TWI669400B - 用於體外擴增自然殺手細胞及自然殺手ｔ細胞之無血清細胞培養液 - Google Patents

用於體外擴增自然殺手細胞及自然殺手ｔ細胞之無血清細胞培養液 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種用於體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之無血 清細胞培養液，其係包含一基礎培養基、一人類介白素-2重組蛋白(rhIL-2)、一肝素以及一抗CD3單株抗體(anti-CD3 monoclonal antibody)，其特徵在於，該細胞培養液於體外擴增自然殺手細胞(NK cells)及自然殺手T細胞(NKT cells)時不需添加血清，即可有效地增殖NK/NKT細胞，並且具備高細胞毒殺性，以能製備為醫藥組成物之用。

Description

用於體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之無血清細胞培養液
本發明係關於一種用於體外擴增自然殺手細胞(NK細胞)及自然殺手T細胞(NKT細胞)之細胞培養液，尤其指一種無需添加血清，即可於體外擴增三至七千倍NK/NKT細胞之細胞培養液，且該細胞培養液所擴增之NK/NKT細胞，其細胞存活率高於85%，具活性之NK/NKT細胞達50%以上，對癌細胞之毒殺效果更達76%以上。
免疫治療(Immunotherapy)，泛指透過強化生物體自身免疫系統，或是外加式地賦予生物體免疫能力來預防及治療疾病的方式，其具備高度專一性、高效率以及持久性等特性；近十年來，由免疫治療之概念所衍生之免疫細胞治療(immune cell therapy)亦逐漸被廣為探討。
2011年，免疫細胞治療首先於國際期刊Nature中被提出具潛力之評論，其被視為可能治癒癌症之治療方法；免疫細胞療法著重於刺激免疫系統，而能破壞手術(如放射線治療或化學治療)後殘留的癌細胞，進而提高療效，並減少手術或化、放療的毒性作用，以提升病患的生活品質及預後；舉例而言，以免疫細胞療法治療癌症，係自患者之血液中分離出免疫細胞，經適當之體外培 養、放大及活化後，再次輸回患者體內，以對體內特定組織之腫瘤產生專一性之免疫反應，利用自身的免疫細胞回輸以進行治療亦可避免產生免疫排斥反應；所述之免疫細胞中，由於自然殺手細胞(Nature killer cells,NK cells)無須透過抗原呈現細胞呈現抗原即可直接對標的細胞進行毒殺，因此被預測其相較於T細胞而言具有更高的抗腫瘤效率。
自然殺手細胞在人體免疫系統中作為對抗外來物質之第一道防線，由於其細胞表面缺乏專一性之抗原受體(TCR)，故其所引發之免疫反應為非專一性之防禦，自然殺手細胞係位於周邊血液循環中，可攻擊受病毒感染之細胞，使人體免於病毒之感染，亦可對腫瘤細胞及骨髓移植產生排斥反應以攻擊此些外來細胞，當自然殺手細胞與此些異質細胞接觸後，即驅動其活化受體(activating receptor)，因而活化其自身，並促使自然殺手細胞釋出穿孔素(perforin)及顆粒酶(granzyme)等因子；穿孔素將在標的異質細胞膜形成孔洞，接著顆粒酶進入該標的異質細胞後，改變粒線體膜之通透性，並活化細胞凋亡(apoptosis)相關之蛋白質以啟動細胞凋亡(apoptosis)反應，進而使標的異質細胞中DNA片斷化並導致細胞分解；此外，自然殺手T細胞係一群同時表現T細胞表面抗原(如：CD3、TCRαβ)及自然殺手細胞表面抗原(如：CD56)之異質性免疫細胞，因此其可同時誘發如同T細胞之專一性免疫反應，以及如同NK細胞之非專一性免疫反應，亦被視為發展免疫細胞治療之一大重點。
然而，習知自然殺手細胞體外擴增技術仍需仰賴宿主血漿或血清，或其他動物來源之血清，以提供充足之營養成分供細胞生長，於製備過程中添加其他動物來源之血清物質，可能造成細胞接收者之排斥反應，而於製備 過程中添加宿主血漿或血清，則所擴增之細胞將僅能限於宿主使用，成為臨床上發展免疫細胞治療上一大瓶頸，據此，本發明遂提出以解決上述習知問題。
本發明於一方面，係提供一種用於體外擴增自然殺手細胞(NK細胞)及自然殺手T細胞(NKT細胞)之無血清細胞培養液，該無血清細胞培養液用於擴增NK/NKT細胞時不需額外添加血漿或血清，如此以解決生物體對異質來源血漿或血清產生排斥現象之問題。
於是，本發明之一方面係關於一種用於體外擴增自然殺手細胞(NK cells)及自然殺手T細胞(NKT cells)之細胞培養液，其係包含：一基礎培養基；一人類介白素-2重組蛋白(rhIL-2)，其濃度範圍係介於50至1,500IU/mL；一肝素，其濃度範圍係介於1至15U/mL；以及一抗CD3單株抗體(anti-CD3 monoclonal antibody)，其濃度範圍係介於30至600ng/mL。
於本發明之一些具體實施態樣，該人類介白素-2重組蛋白之濃度範圍係介於100至1,000IU/mL。
於本發明之一些具體實施態樣，該肝素之濃度範圍係介於2至10U/mL。
於本發明之一些具體實施態樣，該抗CD-3單株抗體之濃度範圍係介於50至500ng/mL。
於本發明之一些具體實施態樣，該自然殺手細胞係CD16+CD56+CD3-之細胞群落，且該自然殺手T細胞係CD16+CD56+CD3+之細胞群落。
於本發明之一些具體實施態樣，該自然殺手細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+NKG2D+CD3-之細胞群落。
於本發明之一些具體實施態樣，該自然殺手T細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+NKG2D+CD3+之細胞群落。
圖1A-1B係經擴增之自然殺手細胞(NK細胞)/自然殺手T細胞(NKT細胞)之比例分析；圖2A-2B係經擴增之自然殺手細胞(NK細胞)/自然殺手T細胞(NKT細胞)之比例分析；圖3係係經擴增之自然殺手細胞(NK細胞)/自然殺手T細胞(NKT細胞)之細胞毒殺能力分析。
有鑑於習知技術對於體外擴增自然殺手細胞(NK細胞)以及自然殺手T細胞(NKT細胞)仍存在諸多待改善之處，至今仍需仰賴宿主血漿或血清，或其他動物來源之血清，以提供細胞生長所需之營養成分，然而，於製備過程中添加其他動物來源之血清物質，可能造成細胞接收者之排斥反應，而於製備 過程中添加宿主血漿或血清，則所擴增之細胞將僅能限於宿主使用，成為臨床上發展免疫細胞治療上一大瓶頸；據此，本發明提出一種用於體外擴增自然殺手細胞(NK細胞)及自然殺手T細胞(NKT細胞)之無血清細胞培養液，並搭配特定之製備方法以能有效擴增NK/NKT細胞，以改善習知技術之不足；以下，將針對本發明之技術手段及特點進行說明。
定義
用於本說明書，術語”自然殺手細胞”(Nature killer cell；NK cell)意指一種隸屬於先天免疫系統(innate immune system)之毒殺性淋巴球(cytotoxic lymphocyte)，可被誘發以執行非專一性細胞毒殺效應。
用於本說明書，術語”自然殺手細胞”(Nature killer T cell；NKT cell)意指一種同時表達αβT細胞受體(TCR)以及與自然殺手細胞相關分子標記之免疫細胞，其同時具備專一性之細胞免疫毒殺性以及非專一性之細胞免疫毒殺性。
用於本說明書，術語”單核球細胞”(peripheral mononuclear cells,PBMCs)意指一種具單一細胞核且細胞核形態為圓形之細胞，其包含T細胞、B細胞及NK細胞等淋巴細胞(lymphocyte)、單核細胞(monocyte)及樹突細胞(dendritic cell)，位於周邊血中的單核球細胞又可稱周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。
材料與方法
試劑製備
細胞基礎培養基(medium)
本發明之一實施例係使用SILAC Advanced DMEM/F-12(GibcoTM)、UltraGROTM或RPMI-1640 medium(Sigma)做為基礎培養基，其均包含細胞生長及分裂所需之生長因子(growth factor)及細胞因子(cytokine)，且原始包裝皆為液體培養基，並於分裝後保存於適當之溫度以備用。
人類重組介白素-2(recombinant human interleukin-2,rhIL-2)
於無菌作業環境下，取無菌針筒取1毫升(mL)無菌水，注入含有1.1毫克(mg)rhIL-2粉末(Proleukin®)之容器中，均勻溶解後獲得濃度為1.1毫克/毫升(mg/mL)之rhIL-2原液，接著以無菌針筒將rhIL-2原液取出，並放置於50mL離心管中，再加入43mL之細胞培養基以將rhIL-2溶液之濃度調整為500單位/微升(U/μl)，以獲得rhIL-2稀釋溶液；將rhIL-2稀釋溶液分裝至微量無菌離心管中，保存於-20℃冰箱備用。
抗-分化簇3之單株抗體(Anti-cluster of differentiation-3 monoclonal antibody,Anti-CD3 mAb)
於無菌作業環境下，將Anti-CD3單株抗體原液(濃度為1mg之Anti-CD3單株抗體溶於1mL溶劑中)自原始包裝(Takara)中取出，接著將Anti-CD3單株抗體原液混合至4mL之細胞培養基中，以將Anti-CD3單株抗體溶液之濃度稀釋為20μg/mL；將Anti-CD3單株抗體溶液稀釋溶液分裝至微量無菌離心管中，保存於-20℃冰箱備用。
肝素(Heparin)
在無菌作業環境下，將肝素原液(台裕衛署藥製字057221號)分裝於1mL離心管，保存於-20℃冰箱備用。
擴增自然殺手細胞(NK cell)/自然殺手T細胞(NKT cell)之無血清細胞培養液
取前述之rhIL-2稀釋溶液、Anti-CD3單株抗體稀釋溶液及肝素分別加入前述三種不同細胞基礎培養基中，均勻混合以配置成三種用以擴增自然殺手細胞/自然殺手T細胞之無血清細胞培養液，所述之無血清細胞培養液於一較佳實施例中包含終濃度為100~1,000IU/mL之rhIL-2、終濃度為50~500ng/mL之Anti-CD3單株抗體以及終濃度為2至10U/mL之肝素。
周邊血檢體
由醫院醫師門診採集受試者之周邊血檢體並保存於無菌採血管中，依據規範將檢體運輸至人體細胞組織優良操作(Good Tissue Practice,GTP)核心實驗室，以進行後續處理。
細胞(cell)
製備周邊血單核球細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)
將周邊血從採血管轉移到50mL離心管中進行梯度離心，其係設定離心機(AUBOCA,4000/4200)之離心力為600xg，並關閉離心機之煞車功能，於室溫下離心10分鐘以將周邊血檢體分為三層，由上而下分別為血漿(Plasma)、白細胞層(Buffy coat)與紅血球(Erythrocytes)；接著將血漿層去除並轉移白細胞層至新的無菌離心管中，再使用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)緩慢地將白細胞混合以獲得白細胞稀釋溶液；另一方面，取1~3mL之單核球細胞分離液(Ficoll-Paque Plus)置於單核球分離離心管中，於室溫下以600xg離心力離心30秒後備用；接著，取前述之白細胞稀釋溶液加入含有單核球細胞分離液之單核球分離離心管中，於室溫下以600xg離心力離心10分鐘以分層，接續移除上清液，轉移白色中 間層(即周邊血單核球細胞)至新的無菌離心管中，加入HBSS均勻混合以清洗細胞，於室溫下離心10分鐘後去除上清液，接著再次以HBSS重新懸浮細胞，於室溫下離心10分鐘，分別收集上清液及周邊血單核球細胞以備用。
細胞測試
細胞表面抗原分析
取1x106cells於15mL離心管中，以離心力500g離心5分鐘後去除上清液，再以4mL杜比可磷酸緩衝溶液(Dulbeccos Phosphate Buffered Saline,DPBS)重新懸浮細胞，並重複此步驟兩次，接著加入5μl之細胞螢光標記試劑，於4℃中避光反應15分鐘，接著，加入4mL DPBS清洗細胞，以離心力500g離心5分鐘後去除上清液，最後加入0.5mL DPBS重新懸浮細胞，接續以流式細胞儀(SONY；SH800Z)分析並定量細胞表面之螢光標記；前述之細胞螢光標記試劑包含與T細胞相關之螢光標記Anti-CD3 mAb(Invitrogen；Cat# 11-0038-42)，以及與NK細胞相關之螢光標記Anti-CD16 mAb(Invitrogen；Cat# 17-0168-42)、Anti-CD56 mAb(Invitrogen；Cat#12-0567-41)及Anti-CD314(NKG2D)mAb(BD；Cat# 562365)。
細胞毒殺性測試
試驗係以擴增後之NK/NKT細胞做為效應細胞(effecter cells)，並以K562細胞株做為毒殺標的細胞(target cells)，將效應細胞及標的細胞以1：1混合後培養4小時，再以染劑7-AAD進行細胞染色，由於7-AAD無法通透正常細胞之細胞膜，僅能通透處於細胞凋亡過程或者已凋亡之細胞，因此可藉由偵測細胞中7-AAD之訊號以做為細胞凋亡之依據。
細胞計數
自細胞培養盤中取得欲分析細胞存活率之細胞樣本，以微量吸管將細胞樣本均勻懸浮以獲得細胞懸浮液，接著取20μl之細胞懸浮液與20μl之0.4%台盼蘭染劑(Trypan blue；Gibco；Cat# 15250-061)均勻混合以獲得細胞混合液，再以微量吸管取10~20μl之細胞混合液注入蓋玻片與細胞計數盤(Marienfeld；Cat# AP-0650030)之間的凹槽，接著將細胞計數盤置於顯微鏡下觀察，待細胞靜止後即開始計數細胞。
細胞計數盤之四個角落分別包括一4*4之區域，計數範圍則包括所述之四個區域；計數四個區域中之亮細胞，獲得活細胞之數量，再計數四個區域中之暗色細胞及深藍色細胞，獲得死細胞之數量，再以此些數值計算細胞密度、細胞總數及細胞存活率等參數值；其中，細胞密度(cells/ml)=(四區域活細胞數/4)x(稀釋倍數2)x 104/mL；細胞總數(cells)=細胞密度(cells/ml)x細胞培養液體積(mL)；細胞存活率%=活細胞數(cells)/(活細胞數+死細胞數)(cells)x%。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
實施例
實施例1、無血清培養液之測試
本實施例目的係建立可用於體外擴增自然殺手細胞(NK cell)/自然殺手T細胞(NKT cell)之無血清細胞培養液，且此細胞培養液不需額外添加周 邊血檢體來源之自體血漿或血清，或其他動物來源之血清；其係如前述方法取得周邊血單核球細胞，分別以該周邊血檢體來源者之自體血清、SILAC Advanced DMEM/F-12、UltraGROTM或RPMI-1640 medium四種細胞培養液進行培養，其中，該周邊血檢體來源者之自體血清係包含500IU/ml之rhIL-2及50ng/ml之Anti-CD3單株抗體，SILAC Advanced DMEM/F-12、UltraGROTM及RPMI-1640 medium則係分別包含500IU/ml之rhIL-2、50ng/ml之Anti-CD3單株抗體及2U/ml之肝素，經培養後，再透過前述之細胞計數方法進行細胞密度評估；結果如表一所示，無論是以自體血清或以不含血清之細胞培養液進行培養，皆可擴增至少3,000倍之細胞數；據此，以本實施例之不含血清之細胞培養液確實可有效地擴增NK/NKT細胞。
於本實施例中，由於擴增NK/NKT細胞之過程中未添加宿主自體血漿或血清，因此擴增所得之NK/NKT細胞可施用於宿主本身或非宿主之接收者，如此，當需接受細胞治療者因患病而體弱時，則可免於自身細胞數不足以進行體外擴增之擔憂，可依據本發明之細胞培養液及其用於擴增NK/NKT細胞之步驟，自他人取得周邊血單核球細胞後進行擴增培養，再施用於患者，將不再有僅能施用自體細胞之侷限。
實施例2、初始細胞數之優化
承上，本實施例接續探討以無血清之細胞培養液擴增NK/NKT細胞時之較佳初始細胞密度，其係如前述方法取得周邊血單核球細胞，以UltraGROTM做為基礎培養基，並添加500IU/ml之rhIL-2、50ng/ml之Anti-CD3單株抗體及2U/ml之肝素進行培養，再透過前述之細胞計數方法進行細胞密度評估。
如表二所示，其係分別以初始細胞密度1.00 x106、2.00x106、3.00 x106及5.00 x106cells/ml進行培養，並於培養後第5、7、9、12、14、16、18及20天自培養盤取出細胞進行計數，並將細胞密度重新調整為1.00 x106cells/ml，由結果可以得知，以此些初始細胞密度進行體外擴增NK/NKT細胞時，皆能將細胞存活率維持在90%以上，其中，以2.00 x106cells/ml之初始細胞密度進行培養時，其細胞擴增效率最好，擴增後所能獲得之細胞數亦為最多；據此，本發明之一實施例中，可選用1.00 x106、2.00x106、3.00 x106及5.00 x106cells/ml之初始細胞密度進行培養，於一較佳實施例中，係以1.5 x106~2.5x106cells/ml作為體外擴增自然殺手細胞/自然殺手T細胞之初始細胞密度。
表二、
實施例3、無血清細胞培養液中肝素(Heparin)濃度之優化
於本發明之一實施例中，係以肝素做為取代血清之部分角色，因此本實施例接續探討，在實施例1及2所建立之無血清細胞培養液及初使細胞密度之培養條件下，可進一步提升細胞生長效率之肝素濃度；其係取得前述之周邊血單核球細胞，以一較佳實施例2.00 x106cells/mL為初始細胞密度，使用UltraGROTM細胞培養液(包含500IU/ml之rhIL-2及50ng/ml之Anti-CD3單株抗體)進行培養，試驗組別分別為包含2、5或10U/ml之肝素。
如表三所示，使用2U/ml肝素進行培養之組別，其細胞擴增趨勢最為穩定，且於培養第20天時所能獲得之細胞總數較其他組別多1.5~4倍，整體而言，加入肝素後並未對擴增後細胞總數造成負面影響；據此，本發明之一實施例係可以2至10U/ml之肝素進行培養，由本實施例之結果亦可得知，本實施例 所用以擴增細胞之細胞培養液，可進一步幫助免疫細胞生長，亦即，本發明之一實施例中所選用之肝素濃度得以提高擴增後之細胞群中NK/NKT細胞比例。
實施例4、無血清細胞培養液中介白素-2(IL-2)濃度之優化
由於細胞擴增培養時，細胞培養液中的添加物使用量亦影響細胞生長效率，因此本實施例接續探討，在實施例1至3所建立之培養條件下，可進一步提升細胞生長效率之rhIL-2濃度；其係取得前述之周邊血單核球細胞，以一較佳實施例2.00 x106cells/mL為初始細胞密度，使用UltraGROTM細胞培養液(包含2U/ml之肝素及50ng/ml之Anti-CD3單株抗體)進行培養，試驗組別分別為包含100、250、500或1,000IU/ml之rhIL-2；如表四所示，結果說明了使用100~1,000IU/ml rhIL-2進行培養後，細胞仍能維持穩定之生長趨勢，據此，本發明之一實施例係可以100至1,000IU/ml之rhIL-2進行培養，由本實施例之結果亦可得知，本發明所用以擴增細胞之細胞培養液，可進一步幫助免疫細胞生長，亦即，本 發明之一實施例中所選用之rhIL-2濃度得以提高擴增後之細胞群中NK/NKT細胞總數。
實施例5、無血清細胞培養液中抗-分化簇-3(CD-3)之抗體濃度之優化
體外擴增之免疫細胞係應用於人體中以提升免疫力，進而對腫瘤細胞進行毒殺作用，為了能提高體外擴增之免疫細胞進入人體後所產生的免疫毒殺效能，除了需增殖大量的細胞外，所獲得之細胞亦需具備細胞毒殺性，於此，本實施例進一步探討用以於體外活化NK/NKT細胞之Anti CD-3單株抗體，其於擴增培養細胞的過程中較佳之用量；其係取得前述之周邊單核球細胞，以一較佳實施例2.00 x106cells/mL為初始細胞密度，使用UltraGROTM細胞培養液(包含2U/ml之肝素及500IU/ml之rhIL-2)進行培養，試驗組別分別為包含50、100、250或500ng/ml之Anti-CD3單株抗體。
如表五所示，使用50、100及500ng/ml之Anti-CD3單株抗體進行培養之組別，相較於其他組別而言，於培養第20天時皆可達到較高的細胞總數，據此，於本發明之一實施例中，係可選用50至500ng/ml之Anti-CD3單株抗體進行培養，此外，又如表六所示，於細胞培養液中添加50ng/ml之Anti-CD3單株抗體之條件，係於細胞培養後分別於第0、5及7天各添加一次，相較於其他組別更能穩定地擴增細胞，除了維持前述實施例能達到之擴增後細胞總數，同時提升擴增後之細胞群中具有毒殺活性之NK/NKT細胞的比例。
實施例6、擴增後之自然殺手細胞(NK cell)及自然殺手T細胞(NKT cell)比例
經上述實施例之數據說明，使用本發明之細胞培養液搭配前述之體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法，不需額外添加血清或血漿，在取得周邊單核球細胞並於培養18天內，細胞擴增量可達3,000至7,000倍，且細胞存活率高於85%；接著，本實施例進一步確立本發明之方法確實能針對初始細胞(即周邊單核球細胞)中的NK/NKT細胞進行擴增。
於本實施例中，係先經前述之實施例獲得經擴增之細胞群落，再利用流式細胞儀(Flow cytometry)分析所擴增之細胞群落中有效細胞(即NK/NKT細胞)之佔比；其係分別依據NK細胞及NKT細胞之細胞專一性標記(cell marker)，透過流式細胞儀定量經擴增之細胞群落中NK/NKT細胞之比例，該NK細胞專一性標記分別為CD56及NK細胞活化受體CD16與NKG2D，此外，亦以CD3作為T細胞專一性標記以分析NKT細胞；試驗係以材料與方法所述之細胞表面抗原分析流程進行細胞群分析。
請見圖1A及圖1B，圖1A係細胞表面顆粒性及細胞顆粒大小之分析結果，如結果所示，本實施例所分析之細胞樣本，大多集中在同一群落，顯示其細胞型態一致，且細胞樣本並未明顯區分為多個群落，顯示其細胞存活率 之一致性；圖1B則係NK/NKT細胞於細胞群落中佔比之分析結果，如圖所示，左上角之細胞群係如圖1A所搜集之細胞群落中，不表現CD3但表現CD56之細胞群(CD3- CD56+)，其即為NK細胞，其佔總細胞之比例為17.16%，此外，右上角為表現CD3亦表現CD56之細胞群(CD3+ CD56+)，其即為NKT細胞，且其細胞比例為45.66%，由此可知，經本發明之無血清細胞培養液所擴增之細胞群落中，NK/NKT細胞之比例達62.28%(NK細胞17.6+NKT細胞45.66)。
請接續參閱2A及2B，圖2A右上角係顯示細胞群落中同時表現CD16及CD56之細胞，其比例為總細胞之31.59%，接續自圖2A選取CD16+CD56+之細胞群後，分析CD16+CD56+之細胞群中，表現NKG2D及CD3之細胞分佈狀態，結果如圖2B所示，左上角係CD16+CD56+NKG2D+CD3-之細胞群，其即為NK細胞，且其細胞比例為33.95%，右上角則係CD16+CD56+NKG2D+CD3+之細胞群，其即為NKT細胞，且其細胞比例為44.55%，依據流式細胞儀之定量結果可以得知，同時表現NK細胞專一性標記CD16、CD56及NKG2D之NK/NKT細胞比例達24.8%(31.59%*(33.95+44.55)%=24.8%)。
實施例7、經擴增之自然殺手細胞(NK cell)及自然殺手T細胞的細胞毒殺能力
最後，為能確立本發明所提供之細胞培養液搭配前述之體外擴增NK/NKT細胞之方法，其所製備之NK/NKT細胞得以符合製備為醫藥組成物之需求，本實施例利用材料與方法中所述的細胞毒殺性測試，進一步分析經擴增所得之NK/NKT細胞對於癌細胞之毒殺效果；請見圖3A及3B，圖3A係顯示細胞樣本呈現一致的細胞型態及細胞存活率，圖3B則可清楚獲知，與擴增所得之 NK/NKT細胞共同培養之K562細胞，其細胞狀態處於早期凋亡或凋亡過程之比例約為75.59%，亦即擴增所得之NK/NKT細胞對於癌細胞之毒殺效果可達75.59%。
綜合上述實施例之說明，本發明所揭示之用於體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之無血清細胞培養液，係經測試證實，其無需添加血清仍能達到較習知技術為佳之細胞擴增效率，且擴增出的NK/NKT細胞比例亦較習知技術為高；細胞培養液所包含之添加物Heparin，提供了細胞生長所需之因子，做為取代血清之角色，而細胞培養液所包含之rhIL-2及anti-CD3單株抗體，除可更提升細胞生長效率外，亦能活化所擴增之NK/NKT細胞，使其具備較佳之細胞毒殺性；據此，由於透過本發明之細胞培養液進行擴增時無需添加其他動物來源之血清，所獲得之細胞製備為醫藥組成物時，可免除細胞接受者產生排斥反應，此外，亦因無需添加周邊血檢體來源自體血漿或血清進行培養，因此所獲得之細胞製備為醫藥組成物時，將不限制其僅能施用於細胞來源宿主；於此，本發明確實解決了臨床上發展免疫細胞治療之瓶頸。
雖然前述說明書已舉出並詳述多種不同的實施範例，使得本發明所屬領域具通常知識者可以很容易地了解本發明的本質及特徵。然而應了解，在不脫離其發明精神和範圍的情況下，本發明亦可以從前述的描述再經過某些變化和修改，而使其更適用於各種用途和條件。因此，本說明書及其所述之申請專利範圍應為示範用途，而非以任何方式限制本發明之範圍。

Claims (6)

  1. 一種用於體外擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞之無血清細胞培養液，其係包含：一基礎培養基；一人類介白素-2重組蛋白(rhIL-2)，其濃度範圍係介於50至1,500IU/mL；一肝素(Heparin)，其濃度範圍係介於1至15U/mL；以及一抗CD3單株抗體(anti-CD3 monoclonal antibody)，其濃度範圍係介於30至600ng/mL；其中該自然殺手細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+CD3-之細胞群落，該自然殺手T細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+CD3+之細胞群落。
  2. 如申請專利範圍第1項之細胞培養液，其中該人類介白素-2重組蛋白之濃度範圍係介於100至1,000IU/mL。
  3. 如申請專利範圍第1項之細胞培養液，其中該肝素之濃度範圍係介於2至10U/mL。
  4. 如申請專利範圍第1項之細胞培養液，其中該抗CD-3單株抗體之濃度範圍係介於50至500ng/mL。
  5. 如申請專利範圍第1項之細胞培養液，其中該自然殺手細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+NKG2D+CD3-之細胞群落。
  6. 如申請專利範圍第1項之細胞培養液，其中該自然殺手T細胞係細胞表面抗原為CD16+CD56+NKG2D+CD3+之細胞群落。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Ayello et al.,〝Characterization of Cord Blood Natural Killer and Lymphokine Activated Killer Lymphocytes Following Ex vivo Cellular Engineering〞Biology of Blood and Marrow Transplantation Vol.12 pp608-622(2006)
Chabannon et al.,〝Manufacturing Natural Killer Cells as Medicinal products〞Frontier in Immunology November 2016,Vol.7 pp1-8
Chabannon et al.,〝Manufacturing Natural Killer Cells as Medicinal products〞Frontier in Immunology November 2016,Vol.7 pp1-8 Ayello et al.,〝Characterization of Cord Blood Natural Killer and Lymphokine Activated Killer Lymphocytes Following Ex vivo Cellular Engineering〞Biology of Blood and Marrow Transplantation Vol.12 pp608-622(2006) *

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