TWI729550B - 體外擴增暨活化自然殺手細胞之方法及其醫藥組合物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種體外擴增暨活化自然殺手細胞之方法，該方法係以含有納豆激酶之培養基進行自然殺手細胞培養，專屬針對自然殺手細胞提供優化的培養環境，且在不使用癌餵養細胞共同培養的條件下，有效率地提升細胞擴增倍數，並產生高純度及對癌細胞具有高度毒殺活性之自然殺手細胞。本發明另關於一種用於抑制腫瘤細胞增殖之醫藥組合物，其包含自然殺手細胞。

Description

體外擴增暨活化自然殺手細胞之方法及其醫藥組合物

本發明係關於一種體外擴增暨活化自然殺手細胞之方法。本發明另關於一種包含自然殺手細胞之醫藥組合物。

自然殺手細胞(Natural Killer Cells；NK細胞)是一群具備CD3^-CD56⁺表現型的細胞，通常存在於淋巴結、各器官及周邊血液中。NK細胞在人體周邊血液淋巴球中約佔5~20%，因此周邊血液是NK細胞方便的來源之一。NK細胞在1970年代被發現具有毒殺癌細胞之特性，且事先不需要經過教育或致敏(Priming)的過程。俟後之研究發現，NK細胞除了可以毒殺癌細胞之外，還可以殺死病毒感染之細胞、癌化之細胞及老化受壓力之細胞(Stressed Cells)。

過去的研究已顯示NK細胞具有治療腫瘤之潛力。自體NK細胞治療癌症之做法，係將病人周邊血液之NK細胞分離後，以體外細胞擴增暨活化之技術培養約14天，再輸注入該病人體內以達到治療癌症之效果。過去實施體外細胞擴增暨活化方法時，多數將NK細胞與癌餵養細胞(Cancer feeder cell)共同培養，以達到大幅提高NK細胞數量之目的。惟使用癌餵養 細胞之擴增方法仍無法解決安全性的問題。在將擴增後自然殺手細胞輸注病人體內前，難以確定癌餵養細胞是否已完全去除，因此產生安全性的疑慮。再者，即使體外培養後之NK細胞數量有大幅提升，倘該NK細胞毒殺癌細胞之活性不佳，後續應用於自體細胞療法之效果仍非常有限。據此，有必要開發一種不使用癌餵養細胞之NK細胞體外擴增方法，且該方法能有效率地提升NK細胞擴增倍數，並產生高純度及高癌細胞毒殺活性之NK細胞。

納豆激酶(nattokinase)是納豆枯草桿菌(Bacillus subtilis natto)所分泌的胞外酵素，已知具有溶解血栓的活性及分解纖維蛋白之功能，可應用於心血管疾病之預防及治療。納豆激酶目前係以口服投與，以營養補充品之形式使用。儘管已有研究探討個體食用納豆或納豆萃取物，有助於調節個體的免疫力(Takeda et al.,Traditional & Kampo Medicine,Vol.3 Iss.2 100-106,2016)，惟其作用之有效成分及相關機制目前仍不清楚。此外，納豆激酶應用於體外免疫細胞培養方法與效用，目前未有相關研究。

本發明於一方面，係提供一種體外擴增暨活化自然殺手細胞之方法，其包含以下步驟：自一血液檢體分離出周邊血單核球細胞；自該周邊血單核球細胞分離出自然殺手細胞；將該自然殺手細胞懸浮於含有納豆激酶之培養基並置於一細胞培養盤中培養；以及每隔二至三天更換該含有納豆激酶之培養基，培養12至16天。

本發明於另一方面，係提供一種體外擴增暨活化自然殺手細胞之方法，該方法所使用之培養基含有濃度介於5FU/ml至20FU/ml之納豆 激酶。

本發明於另一方面，係提供一種體外擴增暨活化自然殺手細胞之方法，該方法所使用之培養基更包含輔酶Q10，其中該輔酶Q10於該培養基中之濃度係介於100nM至1000nM。

於本發明之一些具體實施態樣，以體外擴增暨活化自然殺手細胞方法所產生之細胞中21%至41%係NKG2A⁺CD3^-CD56⁺細胞。

於本發明之一些具體實施態樣，以體外擴增暨活化自然殺手細胞方法所產生之細胞中41%至71%係TRAIL⁺CD3^-CD56⁺細胞。

於本發明之一些具體實施態樣，該體外擴增暨活化自然殺手細胞方法不包含將自然殺手細胞與癌餵養細胞共同培養之步驟。

於本發明之一些具體實施態樣，該體外擴增暨活化自然殺手細胞方法可達到1135倍至1750倍的細胞擴增倍數。

本發明另一方面係關於一種細胞，其係以前述之方法製得。

於本發明之一些具體實施態樣，以前述方式製得之細胞中，包含92%至97%之自然殺手細胞。

於本發明之一些具體實施態樣，以前述方式製得之細胞，當該細胞與K562細胞在活體外以5：1之比率共同培養時，該等細胞具有63%至81%之癌細胞毒殺活性。

本發明另一方面係關於一種用於抑制腫瘤細胞增殖之醫藥組合物，其包含以上述方法製得之自然殺手細胞及醫藥上可接受之賦形劑。

圖一：

S11~S14‧‧‧步驟

圖1係本發明實施例一之NK細胞體外擴增暨活化方法流程圖；

圖2係本發明所產生之細胞擴增倍數分析；

圖3係本發明所產生之NK細胞毒殺癌細胞之能力測試結果，其中圖3A係以 K562作為被NK細胞毒殺之癌細胞株，其中圖3B係以HepG2、HT-29以及 A549作為被NK細胞毒殺之癌細胞株；

圖4係本發明所產生之NK細胞抑制癌細胞生長之小鼠實驗結果。

有鑑於上述待解決之問題，本發明提出一種不使用癌餵養細胞之NK細胞體外擴增方法，該方法係將納豆激酶應用於NK細胞體外擴增，提供NK細胞良好的培養環境，有效率地提升NK細胞擴增倍數，並產生高純度及高癌細胞毒殺活性之NK細胞。

定義

用於本說明書，「自然殺手細胞」(Natural killer cell，簡稱NK細胞)係指細胞表面抗原呈現CD3^-CD56⁺的細胞。

用於本說明書，「癌餵養細胞」(cancer feeder cell)係指體外免疫細胞培養中，加入活的癌細胞共同培養以達到提升免疫細胞擴增之效果，加入之其他活的癌細胞稱之為癌餵養細胞。

用於本說明書，「細胞擴增倍數」係以下列方式判斷：「經體外培養14天後之細胞數量」除以「自周邊血單核球細胞分離出之起始NK細 胞數量」。

用於本說明書，「毒殺癌細胞之活性」係以K562細胞株或其他癌細胞株為目標細胞(target cell)，並以NK細胞為作用細胞(effector cell)，在作用細胞與目標細胞之比例(E：T ratio)為5：1的情況下，將目標細胞死亡之比例做為毒殺效率。

材料與方法

本發明所述周邊血檢體，係依據倫理委員會通過之計畫，自受試者手臂採集全血，置於無菌採血管，於室溫存放待後續處理。

本發明所使用之基礎培養基可選用自：CellGro SCGM(CellGenix公司)、KBM 501(Kohjin Bio公司)、AIM-V(Thermo Fisher公司)、X-VIV015(Lonza公司)、DMEM及RPM1-1640等市售培養基。

本發明所述培養基中，有時含有適當的蛋白質、細胞激素、抗體、血清、化合物等成分。所述細胞激素有時為介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-7(IL-7)、介白素-12(IL-12)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)或介白素-21(IL-21)。

自PBMC分離NK細胞之方法

包括但不限於使用Dynabeads(Invitrogen公司)、CliniMACS磁珠(Miltenyi Biotec公司)或其他市售的免疫磁珠，將表達細胞表面抗原CD3和/或CD34的細胞分離除去，達到純化NK細胞之效果。

以流式細胞儀方式分析細胞表面抗原

以2x10⁵細胞/50μl將擴增暨活化後的細胞置於96孔盤，並 加入3μl螢光標記之抗體於4℃反應15分鐘，接著以磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Phosphate buffer saline；簡稱PBS)清洗3次後，加入400μl PBS懸浮細胞，再以流式細胞儀(Beckman公司)分析細胞表面之螢光標記。上述螢光標記之抗體包含anti-CD3抗體(Invitrogen公司)、anti-CD56抗體(Invitrogen公司)、anti-TRAIL抗體(BD Bioscience公司)以及anti-NKG2A抗體(R&D system公司)。

NK細胞毒殺癌細胞能力測試方式

將擴增暨活化後的細胞做為作用細胞(effector cell)，並以K562細胞株(慢性骨髓性血癌細胞株)、HepG2細胞株(肝癌細胞株)、HT-29細胞株(大腸癌細胞株)或A549細胞株(肺癌細胞株)做為毒殺標的細胞(target cell)。將作用細胞及標的細胞以0.25：1、0.5：1、1：1或5：1混合培養後，反應4小時，再以7-AAD進行細胞染色，藉此測定凋亡之細胞數量。

體外擴增暨活化NK細胞之方法

如圖一所示，步驟11係自血液檢體分離周邊血單核球細胞(PBMC)。將未經冷藏或冷凍之周邊血檢體置於50ml離心管內並離心。離心結束後，去除上層之血漿，加入適量之PBS稀釋後，再加入3ml之Ficoll-paque Plus(GE Healthcare公司)。於室溫離心20分鐘後，吸取PBMC層之細胞，並以PBS清洗3次，所得之細胞即為PBMC。

接著，自PBMC中純化NK細胞(如圖一步驟12)：在每1x10⁷ PBMC的條件下，以80μl含有0.5% BSA、2mM EDTA的PBS懸浮PBMC。在每1x10⁷細胞的條件下，添加30μl CD3磁珠(MACS CD3 MicroBeads human, Miltenyi Biotec公司)到所述PBMC懸浮液中，將所述包含磁珠的PBMC懸浮液均勻攪拌後，置於4℃下15分鐘。之後，所述PBMC懸浮液以300xg離心10分鐘並去除上清液後，以500μl含有0.5% BSA、2mM EDTA的PBS懸浮PBMC，再將所述PBMC懸浮液通過LD Column層析管(Miltenyi Biotec公司)，藉由磁力將細胞表面表達CD3抗原的細胞從所述懸浮液中分離，以2 x 1ml含有0.5% BSA、2mM EDTA的PBS清洗層析管，收集流出的細胞，即取得純化後的NK細胞。

接著，進行NK細胞擴增暨活化：將NK細胞以培養基均勻的配製成濃度介於2~10x105/ml之細胞懸浮液後，轉移至培養盤，在37℃及5% CO2的環境下進行NK細胞之擴增(如圖一步驟13)。所述NK細胞培養基係以AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)為基礎培養基，並添加濃度範圍介於200~1000IU/ml的介白素-2(IL-2)(Thermo Fisher Scientific公司)、濃度範圍介於10~50ng/ml的介白素-12(IL-12)(Sigma-Aldrich公司)、濃度範圍介於100~200ng/mL的介白素-18(IL-18)(Thermo Fisher Scientific公司)，以及濃度範圍介於5~20FU/ml之納豆激酶(NSK-SD；Japan Bio Science Laboratory公司)。所述培養基，可另添加濃度範圍介於100~1000nM之輔酶Q10(Sigma-Aldrich公司)。本發明之一較佳實施例中，於所述培養基另添加100nM之輔酶Q10(Sigma-Aldrich公司)。

此後，每隔二至三天觀察細胞之生長狀況，依細胞生長狀況更換新鮮的NK細胞培養基至14±2天為止(如圖一步驟14)。所述每隔二至三天更換之NK細胞培養基，係以第0036段所述方式配製之。最後，將培養 盤中的細胞與培養基混合液移至離心管，以離心方式收集所述混合液中之細胞，再以PBS清洗，重複此步驟三次後，以PBS將細胞均勻的打散，如此即獲得擴增暨活化後的NK細胞。

經前述方法所獲得之擴增暨活化後的NK細胞，可混合於適當之賦形劑中保存，所述賦形劑可為一磷酸緩衝液，最後製備成醫藥組合物。

實施例

實施例1、NK細胞擴增倍數測試

為測試並優化NK細胞擴增暨活化方法，本實施例探討所述NK細胞培養基之添加物及其添加量，試驗組分別使用培養基A、培養基B或培養基C，對照組則使用培養基D。所述對照組與實驗組皆以同一受試者之周邊血分離出之PBMC進行測試。所述培養基A、培養基B、培養基C及培養基D，皆係以AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)為基礎培養基，並添加濃度範圍介於200~1000IU/ml的介白素-2(IL-2)(Thermo Fisher Scientific公司)、濃度範圍介於10~50ng/ml的介白素-12(IL-12)(Sigma-Aldrich公司)，以及濃度範圍介於100~200ng/mL的介白素-18(IL-18)(Thermo Fisher Scientific公司)。為測試添加納豆激酶對於NK細胞體外擴增暨活化的效用，所述實驗組(培養基A、培養基B及培養基C)添加有20FU/ml(FU係指纖維蛋白分解單位，fibrin degradation unit)或5FU/ml之納豆激酶。為測試同時添加納豆激酶與輔酶Q10對於NK細胞體外擴增暨活化的效用，於所述培養基A同時加入20FU/ml之納豆激酶與100nM之輔酶Q10。培養基 A、培養基B、培養基C及培養基D的成份彙整如下表一。

表一、培養基成份

圖2之實驗結果顯示，使用含有納豆激酶之培養基A、培養基B或培養基C培養14天後，NK細胞擴增倍數皆達到1000倍以上，具體而言，擴增倍數為1135至1750倍。相較與此，使用無添加納豆激酶之培養基D培養14天後，NK細胞擴增倍數只有498倍。由此可知添加5~20FU/ml之納豆激酶，能有效提升NK細胞的擴增倍數。比較培養基A及培養基B之實驗結果，顯示在含有納豆激酶之培養基中再添加輔酶Q10，NK細胞擴增倍數自1326倍提升至1750倍。

實施例3、NK細胞對癌細胞之毒殺能力測試

為進一步探討以本發明擴增後之NK細胞活性，本實施例測試以不同培養基擴增後NK細胞對癌細胞之毒殺能力。首先，試驗組分別使用培養基A、培養基B或培養基C，對照組則使用培養基D，所述培養基成份如表一所示。所述對照組與實驗組皆以同一受試者之周邊血分離出之PBMC進行擴增暨活化。實驗結果顯示(圖3A)，使用含有納豆激酶之培養基A、培 養基B或培養基C培養14天後，當E：T比例為5：1且以K562作為被NK細胞毒殺之癌細胞株時，毒殺效率皆達到60%以上，具體而言，毒殺效率為63.1%~81.2%。相較與此，使用無添加納豆激酶之培養基D培養14天後，毒殺效率只有39.8%。由此可知培養基中添加5~20FU/ml之納豆激酶，不僅能提升NK細胞的擴增倍數，擴增後之NK細胞對於癌細胞也具有較高之毒殺活性。比較培養基A及培養基B之實驗結果，顯示在含有納豆激酶之培養基中再添加輔酶Q10，NK細胞對於癌細胞之毒殺能力還可再提高，自68.3%增加至81.2%。

承上，以一較佳的實施例培養基A擴增暨活化後的NK細胞，測試該NK細胞對不同癌細胞株之毒殺能力。實驗結果顯示(圖3B)，使用含有納豆激酶及輔酶Q10培養基擴增暨活化後之NK細胞(即培養基A組)，皆能有效毒殺HepG2細胞株(肝癌細胞株)、HT-29細胞株(大腸癌細胞株)及A549細胞株(肺癌細胞株)，且相較於使用不含納豆激酶之培養基(即培養基D組)，對於癌細胞明顯有較高的毒殺能力。

實施例4、細胞表面抗原分析

為測試本發明所產生之細胞中，NK細胞的占比(即純度)，以及該NK細胞之活化狀態，因此使用anti-CD3、anti-CD56、anti-TRAIL以及anti-NKG2A抗體標示細胞表面抗原，再以流式細胞儀分析，結果如表二所示。活化狀態的NK細胞表面表現TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)分子，具有較佳的癌細胞毒殺活性。NKG2A係位於NK細胞表面的抑制性受體，若NK細胞表面表現NKG2A，顯示該NK細胞之活性屬於被抑制 之狀態。換言之，當NK細胞表面不表現NKG2A抗原，該NK細胞具有較佳的癌細胞毒殺活性。

表二、細胞表面抗原分析結果

表二顯示，使用培養基A、培養基B或培養基C所產生之細胞中，92%至97%係NK細胞，顯示本發明可產生極高純度之NK細胞。再者，使用培養基A、培養基B或培養基C所產生之細胞中，41%至71%係TRAIL⁺CD3^-CD56⁺細胞，顯示多數細胞為高度活化狀態之NK細胞；相較於此，使用不含納豆激酶之培養基D所產生之細胞中，僅37%至54%係TRAIL⁺CD3^-CD56⁺細胞。另外，使用培養基A、培養基B或培養基C所產生之細胞中，僅21%至41%係NKG2A⁺CD3^-CD56⁺細胞，顯示多數細胞具有較佳的癌細胞毒殺活性；相較於此，使用不含納豆激酶之培養基D所產生之細胞中，高達41%至53%係NKG2A+CD3-CD56+細胞。

實施例5、NK細胞抑制腫瘤細胞增生之小鼠實驗

所有動物實驗係依據適當的動物照護，並使用實驗動物照護 及使用委員會或小組(IACUC)所核定的合乎道德的實驗步驟與準則進行。為測試以本發明擴增後之NK細胞抑制癌細胞增生的能力，將雌性NOD/SCID小鼠(平均體重為20公克)分配至不同組別，一組對照組(n=5)、一組實驗組(n=5)。將100μl含有1x10⁷的K562細胞(腫瘤細胞)以皮下注射方式給予對照組及實驗組小鼠，稱為實驗第0天。在實驗第0天、第4天、第8天、第12天及第14天，將100μl含有1x10⁷以一較佳的實施例培養基A產生的細胞，靜脈注射方式給予實驗組；並於同樣的時間點，將相同體積100μl之生理食鹽水以靜脈注射方式給予對照組。持續記錄小鼠的活動力、體重、毛色及皮下腫瘤的生長情況至第18天。實驗結果顯示，於第18天，實驗組小鼠體內的腫瘤體積為97.6mm³，明顯小於對照組之腫瘤體積364.8mm³。據此，本實施例以含有納豆激酶及輔酶Q10培養基擴增暨活化後NK細胞，在活體內能有效抑制腫瘤細胞之生長，表示擴增後NK細胞之活性極佳，具有臨床治療之應用性。

Claims (14)

1. 一種體外擴增暨活化自然殺手細胞之方法，其包含以下步驟：

   (a)自一血液檢體分離出周邊血單核球細胞；

   (b)自該周邊血單核球細胞分離出自然殺手細胞；

   (c)將該自然殺手細胞懸浮於含有納豆激酶之培養基並置於一細胞培養盤中培養；以及

   (d)每隔二至三天更換該含有納豆激酶之培養基，培養12至16天；

   其中該納豆激酶於該培養基中之濃度係介於5FU/ml至20FU/ml。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養基另包含輔酶Q10；其中該輔酶Q10於該培養基中之濃度係介於100nM至1000nM。
3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該培養基另包含基礎培養基以及細胞激素。
4. 如申請專利範圍第1至第3項中任一項之方法，其中該方法產生之細胞中21%至41%係NKG2A⁺CD3^-CD56⁺細胞。
5. 如申請專利範圍第1至第3項中任一項之方法，其中該方法產生之細胞中41%至71%係TRAIL⁺CD3^-CD56⁺細胞。
6. 如申請專利範圍第1至第3中任一項之方法，其中該方法不包含將自然殺手細胞與癌餵養細胞共同培養之步驟。
7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該方法可達到1135倍至1750倍的細胞擴增倍數。
8. 如申請專利範圍第1至第3項中任一項之方法，其中該方法之(b)步驟係以免疫磁珠之方式分離自然殺手細胞。
9. 一種根據申請專利範圍第1至第8項中任一項之方法製得之細胞。
10. 如申請專利範圍第9項之細胞，其中該細胞中21%至41%係NKG2A⁺CD3^-CD56⁺細胞。
11. 如申請專利範圍第9項之細胞，其中該細胞中41%至71%係TRAIL⁺CD3^-CD56⁺細胞。
12. 如申請專利範圍第9項之細胞，其中包含92%至97%之自然殺手細胞。
13. 如申請專利範圍第9項之細胞，當該細胞與K562細胞在活體外以5：1之比率共同培養時，該等細胞具有63%至81%之癌細胞毒殺活性。
14. 一種用於抑制腫瘤細胞增殖之醫藥組合物，其包含申請專利範圍第9項之自然殺手細胞及醫藥上可接受之賦形劑。

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