CN115011556A - 一种脐带血造血干细胞的分离方法 - Google Patents

一种脐带血造血干细胞的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞分离方法技术领域，具体地说就是一种脐带血造血干细胞的分离方法。一种脐带血造血干细胞的分离方法，包括如下步骤：S1.脐带血预处理；S2.静置沉降；S3.一次离心；S4.二次离心：将步骤S3中离心后的采血袋中的上层血浆和白膜层转移至转移袋中，将采血袋和转移袋重新放回离心机原位置进行离心；S5.去除血浆：使用压浆夹将转移袋上层血浆压回采血袋中，并控制转移袋内造血干细胞终体积在20‑30ml。本申请采用沉降加离心的分离方法，在保证较高有核细胞回收率的基础上，大幅提高了红细胞的去除率。

Description

一种脐带血造血干细胞的分离方法
技术领域
本发明涉及造血干细胞分离方法技术领域，具体地说就是一种脐带血造血干细胞的分离方法。
背景技术
在临床上，红细胞过多是导致临床脐带血移植副反应的主要因素之一，但在脐带血实际制备过程中，往往为了追求更高的有核细胞回收率，而忽略对红细胞去除率的控制。
目前国内脐血库多采用阶梯离心或多次离心来制备脐带血造血干细胞，此方法制备的脐带血分为三层：上层血浆层、中层白膜层和下层红细胞层，其中中层白膜层中含大量目的细胞。由于白膜层较薄，且部分目的细胞混入下层红细胞，所以为了保证目的细胞回收率，往往在取白膜层的基础上，还会取较大一部分红细胞，从而造成终产品中红细胞压积较大，红细胞去除率低的问题。
发明内容
为解决上述脐带血干细胞分离过程中，红细胞去除率低的问题，本发明提供了一种脐带血造血干细胞的分离方法。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：一种脐带血造血干细胞的分离方法，包括如下步骤：
S1.脐带血预处理：打开脐带血采血袋取样出口旋帽，向装有脐带血的采血袋中加入抗凝剂，摇床混匀5min；
S2.静置沉降：将步骤S1预处理后的采血袋取样出口热合封口，然后将采血袋放置于匀强磁场中静置沉降；
S3.一次离心：利用压浆夹将步骤S2中采血袋中的上层血浆转移至转移袋中，将采血袋和转移袋作为整体进行配平，放入离心机中离心；
S4.二次离心：将步骤S3中离心后的采血袋内的上层血浆层和白膜层转移至转移袋中，转移完成后，将采血袋和转移袋重新放回步骤S3中离心机的离心位置进行离心；
S5.去除血浆：使用压浆夹将经过二次离心后的转移袋上层血浆压回采集袋中，并控制转移袋内产品的终体积在20-30ml。
步骤S1中脐带血采血袋中血样体积具有最低入库标准，产妇脐带血血量一般小于250ml，因此本库的脐带血原始体积在40-250ml之间，为了方便统一冻存，转移袋内终产品的体积需控制在20-30ml。
当采血袋中血样体积较少、转移袋内造血干细胞的终体积不足20ml时，转移袋内需要保留部分血浆，以保证终体积符合冻存标准。
作为优化，步骤S1中所述抗凝剂采用羟乙基淀粉，按照脐带血体积与羟乙基淀粉的体积比3~5：1，其中脐带血体积=脐带血称重/脐带血密度。
作为优化，步骤S2中盛有脐带血的采血袋与所述匀强磁场的磁场方向平行设置，所述匀强磁场的磁通量强度为1Wb。
作为优化，步骤S3中一次离心的离心温度为5~15℃，离心力为300~800g，离心时间为5~10min。
作为优化，步骤S4中二次离心的离心温度为5~15℃，离心力500~1000g，离心时间为5~7min。
按照脐带血体积与羟乙基淀粉的体积比3~5：1的比例添加羟乙基淀粉，均能够得到较高的有核细胞回收率和较高的红细胞去除率。
作为优化，脐带血与抗凝剂的体积比为3:1时，沉降时间为24min。
作为优化，脐带血与抗凝剂的体积比为4:1时，沉降时间为34min。
作为优化，脐带血与抗凝剂的体积比为5:1时，沉降时间为44min。
本方案的有益效果是：一种脐带血造血干细胞的分离方法，具有以下有益之处：
本申请采用沉降加离心的分离方法，能够最大程度的保证有核细胞的回收率，大幅提高了红细胞的去除率；
首先加入羟乙基淀粉后，使脐带血在匀强磁场竖直静置，红细胞在羟乙基淀粉的桥联作用下聚集为体积较大的缗钱状团块，由于缗钱状团块携带的大量负电荷，导致缗钱状团块在匀强磁场作用下会加速沉降，同时也会推动白细胞向上移动，最终使脐带血沉降后分为两层，血浆层（含大量目的细胞）和红细胞层，因为沉降的脐带血中目的细胞大多弥散在血浆层，而血浆层只有极少量红细胞，所以极大地提高了脐带血制备过程中的红细胞去除率；
另外为了进一步地提高有核细胞回收率，进行一次离心，此时采血袋中脐带血分为三层：上层血浆层、中层白膜层（含大量目的细胞）和下层红细胞，取中层白膜层作为补充，就可以实现在保证有核细胞回收率的基础上，大幅提高红细胞去除率。
附图说明
附图1为本发明抗凝剂添加量与脐带血最佳沉降时间线性示意图，横坐标为抗凝剂添加量与脐带血比例，纵坐标为沉降时间，单位为min。
附图2为本发明的采集袋结构示意图，包括采血袋和转移袋。
其中，1、采血袋，2、转移袋。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：
一种脐带血造血干细胞的分离方法，使用如图2所示的采集袋，具体包括如下步骤：
S1.脐带血预处理：打开脐带血采血袋1取样出口旋帽，向装有脐带血的采血袋1中按照脐带血体积与羟乙基淀粉的体积比3：1加入羟乙基淀粉，摇床混匀5min；
S2.静置沉降：将步骤S1预处理后的采血袋1取样出口热合封口，然后将盛有脐带血的采血袋1与所述匀强磁场的磁场方向平行设置，所述匀强磁场的磁通量强度为1Wb，沉降时间为24min；
S3.一次离心：利用压浆夹将步骤S2中采血袋1中上层血浆层转移至转移袋2中，将采血袋1和转移袋2作为整体进行配平，放入离心机中离心，保持温度5℃，离心力为300g，离心时间为10min；
S4.二次离心：将步骤S3中离心后的采血袋1中的上层血浆层和白膜层转移至转移袋2中，将采血袋1和转移袋2重新放回步骤S3中离心机的离心位置中进行离心，离心温度为15℃，离心力1000g，离心时间为5min；
S5.去除血浆：使用压浆夹将转移袋2上层血浆压回采血袋1中，转移袋内产品的终体积为24.32ml。
热合转移袋2，并混匀后抽取样本分别做有核细胞计数、台盼蓝拒染、CD34+细胞检测、干/祖细胞培养。
实施例2：
一种脐带血造血干细胞的分离方法，使用如图2所示的采集袋，具体包括如下步骤：
S1.脐带血预处理：打开脐带血采血袋1取样出口旋帽，向装有脐带血的采血袋1中按照脐带血体积与羟乙基淀粉的体积比4：1加入羟乙基淀粉，摇床混匀5min；
S2.静置沉降：将步骤S1预处理后的采血袋1取样出口热合封口，然后将盛有脐带血的采血袋1与所述匀强磁场的磁场方向平行设置，所述匀强磁场的磁通量强度为1Wb，沉降时间为34min；
S3.一次离心：利用压浆夹将步骤S2中采血袋1中上层血浆层转移至转移袋2中，将采血袋1和转移袋2作为整体进行配平，放入离心机中离心，保持温度10℃，离心力为550g，离心时间为8min；
S4.二次离心：将步骤S3中离心后的采血袋1中的上层血浆层和白膜层转移至转移袋2中，将采血袋1和转移袋2重新放回离心机中进行离心，离心温度为5℃，离心力800g，离心时间为6min；
S5.去除血浆：使用压浆夹将转移袋2上层血浆压回采血袋1中，转移袋内产品的终体积为24.04ml。
热合转移袋2，并混匀后抽取样本分别做有核细胞计数、台盼蓝拒染、CD34+细胞检测、干/祖细胞培养。
实施例3：
一种脐带血造血干细胞的分离方法，使用如图2所示的采集袋，具体包括如下步骤：
S1.脐带血预处理：打开脐带血采血袋1取样出口旋帽，向装有脐带血的采血袋1中按照脐带血体积与羟乙基淀粉的体积比5：1加入羟乙基淀粉，摇床混匀5min；
S2.静置沉降：将步骤S1预处理后的采血袋1取样出口热合封口，然后将盛有脐带血的采血袋1与所述匀强磁场的磁场方向平行设置，所述匀强磁场的磁通量强度为1Wb，沉降时间为44min；
S3.一次离心：利用压浆夹将步骤S2中采血袋1中上层血浆层转移至转移袋2中，将采血袋1和转移袋2作为整体进行配平，放入离心机中离心，保持温度15℃，离心力为800g，离心时间为5min；
S4.二次离心：将步骤S3中离心后的采血袋1中的上层血浆层和白膜层转移至转移袋2中，将采血袋1和转移袋2重新放回离心机中进行离心，离心温度为10℃，离心力500g，离心时间为7min；
S5.去除血浆：使用压浆夹将转移袋2上层血浆压回采血袋1中，转移袋内产品的终体积为24.78ml。
热合转移袋2，并混匀后抽取样本分别做有核细胞计数、台盼蓝拒染、CD34+细胞检测、干/祖细胞培养。
实施例1～3中，抗凝剂添加量与脐带血最佳沉降时间如附图1所示。
对比例1：
一种脐带血造血干细胞的分离方法，使用如图2所示的采集袋，包括如下步骤：
S1.脐带血预处理：打开脐带血采血袋1取样出口旋帽，向脐带血中按照脐带血体积与羟乙基淀粉的体积比5：1加入羟乙基淀粉，摇床混匀5min；
S2.一次离心：将步骤S1中预处理后的采血袋1和转移袋2作为整体进行配平，放入离心机中离心，保持温度15℃，离心力为800g，离心时间为5min；
S3.二次离心：将步骤S2中离心后的采血袋1中的上层血浆层和白膜层转移至转移袋2中，将采血袋1配平后和转移袋2重新放回步骤S2中的离心机中进行离心，离心温度为10℃，离心力500g，离心时间为7min；
S4.去除血浆：使用压浆夹将转移袋上层血浆压回采集袋中，转移袋内产品的终体积为24.69ml。
热合转移袋，并混匀后抽取样本分别做有核细胞计数、台盼蓝拒染、CD34+细胞检测、干/祖细胞培养。
表1：实施例1～3和对比例1的分离结果如下:
Figure 659222DEST_PATH_IMAGE001
由此可见，加入羟乙基淀粉后静置，使脐带血在匀强磁场竖直静置，红细胞在羟乙基淀粉的桥联作用下聚集为体积较大的缗钱状团块，由于缗钱状团块携带的大量负电荷，导致缗钱状团块在匀强磁场作用下会加速沉降，同时也会推动白细胞向上移动，最终使脐带血沉降后分为两层，血浆层（含大量目的细胞）和红细胞层，因为沉降的脐带血中目的细胞大多弥散在血浆层，而血浆层只有极少量红细胞，所以极大地提高了脐带血制备过程中有核细胞的回收率和红细胞去除率。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书的一种脐带血造血干细胞的分离方法且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。

Claims (5)

1.一种脐带血造血干细胞的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1.脐带血预处理：打开采血袋取样出口旋帽，向装有脐带血的采血袋中加入抗凝剂，摇床混匀5min；
S2.静置沉降：将步骤S1预处理后的采血袋取样出口热合封口，然后将采血袋放置于匀强磁场中静置沉降；
S3.一次离心：利用压浆夹将步骤S2中采血袋内的上层血浆转移至转移袋中，将采血袋和转移袋作为整体进行配平，放入离心机中离心；
S4.二次离心：将步骤S3中离心后的采血袋中的上层血浆层和白膜层转移至转移袋中，转移完成后，将采血袋和转移袋重新放回步骤S3中离心机的离心位置进行离心；
S5.去除血浆：使用压浆夹将经过二次离心后的转移袋上层血浆压回采血袋中，并控制转移袋内产品的终体积在20-30ml。
2.根据权利要求1所述的一种脐带血造血干细胞的分离方法，其特征在于：步骤S1中所述抗凝剂采用羟乙基淀粉，按照脐带血体积与羟乙基淀粉的体积比3~5：1，其中脐带血体积=脐带血称重/脐带血密度。
3.根据权利要求1所述的一种脐带血造血干细胞的分离方法，其特征在于：步骤S2中盛有脐带血的采血袋与所述匀强磁场的磁场方向平行设置，所述匀强磁场的磁通量强度为1Wb。
4.根据权利要求1所述的一种脐带血造血干细胞的分离方法，其特征在于：步骤S3中一次离心的离心温度为5~15℃，离心力为300~800g，离心时间为5~10min。
5.根据权利要求1所述的一种脐带血造血干细胞的分离方法，其特征在于：步骤S4中二次离心的离心温度为5~15℃，离心力500~1000g，离心时间为5~7min。
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