CN114231487B - 胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法，从围产期胎盘组织中分离培养自然杀伤细胞(NK细胞)的方法包括如下步骤：①取围产期胎盘组织，以小块的形式剪下绒毛小叶结构组织；②利用I、II型胶原酶、DNA酶消化胎盘小叶组织；③利用密度梯度离心的方法提取消化后细胞悬液中的单个核细胞；④利用IL‑15、FLT3‑L、OK432等细胞因子诱导培养单个核细胞中的NK细胞扩增；⑤扩增后的NK细胞的生物学鉴定。本发明方法呈现如说明书所述优良技术效果。

Description

胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及一种从胎盘绒毛小叶组织来源细胞的培养扩增自然杀伤细胞的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
自然杀伤细胞(NK细胞)于30年前在外周血中被发现，CD3-CD56+淋巴细胞被定义为人NK细胞。NK细胞通常含有大量穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)，当激活的NK细胞遇到靶细胞时，NK细胞释放穿孔素和颗粒酶B攻击靶细胞。NK细胞还可以分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-3等细胞因子，这些细胞因子可以直接作用于靶细胞，也可以通过激活其他种类的免疫细胞攻击靶细胞。
有文献(Koepsell SA,Miller JS,McKenna DH Jr.Natural killer cells:areview of manufacturing and clinical utility.Transfusion.2013,53(2):404-10)报道，浸润到肿瘤组织中的NK细胞数量尽管非常少，但是NK细胞浸润到肿瘤组织的患者能明显的观察到其生存期的显著延长，及其肿瘤扩散比率的显著降低。与健康人的NK细胞相比，肿瘤患者NK细胞浸润到肿瘤组织中的杀伤能力显著降低。
另外，肿瘤患者的NK细胞表面抑制受体如CD158a、CD158b和NKG2A表达显著上升，而激活受体如NKG2D、NKG2C、NPp30和CD69则显著下降。现有研究数据表明，癌症患者的NK细胞严重受损，这使得它们无法消灭肿瘤细胞。但这为肿瘤的免疫治疗提供了一个契机，即通过体外细胞活化和扩增的方法恢复或者重建NK细胞抗肿瘤的能力，提高NK细胞对肿瘤免疫治疗的效果。已经报道的许多临床前研究表明，NK细胞作为一种有效地免疫治疗方法可以用于治疗各种肿瘤。
一些NK细胞临床研究的细胞制备方法已经有可能被转化成为临床级或者是cGMP级的标准制备过程(Lapteva N,Durett AG,et al.Large-scale ex vivo expansion andcharacterization of natural killer cells for clinicalapplications.Cytotherapy.2012,14(9):1131-43)。在这些报道的NK细胞制备方法中，大多使用外周血、脐血、骨髓中的单个核细胞作为培养NK细胞的样本。另外，还有文献(Campbell KS,Hasegawa J.Natural killer cell biology:an update and futuredirections.J Allergy Clin Immunol.2013,132(3):536-44)报道，体外扩增NK细胞，有多种因素都会影响到NK细胞的数量，从而降低NK细胞扩增的可能性。
胎盘作为连接胎儿和母体的重要器官，其结构较为复杂，至少可分为胎盘脐带连接、羊膜包被层、绒毛膜板、绒毛组织、底蜕膜等包含不同种类细胞的组织。现有研究表明，同一份胎盘至少可以获得包括造血(祖)干细胞、绒毛血管内皮干细胞以及绒毛膜、羊膜以及绒毛组织来源的间充质干细胞等不同种类的细胞。胎盘在胎儿发育早期也是重要的造血器官，研究表明，绒毛及其绒毛小叶结构中血管成分来源的内皮干细胞和造血祖细胞，在造血过程起着重要作用。在胎盘发育早期存在造血内皮组织，主要存在绒毛小叶结构之中，胎盘小叶结构中的血管内皮在一定条件下可以从血管内皮脱落、或造血内皮细胞失去表达钙黏素5发育成为血液中的悬浮细胞，成为具备造血分化功能的干细胞。
胎儿分娩后胎盘中不仅留存着丰富的造血前体或造血(祖)干细胞，而且可分离得到大量的原始免疫细胞，再经体外扩增诱导为NK等过继性免疫治疗细胞用于临床辅助回输治疗。当前脐带血造血干细胞移植中造血(祖)干细胞(CD34+)细胞数量已成为临床移植植入的关键因素之一，然而单份脐带血CD34+细胞数量有限，造成植入周期较长，临床治疗费用较高，增加移植临床的风险。解决当前脐带血造血干细胞数量，可以在移植后给予辅助淋巴细胞输注提高植入效率，也可以采用移植时辅助给予间充质干细胞输注以降低GvHD不良反应。但这些措施一般只采用异体来源的淋巴细胞或间充质干细胞辅助移植，会因引入异源细胞或抗原增加负反应强度和几率，进而增加临床移植失败的风险。
NK细胞主要分布于外周血液、肝脏、脾脏、围产期组织等，目前采集NK细胞的主要方式主要有两种：一种为通过静脉抽取外周血来制备获得NK细胞；另外一种则通过围产期组织来获取NK细胞及制备。由于部分人群痛觉神经较为敏感，且NK细胞在外周血的含量极低，因此抽取的外周血需要达到足够的数量才能满足临床治疗的需要。相对于此种方式，采用围产期组织来获取NK细胞无疑是更具有无可比拟的优势，尤其是新生儿围产组织胎盘中富含大量的NK细胞。而且围产组织来源的NK细胞会更原始，纯净度更高、干扰素表达能力更强，拥有更强的骨髓归巢功能，但同时免疫原性也更低，这不但规避了需要采集大量外周血液繁琐的步骤，同时也保证采集过程中人不会感受到痛苦。尤其是相较于成年人来讲，未成年人的免疫系统还不够完善，并不适用于静脉抽血的方式进行NK细胞的采集及后续的治疗，因此对于这部分特定的人群来说，围产期胎盘组织无疑是最理想的NK细胞来源。
目前NK细胞培养扩增的方法主要有两种，第一种是主要以滋养层细胞与NK细胞共培养来刺激NK细胞的增殖能力的，该方法虽然价格便宜、效果较稳定，并且能够获得数量可观的NK细胞，但其仍然存在诸多缺点，尤其是在临床应用中，其主要原因在于培养过程中选用的滋养层细胞为多为肿瘤细胞。尽管从理论上讲，经过相应处理的肿瘤细胞已经不再具备增殖的可能性。但其潜在风险难以证明可以完全排除。另外就是伦理方面的问题，将正常细胞与肿瘤细胞共培养，然后将培养后的NK细胞回输体内，确实存在难以克服的伦理障碍。另一种方法是细胞因子诱导扩增NK细胞，向NK细胞方向诱导，并配合相应的细胞培养基，使NK细胞大量增殖。纯因子细胞培养技术以其安全性高而著称，其原因在于所使用的细胞因子，都是体内环境原本就存在的。培养过程相当于模拟体内环境，促进NK细胞的激活及大量增殖。但目前采用传统细胞因子的方法如，白细胞介素-2(IL-2)等，不但价格昂贵，体外扩增NK细胞的效果也不甚理想。因此亟需寻求一种新型的细胞因子，可高效的扩增NK细胞。
FLT3配体(FLT3-ligand，FL)是一种能够调节早期造血的关键性细胞因子，与III型酪氨酸激酶受体FLT3(FMS-like tryosinekinase 3)结合，在多种疾病的病理生理过程中起重要的作用。FL可促进前B淋巴细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒T淋巴细胞(CTL)的增殖、分化和成熟，从而具有重要的抗肿瘤作用。
从19世纪开始，就发现一些细菌毒素有抗癌作用。现在已经知道，它们的抗癌作用主要是通过身体的免疫系统，因此都归因于免疫治疗或者生物治疗的范围内。溶血性链球菌的制剂，比较有名的有OK432。1972年樱井等报道，OK432对实验肿瘤的有杀伤效果。80年代的不少报道，指出了OK432激活免疫系统的作用。OK432亦常与其他治疗综合应用。OK432是由溶血性莲球菌株经青霉素处理、冷冻干燥制成的菌苗。主要通过免疫增强发挥其治疗作用，OK432的治疗作用由免疫细胞介导和细胞因子介导，激活的中性粒细胞能够杀死IFN-γ或者TNF-α处理的癌细胞。OK432诱导的中性粒细胞对自体瘤细胞的杀伤作用通过CD11b/CD18和ICAM-1之间的反应实现的。OK432诱导的单核细胞能够杀死自体瘤细胞，OK432刺激淋巴细胞后，显示出LAK细胞活性，这种激活的淋巴细胞对抗NK细胞的瘤细胞都显示出活性。
然而，本领域仍然存在培养自然杀伤细胞的方法的需求，例如仍然存在培养胎盘来源的自然杀伤细胞的方法的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养自然杀伤细胞的方法，尤其是提供一种培养胎盘来源的自然杀伤细胞的方法，本发明人从胎盘小叶组织中提取单个核细胞(mononuclearcell，MNC)，并在体外添加IL-15、FLT3-L细胞因子及OK432制剂诱导扩增NK细胞的方法，呈现优异的技术效果，本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了培养自然杀伤细胞的方法，其包括如下步骤：
(1)将细胞密度为0.5～1.5×106/mL(例如1×106/mL)胎盘MNC细胞悬液(例如20mL)接种至一个培养瓶(例如T75培养瓶)中，然后向培养瓶中添加IL-15 50ng/mL、FLT3-L10ng/mL、OK432 10ng/mL，混匀后将培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(2)每48h向培养瓶中补加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK43210ng/mL，每48～72h向培养瓶中补加NK细胞完全培养基，并调整细胞密度为0.5～1.5×106/mL，当培养的细胞悬液总体积达到200ml时，将细胞悬液转移至G-rex培养瓶中继续培养至14天；
(3)培养结束后，将细胞悬液吸出至离心瓶中，1500rpm、8min、25℃离心；结束后弃上清液，用PBS重悬细胞沉淀，得到自然杀伤细胞。
根据本发明第一方面的方法，步骤(1)和步骤(2)中随所述IL-15一起还添加氯化亚铁5μg/ml和苏氨酸60μg/ml。
根据本发明第一方面的方法，所述NK细胞完全培养基是以X vivo 15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5％血清替代物(serum replacement，/>)、1mM酪氨酸、2mM的L-谷氨酰胺。
根据本发明第一方面的方法，所述PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
根据本发明第一方面的方法，所述胎盘MNC细胞悬液是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(i)将胎盘小叶组织细胞沉淀用PBS重悬，充分混匀后，置于50ml离心管中，每管20ml；另准备若干50mL离心管，向每管内添加20ml的密度为1.077g/ml的聚蔗糖分离液，再将胎盘小叶组织细胞悬液用移液管小心的加到聚蔗糖分离液的上方，并不要扰乱两溶液之间的分层，每管终体积为40ml；
(ii)将离心管放入离心机中，将离心机的升速/降速均设置为0，进行600g、20min、4℃离心；离心结束后，离心管内的细胞悬液从上至下应分为4层：分别为PBS层、单个核细胞层、聚蔗糖分离液层、胎盘小叶细胞层；用移液管将上层PBS吸弃后，使用一次性巴氏滴管小心的吸取中间的单个核细胞层至一新的50ml离心管中，每管悬液不超过10ml，然后用PBS补齐至40ml，放入离心机中进行1400rpm、5min、4℃离心；
(iii)离心结束后，弃去上清液，再次用PBS重悬细胞沉淀，并定容至40ml，进行第二次1400rpm、5min、4℃离心；离心结束后，弃去上清液，沉淀用NK细胞完全培养基重悬细胞沉淀(必要时调整细胞密度，例如调整至1×106/mL)，得MNC细胞悬液。
根据本发明第一方面的方法，所述NK细胞完全培养基是以X vivo 15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5％血清替代物(serum replacement，)、1mM酪氨酸、2mM的L-谷氨酰胺。
根据本发明第一方面的方法，步骤(i)所述胎盘小叶组织细胞沉淀是照如下步骤的方法制备得到的：
(a)胎盘清洗：使用手术镊将胎盘组织取出，放入不锈钢托盘中，用含青霉素-链霉素-两性霉素的组织清洗液对胎盘表面进行冲洗，去除表面上的凝血污渍；
(b)用剪刀、镊子钝性剥离并丢弃胎盘表面的羊膜层，剪去其上的脐带组织；然后用剪刀将剩余的胎盘小叶组织剪成3～7cm3的小块，在250ml离心杯中添加25～30mL的HBSS缓冲液，将剪后的胎盘组织小块放入离心杯中，用剪子将小叶组织进一步剪碎成0.5～1mm3的大小，然后转移至300目筛网上，用HBSS缓冲液进行过滤，并使用HBSS缓冲液再清洗两次，清洗至滤液清澈；将清洗后的组织加入已预热至37℃的组织消化液100mL中，充分混匀，用封口膜封口后，于摇床中振荡消化30min(37℃，100rpm)；
(c)消化结束后，将装组织消化液的离心杯放入安全柜，倒入组织清洗液，使用300目滤网过滤；再用400ml组织清洗液多次洗涤组织，收集滤清液；将滤清液倾倒入若干250mL离心杯中，放入离心机，进行1500rpm、8min、25℃离心；离心结束后，弃上清液，再次用组织清洗液重悬细胞沉淀，充分混匀后再次以1500rpm、8min、25℃离心；
(d)离心结束后，弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞悬液，至50ml离心管中，以1800rpm、10min、25℃离心，离心结束后弃上清液，收集细胞，得到胎盘小叶组织细胞沉淀。
根据本发明第一方面的方法，所述组织清洗液是通过如下方式配制所得溶液：用0.9％氯化钠注射液配制成含青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml和0.25μg/ml两性霉素B的溶液，过滤除菌，即得。
根据本发明第一方面的方法，所述组织消化液是照如下方式制备得到的：
①向I型胶原酶粉末中添加PBS，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/ml的I型胶原酶溶液；
②向II型胶原酶粉末中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的II型胶原酶溶液；
③向DNA酶中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的DNA酶溶液；
④将以上所得I型胶原酶溶液、II型胶原酶溶液、DNA酶溶液按体积比5：5：7的比例进行混合，配置成为组织消化液。
根据本发明第一方面的方法，所述PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
根据本发明第一方面的方法，所述HBSS缓冲液是通过如下方式配制所得溶液：将8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.1g的MgSO4·7H2O、0.1g的MgCl2·6H2O、0.06g的Na2HPO4·2H2O、0.06g的KH2PO4、1.0g的葡萄糖、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHCO3加蒸馏水至1000ml溶解并调pH至7.4，过滤除菌，摇匀，即得。
根据本发明第一方面的方法，其包括实施例1～3所述的过程。
根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：
A：胎盘组织的消化
1、消化液的配置：
①向I型胶原酶粉末中添加PBS，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/ml的I型胶原酶溶液；[在本发明中，如未另外说明，所用的PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得]；
②向II型胶原酶粉末中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的II型胶原酶溶液；[在本发明中，如未另外说明，所用的HBSS缓冲液是通过如下方式配制所得溶液：将8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.1g的MgSO4·7H2O、0.1g的MgCl2·6H2O、0.06g的Na2HPO4·2H2O、0.06g的KH2PO4、1.0g的葡萄糖、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHCO3加蒸馏水至1000ml溶解并调pH至7.4，过滤除菌，摇匀，即得]；
③向DNA酶中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的DNA酶溶液；
④将以上所得I型胶原酶溶液、II型胶原酶溶液、DNA酶溶液按体积比5：5：7的比例进行混合，配置成为组织消化液；
2、胎盘清洗：使用手术镊将胎盘组织取出，放入不锈钢托盘中，用含青霉素-链霉素-两性霉素的组织清洗液对胎盘表面进行冲洗，去除表面上的凝血污渍；[在本发明中，如未另外说明，所用的组织清洗液是通过如下方式配制所得溶液：用0.9％氯化钠注射液配制成含青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml和0.25μg/ml两性霉素B的溶液，过滤除菌，即得]；
3、用剪刀、镊子钝性剥离并丢弃胎盘表面的羊膜层，剪去其上的脐带组织；然后用剪刀将剩余的胎盘小叶组织剪成3～7cm3的小块，在250ml离心杯中添加25～30mL的HBSS缓冲液，将剪后的胎盘组织小块放入离心杯中，用剪子将小叶组织进一步剪碎成0.5～1mm3的大小，然后转移至300目筛网上，用HBSS缓冲液进行过滤，并使用HBSS缓冲液再清洗两次，清洗至滤液清澈；将清洗后的组织加入已预热至37℃的组织消化液100mL中，充分混匀，用封口膜封口后，于摇床中振荡消化30min(37℃，100rpm)；
4、消化结束后，将装组织消化液的离心杯放入安全柜，倒入组织清洗液，使用300目滤网过滤；再用400ml组织清洗液多次洗涤组织，收集滤清液；将滤清液倾倒入若干250mL离心杯中，放入离心机，进行1500rpm、8min、25℃离心；离心结束后，弃上清液，再次用组织清洗液重悬细胞沉淀，充分混匀后再次以1500rpm、8min、25℃离心；
5、离心结束后，弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞悬液，至50ml离心管中，以1800rpm、10min、25℃离心，离心结束后弃上清液，收集细胞，得到胎盘小叶组织细胞沉淀；
B：胎盘单个核细胞的分离
1、将A中得到的胎盘小叶组织细胞沉淀用PBS重悬，充分混匀后，置于50ml离心管中，每管20ml；另准备若干50mL离心管，向每管内添加20ml的密度为1.077g/ml的聚蔗糖分离液(Ficoll400，货号F8150)，再将胎盘小叶组织细胞悬液用移液管小心的加到聚蔗糖分离液的上方，并不要扰乱两溶液之间的分层，每管终体积为40ml；
2、将离心管放入离心机中，将离心机的升速/降速均设置为0(无刹车)，进行600g(约2000rpm)、20min、4℃离心；离心结束后，离心管内的细胞悬液从上至下应分为4层：分别为PBS层、单个核细胞层、聚蔗糖分离液层、胎盘小叶细胞层；用移液管将上层PBS吸弃后，使用一次性巴氏滴管小心的吸取中间的单个核细胞层至一新的50ml离心管中，每管悬液不超过10ml，然后用PBS补齐至40ml，放入离心机中进行1400rpm、5min、4℃离心；
3、离心结束后，弃去上清液，再次用PBS重悬细胞沉淀，并定容至40ml，进行第二次1400rpm、5min、4℃离心；离心结束后，弃去上清液，沉淀用NK细胞完全培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞密度为1×106/mL，得MNC细胞悬液；[在本发明中，如未另外说明，所用的NK细胞完全培养基是以Xvivo 15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5％血清替代物(serum replacement，/>)、1mM酪氨酸、2mM的L-谷氨酰胺]；
C：胎盘来源的MNC扩增NK细胞
1、将实施例2所得细胞密度为1×106/mL胎盘MNC细胞悬液接种至T75培养瓶中，每瓶添加的细胞悬液20mL，然后向培养瓶中添加IL-15(白细胞介素-15)50ng/mL、FLT3-L(FLT3-配体)10ng/mL、OK432(一种由溶血性莲球菌Su株经青霉素处理、冷冻干燥制成的菌苗，)10ng/mL、氯化亚铁5μg/ml和苏氨酸60μg/ml，混匀后将培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中培养；[在本发明中，上述添加IL-15 50ng/mL是指向培养瓶中添加IL-15至其浓度达到50ng/mL，其它物料的添加的类似表述亦有类似含义]
2、每48h向培养瓶中补加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK43210ng/mL、氯化亚铁5μg/ml和苏氨酸60μg/ml，每48～72h向培养瓶中补加NK细胞完全培养基，并调整细胞密度为0.5～1.5×106/mL(必要时接种到若干T75培养瓶中)，当培养的细胞悬液总体积达到200ml时，将细胞悬液转移至G-rex培养瓶(Wilson Wolf Manufacturing公司)中继续培养至14天；
3、培养结束后，将细胞悬液吸出至250ml离心瓶中，1500rpm、8min、25℃离心；结束后弃上清液，用PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×106/mL，得到自然杀伤细胞。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明方法呈现如说明书所述优良技术效果。
附图说明
图1：NK细胞扩增生长曲线。
图2：NK细胞流式表型，其中CD3-CD56+的NK细胞表型为66.3％。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
实施例1：胎盘小叶组织的消化
1、消化液的配置：
①向I型胶原酶粉末中添加PBS，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/ml的I型胶原酶溶液；[在本发明中，如未另外说明，所用的PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得]；
②向II型胶原酶粉末中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的II型胶原酶溶液；[在本发明中，如未另外说明，所用的HBSS缓冲液是通过如下方式配制所得溶液：将8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.1g的MgSO4·7H2O、0.1g的MgCl2·6H2O、0.06g的Na2HPO4·2H2O、0.06g的KH2PO4、1.0g的葡萄糖、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHCO3加蒸馏水至1000ml溶解并调pH至7.4，过滤除菌，摇匀，即得]；
③向DNA酶中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的DNA酶溶液；
④将以上所得I型胶原酶溶液、II型胶原酶溶液、DNA酶溶液按体积比5：5：7的比例进行混合，配置成为组织消化液；
2、胎盘清洗：使用手术镊将胎盘组织(65g)取出，放入不锈钢托盘中，用含青霉素-链霉素-两性霉素的组织清洗液对胎盘表面进行冲洗，去除表面上的凝血污渍；[在本发明中，如未另外说明，所用的组织清洗液是通过如下方式配制所得溶液：用0.9％氯化钠注射液配制成含青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml和0.25μg/ml两性霉素B的溶液，过滤除菌，即得]；
3、用剪刀、镊子钝性剥离并丢弃胎盘表面的羊膜层，剪去其上的脐带组织。然后用剪刀将剩余的胎盘小叶组织剪成3～7cm3的小块，在250ml离心杯中添加25～30mL的HBSS缓冲液，将剪后的胎盘组织小块放入离心杯中，用剪子将小叶组织进一步剪碎成0.5～1mm3的大小，然后转移至300目筛网上，用HBSS缓冲液进行过滤，并使用HBSS缓冲液再清洗两次，清洗至滤液清澈。将清洗后的组织加入已预热至37℃的组织消化液100mL中，充分混匀，用封口膜封口后，于摇床中振荡消化30min(37℃，100rpm)。
4、消化结束后，将装组织消化液的离心杯放入安全柜，倒入组织清洗液，使用300目滤网过滤。再用400ml组织清洗液多次洗涤组织，收集滤清液。将滤清液倾倒入若干250mL离心杯中，放入离心机，进行1500rpm、8min、25℃离心。离心结束后，弃上清液，再次用组织清洗液重悬细胞沉淀，充分混匀后再次以1500rpm、8min、25℃离心。
5、离心结束后，弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞悬液，至50ml离心管中，以1800rpm、10min、25℃离心，离心结束后弃上清液，收集细胞，得到胎盘小叶组织细胞沉淀。
实施例2：胎盘单个核细胞的分离
1、将实施例1中得到的胎盘小叶组织细胞沉淀用PBS重悬，充分混匀后，置于50ml离心管中，每管20ml；另准备若干50mL离心管，向每管内添加20ml的密度为1.077g/ml的聚蔗糖分离液(Ficoll400，货号F8150)，再将胎盘小叶组织细胞悬液用移液管小心的加到聚蔗糖分离液的上方，并不要扰乱两溶液之间的分层，每管终体积为40ml；
2、将离心管放入离心机中，将离心机的升速/降速均设置为0(无刹车)，进行600g(约2000rpm)、20min、4℃离心；离心结束后，离心管内的细胞悬液从上至下应分为4层：分别为PBS层、单个核细胞层、聚蔗糖分离液层、胎盘小叶细胞层；用移液管将上层PBS吸弃后，使用一次性巴氏滴管小心的吸取中间的单个核细胞层至一新的50ml离心管中，每管悬液不超过10ml，然后用PBS补齐至40ml，放入离心机中进行1400rpm、5min、4℃离心；
3、离心结束后，弃去上清液，再次用PBS重悬细胞沉淀，并定容至40ml，进行第二次1400rpm、5min、4℃离心；离心结束后，弃去上清液，沉淀用NK细胞完全培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞密度为1×106/mL，得MNC细胞悬液。[在本发明中，如未另外说明，所用的NK细胞完全培养基是以Xvivo 15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5％血清替代物(serum replacement，/>)、1mM酪氨酸、2mM的L-谷氨酰胺]。
实施例3：胎盘来源的MNC扩增NK细胞
1、将实施例2所得细胞密度为1×106/mL胎盘MNC细胞悬液接种至T75培养瓶中，每瓶添加的细胞悬液20mL，然后向培养瓶中添加IL-15(白细胞介素-15)50ng/mL、FLT3-L(FLT3-配体)10ng/mL、OK432(一种由溶血性莲球菌Su株经青霉素处理、冷冻干燥制成的菌苗，)10ng/mL、氯化亚铁5μg/ml和苏氨酸60μg/ml，混匀后将培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中培养；[在本发明中，上述添加IL-15 50ng/mL是指向培养瓶中添加IL-15至其浓度达到50ng/mL，其它物料的添加的类似表述亦有类似含义]
2、每48h向培养瓶中补加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK432 10ng/mL、氯化亚铁5μg/ml和苏氨酸60μg/ml，每48～72h向培养瓶中补加NK细胞完全培养基，并调整细胞密度为0.5～1.5×106/mL(必要时接种到若干T75培养瓶中)，当培养的细胞悬液总体积达到200ml时，将细胞悬液转移至G-rex培养瓶(Wilson Wolf Manufacturing公司)中继续培养至14天；
3、培养结束后，将细胞悬液吸出至250ml离心瓶中，1500rpm、8min、25℃离心；结束后弃上清液，用PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×106/mL，得到自然杀伤细胞，计算扩增后的细胞比例和数量。
以下提供一些补充的实施例以进一步对本发明进行说明。实施例3a：参照实施例3进行胎盘来源的MNC扩增NK细胞，不同的仅是各操作中不添加氯化亚铁也不添加苏氨酸，得到自然杀伤细胞，并计算扩增后的细胞比例和数量。实施例3b：参照实施例3进行胎盘来源的MNC扩增NK细胞，不同的仅是各操作中不添加氯化亚铁，得到自然杀伤细胞，并计算扩增后的细胞比例和数量。实施例3c：参照实施例3进行胎盘来源的MNC扩增NK细胞，不同的仅是各操作中不添加苏氨酸，得到自然杀伤细胞，并计算扩增后的细胞比例和数量。实施例3d：参照实施例3进行胎盘来源的MNC扩增NK细胞，不同的仅是各操作中添加的氯化亚铁改为等摩尔量的氯化铁，得到自然杀伤细胞，并计算扩增后的细胞比例和数量。
实施例4：胎盘来源的NK细胞表型检测
1、将实施例3所得扩增后的细胞悬液调整密度为1×106/mL，取一流式试管，向试管中添加5ul的CD3-PE抗体(Invitrogen公司)，5ul的CD56-APC抗体(Invitrogen公司)，将细胞悬液200ul加入至流式管内，充分震荡混匀，在4℃下，避光孵育30min，赋予结束后，向试管内添加1ml的PBS，300g、5min、4℃离心。离心结束后，弃上清液，沉淀用500ul的PBS重悬后，混匀上机检测。
2、打开BD FACSCantoII型流式细胞仪，预热后打开FACSDiva分析软件，创建FSC-SSC散点图，并以淋巴细胞、单核细胞设门P1，另建四象限散点图FL1-FL2，以CD3为横坐标，CD56为纵坐标，观察扩增后的NK细胞表型，计算NK细胞的扩增倍数和效率。
图1显示了实施例1～3方法所得NK细胞扩增生长曲线，图2显示了实施例1～3方法所得NK细胞流式表型，其中CD3-CD56+的NK细胞表型为66.3％。
通过实施例1～3过程(即实施例3所得NK细胞)的NK细胞扩增效率的结果如下：初始胎盘单个核细胞总数＝2.8×107、收获细胞总数＝2.09×109、扩增倍数＝74.6倍、细胞活率＝99.9％、CD3-CD56+NK细胞比例＝66.3％、初始NK细胞数量＝0.9×106、收获后NK细胞数量＝1.38×109、NK细胞扩增倍数＝1533倍。
另外参照本实施例4的方法测试实施例3a～3d所得NK细胞。实施例3a方法的NK细胞扩增效率结果为：收获细胞总数＝0.87×109、扩增倍数＝31倍、细胞活率＝95.2％、CD3-CD56+NK细胞比例＝25.1％、收获后NK细胞数量＝0.37×109、NK细胞扩增倍数＝411倍；实施例3b～3d方法的NK细胞扩增效率结果为：扩增倍数＝28～32倍、细胞活率＝94.4％～95.7％、CD3-CD56+NK细胞比例＝24.4％～25.6％、NK细胞扩增倍数＝374～432倍。
上述结果表明，本发明所述方法可以有效的扩增胎盘小叶组织来源的单个核细胞向NK细胞分化、扩增。总扩增倍数约74.6倍，总细胞数2.09×10E9；NK细胞扩增倍数1533倍，NK细胞收获总数1.38×10E9，NK细胞比例(纯度)66.3％；明显优于其他方法培养的NK细胞。尤其是，本发明出人意料地发现，在进行NK细胞扩增时，通过向细胞培养液中同时增补添加氯化亚铁和苏氨酸能够显著提高NK细胞的扩增效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。

Claims (9)

1.培养自然杀伤细胞的方法，其包括如下步骤：
(1)将细胞密度为（0.5~1.5）×106/mL的胎盘MNC细胞悬液20mL接种至一个T75培养瓶中，然后向培养瓶中添加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK432 10ng/mL、氯化亚铁5µg/ml和苏氨酸60µg/ml，混匀后将培养瓶置于37℃、5% CO2培养箱中培养；
(2)每48h向培养瓶中补加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK432 10ng/mL、氯化亚铁5µg/ml和苏氨酸60µg/ml，每48～72h向培养瓶中补加NK细胞完全培养基，并调整细胞密度为（0.5～1.5）×106/mL，当培养的细胞悬液总体积达到200ml时，将细胞悬液转移至G-rex培养瓶中继续培养至14天；
(3)培养结束后，将细胞悬液吸出至离心瓶中，1500rpm、8min、25℃离心；结束后弃上清液，用PBS重悬细胞沉淀，得到自然杀伤细胞。
2.根据权利要求1的方法，所述NK细胞完全培养基是以X vivo 15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5%的Helios®血清替代物、1mM酪氨酸、2mM的L-谷氨酰胺。
3.根据权利要求1的方法，所述PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
4.根据权利要求1的方法，所述胎盘MNC细胞悬液是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(i)将胎盘小叶组织细胞沉淀用PBS重悬，充分混匀后，置于50ml离心管中，每管20ml；另准备若干50mL离心管，向每管内添加20ml的密度为1.077g/ml的聚蔗糖分离液，再将胎盘小叶组织细胞悬液用移液管小心的加到聚蔗糖分离液的上方，并不要扰乱两溶液之间的分层，每管终体积为40ml；
(ii)将离心管放入离心机中，将离心机的升速/降速均设置为0，进行600g、20min、4℃离心；离心结束后，离心管内的细胞悬液从上至下应分为4层：分别为PBS层、单个核细胞层、聚蔗糖分离液层、胎盘小叶细胞层；用移液管将上层PBS吸弃后，使用一次性巴氏滴管小心的吸取中间的单个核细胞层至一新的50ml离心管中，每管悬液不超过10ml，然后用PBS补齐至40ml，放入离心机中进行1400rpm、5min、4℃离心；
(iii)离心结束后，弃去上清液，再次用PBS重悬细胞沉淀，并定容至40ml，进行第二次1400rpm、5min、4℃离心；离心结束后，弃去上清液，沉淀用NK细胞完全培养基重悬细胞沉淀，得MNC细胞悬液；
其中，步骤(i)所述胎盘小叶组织细胞沉淀是照如下步骤的方法制备得到的：
(a)胎盘清洗：使用手术镊将胎盘组织取出，放入不锈钢托盘中，用含青霉素-链霉素-两性霉素的组织清洗液对胎盘表面进行冲洗，去除表面上的凝血污渍；
(b)用剪刀、镊子钝性剥离并丢弃胎盘表面的羊膜层，剪去其上的脐带组织；然后用剪刀将剩余的胎盘小叶组织剪成3~7cm3的小块，在250ml离心杯中添加25～30mL的HBSS缓冲液，将剪后的胎盘组织小块放入离心杯中，用剪子将小叶组织进一步剪碎成0.5～1mm3的大小，然后转移至300目筛网上，用HBSS缓冲液进行过滤，并使用HBSS缓冲液再清洗两次，清洗至滤液清澈；将清洗后的组织加入已预热至37℃的组织消化液100mL中，充分混匀，用封口膜封口后，于37℃、100rpm的摇床中振荡消化30min；
(c)消化结束后，将装组织消化液的离心杯放入安全柜，倒入组织清洗液，使用300目滤网过滤；再用400ml组织清洗液多次洗涤组织，收集滤清液；将滤清液倾倒入若干250mL离心杯中，放入离心机，进行1500rpm、8min、25℃离心；离心结束后，弃上清液，再次用组织清洗液重悬细胞沉淀，充分混匀后再次以1500rpm、8min、25℃离心；
(d)离心结束后，弃上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞悬液，至50ml离心管中，以1800rpm、10min、25℃离心，离心结束后弃上清液，收集细胞，得到胎盘小叶组织细胞沉淀。
5.根据权利要求4的方法，所述NK细胞完全培养基是以X vivo 15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5%的Helios®血清替代物、1mM酪氨酸、2mM的L-谷氨酰胺。
6.根据权利要求4的方法，所述组织清洗液是通过如下方式配制所得溶液：用0.9%氯化钠注射液配制成含青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml和0.25µg/ml两性霉素B的溶液，过滤除菌，即得。
7.根据权利要求4的方法，所述组织消化液是照如下方式制备得到的：
①向I型胶原酶粉末中添加PBS，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/ml的I型胶原酶溶液；
②向II型胶原酶粉末中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的II型胶原酶溶液；
③向DNA酶中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的DNA酶溶液；
④将以上所得I型胶原酶溶液、II型胶原酶溶液、DNA酶溶液按体积比5：5：7的比例进行混合，配置成为组织消化液。
8.根据权利要求4的方法，所述HBSS缓冲液是通过如下方式配制所得溶液：将8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.1g的MgSO4·7H2O、0.1g的MgCl2·6H2O、0.06g的Na2HPO4·2H2O、0.06g的KH2PO4、1.0g的葡萄糖、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHCO3加蒸馏水至1000ml溶解并调pH至7.4，过滤除菌，摇匀，即得。
9.根据权利要求1的方法，其包括如下步骤：
A：胎盘组织的消化
(1)消化液的配置：
①向I型胶原酶粉末中添加PBS，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/ml的I型胶原酶溶液；所用的PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得；
②向II型胶原酶粉末中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的II型胶原酶溶液；所用的HBSS缓冲液是通过如下方式配制所得溶液：将8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.1g的MgSO4·7H2O、0.1g的MgCl2·6H2O、0.06g的Na2HPO4·2H2O、0.06g的KH2PO4、1.0g的葡萄糖、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHCO3加蒸馏水至1000ml溶解并调pH至7.4，过滤除菌，摇匀，即得；
③向DNA酶中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的DNA酶溶液；
④将以上所得I型胶原酶溶液、II型胶原酶溶液、DNA酶溶液按体积比5：5：7的比例进行混合，配置成为组织消化液；
(2)胎盘清洗：使用手术镊将胎盘组织取出，放入不锈钢托盘中，用含青霉素-链霉素-两性霉素的组织清洗液对胎盘表面进行冲洗，去除表面上的凝血污渍；所用的组织清洗液是通过如下方式配制所得溶液：用0.9%氯化钠注射液配制成含青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml和0.25µg/ml两性霉素B的溶液，过滤除菌，即得；
(3)用剪刀、镊子钝性剥离并丢弃胎盘表面的羊膜层，剪去其上的脐带组织；然后用剪刀将剩余的胎盘小叶组织剪成3~7cm3的小块，在250ml离心杯中添加25～30mL的HBSS缓冲液，将剪后的胎盘组织小块放入离心杯中，用剪子将小叶组织进一步剪碎成0.5～1mm3的大小，然后转移至300目筛网上，用HBSS缓冲液进行过滤，并使用HBSS缓冲液再清洗两次，清洗至滤液清澈；将清洗后的组织加入已预热至37℃的组织消化液100mL中，充分混匀，用封口膜封口后，于37℃、100rpm摇床中振荡消化30min；
(4)消化结束后，将装组织消化液的离心杯放入安全柜，倒入组织清洗液，使用300目滤网过滤；再用400ml组织清洗液多次洗涤组织，收集滤清液；将滤清液倾倒入若干250mL离心杯中，放入离心机，进行1500rpm、8min、25℃离心；离心结束后，弃上清液，再次用组织清洗液重悬细胞沉淀，充分混匀后再次以1500rpm、8min、25℃离心；
(5)离心结束后，弃上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞悬液，至50ml离心管中，以1800rpm、10min、25℃离心，离心结束后弃上清液，收集细胞，得到胎盘小叶组织细胞沉淀；
B：胎盘单个核细胞的分离
(1)将步骤A所得胎盘小叶组织细胞沉淀用PBS重悬，充分混匀后，置于50ml离心管中，每管20ml；另准备若干50mL离心管，向每管内添加20ml的密度为1.077g/ml的聚蔗糖分离液，再将胎盘小叶组织细胞悬液用移液管小心的加到聚蔗糖分离液的上方，并不要扰乱两溶液之间的分层，每管终体积为40ml；
(2)将离心管放入离心机中，将离心机的升速/降速均设置为0，进行600g、20min、4℃离心；离心结束后，离心管内的细胞悬液从上至下应分为4层：分别为PBS层、单个核细胞层、聚蔗糖分离液层、胎盘小叶细胞层；用移液管将上层PBS吸弃后，使用一次性巴氏滴管小心的吸取中间的单个核细胞层至一新的50ml离心管中，每管悬液不超过10ml，然后用PBS补齐至40ml，放入离心机中进行1400rpm、5min、4℃离心；
(3)离心结束后，弃去上清液，再次用PBS重悬细胞沉淀，并定容至40ml，进行第二次1400rpm、5min、4℃离心；离心结束后，弃去上清液，沉淀用NK细胞完全培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞密度为1×106/mL，得MNC细胞悬液；所用的NK细胞完全培养基是以X vivo15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5%的Helios®血清替代物、1mM酪氨酸、2mM的L-谷氨酰胺；
C：胎盘来源的MNC扩增NK细胞
(1)将步骤B所得细胞密度为1×106/mL胎盘MNC细胞悬液接种至T75培养瓶中，每瓶添加的细胞悬液20mL，然后向培养瓶中添加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK432 10ng/mL、氯化亚铁5µg/ml和苏氨酸60µg/ml，混匀后将培养瓶置于37℃、5% CO2培养箱中培养；
(2)每48h向培养瓶中补加IL-15 50ng/mL、FLT3-L 10ng/mL、OK432 10ng/mL、氯化亚铁5µg/ml和苏氨酸60µg/ml，每48～72h向培养瓶中补加NK细胞完全培养基，并调整细胞密度为（0.5～1.5）×106/mL，当培养的细胞悬液总体积达到200ml时，将细胞悬液转移至G-rex培养瓶中继续培养至14天；
(3)培养结束后，将细胞悬液吸出至250ml离心瓶中，1500rpm、8min、25℃离心；结束后弃上清液，用PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×106/mL，得到自然杀伤细胞。
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