JP7318019B2 - 健康な人の免疫細胞培養液を用いたｎｋ細胞の含有量を増進させる方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ＮＫ細胞の細胞含有量を増進するための培養方法に関し、より詳細には、免疫細胞を正常人の免疫細胞培養液を含有する培地で培養する段階を含むＮＫ細胞の培養方法に関する。
人体では毎日数多くの癌細胞が生成されており、生成された癌細胞は体内の免疫システムにより死滅する。このような免疫システムにおいて最大の役割を担う細胞が、他ならぬ自然殺害細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、以下、‘ＮＫ細胞’という。）である。
ＮＫ細胞は人体において自然免疫の重要因子であって、主に、腫瘍細胞及びウイルスに感染された細胞を除去する重要な役割を有する。健康な人の体内に存在するＮＫ細胞の比率は約５～２０％と知られている。しかし、癌患者のＮＫ細胞比率は健康な人に比べて低く、しかもＮＫ細胞の効率が低下していると知られている（Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７：８３０４，２０１４）。癌患者では、このようなＮＫ細胞数及び機能の低下によって正常の免疫システムが活性化されず、癌へと悪化する。
体内に存在する大部分のＮＫ細胞は、正常状態では非活性化状態（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）として存在するが、実際にＮＫ細胞を治療用途に用いるためには、活性化されたＮＫ細胞が必要であることから、正常血液から或いはＮＫ細胞が非活性化された患者の血液からＮＫ細胞を活性化させる研究が活発に行われている。
体外でＮＫ細胞を活性化させる場合、ＮＫ細胞は高い細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示すことが確認され、これは、ＮＫ細胞を用いた免疫細胞治療の可能性を裏付けている。体外で活性化されたＮＫ細胞を種々の癌種類、特に、白血病のような血液癌（ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）患者を対象に同種骨髄移植後に投与し、その治療効果を確認した報告がある（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＆ Ｄｉｓｅａｓｅ，３３： ｐ２６１－２６６，２００４）。
一方、上記のようなＮＫ細胞の治療剤としての可能性にもかかわらず、体内に存在するＮＫ細胞の数は多くないため、ＮＫ細胞を治療用途に使用できる程度に十分の効能を維持しながら大量で生産する技術が必須である。しかし、ＮＫ細胞は、試験管内で（ｉｎ－ｖｉｔｒｏ）大量増殖及び培養がし難い。このため、実際に有用なレベルにＮＫ細胞を増幅、培養する技術に関心が集まっており、多くの研究が進行されているが、まだ臨床に適用可能なレベルには至らずにいる。
ＮＫ細胞の培養には、既存にＴ細胞の増殖／活性に使用していたＩＬ－２だけでなく、ＩＬ－１５（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７（６）：ｐ３１２９－３１３８，２００１；Ｂｌｏｏｄ，１０６（１）：ｐ１５８－１６６，２００５、大韓民国公開特許公報第２００９－０１２１６９４号）、ＬＰＳ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５（１）：ｐ１３９－１４７，２０００）、ＣＤ３を刺激するＯＫＴ－３抗体（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９（１）：ｐ１０４－１１３，２００１）を利用する研究が行われてきたが、このような研究は、以前から用いられてきたＩＬ－２使用に対する変形及び発展形態で新しい増殖物質を見出すことであるだけで、画期的な増殖方法を提示できずにいる。一般に、ＩＬ－２或いはその他のサイトカイン及び化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いたＮＫ細胞培養によっては初期ＮＫ細胞に比べて３～１０倍程度しか細胞数を増加せしめないと知られている。
癌患者のＮＫ細胞を健康な人のＮＫ細胞と同じ性能に戻す研究、及び健康なドナーの免疫細胞を使用（他家）しようとする研究が進行中であるが（Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７：８３０４，２０１４；Ｅ．Ｇ．Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２６２－０１０－０９０４－３，２０１０；Ｓ．Ｒ．Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｂｍｔ．２００９．３０４，２０１０）、このような免疫細胞治療剤の製造時に、多い種類のインターロイキンの添加及びＰＢＭＣ段階でのＮＫ細胞選択的な分類などが必要であり、面倒である。
そこで、本発明者らは、より経済的に且つ効率的にＮＫ細胞培養時にＮＫ細胞数を増加させる方法を開発しようと鋭意努力した結果、健康な人の免疫細胞培養液を患者由来免疫細胞培養時に添加する場合、ＮＫ細胞含有量が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ＮＫ細胞の細胞含有量を増進するための方法を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、癌患者又は正常人由来末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を、正常人の免疫細胞培養液及びＣＤ３抗体を含有する培地で培養する段階を含む、ＮＫ細胞含有量を増進させる方法を提供する。
特に断りのない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
本発明では、癌患者のＮＫ細胞を、健康な人のＮＫ細胞と同じ性能に戻すために、免疫細胞においてＮＫ細胞の含有量を増進できる方法を開発しようとし、若い健康人由来免疫細胞を培養した培養液を癌患者由来の免疫細胞を培養することに使用する場合、リンパ球細胞の細胞数が増加し、免疫細胞においてＮＫ細胞の細胞分率が高まることを確認した。
したがって、本発明は、癌患者又は正常人由来末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を、正常人の免疫細胞培養液及びＣＤ３抗体を含有する培地で培養する段階を含む、ＮＫ細胞含有量を増進させる方法に関する。
本発明において、‘正常人’は、満１６～４０歳の診断された疾病のない健康な人を意味する。
本発明において、‘免疫細胞’は、リンパ球系免疫細胞を意味し、好ましくは、末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）に含まれている免疫細胞を意味する。
本発明において、前記‘免疫細胞’は、末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）をＰ１～Ｐ３継代培養した免疫細胞を使用することができ、好ましくは、ＮＫ細胞の増殖を刺激するために、ＮＫ細胞増殖刺激物質で刺激された免疫細胞を使用することができる。
前記‘ＮＫ細胞増殖刺激物質’としてはＣＤ３抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ５６抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＬＰＳ、ＯＫＴ－３抗体などを使用できるが、これに限定されるものではない。
本発明において、正常人の免疫細胞培養液は、正常人由来末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）をＰ１～Ｐ３培養して生成された培養液であることを特徴とし、前記末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）の培養は、ＣＤ３、ＣＤ１６及びＣＤ５６からなる群から選ばれるサイトカインの抗体を追加して培養することを特徴とする。
本発明において、前記免疫細胞培養液は、細胞の除去された（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）培養液であることを特徴とする。
本発明において、前記免疫細胞は、癌患者又は正常人由来免疫細胞であることを特徴とし得る。
本発明において、前記免疫細胞は、癌患者又は正常人由来末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）をＣＤ３抗体存在下に培養することを特徴とし得る。
本発明において、前記正常人の免疫細胞培養液は、培地に１～５０％濃度で添加されることを特徴とし、好ましくは、５～３０％濃度で添加されてよく、より好ましくは、１０～２０％濃度で添加されてよい。
本発明において、免疫細胞培養のとき、Ｐ２培養時に前記正常人の免疫細胞培養液を添加することを特徴とし得る。
本発明の一態様では、ＮＫ細胞の標的となる慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２細胞と健康な人の免疫細胞培養液を１０％添加して培養した免疫細胞とを、それぞれ、１：３、１：５及び１：１０の割合に混ぜて共培養し、癌細胞に対する免疫細胞の細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を確認し、その結果、Ｋ５６２細胞と免疫細胞との比率１：３、１：５及び１：１０のそれぞれに対して、Ｋ５６２に対する健康な人の免疫細胞培養液を添加した実験群の細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が、対照群の細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）に比べて高いという事実を確認した（図３）。
本発明に係る方法によって製造されたＮＫ細胞及びこれを含む組成物は、腫瘍及び感染性疾患の治療に使用することができる。本発明に係る方法で製造されたＮＫ細胞は、固形癌（ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒ）及び血液癌を含むあらゆる種類の腫瘍に適用可能である。固形癌とは、血液癌とは違い、臓器（ｏｒｇａｎ）で塊状に形成された癌を意味し、大部分の臓器で発生する癌がそれに当たる。本発明に係るＮＫ細胞を用いて治療可能な腫瘍は、特に制限はなく、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌、リンパ腫などが挙げられるが、これに制限されるものではない。
本発明で用いられる感染性疾患は、ウイルス又は病原菌の感染によって発生する疾患であり、呼吸器及び血液、皮膚接触などにより伝染して感染され得るいかなる疾患も含む概念である。このような感染性疾患の非制限的な例としては、Ｂ型及びＣ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）感染、ウイルス性呼吸器疾患、インフルエンザー、コロナウイルス感染などがあるが、これに制限されるものではない。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものとして解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：若くて健康な人の免疫細胞を培養した培養液の製造
１－１：ＰＢＭＣ（末梢血液単核球）分離
２５歳の診断された疾病のない健康な人の血液５０ｍｌを、ＤＰＢＳを用いて１（血液）：１（ＰＢＳ）に希釈し、希釈した血液２０ｍｌを、１５ｍｌのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が含まれているチューブに添加した後、４００ｇで４５分間遠心分離し、バフィーコート（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）層に分布している細胞を回収し、回収した細胞を４０ｍｌのＰＢＳと混合した後、４００ｇ、５分間遠心分離を行い、上澄液を除去後に、分離したＰＢＭＣ細胞数を確認した。
１－１：ＰＢＭＣ（末梢血液単核球）分離
２５歳の診断された疾病のない健康な人の血液５０ｍｌを、ＤＰＢＳを用いて１（血液）：１（ＰＢＳ）に希釈し、希釈した血液２０ｍｌを、１５ｍｌのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が含まれているチューブに添加した後、４００ｇで４５分間遠心分離し、バフィーコート（Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）層に分布している細胞を回収し、回収した細胞を４０ｍｌのＰＢＳと混合した後、４００ｇ、５分間遠心分離を行い、上澄液を除去後に、分離したＰＢＭＣ細胞数を確認した。
１－２：免疫細胞培養液の製造
Ｐ０培養：１－１で分離したＰＢＭＣを均等に分け、２個のＴ７５フラスコでＫＢＭ５０１培地（Ｋｏｈｉｊｉｎ ｂｉｏ，ｃａｔ．Ｎｏ．１６２５０１５）を用いて培養したが、培養時に、２個のフラスコともに０．０２５％のＣＤ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５６６６８５）とＣＤ５６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５９０４３）を添加し、いずれか一方のフラスコ（ＣＤ１６＋フラスコ）には０．１５％のＣＤ１６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５５４０４）を添加し、培養１日目及び３日目にＣＤ１６抗体をさらに添加した。
Ｐ０培養：１－１で分離したＰＢＭＣを均等に分け、２個のＴ７５フラスコでＫＢＭ５０１培地（Ｋｏｈｉｊｉｎ ｂｉｏ，ｃａｔ．Ｎｏ．１６２５０１５）を用いて培養したが、培養時に、２個のフラスコともに０．０２５％のＣＤ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５６６６８５）とＣＤ５６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５９０４３）を添加し、いずれか一方のフラスコ（ＣＤ１６＋フラスコ）には０．１５％のＣＤ１６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５５４０４）を添加し、培養１日目及び３日目にＣＤ１６抗体をさらに添加した。
培養は、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度５．０％）、３７℃条件で培養し、以降の培養はいずれも同じ条件で行った。培養２日目に各フラスコに培地１０％ ＦＢＳを添加し、培養５日目に継代培養を行った。
Ｐ１培養：Ｐ０培養で回収した細胞を各Ｔ１７５フラスコに追加した。このとき、培養液は捨てないでそのままＴ１７５フラスコに入れた（フラスコ１：ＣＤ１６添加用、フラスコ２：ＣＤ１６不添加用）。この時、各フラスコに０．０５％のＣＤ３抗体をさらに添加し、ＫＢＭ５０１培地（Ｋｏｈｉｊｉｎ ｂｉｏ，ｃａｔ．Ｎｏ．１６２５０１５）を用いて培養した。Ｐ１培養１日目に各フラスコにＣＤ５６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５９０４３）を添加し、ＣＤ１６＋フラスコに０．２％のＣＤ１６抗体をさらに添加した。培養２日目に各フラスコに培地及び１％のＦＢＳを追加した。培養３日目に各フラスコに０．１２％のＣＤ５６さらに添加し、ＣＤ１６＋フラスコに０．２％のＣＤ１６抗体をさらに添加した。培養４日目に各フラスコに培地及び１％のＦＢＳをさらに添加し、培養８日目に両フラスコの培養液を回収して合わせた後、ＮＫ細胞培養に使用した。
実施例２：癌患者のＮＫ細胞培養
２－１：ＰＢＭＣ（末梢血液単核球）分離
満３９歳の脳腫瘍診断患者の血液５０ｍｌをＤＰＢＳを用いて１（血液）：１（ＰＢＳ）に希釈し、希釈した血液２０ｍｌを、１５ｍｌのフィコールが含まれているチューブに添加した後、４００ｇ、５分間遠心分離し、バフィーコート層に分布している細胞を回収し、回収した細胞を４０ｍｌのＰＢＳと混合した後、４００ｇ、５分間遠心分離を行い、上澄液を除去後に、分離したＰＢＭＣ細胞数を確認した。
２－１：ＰＢＭＣ（末梢血液単核球）分離
満３９歳の脳腫瘍診断患者の血液５０ｍｌをＤＰＢＳを用いて１（血液）：１（ＰＢＳ）に希釈し、希釈した血液２０ｍｌを、１５ｍｌのフィコールが含まれているチューブに添加した後、４００ｇ、５分間遠心分離し、バフィーコート層に分布している細胞を回収し、回収した細胞を４０ｍｌのＰＢＳと混合した後、４００ｇ、５分間遠心分離を行い、上澄液を除去後に、分離したＰＢＭＣ細胞数を確認した。
２－２：ＮＫ細胞培養
Ｐ０培養：２－１で分離したＰＢＭＣを均等に分け、２個のＴ７５フラスコでＫＢＭ５０１培地（Ｋｏｈｉｊｉｎ ｂｉｏ，ｃａｔ．Ｎｏ．１６２５０１５）を用いて培養したが、培養時に、２個のフラスコともに０．０２５％のＣＤ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５６６６８５）及び０．０７５％のＣＤ５６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５９０４３）を添加し、いずれか一方のフラスコ（ＣＤ１６＋フラスコ）には０．１５％のＣＤ１６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５５４０４）を添加し、培養１日目及び３日目に０．０１５％のＣＤ１６抗体をさらに添加した。
Ｐ０培養：２－１で分離したＰＢＭＣを均等に分け、２個のＴ７５フラスコでＫＢＭ５０１培地（Ｋｏｈｉｊｉｎ ｂｉｏ，ｃａｔ．Ｎｏ．１６２５０１５）を用いて培養したが、培養時に、２個のフラスコともに０．０２５％のＣＤ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５６６６８５）及び０．０７５％のＣＤ５６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５９０４３）を添加し、いずれか一方のフラスコ（ＣＤ１６＋フラスコ）には０．１５％のＣＤ１６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５５４０４）を添加し、培養１日目及び３日目に０．０１５％のＣＤ１６抗体をさらに添加した。
培養は、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２濃度５．０％）、３７℃条件で培養し、以降の培養はいずれも同じ条件で行った。培養２日目に各フラスコに培地１０％のＦＢＳを添加し、培養５日目に継代培養を行った。
Ｐ１培養：Ｐ０培養で回収した細胞を各Ｔ１７５フラスコに追加した。この時、培養液は捨てないでそのままＴ１７５フラスコに入れた（フラスコ１：ＣＤ１６添加用、フラスコ２：ＣＤ１６不添加用）。この時、各フラスコにＫＢＭ５０１培地及び０．０５％のＣＤ３抗体をさらに添加して培養した。Ｐ１培養１日目に各フラスコに０．０１２％のＣＤ５６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ５５９０４３）を添加し、ＣＤ１６＋フラスコに０．２％のＣＤ１６抗体をさらに添加した。培養２日目に各フラスコに培地及び１％のＦＢＳを追加した。培養３日目に各フラスコに０．１２％のＣＤ５６抗体をさらに添加し、ＣＤ１６＋フラスコにＣＤ１６抗体をさらに添加した。培養４日目に各フラスコに培地及び１％のＦＢＳをさらに添加し、培養５日目に継代培養を行った。
Ｐ２培養：Ｐ１培養で回収した細胞及び培養液をそのまま一つのＫＢＭ５０２Ｂ（ＫＯＨＪＩＮ ＢＩＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ１６０２５０２Ｂ）に入れた。ここに１０％のＦＢＳ及び実施例１で得た健康な人の免疫細胞培養液をそれぞれ１０％、１５％及び２０％の濃度で追加し、７日間培養後に細胞を回収した。
実施例３：合計免疫細胞数及びＮＫ細胞分率の測定
実験群は、実施例２の方法で培養した免疫細胞であり、対照群としては、健康な人の免疫細胞培養液を添加しないで培養した免疫細胞を使用した。
実験群は、実施例２の方法で培養した免疫細胞であり、対照群としては、健康な人の免疫細胞培養液を添加しないで培養した免疫細胞を使用した。
癌患者由来免疫細胞数を、顕微鏡及びヘモサイトメーター（Ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定し、ＮＫ細胞分率をＦＡＣＳアッセイ（ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により確認した（ＦＩＴＣ－ＣＤ３／ＰＥ－ＣＤ１６、５６）。
その結果、図１及び表１に示すように、健康な人の免疫細胞培養液を１０％、１５％及び２０％の濃度でそれぞれ添加して培養した実験群ではいずれも、細胞数が対照群に比べて高いことを確認した。
なお、図２及び表２に示すように、健康な人の免疫細胞培養液を１０％、１５％及び２０％の濃度でそれぞれ添加して培養した実験群ではいずれも、ＮＫ細胞分率が対照群に比べて高いことを確認した。
実施例４：癌細胞に対する細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）測定
実験群は、実施例２の方法で培養した健康な人の免疫細胞培養液を添加して得られた免疫細胞であり、対照群としては、健康な人の免疫細胞培養液を添加しないで培養した免疫細胞を使用した。
実験群は、実施例２の方法で培養した健康な人の免疫細胞培養液を添加して得られた免疫細胞であり、対照群としては、健康な人の免疫細胞培養液を添加しないで培養した免疫細胞を使用した。
細胞毒性は、ＮＫ細胞の標的となる慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２細胞（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ，８９１２１４０７）と、健康な人の免疫細胞培養液を１０％添加して培養した免疫細胞とを、それぞれ１：３、１：５及び１：１０の割合に混ぜ、４時間、１０％のＦＢＳの添加されたＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ，１２４４００５３）を用いて共培養を行い、癌細胞に対する細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を確認した。
７－ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞媒介性細胞毒性アッセイキット（Ｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）（Ｃａｙｍａｎ，６００１２０）の構成品の一つであるＣＦＳＥ液を用いて癌細胞だけを染色後に、それぞれの比率によって細胞を混ぜた後、Ｖ底９６ウェルプレート（Ｖ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）（Ｎｕｎｃ，２４９９３５）を用いて共培養を行った。４時間共培養後に、キット構成品である７－ＡＡＤ液を用いて死んだ細胞を表示した。結果分析は、ＦＡＣＳ機器（ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＣＦＳＥ染色された癌細胞のうち、７－ＡＡＤの染色された死んだ細胞を確認し、その分率を確認した。
キットを用いた細胞毒性分析は、キットのメーカーが推薦するプロトコルを基本的に遵守した。
その結果、図３及び表３に示すように、Ｋ５６２細胞と免疫細胞との比率１：３、１：５及び１：１０のそれぞれに対して、Ｋ５６２に対して、健康な人の免疫細胞培養液を添加して培養した免疫細胞（実験群）の細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が、健康な人の免疫細胞培養液を添加しないで培養した免疫細胞（対照群）の細胞毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）よりも高いという事実を確認した。
本発明によれば、癌患者だけでなく、遺伝的に癌に脆弱な人又は老人のＮＫ細胞を含む免疫細胞の増殖率を高めることができ、ＮＫ細胞分率及び細胞殺害能も高めることができる。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施の態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点が明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
Claims (2)
- 癌患者由来末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３抗体０．０２５～０．０５％及び、正常人由来末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を１～３継代で培養し、細胞を除去した培養液５～３０％を含む培地で培養する工程を含む、ＮＫ細胞含有量を増進させる方法であって、
ここで、前記正常人由来末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を１～３継代で培養し細胞を除去した培養液は、（ｉ）正常人由来末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ５６抗体を含む培地で培養した培養液及び（ii）正常人由来末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５６抗体を含む培地で培養した培養液を混合した培養液であることを特徴とする、前記方法。 - 前記正常人は、満１６～４０歳の疾病のない状態の人であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
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