖する第２の仮止め部を備えることを特徴とする請求項１記載の細胞分離バック。
　前記第１バック部において、前記接続部側の端部の形状は、幅方向の両端部から前記接続部へ向かって傾斜するテーパ状であることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離バック。
　前記第２バック部は、前記密度勾配遠心分離媒体を注入するための媒体注入ポート部を備えていることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離バック。
　前記第１バック部は、液体を注出又注入させるポート部を更に幅方向の端部にも備えていることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離バック。
　前記第１バック部において、前記ポート部は前記接続部側と反対側の端部中央に形成されており、前記第１バック部の接続部側と反対側の端部の形状は、幅方向の両端部から前記ポート部へ向かって傾斜するテーパ状であることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離バック。
　前記第１の仮止め部は、内側に対向する状態で設けられた互いに嵌合可能な凸部材及び凹部材からなるチャック部であることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離バック。
　前記第１の仮止め部は、仮止めを行う目印となる仮止め目印ライン部であることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離バック。
　前記第２の仮止め部は、内側に対向する状態で設けられた互いに嵌合可能な凸部材及び凹部材からなるチャック部であることを特徴とする請求項２に記載の細胞分離バック。
　前記第２の仮止め部は、仮止めを行う目印となる仮止め目印ライン部であることを特徴とする請求項２に記載の細胞分離バック。
　前記シール部は、シールを行う目印となるシール目印ライン部であることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離バック。
　請求項１に記載の細胞分離バックと、
　軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成される筒状袋を備え、前記筒状袋の長手方向の一方の端部は、前記筒状袋の幅方向の両端部から前記一方の端部へ向かって傾斜するテーパ状端部であり、前記テーパ状端部には、前記テーパ状端部の内部空間を前記筒状袋の幅方向に一時的に閉鎖するテーパ内部仮止め部が形成されている、細胞洗浄バックと、
　前記細胞分離バックの第１バック部の前記ポート部側の端部と、前記細胞洗浄バックの筒状袋の長手方向の他方の端部と、を連通させる連通部と、を備えることを特徴とする細胞分離システム。
　袋状の第１バック部と、袋状の第２バック部と、前記第１バック部及び前記第２バック部の開口部どうしが連通状態に接続され、幅の長さが前記第１バック部及び第２バック部の幅の長さよりも短い接続部とを備え、前記第１バック部は液体を注出又注入させるポート部を長手方向の端部に備えており、軟質プラスチック製の可撓性を有する材質にて形成された筒状の細胞分離バックを使用する遠心分離による細胞分離方法であって、
　前記第２バック部に密度勾配遠心分離媒体を注入し、前記接続部における第１バック部と第２バック部との連通状態を一時的に非連通状態に閉鎖して第１の仮止めを行い、前記第１バック部に目的細胞を含む複数成分からなる試料溶液を注入する第１工程と、
　前記第１工程の後、前記第１の仮止めを解除して、前記第１バック部と前記第２バック部とを連通状態にし、前記第２バック部を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行う第２工程と、
　前記第２工程の後、前記第１バック部に形成される目的細胞の層よりも高比重成分側を、前記目的細胞の層と該目的細胞の層よりも高比重成分の層とを区画して第１バック部の内部空間を液密にシールすると共に、前記目的細胞の層より低比重成分側を、前記目的細胞の層と該目的細胞の層よりも低比重成分の層とを区画して第１バック部の内部空間を一時的に閉鎖して第２の仮止めを行う第３工程と、
　前記第３工程の後、前記第２の仮止めにより区画された箇所よりも低比重成分の層を排出させてから希釈液を注入する第４工程と、
　前記第４工程の後、前記第２の仮止めを解除して、前記第１バック部のポート部を遠心分離の半径方向外方に向けて位置させて遠心分離を行う第５工程と、
　前記第５工程の後、前記第１バック部のポート部から、目的細胞を採取する第６工程と、を備えることを特徴とする遠心分離による細胞分離方法。