CN104195037A - 一种从脐血中分离造血干细胞的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从脐血中分离造血干细胞的装置和方法。本发明的一种从脐血中分离造血干细胞的装置，包括采血袋、血浆袋、红细胞收集袋、洗脱液袋、干细胞收集袋、白细胞过滤器和加压泵，采血袋和血浆袋之间设有凝块过滤网，采血袋和洗脱液袋之间设有凝块过滤网和白细胞过滤器，血浆袋和红细胞收集袋之间设有加压泵，实现血浆的逆向灌注。本发明的装置简单，使用方法简便，所得造血干细胞回收率为83%以上，造血干细胞活性高，用时短，回收效率高，为脐血造血干细胞制备提供一个新的方法，具有较好的实际应用价值和推广价值。

Description

一种从脐血中分离造血干细胞的装置和方法

技术领域

本发明涉及一种从脐血中分离造血干细胞的装置和方法。

技术背景

造血干细胞(Hematopoieticstemcells，HSCs)是一类存在于造血组织中的多能干细胞，可以定向分化、增殖为不同的血细胞系，并进一步生成血细胞。造血干细胞广泛地应用于治疗血液系统疾病、自身免疫性疾病和某些实体肿瘤等。造血干细胞根据来源又可分为骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐血造血干细胞。与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，且脐血具有采集方便、细胞免疫不成熟、移植过程中不需要严格配型等优点，因而脐血造血干细胞具有极大的临床应用价值。

脐血造血干细胞在体外的分离效果直接关系到采集物中造血干细胞的数量和移植物受者的造血重建。目前，脐血库制备造血干细胞均采用离心压浆分离法，该方法需要大型离心机、压浆分离夹，耗时较长、操作复杂、效率低下。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种从脐血中分离造血干细胞的装置及其使用方法，本发明的装置简单、设计科学、使用方法简便、用时短、效率高、回收率高。

本发明的一种从脐血中分离造血干细胞的装置，包括采血袋、血浆袋、红细胞收集袋、洗脱液袋、干细胞收集袋、白细胞过滤器和加压泵，采血袋通过带有1#阀门的连接管和采血装置连接；采血袋和血浆袋之间通过带有2#阀门的连接管连接在2#阀门和血浆袋之间还设有1#凝块过滤网；采血袋和洗脱液袋之间通过连接管连接，该连接管上依次设有3#阀门、2#凝块过滤网、白细胞过滤器和5#阀门；2#凝块过滤网和白细胞过滤器之间设有带7#阀门的支管，该支管与干细胞收集袋相连；在白细胞过滤器和5#阀门之间设有带6#阀门的支管，该支管与红细胞收集袋相连；在6#阀门和连接管之间设有支管，该支管通过加压泵、4#阀门和血浆袋相连。

所述的，白细胞过滤器的滤膜为尼龙滤膜或为玻璃纤维滤膜，孔径为80μm-120μm。

优选的，白细胞过滤器的滤膜为尼龙滤膜，孔径为100μm。

一种采用本发明的装置分离造血干细胞的方法，包括以下步骤：

a. 打开1#阀门，脐血采集装置采集正常孕妇顺产的新生儿脐血全血，脐血经由连接管进入采血袋中，关闭1#阀门；

b. 采血袋中脐血全血分层后，得上层血浆、中层白细胞和下层红细胞，打开2#阀门，上层血浆经1#凝块过滤网过滤，血浆经由连接管进入血浆袋备用，关闭2#阀门；

c. 打开3#阀门和6#阀门，采血袋中脐血剩余部分经2#凝块过滤网和白细胞过滤器过滤，红细胞及剩余血浆经由连接管进入红细胞收集袋，关闭3#阀门和6#阀门；

d. 打开5#阀门，洗脱液袋中的洗脱液逆向灌注到白细胞过滤器中，关闭5#阀门；

e. 孵育完毕，打开4#阀门和7#阀门，加压泵对血浆袋中的血浆加压，经由连接管快速逆向冲洗白细胞过滤器，经由连接管进入干细胞收集袋，关闭4#阀门和7#阀门，得造血干细胞；

f. 在造血干细胞中加注细胞冷冻保护剂，程序降温冷冻液氮保存。

所述的，洗脱液是在PBS溶液中加入以下质量分数的组分构成的：0.3%-0.4%枸橼酸、2.0%-3.0%枸橼酸钠、3.0%-4.0%葡萄糖、0.02%-0.04%腺嘌呤、0.9%-2.0%NaCl、0.20%-0.30%胰蛋白酶和0.2%-2.0%乙二胺四乙酸，洗脱液的流速为1-3ml/min。

所述的，洗脱液的体积为10-30ml，温度为35-40℃，洗脱液灌注到白细胞过滤器中，需震荡孵育5-15min。

优选的，洗脱液是由PBS溶液加入以下重量比的物质组成：0.3%枸橼酸、3.0%枸橼酸钠、4.0%葡萄糖、0.03%腺嘌呤、1.5%NaCl、0.30%胰蛋白酶和1.0%乙二胺四乙酸，洗脱液的流速为2ml/min。 

优选的，洗脱液的体积为20ml，温度为37℃，洗脱液灌注到白细胞过滤器（7）中，需震荡孵育10min。

本发明具有如下优点：

（1）本发明的装置简单，使用方法简便，所得造血干细胞回收率为83%以上，造血干细胞活性高，用时短，回收效率高；

（2）本发明的装置设计科学，利用抑制白细胞吸附作用和细胞形态变化的原理，将抓附在尼龙滤膜上的白细胞进行洗脱，为脐血造血干细胞分离提供一个新的方法，具有较好的实际应用价值和推广价值。

附图说明

图1为本发明一种从脐血中分离造血干细胞的装置。

图2为本发明实施例1中脐血全血和脐血造血干细胞的细胞凋亡试剂盒检测结果。

图1为本发明专用装置，各部分的名称为：1为采血袋，2为血浆袋，3为红细胞收集袋，4为洗脱液袋，5为干细胞收集袋，61和62分别为1#凝块过滤网和2#凝块过滤网，71、72、73、74、75、76和77分别为1#阀门-7#阀门，8为加压泵，91、92、93、94、95和96为连接管。

图2为本发明实施例1中细胞凋亡试剂盒检测结果。流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI双染色法基本原理：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限（LL）显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限(UR)是非活细胞，即凋亡细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限(LR)为坏死细胞，显现（FITC+/PI-）。

由图2可知，脐血全血（Before）的LL活细胞为84.98%，UL凋亡ing为10.87%，LR坏死为0.70%，UR凋亡为3.45%，所以脐血全血的细胞活性为95.85%。脐血造血干细胞（After）的LL活细胞为86.33%，UL凋亡ing为9.89%，LR坏死为0.43%，UR凋亡为3.35%，，所以脐血造血干细胞的细胞活性为96.22。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

     本发明的装置，是由以下各部件连接而成的：包括采血袋1、血浆袋2、红细胞收集袋3、洗脱液袋4、干细胞收集袋5、白细胞过滤器7和加压泵8，采血袋1通过带有1#阀门71的连接管91和采血装置连接；采血袋1和血浆袋2之间通过带有2#阀门72的连接管92连接，连接管92在2#阀门72和血浆袋2之间还设有1#凝块过滤网61；采血袋1和洗脱液袋4之间通过连接管93连接，连接管93上依次设有3#阀门73、2#凝块过滤网62、白细胞过滤器7和5#阀门75；2#凝块过滤网62和白细胞过滤器7之间设有带7#阀门77的支管94，支管94与干细胞收集袋5相连；在白细胞过滤器7和5#阀门95之间设有带阀门76的支管96，支管96与红细胞收集袋3相连；在6#阀门76和连接管93之间设有支管95，支管95通过加压泵8、4#阀门74和血浆袋2相连。非使用状态，各个阀门均关闭。

本发明的使用方法包括以下步骤：

打开1#阀门71，脐血采集装置采集正常孕妇顺产的新生儿脐血全血，脐血经由连接管91进入采血袋1中，得脐血全血39.6ml，测得浓度为wbc7.0×10⁶/ml，脐血各项检测指标达到实验操作要求，经专家委员会批准和供者知情同意。关闭1#阀门71。

采血袋1中脐血全血分层后，得上层血浆、中层白细胞和下层红细胞，打开2#阀门72，上层血浆经1#凝块过滤网61过滤，血浆经由连接管92进入血浆袋2备用，关闭2#阀门72；

打开3#阀门73和6#阀门76，采血袋1中脐血剩余部分经2#凝块过滤网62和孔径为100μm白细胞过滤器7过滤，红细胞及剩余血浆经由连接管93进入红细胞收集袋3，关闭3#阀门73和6#阀门76。

打开5#阀门75，洗脱液袋4中的20ml洗脱液37℃预热后经由连接管93逆向灌注到白细胞过滤器7中，关闭5#阀门75，震荡孵育10min，洗脱液是由PBS溶液加入以下重量比的物质组成：0.3%枸橼酸、3.0%枸橼酸钠、4.0%葡萄糖、0.03%腺嘌呤、1.5%NaCl、0.3%胰蛋白酶和1.0%乙二胺四乙酸，流速为2ml/min。

孵育完毕，打开4#阀门74和7#阀门77，加压泵8对血浆袋2中的血浆加压，经由连接管95、连接管96和连接管93快速逆向冲洗白细胞过滤器7，经由连接管94进入干细胞收集袋5，关闭4#阀门74和7#阀门77，得造血干细胞。

在造血干细胞中加注细胞冷冻保护剂，程序降温冷冻液氮保存。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (8)

1.一种从脐血中分离造血干细胞的装置 ，其特征在于，包括采血袋（1）、血浆袋（2）、红细胞收集袋（3）、洗脱液袋（4）、干细胞收集袋（5）、白细胞过滤器（7）和加压泵（8），采血袋（1）通过带有1#阀门（71）的连接管（91）和采血装置连接；采血袋（1）和血浆袋（2）之间通过带有2#阀门（72）的连接管（92）连接，连接管（92）在2#阀门（72）和血浆袋（2）之间还设有1#凝块过滤网（61）；采血袋（1）和洗脱液袋（4）之间通过连接管（93）连接，连接管（93）上依次设有3#阀门（73）、2#凝块过滤网（62）、白细胞过滤器（7）和5#阀门（75）；2#凝块过滤网（62）和白细胞过滤器（7）之间设有带7#阀门（77）的支管（94），支管（94）与干细胞收集袋（5）相连；在白细胞过滤器（7）和5#阀门（95）之间设有带6#阀门（76）的支管（96），支管（96）与红细胞收集袋（3）相连；在6#阀门（76）和连接管（93）之间设有支管（95），支管（95）通过加压泵（8）、4#阀门（74）和血浆袋（2）相连。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述白细胞过滤器（7）的滤膜为尼龙滤膜或为玻璃纤维滤膜，孔径为80μm-120μm。

3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述白细胞过滤器（7）的滤膜为尼龙滤膜，孔径为100μm。

4.一种采用权利要求1所述装置分离造血干细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a. 打开1#阀门（71），脐血采集装置采集正常孕妇顺产的新生儿脐血全血，脐血经由连接管（91）进入采血袋（1）中，关闭1#阀门（71）；

b. 采血袋（1）中脐血全血分层后，得上层血浆、中层白细胞和下层红细胞，打开2#阀门（72），上层血浆经1#凝块过滤网（61）过滤，血浆经由连接管（92）进入血浆袋（2）备用，关闭2#阀门（72）；

c. 打开3#阀门（73）和6#阀门（76），采血袋（1）中脐血剩余部分经2#凝块过滤网（62）和白细胞过滤器（7）过滤，红细胞及剩余血浆经由连接管（93）进入红细胞收集袋（3），关闭3#阀门（73）和6#阀门（76）；

d. 打开5#阀门（75），洗脱液袋（4）中的洗脱液逆向灌注到白细胞过滤器（7）中，关闭5#阀门（75）；

e. 孵育完毕，打开4#阀门（74）和7#阀门（77），加压泵（8）对血浆袋（2）中的血浆加压，经由连接管（95）、连接管（96）和连接管（93）快速逆向冲洗白细胞过滤器（7），经由连接管（94）进入干细胞收集袋（5），关闭4#阀门（74）和7#阀门（77），得造血干细胞；

f. 在造血干细胞中加注细胞冷冻保护剂，程序降温冷冻液氮保存。

5.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述洗脱液是在PBS溶液中加入以下质量分数的组分构成的：0.3%-0.4%枸橼酸、2.0%-3.0%枸橼酸钠、3.0%-4.0%葡萄糖、0.02%-0.04%腺嘌呤、0.9%-2.0%NaCl、0.20%-0.30%胰蛋白酶和0.2%-2.0%乙二胺四乙酸，洗脱液的流速为1-3ml/min。

6.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述洗脱液的体积为10-30ml，温度为35-40℃，洗脱液灌注到白细胞过滤器（7）中，需震荡孵育5-15min。

7.根据权利要求5所述的一种从脐血中分离造血干细胞的方法，其特征在于，所述洗脱液是由PBS溶液加入以下重量比的物质组成：0.3%枸橼酸、3.0%枸橼酸钠、4.0%葡萄糖、0.03%腺嘌呤、1.5%NaCl、0.30%胰蛋白酶和1.0%乙二胺四乙酸，洗脱液的流速为2ml/min。

8.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述洗脱液的体积为20ml，温度为37℃，洗脱液灌注到白细胞过滤器（7）中，需震荡孵育10min。