CN108841790B - 一种胎盘来源的单个核细胞诱导cik细胞的方法 - Google Patents

一种胎盘来源的单个核细胞诱导cik细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108841790B
CN108841790B CN201810638317.6A CN201810638317A CN108841790B CN 108841790 B CN108841790 B CN 108841790B CN 201810638317 A CN201810638317 A CN 201810638317A CN 108841790 B CN108841790 B CN 108841790B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cord blood
cik
blood plasma
umbilical cord
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810638317.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108841790A (zh
Inventor
张瑞婷
朱丰城
王浩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xirui Stem Cell Technology Co ltd
Original Assignee
Xirui Stem Cell Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xirui Stem Cell Technology Co ltd filed Critical Xirui Stem Cell Technology Co ltd
Priority to CN201810638317.6A priority Critical patent/CN108841790B/zh
Publication of CN108841790A publication Critical patent/CN108841790A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108841790B publication Critical patent/CN108841790B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，通过采用胎盘来源的单个核细胞诱导培养CIK细胞，与采用脐带血单个细胞诱导培养相比，获得的CIK细胞CD3 +CD56 +双阳性率、扩增数量和存活率更高，可更好的满足肿瘤治疗的临床需求。

Description

一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法。
背景技术
随着免疫细胞生物学及免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展，细胞介导的过继免疫治疗已成为肿瘤患者放、化疗后辅助治疗的重要手段之一。
CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer)，是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外用多种细胞因子(抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α等)共同诱导而获得的一群异质细胞，被称为NK样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点。CIK细胞主要通过三种作用途径来杀伤肿瘤细胞：一是通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞的裂解，直接杀伤肿瘤细胞；二是体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞；三是CIK细胞在培养过程中表达FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)通过与肿瘤细胞膜表达的Fas(Ⅰ型跨膜糖蛋白)结合，诱导肿瘤细胞凋亡。CIK细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。对手术后或放化疗后患者疗效显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力。
CD3 +、CD56 +细胞是CIK细胞群体中主要的效应细胞，但在外周血中含量极少，仅占1％—5％。为了使CD3 +、CD56 +细胞含量达到临床使用所需的浓度，需要对CIK细胞进行人工培养，以获得大量CIK细胞。目前，常常采用病人外周血单个核细胞(PBMC)进行诱导培养CIK细胞。但由肿瘤患者自身外周血单个核细胞(PBMC)，诱导的CIK细胞扩增效率低，高峰延迟，杀伤活性弱，主要效应细胞CD3 +、CD56 +阳性比例低，CIK细胞的扩增效率及成熟率都较低，很难满足肿瘤治疗的临床需求；后来有研究者采用脐带血单个核细胞(PBMC)进行诱导培养CIK细胞，虽然不受患者本身身体条件限制，但是脐带血单个核细胞的起始数量往往偏低，无法获得足够的CIK细胞。
为了解决这一问题我们需要寻求更合适的CIK细胞诱导细胞来源。而胎盘中富含游离的单个核细胞，其免疫原性弱，是诱导CIK细胞的理想材料。与来源于肿瘤患者的外周血单个核细胞相比，该途径不仅能够提高CIK细胞的扩增效率及成熟率，而且能够提高CD3+和CD56+CIK细胞数量；与来源于脐带血单个核细胞相比，该途径更能提高CD3 +和CD56 +CIK细胞数量，可以很好的运用于临床。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法。
本发明提供了一种胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1，脐带血血浆分成两份，分别进行处理保存，其中，第一份脐带血血浆灭活后-20℃冷冻保存，第二份脐带血血浆未经灭活，在4℃下保存备用；
步骤2，细胞培养瓶中加入未经灭活的脐带血血浆，在4℃下包被过夜，或者在37℃下，包被3h；
步骤3，包被结束，弃去细胞培养瓶中脐带血血浆，对细胞培养瓶顺次用10mlPBS和10ml GT-T551培养液各洗涤一次；
步骤4，获取胎盘来源的单个核细胞，并用GT-T551培养基制备细胞浓度为1～2×106/ml的胎盘来源的单个核细胞悬液；
步骤5，向步骤3中的细胞培养瓶中加入步骤4中的细胞悬液，同时再加入步骤1中灭活脐带血血浆、IFN-γ，使灭活脐带血血浆浓度为10％，IFN-γ浓度为1000IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中，培养24h；
步骤6，加入与步骤5中细胞悬液体积相同的GT-T551培养基，细胞培养瓶中加入IL-1、CD3单抗、IL-2、脐带血血浆，使其终浓度为IL-1 100IU/ml、CD3单抗50ng/ml、IL-2300IU/ml、脐带血血浆10％，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；
步骤7，第4天，加入20ml GT-T551培养液，并添加IL-2，使IL-2终浓度为300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；
步骤8，每隔2天或3天补加1次GT-T551培养液，每次添加的GT-T551培养液体积与培养瓶中液体体积相同，并补充IL-2浓度至300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养；
步骤9，第15天，收集培养瓶中的全部培养基及细胞，以500g/min离心10min，收集沉淀，沉淀即为CIK细胞。
在本发明还具有这样的特征：脐带血血浆的制备方法如下：
步骤1-1，用含抗凝剂的无菌采血袋，穿刺脐带静脉，采集脐带血；
步骤1-2，将脐带血在3000rpm下，离心15min，弃去沉淀，获取上清液，即为脐带血血浆。
进一步地，抗凝剂为肝素钠或CPDA-1。
在本发明还具有这样的特征：步骤4中，胎盘来源的单个核细胞的获得方法如下：
步骤4-1，将胎盘组织用含1％青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗，重复多次，以除尽胎盘组织表面的血块和其他杂质；
步骤4-2，从胎盘母体面剪下胎盘小叶，将胎盘小叶剪碎成多个体积为1～5mm3的组织块，把该组织块放入200目滤网，用含1％青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗过滤，直至红色变浅，收集过滤液；
步骤4-3，将步骤4-2中的过滤液经1800rpm离心10min，弃上清，下层细胞用含1％青霉素-链霉素双抗的PBS重悬，重悬液缓慢加入人外周血淋巴细胞分离液，重悬液与人外周血淋巴细胞分离液体积比为4:3，离心，该离心条件为800g，15min，加速为1，降速为0；
步骤4-4，离心结束，离心管中液体分为4层，吸取中间白膜层细胞，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为600g，10min；
步骤4-5，离心结束弃上清，收集沉淀，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为500g离心10min；
步骤4-6，离心结束弃上清，收集沉淀，用CIK完全培养基重悬细胞，计数待用。
进一步地，步骤4-6中CIK完全培养基重悬细胞含有1000IU/ml IL-2、以及GT-551培养基。
本发明的优点如下：
胎盘来源的单个核细胞免疫原性弱，采用该来源的单个核细胞作为诱导CIK细胞的材料，不仅能够提高CD3 +和CD56 +CIK细胞数量，而且能够提高CIK细胞的存活率及CD3 +CD56 +双阳性率，很好的满足肿瘤治疗的临床需求。
附图说明
图1是本发明的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第2天细胞形态图；
图2是本发明的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第4天细胞形态图；
图3是本发明的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第6天细胞形态图；
图4是本发明的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第8天细胞形态图；
图5是本发明的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第10天细胞形态图；
图6是本发明的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第15天细胞形态图；
图7-a是本发明的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第10天细胞流式表型图，CD3 +CD56 +双阳性比例为23.63％；
图7-b是本发明的实施例中脐带血单个核细胞诱导CIK第10天细胞流式表型图，CD3 +CD56 +双阳性比例为23.00％；
图8-a是本发明的实施例中胎盘来源的单个核细胞诱导CIK第15天细胞流式表型图，CD3 +CD56 +双阳性比例为55.24％；
图8-b是本发明的实施例中脐带血单个核细胞诱导CIK第15天细胞流式表型图，CD3 +CD56 +双阳性比例为50.42％。
具体实施方式
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1.胎盘组织及脐带血来源情况
胎盘组织及脐带血由某妇幼保健院的产妇捐赠，捐赠者事先签署知情同意书和捐赠协议。捐赠对象家族中无遗传性疾病和先天性疾病史；年龄20～36周岁，妊娠34～42周，非双胎、多胎、试管婴儿；妊娠期血液检测，无发现地中海贫血、肝功能、乙肝、丙肝抗体、艾滋病毒抗体、梅毒、巨细胞病毒及其他传染病毒感染；无接受器官和组织移植；孕期无妊娠合并症及并发症，近1年未接受过输血；产前体温正常、胎膜早破未超过24小时，无感染，无胎盘早剥、脐带畸形。
2.脐带血血浆的获取处理
脐带血血浆的制备方法如下：
步骤1-1，用含抗凝剂的无菌采血袋，穿刺脐带静脉，采集脐带血。抗凝剂可为肝素钠或CPDA-1，本实施例中，优选地为CPDA-1。
步骤1-2，将脐带血在3000rpm下，离心15min，弃去沉淀，获取上清液，即为脐带血血浆。
3.脐带血来源的单个核细胞获得
脐带血来源的单个核细胞的获得方法如下：
步骤①，将分离脐带血血浆后的脐带血细胞，用PBS补充定容至分离血浆前的脐带血体积，充分混匀。
步骤②，重悬液缓慢加入人外周血淋巴细胞分离液，重悬液与人外周血淋巴细胞分离液体积比可以为2:1-1:1之间的任一比例，其中比例取4:3时效果最好。再离心，该离心条件为800g，15min，加速为1，降速为0。
步骤③，离心结束，离心管中液体分为4层，吸取中间白膜层细胞，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为600g，10min。
步骤④，离心结束弃上清，收集沉淀，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为500g离心10min。
步骤⑤，离心结束弃上清，收集沉淀，用CIK完全培养基重悬细胞，计数待用。该CIK完全培养基重悬细胞含有1000IU/ml IL-2、以及GT-551培养基。
4.脐带血来源的单个核细胞向CIK诱导
脐带血来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，包括以下步骤：
步骤Ⅰ，将脐带血血浆分成两份，分别进行处理保存，其中，第一份脐带血血浆灭活后-20℃冷冻保存，第二份脐带血血浆未经灭活，在4℃下保存备用。
步骤Ⅱ，细胞培养瓶中加入未经灭活的脐带血血浆，在4℃下包被过夜，或者在37℃下，包被3h。
步骤Ⅲ，包被结束，弃去细胞培养瓶中的脐带血血浆，对细胞培养瓶顺次用10mlPBS和10ml GT-T551培养液各洗涤一次。
步骤Ⅳ，获取脐带血来源的单个核细胞，并用GT-T551培养基制备细胞浓度为1～2×106/ml的脐带血来源的单个核细胞悬液。
步骤Ⅴ，向步骤Ⅲ中的细胞培养瓶中加入步骤Ⅳ中的细胞悬液，同时再加入步骤Ⅰ中灭活脐带血血浆、IFN-γ，使灭活脐带血血浆浓度为10％，IFN-γ浓度为1000IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中，培养24h。
步骤Ⅵ，加入与步骤Ⅴ中细胞悬液体积相同的GT-T551培养基，细胞培养瓶中加入IL-1、CD3单抗、IL-2、脐带血血浆，使其终浓度为IL-1 100IU/ml、CD3单抗50ng/ml、IL-2300IU/ml、脐带血血浆10％，在37℃下、5％CO2培养箱中培养。
步骤Ⅶ，第4天，加入20ml GT-T551培养液，并添加IL-2，使IL-2终浓度为300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养。
步骤Ⅷ，每隔2天或3天补加1次GT-T551培养液，每次添加的GT-T551培养液体积与培养瓶中液体体积相同，并补充IL-2浓度至300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养。
步骤Ⅸ，第15天，收集培养瓶中的全部培养基，以500g/min离心10min，收集沉淀，沉淀即为CIK细胞。
5.胎盘来源的单个核细胞获得
胎盘来源的单个核细胞的获得方法如下：
步骤4-1，将胎盘组织用含1％青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗，重复多次，以除尽胎盘组织表面的血块和其他杂质。
步骤4-2，从胎盘母体面剪下胎盘小叶，将胎盘小叶剪碎成多个体积为1～5mm3的组织块，把该组织块放入200目滤网，用含1％青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗过滤，直至红色变浅，收集过滤液。
步骤4-3，将步骤4-2中的过滤液经1800rpm离心10min，弃上清，下层细胞用含1％青霉素-链霉素双抗的PBS重悬，重悬液缓慢加入人外周血淋巴细胞分离液，重悬液与人外周血淋巴细胞分离液体积比可以为2:1-1:1之间的任一比例，其中比例取4:3时效果最好。再离心，该离心条件为800g，15min，加速为1，降速为0。
步骤4-4，离心结束，离心管中液体分为4层，吸取中间白膜层细胞，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为600g，10min。
步骤4-5，离心结束弃上清，收集沉淀，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为500g离心10min。
步骤4-6，离心结束弃上清，收集沉淀，用CIK完全培养基重悬细胞，计数待用。该CIK完全培养基重悬细胞含有1000IU/ml IL-2、以及GT-551培养基。6.胎盘来源的单个核细胞向CIK诱导
胎盘来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1，将脐带血血浆分成两份，分别进行处理保存，其中，第一份脐带血血浆灭活后-20℃冷冻保存，第二份脐带血血浆未经灭活，在4℃下保存备用。
步骤2，细胞培养瓶中加入未经灭活的脐带血血浆，在4℃下包被过夜，或者在37℃下，包被3h。
步骤3，包被结束，弃去细胞培养瓶中的脐带血血浆，对细胞培养瓶顺次用10mlPBS和10ml GT-T551培养液各洗涤一次。
步骤4，获取胎盘来源的单个核细胞，并用GT-T551培养基制备细胞浓度为1～2×106/ml的胎盘来源的单个核细胞悬液。
步骤5，向步骤3中的细胞培养瓶中加入步骤4中的细胞悬液，同时再加入步骤1中灭活脐带血血浆、IFN-γ，使灭活脐带血血浆浓度为10％，IFN-γ浓度为1000IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中，培养24h。
步骤6，加入与步骤5中细胞悬液体积相同的GT-T551培养基，细胞培养瓶中加入IL-1、CD3单抗、IL-2、脐带血血浆，使其终浓度为IL-1 100IU/ml、CD3单抗50ng/ml、IL-2300IU/ml、脐带血血浆10％，在37℃下、5％CO2培养箱中培养。
步骤7，第4天，加入20ml GT-T551培养液，并添加IL-2，使IL-2终浓度为300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养。
步骤8，每隔2天或3天补加1次GT-T551培养液，每次添加的GT-T551培养液体积与培养瓶中液体体积相同，并补充IL-2浓度至300IU/ml，在37℃下、5％CO2培养箱中培养。
步骤9，第15天，收集培养瓶中的全部培养基，以500g/min离心10min，收集沉淀，沉淀即为CIK细胞。
7.细胞流式检测
本实施例中采用BD公司FACSCalibur型流式细胞仪，进行CIK表面标志物CD3和CD56的检测并进行分析。
(1)将含CIK细胞的培养基收集至15ml离心管，1200rpm，4℃，离心10min；
(2)弃上清。用PBS重悬细胞，充分吹匀后计数。根据计数结果，将细胞密度调整到1～2×106/ml，制成细胞悬液；
(3)取4个流式管，分别加入100ul细胞悬液；
(4)标记样本检测管(包括2支单染管和1支双染管)和阴性对照管；
(5)其中1支单染样本检测管加入5～10ul CD3抗体，另一只单染管加入5～10ulCD56抗体，双染样本检测管分别加入5～10ul CD3抗体和CD56抗体，阴性对照管不做任何处理；
(6)室温，避光孵育20min；
(7)1500rpm，离心5min；
(8)弃上清，每管加入300～500ul PBS重悬；
(9)单染管，调节荧光通道间荧光补偿，双染管进行样本检测。
8.结果分析
采用同一供体来源的胎盘单个核细胞与脐带血单个核细胞分别进行诱导培养实验。实施例中利用胎盘来源单个核细胞诱导培养第10天时，CIK细胞CD3 +CD56 +双阳性百分含量与利用脐带血单个核细胞诱导第10天时的CIK细胞CD3 +CD56 +双阳性百分含量相当；与利用脐带血单个核细胞诱导培养第15天相比，利用胎盘来源单个核细胞诱导第15天时，CIK细胞CD3 +CD56 +双阳性百分含量更高，详见图7-a、7-b、8-a、8-b。
诱导培养第5天、第13天、第15天时，胎盘单个可细胞诱导的CIK细胞数量均高于脐带血单个核细胞诱导的CIK细胞数量；诱导培养第5天、第13天、第15天时，胎盘单个可细胞诱导的CIK细胞存活率均高于脐带血单个核细胞诱导的CIK细胞存活率，详见表1。
检测结果表明，采用胎盘来源的单个核细胞诱导培养的CIK细胞，经形态观察、流式检测、细胞计数和活率分析等检测结果显示，同一供体来源的胎盘单个核细胞与脐带血单个核细胞相比，获得的CIK细胞CD3 +CD56 +双阳性率、扩增数量和存活率更高。
表1.两种单个核细胞诱导CIK在不同时间的细胞数量和存活率(x±s％，n＝5)
Figure BDA0001701520760000111
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围。

Claims (5)

1.一种胎盘组织来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，脐带血血浆分成两份，分别进行处理保存，其中，第一份脐带血血浆灭活后-20℃冷冻保存，第二份脐带血血浆未经灭活，在4℃下保存备用；
步骤2，细胞培养瓶中加入未经灭活的脐带血血浆，在4℃下包被过夜，或者在37℃下，包被3h；
步骤3，包被结束，弃去细胞培养瓶中的脐带血血浆，对细胞培养瓶顺次用10mlPBS和10mlGT-T551培养液各洗涤一次；
步骤4，获取胎盘组织来源的单个核细胞，并用GT-T551培养基制备细胞浓度为1-2×106/ml的胎盘组织来源的单个核细胞悬液；
步骤5，向步骤3中的细胞培养瓶中加入步骤4中的细胞悬液，同时再加入步骤1中灭活脐带血血浆、IFN-γ，使灭活脐带血血浆浓度为10%，IFN-γ浓度为1000IU/ml，在37℃下、5%CO2培养箱中，培养24h；
步骤6，加入与步骤5中细胞悬液体积相同的GT-T551培养基，细胞培养瓶中加入IL-1、CD3单抗、IL-2、脐带血血浆，使其终浓度为IL-1100IU/ml、CD3单抗50ng/ml、IL-2 300IU/ml、脐带血血浆10%，在37℃下、5%CO2培养箱中培养；
步骤7，第4天，加入20mlGT-T551培养液，并添加IL-2，使IL-2终浓度为300IU/ml，在37℃下、5%CO2培养箱中培养；
步骤8，每隔2天或3天补加1次GT-T551培养液，每次添加的GT-T551培养液体积与培养瓶中液体体积相同，并补充IL-2浓度至300IU/ml，在37℃下、5%CO2培养箱中培养；
步骤9，第15天，收集培养瓶中的全部培养基及细胞，以500g/min离心10min，收集沉淀，沉淀即为CIK细胞。
2.根据权利要求1所述的胎盘组织来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，其特征在于：所述脐带血血浆的制备方法如下：
步骤1-1，用含抗凝剂的无菌采血袋，穿刺脐带静脉，采集脐带血；
步骤1-2，将脐带血在3000rpm下，离心15min，弃去沉淀，获取上清液，即为脐带血血浆。
3.根据权利要求2所述的胎盘组织来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，其特征在于：所述抗凝剂为肝素钠或CPDA-1。
4.根据权利要求1所述的胎盘组织来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，其特征在于：所述步骤4中，胎盘组织来源的单个核细胞的获得方法如下：
步骤4-1，将胎盘组织用含1%青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗，重复多次，以除尽胎盘组织表面的血块和其他杂质；
步骤4-2，从胎盘组织母体面剪下胎盘小叶，将胎盘小叶剪碎成多个体积为1~5mm3的组织块，把该组织块放入200目滤网，用含1%青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗过滤，直至红色变浅，收集过滤液；
步骤4-3，将步骤4-2中的过滤液经1800rpm离心10min，弃上清，下层细胞用含1%青霉素-链霉素双抗的PBS重悬，重悬液缓慢加入人外周血淋巴细胞分离液，重悬液与人外周血淋巴细胞分离液体积比为4:3，离心，该离心条件为800g，15min，加速为1，降速为0；
步骤4-4，离心结束，离心管中液体分为4层，吸取中间白膜层细胞，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为600g，10min；
步骤4-5，离心结束弃上清，收集沉淀，用GT-551培养基重悬细胞，对重悬液离心，该离心条件为500g离心10min；
步骤4-6，离心结束弃上清，收集沉淀，用CIK完全培养基重悬细胞，计数待用。
5.根据权利要求4所述的胎盘组织来源的单个核细胞诱导CIK细胞的方法，其特征在于：所述步骤4-6中CIK完全培养基重悬细胞含有1000IU/ml IL-2、以及GT-551培养基。
CN201810638317.6A 2018-06-20 2018-06-20 一种胎盘来源的单个核细胞诱导cik细胞的方法 Active CN108841790B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810638317.6A CN108841790B (zh) 2018-06-20 2018-06-20 一种胎盘来源的单个核细胞诱导cik细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810638317.6A CN108841790B (zh) 2018-06-20 2018-06-20 一种胎盘来源的单个核细胞诱导cik细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108841790A CN108841790A (zh) 2018-11-20
CN108841790B true CN108841790B (zh) 2022-08-05

Family

ID=64202614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810638317.6A Active CN108841790B (zh) 2018-06-20 2018-06-20 一种胎盘来源的单个核细胞诱导cik细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108841790B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111394308B (zh) * 2019-12-10 2021-01-22 广东先康达生物科技有限公司 一种脐带血淋巴细胞cik的培养方法
CN114231487B (zh) * 2021-12-14 2023-08-15 博雅干细胞科技有限公司 胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法
CN114591904A (zh) * 2022-03-09 2022-06-07 河南省组织细胞库有限公司 一种从胎盘中提取自然杀伤性细胞的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907789A (zh) * 2016-03-14 2016-08-31 紫程瑞生会(北京)生物技术发展有限公司 一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法及其试剂盒
CN106893695A (zh) * 2015-12-21 2017-06-27 中国医学科学院基础医学研究所 一种新型调节性树突状细胞及其联合dc-cik的新型免疫疗法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106893695A (zh) * 2015-12-21 2017-06-27 中国医学科学院基础医学研究所 一种新型调节性树突状细胞及其联合dc-cik的新型免疫疗法
CN105907789A (zh) * 2016-03-14 2016-08-31 紫程瑞生会(北京)生物技术发展有限公司 一种介导抗体依赖性的细胞毒性的细胞因子诱导杀伤细胞的制备方法及其试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
不同培养基与血清的培养体系对细胞因子诱导杀伤细胞增殖和功能的影响;高群;《中国肿瘤生物治疗杂志》;20141230;摘要，图1 *
胎盘血来源CIK细胞的诱导培养及其对肿瘤细胞杀伤作用的研究;李艳君;《万方数据知识服务平台》;20170428;摘要，第二部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108841790A (zh) 2018-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5343110B2 (ja) 接線流れ濾過デバイス、および幹細胞富化のための方法
JP4294316B2 (ja) 胎盤幹細胞の回収方法
CN1713951B (zh) 切向流过滤设备和白细胞富集方法
CN108841790B (zh) 一种胎盘来源的单个核细胞诱导cik细胞的方法
CN110551686A (zh) 外周血单个核细胞的分离方法
CN108251365B (zh) 免疫细胞培养基体系
Hu Isolation of human and mouse neutrophils ex vivo and in vitro
AU2010202385A1 (en) Methods for inducing the differentiation of blood monocytes into functional dendritic cells
US10113148B2 (en) Method for obtaining monocytes or NK cells
CN114134114B (zh) 从胎盘组织中扩增自然杀伤细胞的方法
CN111394308B (zh) 一种脐带血淋巴细胞cik的培养方法
CN112852728A (zh) 基于外周血的lcl-nk细胞联合培养方法、细胞及产品
CN111849897B (zh) 一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法
CN111154721B (zh) Nk细胞扩增方法
CN114480279A (zh) 一种高效的人类血液免疫细胞cd4t分离培养技术
CN112410297B (zh) 一种γδT样αβT细胞及其制备方法和应用
CN106244542A (zh) 制备hiv抗原特异性ctl的试剂盒与方法
CN113881633B (zh) 一种脐带血造血干细胞体外干性扩增的培养基及方法
CN110628715B (zh) 体外扩增自然杀手细胞及自然杀手t细胞的方法及其医药组成物
WO2009029305A1 (en) Methods for inducing the differentiation of blood monocytes into functional dendritic cells
CN110628714B (zh) 用于体外扩增自然杀手细胞及自然杀手t细胞的无血清细胞培养液
WO2006011681A1 (ja) 白血球培養用血液の保存方法、輸送方法、末梢血単核球の保存方法、輸送方法及びそれらを用いた白血球の培養方法
CN113957049A (zh) 一种人类γδT细胞培养方法
CN106661555B (zh) 一种自体cik细胞高效扩增方法
JP2023103632A (ja) Ｎｋ細胞の培養方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant