JPH08104643A

JPH08104643A - 赤血球除去方法

Info

Publication number: JPH08104643A
Application number: JP6264379A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiko Nakamura; 嘉彦中村
Original assignee: Asahi Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1994-10-05
Publication date: 1996-04-23

Abstract

(57)【要約】【目的】遠心分離器を用いずに、簡便に低コスト、短
時間で分離可能な赤血球の除去方法を提供する。【構成】赤血球と造血幹細胞および／または造血前駆
細胞を含む細胞集団を、実質的に赤血球は透過し、白血
球は捕捉するフィルターに通液した後、該通液方向とは
逆方向の液流を惹起させ、捕捉された白血球を回収する
赤血球除去方法。また、前記方法において、フィルター
が実質的に血小板も透過するものを用いる方法。【効果】遠心分離器や特殊な試薬を用いることなく、
簡便かつ低コストで、さらに、短時間で効率よく赤血球
を除去することができ、また、同時に、さらなる細胞分
離の際に障害となる血小板の除去も可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨髄あるいは末梢血な
ど、赤血球と造血幹細胞および／または造血前駆細胞を
含む細胞集団から、赤血球を除去する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】白血病などの造血器腫瘍および固形癌の
化学療法における主たる副作用である造血障害に対し
て、骨髄移殖療法が広く施行されている。骨髄移植療法
とは、移植骨髄による致死的造血障害の回復法であるた
め、患者にとって致死的な大量放射線および／または大
量化学療法の施行が可能となり、白血病や固形癌の治療
につながる。さらに、近年、骨髄と同様に末梢血中に
も、これらの治療に必要な造血幹細胞および／または造
血前駆細胞が含まれていることが明らかになった（これ
を用いる療法を末梢血幹細胞移植療法と言う）。

【０００３】通常、これらの移植療法においては、健常
人ドナーから採取された骨髄または末梢血単核球が用い
られるが（同種移植と言う）、ドナーとレシピエント
（移植を受ける患者）の白血球の血液型であるＨＬＡの
一致が重要であり、赤血球の血液型であるＡＢＯ血液型
がドナーとレシピエントとの間で異なっていても、ドナ
ー骨髄または末梢血から赤血球を除去することで、問題
なく移植を行うことができる。また、健常人ドナーの骨
髄ではなく患者自身の骨髄を用いる自家移植も、固形癌
に対しては盛んに応用されている。本移植法において
は、採取した後、大量化学療法後まで骨髄を凍結保存す
ることになる。ここで、赤血球が混入していると、融解
後、溶血を起こし副作用の原因となるため、やはり赤血
球を除去しておくことが必要である。

【０００４】一方、末梢血を用いる移植の場合は、ドナ
ー（患者自身を含む）から移植用の細胞を採取する際
に、遠心血球採取装置（例えば、コーブ社製「Ｓｐｅｃ
ｔｒａ」、バクスター社製「ＣＳ３０００ｐｌｕｓ」）
を用いるので、赤血球は採取と同時にかなり除去される
ことから、あらたに除去する必要はないとも考えられて
いるが、骨髄の場合は、ドナー腸骨に注射器で穿刺して
採取するだけであるから、赤血球の除去は必須である。

【０００５】移植骨髄からの赤血球除去は、移植におい
て真に必要な造血幹細胞および／または造血前駆細胞が
含まれている白血球画分、さらに詳しくは単核球画分
と、赤血球の比重が異なることから、遠心分離器を用い
て行われる。とくに効率的に赤血球と単核球を分離した
い場合には、密度勾配遠心法と呼ばれる、比重液（例え
ば、ファルマシア社製Ｆｉｃｏｌｌ）を用いた遠心分離
法が用いられる。該方法は非常に煩雑であり、比重液に
細胞浮遊液を重層する際に決して液面を乱してはならな
いなど、非常に熟練を要する。また、比重液を用いるこ
とから、コスト高でもある。

【０００６】上記方法の煩雑さを克服するために、多く
の試みがなされているが（例えば、特開昭６１−８４５
５７、特開平２−１３４５６４など）、これらも比重液
と遠心分離器を用いるという点では何ら従来法と変わら
ず、簡便、低コスト、短時間の赤血球除去法が待望され
ていた。また、従来の方法では血小板を除去することは
できない。通常の移植では、血小板の除去は必ずしも必
要ではない。しかし、移植骨髄（または末梢血）から、
モノクローナル抗体固定器具を用いて、さらなる細胞分
離（目的：同種移植においては合併症の原因となる細胞
の除去など、自家移植においては癌細胞の除去など）を
行うことが盛んに検討され始めており、このような細胞
分離においては、赤血球、血小板は凝集、付着により、
細胞分離効率を低下させることが明らかになってきてお
り、赤血球とともに、簡便な血小板の除去法の開発も必
要となってきている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】以上述べたように、骨
髄移植において赤血球分離は、遠心分離器を用いて行わ
れているが、その操作の煩雑さ、コスト、処理時間の長
さが問題となっている。本発明の目的は、遠心分離器を
用いずに、簡便に低コスト、短時間で分離可能な赤血球
の除去方法を提供することにある。さらに、血小板も同
時に除去できる方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を重ねた結果、骨髄等、赤血球と
造血幹細胞および／または造血前駆細胞を含む細胞集団
を、実質的に赤血球は透過し、白血球は捕捉するフィル
ターに通液したところ、出口側から実質的に白血球を含
まない赤血球の流出を確認し、該出口から洗浄液を通液
したところ、フィルター内に捕捉されていた白血球が入
口側から流出してくることを発見した。また、出口側か
ら流出してきた赤血球画分には白血球はほとんど存在せ
ず、入口側から回収した白血球画分には赤血球はほとん
ど存在せず、インプットした白血球のほとんどが回収で
きていることを発見した（血小板は混入していた）。

【０００９】本発明者は、さらに検討を重ね、実質的に
赤血球と血小板は透過し、白血球は捕捉するフィルター
を用いた場合、出口側から流出してきた赤血球画分には
血小板も含まれており、入口側から回収した白血球画分
には赤血球だけでなく、血小板も実質的に除去されてい
ることを確認し、本発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、赤血球と造血幹細胞
および／または造血前駆細胞集団を、実質的に赤血球は
透過し、白血球は捕捉するフィルターに通液した後、前
記通液方向とは逆方向の液流を惹起させ、捕捉された白
血球を回収することを特徴とする赤血球除去方法であ
る。また、前記方法において、フィルターが実質的に血
小板も通過するものを用いる赤血球除去方法である。

【００１１】本発明に用いるフィルターは、ナイロンウ
ール、ポリエステル不織布、セルロース不織布、ハイド
ロキシアパタイトビーズ、スポンジ状高分子化合物な
ど、通常、白血球除去に用いられているものであれば特
に制限はないが、血小板の除去も同時に行いたい場合に
は、血小板透過性を持つフィルターでなければならな
い。血小板透過性を持つフィルターは、例えば、特公平
６−５１０６０号公報に記載のように、表面に非イオン
性親水基と塩基性含窒素官能基を含有しているポリマー
をコーティングすることによって得られる。また、これ
らのフィルターは、臨床用として用いるには滅菌済みで
なければならない。

【００１２】捕捉されている白血球を、最初の通液方向
とは逆方向の液流を惹起させる方法としては、ディスポ
ーザブルシリンジなどで、洗浄液を出口側から注入する
か、出口側に洗浄液の送液管を接続し、入口側からディ
スポーザブルシリンジなどで吸引することで達成され
る。ここで、洗浄液はＨＢＳＳ（ハンクス液）などの緩
衝液または生理食塩水に、ヒト血清アルブミンなどのタ
ンパクを添加したものが好ましい。

【００１３】本発明に用いる赤血球と造血幹細胞および
／または造血前駆細胞を含む細胞集団としては、骨髄、
末梢血、臍帯血あるいはこれらを遠心分離器により粗分
離したものがあげられる。ここで、末梢血を用いる場
合、通常、移植に用いられる細胞は、遠心血球採取装置
を用いて採取するため、赤血球の除去は必要ない旨先述
したが、本フィルターを用いることにより、遠心血球採
取装置そのものを用いることなく、注射器などで採取し
た全血から、造血幹細胞および／または造血前駆細胞を
含む白血球分画が分離できるので、末梢血幹細胞移植に
おいても、本フィルターにより操作時間の短縮、コスト
軽減を達成することができる。

【００１４】ただし、現状では、末梢血中に含まれてい
る造血幹細胞および／または造血前駆細胞の数が少ない
ので、大量の全血を採取しなければならない。本フィル
ターによる白血球分離は、遠心血球採取装置のように赤
血球の返血装置が付随していないので、赤血球は輸血に
より返血しなければならず、多少問題がある。現在、ご
く少量の造血幹細胞を採取して、体外で培養により増や
し、移植に必要な細胞数を得るという、いわゆる幹細胞
増幅法の研究が盛んに行われており、ほぼ実現のメドが
立っていることから、赤血球返血の不要な量の全血を採
取して移植に用いることが可能となるので、本フィルタ
ーを用いる白血球分離の有用性は極めて高くなると考え
られる。

【００１５】本発明により赤血球が除去された細胞集団
は、このまま患者に移植、またはさらなる細胞分離に供
された後、あるいは冷凍保存された後、患者に移植さ
れ、大量化学療法および／または大量放射線療法後の造
血機能回復に寄与する。

【００１６】

【実施例】以下に実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明は、これらにより限定されるものではない。（実施例１）フィルター内面積２．１５×２．１５ｃｍのハウジングに、平均繊
維径３．９μｍのポリエステル不織布を濾過面積が１．
８×１．８ｃｍとなるように充填した後、ＥＯガス滅菌
を行い、実験用フィルターとした。

【００１７】実験用検体健常人から遠心血球採取装置（コーブ社製、商品名「Ｓ
ｐｅｃｔｒａ」）を用いて、末梢静脈からバッフィーコ
ート３ｍｌを採取した。このバッフィーコートの性状は
以下のとおりであった。総細胞数８×１０⁸ 白血球数１×１０⁸ 赤血球数３×１０⁸ 血小板数４×１０⁸ このバッフィーコートをＨＢＳＳで２０ｍｌに希釈した
ものを実験用検体とした。

【００１８】分離操作で調製した実験用検体をディスポーザブルシリンジに
てで作製したフィルターに通液し、通過液をコニカル
チューブに回収した。また、さらに２０ｍｌのＨＢＳＳ
を通液し、これも前のコニカルチューブに回収した。次
に、ＨＢＳＳ２０ｍｌをディスポーザブルシリンジに
て、上記とは逆に、出口側からフィルターに注入し、入
口側から流出してくる液をコニカルチューブに回収し
た。ここで、入口側から回収した液を試料Ａとした。

【００１９】結果試料Ａの赤血球数、白血球数との出発試料から、白血
球回収率と赤血球および血小板除去率を算出したとこ
ろ、以下のとおりとなった。また、分離に要した時間は
２０分であった。白血球回収率９３％赤血球除去率９０％血小板除去率２０％

【００２０】（比較例１）実施例１と同様の検体を用
い、常法のＦｉｃｏｌｌ法によって赤血球を除去したと
ころ、白血球回収率と赤血球および血小板除去率は以下
のとおりとなった。また、分離にかかわる時間は１２０
分で、実施例の６倍を要した。白血球回収率３０％赤血球除去率９０％血小板除去率５％

【００２１】（実施例２）フィルター市販の滅菌済白血球除去フィルター（旭メディカル製
「セパセルＰＬ」）を実験用フィルターとした。実験用検体健常人から全血３ｍｌを採取した。この全血の性状は以
下のとおりであった。総細胞数１．５×１０¹⁰ 白血球数１．２×１０⁷ 赤血球数１．５×１０¹⁰ 血小板数６×１０⁸ この全血をＨＢＳＳで２０ｍｌに希釈したものを実験用
検体とした。

【００２２】分離操作実施例１と同様な操作を行い、試料Ｂとした。結果試料Ｂの赤血球数、白血球数との出発試料から、白血
球回収率と赤血球および血小板除去率を算出したとこ
ろ、以下のとおりとなった。また、分離に要した時間は
２０分であった。白血球回収率８０％赤血球除去率８０％血小板除去率７０％

【００２３】（比較例２）実施例２と同様の検体を用
い、常法のＦｉｃｏｌｌ法によって赤血球を除去したと
ころ、白血球回収率と赤血球および血小板除去率は以下
のとおりとなった。また、分離にかかわる時間は１５０
分で、実施例の７．５倍を要した。白血球回収率３０％赤血球除去率８０％血小板除去率５％

【００２４】

【発明の効果】以上示したように、本発明による赤血球
除去方法は、遠心分離器や特殊な試薬を用いることな
く、簡便かつ低コストで、さらに、短時間で効率よく赤
血球を除去することができる。また、同時に、さらなる
細胞分離の際に障害となる血小板の除去も可能である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】赤血球と造血幹細胞および／または造血
前駆細胞を含む細胞集団を、実質的に赤血球は透過し、
白血球は捕捉するフィルターに通液した後、前記通液方
向とは逆方向の液流を惹起させ、捕捉された白血球を回
収することを特徴とする赤血球の除去方法。
【請求項２】フィルターが実質的に血小板も透過する
ものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。