CN108486055B - 培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用 - Google Patents

培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108486055B
CN108486055B CN201810325698.2A CN201810325698A CN108486055B CN 108486055 B CN108486055 B CN 108486055B CN 201810325698 A CN201810325698 A CN 201810325698A CN 108486055 B CN108486055 B CN 108486055B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
culture
culture medium
interleukin
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810325698.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108486055A (zh
Inventor
孙忠杰
陈立功
郭潇
薛庆磊
左慧晶
刘庆军
马骏凡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Saidete Beijing Bioengineering Co ltd
Original Assignee
Baoding Norway Technology Co ltd
Nuowei Technology Beijing Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baoding Norway Technology Co ltd, Nuowei Technology Beijing Co ltd filed Critical Baoding Norway Technology Co ltd
Priority to CN201810325698.2A priority Critical patent/CN108486055B/zh
Publication of CN108486055A publication Critical patent/CN108486055A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108486055B publication Critical patent/CN108486055B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及培养基及其在中央记忆型T淋巴细胞培养中的应用。本发明提供的培养基由基础培养基、mTOR抑制剂、白细胞介素‑2、白细胞介素‑7、白细胞介素‑12、白细胞介素‑15、白细胞介素‑1a、Anti‑CD3抗体和Anti‑CD28抗体组成。本发明培养基和培养方法可以提供高数量和比例的中央记忆型T淋巴细胞，实验表明，使用本发明提供的培养基可以扩增TCM达约100倍，在培养的20天中，第20天细胞数量最多，而第12天(样本B)TCM细胞的纯度最高。

Description

培养基及其在中央记忆型T淋巴细胞培养中的应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及培养基及其在中央记忆型T淋巴细胞培养中的应用。
背景技术
免疫系统能够帮助机体抵抗病菌感染和清除肿瘤，以维持机体内环境的稳态，其发挥作用的基础在于免疫细胞。免疫细胞包括抗原递呈细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞等，在中枢免疫器官和外周免疫器官均有分布。中枢免疫器官一般指骨髓和胸腺，分别是B细胞和T细胞发育的场所；外周免疫器官一般指脾脏、扁桃体、淋巴结等，是B细胞和T细胞驻守和巡视的场所。免疫系统稳态的紊乱会导致多种疾病的产生。免疫缺陷，如先天性重症联合免疫缺陷、HIV感染引发的T细胞死亡以及药物处理导致免疫细胞的清除，均会大大增加机体机会感染的概率，严重者引发死亡。免疫机能亢进则会引发自身免疫疾病如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。因此，维持机体免疫系统的稳态对于机体的正常生理功能和健康至关重要。
肿瘤细胞是一类恶性无限增殖的细胞，正常情况下会被机体免疫系统识别并杀死。肿瘤细胞一般过量表达机体正常细胞不表达或者低表达的表面抗原，因而会被抗原递呈细胞识别，并激活T细胞分化产生抗原特异性的效应T细胞，效应T细胞迁移至病灶处杀死肿瘤细胞。初次免疫反应发生后，90-95％的效应T细胞相继死亡，剩下的细胞是中央记忆T细胞(Central Memory T Cell,TCM)和效应记忆T细胞(Effector Memory Cell,TEM)，它们会在相同抗原的再次刺激下迅速增殖分化产生效应T细胞，快速消灭肿瘤。
一般地，发挥杀瘤作用的细胞多为CD8+细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic TLymphocyte,CTL)，主要通过T细胞受体(T cell receptor,TCR)与靶细胞的肿瘤抗原和HLAI型抗原相结合，成功捕捉靶细胞，然后通过两种方式杀死靶细胞：一种方式是CTL分泌释放细胞毒素，如穿孔素、颗粒酶以及颗粒酶溶解素等，细胞毒素进入靶细胞胞质后激活Caspase级联反应，引发靶细胞凋亡；另一种方式是通过CTL的表面配体FasL与靶细胞表面的Fas相结合，通过招募死亡诱导讯号复合体(Death Inducing Signal Complex,DISC)，诱发Caspase级联反应，引发靶细胞凋亡。CD4+T细胞在肿瘤免疫中主要发挥辅助作用。CD4+T细胞经靶细胞活化后，通过分泌TNFa,IFNγ等炎症因子招募巨噬细胞侵入肿瘤病灶，帮助CTL杀伤肿瘤细胞，且对CD8+Tcm的形成不可或缺。
肿瘤细胞有多种方式逃避免疫监视而逐步发展成为难以治愈的癌症。首先，有些肿瘤细胞因为TAP或者B2M基因突变导致人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)表达量偏低或者消失，致使CTL不能有效辨别并结合肿瘤细胞。另外，肿瘤细胞表达VISTA、TIM3、LAG3、PD-1等表面抗原，与CTL相应受体结合后能够激发免疫抑制效果，使CTL瘫痪，无法释放细胞毒素。再者，肿瘤细胞分泌TGFb、CSF-1、adenosine等因子吸引或激活调节性T细胞、二型巨噬细胞和髓系来源的抑制细胞(myeloid derived suppressive cells,MDSC)等，使CTL凋亡或衰竭。
过继性免疫细胞疗法在抗癌、造血干细胞移植、抗病毒感染和自体免疫治疗等方面具有广泛的应用价值和前景。早期过继性免疫细胞疗法利用扩增患者自体肿瘤浸润的T淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL)回输，能够短期内抑制肿瘤的生长，但其有效应用范围只存在于黑色素瘤治疗，且不具备体内自我更新和长期存在的特性，仅有不到1/5的患者有5年以上的存活率，存在很强的局限性。另外两种过继性免疫细胞疗法采用基因编辑的TCR或者能够特异识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)T细胞进行治疗。其中TCR技术能够识别肿瘤细胞胞内抗原但是仍然依赖于HLAI，因而无法识别并杀死无HLAI抗原的肿瘤。CAR技术在T细胞中表达嵌合抗原受体，含CD3ζ活化结构域和CD28或4-1BB共激活结构域，因而只需肿瘤抗原刺激即可活化，摆脱了HLAI的限制。CAR技术在CD19阳性B细胞淋巴瘤治疗中有一定进展，30位患者中，90％得到完全缓释，且2/3的患者术后6个月后仍没有复发。但CAR技术仅限于血液瘤治疗领域，而在实体瘤治疗方面无实际进展，其术后引发的细胞因子风暴和短暂的T细胞体内存活限制了更广泛的使用。一般来讲，高度分化的CTL细胞在体内存活周期大约只有15天。研究发现，T细胞体内增殖和长期存活以及肿瘤微环境的信号调控对于其发挥杀肿瘤效用密切相关。
中央记忆T细胞是一类能够在体内长期存活和自我更新的免疫细胞。它能够发育为效应记忆T细胞和终末分化的效应T细胞，既具有产生细胞因子、快速响应抗原刺激并增殖的特征，又具有较强的体内存活、自我更新和多能分化的干细胞特征，因此成为目前过继性免疫细胞疗法的首选细胞。在小鼠和非人灵长类的动物模型试验表明，其移植物体内增殖、存活和杀瘤能力远远强于其他类型的T细胞，临床实验也表现出显著的疗效。尽管发挥杀瘤作用的细胞是CD8+T细胞，但CD4+记忆T细胞在调节CD8+细胞响应抗原刺激和增殖分化中发挥重要的调节作用。研究发现，特定比例的CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的输送对于抑制肿瘤的效果有显著影响。
目前体外扩增中央记忆T细胞的策略并不能有效地维持其干性和体内长期存活的能力。早期TIL的培养依赖于CD3抗原刺激和高浓度的IL2以及异体饲养层细胞，不可避免地引发大量细胞的分化和衰老。后来，人们发现IL-15能够有效维持和扩增CD8+TCM细胞，其扩增产物在表型、功能和代谢状态及基因表达方面均与自然状态的TCM相似，表达CD62L和CCR7，在杀瘤效果上强于单纯IL-2培养的T细胞。IL-15的作用机制可能集中于调节线粒体脂肪酸代谢。近期，IL21被发现能够有效扩增肿瘤特异的CD8+T细胞并抑制其分化，维持细胞CD62L、CD28、CD27、IL7Ra的表达，其杀瘤能力超过了以往的任何培养方法。然而，体内有效的抗肿瘤效果依赖于CD4+和CD8+中央记忆细胞的共同作用，由此，开发简便有效的CD4+和CD8+的中央记忆T细胞的分离和体外扩增技术仍需要进一步优化。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养基及其在中央记忆型T淋巴细胞培养中的应用，本发明提供的培养基能够在培养中提高中央记忆型T淋巴细胞的数量和比例。
mTOR抑制剂在中央记忆型T淋巴细胞分离培养中的应用。
本发明提供的培养基由基础培养基、mTOR抑制剂、白细胞介素-2、白细胞介素-7、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-1a、Anti-CD3抗体和Anti-CD28抗体组成。
本发明在T细胞体外培养的过程中，施加mTOR抑制剂，例如：雷帕霉素、metformin、Torin或PP242均能促进记忆CD4+、CD8+T细胞的扩增而增强其杀伤肿瘤的能力。本发明中，所述mTOR抑制剂为everolimus(依维莫司)、Rapamycin、RAD001、CCI-779、NVP-BEZ235、GSK2126458、XL765、AZD8055、INK128、OSI027或Rapalinks中至少一种。一些实施例中，培养基中添加的mTOR抑制剂为依维莫司。
本发明实施例中，所述培养基中，
所述白细胞介素-2的浓度为5×104U/L～1×106U/L；
所述白细胞介素-7的浓度为1ng/mL～60ng/mL；
所述白细胞介素-12的浓度为1ng/mL～100ng/mL；
所述白细胞介素-15的浓度为1ng/mL～60ng/mL；
所述白细胞介素-1a的浓度为1ng/mL～60ng/mL；
所述Anti-CD3抗体的浓度为1ng/mL～100ng/mL；
所述Anti-CD28抗体的浓度为1ng/mL～100ng/mL；
所述mTOR抑制剂的浓度为0.1μmol/L～10μmol/L。
本发明实施例中，所述基础培养基为GT-T551培养基。
所述培养基的PH值是7.2～7.4。
本发明所述的培养基在中央记忆型T淋巴细胞分离培养中的应用。
以本发明所述培养基培养的中央记忆型T淋巴细胞表达如下几种T淋巴细胞膜分子：白细胞分化抗原CD3、白细胞分化抗原CD4或CD8、白细胞分化抗原CD62L、白细胞分化抗原CD45RO。
本发明还提供了一种中央记忆型T淋巴细胞的分离培养方法，以本发明所述的培养基重悬外周血单个核细胞后培养，每隔2～4天补加新鲜的本发明提供的培养基。
本发明实施例中，所述重悬至外周血单个核细胞的密度为1×105个/mL～1×106个/mL。
所述外周血单个核细胞的制备方法为：
以肝素为抗凝剂采取外周血，以生理盐水稀释后逐滴加入淋巴细胞分离液中，其中，所述外周血、生理盐水、淋巴细胞分离液的比例为1：1：1；
1500～2000rpm/min离心20～30min，取单个核细胞层(PBMC)，以生理盐水1500～2000rpm/min离心5～10min，洗涤3次，制得外周血单个核细胞。
本发明实施例中，所述补加至细胞密度为0.5×106个/mL～2.5×106个/mL。
所述培养的条件为37℃，5％二氧化碳。
本发明实施例中，所述培养至细胞铺满培养容器的底部，然后传代；所述传代包括，将贴壁细胞以本发明所述的培养基重悬后继续培养。
本发明提供的培养基由基础培养基、白细胞介素-2、白细胞介素-7、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-1a、Anti-CD3抗体和Anti-CD28抗体组成。本发明培养基和培养方法可以提供高数量和比例的中央记忆型T淋巴细胞，用该培养基获得的中央记忆型T淋巴细胞配合传统的手术、放疗和化疗治疗，可以提供持续有效癌细胞杀伤效果。实验表明，使用本发明提供的培养基可以扩增TCM达约100倍，在培养的20天中，第20天细胞数量最多，而第12天(样本B)TCM细胞的纯度最高。
附图说明
图1示本发明实施例1(培养基2培养的细胞)显微镜下细胞出现增殖迹象的细胞形态图；
图2示本发明实施例1(培养基2培养的细胞)转袋前的细胞形态图；
图3示流式细胞术鉴定TCM细胞表型结果图；其中:
图3a-1示培养基2培养细胞的样本1的CD8阳性TCM表型结果；
图3a-2示培养基2培养细胞的样本2的CD8阳性TCM表型结果；
图3a-3示培养基2培养细胞的样本3的CD8阳性TCM表型结果；
图3b-1示培养基2培养细胞的样本1的CD4阳性TCM表型结果；
图3b-2示培养基2培养细胞的样本2的CD4阳性TCM表型结果；
图3b-3示培养基2培养细胞的样本3的CD4阳性TCM表型结果；
图4示本发明对比例1流式细胞术鉴定TCM细胞表型结果图；其中图3a是第20天CD8阳性TCM表型结果，图3b是第20天CD4阳性TCM表型结果；
图5示本发明实施例1样本的细胞因子分泌量检测结果；
图6示本发明实施例2样本的肿瘤杀伤效果对比图。
具体实施方式
本发明提供了培养基及其在中央记忆型T淋巴细胞培养中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
具体地，关于下面实施例中涉及的原料生产厂家如下表(表1)：
表1：原料表
试剂名称 品牌
GT-T551 Takara
白细胞介素-2 PeproTech
白细胞介素-7 PeproTech
白细胞介素-12 PeproTech
白细胞介素-15 PeproTech
白细胞介素-1a PeproTech
Anti-CD3抗体 eBioscience
Anti-CD28抗体 eBioscience
依维莫司 LC Laboratories
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1周血单个核细胞的获取
⑴用肝素抗凝管采外周血约30～100ml，将外周血转移至50ml离心管中，加等量生理盐水稀释，混匀后逐滴加入等量淋巴细胞分离液中，注意不要破坏界面。外周血、生理盐水、淋巴细胞分离液的比例为1：1：1。
⑵1500～2000rpm/min离心20～30min，因密度不同离心管中由上到下分为四层：第一层为血浆层。第二层为环状乳白色单个核细胞层(PBMC)。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
⑶用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层(PBMC)到另一50ml离心管中，补加生理盐水，1500～2000rpm/min离心5～10min。
⑷弃上清，加生理盐水重悬，1500～2000rpm/min离心5～10min。
⑸弃上清，加生理盐水重悬，细胞计数，1500～2000rpm/min离心5～10min。
实施例2人中央记忆型T淋巴细胞的分离培养
首先配制培养基，配方如表2：
表2培养基配方
试剂名称 培养基1 培养基2 培养基3
GT-T551 100ml 100ml 100ml
白细胞介素-2 5×10<sup>4</sup>U/L 5×10<sup>5</sup>U/L 1×10<sup>6</sup>U/L
白细胞介素-7 1ng/ml 30ng/ml 60ng/ml
白细胞介素-12 1ng/ml 50ng/mL 100ng/ml
白细胞介素-15 1ng/ml 30ng/ml 60ng/ml
白细胞介素-1a 1ng/ml 30ng/ml 60ng/ml
Anti-CD3抗体 1ng/ml 50ng/mL 100ng/ml
Anti-CD28抗体 1ng/ml 50ng/mL 100ng/ml
依维莫司 0.1μM 5μM 10μM
该培养基的配制方法为，将除各组分混合均匀，现用现配。
1.将实施例1制得的单个核细胞悬浮分别接种于上述培养基培养，具体步
骤为：
⑴用50～100ml培养基重悬步骤1中得到的PBMC，调整PBMC浓度为(1～10)×105个/ml，充分混匀后移入细胞培养瓶中。
⑵将细胞培养瓶放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。
2.补液
上述培养2～4天时，如图1所示，细胞出现增殖迹象，向细胞培养瓶中添加新鲜培养基50～100ml；将细胞培养瓶放入37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养。
3.转袋
继续培养1～2天时，如图2所示，当细胞基本铺满包被瓶底部，细胞形态大而圆时，将细胞培养瓶中细胞转移至细胞培养袋中继续培养。
⑴用移液管吹下细胞培养瓶中的贴壁细胞，将培养瓶中的细胞及培养基倒入细胞培养袋。
⑵用新鲜培养基润洗培养瓶1～2次，将润洗液倒入细胞培养袋，补加培养基至300～500ml，将细胞培养袋放入37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养。
4.根据细胞培养状态，每隔2-4天补加TCM细胞专用培养基300～500ml，保持细胞密度为(0.5～2.5)×106个/ml，12～16天可获得数量较多的TCM细胞，经检测，以培养基A培养细胞16天后扩增40倍；以培养基B培养细胞16天后扩增100倍；以培养基C培养细胞16天后扩增30倍。
对比例1人中央记忆型T淋巴细胞的分离培养
首先配制培养基，配方如表3：
表3培养基配方
试剂名称 培养基4
GT-T551 100mL
白细胞介素-2 6×10<sup>5</sup>U/L
白细胞介素-1a 30u/mL
Anti-CD3抗体 50ng/mL
IFN-γ 100u/mL
该培养基的配制方法为，将各组分混合，现用现配。
1.将实施例1制得的单个核细胞悬浮分别接种于上述培养基培养，具体步骤为：
⑴用50～100ml培养基重悬步骤1中得到的PBMC，调整PBMC浓度为(1～10)×105个/ml，充分混匀后移入细胞培养瓶中。
⑵将细胞培养瓶放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。
2.补液
上述培养2～4天时，细胞出现增殖迹象，向细胞培养瓶中添加新鲜培养基50～100ml；将细胞培养瓶放入37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养。
3.转袋
继续培养1～2天时，当细胞基本铺满包被瓶底部，细胞形态大而圆时，将细胞培养瓶中细胞转移至细胞培养袋中继续培养。
⑴用移液管吹下细胞培养瓶中的贴壁细胞，将培养瓶中的细胞及培养基倒入细胞培养袋。
⑵用新鲜培养基润洗培养瓶1～2次，将润洗液倒入细胞培养袋，补加培养基至300～500ml；将细胞培养袋放入37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养。
4.根据细胞培养状态，每隔2～4天补加TCM细胞专用培养基300～500ml，保持细胞密度为(0.5～2.5)×106个/ml，12～16天可获得数量较多的TCM细胞，扩增倍数约为100倍。
细胞鉴定
将上述实施例2和对比例1培养的中央记忆型T淋巴细胞进行表型鉴定及活率、纯度检测，包括如下步骤：
1.分别取第0天(获得外周血PBMC记为第0天)的PBMC，第12、20天的培养的细胞，标记为样本1、2、3离心洗涤后备用。
2.用流式细胞术测各培养基培养的样本1、2、3中TCM细胞的表型(图3～4、表4)
各取100μL待测样本，分别加入FITC-CD3、APC-Cy7-CD8、PE-CD62L、PE-Cy7-CD45RO、PerCP-Cy5.5-CD197、APC-CD27荧光标记抗体,设相应的同型对照,流式细胞仪检测，ACEA NovoCyteTM软件分析数据。
表4：不同培养时间TCM的免疫表型(％)
Figure GDA0001684980330000091
Figure GDA0001684980330000101
从图3可以看出，使用培养基2的TCM培养基可以扩增TCM达约100倍。而培养基1和培养基3的扩增倍数皆无法达到这样的程度，与培养基4的效果存在显著性差异，p<0.05。
3.评估样本1～4中TCM细胞的增殖、活率、纯度(表5)变化情况。
从表5可以看出在各组细胞在第20天(样本C)TCM细胞的数量最多，使用本发明的TCM培养基可以扩增TCM达约50～100倍；表4～5可以看出，在第12天(样本B)TCM细胞的纯度最高。
4.将样本进行台盼蓝染色，比较细胞活率(表4～5)的变化。
从表5可以看出，在第12天(样本B)TCM细胞的活率最高。
表5：不同培养时间细胞鉴定
Figure GDA0001684980330000102
5.肿瘤细胞的杀伤能力检测
以人非小细胞肺癌A549细胞为靶细胞，测试培养基2培养获得细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。检测方法为(1)利用ELISA检测细胞因子IL4,IL10,IFNγ分泌量；(2)利用流式细胞术分析7-AAD和Annexin V染色检测凋亡比例。具体实施过程如下：
(1)96孔板每孔接种5×105靶细胞(A549细胞)，设杀伤试验孔、自发释放孔，每孔均设3个复孔。其中杀伤试验孔效应细胞(Effetor,E,即TCM)和靶细胞(Tumor,T)设置数量比例(E:T)为1：1，1：2，1：5和1：10；自发释放孔不接种TCM，即E:T＝0：1,或者只接种TCM，即E:T＝1:0。在加入相应数量效应细胞(TCM)后于37℃，5％CO2中培养4h,8h,12h,24h，分别用冷0.9％NaCl 50ul/孔中止效靶反应，并收集100μl培养液，3000r/min离心5min，上清置于酶标测试板中。每孔加入100ul LDH室温反应10～30min。每孔加入30ul 0.1mol/L柠檬酸钠，中止酶促反应。最后于酶标仪上570nm处测OD值。最后，根据标准曲线计算培养液中细胞因子IL4,IL10,IFNγ的浓度。
(2)收集A,B,C,D,E共计5种来源的A549细胞系，96孔板每孔接种5x105靶细胞，在加入相应数量效应细胞(TCM)后于37℃，5％CO2中培养4h,8h,12h；分别用冷0.9％NaCl50ul/孔中止效靶反应，并收集100μl培养液，3000r/min离心5min，重悬细胞团块，加入7-AAD和Annexin V抗体，30分钟后洗脱，进行流式分析；7-AAD和Annexin V双阳性的细胞的比例即肿瘤细胞杀伤比率。
共培养后，上清液中细胞因子的分泌情况如图5；对肿瘤细胞的杀伤能力如图6。
结果表明，该中央记忆型T淋巴细胞配合传统的手术、放疗和化疗治疗，可以提供持续有效癌细胞杀伤效果。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种培养基，其特征在于，由基础培养基、0.1μmol/L～10μmol/L依维莫司、5×104U/L～1×106U/L白细胞介素-2、1ng/mL～60ng/mL白细胞介素-7、1ng/mL～100ng/mL白细胞介素-12、1ng/mL～60ng/mL白细胞介素-15、1ng/mL～60ng/mL白细胞介素-1a、1ng/mL～100ng/mL Anti-CD3抗体和1ng/mL～100ng/mL Anti-CD28抗体组成。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为GT-T551培养基。
3.权利要求1所述的培养基在中央记忆型T淋巴细胞分离培养中的应用。
4.一种中央记忆型T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，
以权利要求1所述的培养基重悬外周血单个核细胞后培养，每隔2～4天补加新鲜的权利要求1所述的培养基。
5.根据权利要求4所述的分离培养方法，其特征在于，所述重悬至外周血单个核细胞的密度为1×105个/mL～1×106个/mL。
6.根据权利要求4所述的分离培养方法，其特征在于，所述补加至细胞密度为0.5×106个/mL～2.5×106个/mL。
7.根据权利要求4所述的分离培养方法，其特征在于，所述培养至细胞铺满培养容器的底部，然后传代；所述传代包括，将贴壁细胞以权利要求1所述的培养基重悬后继续培养。
CN201810325698.2A 2018-04-12 2018-04-12 培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用 Active CN108486055B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810325698.2A CN108486055B (zh) 2018-04-12 2018-04-12 培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810325698.2A CN108486055B (zh) 2018-04-12 2018-04-12 培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108486055A CN108486055A (zh) 2018-09-04
CN108486055B true CN108486055B (zh) 2020-10-30

Family

ID=63315856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810325698.2A Active CN108486055B (zh) 2018-04-12 2018-04-12 培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108486055B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109628396B (zh) * 2019-01-24 2021-03-26 清华大学 记忆性淋巴细胞群在肝癌治疗中的应用
CN110592016B (zh) * 2019-10-28 2020-10-02 上海科医联创生物科技有限公司 一种特异性t细胞的培养方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010049935A1 (en) * 2008-10-30 2010-05-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
US11020429B2 (en) * 2015-11-05 2021-06-01 Juno Therapeutics, Inc. Vectors and genetically engineered immune cells expressing metabolic pathway modulators and uses in adoptive cell therapy
CN108165529B (zh) * 2017-12-28 2021-07-16 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 中枢记忆性t细胞体及其外培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108486055A (zh) 2018-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107022524B (zh) 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法
JP6799895B2 (ja) ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の生産方法
CN107326008B (zh) 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法
Klangsinsirikul et al. Peripheral blood stem cell harvests from G-CSF–stimulated donors contain a skewed Th2 CD4 phenotype and a predominance of type 2 dendritic cells
Davis et al. Interleukin-7 permits Th1/Tc1 maturation and promotes ex vivo expansion of cord blood T cells: a critical step toward adoptive immunotherapy after cord blood transplantation
CN108588022B (zh) 体外培养富集人cd4+和cd8+ tcm细胞的方法
JP6073417B2 (ja) 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物
Eyrich et al. Development and validation of a fully GMP-compliant production process of autologous, tumor-lysate-pulsed dendritic cells
Torelli et al. A good manufacturing practice method to ex vivo expand natural killer cells for clinical use
Chen et al. Cross regulation by IL-10 and IL-2/IL-12 of the helper T cells and the cytolytic activity of lymphocytes from malignant effusions of lung cancer patients
CN111918963A (zh) 表达趋化因子受体和细胞粘附分子的cd3阴性细胞群体及其用途和制备方法
CN108486055B (zh) 培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用
Bonifacius et al. Rapid manufacturing of highly cytotoxic clinical-grade SARS-CoV-2-specific T cell products covering SARS-CoV-2 and its variants for adoptive T cell therapy
CN109486758A (zh) 一种外周血nk细胞体外高效扩增试剂及操作说明
Pan et al. Gamma/delta T-cells enhance carboplatin-induced cytotoxicity towards advanced bladder cancer cells
TWI757709B (zh) 含有nk細胞之細胞集團之製造方法
Donnenberg et al. A maladaptive pleural environment suppresses preexisting anti-tumor activity of pleural infiltrating T cells
CN112779215A (zh) 用于体外扩增和活化自然杀伤细胞的细胞培养基
CN107586758B (zh) 一种干细胞样记忆性t细胞体外诱导剂及诱导方法
Rouas et al. Dendritic cells generated in clinical grade bags strongly differ in immune functionality when compared with classical DCs generated in plates
KR101232128B1 (ko) 면역 기능이 우수한 성숙 수지상 세포의 제조방법
WO2020223479A1 (en) Systems and methods for modulating a cell phenotype
Fowler et al. Tripartite immune cell co‐operation in the Bacillus Calmette Guérin‐induced activation of γδ T cells
Lin et al. Cytokine activation of natural killer cells
TWI778302B (zh) 用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之細胞培養基

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Sun Zhongjie

Inventor after: Chen Ligong

Inventor after: Guo Xiao

Inventor after: Xue Qinglei

Inventor after: Zuo Huijing

Inventor after: Liu Qingjun

Inventor after: Ma Junfan

Inventor before: Sun Zhongjie

Inventor before: Guo Xiao

Inventor before: Chen Ligong

Inventor before: Xue Qinglei

Inventor before: Zuo Huijing

Inventor before: Liu Qingjun

Inventor before: Ma Junfan

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20201015

Address after: 100176 room 103, floor 1, block B, No. 18, Xihuan South Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Applicant after: NEWISH TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.

Applicant after: Baoding Norway Technology Co.,Ltd.

Address before: 100022 room 1002, block A, Shi Yun Hao Ting, 33 Guang Qu Road, Chaoyang District, Beijing.

Applicant before: NEWISH TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221222

Address after: Room 103, 1st Floor, Building B, No. 18, West Ring South Road, Daxing District, Beijing 100176

Patentee after: NEWISH TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.

Address before: Room 103, floor 1, block B, No. 18, Xihuan South Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing 100176

Patentee before: NEWISH TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.

Patentee before: Baoding Norway Technology Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230208

Address after: Room B103, Floor 1, Building B, No. 18, Xihuan South Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing, 100176

Patentee after: Saidete (Beijing) Bioengineering Co.,Ltd.

Address before: Room 103, 1st Floor, Building B, No. 18, West Ring South Road, Daxing District, Beijing 100176

Patentee before: NEWISH TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.