CN112779215A - 用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的细胞培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基包含纳豆激酶，专属针对自然杀伤细胞提供优化的培养环境，且在不使用癌饲养细胞共同培养的条件下，使用该培养基可有效提升细胞扩增倍数，并产生高纯度及对癌细胞具有高度毒杀活性的自然杀伤细胞。

Description

用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的细胞培养基

技术领域

本发明涉及一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的细胞培养基。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural Killer Cells；NK细胞)是一群具备CD3^-CD56⁺表达型的细胞，通常存在于淋巴结、各器官及外周血液中。NK细胞在人体外周血液淋巴细胞中约占5～20％，因此外周血液是NK细胞方便的来源之一。NK细胞在1970年代被发现具有毒杀癌细胞的特性，且事先不需要经过教育或致敏(Priming)的过程。之后研究发现，NK细胞除了可以毒杀癌细胞之外，还可以杀死病毒感染的细胞、癌化的细胞及老化应激细胞(StressedCells)。

过去的研究已显示NK细胞具有治疗肿瘤的潜力。自体NK细胞治疗癌症的做法，是将病人外周血液的NK细胞分离后，以体外细胞扩增和活化技术培养约14天，再输注入该病人体内以达到治疗癌症的效果。过去实施体外细胞扩增和活化方法时，多数将NK细胞与癌饲养细胞(Cancer feeder cell)共同培养，以达到大幅提高NK细胞数量的目的。但使用癌饲养细胞的扩增方法仍无法解决安全性的问题。在将扩增后自然杀伤细胞输注病人体内前，难以确定癌饲养细胞是否已完全去除，因此产生安全性的疑虑。再者，即使体外培养后NK细胞数量有大幅提升，若该NK细胞毒杀癌细胞的活性不佳，后续应用于自体细胞疗法的效果仍非常有限。据此，有必要开发一种培养基，在不使用癌饲养细胞共同培养的条件下，使用该培养基能有效率地提升NK细胞扩增倍数，并产生高纯度及高癌细胞毒杀活性的NK细胞。

纳豆激酶(nattokinase)是纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto)所分泌的胞外酶，已知具有溶解血栓的活性及分解纤维蛋白的功能，可应用于心血管疾病的预防及治疗。纳豆激酶目前系以口服给予，以营养补充品的形式使用。尽管已有研究探讨对象食用纳豆或纳豆萃取物，有助于调节对象的免疫力(Takeda et al.,Traditional&KampoMedicine,Vol.3Iss.2 100-106,2016)，但其作用的有效成分及相关机制目前仍不清楚。此外，纳豆激酶应用于体外免疫细胞培养方法与效用，目前未有相关研究。

发明内容

本发明于一方面，提供一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基包含浓度范围为5FU/ml至20FU/ml的纳豆激酶。

本发明于另一方面，提供一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基更包含辅酶Q10。

于本发明的一些具体实施方面，该培养基包含浓度为100nM至1000nM的辅酶Q10。

本发明于另一方面，提供一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基还包含白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)以及白介素-18(IL-18)；其中该白介素-2(IL-2)于该培养基中的浓度为200～1000IU/ml；其中该白介素-12(IL-12)于该培养基中的浓度为10～50ng/ml；其中该白介素-18(IL-18)于该培养基中的浓度为100～200ng/ml。

本发明于另一方面，提供一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，该培养基更包含基础培养基；其中该基础培养基为AIM V、X-VIV015、CellGro SCGM、KBM 501、DMEM或RPM1-1640培养基。

在本发明一些具体实施方面，以前述培养基培养后的细胞中，21％至41％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺细胞。

在本发明一些具体实施方面，以前述培养基培养后的细胞中，41％至71％是TRAIL⁺CD3^-CD56⁺细胞。

在本发明一些具体实施方面，以前述培养基培养后的细胞中，92％至97％是自然杀伤细胞。

在本发明一些具体实施方面，以前述培养基培养后的细胞，当该细胞与K562细胞在体外以5:1的比率共同培养时，所述细胞具有63％至81％的癌细胞毒杀活性。

附图说明

图1是本发明实施例1的NK细胞体外扩增和活化方法流程图；

图2是本发明所产生的细胞扩增倍数分析；

图3是本发明所产生之NK细胞毒杀癌细胞的能力测试结果，其中图3A是以K562作为被NK细胞毒杀的癌细胞株，其中图3B是以HepG2、HT-29以及A549作为被NK细胞毒杀的癌细胞株；

图4是本发明所产生的NK细胞抑制癌细胞生长的小鼠实验结果。

具体实施方式

有鉴于上述待解决的问题，本发明提出一种用于体外扩增和活化NK细胞的培养基，在不使用癌饲养细胞共同培养的条件下，所述培养基含有纳豆激酶，可提供NK细胞良好的培养环境，有效率地提升NK细胞扩增倍数，并产生高纯度及高癌细胞毒杀活性的NK细胞。

定义

用于本说明书，“自然杀伤细胞”(Natural killer cell，简称NK细胞)指细胞表面抗原呈现CD3^-CD56⁺的细胞。

用于本说明书，“癌饲养细胞”(cancer feeder cell)指体外免疫细胞培养中，加入活的癌细胞共同培养以达到提升免疫细胞扩增的效果，加入的其他活的癌细胞称之为癌饲养细胞。

用于本说明书，“细胞扩增倍数”以下列方式判断：“经体外培养14天后的细胞数量”除以“自外周血单核细胞分离出的起始NK细胞数量”。

用于本说明书，“毒杀癌细胞的活性”以K562细胞株或其他癌细胞株为靶标细胞(target cell)，并以NK细胞为效应细胞(effector cell)，在效应细胞与靶标细胞之比例(E:T ratio)为5:1的情况下，将靶标细胞死亡的比例做为毒杀效率。

材料与方法

本发明所述外周血样品，是依据伦理委员会通过之计划，自受试者手臂采集全血，置于无菌采血管，于室温存放待后续处理。

本发明所使用的基础培养基可选用自：CellGro SCGM(CellGenix公司)、KBM 501(Kohjin Bio公司)、AIM-V(Thermo Fisher公司)、X-VIV015(Lonza公司)、DMEM及RPM1-1640等市售培养基。

本发明所述培养基中，有时含有适当的蛋白质、细胞激素、抗体、血清、化合物等成分。所述细胞激素有时为白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)或白介素-21(IL-21)。

自PBMC分离NK细胞的方法

包括但不限于使用Dynabeads(Invitrogen公司)、CliniMACS磁珠(MiltenyiBiotec公司)或其他市售的免疫磁珠，将表达细胞表面抗原CD3和/或CD34的细胞分离除去，达到纯化NK细胞的效果。

以流式细胞仪方式分析细胞表面抗原

以2x10⁵细胞/50μl将扩增和活化后的细胞置于96孔盘，并加入3μl荧光标记之抗体于4℃反应15分钟，接着以磷酸盐缓冲生理食盐水(Phosphate buffer saline；简称PBS)清洗3次后，加入400μl PBS悬浮细胞，再以流式细胞仪(Beckman公司)分析细胞表面之荧光标记。上述荧光标记之抗体包含anti-CD3抗体(Invitrogen公司)、anti-CD56抗体(Invitrogen公司)、anti-TRAIL抗体(BD Bioscience公司)以及anti-NKG2A抗体(R&Dsystem公司)。

NK细胞毒杀癌细胞能力测试方式

将扩增和活化后的细胞做为效应细胞(effector cell)，并以K562细胞株(慢性骨髓性血癌细胞株)、HepG2细胞株(肝癌细胞株)、HT-29细胞株(大肠癌细胞株)或A549细胞株(肺癌细胞株)做为毒杀靶标细胞(target cell)。将效应细胞及靶标细胞以0.25:1、0.5:1、1:1或5:1混合培养后，反应4小时，再以7-AAD进行细胞染色，以此测定凋亡的细胞数量。

体外扩增和活化NK细胞的方法

如图1所示，步骤11是自血液样品分离外周血单核细胞(PBMC)。将未经冷藏或冷冻的外周血样品置于50ml离心管内并离心。离心结束后，去除上层之血浆，加入适量之PBS稀释后，再加入3ml之Ficoll-paque Plus(GE Healthcare公司)。于室温离心20分钟后，吸取PBMC层的细胞，并以PBS清洗3次，所得的细胞即为PBMC。

接着，自PBMC中纯化NK细胞(如图1步骤12)：在每1x10⁷PBMC的条件下，以80μl含有0.5％BSA、2mM EDTA的PBS悬浮PBMC。在每1x10⁷细胞的条件下，添加30μl CD3磁珠(MACSCD3 MicroBeads human,Miltenyi Biotec公司)到所述PBMC悬浮液中，将所述包含磁珠的PBMC悬浮液均匀搅拌后，置于4℃下15分钟。之后，所述PBMC悬浮液以300xg离心10分钟并去除上清液后，以500μl含有0.5％BSA、2mM EDTA的PBS悬浮PBMC，再将所述PBMC悬浮液通过LDColumn层析管(Miltenyi Biotec公司)，通过磁力将细胞表面表达CD3抗原的细胞从所述悬浮液中分离，以2x 1ml含有0.5％BSA、2mM EDTA的PBS清洗层析管，收集流出的细胞，即取得纯化后的NK细胞。

接着，进行NK细胞扩增和活化：将NK细胞以培养基均匀的配制成浓度为2～10x10⁵/ml的细胞悬浮液后，转移至培养盘，在37℃及5％CO₂的环境下进行NK细胞之扩增(如图1步骤13)。所述NK细胞培养基以AIM-V培养基(Thermo Fisher Scientific公司)为基础培养基，并添加浓度范围为200～1000IU/ml的白介素-2(IL-2)(Thermo FisherScientific公司)、浓度范围为10～50ng/ml的白介素-12(IL-12)(Sigma-Aldrich公司)、浓度范围为100～200ng/mL的白介素-18(IL-18)(Thermo Fisher Scientific公司)，以及浓度范围为5～20FU/ml之纳豆激酶(NSK-SD；Japan Bio Science Laboratory公司)。所述培养基，可另添加浓度范围为100～1000nM的辅酶Q10(Sigma-Aldrich公司)。本发明优选实施例中，于所述培养基另添加100nM的辅酶Q10(Sigma-Aldrich公司)。

此后，每隔二至三天观察细胞的生长状况，根据细胞生长状况更换新鲜的NK细胞培养基至14±2天为止(如图1步骤14)。所述每隔二至三天更换的NK细胞培养基，是以前一段所述方式配制的。最后，将培养盘中的细胞与培养基混合液移至离心管，以离心方式收集所述混合液中的细胞，再以PBS清洗，重复此步骤三次后，以PBS将细胞均匀的打散，如此即获得扩增和活化后的NK细胞。

经前述方法所获得的扩增和活化后的NK细胞，可混合于适当的赋形剂中保存，所述赋形剂可为磷酸缓冲液，最后制备成药物组合物。

实施例

实施例1、NK细胞扩增倍数测试

为测试并优化NK细胞扩增和活化方法，本实施例探讨所述NK细胞培养基的添加物及其添加量，试验组分别使用培养基A、培养基B或培养基C，对照组则使用培养基D。所述对照组与实验组都以同一受试者的外周血分离出的PBMC进行测试。所述培养基A、培养基B、培养基C及培养基D，都以AIM-V培养基(Thermo Fisher Scientific公司)为基础培养基，并添加浓度范围介于200～1000IU/ml的白介素-2(IL-2)(Thermo Fisher Scientific公司)、浓度范围介于10～50ng/ml的白介素-12(IL-12)(Sigma-Aldrich公司)，以及浓度范围介于100～200ng/mL的白介素-18(IL-18)(Thermo Fisher Scientific公司)。为测试添加纳豆激酶对于NK细胞体外扩增和活化的效用，所述实验组(培养基A、培养基B及培养基C)添加有20FU/ml(FU指纤维蛋白分解单位，fibrin degradation unit)或5FU/ml之纳豆激酶。为测试同时添加纳豆激酶与辅酶Q10对于NK细胞体外扩增和活化的效用，于所述培养基A同时加入20FU/ml之纳豆激酶与100nM之辅酶Q10。培养基A、培养基B、培养基C及培养基D的成份汇总如下表1。

表1、培养基成份

图2的实验结果显示，使用含有纳豆激酶的培养基A、培养基B或培养基C培养14天后，NK细胞扩增倍数都达到1000倍以上，具体而言，扩增倍数为1135至1750倍。相较与此，使用无添加纳豆激酶的培养基D培养14天后，NK细胞扩增倍数只有498倍。由此可知添加5～20FU/ml之纳豆激酶，能有效提升NK细胞的扩增倍数。比较培养基A及培养基B之实验结果，显示在含有纳豆激酶的培养基中再添加辅酶Q10，NK细胞扩增倍数自1326倍提升至1750倍。

实施例3、NK细胞对癌细胞的毒杀能力测试

为进一步探讨以本发明扩增后的NK细胞活性，本实施例测试以不同培养基扩增后NK细胞对癌细胞之毒杀能力。首先，试验组分别使用培养基A、培养基B或培养基C，对照组则使用培养基D，所述培养基成份如表1所示。所述对照组与实验组都以同一受试者的外周血分离出的PBMC进行扩增和活化。实验结果显示(图3A)，使用含有纳豆激酶的培养基A、培养基B或培养基C培养14天后，当E:T比例为5:1且以K562作为被NK细胞毒杀之癌细胞株时，毒杀效率均达到60％以上，具体而言，毒杀效率为63.1％～81.2％。相较与此，使用无添加纳豆激酶的培养基D培养14天后，毒杀效率只有39.8％。由此可知培养基中添加5～20FU/ml之纳豆激酶，不仅能提升NK细胞的扩增倍数，扩增后的NK细胞对于癌细胞也具有较高之毒杀活性。比较培养基A及培养基B的实验结果，显示在含有纳豆激酶的培养基中再添加辅酶Q10，NK细胞对于癌细胞的毒杀能力还可再提高，自68.3％增加至81.2％。

综上，以优选的实施例培养基A扩增和活化后的NK细胞，测试该NK细胞对不同癌细胞株之毒杀能力。实验结果显示(图3B)，使用含有纳豆激酶及辅酶Q10培养基扩增和活化后的NK细胞(即培养基A组)，均能有效毒杀HepG2细胞株(肝癌细胞株)、HT-29细胞株(大肠癌细胞株)及A549细胞株(肺癌细胞株)，且相较于使用不含纳豆激酶的培养基(即培养基D组)，对于癌细胞明显有较高的毒杀能力。

实施例4、细胞表面抗原分析

为测试本发明所产生的细胞中，NK细胞的占比(即纯度)，以及该NK细胞之活化状态，因此使用anti-CD3、anti-CD56、anti-TRAIL以及anti-NKG2A抗体标示细胞表面抗原，再以流式细胞仪分析，结果如表2所示。活化状态的NK细胞表面表达TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducing ligand)分子，具有较佳的癌细胞毒杀活性。NKG2A是位于NK细胞表面的抑制性受体，若NK细胞表面表达NKG2A，显示该NK细胞的活性属于被抑制的状态。换言之，当NK细胞表面不表达NKG2A抗原，该NK细胞具有更好的癌细胞毒杀活性。

表2、细胞表面抗原分析结果

表2显示，使用培养基A、培养基B或培养基C所产生的细胞中，92％至97％是NK细胞，显示本发明可产生极高纯度之NK细胞。再者，使用培养基A、培养基B或培养基C所产生的细胞中，41％至71％是TRAIL⁺CD3^-CD56⁺细胞，显示多数细胞为高度活化状态的NK细胞；相较于此，使用不含纳豆激酶的培养基D所产生的细胞中，仅37％至54％是TRAIL⁺CD3^-CD56⁺细胞。另外，使用培养基A、培养基B或培养基C所产生的细胞中，仅21％至41％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺细胞，显示多数细胞具有较佳的癌细胞毒杀活性；相较于此，使用不含纳豆激酶的培养基D所产生的细胞中，高达41％至53％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺细胞。

实施例5、NK细胞抑制肿瘤细胞增生的小鼠实验

所有动物实验依据适当的动物保护，并使用实验动物保护及使用委员会或小组(IACUC)所核定的合乎道德的实验步骤与准则进行。为测试以本发明扩增后的NK细胞抑制癌细胞增生的能力，将雌性NOD/SCID小鼠(平均体重为20公克)分配至不同组别，一组对照组(n＝5)、一组实验组(n＝5)。将100μl含有1x10⁷的K562细胞(肿瘤细胞)以皮下注射方式给予对照组及实验组小鼠，称为实验第0天。在实验第0天、第4天、第8天、第12天及第14天，将100μl含有1x10⁷以优选的实施例培养基A产生的细胞，静脉注射方式给予实验组；并于同样的时间点，将相同体积100μl的生理食盐水以静脉注射方式给予对照组。持续记录小鼠的活动力、体重、毛色及皮下肿瘤的生长情况至第18天。实验结果显示，在第18天，实验组小鼠体内的肿瘤体积为97.6mm³，明显小于对照组之肿瘤体积364.8mm³。据此，本实施例以含有纳豆激酶及辅酶Q10培养基扩增和活化后NK细胞，在活体内能有效抑制肿瘤细胞之生长，表示扩增后NK细胞的活性极佳，具有临床治疗的应用性。

Claims (10)

1.一种用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的培养基，其包含浓度范围为5FU/ml至20FU/ml的纳豆激酶。

2.如权利要求1所述的培养基，其另包含辅酶Q10。

3.如权利要求2所述的培养基，其中所述辅酶Q10的浓度为100nM至1000nM。

4.如权利要求3所述的培养基，其另包含白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)以及白介素-18(IL-18)；其中所述白介素-2(IL-2)在所述培养基中的浓度为200～1000IU/ml；其中所述白介素-12(IL-12)在所述培养基中的浓度为10～50ng/ml；其中所述白介素-18(IL-18)在所述培养基中的浓度为100～200ng/ml。

5.如权利要求4所述的培养基，其另包含基础培养基；其中所述基础培养基为AIM V、X-VIV015、CellGro SCGM、KBM 501、DMEM或RPM1-1640培养基。

6.如权利要求1-5中任一项所述的培养基，其中所述培养基所培养的细胞无需添加癌饲养细胞共同培养，即可达到1135倍至1750倍的细胞扩增倍数。

7.如权利要求1-5中任一项所述的培养基，其培养后的细胞中21％至41％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺细胞。

8.如权利要求1-5中任一项所述的培养基，其培养后的细胞中41％至71％是TRAIL⁺CD3^-CD56⁺细胞。

9.如权利要求1-5中任一项所述的培养基，其培养后的细胞中包含92％至97％的自然杀伤细胞。

10.如权利要求1-5中任一项所述的培养基，当所述自然杀伤细胞与K562细胞在体外以5:1的比率共同培养时，所述自然杀伤细胞具有63％～81％的癌细胞毒杀活性。

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