JPH09121850A - ２段式細胞濃縮システムおよび細胞濃縮方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、骨髄、末梢血。臍帯血あるいはこ
れらを遠心分離器により粗分離した原料細胞液から、濃
縮された造血幹細胞分画を、簡便、低コストで処理時間
が短く採取できる閉鎖系の単核球分離システムを提供す
る。 【解決手段】 少なくとも、採取された原料細胞液を貯
留する手段（１）と、顆粒球、単球を捕捉する第１の捕
捉手段（２）と、造血幹細胞を捕捉し赤血球は通過する
第２の捕捉手段（３）と該第２の捕捉手段より流出した
赤血球含有液を貯留する手段（４）とがこの順に接続手
段を介して直列に接続された閉鎖回路からなり、前記第
１の捕捉手段（２）の出口と前記赤血球含有液を貯留す
る手段（４）の間から分岐した造血幹細胞貯留部（５）
を具備した２段式細胞濃縮システム。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨髄あるいは末梢血な
どの、赤血球、造血幹細胞および／または造血前駆細胞
（以下、造血幹細胞と略す）、単球、顆粒球等を含む細
胞集団から造血幹細胞を選択的に濃縮するシステム、お
よび細胞濃縮方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】白血病などの造血器腫瘍および固形癌の
化学療法における副作用である造血障害に対して、骨髄
移植療法が広く施行されている。骨髄移植療法とは、移
植骨髄による致死的造血障害の回復法であるため、患者
にとって致死的な大量放射線および／または大量化学療
法（以下、大量化学療法と略す）の施行が可能となり、
白血病や固形癌の治癒につながる。また、近年、骨髄と
同様に末梢血中にも、これらの治療に必要な造血幹細胞
が含まれていることが明らかになった。通常、これらの
細胞の末梢血中での含有率はかなり低値であり、採取し
て骨髄移植の代わりに用いることは困難であるが、抗癌
剤および／またはＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因
子）等のサイトカインを投与することにより、その含有
率が増大することが明らかにされ、骨髄採取と比べる
と、全身麻酔が不要で安全なことから、さかんに臨床応
用が行われている。更に近年、臍帯血中には末梢血より
もはるかに高濃度で造血幹細胞が含有されていることが
明らかになり、臨床応用が始まった。以下、本明細書で
は末梢血、臍帯血を用いる移植も、骨髄移植という語で
代表させることにする。

【０００３】ここで、移植法は細胞を誰から得るかによ
って同種移植と自家移植に分けられる。前者は健康な他
人（血縁書または非血縁者）の細胞を用いるもので、後
者は患者本人の細胞を用いるものである。同種移植が主
に移植当日（大量化学療法後）に細胞が採取され、すぐ
に移植されることが多いのに対し、自家移植においては
大量化学療法前に患者自身の細胞を採取して単核球分離
して凍結保存し、その後、大量化学療法を行い、凍結保
存しておいた細胞を解凍後、移植することが通常行われ
る。ここで、凍結保存に際し、単核球分離が行われるの
は、解凍時破壊赤血球の輸注による腎障害等の副作用を
防止するとともに、混入顆粒球による凝集を防止するた
めである。また、今までの知見により造血幹細胞が単核
球分画中に存在することが確認されていることは言うま
でもない。更に近年、モノクロナール抗体固定器具を用
いてさらなる細胞分離（目的：同種移植においては合併
症の原因となる細胞の除去、自家移植においてはＣＤ３
４陽性造血幹細胞の選択採取など）を行うことが盛んに
検討され始めているが、このような細胞分離においては
前処理として単核球分離が必須である。単核球分離の方
法は、通常、密度勾配遠心法と呼ばれる、比重液（例え
ば、ファルマシア社製Ｆｉｃｏｌｌ）を用いた遠心分離
法が用いられる。該方法は非常に煩雑で処理時間が長
く、比重液に細胞浮遊液を重層する際に決して液面を乱
してはならないなど、非常に熟練を要する。また、比重
液を用いることからコスト高である。更に、細胞浮遊液
重層操作はクリーンベンチ内で行われるが、開放系であ
るため細菌のコンタミが危惧されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記方法の煩雑さを克
服するために、多くの試みがなされている（例えば、特
開昭６１−８４５５７号公報、特開平２−１３４５６４
号公報など多数）。しかしながら、これらも比重液と遠
心分離器を用いる点では何ら従来法と変わらず、簡便、
低コスト、処理時間が短く、閉鎖系の単核球分離システ
ムが待望されていた。また、従来の方法では血小板、単
球を除去することはできない。これらの細胞も、顆粒球
と同様、凝集の原因となることから、簡便かつ有効な除
去法が待望されていた。ところで、特開昭５４−１１９
０５号公報には、まず顆粒球、単球を捕捉するフィルタ
ーに原料細胞液を通し、これらを除去し、次に白血球を
捕捉するフィルターに通し、リンパ球を捕捉し、この捕
捉されたリンパを回収することで、リンパ球以外の成分
の少ないリンパ球浮遊液を得る方法が開示されている。
しかしながら同公報では、現在の臨床現場には必須とな
ってきた閉鎖系システムに関しては何等記述がなく、ま
た造血幹細胞に関する記述もない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】かかる課題を解決すべく
鋭意検討した結果、本発明を完成させたものである。即
ち、本発明は少なくとも、採取された原料細胞液を貯留
する手段と、顆粒球、単球を捕捉する第１の捕捉手段
と、造血幹細胞を捕捉し赤血球は通過する第２の捕捉手
段と該第２の捕捉手段より流出した赤血球含有液を貯留
する手段とがこの順に接続手段を介して直列に接続され
た閉鎖回路からなり、前記第１の捕捉手段の出口と前記
赤血球含有液を貯留する手段の間から分岐した造血幹細
胞貯留部を具備した２段式細胞濃縮システムに関する。
更に、第２の捕捉手段より上流にリンス液貯留部を具備
した二段式細胞濃縮システムに関する。また、原料細胞
液を貯留する手段と該造血幹細胞貯留部が共通である２
段式細胞濃縮システムに関する。更に、第１の捕捉手段
が実質的に血小板を通過させるものである２段式細胞濃
縮システムに関する。また、少なくとも、赤血球、造血
幹細胞、顆粒球、単球を含む細胞集団を、顆粒球、単球
は捕捉される第１の捕捉手段に通液させ、次いで造血幹
細胞は捕捉し赤血球は通過する第２の捕捉手段に通液さ
せた後、該第２の捕捉手段に捕捉された造血幹細胞を回
収液を用いて回収することを特徴とする細胞濃縮方法に
関する。更に、第１の捕捉手段が実質的に血小板も捕捉
するものである細胞濃縮方法に関する。

【０００６】本発明に用いる捕捉手段としてはナイロン
ウール、ポリエステル不織布、ハイドロキシアパタイト
ビーズ、酢酸セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、
スポンジ状高分子化合物などがあるが、これに限定され
るものでなく、第１の捕捉手段は顆粒球、単球を捕捉
し、赤血球を通過するものであればよく、第２の捕捉手
段は造血幹細胞を捕捉した後、その造血幹細胞を回収で
きる素材であれば良い。一般的に、特開昭５４−１１９
０１６号公報で開示されている素材等が好適に用いられ
る。ただし、回収細胞液が血小板も実質的に除去されて
いることが好ましい場合は、第１の捕捉手段が血小板も
捕捉するものであるか、あるいは第１の捕捉手段、第２
の捕捉手段とも血小板を通過するものであることが必要
がある。血小板を通過させるには、例えば特公平６−５
１０６０号公報に記載されている非イオン性親水基と塩
基性含窒素官能基を含有しているポリマーをコーティン
グ処理して表面電荷を調整すること等、公知の方法で達
成できる。本発明に用いる原料細胞液としては、骨髄、
末梢血、臍帯血あるいはこれらを遠心分離器により粗分
離したものがあげられる。本発明の各々の貯留手段には
血液バッグが、接続手段にはチューブを用いることがで
きるが、原料細胞液が少量の場合は、貯留手段と供給手
段を併せて、必要に応じ三方活栓を介してシリンジで行
うことができる。この場合、流速を増すことができ、極
めて好都合である。

【０００７】本発明の赤血球含有液を貯留する手段に
は、血液バッグを用いることができるが、排液ビン、排
液チューブ等につなげるためにオープンにしてもよい。
また、原料細胞液中の血漿を採取したい場合は中空糸型
血漿分離器と、これに接続する血漿採取手段（血液バッ
グなど）を付与するか、２連バッグにして遠心分離器に
かけられるようにすればよい。本発明の造血幹細胞貯留
部は第１の捕捉手段の出口と赤血球含有液を貯留する手
段の間から分岐した造血幹細胞貯留部を有する。この分
岐位置は、第２の捕捉手段から造血幹細胞をどのように
回収するかによって異なる。即ち、最初の通液方向と同
じ方向に回収液を通液する場合は第２の捕捉手段の出口
以降、赤血球貯留手段以前、最初の通液方向とは逆方向
に回収液を通液する場合は第１の捕捉手段の出口より下
流で、かつ第２の捕捉手段の入口以前に位置させる必要
がある。回収液としては生理食塩水、ＨＢＳＳ（ハンク
ス液）、Ｄ−ＰＢＳ（ダルベッコリン酸塩緩衝液）など
の緩衝液に、必要に応じてヒト血清アルブミンなどのタ
ンパクあるいは抗凝固剤を添加したものが用いられる。
回収液を供給するためにバッグに代表される溶液貯留部
とチューブに代表される溶液供給手段を設けるが、溶液
量が少量の場合は貯留手段と供給手段を併せて、１本の
シリンジで行うことができる。この場合、流速を増すこ
とができ、極めて好都合である。回収液供給手段を接続
する位置は造血幹細胞をどのように回収するかによって
異なる。即ち、最初の通液方向と同じ方向に回収液を通
液する場合は第１の捕捉手段の出口以降、第２の捕捉手
段入口以前に、最初の通液方向とは逆方向に回収液を通
液する場合は第２の捕捉手段の出口より顆粒で、かつ赤
血球貯留手段以前に接続する必要がある。

【０００８】本発明のリンス手段は少なくとも第２の捕
捉手段を通って赤血球含有液を回収する手段に通液する
が、好ましくは第１の捕捉手段、第２の捕捉手段を通っ
て、赤血球含有液を回収する手段に通液、更に好ましく
は原料細胞バッグ、第１の捕捉手段、第２の捕捉手段を
通って赤血球含有液回収手段に通液する。本発明の造血
幹細胞回収部は、原料細胞液貯留手段と兼ねることもで
きるが、この場合、赤血球のコンタミが危惧されるの
で、赤血球混入率を低くしたい場合は、別に設けた方が
良く、第１の捕捉手段の後ろから分岐させ、血液バッグ
を連結させることで達成できる。しかしながら、使用部
材削減等の理由で、新たなバッグを設けず、原料細胞液
バッグと回収バッグを兼ねたい場合にはリンス手段を原
料細胞液バッグから洗流を始めることが望ましい。これ
により、原料バッグに残存した赤血球を洗流することが
可能となり、造血幹細胞回収の際の赤血球混入を防ぐこ
とができる。また、回収細胞液中の液体成分を除去した
い場合には中空糸型血漿分離器と、これに接続する細胞
回収手段（血液バッグなど）を付与するか、２連バッグ
にして遠心分離器にかけられるようにすれば良い。更
に、凍結保存のために必要な薬剤を混合し、このまま凍
結保存したい場合には、あらかじめ凍害保護剤（ＤＭＳ
Ｏ等）、アルブミンなど凍結保存に必要な薬剤を入れた
バッグを接続しておけば良い。ただし、この際には造血
幹細胞回収バッグは通常の血液バッグではなく、バクス
ター社製「クリオサイトバッグ」など凍結保存に耐えら
れるものでなければならない。本発明の、一方向へ通過
せしめるための手段は三方活栓、デュアルチェックバル
ブ、クランプ等が挙げられるが三方活栓を用いるのが望
ましい。本発明のシステムには流速を増す手段を付与し
てもよい。流速を増す手段としては、ペリスターポンプ
を用いる方法、デュアルチェックバルブに接続したシリ
ンジ（ビーブラウン社製「マルチＡｄ」システムを好適
に用いることができる）で吸引・排出を繰り返し、流速
を惹起する方法がある。これにより作業時間の短縮につ
ながる。本システムの用途は前述した骨髄移植に限ら
ず、移植後再発に対し有効な治療法であるドナーリンパ
球輸注療法（以下ＤＬＴ）や、リンパ球を培養、活性化
して患者に輸注し癌治療や感染症治療を狙う養子免疫療
法、あるいは遺伝子導入の細胞ソースなど幅広い用途が
ある。

【０００９】

【実施態様】発明の実施態様を図面により説明する。図
１は第２の捕捉手段に捕捉されている造血幹細胞を最初
の通液方向とは逆に回収液を通液させて回収するもので
あり、また原料細胞バッグと別に回収バッグを設け、更
に第１の捕捉手段と第２の捕捉手段を洗流するリンス手
段を設けているものである。１は原料細胞が入った容器
（通常、血液バッグ）であり第１のチューブ７と接続し
ている。６は回収液の入っているバッグであり、第２の
捕捉手段３に回収液を供給する。第２のチューブ８は第
１の捕捉手段２と第２の捕捉手段３を接続するためのも
のであり、途中に三方活栓１７がある。第３のチューブ
９は第２の捕捉手段３から流出した赤血球含有液を回収
手段４に導入するためのものである。第４のチューブ１
０は回収液を第２の捕捉手段３に供給するためのもの
で、第３のチューブ９に三方活栓１８で接続している。
第５のチューブ１１は回収細胞を造血幹細胞回収バッグ
５に導入するためのものであり、第２のチューブ８に三
方活栓１７で接続している。第６のチューブ１２はリン
ス液を第１の捕捉手段２に導入するチューブであり、第
１のチューブ７からＹ字管等により分岐している。ただ
し、第１の捕捉手段の出口に直接取り付けてもよい。第
１のチューブ７にはメッシュ入りトラップ２３とクラン
プ１４がある。第４のチューブ１０にはクランプ１６が
ある。第６のチューブ１２にはクランプ１５がある。第
１の捕捉手段２は顆粒球、単球、血小板は捕捉し、赤血
球、造血幹細胞を通過する捕捉手段であり、第２の捕捉
手段３は赤血球は通過し、造血幹細胞は捕捉する捕捉手
段である。あるいは、第１の捕捉手段２は顆粒球、単球
は捕捉し、赤血球、血小板、造血幹細胞は通過する捕捉
手段であり、第２の捕捉手段３は赤血球、血小板は通過
し、造血幹細胞は捕捉する捕捉手段である。それぞれ
１、４、５、６の手段に用いるバッグはスパイクまたは
無菌接続器でチューブと接続可能となっている。

【００１０】次に使用方法を説明する。まず、常法によ
り採取された骨髄、末梢血バフィーコート、臍帯血等を
予め血液バッグ１に入れておく。この時クランプ１４は
「閉」、三方活栓１７は第５のチューブ１１の方向が
「閉」、三方活栓１８は第４のチューブ１０の方向が
「閉」の状態にする。クランプ１４を開くと血液バッグ
１内の細胞液は第１のチューブ７を通じて第１の捕捉手
段２に導入される。そこで顆粒球、単球、血小板は捕捉
され（血小板を通過する捕捉手段を用いた場合、顆粒
球、単球は捕捉され）、造血幹細胞、赤血球は通過し
（血小板を通過する捕捉手段を用いた場合、造血幹細
胞、赤血球、血小板は通過し）、第２のチューブ８を通
じて第２の捕捉手段３に導入される。そこで造血幹細胞
は捕捉され、赤血球は通過し（血小板を通過する捕捉手
段を用いた場合、赤血球、血小板は通過し）、第３のチ
ューブ９から排液バッグ４に回収される。なお、第１の
捕捉手段２に残存する若干の造血幹細胞と捕捉手段３に
残存する若干の赤血球を洗流するためのクランプ１５を
「開」にし、回収液バッグ６から第６のチューブ１２、
第１の捕捉手段２、第２のチューブ８、第２の捕捉手段
３、第３のチューブ９の順にリンス液を排液バッグ４に
流す。次に、クランプ１４を「閉」、クランプ１６を
「開」、クランプ１５を「閉」にし、三方活栓１７を第
１の捕捉手段２側が「閉」、三方活栓１８を排液バッグ
４の方向が「閉」となるようにする。そして回収液バッ
グ６を強く押しつぶすことにより、回収液を第２の捕捉
手段３に導入し、該捕捉手段に捕捉された造血幹細胞を
押し出し、第５のチューブ１１を通じて造血幹細胞回収
バッグ５に流す。

【００１１】図２は第２の捕捉手段に捕捉されている造
血幹細胞を最初の通液方向と同じ方向に回収液を通液さ
せて回収するものである。第４のチューブ１０が図１で
は第３のチューブ９に接続しているのに対し、本図では
第２のチューブ８に接続していること、造血幹細胞回収
バッグが図１では第２のチューブに接続しているのに対
し、本図では第３のチューブに接続していること以外は
図１と同じである。

【００１２】図３は原料細胞液バッグが回収細胞バッグ
を兼ねている場合の例である。６は回収液の入っている
バッグであり、ここから第７のチューブ１３、三方活栓
１９、第１のバイパス２１、三方活栓２０、第３のチュ
ーブ９を通して第２の捕捉手段３に回収液を供給する。
また、リンス液を第７のチューブ１３、原料／回収細胞
バッグ１、第１のチューブ７、第１の捕捉手段２、第２
のチューブ８、第２の捕捉手段３、第３のチューブ９を
通して排液バッグ４に流す。第７のチューブ１３にはク
ランプ１４がある。また、第１のバイパス２１は三方活
栓１９で第７のチューブ１３に、三方活栓２０で第３の
チューブ９に接続している。第１のバイパス２１は直接
回収液バッグ６に接続させることができる。その場合、
三方活栓１９は不要となり第１のバイパス２１内にクラ
ンプが必要となる。また、第１のバイパス２１は第２の
捕捉手段３の出口に直接接続しても良い。その場合、三
方活栓２０は不要となるが、第１のバイパス内にクラン
プが必要となる。１は原料細胞が入った容器（通常、血
液バッグ）であり、原料細胞を第１のチューブ７を通し
て第１の捕捉手段２に供給する。また、第２の捕捉手段
３に回収液を出口側から導入して、捕捉されていた造血
幹細胞を第２のチューブ８、第２のバイパス２２を通し
て回収するバッグである。第１のチューブ７に第２のバ
イパス２２が三方活栓１７により分岐している。第２の
チューブ８には、三方活栓１８があり、第２のバイパス
２２と接続している。第２のバイパス２２は原料／回収
細胞バッグ１に直接接続することもできる。その場合三
方活栓１７は不要となるが、第２のバイパス２２内にク
ランプが必要となる。また、第２のバイパス２２は第２
の捕捉手段３の入口に直接接続することもできる。その
場合、三方活栓１８は不要となるが、第２のバイパス２
２内にクランプが必要となる。それぞれ１、４、６の手
段に用いるバッグはスパイクまたは無菌接続器でチュー
ブと接続可能となっている。

【００１３】次に使用方法を説明する。まず、常法によ
り採取された骨髄、末梢血バフィーコート、臍帯血等を
予め血液バッグ１に入れておく。この時クランプ１４は
「閉」、三方活栓１９、２０は第１のバイパス２１の方
向が「閉」、三方活栓１７は原料／回収細胞バッグの方
向が「閉」、三方活栓１８は第２のバイパス２２の方向
が「閉」、の状態にしておく。三方活栓１７を原料／回
収細胞バッグ１と第１の捕捉手段２にのみ流通するよう
に開くと血液バッグ１内の細胞液は第１のチューブ７を
通じて第１の捕捉手段２に導入される。そこで顆粒球、
単球、血小板は捕捉され（血小板を通過する捕捉手段を
用いた場合、顆粒球、単球は捕捉され）、造血幹細胞、
赤血球は通過し（血小板を通過する捕捉手段を用いた場
合、造血幹細胞、赤血球、血小板は通過し）、第２のチ
ューブ８を通じて第２の捕捉手段３に導入される。そこ
で造血幹細胞は捕捉され、赤血球は通過し（血小板を通
過する捕捉手段を用いた場合、赤血球、血小板は通過
し）、第３のチューブ９から排液バッグ４に回収され
る。なお、原料／回収細胞バッグ１、第２の捕捉手段３
に残存する若干の赤血球を洗流するためにクランプ１４
を「開」にし、回収液バッグ６から第７のチューブ１
３、原料／回収細胞バッグ１、第１のチューブ７、第１
の捕捉手段２、第２のチューブ８、第２の捕捉手段３、
第３のチューブ９の順にリンス液を排液バッグ４に流
す。次に、三方活栓１９を原料／回収細胞バッグの方向
を「閉」、三方活栓２０を排液バッグ方向を「閉」、三
方活栓１７、１８を第１の捕捉手段方向を「閉」にし
て、回収液バッグ６を強く押しつぶすことにより、回収
液を第２の捕捉手段３に導入し、該捕捉手段に捕捉され
た造血幹細胞を押し出し、第２のバイパス２２、第１の
チューブ７を通して原料／回収細胞バッグ１に流す。

【００１４】

【発明の効果】本発明によれば簡便、低コストで処理時
間が短く、閉鎖系で造血幹細胞分画が濃縮された単核球
を得ることができる細胞濃縮システム及び細胞濃縮方法
を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明システムの基本構成を示す模式図。

【図２】本発明システムの１例を示す模式図。

【図３】本発明システムの他の１例を示す模式図。

【符号の説明】

１ 原料細胞液バッグ ２ 第１の捕捉手段 ３ 第２の捕捉手段 ４ 赤血球含有液バッグ ５ 造血幹細胞回収バッグ ６ 回収液バッグ ７ 第１のチューブ ８ 第２のチューブ ９ 第３のチューブ １０ 第４のチューブ １１ 第５のチューブ １２ 第６のチューブ １３ 第６のチューブ １４ クランプ １５ クランプ １６ クランプ １７ 三方活性 １８ 三方活性 １９ 三方活性 ２０ 三方活性 ２１ 第１のバイパス ２２ 第１のバイパス ２３ メッシュ入りトラップ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも、採取された原料細胞液を貯
   留する手段と、顆粒球、単球を捕捉する第１の捕捉手段
   と、造血幹細胞を捕捉し赤血球は通過する第２の捕捉手
   段と該第２の捕捉手段より流出した赤血球含有液を貯留
   する手段とがこの順に接続手段を介して直列に接続され
   た閉鎖回路からなり、前記第１の捕捉手段の出口と前記
   赤血球含有液を貯留する手段の間から分岐した造血幹細
   胞貯留部を具備した２段式細胞濃縮システム。
2. 【請求項２】 前記第２の捕捉手段より上流にリンス液
   貯留部を具備した請求項１記載の二段式細胞濃縮システ
   ム。
3. 【請求項３】 原料細胞液を貯留する手段と該造血幹細
   胞貯留部が共通である請求項１または２記載の二段式細
   胞濃縮システム。
4. 【請求項４】 第１の捕捉手段が実質的に血小板を通過
   させるものである請求項１〜３記載の二段式細胞濃縮シ
   ステム。
5. 【請求項５】 少なくとも、赤血球、造血幹細胞、顆粒
   球、単球を含む細胞集団を、顆粒球、単球は捕捉される
   第１の捕捉手段に通液させ、次いで造血幹細胞は捕捉し
   赤血球は通過する第２の捕捉手段に通液させた後、該第
   ２の捕捉手段に捕捉された造血幹細胞を回収液を用いて
   回収することを特徴とする細胞濃縮方法。
6. 【請求項６】 前記第１の捕捉手段が実質的に血小板も
   捕捉するものである請求項５記載の細胞濃縮方法。