CN112458051A - 一种外周血单个核细胞的提取收集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外周血单个核细胞的提取收集方法，包括以下步骤：1)外周血采集；2)外周血预处理；3)离心；4)提取血浆；5)血浆灭活；6)收集单个核细胞层；7)单个核细胞层离心；8)清洗；9)提取单个核细胞。本发明属于细胞提取技术领域，具体是提供了一种利用Ficoll淋巴细胞分离液离心提取获得外周血单个核细胞，细胞得率高、活性高的外周血单个核细胞的分离方法。
Description
技术领域
本发明属于细胞提取技术领域，具体是指一种外周血单个核细胞的提取收集方法。
背景技术
外周血单个核细胞是外周血中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞、淋巴细胞(B细胞和T细胞)、吞噬细胞、树突状细胞和NK细胞等，这些细胞是机体免疫应答的重要细胞。外周血单个核细胞含有丰富的外周血干细胞，其可以治疗代谢性遗传疾病、肿瘤疾病、免疫缺陷疾病、恶性血液病等。
近年来免疫疗法作为肿瘤综合治疗的第四种模式，越来越被广泛应用。研究发现外周血单个核细胞可以在体外增殖并定向分化用于疾病的治疗。此外，外周血单个核细胞是肝炎和艾滋病等传染病样本资源库储存的重要样本。相比于从骨髓抽取免疫细胞，其采集获取更容易，具有痛苦性小、安全性高、无需麻醉、自身血小板和粒细胞恢复快等特点，能更好地应用治疗患者。
目前，相关PBMC提取分离的方法有很多种，但细胞的得率与活性率不稳定，在一定程度上不利于其应用。因此，开发一种新的分离提取外周血单个核细胞的方法是非常必要的，提高其得率和活性率，为临床与基础细胞学研究提供一个较为有效的细胞获取途径以便后续免疫细胞实验。
发明内容
为解决上述现有难题，本发明提供了一种利用Ficoll淋巴细胞分离液离心提取获得外周血单个核细胞，细胞得率高、活性高的外周血单个核细胞的分离方法。
本发明采用的技术方案如下：一种外周血单个核细胞的提取收集方法，包括以下步骤：
1)外周血采集：采集100ml人外周血于采血袋中，采集完成后，采血袋于密封无菌运输箱中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃；
2)外周血预处理：将步骤1)冷藏运输的含外周血的采血袋进行消毒处理，然后将采血袋中的外周血转移到50ml离心管中，取样进行计数，做相应的检测；
3)离心：将步骤2)所述装有外周血的离心管放置于离心机内，在4℃条件下1500～2700rpm离心10～20min，离心管中血液分层，分别为上层血浆和下层血细胞；
4)提取血浆：将步骤3)中的上层血浆吸出即得自体血浆,在两层的接触处有一层白色的膜层位于血细胞层，收集血浆时不应吸到该层；
5)血浆灭活：将步骤4)分离好的自体血浆置于50～60℃水浴锅灭活20～60min；
6)收集单个核细胞层：将步骤4)提取血浆后剩余的下层血细胞加入生理盐水或羟乙基淀粉溶液稀释，混合均匀，然后非常缓慢地加入离心管中的Ficoll淋巴细胞分离液之上，稀释的血液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为(0.70～1.25)：1，注意保持液层分界清晰，不要将血液混入Ficoll淋巴细胞分离液中，于4℃温度下以1500～2500rpm离心15～40min，离心机调节升速1-4，降速0-4，离心完后离心管中的液体形成三层明显的分层，第一层即最上层为血浆及稀释液，第二层即中间层为Ficoll淋巴细胞分离液，第三层即最下层为红细胞，单个核细胞所在的白膜层位于第一层与第二层之间，另有部分悬浮在第二层中，第一层及第二层收集至新的离心管中得单个核细胞层；
7)单个核细胞层离心：将步骤6)所述的单个核细胞层于4℃温度下以1500～2500rpm离心5～30min，离心机调节升速5-9，降速5-9离心得单个核细胞层；
8)清洗：将步骤7所述的单个核细胞层中的上清预留3-5ml，其余弃去，向预留上清内加入适量生理盐水或PBS溶液重悬收集细胞得细胞悬液，取样检测单个核细胞数目及活率；
9)提取单个核细胞：将步骤8)所述的细胞悬液于4℃，1500～3000rpm离心5～30min，离心机调节升速4-9，降速4-9，弃去上清，收集底部沉淀即得单个核细胞。
进一步地，步骤1)所述的采血袋内含有枸橼酸钠抗凝剂。
进一步地，步骤2)所述的离心机调节升速1-9，降速0-9。
采用上述方案本发明取得有益效果如下：本发明外周血单个核细胞的提取收集方法,利用Ficoll淋巴细胞分离液离心提取获得外周血单个核细胞，细胞得率高、活性高，为临床与基础细胞学研究提供一个有效的细胞获取途径以便后续免疫细胞实验。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种外周血单个核细胞的提取收集方法，包括以下步骤：
1)外周血采集：采集100ml人外周血于含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋中，采集完成后，采血袋于密封无菌运输箱中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃；
2)外周血预处理：将步骤1)冷藏运输的含外周血的采血袋进行消毒处理，然后将采血袋中的外周血转移到50ml离心管中，取样进行计数，做相应的检测；
3)离心：将步骤2)所述装有外周血的离心管放置于离心机内，在4℃条件下2500rpm离心10min，离心机调节升速2，降速1，离心管中血液分层，分别为上层血浆和下层血细胞；
4)提取血浆：将步骤3)中的上层血浆吸出即得自体血浆,在两层的接触处有一层白色的膜层位于血细胞层，收集血浆时不应吸到该层；
5)血浆灭活：将步骤4)分离好的自体血浆置于55℃水浴锅灭活30min；
6)收集单个核细胞层：将步骤4)提取血浆后剩余的下层血细胞加入生理盐水稀释，混合均匀，然后缓慢地加入离心管中的Ficoll淋巴细胞分离液之上，稀释的血液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为1.25：1，注意保持液层分界清晰，不要将血液混入Ficoll淋巴细胞分离液中，于4℃温度下以2300rpm离心20min，离心机调节升速2，降速1，离心完后离心管中的液体形成三层明显的分层，第一层即最上层为血浆及稀释液，第二层即中间层为Ficoll淋巴细胞分离液，第三层即最下层为红细胞，单个核细胞所在的白膜层位于第一层与第二层之间，另有部分悬浮在第二层中，第一层及第二层收集至新的离心管中得单个核细胞层；
7)单个核细胞层离心：将步骤6)所述的单个核细胞层的于4℃温度下以2000rpm离心6min，离心机调节升速8，降速9离心得单个核细胞层；
8)清洗：将步骤7所述的单个核细胞层中的上清预留5ml，其余弃去，向预留上清内加入40ml生理盐水重悬收集细胞得细胞悬液，取样检测单个核细胞数目及活率；
9)提取单个核细胞：将步骤8)所述的细胞悬液于4℃，2000rpm离心6min，离心机调节升速8，降速9，弃去上清，收集底部沉淀即得单个核细胞。
实施例2
一种外周血单个核细胞的提取收集方法，包括以下步骤：
1)外周血采集：采集50ml人外周血于含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋中，，采集完成后，采血袋于密封无菌运输箱中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃；
2)外周血预处理：将步骤1)冷藏运输的含外周血的采血袋进行消毒处理，然后将采血袋中的外周血转移到50ml离心管中，取样进行计数，做相应的检测；
3)离心：将步骤2)所述装有外周血的离心管放置于离心机内，在4℃条件下2100rpm离心15min，离心机调节升速1，降速1，离心管中血液分层，分别为上层血浆和下层血细胞；
4)提取血浆：将步骤3)中的上层血浆吸出即得自体血浆,在两层的接触处有一层白色的膜层位于血细胞层，收集血浆时不应吸到该层；
5)血浆灭活：将步骤4)分离好的自体血浆置于56℃水浴锅灭活30min；
6)收集单个核细胞层：将步骤4)提取血浆后剩余的下层血细胞加入生理盐水稀释，混合均匀，然后缓慢地加入离心管中的Ficoll淋巴细胞分离液之上，稀释的血液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为1：1，注意保持液层分界清晰，不要将血液混入Ficoll淋巴细胞分离液中，于4℃温度下以2100rpm离心20min，离心机调节升速1，降速1，离心完后离心管中的液体形成三层明显的分层，第一层即最上层为血浆及稀释液，第二层即中间层为Ficoll淋巴细胞分离液，第三层即最下层为红细胞，单个核细胞所在的白膜层位于第一层与第二层之间，另有部分悬浮在第二层中，第一层及第二层收集至新的离心管中得单个核细胞层；
7)单个核细胞层离心：将步骤6)所述的单个核细胞层的于4℃温度下以2100rpm离心5min，离心机调节升速9，降速9离心得单个核细胞层；
8)清洗：将步骤7所述的单个核细胞层中的上清预留5ml，其余弃去，向预留上清内加入40ml生理盐水重悬收集细胞得细胞悬液，取样检测单个核细胞数目及活率；
9)提取单个核细胞：将步骤8)所述的细胞悬液于4℃，2100rpm离心5min，离心机调节升速9，降速9，弃去上清，收集底部沉淀即得单个核细胞。
实施例3
一种外周血单个核细胞的提取收集方法，包括以下步骤：
1)外周血采集：采集80ml人外周血于含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋中，，采集完成后，采血袋于密封无菌运输箱中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃；
2)外周血预处理：将步骤1)冷藏运输的含外周血的采血袋进行消毒处理，然后将采血袋中的外周血转移到50ml离心管中，取样进行计数，做相应的检测；
3)离心：将步骤2)所述装有外周血的离心管放置于离心机内，在4℃条件下2500rpm离心10min，离心机调节升速2，降速1，离心管中血液分层，分别为上层血浆和下层血细胞；
4)提取血浆：将步骤3)中的上层血浆吸出即得自体血浆,在两层的接触处有一层白色的膜层位于血细胞层，收集血浆时不应吸到该层；
5)血浆灭活：将步骤4)分离好的自体血浆置于55℃水浴锅灭活30min；
6)收集单个核细胞层：将步骤4)提取血浆后剩余的下层血细胞加入羟乙基淀粉溶液稀释，混合均匀，然后缓慢地加入离心管中的Ficoll淋巴细胞分离液之上，稀释的血液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为1.25：1，注意保持液层分界清晰，不要将血液混入Ficoll淋巴细胞分离液中，于4℃温度下以2300rpm离心20min，离心机调节升速2，降速1，离心完后离心管中的液体形成三层明显的分层，第一层即最上层为血浆及稀释液，第二层即中间层为Ficoll淋巴细胞分离液，第三层即最下层为红细胞，单个核细胞所在的白膜层位于第一层与第二层之间，另有部分悬浮在第二层中，第一层及第二层收集至新的离心管中得单个核细胞层；
7)单个核细胞层离心：将步骤6)所述的单个核细胞层的于4℃温度下以2000rpm离心6min，离心机调节升速8，降速9离心得单个核细胞层；
8)清洗：将步骤7所述的单个核细胞层中的上清预留5ml，其余弃去，向预留上清内加入40mlPBS溶液重悬收集细胞得细胞悬液，取样检测单个核细胞数目及活率；
9)提取单个核细胞：将步骤8)所述的细胞悬液于4℃，2000rpm离心6min，离心机调节升速8，降速9，弃去上清，收集底部沉淀即得单个核细胞。
分别取实施例1-3的1ml细胞悬液，用XP-100型自动血液分析仪进行计数，检测提取获得的外周血中的血小板数、红细胞数、单个核细胞总数，计算单个核细胞回收率、单个核细胞活率，并与传统方法对比，结果如表1所示：
表1.细胞纯度检测
以上所述的实施例的各技术特征可以进行任意组合，为了简洁表述，并未对上述的实施例的技术特征所有的组合都详细描述，只要这些技术特征组合不存在矛盾，皆应被认为是本说明书所记载的应用范围。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (3)
1.一种外周血单个核细胞的提取收集方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)外周血采集：采集100ml人外周血于采血袋中，采集完成后，采血袋于密封无菌运输箱中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃；
2)外周血预处理：将步骤1)冷藏运输的含外周血的采血袋进行消毒处理，然后将采血袋中的外周血转移到50ml离心管中，取样进行计数，做相应的检测；
3)离心：将步骤2)所述装有外周血的离心管放置于离心机内，在4℃条件下1500～2700rpm离心10～20min，离心管中血液分层，分别为上层血浆和下层血细胞；
4)提取血浆：将步骤3)中的上层血浆吸出即得自体血浆；
5)血浆灭活：将步骤4)分离好的自体血浆置于50～60℃水浴锅灭活20～60min；
6)收集单个核细胞层：将步骤4)提取血浆后剩余的下层血细胞加入生理盐水或羟乙基淀粉溶液稀释，混合均匀，然后缓慢地加入离心管中的Ficoll淋巴细胞分离液之上，稀释的血液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为(0.70～1.25)：1，于4℃温度下以1500～2500rpm离心15～40min，离心机调节升速1-4，降速0-4，离心完后离心管中的液体形成三层明显的分层，第一层及第二层收集至新的离心管中得单个核细胞层；
7)单个核细胞层离心：将步骤6)所述的单个核细胞层的于4℃温度下以1500～2500rpm离心5～30min，离心机调节升速5-9，降速5-9离心得单个核细胞层；
8)清洗：将步骤7所述的单个核细胞层中的上清预留3-5ml，其余弃去，向预留上清内加入适量生理盐水或PBS溶液重悬收集细胞得细胞悬液，取样检测单个核细胞数目及活率；
9)提取单个核细胞：将步骤8)所述的细胞悬液于4℃，1500～3000rpm离心5～30min，离心机调节升速4-9，降速4-9，弃去上清，收集底部沉淀即得单个核细胞。
2.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的提取收集方法，其特征在于，步骤1)所述的采血袋内含有枸橼酸钠抗凝剂。
3.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的提取收集方法，其特征在于，步骤2)所述的离心机调节升速1-9，降速0-9。
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2020
- 2020-11-11 CN CN202011252394.1A patent/CN112458051A/zh active Pending
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